Efeito da fração acetato de etila do Echinodorus macrophyllus … · Maria Fábio Aranha, além de professora, uma amiga, sempre ajudando nos momentos de dúvida. Ao Magnífico

Programa de Mestrado em Ciências Odontológicas Inte gradas Área de Concentração Odontologia

PAULO ARTUR ANDRADE DE ALBUQUERQUE

EFEITO DA FRAÇÃO ACETATO DE ETILA DO ECHINODORUS MACROPHYLLUS (KUNTH) MICHELI NA CICATRIZAÇÃO DE LESÃO EM

LÍNGUA DE RATOS

Cuiabá, 2015



LÍNGUA DE RATOS

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciências Odontológicas, da Universidade de Cuiabá – UNIC como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas Área de Concentração Odontologia.

Orientadora: Profª. Drª. Evanice Menezes Marçal Vieira

Co-orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida D V Semenoff

Cuiabá, 2015

FICHA CATALOGRÁFICA Catalogação na Fonte

Ficha Catalográfica Valéria Oliveira dos Anjos Bibliotecária – CRB1/1713

A345e Albuquerque, Paulo Artur Andrade de.

Efeito da fração acetato de etila de Echinodorus macrophyllus (kunth) micheli na cicatrização de lesão em língua de ratos / Paulo Artur Andrade de Albuquerque – Cuiabá, 2015.

59 f. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências

Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, para obtenção do título de Mestre em Ciências Ontológicas.

Orientadora: Profª Drª Evanice Menezes Marçal Vieira. Co-orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida D. V. Semenoff. 1. Regeneração. 2. Cicatrização. 3. Echinodorus macrophyllus. 4. Planta Medicinal. I. Título.

CDU: 615.322:581.4



LÍNGUA DE RATOS

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas, da Universidade de Cuiabá – UNIC como requisito parcial para obtenção do Título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas – Área de Concentração Odontologia. Orientadora: Profª. Drª. Evanice Menezes Marçal Vieira. Co-orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida D. V. Semenoff

BANCA EXAMINADORA

__________________________________

Orientadora Profª. Drª. Evanice Menezes Marçal Vieira

__________________________________

Membro Titular Prof. Dr. Amílcar Sabino Damazo

__________________________________

Membro Titular Profª. Drª. Andreza Maria Fábio Aranha

Conceito Final: _______________________

Cuiabá, 25 de Março de 2015.

Dedico este trabalho à minha família, pelo apoio e incentivo durante toda essa

jornada, à vocês, o meu amor incondicional.

AGRADECIMENTO

Aos meus pais, Alvaro e Luciete, pelo amor, carinho, conselhos e apoio a todo e qualquer momento. É uma honra partilhar do mesmo caminho acadêmico que vocês trilharam com tamanha maestria, meus maiores exemplos de vida. Amo vocês!

À minha esposa Annelyze, seu amor, apoio, companheirismo e paciência foram essenciais para que essa conquista fosse possível. Ao seu lado me sinto mais forte e que tudo é possível. Te amo bêzinha!

À minha irmã Inara, que no melhor estilo “irmã” de ser, sempre apoiando e por ter me dado dois sobrinhos lindo, Natalie e Antônio, que colorem e iluminam o meu dia. Maninho e titio ama!

À minha Orientadora Profª. Drª. Evanice Menezes Marçal Vieira, pela paciência, dedicação e carinho nos ensinamentos passados. Sempre cobrando mas nunca perdendo a ternura.

Ao Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo, pela análise estatística deste trabalho, pela paciência ao ensinar sobre estatística e pelas oportunidades dadas à mim.

Ao departamento de Química da UFMT, na pessoa da Profª. Drª. Virginia Claudia da Silva, pelo fornecimento do material vegetal utilizado nesta pesquisa.

À Profª. Gabriela Volpato Pazin, no auxílio das formulações das medicações utilizadas no estudo.

Às acadêmicas Izabella Caroline Lima Pereira e Patrícia Costa Leite, pelo auxílio na realização dos experimentos.

Às funcionárias do Laboratório de Patologia Patrícia da Silva Manzano e Camila Vieira de Oliveira, pela ajuda e carinho no preparo das lâminas do estudo.

Aos meus queridos companheiros de mestrado Ana Paula da Cunha Barbosa, André Luis Fernandes da Silva, Andreia Santini, Ariane Liamara Brito Sala Braum, Craudeli Moreira, Fernanda Zanol Matos, Fernanda Silva de Assis, Grace Emanuelle Guerreiro Dias Rocatto, Heitor Simões Dutra Corrêa, João Milanez Moreira Júnior, Jussara Machado Pereira, Kadyja Assis Veiga, Laura Maria de Amorim Santana, Lorena Frange Caldas, Marcondes Paiva Serra, Maria Francisca Moretti, Marta Eloiza Zanelli, Pâmela Juara Mendes de Oliveira, Regina Greyce da Silva Pereira Ribeiro, Rejane Cristina da Cruz Nascimento, Renata Meira Coelho, Sandra Regina Altoé, Sebastião Dias de Oliveira, Thiago Machado Pereira, Vanessa de Souza, Yolanda Benedita Abadia Martins de Barros. Muitas risadas e angústias compartilhadas nesses dois anos juntos. Foi um enorme prazer e honra conhecê-los.

Aos Professores Doutores do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Alessandra Nogueira Porto, Alex Semenoff Segundo, Alexandre Meireles Borba, Álvaro Henrique Borges, Artur Aburad de Carvalhosa, Cyntia Rodrigues de Araujo Estrela, Fábio Luís Miranda Pedro, Luiz Evaristo Ricci Volpato, Matheus Coelho Bandéca, Orlando Aguirre Guedes e Tereza Aparecida D.

V. Semenoff, pelos ensinamentos compartilhados, em especial a Profª. Drª Andreza Maria Fábio Aranha, além de professora, uma amiga, sempre ajudando nos momentos de dúvida.

Ao Magnífico reitor da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Rui Fava.

Ao Pró Reitor Acadêmico da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Ms. José Cláudio Perecin.

À Pró Reitora Administrativa e Diretora de unidade da Universidade de Cuiabá – UNIC, Profª. Simone Cristina de Castro Wojcicki.

Ao Diretor de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Prof. Dr. Helio Suguimoto.

À Coordenadora de Pesquisa e Pós-Graduação Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC, Profª. Lucélia de Oliveira Santos.

Ao Coordenador do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges.

Ao Diretor da Faculdade de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Prof. Dr. Fábio Luis Miranda Pedro.

À faculdade de Medicina Veterinária, na pessoa do diretos Prof. Dr. Lázaro Manoel de Camargo, pela disponibilidade da Sala de Apoio à Pesquisa utilizada na realização dos experimentos deste trabalho.

Às secretárias do Programa de Mestrado da Universidade de Cuiabá, Cátia Balduíno Ferreira e Josieire Marques Missias.

Aos meus pacientes, que compreenderam minha ausência quando necessária.

Aos meus amigos, pela ausência nos churrascos e confraternizações.

À todos aqueles que ajudaram e/ou apoiaram direta ou indiretamente a realização deste trabalho.

MUITO OBRIGADO!

RESUMO

RESUMO


LÍNGUA DE RATOS

ALBUQUERQUE, P. A. A. Efeito da fração acetato de etila do Echinodorus macrophyllus (Kunth) Micheli na cicatrização de lesão em língua de ratos. 2015. 59f. Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas) Programa de Pós Graduação em Odontologia, Universidade de Cuiabá – UNIC, Cuiabá 2015.

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da Fração acetato de etila de Echinodorus macrophyllus (FaeEm) na cicatrização de ferida na língua de rato. Utilizando punch metálico de 6 mm de diâmetro e 1 mm de profundidade confeccionou-se a ferida no dorso da língua de 50 ratos Wistar, sob anestesia geral. Os animais foram divididos em 5 grupos: G1 (soro fisiológico 0,9%); G2 (FaeEm 25 mg/mL); G3 (FaeEm 50 mg/mL); G4 (FaeEm 100 mg/mL) e G5 (triancinolona acetonida 100 mg/mL), sendo 10 animais por grupo, subdivididos em 2 subgrupos, de acordo com o período de tratamento (3 e 7 dias). Aplicações tópicas diárias, uma vez ao dia, das formulações, foram realizadas. Após os períodos experimentais estabelecidos, os animais foram eutanasiados, os espécimes biológicos removidos, processados histologicamente e corados por Hematoxilina-Eosina (HE). Os parâmetros: infiltrado inflamatório (INF), células polimorfonucleares (PMN), edema (EDE), neovascularização (NEO) e reepitelização (REP) foram analisados e classificados de acordo com escore pré-definido. Os resultados obtidos dos escores foram analisados por ANOVA one way e o valor de significância determinado em p<0,05. No período de 3 dias, G3 e G4 apresentaram menor EDE (p<0,05) em relação ao grupo controle negativo (G1) e positivo (G5) e, no período de 7 dias, G4 apresentou maior NEO em relação ao grupo controle (G1). Concluímos que o G3 (50 mg/mL) apresentou melhor modulação do processo inflamatório, em comparação ao processo normal de cicatrização (grupo controle negativo) e a medicação de referência no tratamento das afecções orais (grupo controle positivo).

Palavras-chave: Alismataceae. Triancinolona Acetonida. Cicatrização.

ABSTRACT

ABSTRACT

EFFECT OF ETHYL ACETATE FRACTION OF ECHINODORUS MACROPHYLLUS (KUNTH) MICHELI IN WOUND HEALING AT TONGUE OF RATS.

ALBUQUERQUE, P. A. A. Effect of ethyl acetate fraction of Echinodorus macrophyllus (Kunth) Micheli in wound healing at tongue of rats. 2015. 59f. Dissertation (Master Degree in Integrated Dental Sciences) raduation Program in Dentistry, University of Cuiabá - UNIC, Cuiabá 2015.

The aim of this study was to evaluate the effect of Echinodorus macrophyllus in wound healing in the rat tongue. Using a 6 mm diameter and 1 mm deep metal punch, a wound created on the tongue’s dorsum of 50 Wistar rats under general anesthesia. The animals were divided into 5 groups: G1 (0.9% saline solution); G2 (FaeEm 25 mg/mL); G3 (FaeEm 50 mg/mL); G4 (FaeEm 100 mg/mL) and G5 (triamcinolone acetonide 100 mg/mL), with 10 animals per group, divided into two subgroups, according to the treatment period (days 3 and 7). Daily topical applications, once a day, of the formulations were performed. After the established experimental periods, the animals were euthanized, the biological specimens removed, histologically processed and stained with Hematoxylin-Eosin (HE). The parameters: inflammatory infiltration (INF), polymorphonuclears cells (PMN), edema (EDE), neovascularization (NEO) and re-epithelialization (REP) were analyzed and classified according to pre-defined score. The results were analyzed by one-way ANOVA, and significance determined at p value < 0.05. At 3 day period, G3 and G4 showed lower EDE (p<0.05) compared to the control group and triamcinolone and, at 7 days, G4 showed higher NEO than control group (G1). It was concluded that the G3 (50 mg/mL) showed better modulation of the inflammatory process compared to the normal healing process (negative control group) and reference drug (positive control group) in the treatment of oral diseases.

Key words: Alismataceae. Triancinolone Acetonide. Wound Healing.

LISTA DE FIGURAS

Lista de Figuras

Figura 1: Aspectos histomorfológicos dos grupos experimentais nos períodos de 3 e 7 dias ........................................................................................................................ 41

LISTA DE TABELAS

Lista de tabelas

Tabela 1 – Análise histológica quantitativa dos grupos experimentais, conforme escore pré-definidos ................................................................................................. 42

Tabela 2 – Tabela 2 – Demonstração das Médias e Desvio Padrão dos grupos avaliados no estudo, no período de 3 e 7 dias ......................................................... 43

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE ABREVIATURAS

µg Micrograma

µl Microlitro

ECM Matriz extracelular

FaeEm Fração acetato de etila do Echinodorus macrophyllus

EM Echinodorus macrophyllus (Kunth) Micheli

FGF Fator de crescimento fibroblástico

G1 Grupo experimental 01: controle negativo (SF 0,9%)

G2 Grupo experimental 02: FaeEm 25mg/mL



G5 Grupo experimental 05: Triancinolona acetonida 0,1%

HE Técnica de coloração por Hematoxilina-Eosina

INF Infiltrado inflamatório

kg Quilograma

mg Miligrama

mL Mililitro

NEO Neovascularização

PDGF Fator de crescimento derivado de plaqueta

pH Potencial hidrogeniônico

PMN Células polimorfonucleares

pO2 Pressão parcial de oxigênio

REP Reepitelização

TGF-α Fator de crescimento tumoral alfa

TGF-β Fator de crescimento tumoral beta

VEGF Fator de crescimento endotelial vascular

SUMÁRIO

SUMÁRIO

1. REVISÃO DA LITERATURA ....................................................................................................... 21

1.1 REPARO TECIDUAL .............................................................................................................. 21

1.1.1 Hemostasia ...................................................................................................................... 22

1.1.2 Inflamação ........................................................................................................................ 23

1.1.3 Proliferação ...................................................................................................................... 23

1.1.4 Remodelação ................................................................................................................... 25

1.2 TRIANCINOLONA ACETONIDA ........................................................................................... 25

1.3 ECHINODORUS MACROPHYLLUS (KUNTH) MICHELI ................................................. 26

1.4 REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 29

2. CAPÍTULO 1 ................................................................................................................................... 21

2.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 34

2.2 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................... 37

2.2.1 MATERIAL VEGETAL E OBTENÇÃO DO EXTRATO DA PLANTA ............................ 37

2.2.2 ANIMAIS ................................................................................................................................ 37

2.2.3 FORMULAÇÕES EXPERIMENTAIS E PERÍODOS OBSERVACIONAIS .................. 38

2.2.4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ............................................................................ 38

2.2.5 PREPARAÇÃO DOS ESPÉCIMES PARA A MICROSCOPIA DE LUZ E ANÁLISE HISTOLÓGICA ............................................................................................................................... 39

2.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................................... 39

2.3 RESULTADOS ............................................................................................................................. 41

2.4 DISCUSSÃO ................................................................................................................................ 46

2.5 CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 52

2.6 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................... 54

2.7 ANEXOS ....................................................................................................................................... 59

1. REVISÃO DA LITERATURA

21

1. REVISÃO DA LITERATURA

1.1 REPARO TECIDUAL

Ferida é definida como uma interrupção na estrutura anatômica normal e

funcional, decorrentes de fatores internos ou externos ao organismo e são classificas

em agudas ou crônicas. Feridas agudas são lesões que completam o processo de

reparo dentro do prazo esperado, as feridas crônicas são aquelas que falharam em

devolver a integridade anatômica e funcional do organismo, por meio do processo de

cicatrização (LAZARUS et al., 1994).

O reparo tecidual pode ser classificado em três tipos, dependendo do

tempo e método pelo qual é realizado o fechamento da ferida, podendo ele ser por

primeira, segunda ou terceira intenção. Reparo por primeira intenção ocorre quando

a ferida é fechada mecanicamente, promovendo a aproximação das bordas da

mesma. Tal fechamento deve ser realizado em até 24 horas após o trauma. Reparo

por segunda intenção ocorre quando a ferida não favorece a aproximação livre de

tensão das margens, devido à perda significativa de tecido, bordas desvitalizadas,

ulcerações ou cavidades de abscesso. A ferida permanece aberta e o reparo ocorre

pela formação de grande quantidade de tecido de granulação e contração da ferida.

O reparo por terceira intenção, ou primeira intenção tardia, ocorre quando o

fechamento mecânico ocorre após um período que a ferida tenha permanecido aberta,

mas sem perda significativa de tecido. Normalmente são feridas infectadas,

contaminadas por terra, esterco, fezes, mordidas de animais ou projéteis (NAWAZ e

BENTLEY, 2010).

Com o surgimento da ferida, desencadeia-se uma cascata de eventos

celulares e bioquímicos, complexos e organizados, a fim de restaurar a integridade

tecidual. Os eventos do processo de reparo tecidual, embora sejam organizados em

fases distintas, não possuem limites definidos entre eles e os eventos se sobrepõem

no tempo-espaço, podendo uma única ferida apresentar diferentes estágios do reparo

(EMING et al., 2007; STRONCEK et al., 2008; COSTA et al., 2014).

Feridas em mucosa oral passam pelos mesmos estágios do processo de

reparo que ocorrem nas lesões em pele porém e apresentam característica que

aceleram o processo tais como diminuição na resposta inflamatória, melhor controle

22

da angiogênese e rápida reepitelização (CHEN et al., 2010; JOHNSON et al., 2014).

Em geral, as fases da cicatrização de lesão na mucosa apresentam redução na

duração, na expressão gênica e proteica, em comparação a cicatrização de feridas

em pele (CHEN et al., 2010). Ambos os epitélios apresentam semelhanças

histológicas dependendo da localização, em humanos e ratos, são epitélios

queratinizados o dorso da língua, palato duro e gengiva inserida, sendo considerados

bons meios para estudos (TURABELIDZE et al., 2014).

Conforme a literatura, o reparo tecidual pode ser dividido didaticamente em,

3 fases: inflamação, proliferação e remodelação (LAZARUS et al., 1994; WILD et al.,

2010); 4 fases: hemostasia, inflamação, proliferação e remodelação (EMING et al.,

2007; YOUNG e MCNAUGHT, 2011); ou 5 fases: hemostasia, inflamação,

proliferação, remodelação e maturação (ENOCH e LEAPER, 2007; COSTA et al.,

2014), ficando a critério de cada autor seguir a classificação que melhor adequar ao

seu estudo.

1.1.1 Hemostasia

Imediatamente após o ferimento instalado inicia-se a fase da hemostasia,

a fim de evitar a perda contínua de sangue, fornecer um arcabouço para as células

presentes nas fases seguintes do processo de reparo, além de prover uma barreira

física contra a invasão de microrganismos (BROUGHTON II et al., 2006; KONDO e

ISHIDA, 2010).

As plaquetas são importantes no processo de cicatrização de feridas por

participarem do processo de formação do coágulo e por produzirem múltiplos fatores

de crescimento e citocinas, que contribuem na manutenção do processo de reparo

(YOUNG e MCNAUGHT, 2011). As células inflamatórias e reparadoras são

quimicamente atraídas para o arcabouço de moléculas armazenadas dentro do

coágulo, dando início ao segundo estágio do processo de reparo: a inflamação

(ENOCH e LEAPER, 2007; STRONCEK et al., 2008; VELNAR et al., 2009).

23

1.1.2 Inflamação

Horas após a injúria, é possível observar os primeiros componentes da fase

inflamatória, os neutrófilos. Estas células migram para o interior da ferida respondendo

às quimiocinas liberadas pelas plaquetas e células endoteliais. Dentro da ferida, os

neutrófilos promovem o debridamento de tecido desvitalizado e destruição de agentes

infecciosos (EMING et al., 2007). Em torno de 48 horas após o início do processo de

cicatrização, a quantidade de neutrófilos começa a diminuir, enquanto a de

macrófagos aumenta (LI et al., 2007; VELNAR et al., 2009). Os macrófagos são

células fagocitárias oriundas dos monócitos que se ativaram ao entrar em contato com

a matriz de fibrina, são atraídos à ferida por meio das citocinas liberadas pelas

plaquetas durante a fase de hemostasia e são responsáveis por remover todo e

qualquer resíduo da ferida, tais como bactérias, corpos estranhos e tecido necrosado

(VELNAR et al., 2009). Essa função é bem similar à dos neutrófilos, porém os

macrófagos conseguem regular melhor a destruição proteolítica secretando proteases

inibidoras. Além disso, os macrófagos exercem uma importante função reguladora da

resposta inflamatória, liberando citocinas e fatores de crescimento (PARK e BARBUL,

2004; KONDO e ISHIDA, 2010; GOLDBERG e DIEGELMANN, 2010; YOUNG e

MCNAUGHT, 2011).

1.1.3 Proliferação

Com a ferida livre de estímulo traumático, hemostasia alcançada e livre de

detritos, inicia-se a fase proliferativa do processo de reparo. Esta fase, que se inicia

por volta do terceiro dia, envolve os processos de angiogênese (formação de tecido

de granulação); deposição de colágeno (formação de matriz extracelular); e

epitelização (formação do epitélio de revestimento). Todos esses processos ocorrem

simultaneamente e podem perdurar por pelo menos duas semanas (ENOCH e

LEAPER, 2007).

A angiogênese é responsável por fornecer nutrição e oxigênio aos tecidos

em desenvolvimento e participa da formação do tecido de granulação a partir da

migração de células endoteliais e neoformação capilar (BROUGHTON II et al., 2006;

24

ENOCH e LEAPER, 2007; LI et al., 2007). O processo de angiogênese consiste na

ativação de células endoteliais, degradação local da membrana basal do vaso

sanguíneo por meio de enzimas proteolíticas, favorecendo o brotamento de vasos

neoformados no interior do coágulo; proliferação celular; formação da estrutura

tubular; e reconstrução da membrana basal (LI et al., 2007; ENOCH e LEAPER, 2007).

A angiogênese é regulada por uma série de fatores estimulantes locais (VEGF, FGF,

PDGF, angiogenina, TGF-α e TGF-β, baixo pO2 e pH e alta concentração de lactato)

e fatores anti-angiogênicos (angiostatina e esteroides) (ENOCH e LEAPER, 2007;

VELNAR et al., 2009; GOLDBER E DIELGELMAN).

A degradação da matriz provisória de fibrina do coágulo pelas enzimas

proteolíticas presentes na angiogênese é acompanhada pela formação do tecido de

granulação. Tal tecido é composto por substância fundamental amorfa, colágeno

depositado de forma aleatória, capilares neoformados e fibroblastos (WILD et al.,

2010; GOLDBERG e DIEGELMANN, 2010).

Os fibroblastos atuam na síntese, deposição e remodelação da matriz

extracelular (ECM), são recrutados a partir do tecido conjuntivo local e perivascular

próximo, por meio dos fatores de crescimento secretados pelos macrófagos. Os

fibroblastos migram para a matriz da ferida, onde proliferam-se e depositam moléculas

adicionais à ECM - fibronectina, proteoglicanas e glicoproteínas - assim como síntese

de colágeno. O colágeno produzido é depositado de forma aleatória na ECM de modo

a formar uma estrutura rígida de suporte. Com o decorrer do processo de reparo, esse

colágeno se reorienta a fim de estabelecer um padrão de disposição, aumentando a

resistência à tração da ferida (BROUGHTON II et al., 2006; WILD et al., 2010;

GOLDBERG e DIEGELMANN, 2010).

Mesmo sendo um componente da fase proliferativa, a epitelização tem

início horas após a instalação da ferida, em que uma única camada celular epidérmica

advinda dos bordos da ferida forma uma fina cobertura à mesma. Os queratinócitos

localizados nos bordos da ferida são as principais células responsáveis pela

epitelização da ferida (NAWAZ E BENTLEY; SCHREML et al., 2010). Para que haja

uma adequada epitelização, é necessário que haja um ambiente úmido, nutrição

vascular suficiente e um adequado controle bacteriano (ENOCH e LEAPER, 2007).

25

1.1.4 Remodelação

Sete dias após o início do processo de reparo, a inibição por contato induz

a transformação de fibroblastos em miofibroblastos. Os miofibroblastos contêm feixes

de actina, semelhantes às encontradas em células da musculatura lisa, que começam

a se contrair diminuindo assim o leito da ferida. Essa contração pode perdurar por

várias semanas e continua mesmo após o fechamento completo da ferida (NAWAZ e

BENTLEY, 2010; KONDO e ISHIDA, 2010). Uma das características da remodelação

é a mudança da composição da ECM. Durante o processo de reparo, o colágeno

sintetizado e depositado de forma aleatória é então remodelado em um delicado

equilíbrio de síntese (colágeno tipo I, mais resistente) e degradação (colágeno tipo III),

até voltar a proporção normal. O tecido cicatrizado não possuirá a mesma resistência

que possuía antes da lesão, sua resistência pode chegar a 80% do que era antes do

trauma (GOLDBERG e DIEGELMANN, 2010; WILD et al., 2010).

1.2 TRIANCINOLONA ACETONIDA

A triancinolona acetonida é um glicocorticóide sintético potente, de ação

prolongada que age suprimindo a resposta inflamatória por meio da inibição da síntese

dos principais produtos inflamatórios, a prostaglandina e leucotrieno (CHOI et al.,

2013; KUO et al., 2013).

O uso da triancinolona na odontologia está relacionado com o alívio do

desconforto, o que se dá principalmente pela formação de uma película sobre a lesão

por meio do veículo empregado na formulação do medicamento. A posologia utilizada

no tratamento das afecções inflamatórias orais é de 01mg/g (0,1%) e apresenta taxa

de absorção de 36% em tecido hígido, sendo sua absorção aumentada em tecido

lesado e/ou inflamado. O uso deste fármaco em mucosa oral pode apresentar efeitos

sistêmicos, bem como as reações adversas associadas ao uso de glicocorticóide

(FANI et al., 2012).

26

Efeitos colaterais relacionados ao uso tópico da triancinolona acetonida são

ardor, prurido, irritação, ressecamento, foliculite, hirsutismo, hiperpigmentação,

dermatite perioral, dermatite alérgica de contato, infecções secundárias e atrofia

tecidual (FANI et al. 2012), além dos efeitos sistêmicos associados ao uso contínuo

de corticoesteróides, como supressão adrenal, alteração do metabolismo de glicose,

lipídios e proteínas, hipotrofia hipocampal e disfunção cognitiva (CIRIACO et al., 2013)

1.3 ECHINODORUS MACROPHYLLUS (KUNTH) MICHELI

O EM são plantas herbáceas perenes, aquáticas, pertencentes à família

Alismataceae, encontradas quase que exclusivamente no continente sul-americano.

Estudo morfológico a descrevem como uma planta com folha peciolada, oval, de base

cordiforme e aguda ou acuminada no ápice, limbo inteiro, de cor verde-escura,

comprimento de 20 a 40 cm, largura de 15 a 35 cm na região próxima à base, de

superfície rugosa, áspera, com 11 a 13 nervuras principais, salientes na página

inferior, pecíolo longo, coriáceo, medindo até 70 cm de comprimento, sulcado

longitudinalmente e provido de estrias longitudinais e com flores brancas,

hermafroditas, perfeitas, numerosas, dispostas em racimos alongados (LEITE et al.,

2007).

As folhas do EM são utilizadas na forma de infusão ou decocto,

popularmente, no tratamento de artrite, reumatismo (LOPES et al., 2000), diurético,

doenças hepáticas (KOBAYASHI et al., 2000), doenças respiratórias e anti-

inflamatório (TANUS-RANGEL et al., 2010). Estudos fitoquímicos realizados

demonstraram a presença de metabólitos secundários diterpenos (KOBAYASHI et al.,

2000a, KOBAYASHI et al., 2000b; SHIGEMORI et al., 2002), polifenóis, alcalóides

(PINTO et al., 2007), triterpenos, esteróides, flavonas, flavonóis e xantona (TANUS-

RANGEL et al., 2010).

Os efeitos medicinais de diversos compostos fenólicos já são conhecidos,

tais como, antibacteriano, hepatoprotetor, anti-inflamatória, anticâncer, antiviral e

antioxidante (KUMAR e PANDEY, 2013). Aos alcalóides são relatadas atividades

biológicas diversas, entre elas antitumoral, anticolinérgico, diurético,

simpaticomimética, antiviral, anti-hipertensivos, hipnoanalgesico, antidepressivo,

27

miorrelaxante, antimicrobiana, antiemético e anti-inflamatórias (NASCIMENTO et al.,

2015). Aos terpenóides creditam-se atividades biológicas analgésica, anti-

inflamatória, antibacteriana, antifúngica, antimalariana, anti-hipertensiva, hemolítica,

anticancerígenas e antioxidante (KASHANI et al., 2012).

Lopes et al. (2000), realizaram uma avaliação toxicológica do extrato

aquoso da folha de EM em diferentes ensaios in vitro. No teste de mutagênicidade,

não houveram alterações nos ensaios utilizando doses de até 50 mg de extrato

aquoso liofilizado. Quanto ao teste de citotoxicidade, quando utilizada concentrações

até 7,5 mg/mL de extrato bruto, não apresentou atividade citotóxicas. Observaram

também que doses de até 1 mg/mL de extrato foram estimulantes ao crescimento

celular. Nesse mesmo estudo foi realizado teste in vivo, a fim de observar os efeitos

acumulativos de ingestão contínua do extrato de EM (liofilizado e bruto). Os autores

observaram que a exposição de 23 mg/Kg, equivalente a dose diária recomendada

para os humanos, não revelou qualquer efeito genotóxico.

Pinto et al. (2007) analisaram em seu trabalho, os efeitos

imunossupressores do extrato aquoso de EM em diferentes concentrações, avaliando

os efeitos sobre as funções celulares e proliferação celular em linfócitos T e B e,

produção de óxido nítrico. Neste estudo, os autores demonstraram a eficácia do uso

do EM no tratamento das respostas inflamatórias humoral e/ou celular exacerbadas,

como nos processos imunoinflamatórios crônico, doenças autoimunes, enxertos e

transplante.

No estudo de Vidal et al. (2010), foram utilizados ensaios de bactérias de

curto prazo para examinar a genotoxicidade e mutagenicidade do extrato aquoso e da

fração acetato de etila de EM, utilizando concentração de 150 mg. O EM mostrou ser

mutagênico apenas em uma cepa bacteriana e a fração de acetato de etila mostrou

ser genotóxica, tal mutagenicidade e genotoxicidade são creditadas à presença das

agliconas flavonóides luteolina e quecertina.

Tanus-Rangel et al. (2010) realizou um estudo sobre os efeitos anti-

inflamatórios tópicos e sistêmicos do uso de extrato etanólico de EM em diferentes

concentrações (1, 5 e 30 mg/Kg), em diversos modelos experimentais de inflamação

em ratos. Como resultados obtiveram a redução significava do edema, diminuição da

permeabilidade vascular peritoneal e decréscimos acentuados no volume de

exsudado e na migração de leucócitos.

28

Portella et al. (2012) realizaram um estudo avaliando as propriedades

diuréticas e nefroprotetoras do EM e, ao contrário do que se é creditado, o EM não

apresentou atividade diurética e sim antidiurética. Os autores observaram também

que o EM apresentou atividade nefroprotetora no ensaio de lesão renal aguda

induzida por gentamicina.

29

1.4 REFERÊNCIAS

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2. CAPÍTULO 1

Efeito da fração acetato de etila de Echinodorus macrophyllus (Kunth) Micheli na cicatrização de lesão em língua de ratos

2.1 INTRODUÇÃO

34

2.1 INTRODUÇÃO

O reparo tecidual é um processo dinâmico complexo que resulta no

reestabelecimento da continuidade anatômica e funcional (LAZARUS et al., 1994).

Este processo pode ser dividido didaticamente em quatro fases: hemostasia,

inflamação, proliferação, remodelação (EMING et al., 2007). Embora os eventos

sejam organizados em fases distintas, não há limites definidos entre estas fases e os

eventos envolvidos se sobrepõem no tempo (STRONCEK et al., 2008). Por sua vez,

o tratamento de feridas busca o fechamento rápido da lesão de forma a se obter uma

cicatriz funcional e esteticamente satisfatória, embora os mecanismos moleculares e

bioquímicos envolvidos na regulação da reparação tecidual ainda não estejam

completamente elucidados (PARK e BARBUL, 2004).

O reparo tecidual na cavidade oral é um fenômeno frequente, decorrente

de trauma físico, químico ou térmico, extrações dentárias e manifestações orais de

doenças sistêmicas (LANKARANI et al., 2013; CARROZZO e SCALLY, 2014).

Geralmente, as fases da cicatrização de lesão na mucosa apresentam redução na

duração, na expressão gênica e proteica, quando em comparação à cicatrização das

feridas em pele (Chen L et al., 2010). Os epitélios oral e da pele apresentam

semelhanças histológicas, dependendo da localização. Na cavidade oral de humanos

e ratos, são epitélios queratinizados, o dorso da língua, palato duro e gengiva inserida,

sendo considerados bons meios para estudos (TURABELIDZE et al., 2014).

Diversos fármacos são utilizados no auxílio da cicatrização de feridas na

mucosa oral, dentre eles encontramos a triancinolona acetonida, utilizado com

sucesso no alívio dos sinais e sintomas de diversas condições inflamatórias orais

(NICOLAZZO et al., 2005). A triancinolona acetonida é um glicocorticóide sintético

potente, de ação prolongada que age suprimindo a resposta inflamatória por meio da

inibição da síntese dos principais produtos inflamatórios, a prostaglandina e

leucotrieno (CHOI et al., 2013; KUO et al., 2013). Seu uso pode apresentar efeitos

adversos locais, tais como dermatite alérgica, infecções secundárias e atrofia tecidal;

(FANI et al. 2012) e sistêmicos, como supressão adrenal, alteração do metabolismo

de glicose, lipídios e proteínas, hipotrofia hipocampal e disfunção cognitiva (CIRIACO

et al., 2013), associados ao uso contínuo e prolongado da medicação.

35

O uso de plantas para fins medicinais está cada vez mais difundido,

principalmente por serem creditadas como sendo benéficas e livres de efeitos

adversos, no entanto, parte das informações disponíveis sobre várias ervas

medicinais necessitam de maior embasamento científico para sua utilização (LOPES

et al., 2000). Os efeitos medicinais obtidos das plantas são decorrentes da presença

e ação de compostos orgânicos, denominados metabólitos secundários. Tais

compostos podem ser específicos à uma espécie ou geral, produzidos frente à um

estímulo específico e contribuem na interação da planta com o ambiente envolvido,

por meio de mecanismos de ação antioxidante, antirradicais livres, ajudam na

absorção de raios UV e agem como agentes antiproliferativos (KENNEDY e

WIGHTMAN, 2011).

A planta Echinodorus macrophyllus (Kunth) Micheli (EM) é uma planta

perene, aquática, da família Alismataceae, conhecida popularmente como chapéu de

couro e utilizada na medicina popular na forma de decocto ou infusão das folhas no

tratamento de artrite, reumatismo (LOPES et al., 2000), diurético, hepatite

(KOBAYASHI et al., 2000), doenças respiratórias e anti-inflamatório (TANUS-

RANGEL et al., 2010). Estudos fitoquímicos da espécie demonstraram a presença de

metabólitos secundários terpenóides, compostos fenólicos (LEITE et al., 2007;

TANUS-RANGEL et al. 2010, VIDAL et al. 2010) e alcalóides (PINTO et al. 2007).

Baseados nas evidências, é objetivo do presente estudo avaliar o potencial

de cicatrização de ferida na mucosa oral, da fração acetato de etila do EM em

diferentes concentrações.

2.2 MATERIAIS E MÉTODOS

37

2.2 MATERIAIS E MÉTODOS

2.2.1 MATERIAL VEGETAL E OBTENÇÃO DO EXTRATO DA PLANTA

O material utilizado na pesquisa foi fornecido pelo Departamento de

Química da Universidade Federal de Mato Grosso – UFMT, em sua forma liofilizada,

obtidos através do processamento seguinte.

As folhas de EM foram secas em temperatura ambiente durante sete dias.

Após a secagem, o material botânico foi separado do limbo e triturado em moinho de

facas, sendo posteriormente tamisado e armazenado ao abrigo da luz e do calor. O

método utilizado para a produção do extrato bruto foi a percolação, utilizando o pó das

folhas e álcool etílico 80ºGL como solvente extrator. Após o processo, o percolado foi

seco com o auxílio de rotavapor, obtendo-se o extrato seco. O extrato seco foi

resuspenso em água destilada, transferido à um funil de separação e submetido à

extração por solventes por ordem crescente de polaridade (hexano, diclorometano e

acetato de etila) até obtenção da fração acetato de etila do EM (FaeEm). A FaeEm foi,

em seguida, submetida ao processo de liofilização e armazenado em geladeira até

sua utilização. O rendimento do resíduo liofilizado foi de aproximadamente 10%.

2.2.2 ANIMAIS

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Uso de Animais –

Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de Cuiabá sob o protocolo nº

010/2014 (Anexo A).

Neste estudo foram utilizados 50 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos,

jovens, com peso médio de 275 g, ± 25g, fornecidos pelo biotério da Universidade de

Cuiabá - UNIC. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas, 05 animais por

gaiola, em ambiente com controle de temperatura e ciclo dia/noite bem definidos

(12/12), ração própria para a espécie e água ad libitum. Os animais selecionados

passaram por um período observacional de dois dias para análise do estado geral de

38

saúde e comportamental e, previamente ao procedimento cirúrgico, mantidos sob

jejum alimentar e hídrico por 12 horas.

2.2.3 FORMULAÇÕES EXPERIMENTAIS E PERÍODOS OBSERVACIONAIS

Para a produção das medicações utilizadas no estudo, o extrato liofilizado

da FaeEm foi então pesado em balança analítica de alta precisão (Q500L210C,

Quimis, Diadema, SP, Brasil), e em seguida, solubilizado em solvente Dimetilsulfóxido

2%, obtendo diferentes concentrações da fração (25 mg/mL, 50 mg/mL e 100 mg/mL).

Para este estudo foi utilizado o princípio ativo da medicação sintética, Triancinolona

Acetonida, na forma líquida, na mesma concentração encontrada na formulação

orabase 100 mg/mL (0,1%).

Os animais foram divididos igualmente e aleatoriamente em cinco grupos,

conforme a medicação utilizada, e devidamente identificados: Grupo 1 (G1) – controle

negativo (Soro Fisiológico 0,9%); Grupo 2 (G2) – FaeEm 25 mg/mL; Grupo 3 (G3) –

FaeEm 50 mg/mL; Grupo 4 (G4) – FaeEm 100 mg/mL; Grupo 5 (G5) – Triancinolona

acetonida 1 mg/mL. Cada grupo foi divido em dois subgrupos, referentes ao período

observacional: Subgrupo A – 03 dias e Subgrupo B – 07 dias.

2.2.4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia geral, por

meio de cloridrato de cetamina (90 mg/Kg) e cloridrato de xilazina (10 mg/Kg) via

intramuscular. Utilizando Punch metálico de 6mm de diâmetro e 1mm de profundidade

confeccionou-se a ferida em dorso de língua, a 5mm do ápice da língua. A primeira

administração da medicação ocorreu imediatamente após o procedimento cirúrgico e

obtenção da hemostasia, por meio de irrigação de 50 µL da medicação pertinente a

cada grupo, com aplicação tópica a cada 24 horas. Após o procedimento cirúrgico, os

animais foram recolocados em gaiolas limpas, com água e ração própria para espécie,

ad libitum.

39

Decorridos os períodos experimentais os animais foram eutanasiados por

meio de superdosagem inalatória com complementar deslocamento cervical, pesados

e removida amostra do tecido cicatricial por de incisão em base de língua, utilizando

tesoura cirúrgica curva (Quinelato, Rio Claro – SP, Brasil).

2.2.5 PREPARAÇÃO DOS ESPÉCIMES PARA A MICROSCOPIA DE LUZ E

ANÁLISE HISTOLÓGICA

Após a análise macroscópica os espécimes foram acondicionados em

recipientes contendo formol 10% e encaminhado para processamento histológico.

Para o estudo foi realizada a técnica histológica de rotina (desidratação, diafanização

e inclusão). A partir de cada bloco obteve-se lâminas de 5 µm de espessura de cada

espécime por meio de micrótomo rotativo e coradas por Hematoxilina-Eosina (HE).

Após as colorações, os espécimes foram analisados por um examinador calibrado,

utilizando microscópio de luz e, análises quantitativas do infiltrado inflamatório (INF),

células polimorfonucleares (PMN), neovascularização (NEO), edema (EDE) e

reepitelização (REP) foram realizadas e classificadas de acordo com escores pré-

definido em: Ausente (-); Discreto (+); Moderado (++); Acentuado (+++) (GARROS et

al.2006).

2.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados apresentados foram analisados por meio da Análise de Variância

de uma via (ANOVA one way), utilizando o teste de Duncan, por meio do programa

SPSS (IBM, Nova York, EUA). O critério de significância estatística foi estabelecido

em p < 0,05.

2.3 RESULTADOS

41

A B D

G1

G2

G3

C

2.3 RESULTADOS

Análises histológicas dos espécimes foram realizadas, as características

histológicas observadas (Figura 1) foram transformadas em parâmetros quantitativos,

classificadas conforme escores pré-definidos e os valores médios obtidos e descritos,

conforme observado na Tabela 1.

Figura 1: Aspectos histomorfológicos dos grupos experimentais nos períodos de 3 e 7 dias. Aspectos histológicos do processo de reparo, em todos os grupos, nos períodos de 3 (A e B) e 7 (C e D) dias. Aumentos com objetivas de 10x (A e C) e 40x (B e D). G1: SF 0,9%; G2: FaeEm 25mg/mL; G3: 50mg/mL; G4: 100mg/mL; G5: Triancinolona acetonida 0,1%. INF: Infiltrado Inflamatório; PMN: Concentração de células polimorfonucleares; ED: Edema; NEO: Vasos neoformados; REP: Reepitelização.

G4

G5

42

Nas análises histológicas dos grupos experimentais no período de três dias,

apenas o G3 apresentou INF discreto, enquanto os demais grupos apresentaram INF

moderado. A quantidade de PMN apresentou-se moderada e equivalente entre os

grupos. Os grupos G3 e G4 apresentaram EDE discreto e os demais grupos

apresentaram-se EDE moderado. A variável NEO não apresentou resultados

significantes em nenhum dos grupos observados. A REP em todos os grupos

encontrava-se em sua fase inicial, sendo considerada discreta.

Nas análises histológicas dos grupos experimentais do período de sete dias

observou-se que G3 e G4 apresentaram menor INF em comparação aos demais

grupos. A presença de PMN mostrou-se insignificante para todos os grupos

experimentais, assim como a variável EDE. Em relação à NEO, o G1 apresentou os

menores índices de vasos neoformados, enquanto os demais grupos apresentaram

NEO moderada. Os grupos G3 e G5 apresentaram índices de REP acentuados,

enquanto os demais grupos apresentaram índices moderados.

Tabela 1 – Análise histológica quantitativa dos grupos experimentais, conforme escore pré-definidos*

Grupos Experimentais***

Período Variável** G1 G2 G3 G4 G5

3 DIAS

INF ++ ++ + ++ ++ PMN ++ ++ ++ ++ ++ EDE ++ ++ + + ++ NEO - - - - - REP + + + + +

7 DIAS

INF ++ ++ + + ++ PMN - - - - - EDE - - - - - NEO + ++ ++ ++ ++ REP ++ ++ +++ ++ ++

* (-) Ausente; (+) Discreto; (++) Moderado; (+++) Acentuado. ** INF: Infiltrado Inflamatório; PMN: Células Polifmorfonucleares; EDE: Edema; NEO: Neovascularização; REP: Reepitelização. *** G1: SF 0,9%; G2: FaeEm 25mg/mL; G3: 50mg/mL; G4: 100mg/mL; G5: Triancinolona acetonida 0,1%.

Os dados obtidos nas análises histológicas foram transformados em

parâmetros numéricos e submetidos a Análise de Variância de uma via (ANOVA One

Way), representados na Tabela 2.

43

Tabela 2 – Demonstração das Médias e Desvio Padrão dos grupos avaliados no estudo, no período de 3 dias e 7 dias.

Período Variável***

Grupos experimentais**

G1

Média ± DP

G2

Média ± DP

G3

Média ± DP

G4

Média ± DP

G5

Média ± DP

3 D

ias

INF A 2,00 ± 0,00 A 2,00 ± 0,70 A 1,20 ± 0,44 A 1,80 ± 1,09 A 1,80 ± 0,44 PMN A 1,60 ± 0,54 A 1,80 ± 0,44 A 1,60 ± 0,89 A 1,80 ± 0,83 A 2,40 ± 0,54 EDE C 2,00 ± 0,00 BC 1,80 ± 0,44 A 1,20 ± 0,44 AB 1,40 ± 0,54 C 2,00 ± 0,00 NEO A 0,40 ± 0,54 A 0,40 ± 0,54 A 0,40 ± 0,54 A 0,40 ± 0,54 A 040 ± 0,54 REP A 1,00 ± 0,00 A 1,00 ± 0,00 A 1,00 ± 0,00 A 1,00 ± 0,00 A 1,00 ± 0,00

7 D

ias

INF AB 1,60 ± 0,54 B 2,00 ± 0,70 A 1,00 ± 0,00 A 1,00 ± 0,00 AB 1,60 ± 0,89 PMN A 0,00 ± 0,00 A 0,20 ± 0,44 A 0,00 ± 0,00 A 0,00 ± 0,00 A 0,00 ± 0,00 EDE A 0,40 ± 0,54 A 0,40 ± 0,54 A 0,20 ± 0,44 A 0,40 ± 0,54 A 0,40 ± 0,54 NEO A 1,00 ± 0,00 AB 1,80 ± 0,83 AB 1,60 ± 0,54 B 2,20 ± 0,44 AB 1,80 ± 0,83 REP A 2,40 ± 0,54 A 2,20 ± 1,09 A 2,60 ± 0,54 A 2,20 ± 1,09 A 2,40 ±0,54

* Letras em colunas distintas significam diferença estatística pelo teste estatístico de Duncan (p<0,05). ** G1: SF 0,9%; G2: FaeEm 25mg/ml; G3: 50mg/ml; G4: 100mg/ml; G5: Triancinolona acetonida 0,1%. *** INF: Infiltrado Inflamatório; PMN: Células Polifmorfonucleares; EDE: Edema; NEO: Neovascularização; REP: Reepitelização.

44

Para as análises dos grupos experimentais do período de 3 dias,

observamos que as variáveis INF, PMN, NEO e REP não apresentaram diferença

estatisticamente significante entre os grupos. Na variável EDE, os grupos G1, G2 e

G5 apresentaram os maiores resultados encontrados, não apresentando diferença

estatística entre si (p>0,05). Para os grupos G3 e G4, observou-se os menores

resultados e não apresentaram diferença entre si (p>0,05). Ao observar os grupos G2

e G4, não houve diferença estatística entre si (p>0,05), porém quando comparados

aos demais grupos, apresentaram-se significância estatística (p<0,05).

Nas análises dos grupos experimentais do período de 7 dias, as variáveis

PMN, EDE e REP não apresentaram significância estatísticas quando comparado os

grupos experimentais. Os grupos G3 e G4 apresentaram INF menores e

estatisticamente significantes (p<0,05) em comparação ao G2, enquanto G1 e G5 não

demonstraram diferença significante entre todos os grupos. Quanto à NEO, o G1

apresentou menores índices de neoformação vascular e o G4 apresentou os melhores

índices, demonstrando significância (p<0,05) entre os grupos, enquanto G2, G3 e G5

apresentaram-se estatisticamente iguais a todos os grupos.

2.4 DISCUSSÃO

46

2.4 DISCUSSÃO

As terapias coadjuvantes ao reparo tecidual são amplamente utilizadas,

visando otimizar o processo de cicatrização e minimizar o dano tecidual, provendo

adequada oxigenação e nutrição ao tecido, além de favorecer um ambiente úmido

adequado para o reestabelecimento da continuidade anatômica e funcional do tecido.

Para tal, diversas técnicas terapêuticas foram desenvolvidas ao decorrer dos anos

visando melhores resultados na cicatrização, tais como, medicações tópicas

(ZEGARELI et al., 1960; DU et al. 2014), terapia ultrassônica (POSPISILOVÁ, 1976;

MAEDA et al., 2013), terapia com laser de baixa potência (MESTER et al., 1971;

GALAYANI et al., 2013) e a retomada nas pesquisas de uso de produtos naturais

(AMORIM, et al., 2006; KOKANE et al., 2009 DUARTE et al., 2011). Apesar da

predominância de fármacos comercialmente disponíveis com essas propriedades, o

uso de plantas medicinais que apresentem tais propriedades deve ser considerado

uma alternativa pois, além de ser um produto de baixo custo, fácil acesso e

manipulação, proporcionam pouco ou nenhum efeito colateral (DUARTE et al., 2011;

KOVALIK et al., 2014).

Os corticoesteróides são amplamente utilizados no tratamento tópico de

lesões em boca mas, apesar da via de administração, podem apresentar efeitos

adversos (CHOI et al., 2013). A triancinolona acetonida é um corticoesteróide

frequentemente utilizado no tratamento das afecções orais, principalmente por

oferecer conforto ao paciente durante o processo de reparo. No presente estudo, a

triancinolona acetonida utilizada no experimento foi manipulada na forma líquida para,

além de manter-se o mesmo padrão de aplicação das medicações experimentais,

poder-se analisar o efeito terapêutico do princípio ativo (CHOI et al., 2013).

O punch é um instrumento cirúrgico amplamente utilizado na literatura,

tanto para confecção de feridas em pele (AMORIM et al., 2006; Santos et al., 2006,

SÜNTAR et al., 2010; CHOI et al., 2013) quanto em mucosa oral (CAMACHO-

ALONSO et al., 2005; CAVALCANTE et al. 2011; DUARTE et al. 2011; CHOI et al.,

2013; KOVALIK et al., 2014), pois favorece a padronização do tamanho da ferida a

ser estudada (CAMACHO-ALONSO et al., 2005; CAVALCANTE et al. 2011), sendo

utilizado nos procedimentos cirúrgicos nesta pesquisa.

47

No presente estudo, optou-se pela realização da ferida em língua de rato

pois, além da mucosa oral passar pelos mesmo processos do reparo tecidual que a

pele, apresenta epitélio queratinizado, semelhante à pele, tornando-a propícia aos

estudos de cicatrização (TURABELIDZE et al., 2014). A cicatrização de feridas na

cavidade oral são exemplos de reparação que resultam em regeneração tecidual e,

estudos mais profundos dos mecanismos envolvidos na reparação tecidual da mucosa

oral podem levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas que possam otimizar a

cicatrização de feridas cutâneas (JOHNSON et al., 2014).

A planta Echinodorus macrophyllus foi escolhida para este estudo por ser

uma planta de uso popular difundido apesar da pouca evidência científica acerca das

suas funções terapêuticas (LEITE et al. 2007). Embora pesquisas utilizando plantas

medicinais no tratamento de lesões em boca sejam realizadas frequentemente

(DUARTE et al., 2011; KOVALIK et al., 2014; TSAI et al., 2015), não há descrito na

literatura estudos relatando os efeitos do EM sobre o reparo tecidual. Este trabalho foi

realizado para avaliar os efeitos do Echinodorus macrophyllus na cicatrização de lesão

em língua de rato, visando a fundamentar cientificamente o uso desta planta na

otimização da cicatrização.

Poucos estudos envolvendo o EM foram realizados até o momento, dentre

eles identificam-se estudos fitoquímicos (KOBAYASHI et al., 2000a, KOBAYASHI et

al., 2000b, SHIGEMORI et al., 2002; TANUS-RANGEL et al., 2010), determinação da

presença de metais e metaloides (BARBOSA et al., 2013), avaliação de níveis

toxicológicos in vitro (LOPES et al., 2000; VIDAL et al., 2010) e in vivo (LOPES et al.,

2000), análise dos efeitos imunossupressivo (PINTO et al., 2007), nefroprotetor,

diurético (PORTELLA et al. 2012) e anti-inflamatório (TANUS-RANGEL et al.,2010),

de diferentes extratos e em diversas concentrações.

Estudos fitoquímicos da espécie demonstraram a presença de metabólitos

secundários terpenóides (KOBAYASHI et al., 2000a, KOBAYASHI et al., 2000b;

SHIGEMORI et al., 2002), compostos fenólicos (LEITE et al., 2007; TANUS-RANGEL

et al. 2010, VIDAL et al. 2010) e alcalóides (PINTO et al. 2007). Estes compostos

orgânicos são capazes de promover a um melhor reparo devido às suas propriedades

antimicrobianas, anti-inflamatórias, antioxidantes e adstringentes, demonstradas em

vários modelos de estudos in vivo e in vitro, tornando-os objetos promissores para o

desenvolvimento de novas drogas pró-reparadoras, com ação dirigida às proteínas

48

associadas ao reparo tecidual (BUDOVSKY et al., 2015). A fração de acetato de etila

de EM foi utilizada no estudo por apresentar, em sua composição, metabólitos

secundários terpenóides e flavonóides, ambas com ação anti-inflamatória

reconhecidas (KASHAMI et al. 2012).

No presente estudo, foram utilizadas três concentrações diferentes da

planta (25, 50 e 100 mg/mL), baseado na literatura pesquisada onde, em testes in

vitro, concentrações de até 50 mg de extrato aquoso não apresentaram nenhuma

atividade mutagênica (LOPES et al. 2000) e em testes in vivo, a genotoxicidade em

células hepáticas, renais e sanguíneas de diferentes concentrações (3, 23 e 297

mg/Kg de extrato liofilizado e 2200 mg/Kg de extrato bruto) foram avaliadas, não

apresentando toxicidade para as células hepáticas e sanguínea. As células renais

apresentaram atividade genotóxica para a dose maiores que 23 mg/kg. (LOPES et al.,

2000). A fração acetato de etila de EM, em ensaios bacterianos de curto prazo,

apresentou mutagenicidade e genotoxicidade em concentração de 150mg (VIDAL et

al., 2010). As doses das medicações utilizadas no presente estudo consistiam de 1,25

mg/kg, 2,5 mg/kg e 5 mg/kg respectivamente para os grupos G2, G3 e G4. Tais doses

encontram-se dentro dos valores recomendados de 23 mg/kg para o uso diário

contínuo (LOPES et al., 2000; PINTO et al., 2007).

Para avaliação do processo de reparo, foram realizadas análises

histológicas do tecido em reparo em que INF, PMN, EDE, NEO, REP foram avaliados

de acordo com a intensidade em que foram encontrados e transformados em variáveis

quantitativas pré-definidas (GARROS et al., 2006). Os animais do G1 foram tratados

com solução inerte (soro fisiológico 0,9%) e utilizados como parâmetro de comparação

às medicações utilizadas no estudo (grupo controle negativo).

Nos animais do período de 3 dias foi observado que o G1 apresentou um

INF moderado com PMN discreto, EDE difuso e moderado, NEO ausente e REP em

sua fase inicial, localizada apenas nos bordos da ferida. Dados obtidos nos animais

do G2, com exceção da concentração de PMN que mostrou-se aumentada

(moderado), demonstraram que as demais variáveis apresentaram valores

semelhantes aos encontrados no G1. O G3 foi o grupo em que observou-se a maior

quantidade de resultados diferentes em relação ao G1, nele, observou-se menor INF,

maior concentração de PMN e menor formação de EDE. O G4 apresentou maior

concentração de PMN e menor formação de EDE em relação ao G1 e, por fim, o G5

49

apresentou apenas maior concentração de PMN do que o G1. As variáveis NEO e

REP não apresentaram diferenças histológicas e estatísticas significativas entre os

grupos.

No período de 3 dias, mesmo com diferenças histológicas observadas entre

os grupos, em todas as variáveis analisadas, apenas os resultados observados no

EDE apresentaram significância estatística (p<0,05). Observou-se três níveis de

formação de edema em que o G3 apresentou o menor edema, G2 e G4 valores

médios e o G1 e G5 os maiores edemas observados. Tais resultados obtidos em

nosso trabalho corroboram para com os dados encontrados na literatura em que,

estudos com ratos com pleurisia e edema de pata induzidos por carragenina e edema

de pata induzido por dextrana, tratados com extrato etanólico de EM, apresentando

significativa redução da permeabilidade vascular e do edema formado (TANUS-

RANGEL et al., 2010).

Essa resposta antiedema é resultado da capacidade de suprimir a

biossíntese de prostaglandina a partir do ácido araquidônico, por meio da inibição da

cicloxigenase, no entanto, mesmo que a migração celular seja influenciada pelo

aumento do fluxo plasmático devido ao aumento da permeabilidade vascular, a

prostaglandina não está diretamente relacionada à resposta quimiotáxica (TANUS-

RANGEL et al., 2010), o que justifica a semelhança estatística encontrada entre os

grupos, nas análises de concentração de PMN e INF.

A REP, assim como a NEO, nos animais de 3 dias, encontrava-se em sua

fase inicial, apresentando valores histológicos discretos em todos os grupos e sem

significância estatística entre eles.

Nos animais do período de 7 dias observou-se que os animais do G1

apresentavam INF moderado sem presença de PMN, ausência de EDE, NEO discreta

e intensa REP. No G2 observou-se maior NEO porém, a REP encontrava-se menos

acentuada do que os resultados observados no G1. O escore observado no G3

apresentou, em relação ao G1, menor INF remanescente e maior NEO embora não

apresentarem diferença estatística entre eles. Assim como o G3, o G4 apresentou

menor INF e maior NEO embora, sendo a NEO estatisticamente significante (p<0,05)

em relação ao G1. O G5 apresentou apenas uma NEO melhor que a observada no

G1, e os demais resultados mostraram-se semelhantes aos encontrados no G1. No

50

período de 7 dias, as variáveis PMN e EDE apresentaram valores insignificantes,

quando não, ausentes, equivalentes para todos os grupos.

Estatisticamente observou-se significância (p<0,05) nas variáveis INF e

NEO apenas ao final de 7 dias de tratamento. Os grupos G3 e G4 apresentaram menor

INF e o G2 o maior INF observado, embora os valores observados no G2 sejam

estatisticamente iguais aos observados no G1 e G5. Em relação à NEO, o G4 foi o

grupo que apresentou a maior quantidade de vasos formados e o G1, a menor

quantidade, sendo eles estatisticamente diferentes (p<0,05). Com valores médios, G2,

G3 e G5 apresentaram-se estatisticamente equivalentes a todos os grupos.

Observou-se que a triancinolona (G5), com exceção da NEO no período de

7 dias, não apresentou diferenças histológicas e estatisticamente apresentou-se igual

nos parâmetros analisados, em comparação com o grupo controle (G1),

representando não possuir melhora significativa no processo de reparo, dados

similares encontrados por CHOI et al. (2013). Em contrapartida, observou-se que os

grupos tratados com EM (G3 e G4) apresentaram, no contexto geral, uma melhor

modulação do processo inflamatório, com discreta melhora no processo de reparo,

observados nas avaliações histológicas e estatísticas.

Apesar dos resultados encontrados neste trabalho, mais estudos devem

ser realizados para uma futura aplicação clínica segura do EM, no tratamento de

lesões em mucosa oral.

2.5 CONCLUSÃO

52

2.5 CONCLUSÃO

Diante dos resultados obtidos, conclui-se que:

I. O G3 (50mg/mL) e G4 (100mg/mL) apresentaram maior atividade

antiedema durante a fase inicial do reparo (período de 3 dias), em

comparação aos grupos controle negativo (G1) e positivo (G5).

II. No período de 7 dias, o G4 (100mg/mL) apresentou maior

neoformação vascular em relação ao processo normal de reparo

(G1).

III. Não houveram diferenças significativas nos resultados nas demais

variáveis analisadas, em ambos os períodos observacionais.

Os resultados obtidos neste estudo validam o uso de Echinodorus

macrophyllus, do ponto de vista laboratorial, como coadjuvante no tratamento das

afecções inflamatórias em boca.

2.6 REFERÊNCIAS

54

2.6 REFERÊNCIAS

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2.7 ANEXOS

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2.7 ANEXOS

ANEXO A: Parecer do Comitê de Ética.

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Efeito da fração acetato de etila do Echinodorus macrophyllus … · Maria Fábio Aranha, além de professora, uma amiga, sempre ajudando nos momentos de dúvida. Ao Magnífico