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EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE
SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE
OÓCITOS BOVINOS
SÍLVIA GONSALVES DE CARVALHO MATTA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
JULHO-2006
2
EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE
SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE
OÓCITOS BOVINOS
SÍLVIA GONSALVES DE CARVALHO MATTA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Produção Animal.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Clara Caldas Bussiere
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ jULHO – 2006
3
EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE
SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE
OÓCITOS BOVINOS
SÍLVIA GONSALVES DE CARVALHO MATTA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Produção Animal.
Aprovada em 27 de julho de 2006
Comissão Examinadora
Prof. Luiz Altamiro Garcia Nogueira (Reprodução Animal) - UFF _______________________________________________________________ Prof. Reginaldo da Silva Fontes (Reprodução Animal) - UENF Profa. Celia Raquel Quirino (Melhoramento Genético Animal) – UENF Profa . Maria Clara Caldas Bussiere (Doutora, Fisiologia Animal) – UENF
(Orientadora)
4
Alguma coisa por acontecer.
Silêncio. Frio. Noite estrelada.
Belém dorme tranqüila, sem saber
Da hora que a sua noite traz, guardada...
Alguma coisa. É o que parece ser?
Silêncio. Quietude. Madrugada.
A noite leve faz perecer
Nenhuma coisa guardada.
Alguma coisa. E nada há de conter.
Como se milimetricamente calculada.
Que certamente há de ver quem é de ver
E há de escutar quem traz a alma alinhada.
Quem ousa, em sã consciência, desdizer?
Que palavra não cala, encabulada?
Que sacerdote? Que Império? Que poder?
Que humanidade necessitada?
Alguma coisa. Porque Deus querer
É o mesmo que uma ordem executada.
Alguma coisa. Dá pra perceber.
Silêncio. Frio. Noite abençoada.
Luís Alberto Mussa Tavares
ii
5
A Deus, que foi o início de tudo;
Ao meu pai e à minha mãe que, me deram a vida e oportunidade de estudar,
mostrando-me o melhor caminho, a educação...
Ao meu esposo e aos meus filhos, pelo amor, carinho, compreensão e força para
continuar...
Dedico
iii
6
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), pelo oferecimento deste curso.
À UENF, pela concessão da bolsa de estudo.
À minha orientadora, pela sua valiosa orientação, competência, incentivo e
exemplo de dedicação profissional. Um agradecimento mais do que especial pelos
ensinamentos e credibilidade.
Aos professores Reginaldo da Silva Fontes e Ângelo Burla Dias, pela atenção e
apoio na realização do trabalho.
À professora Celia Raquel Quirino, pela orientação nas análises estatísticas, boa
vontade e pelos encontros nos feriados e finais de semana.
Os meus sinceros agradecimentos à minha amiga Kelen Salaroli Viana, pelo
seu companheirismo, dedicação, fidelidade, sugestões e ajuda durante todo o meu
trabalho.
À minha amiga Carla Sobrinho Paz de Carvalho, pela sua competência e
experiência profissional e importante participação nas pesquisas.
A todos os membros da Coordenação de Pós-Graduação Animal, em especial
a Jovana e a Etiene, pela disponibilidade nas informações.
iv
7
Aos funcionários da biblioteca do CCTA, pelos empréstimos concedidos
durantes todos esses anos.
À minha amiga Márcia Rezende Faes, pelo carinho e amizade.
Aos bolsistas de apoio do laboratório de Melhoramento Genético Animal, do
setor de Reprodução Animal, pela preparação de material necessário para a realização
deste trabalho.
Aos amigos João, Steeven, Vitor, Luís, Leonardo, Janaína, Bianca, Reubes,
Vanessa, Helga, Georgina, Patrícia, Camila e Fernanda, pelo carinho e convívio no
laboratório.
A Deus, por ter dado força de vontade para continuar, apesar das dificuldades
encontradas, e pela oportunidade de chegar até aqui.
v
8
BIOGRAFIA
Sílvia Gonsalves de Carvalho Matta, filha de Mário Leite de Carvalho Júnior e
Maria Madalena de Souza Gonsalves, nasceu em 17 de fevereiro de 1973, na cidade
de Campos dos Goytacazes – RJ.
Concluiu o segundo grau no curso Científico da Escola Estadual Liceu de
Humanidades de Campos, em, 1992. Em janeiro de 1999, concluiu o curso de nível
superior em Medicina Veterinária, na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, sendo que no período entre 01 de agosto de 1997 a 31 de janeiro de 1999, foi
bolsista de Iniciação Científica no setor de Reprodução Animal. Em agosto de 2001,
concluiu o curso de Mestrado em Fisiologia Animal, na Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro.
Foi admitida em agosto de 2001 no Curso de Pós-Graduação em Produção
Animal, Doutorado, Reprodução Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, em Campos dos Goytacazes – RJ, submetendo-se à defesa de tese para
conclusão do curso em julho de 2006.
vi
9
CONTEÚDO
LISTA DE TABELAS.........................................................................................................ix LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................xi LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................xii RESUMO........................................................................................................................xiv ABSTRACT....................................................................................................................xvi 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA................................................................................1 2. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................4 2.1. Maturação oocitária....................................................................................................4
2.1.1. Maturação nuclear...........................................................................................5
2.1.2. Maturação citoplasmática................................................................................7
2.1.3. Maturação molecular.......................................................................................9 2.2. Fatores que afetam a maturação oocitária...............................................................10
2.2.1. Adenosina monofosfato cíclica (AMPc).........................................................10
vii
10
2.2.2. Proteínas envolvidas no controle do ciclo celular.........................................11 2.2.3. Células do cumulus.......................................................................................15 2.2.4. GDF-9............................................................................................................17 2.2.5. Hormônios esteróides: P4 e E2......................................................................18 2.2.6. Óxido nítrico (NO).........................................................................................20
2.2.6.1. Óxido nítrico no sistema ovariano...................................................23
2.2.6.2. Papel do óxido nítrico na maturação oocitária................................25
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................28 4. TRABALHO.................................................................................................................48
4.1. Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina
na maturação in vitro de oócitos bovinos.
RESUMO........................................................................................................................49 ABSTRACT.....................................................................................................................50 INTRODUÇÃO................................................................................................................51 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................53 RESULTADOS................................................................................................................59 DISCUSSÃO...................................................................................................................68 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................74 CONCLUSÔES GERAIS.................................................................................................79
viii
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
expansão das células do cumulus de oócitos bovinos maturados
in vitro por 24 h................................................................................................60
Tabela 02. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
viabilidade das células do cumulus de oócitos bovinos maturados in vitro por
24 h...............................................................................................................62
Tabela 03. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
progressão da meiose de oócitos bovinos maturados in vitro por
24 h.................................................................................................................63
Tabela 04. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
integridade da membrana plasmática de oócitos bovinos maturados in vitro
por 24 h...........................................................................................................64
Tabela 05. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
concentração de NO2- e NO3
-..........................................................................65
ix
12
Tabela 06. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
concentração de hormônios esteróides: 17β-estradiol (E2) e progesterona
(P4)..................................................................................................................66
Tabela 07. Efeito da adição de diferentes concentrações de aminoguanidina na
migração dos grânulos corticais de oócitos bovinos....................................67
Tabela 08. Efeito da adição de aminoguanidina no meio de maturação de oócitos
bovinos in vitro na concentração na taxa de clivagem e formação de
blastocistos (média ± DP).............................................................................68
x
13
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Eventos celulares que ocorrem durante a maturação nuclear em oócitos de
mamíferos.........................................................................................................7
Figura 02. Atividades do MPF e MAPK durante a maturação
nuclear.............................................................................................................13
Figura 01. Efeito da adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação
na expansão das células do cumulus de oócitos
bovinos............................................................................................................61
xi
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AC – Adenil ciclase
AG – Aminoguanidina
AMPc – adenosina monofosfato cíclica
AMPC - PDE – Fosfodiesterase AMPc
AI – Anáfase I
COC – Complexo cumulus oócito
CSF – Fator citostático
Cx43 – Conexina 43
D-NMMA – NG-monometil-D-arginina
E2 – 17β-Estradiol
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial
FIV – Fertilização in vitro
FSH – Hormônio folículo estimulante
GDF-9 – Fator de crescimento e diferenciação do tipo 9
GMPc – guanosina 3’ 5’ - monofosfato cíclica
IBMX – 3-isobutil-1-metil xantina
iNOS – Óxido nítrico sintase induzível
L - NAME – Nw-nitro-L-arginina metil éster
xii
15
LH – Hormônio luteinizante
L-NMMA – NG-monometil-L-arginina
MAPK – MAP cinase
MAPKK – MAP cinase cinase
MAPKKK– MAP cinase cinase cinase
MBP – Proteína básica de mielina
MI – Metáfase I
MII – Metáfase II
MIV – Maturação in vitro
MPF – Fator promotor da maturação
MTOC – Centro de organização de microtúbulos
nNOS - Óxido nítrico sintase neuronal
NO – Óxido nítrico
NO2- – Nitrito
NO3- – Nitrato
NOS – Óxido nítrico sintase
P4 - Progesterona
PIV – Produção in vitro
PKA – Proteína cinase
Pkc – Proteína cinase c
SFB – Soro fetal bovino
SNP – Nitroprussiato de sódio.
TCM – Meio de cultura de tecidos
TI – Telófase I
VG – Vesícula germinativa
VGBD – Rompimento da vesícula germinativa
xiii
16
RESUMO
MATTA, Sílvia Gonsalves de Carvalho, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; julho de 2006; Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina na maturação in vitro de oócitos bovinos; Professor Orientador: Profa Maria Clara Caldas Bussiere.
O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da inibição da enzima óxido
nítrico sintase (NOS) sensível à aminoguanidina (AG) na maturação nuclear e
citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Os COCs foram cultivados com diferentes
concentrações de AG (0, 1, 10 e 100 mM) e 10-5 M de nitroprussiato de sódio (SNP,
doador de NO) adicionado a 100 mM de AG, durante 24 h. No experimento 1, foi
avaliado o grau da expansão das células do cumulus, o estádio de maturação nuclear,
a integridade da membrana plasmática das células do cumulus e do oócito. As
concentrações de NO2-,/NO3
-, P4 e E2 foram determinadas no meio de maturação pelo
método de Griess e por quiluminescência, respectivamente. A adição de diferentes
concentrações de AG no meio de maturação promoveu um efeito dose-resposta na
expansão das células do cumulus de COCs bovinos (P<0,05). A adição de 1 e 10 mM
de AG no meio de MIV não afetou a integridade da membrana plasmática dos oócitos
nem a maturação nuclear (P>0,05), contudo, diminuiu a integridade da membrana das
células do cumulus. A concentração de 100 mM inibiu a transição da metáfase I
xiv
17
(MI) para a metáfase II (MII), promoveu lesão da membrana plasmática dos oócitos
(P<0,05) e aumentou a concentração de NO2-,/NO3
- quando comparada com o controle
(P<0,05) e com 1 e 10 mM de AG (P>0,05). A adição de 10-5 M de SNP a 100 mM de
AG não reverteu os efeitos causados por 100 mM de AG, mas aumentou a
concentração de NO2-/NO3
-. Nenhuma concentração adicionada ao meio de maturação
alterou a concentração de E2. A adição de 100 mM de AG diminuiu a concentração de
P4 (P<0,05), quando comparada ao controle e demais concentrações. Este efeito foi
revertido pela adição de SNP. No experimento 2, foi avaliado o efeito da adição de
diferentes concentrações de AG na maturação citoplasmática in vitro pela avaliação da
taxa de migração dos grânulos corticais, clivagem e produção de blastocistos. Houve
um efeito dose-resposta na migração dos grânulos corticais, onde 1 mM (83,9 ± 6,2%)
não diferiu do controle (83,6 ± 8,2%; P>0,05), 10 mM inibiu parcialmente (3,8 ± 6,4%) e
100 mM inibiu totalmente a migração dos grânulos corticais (P<0,05). A adição de SNP
(10-5 M) não reverteu o efeito inibitório da migração dos grânulos corticais dos oócitos
tratados com 100 mM. Somente as concentrações de AG que não inibiram a MIV foram
utilizadas para avaliar a taxa de clivagem e produção de blastocistos. A adição de 10
mM de AG no meio de maturação diminuiu (73,0 ± 8,1%; P<0,05) a taxa de clivagem e
produção de blastocistos, quando comparada com grupo controle (89,1 ± 3,4%; 37,6 ±
7,3%, respectivamente), mas não diferiu, (P>0,05), do grupo tratado com 1 mM de AG
(80,9 ± 8,4%; 41,5 ± 10,5%, respectivamente). Os resultados do presente experimento
demonstram que o NO derivado da NOS sensível à AG modula a maturação nuclear e
citoplasmática in vitro de oócitos bovinos.
Palavras-chave: óxido nítrico, aminoguanidina, maturação nuclear, grânulos corticais,
desenvolvimento embrionário inicial.
xv
18
ABSTRACT
MATTA, Sílvia Gonsalves de Carvalho, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; julho de 2006; Effects of inhibition of nitric oxide synthase sensitive to aminoguanidine on in vitro maturation of bovine oocytes; Graduate supervisor: Prof. Maria Clara Caldas Bussiere.
The aim of the present study was to investigate the effects of inhibition of the
enzyme nitric oxide synthase (NOS) sensitive to aminoguanidine (AG) on nuclear and
cytoplasmic maturation of bovine oocytes in vitro. COCs were cultured with different
concentrations of AG AG (0, 1, 10 and 100 mM) and to 10-5 M sodium nitroprusside
(SNP, NO donor) associated with 100mM AG for 24h. In experiment 1, the degree of
cumulus cells expansion, nuclear maturation status and plasma membrane integrity of
oocytes and granulosa cells were assessed. NO2-,/NO3
-, P4 and E2 were determined in
culture medium by Griess method and chemiluminescence, respectively. Addition of
different concentrations of AG to maturation medium promoted a dose-response effect
on cumulus expansion (P<0.05). Addition of 1 and 10mM AG to IVM medium did not
affect plasma membrane integrity of oocytes or nuclear maturation rates (P>0.05),
however, plasma membrane integrity was reduced in cumulus cells. One hundred
millimolar inhibited metaphase I (MI) to metaphase II (MII) transition, promoted plasma
xvi
19
membrane damage in oocytes (P<0.05) and increased NO2-,/NO3
- concentration when
compared to controls (P<0.05). Association of 10-5 M SNP to 100mM AG did not reverse
the effects of AG, but increased NO2-/NO3
-concentration. None of the AG concentrations
tested in maturation medium affected E2 concentration. Addition of 100mM AG reduced
P4 concentration (P<0.05) when compared to controls and the other concentrations
used. This effect was reversed by SNP. In experiment 2, the effect of different AG
concentrations on cytoplasmic maturation in vitro was assessed based on cortical
granules migration, cleavage and blastocyst development rates. There was a dose-
effect on cortical granules migration rate, in which 1mM AG (83.9 ± 6.2%) did not differ
from control oocytes (83.6 ± 8.2%; P>0.05), but 10mM partially inhibited (3.8 ± 6.4%)
and 100mM totally inhibited migration (P<0.05). SNP (10-5 M) did not revert this
inhibitory effect on cortical granules migration in oocytes treated with 100mM AG. Only
those concentrations that did not inhibit IVM were used to assess cleavage and
blastocyst rates. Addition of 10mM AG to IVM medium reduced (73.0 ± 8.1%; P<0.05)
cleavage and blastocyst rates when compared with controls (89.1 ± 3.4%; 37.6 ± 7.3%,
respectively), but did not differ, (P>0,05), from the group treated with 1mM AG (80.9 ±
8.4%; 41.5 ± 10.5%, respectively). The results from the present study demonstrate that
NO derived from NOS sensitive to AG modulates nuclear and cytoplasmic maturation of
bovine oocytes in vitro.
Keyword: nitric oxide, aminoguanidine, nuclear maturation, cortical granules, early
embryo development.
xvii
1
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Durante os últimos trinta anos, os estudos clássicos como superovulação,
recuperação e transferência de embriões e avançadas tecnologias embrionárias, como
produção in vitro e clonagem por transferência nuclear de células somáticas, têm
gerado informações sobre estrutura, função e qualidade durante o desenvolvimento do
oócito, na fertilização e no desenvolvimento embrionário (SCHENK et al., 2006). Estas
informações têm gerado novas incertezas, não somente nessas tecnologias, mas
também sobre fatores que contribuem para a fertilidade em bovinos (GREVE e
CALLESEN, 2005; GALLI e LAZZARI, 2005).
Os perfis endócrino folicular e periférico têm uma profunda influência no
subseqüente desenvolvimento da competência do embrião e está estabelecido,
também, que a manipulação de oócitos ou embriões pode, adversamente, afetar o
desenvolvimento embrionário e fetal (GREVE e CALLESEN, 2005; GALLI e LAZZARI,
2005).
A habilidade para a retomada da meiose, clivagem após a fertilização e
desenvolvimento até blastocistos, taxa de prenhez e geração de descendentes
saudáveis são eventos que ocorrem separadamente, mas estão associados a três tipos
de maturação observados no oócito: nuclear, citoplasmática e molecular. Estas
habilidades variam dependentemente com o tipo de oócitos que são removidos dos
folículos. A influência da qualidade do oócito no potencial de desenvolvimento do
embrião tem sido mostrada mais claramente em bovinos do que em quaisquer outras
2
espécies, pois sabe-se que existem múltiplos fatores que estão envolvidos e uma
grande quantidade de dados têm sido publicados nesta área (SIRARD et al., 2006).
Estudos recentes mostram que em comparações feitas entre a maturação in
vivo e in vitro, o potencial de desenvolvimento de oócitos maturados in vitro é,
geralmente, menor do que de oócitos maturados in vivo. Esses achados são, também,
uma conseqüência óbvia da coleta de uma população heterogênea de oócitos com
diferentes potenciais de desenvolvimento. Os mesmos autores apontam que a
qualidade do desenvolvimento embrionário seguido da maturação in vitro – fertilização
in vitro (MIV – FIV) é muito influenciada pelas condições dos meios de cultivo dos
zigotos até blastocisto (RISOS et al., 2002).
A maturação do oócito requer um ajuste adicional às gonadotrofinas realizado
pelos fatores intra-ovarianos esteróides e não-esteróides que atuam como reguladores
parácrinos e autócrinos da sinalização hormonal (TERRANOVA e RICE, 1997). Uma
célula animal possui um sistema complexo de proteínas que lhe permite responder aos
sinais enviados por outras células. Este sistema inclui receptores protéicos de superfície
celular e intracelulares, proteinoquinases, fosfatases, proteínas ligadoras de GTP e
muitas outras, pequenos peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, esteróides, retinóides,
derivados de ácidos graxos e o óxido nítrico (NO), que vem se destacando como uma
molécula envolvida na sinalização intra e intercelular, controlando muitos processos da
fisiologia ovariana (DIXIT e PARVIZI, 2001).
Três isoformas de NOS têm sido identificadas: duas isoformas constitutivas,
incluindo a endotelial (eNOS) e neuronal (nNOS) e a isoforma induzível (iNOS). As
isoformas constitutivas são cálcio-calmodulina dependentes e produzem pequenas
quantidades de NO. Em contraste, a iNOS é expressa em muitos tipos celulares (DIXIT
e PARVIZI, 2001). Das três isoformas, os ovários de mamíferos expressam a eNOS e a
iNOS, mas não a nNOS (TAO et al., 2005).
Os mecanismos exatos da influência do sistema NO/NOS (NO/óxido nítrico
sintase) na maturação de oócitos de fêmeas de camundongos, ratos e bovinos não são
totalmente conhecidos. Os estudos sustentam o conceito de que o NO tanto pode inibir
(JABLONKA-SHARIFF et al., 1999a) quanto estimular (VIANA et al., 2006) a maturação
nuclear, dependendo de sua concentração. Segundo MATTA et al. (2001), num
trabalho realizado em oócitos de bovinos, demonstraram que apesar do inibidor da
3
síntese de NO utilizado no experimento (L-NAME) nas concentrações utilizadas na
maturação in vitro não inibir a meiose, o NO está envolvido na regulação de proteínas,
possivelmente relacionadas com a inibição da maturação e, conseqüentemente, com o
desenvolvimento embrionário inicial. Estudos realizados também com doadores de NO,
como por exemplo, o SNP (nitroprussiato de sódio) sugerem que adequadas
concentrações de NO no meio de cultivo são necessárias para a ocorrência da
maturação normal do oócito, da fertilização e, conseqüentemente, do desenvolvimento
embrionário inicial (VIANA et al., 2003, 2006), demonstrando, pela primeira vez na
literatura, que a maturação in vitro de oócitos bovinos é influenciada pela concentração
de NO no meio de cultivo.
Neste estudo, propomos determinar o papel da enzima óxido nítrico sintase
sensível à aminoguanidina (AG), utilizando-se diferentes concentrações do inibidor da
síntese de NO pela iNOS durante a maturação in vitro, com o objetivo de entendermos
melhor o papel do NO na maturação nuclear e citoplsmática in vitro de oócitos bovinos.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Maturação oocitária
A maturação oocitária compreende a maturação nuclear (LONERGAN et al.,
1997; CHA e CHIAN, 1998; MAYES e SIRARD, 2001), a maturação citoplasmática
(KHATIR et al., 1997) e a maturação molecular (SIRARD et al., 2006), as quais
envolvem mudanças morfológicas (KIM et al., 1996; KIM et al., 2000) e mudanças
moleculares ou bioquímicas (WU et al., 1996; KHATIR et al., 1998; LEDAN et al., 2001;
SIRARD et al., 2006). Tanto a maturação nuclear e citoplasmática quanto a molecular
são consideradas importantes para o desenvolvimento normal do embrião (PLACHOT E
CROZET, 1992; YANG et al., 1998; GALLI e LAZZARI, 2005; SIRARD et al., 2006) e
não há dúvida de que muitos fatores biológicos agem juntos para preparar oócitos
imaturos para o desenvolvimento de embriões competentes após a fertilização (YANG
et al., 1998) e que alguns defeitos na maturação do oócito podem ser causados por
uma maturação nuclear, citoplasmática ou molecular inadequada (PLACHOT e
CROZET, 1992; YANG et al., 1998; SIRARD et al., 2006).
5
2.1.1. Maturação nuclear
Em oócitos mamíferos, a meiose é interrompida durante o período fetal na
prófase I, permanecendo assim até serem estimulados a retomarem a primeira divisão
meiótica, que ocorre antes da ovulação, após o oócito/folículo ter sofrido um extenso
crescimento. A primeira etapa da retomada da meiose é o rompimento da vesícula
germinativa (VGBD), que não é um processo regulado por microfilamentos (SUN e
SHATTEN, 2006), quando os cromossomos condensam-se numa forma compacta. O
centrossoma, então, se divide em dois centríolos, ao redor dos quais aparecem ásteres
que se movem separadamente e um feixe é formado entre eles. Os cromossomos, em
pares diplóides, estão dispostos livres no citoplasma e tornam-se arranjados numa
placa de feixe equatorial, estacionando na metáfase I (MI). Esse movimento polarizado
dos cromossomos depende dos processos mediados por microfilamentos (Figura 01:
Linha 1) (SUN e SHATTEN, 2006).
O oócito primário sofre duas divisões meióticas. Na primeira divisão, duas
células são formadas, mas uma delas contém quase todo o citoplasma; e a outra, muito
menor, forma o primeiro corpúsculo polar (Figura 01: Linha 2). Além dos cromossomos,
o primeiro corpúsculo polar contém uma variedade de organelas, incluindo
mitocôndrias, ribossomas e grânulos corticais (VEECK, 1991; JONES, 2004). Estas
divisões consistem em uma seqüência de eventos celulares que são controlados pelo
citoesqueleto do oócito e são altamente regulados com o tempo. Os microtúbulos
formam um fuso e segregam cromossomos homólogos durante a primeira divisão
meiótica graças aos microfilamentos de actina (BRUNET e MARO, 2005). Interações
diretas entre os cromossomos e os microfilamentos de actina controlam a posição do
fuso mitótico (ZENG, 2004). Os cromossomos agem para organizar tanto os
microtúbulos quanto os microfilamentos de actina, atuando como fator essencial para a
divisão meiótica assimétrica para a formação do gameta funcional (BRUNET e MARO,
2005). Assim, a maturação meótica em oócitos mamíferos é um complexo processo que
envolve um extenso rearranjo de microtúbulos e microfilamentos de actina (ROTH e
HANSEN, 2005), bem como outras proteínas associadas ao citoesqueleto (SUN e
SCHATTEN, 2006).
6
Durante a mitose, a formação do fuso é controlada pelo rearranjo dos
cromossomos, os principais sítios de polimerização dos microtúbulos (OU e RATTNER,
2004). No início da mitose, ocorre a divisão do centrossoma em dois e a migração dos
mesmos para lados opostos do núcleo. Como conseqüência, assim como, a VGBD,
ocorre o prolongamento dos microtúbulos e o desprendimento dos centrossomas, que
interagem com os cromossomos e tornam-se rapidamente organizados dentro de um
fuso bipolar. Os centrossomas dos oócitos e os microtúbulos são polimerizados num
discreto sítio no citoplasma chamado de centros de organização de microtúbulos
(MTOCs). Em oócitos de camundongos, onde os MTOCs estão dispersos no
citoplasma, os cromossomos prendem-se para conduzir a montagem do fuso. No início
da MI, logo após a VGBD, os MTOCs são, preferencialmente, ativados e/ou recrutados
juntamente com os cromossomos e os microtúbulos são, preferencialmente,
estabilizados nesta área. O crescimento dos microtúbulos é, então, organizado de uma
maneira bipolar ao redor dos cromossomos (BRUNET e MARO, 2005).
Assim, a progressão da telófase I (TI) da primeira divisão meiótica para a
extrusão do primeiro corpúsculo polar permite que um grupo de cromossomos seja
expelido no espaço perivitelínico, enquanto o outro grupo permanece no citoplasma do
oócito. O oócito passa a ser chamado de oócito secundário e os cromossomos
vitelínicos revertem-se para a formação do segundo eixo meiótico. A segunda divisão
meiótica começa e progride para a metáfase II (MII), mas não é completada até que a
penetração do espermatozóide ocorra. O objetivo da meiose é a redução para o
número haplóide de cromossomos e a recombinação genética. Somente os oócitos que
tenham alcançado este estádio de maturação e que tenham sido bloqueados na MII são
capazes de ser fertilizados e se desenvolver normalmente (Figura 01: Linha 3)
(STRÖMSTEDT e BYSKOV, 1999).
7
Figura 01: Eventos celulares que ocorrem durante a maturação nuclear em oócitos de
mamíferos. Linha 1: Durante a VGBD, os microtúbulos em verde, polimerizam-se ao
redor dos cromossomos e organizam-se progressivamente até formar um fuso bipolar;
Linha 2: A formação do fuso induz a reorganização dos cromossomos na região
cortical do oócito (áreas vermelha e rosa) e a liberação do primeiro corpúsculo polar;
Linha 3: Durante a MII, o fuso metafásico é ancorado na membrana plasmática do
oócito e após a fertilização ocorre a liberação do segundo corpúsculo polar (BRUNET
e MARO, 2005).
2.1.2. Maturação citoplasmática
O processo de maturação citoplasmática ainda não está tão bem definido
(FAIR, 2003), mas se sabe que a capacidade de desenvolvimento adquirida pelo oócito
é dependente das mudanças citoplasmáticas, que ocorrem simultaneamente às
mudanças nucleares durante a maturação. A maturação citoplasmática, em mamíferos,
é um processo altamente complexo que envolve, entre outros eventos, mudanças na
8
síntese de proteínas (KHATIR, et al., 1997: SIRARD et al., 1998) e na migração e
reorganização de organelas (HYTTEL et al., 1997; STOJKOVIC et al., 2001).
A maturação citoplasmática é caracterizada pelo acúmulo de lipídios do oócito,
pela redução no aparato de Golgi, pelo aparecimento de numerosos ribossomos
especialmente adjacentes aos cromossomos, alinhamento dos grânulos corticais
(CRAN e ESPER, 1990) e rearranjo de microfilamentos, que são as principais
mudanças citoplasmáticas que ocorrem durante a maturação do oócito (KIM et al.,
1996; KITO e BAVISTER, 1997; SUN et al., 2001b).
Os microtúbulos e os microfilamentos, são estruturas altamente dinâmicas que
podem aumentar ou diminuir em comprimento pela adição ou perda de subunidades de
tubulina. Proteínas motoras se movem numa direção ou outra ao longo dos
microtúbulos, carregando organelas específicas para locais pré-determinados dentro da
célula (ALBERTS et al., 1997). Eles são, também, os maiores componentes do
citoesqueleto de oócito de mamíferos e são responsáveis pela divisão celular (KIM et
al., 1996; KIM et al., 2000; SUN e SHATTEN, 2006), manutenção do fuso meiótico,
posicionamento dos cromossomos na periferia e pela extrusão do corpúsculo polar
durante a maturação e fecundação (KIM et al., 2000).
Na maioria das espécies, após a fertilização, o conteúdo dos grânulos corticais
é liberado por exocitose para o córtex do oócito (CRAN e ESPER, 1990; DENG et al.,
2005) e, em seguida, algumas proteínas dos grânulos bloqueiam a poliespermia na
zona pelúcida e no oolema (DUCIBELLA, 1996; SUN e SHATTEN, 2006). Nos
mamíferos e nos marsupiais, algumas proteínas dos grânulos corticais permanecem no
espaço perivitelínico e formam, após a fertilização, uma matriz chamada de envelope de
grânulos corticais, que é ancorada na membrana plasmática dos oócitos maturados
(TALBOT e DiCARLANTONIO, 1984; DANDEKAR e TALBOT, 1992), e que é retida até
a implantacão do blastocisto (TALBOT e DiCARLANTONIO, 1984; DANDEKAR e
TALBOT, 1992; DANDEKAR et al., 1995).
Em oócitos de ouriço-do-mar, a migração dos grânulos corticais requer uma
associação com microfilamentos e não com microtúbulos. Logo após a VGBD, os
grânulos corticais prendem-se aos microfilamentos e são translocados para a
superfícies da célula. A ativação do MPF estimula a associação entre a vesícula e os
9
microfilamentos e isso é a chave regulatória para a migração coordenada dos grânulos
corticais para o córtex (WESSEL et al., 2002).
No entanto, de acordo com SUN et al. (2001a), a localização dos grânulos
corticais no oolema e sua ancoragem no córtex foi independente dos microfilamentos
ou dos microtúbulos; eles se mantiveram no córtex após o tratamento com inibidores da
maturação do oócito para permanecerem na MII. Mas os dados envolvendo exocitose
dos grânulos corticais com microfilamentos de actina e microtúbulos precisam ser
melhor elucidados (SUN e SCHATTEN, 2006).
Com estas modificações, o oócito secundário apresenta mudanças biológicas
celulares necessárias para o sucesso da fertilização e do desenvolvimento embrionário
inicial (HYTTEL et al., 1997).
A avaliação da maturação citoplasmática é importante para um bom
entendimento dos fatores envolvidos na maturação oocitária in vitro, visando a uma
maior eficiência no desenvolvimento embrionário inicial (ALBERIO et al., 2000; SIRARD
et al., 2006).
2.1.3. Maturação molecular
A maturação molecular é uma das definições mais recentes do processo de
maturação do oócito (SIRARD et al., 2006). O controle da conformação da cromatina
durante o crescimento e a maturação oocitária faz parte de um caminho fisiológico
complexo. Múltiplas sinalizações convergem para induzir modificações pós-
transducionais em resíduos de aminoácidos específicos de várias proteínas histonas
(CHEUNG et al., 2000).
A maioria das hipóteses sustenta o conceito de que RNAs mensageiros
específicos e a possibilidade de algumas proteínas serem produzidas e estocadas no
oócito nos últimos dias antes da ovulação proporcionam ao oócito a capacidade de
desenvolvimento, sendo essenciais para promover a cascata molecular durante a
ativação do gameta embrionário e o desenvolvimento até o estádio de blastocisto
(SIRARD et al., 2006).
10
2.2. Fatores que afetam a maturação oocitária
2.2.1. Adenosina monofosfato cíclica (AMPc)
A adenosina monofosfato cíclica exerce um importante papel no controle da
maturação nuclear de oócitos bovinos (GUIXUE et al., 2001). Tem sido sugerido que
uma parte do AMPc requerido pode ser sintetizado pelas células do cumulus e
transferido para o oócito via junções comunicantes (DEKEL et al., 1988; TORNELL et
al., 1991; BILODEAU et al., 1993). Também é possível que a estimulação das células
do cumulus induza a síntese de AMPc em níveis basais que sejam suficientes para a
manutenção do bloqueio meiótico (BORNSLAEGER e SCHULTZ, 1985; EPPIG, 1993).
Em bovinos, a adenilato ciclase (AC) foi localizada nas células do cumulus,
principalmente nas células em contato com o oócito (KUYT et al., 1988). Sugere-se,
também, que o próprio oócito produz seu próprio AMPc a partir de um receptor para
proteína G na membrana plasmática dele mesmo, que estimula a Gs, uma proteína
ligada à proteína G, a ativar a AC (MEHLMANN et al., 2002; 2004). O receptor acoplado
à Gs (GPR3) foi identificado como um regulador essencial do bloqueio meiótico em
oócitos de camundongos (MEHLMANN et al., 2004). Esse receptor exibe um alto grau
de atividade constitutiva quando expresso em várias linhas celulares, resultando em um
aumento na produção de AMPc (UHLENBROCK et al., 2002), indicando que ele está
ligado à Gs. A atividade constitutiva do GRP3 no oócito é suficiente para produzir a
quantidade de AMPc requerida para o bloqueio meiótico.
Tem sido mostrado que existem ainda substâncias que têm o papel de inibir a
maturação de oócitos, tais como, purinas (DOWNS et al., 1985), esteróides (EPPIG et
al., 1983) e guanosina 3’ 5’- monofosfato cíclica (GMPc) (HUBBARD e TERRANOVA,
1982; DOWS e EPPIG, 1984; TORNELL et al., 1990; TORNELL et al., 1991; DOWNS,
1993). Concentrações elevada de GMPc pode inibir a maturação espontânea em
oócitos de ratas (TORNELL et al., 1990) e também inibir a atividade da fosfodiesterase-
AMPc (AMPc-PDE) no oócito, elevando as concentrações de AMPc (BORNSLAEGER
et al., 1984). Segundo TORNELL et al. (1990), as concentrações de GMPc diminuem
em paralelo à maturação de oócitos em ratas, mas os mecanismos que controlam esta
produção ainda não são claros. No entanto, num estudo feito por HUBBARD e PRICE
11
(1988) e EPPIG et al. (2004), sugere-se que o GMPc diminua a concentração de AMPc
pela ativação da fosfodiesterase AMPc do oócito de hamster, permitindo que o
processo de maturação oocitária continue.
A proteína cinase A (PKA), uma enzima que pertence ao grupo das MAP
cinases (MAPK) de membrana, é dependente de AMPc (MOCHLY-ROSEN, 1995), ou
seja, intercede na ação do AMPc nas células pela fosforilação de proteínas alvo
(STRÖMSTEDT e BYSKOV, 1999), fazendo parte da cascata de transdução de sinal,
incluindo a AC e AMPc-PDE. A AC converte o ATP para o AMPc e esta atividade é
controlada pela proteínas-G de membrana. Uma vez produzido, o AMPc se liga às
subunidades regulatórias da PKA. Porém, para balancear os níveis intracelulares de
AMPc, a AMPc-PDE transforma AMPc em 5,- AMPc, que, por sua vez, é ineficiente
para a atividade da PKA (MOCHLY-ROSEN, 1995). Segundo DOWNS e HUNZICKER-
DUNN (1995), a ativação da isoenzima tipo I (uma isoenzima da PKA) do oócito
mantém o bloqueio meiótico. Em oócitos de hamsters, a atividade da PKA também
parece ser necessária para manter o bloqueio meiótico e a inibição da PKA induz a
retomada meiótica (HELLEKANT e BAVISTER, 1996a). Assim, estes eventos estão
relacionados com o papel da PKA e tem sido proposto que, em oócitos de bovinos, a
subunidade regulatória da PKA poderia modular o processo de transcrição nas células
do cumulus e a subunidade catalítica poderia manter o bloqueio meiótico, fosforilando
proteínas importantes deste mecanismo de regulação (HELLEKANT e BAVISTER,
1996b).
2.2.2. Proteínas envolvidas no controle do ciclo celular
O ciclo celular em células animais consiste em um ciclo de replicação do DNA
cromossômico na fase S que procede ao estádio completo de diplóteno da primeira
prófase e é detida na diacinese. Este estádio corresponde à fase G2 do ciclo celular e é
caracterizado por cromossomos difusos cercados por uma membrana nuclear intacta
chamada vesícula germinativa (VG). O reinício da meiose, onde ocorre um crescimento
total dos oócitos após a puberdade, representa a transição da fase G2 para a fase M e
envolve a condensação da cromatina, a VGBD, formação do fuso mitótico e segregação
do cromossomo replicado em núcleos “filhos” na fase M (DEKEL, 1995; 1999).
12
A regulação da divisão do ciclo celular tem sido o assunto de muitos estudos
durante os últimos anos (MURRAY e HUNT, 1993; DOREE e HUNT, 2002). Entre os
reguladores do ciclo celular, as cinases dependentes de ciclinas exercem um papel
central no início e na ordenação dos eventos do ciclo celular, ou seja, regulam a
progressão das fases G1, S, G2 e M (GOULD, 1995; GRANA e REDDY, 1995;
MORGAN, 1995; PINES, 1995; KNOCKAERT et al., 2002).
Inúmeros estudos vêm mostrando que os eventos ocorridos no processo de
maturação nuclear são acompanhados por mudanças específicas na fosforilação de
proteínas controladas por enzimas que são modificadas pela transdução de sinais
(WANG e LIU, 2004). Uma enzima importante é o fator promotor da maturação (MPF), a
qual pertence ao grupo de proteínas cinases dependentes de ciclinas (MASUI e
MARKERT, 1971). O MPF é uma proteína cinase que consiste de duas subunidades,
uma cinase p34cdc2 catalítica e uma ciclina B regulatória (ALBERTS et al., 1997;
MOTLIK et al., 1999; DOREE e HUNT, 2002). A atividade do complexo ocorre na
entrada da fase-M, ou seja, quando há o rompimento da VG marcando o final da
prófase I, mas requer a desfosforilação da p34cdc2 cinase com remoção dos fósforos da
treonina 14 e tirosina 15 (JOSEFSBERG et al., 2001; VAILLANT et al., 2001). Um
rápido declínio na atividade do MPF ocorre durante o período de transição entre a MI e
MII. O MPF é reativado rapidamente para entrar na MII e mantido em altas
concentrações durante a MII (Figura 02) (BRUNET e MARO, 2005).
A desfosforilação da forma p34cdc2 (forma ativa) presente em oócitos retidos na
fase G2 desaparece logo após o início da meiose com nenhuma mudança até a MII
(POLANSKI e KUBIAK, 1999). O processo da condensação dos cromossomos durante
a fase M, em muitas espécies, é acompanhado por fosforilações da histona H1 e da
histona H3, que são substratos do MPF (KUBELKA et al., 2000). A atividade cinase da
histona H1, que está alta durante a MI e MII, diminuiu com a extrusão do corpúsculo
polar. Estes resultados sugerem que, na maturação de oócitos de mamíferos, a
desfosforilação da p34cdc2 dispara esta ativação na primeira metáfase (POLANSKI e
KUBIAK, 1999).
13
Figura 02: Atividades do MPF e MAPK durante a maturação nuclear. A atividade do MPF está
representada em linha vermelha e a atividade da MAPK em linha verde (BRUNET e
MARO, 2005).
Alguns estudos mostram que a atividade do MPF é encontrada na divisão
mitótica das células, pois parece controlar a transição da G2 para a fase M, tanto na
meiose quanto na mitose (POLANSKI e KUBIAK, 1999; BRUNET e MARO, 2005). O
início da ativação do MPF ocorre em cerca de 7 h (progressão VG – MI) após o inicio da
maturação in vitro e alcança um pico ao término da primeira fase M (MI, 12 h).
Posteriormente, ocorre um declínio em sua atividade durante a transição entre a MI e
MII. Esse fator é reativado para entrar na MII e mantido em níveis altos durante o
segundo bloqueio em MII (24 h) (POLANSKI e KUBIAK, 1999, KUBELKA et al., 2000;
LEDAN et al., 2001).
Segundo VERDE et al. (1990) e KIM et al. (2000), o MPF regula diretamente
algumas mudanças morfológicas que ocorrem durante a fase M. Por exemplo, o MPF
pode converter o estado de intérfase dos microtúbulos para uma configuração de
metáfase in vitro. Porém, a relação entre a condensação dos cromossomos durante a
fase M e a ativação do MPF ainda apresenta algumas controvérsias (KUBELKA et al.,
2000; BRUNET e MARO, 2005).
Recentemente, tem sido sugerido que o fator-chave que controla a meiose é a
síntese de ciclina B (SIRARD et al., 1998; BRUNET e MARO, 2005). Sugere-se,
também, que os níveis de p34cdc2 não mudam na maturação de oócitos bovinos, em
VGBD Fertilização
Pro-metáfase e metáfase I Metáfase II
14
contraste, a ciclina B está ausente em oócitos bovinos no momento de sua liberação do
folículo, mas ela é sintetizada durante a maturação do mesmo, ou seja, após a VGBD, a
síntese de ciclina B aumenta progressivamente, alcançando a concentração máxima no
final da primeira fase M, associando-se imediatamente com a p34cdc2 para formar um
complexo ativo (LEDAN et al., 2001). A degradação da ciclina B é requerida durante a
extrusão do primeiro corpúsculo polar (TERRET et al., 2003). Assim, a atividade do
MPF é regulada pelo mecanismo de transição dependente que determina a
concentração da síntese de ciclina (BRUNET e MARO, 2005).
A injeção da proteína ciclina B1 humana em oócitos bovinos tratados com
ciclohexamida dá início à retomada meiótica (LEVESQUE e SIRARD, 1996). Em
camundongos, a síntese de ciclina B1 controla a duração da primeira fase M meiótica
(POLANSKI et al., 1999). Em porcas, há uma quantidade extremamente pequena de
pré-MPF na VG do oócito (NAITO et al., 1995). A ativação do MPF não é dependente
da amplificação autocatalítica, mas requer atividade de síntese da proteína (FULKA et
al., 1988). Segundo SUN et al. (2001a), há evidências de que a síntese de ciclina B1
determina a habilidade do oócito de porcas retomar a meiose.
Um segundo grupo importante de enzimas envolvidas na retomada da meiose
são as proteínas da família das cinases ativadas por mitógenos, ou seja, as MAPK de
membrana. Estas enzimas são ativadas por transdução de sinais específicos
provenientes de sinais extracelulares. A ativação do MPF e da MAPK está
temporalmente relacionada com a progressão da meiose (MASUI e MARKERT, 1971;
SUN et al., 1999; JONES, 2004).
As MAPK são os principais componentes celulares que controlam a
embriogênese, diferenciação celular, proliferação celular e morte celular (PEARSON et
al., 2001). Essas proteínas pertencem a uma família de serina/treonina cinases que são
reguladas por uma cascata de fosforilação, ativadas pela MAPKK (MAP cinases-
cinases, ativadora da MAPK) que fosforila os resíduos de tirosina e serina da MAPK
(KUBELKA et al., 2000; LU et al., 2001; PEARSON et al., 2001). A atividade da MAPK
pode ser associada à ativação do MPF. Paralelamente com o MPF, a ativação da
MAPK ocorre em torno das 8 h e apresenta um aumento gradual, alcançando valores
máximos entre 12 – 14 h e mantendo-se assim até completar as 24 h de maturação in
vitro em oócitos bovinos (KUBELKA et al., 2000; JONES, 2004).
15
A parada do oócito na MII é causada, provavelmente, por dois fatores: o MPF e
o fator citostático (CSF) (LIU et al., 1998). O CSF é uma proteína citoplasmática que
também está envolvida na regulação dos processos de maturação (CHA e CHIAN,
1998; LIU e YANG, 1999; KUBELKA et al., 2000). A oncoproteína C-mos cinase e a
MAP cinase são componentes do CSF, que, provavelmente, fazem parte da retro-
alimentação positiva entre o MPF, C-mos e a cascata de MAPK, que são importantes
para a maturação do oócito e parada do mesmo em MII (GOTOH et al., 1995; FISHER
et al., 2000; VIVEIROS et al., 2001; VAILLANT et al., 2001). A C-mos é uma MAPKKK
(MAP cinases-cinases-cinases) que ativa a MAPKK, que, por sua vez, ativa MAPK, que
implica na parada do oócito em MII (GOTOH et al., 1995; KUBELKA et al., 2000;
VAILLANT et al., 2001). Já o CSF é o responsável por manter um nível elevado de
MPF, e, portanto, a retenção em MII. A MAPK contribui para estabilizar a atividade
ciclina B/cdk2 cinase (MOTLIK et al., 1999), mantendo o MPF em níveis elevados
(JOSEFSBERG e et al., 2002).
2.2.3. Células do cumulus
As células da granulosa do cumulus desempenham um importante papel na
manutenção e controle da função ovariana. Elas contribuem para a formação do folículo
ovariano e fornecem um micro-ambiente e cito-arquitetura próprios para o
desenvolvimento do oócito. Segundo SUN et al. (2001a), as células do cumulus e
gonadotrofinas não são requeridas para a retomada da meiose, mas são necessárias
tanto para a maturação nuclear quanto para a citoplasmática. Os efeitos das
gonadotrofinas parecem ser mediados pelas células do cumulus no complexo cumulus-
oócito (COC) e quando o cumulus foi removido e os oócitos foram cultivados em meio
suplementado com gonadotrofinas, somente em 32% havia ocorrido o rompimento da
VG e 4,2% concluíram a maturação nuclear. Correspondentemente, as mudanças da
maturação citoplasmática, como concentração de ciclina B1, fosforilação da MAPK e
migração dos grânulos corticais foram também bloqueados.
Durante o desenvolvimento folicular, as células da granulosa podem se
comunicar umas com as outras e com o oócito via junções comunicantes (GILULA et
al., 1978). Esses canais permitem a passagem de moléculas de baixo peso molecular
16
incluindo nutrientes (piruvato), precursores metabólicos (aminoácidos e nucleotídeos)
(WASSARMAM, 1988) e moléculas envolvidas com a sinalização celular, como o
AMPc, que pode regular a manutenção do bloqueio da meiose do oócito (LAWRENCE
et al., 1978; TORNELL et al., 1991). Em ratos, a retomada da meiose tem sido
correlacionada com a diminuição das junções comunicantes das células do cumulus
(SUN et al., 2001a). Em bovinos, a mesma correlação tem sido observada, mas as
junções comunicantes se mantêm funcionais até a MII (SUTOVSKY et al., 1993). Esta
rede de junções comunicantes une as células murais com as antrais e do cumulus com
o oócito, formando um sincício funcional e estrutural. Segundo os estudos, esta
comunicação exerce um importante papel durante a maturação do oócito pelo sustento
da maturação citoplasmática necessária para o subseqüente desenvolvimento posterior
à fertilização in vitro (NAGAI et al., 1993; ALI e SIRARD, 2002 a,b).
Tem sido mostrado que a remoção das células do cumulus antes da maturação
in vitro é prejudicial para a maturação do oócito em vaca (CHIAN e NIWA, 1994). A
importância das células do cumulus durante a maturação in vitro é, provavelmente,
atribuída à função das junções comunicantes e suas específicas capacidades
metabólicas (TANGHE et al., 2002). Assim, a comunicação via junções comunicantes é
o pilar para as interações celulares que controlam as funções foliculares, principalmente
aquelas reguladas por sinais endócrinos, parácrinos e/ou autócrinos (EPPIG, 1991). A
resposta ao LH da rede de comunicação juncional vem sendo analisada. Estes estudos
mostram que a proteína da junção comunicante, a conexina 43 (Cx43), sofre
fosforilação/desfosforilação 10 min após a exposição ao LH, mudando a conformação
da proteína e, assim, diminuindo a ligação entre o oócito e as células do cumulus.
Posteriormente, o efeito se traduz em diminuição da expressão do RNAm da Cx43
(KNOBIL e NEILL, 1998).
A expansão das últimas camadas de células durante a segunda metade da
maturação in vitro limita a comunicação entre as células do cumulus e o oócito
(MATTIOLI e BARBONI, 2000). Sabe-se, também, que esta queda da regulação da
comunicação das junções comunicantes é um pré-requisito para a expansão do
cumulus e que não há comunicação entre as células quando a expansão no cumulus já
ocorreu (BUCCIONE et al., 1990). ALI et al. (2005), em um trabalho realizado em
oócitos bovinos maturados in vitro, mostrou que a expansão inicial das células do
17
cumulus, causando um rompimento das junções comunicantes, teve uma grande
influência no subseqüente desenvolvimento do oócito.
2.2.4. GDF-9 (fator de crescimento e diferenciação do tipo 9)
Após o surgimento do pico de LH, as conexões intracelulares entre o oócito e
as células do cumulus são rompidas, mas essas células já possuem capacidade de
alcançar o processo de expansão de suas camadas ao redor do oócito, influenciando
diretamente na ovulação e na subseqüente fertilização. As características da expansão
das células do cumulus incluem a secreção do ácido hialurônico pelas próprias células
e a expressão de outras proteínas requeridas para a formação e retenção da matriz
(FULOP et al., 2003).
Estudos recentes têm mostrado que alguns fatores de crescimento e
diferenciação, como o GDF-9, estão associados com o desenvolvimento folicular no
ovário de mamíferos (JAYAWARDANA et al., 2006), promovendo a expansão in vitro
das células do cumulus (VANDERRHYDEN et al., 2003) e que alguns distúrbios na
comunicação entre o oócito e as células somáticas, tanto no período pré-ovulatório
quanto no pós-ovulatório, pode resultar numa baixa fertilidade (PANGAS et al., 2005).
Uma vez sintetizado no oócito, o GDF-9 chega nas células da granulosa e se
liga a receptores específicos, como o BMPRII, receptores de ativina (AcTRIIA ou
AcTRIIB), e receptores do tipo I (ALK-3, ALK-5 e ALK-6) na membrana dessas células
(AOKI et al., 2001). Em bovinos, alguns receptores como o ALK-3, ALK-6 e BMPRII têm
sido identificados (BODENSTEINER et al., 1999; GLISTER et al., 2004;). Isso sugere
que o GDF-9 pode precisamente controlar o processo de expansão das células do
cumulus, influenciando na fase de maturação final de oócitos mamíferos (HAYASHI et
al., 1999; AALTONEN et al., 1999; McKENZIE et al., 2004; PANGAS e MATZUK, 2005;
JAYAWARDANA et al., 2006).
A expressão da GDF-9 tem sido encontrada em oócitos de roedores (HAYASHI
et al., 1999), em ovários suínos (SHIMIZU et al., 2004a), ovinos, bovinos
(BODENSTEINER et al., 1999) e humanos (AALTONEN et al., 1999). Segundo
SHIMIZU et al. (2004a), a injeção direta do gene GDF-9 em ovário de suínos promoveu
o desenvolvimento folicular e, de acordo com VITT et al. (2000a), o tratamento GDF-9
18
melhorou o crescimento de folículos pré-antrais e primários, tanto in vivo quanto in vitro
e GLISTER et al. (2004) observaram que o GDF-9 promoveu a proliferação das células
da granulosa, pois se ligou a receptores específicos da membrana das células da
granulosa de oócitos bovinos.
2.2.5. Hormônios esteróides: progesterona (P4) e 17ββ-estradiol (E2)
O papel dos esteróides na retomada da meiose em mamíferos tem sido
examinado com dois objetivos: ver se alguns dos esteróides servem como inibidores da
meiose oocitária e se eles mediam a ação das gonadotrofinas na estimulação da
meiose (TSAFRIRI et al., 2005).
Durante o desenvolvimento folicular, o retorno da meiose é iniciado por uma
onda pré-ovulatória de LH e só ocorre em oócitos que já tenham completado o seu
crescimento e adquirido competência meiótica. Durante o período entre a onda de LH e
a ovulação, o oócito passa por uma série de transformações no núcleo e no citoplasma.
A onda de LH estimula uma mudança na síntese de esteróides feita pelas células da
granulosa, sendo que a síntese do E2 tem uma queda significativa, enquanto a
concentração de P4 começa a se elevar e se torna mais marcante momentos antes da
ovulação. A inibição da síntese de LH ou o bloqueio dos seus receptores provocam
falhas na maturação e na ovulação, sendo que os receptores para LH estão presentes
somente nas células somáticas do folículo. Desse modo, os sinais que disparam a
maturação chegam ao oócito por meio das células da granulosa (VAN DEN HURK e
ZHAO, 2005).
Em bovinos, o pico de LH inibe a produção de androstenediona pelas células
da teca e induz a luteinização das células da granulosa murais. Este processo é
refletido pela concentração de esteróides no fluido folicular, que mostra que alta
concentração de E2 ao redor de 1µg/ml antes e até 6 h após a concentração máximo de
LH (pico pré-ovulatório) ocorre após um declínio na concentração de E2. Este fenômeno
é seguido pelo aumento gradual da progesterona cerca de 20 h após o pico de LH.
Apesar do declínio da concentração de E2 ocorrer concomitantemente com a GVBD,
não há evidência de que o E2 esteja envolvido na retomada da meiose (DIELEMAN et
al., 1983).
19
Os receptores esteróides realmente se localizavam na membrana do oócito,
fazendo parte do processo de maturação nuclear e citoplasmática, mediando a
sinalização de outros sistemas, incluindo, por exemplo, o efeito da indução pelo P4 na
ativação da MAPK e da eNOS no tecido cardíaco e em células endoteliais,
respectivamente (SHAUL, 2002). Em xenopus, foi observada a ação dos receptores de
P4 na maturação oocitária, demonstrando que eles têm participação neste processo
(TIAN et al., 2000; BAGOWSKI et al., 2001).
A presença de esteróides no fluido folicular antes e também durante a
maturação sugere que esses hormônios (P4 e E2) sejam importantes para a maturação
nuclear e citoplasmática. Embora tenham sido feitos vários trabalhos nessa linha, os
resultados são inconsistentes e a função desses hormônios na maturação ainda gera
controvérsias (LI et al., 2004). Segundo EPPIG e KOIDE (1978), a adição de E2 no meio
de maturação reduziu a taxa de maturação de oócitos com as células do cumulus e
desnudos em oócitos de camundongos.
Para avaliar o efeito dos esteróides na maturação dos oócitos, estudos
recentes foram conduzidos usando-se oócitos de camundongas tratadas com
gonadotrofinas e com um inibidor da fosfodiesterase (IBMX). Foi observado que tanto a
testosterona quanto o E2 foram capazes de potencializar um sinal inibitório e promover
a VGBD, assim como a ativação da CDK1 e MAPK de uma maneira dose-dependente
(HAMMES, 2004).
Segundo ALI et al. 2004, a adição de E2 ao meio de maturação provocou
aumento na produção de blastocistos em bovinos. Também em bovinos, KIM et al.
(1995) mostraram que a adição de E2 no meio de maturação não alterou os índices de
maturação e a formação de blastocistos, enquanto que BEKER et al. (2002) concluíram
que a suplementação com E2 no meio de maturação livre de SFB afetou negativamente
a retomada da meiose, com diminuição na proporção de oócitos em MII e pelo aumento
na ocorrência de aberrações nucleares, como também no subseqüente
desenvolvimento embrionário, diminuindo a taxa de balstocistos. JAYAWARDANA et al.
(2006) observaram que o E2, juntamente com o FSH, está envolvido na expressão do
GDF-9, que é um dos principais fatores secretados pelo oócito que está envolvido no
processo de expansão das células do cumulus durante a maturação.
20
Vários trabalhos têm demonstrado que a P4 tem sido um importante mediador
da maturação de oócitos de Xenopus (WANG e LIU, 2004; HAMMES, 2004), de suínos
(LI et al., 2004), ratas (DAVE et al., 1997) e de bovinos (FATEHI et al., 2002). Segundo
WANG e LIU (2004), a P4 está envolvida na retomada da meiose, diminuindo as
concentrações de AMPc. No entanto, ainda há algumas controvérsias em relação aos
níveis de AMPc durante a maturação do oócito induzida pela P4. DUCKWORTH et al.
(2002) demonstraram que a P4 diminui a atividade da PKA, ativando o MPF, e por fim, a
MAPK.
O uso de P4 nos meios de maturação não é uma prática comum, e, além disso,
também tem sido mostrado que a sua adição nos meios de maturação é desnecessária
(DODE e GRAVES, 2002; LI et al., 2004). Se esses hormônios esteróides são
importantes para a maturação, provavelmente as células do cumulus os sintetizam em
quantidades suficientes (DODE e GRAVES, 2002). MINGOTI et al. (2002)
demonstraram que as células de COCs bovinos possuem a capacidade de secretar E2 e
P4 no meio de cultura definido durante a maturação in vitro. WANG et al. (2006)
demonstraram que a inibição da secreção de esteróides pela adição de
aminoglutatimida (AGT, um inibidor da cadeia de clivagem do colesterol) no meio de
maturação preveniu a maturação e expansão das células do cumulus em oócitos
bovinos, e que seu efeito inibitório não foi revertido pela adição de E2 e P4 nesse meio.
Essas evidências mostram que os hormônios esteróides secretados pelo COC durante
o cultivo têm efeito significativo na maturação oocitária in vitro, contudo mais estudos
são necessários para se avaliar o seu papel em bovinos.
2.2.6. Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é um radical livre (YAMAUCHI et al., 1997) sintetizado via
oxidação da L-arginina em NO e L-citrulina (MONCADA et al., 1991; NATHAN, 1992),
catalisada por três diferentes isoformas de NOS (NO sintase), dependendo do tecido de
origem, assim como nas propriedades funcionais: 1) NOS neuronal (nNOS), 2) NOS
endotelial (eNOS), que são constitutivas (cNOS) e são capazes de liberar NO em
pequenas quantidades por períodos curtos em resposta ao estímulo no receptor
(PALMER et al., 1998) e 3) NOS induzível (iNOS), que é expressada, principalmente,
21
em resposta a citocinas inflamatórias e lipopolissacarídeos (MORRIS e BILLIAR, 1994;
VAN VOORHIS et al., 1995; ZACKRISSON et al., 1996; JABLONKA-SHARIFF e
OLSON, 1997; NAKAMURA et al., 1999) e responsável pela produção de NO em alta
concentração por um período prolongado.
Tanto a nNOS quanto a eNOS são cálcio/calmodulina dependentes durante
sua ativação (SNYDER, 1995). O aumento do cálcio intracelular desencadeia uma
cascata de eventos ativando a cNOS e a síntese de NO. O cálcio intracelular se liga à
calmodulina para formar um complexo cálicio-calmodulina e regula a ligação da
calmodulina ao “alelo dominante”, permitindo a transferência de elétrons do NADPH via
grupamento flavina, cujo sítio ativo contém domínio heme redutase, facilitando a
conversão do O2 e L-arginina em NO e L-citrulina (SIDDHANTA et al., 1996). O NO
gerado por essas isoformas participa de várias respostas fisiológicas, por exemplo,
neurotransmissão e manutenção do tônus vascular (DAWSON e DAWSON, 1996). Já a
iNOS é cálcio independente e contém calmodulina para cada subunidade da enzima e
sua ativação não requer um aumento intracelular de cálcio e resulta na permanente
ativação da enzima (CHO et al., 1992). O NO liberado por esta enzima está envolvido
na vasodilatação patológica e danificação dos tecidos (KILBOURN et al., 1990).
Além do cálcio, vários outros fatores podem regular a atividade da NOS.
Mecanismos pré e pós-transducionais e transcripcionais têm sido mostrados por regular
a expressão de todas as isoformas da NOS (KELLY et al., 1996). Apesar da iNOS ser
citosólica, a cNOS possui um sítio para miristilação, possibilitando sua ligação na
membrana da célula (BUSCONI e MICHEL, 1993). A fosforilação da cNOS pela
proteína cinase C e A está associada com o desligamento da enzima e perda da
atividade (MICHEL et al., 1993). Segundo GELLER et al. (1993), existem sitios de
fosforilação na iNOS, mas nenhuma significância funcional tem sido demonstrada.
Estudos mostram que a atividade da NOS é dependente de uma variedade de
substratos e co-fatores como NADPH, flavina mononucleotídeo (FMN), flavina adenina
dinucleotídeo (FAD) e tetrahidrobiopterina (THB) e a disponibilidade desses co-fatores
determina o padrão de síntese de NO pelas células. A ativação máxima de NOS requer
NADPH, FAD, FMN, THB e “thiol” reduzido. Isto implica que a atividade dos caminhos
metabólicos que geram ou competem com esses co-fatores, sob condições fisiológicas
e patológicas, poderia exercer um importante papel na determinação da taxa de NO
22
celular. A síntese de NADPH tem sido demonstrada por ser co-induzida com a iNOS.
Além disso, a atividade da geração da NADPH pelo caminho das pentoses e da taxa
limitante da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, em particular, tem sido
correlacionada com a produção de NO (MORRIS e BILLAR, 1994). A glicose, então,
estimula a síntese de NADPH via caminho das pentoses fosfatos, que, por sua vez,
favorecem a conversão da L-arginina em L-citrulina (BLACHIER et al., 1991).
Diversos efeitos na citotoxidade celular podem ser causados pelo NO, mas seu
efeito é mais complexo em relação à apoptose. A morte celular mediada pela apoptose
é controlada por sinais celulares específicos. O NO pode tanto proteger quanto mediar
esse tipo de morte celular, dependendo do tipo da célula e de sua concentração. A
proteção pode ocorrer em diferentes condições. Por exemplo, o NO protege os
hepatócitos in vivo da apoptose induzida pelo TNFα (BOHLINGER et al., 1995) e
também os folículos ovarianos da degeneração causada pela atresia em ratas (CHUN
et al., 1995). Por outro lado, o NO participa na apoptose de neurônios corticais,
macrófagos (TERENZI et al., 1995) e células pancreáticas, entre outros (MESSMER et
al., 1994). A morte celular mediada pelo NO em macrófagos é inibida por antagonistas
dos fatores ativadores das proteínas cinase A e C, sugerindo que a transdução de
sinais por meio destas proteínas está envolvida no mecanismo de ação do NO, que
leva à apoptose (MESSMER et al., 1995). Contudo, este mecanismo nunca foi
estudado no sistema reprodutor de bovinos.
Um dos primeiros alvos para a ação citotóxica do NO é a mitocôndria
(MONCADA et al., 1991). A inibição da mitocôndria mediada pelo NO parece ter um
componente reversível e irreversível. O NO pode interagir diretamente com a citocromo
c oxidase para inibir reversivelmente a respiração celular (LISDERO et al., 1996; SHIVA
et al., 2001) e esta interação ocorre quando o NO se encontra em altas concentrações.
Entretanto, como ocorre em condições inflamatórias, o complexo I (NADH-ubiquinona
oxidoredutase) e o complexo II (succinato-ubiquinona oxidoredutase) são,
irreversivelmente, inibidos pelo NO (BROWN, 1995).
O NO pode atuar por meio da sua ligação com radicais livres levando à
inativação do O2-, prevenindo, assim, a toxidade celular. No entanto, em condições
apropriadas, a reação do NO com O2- pode resultar na formação do peroxinitrito
(ONOO-), um potente oxidante (BECKMAN e CROW, 1993). Esses achados
23
demonstram que a ação do NO na célula depende da sua concentração, seu estado
reduzido, e da abundância de metais, proteínas e tiols de baixo peso molecular, como a
glutationa.
A solubilidade máxima do NO na água é semelhante à do oxigênio puro. Ele é
considerado uma molécula polar que se difunde livremente através das membranas. Na
presença de tecidos biológicos, a meia-vida do NO é de 3 a 5 segundos (MONCADA et
al., 1991; IGNARRO, et al., 1993; BLASHKIV et al., 2001). Numerosas interações
químicas nas células ou tecidos podem ocorrer mesmo com esta meia-vida tão curta,
incluindo reações com O2, ânion superóxido e outros radicais derivados de O2 e
oxihemoproteínas (IGNARRO et al., 1993). A mensuração de NO2- e de NO3
- em
soluções aquosas é utilizada para prover uma estimativa indireta do NO endógeno
(ARCHEOR, 1993).
2.2.6.1. Óxido nítrico no sistema ovariano
O óxido nítrico é gerado por várias células ovarianas e no interior dos vasos
sangüíneos ovariana; macrófagos residentes neste local também têm sido indicados
como uma possível fonte de NO em ratas (DAVE et al., 1997).
O sistema NOS/NO ovariano exerce papel na regulação da esteroidogênese
(OLSON et al, 1996; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998; MITHELL et al., 2004), na
morte apoptótica das células (CHUN et al, 1995; YAMAGATA et al., 2002), na ovulação
(DIXIT e PARVIZI, 2001; YAMAGATA et al., 2002; LUKAS et al., 2002), na maturação
meiótica in vivo (JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998; JABLONKA-SHARIFF et al,
1999a) e in vitro (SENGOKU et al., 2001; MATTA et al., 2001; NAKAMURA et al., 2002;
GOUD et al., 2005; HUO et al., 2005; VIANA et al., 2003) e no desenvolvimento
embrionário inicial (SENGOKU et al., 2001; BLASHKIV et al., 2001; LUKAS et al., 2002;
YANG et al., 2005).
Das três isoenzimas de NOS, os ovários de ratas expressam a eNOS e a
iNOS, mas não a nNOS (VAN VOORHIS et al., 1995; ZACKRISSON et al., 1996;
JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; NAKAMURA et al., 1999). A expressão da
eNOS aumenta depois do surgimento de LH ou da injeção de hCG (VAN VOORHIS et
al., 1995; JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; NAKAMURA et al., 1999). Foi
24
observada a presença da eNOS na região periférica de oócitos de ratas por meio de
estudos imunocitoquímicos de folículos imaturos estimulados por gonadotrofinas
(JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997). Em camundongos, foi observado que, na
ausência da eNOS, a maturação meiótica foi prejudicada (JABLONKA-SHARIFF e
OLSON, 1998). Usando a análise por transcrição reversa, ou seja, a reação em cadeia
de polimerase (RT-PCR) e “Western blotting”, foi demonstrado por HATTORI et al.
(2000, 2001) que oócitos de porca apresentavam alto conteúdo de proteína eNOS. Sob
condições basais, a eNOS constantemente produz pequenas quantidades de NO, mas
um aumento na síntese pode ocorrer se estimulado pela elevação do Ca2+ ou, talvez,
ativado por fosforilação devido à sinalização parácrina.
Embora as mudanças da expressão da iNOS durante os processo citados
acima sejam controversas (VAN VOORHIS et al., 1995; ZACKRISSON et al., 1996;
JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997; MATSUMI et al., 1998a; NAKAMURA et al.,
1999) e o papel do NO derivado da iNOS não esteja tão bem estabelecido, estudos
indicam que a expressão, tanto da iNOS quanto da eNOS, é regulada por
gonadotrofinas (JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1997). A produção de NO nas células
ovarianas de ratas é ativamente estimulada pela interleucina-1, assim como por várias
citocinas inflamatórias. Tem sido demonstrado que a iNOS pode ser induzida pelo fator
de necrose tumoral (TNFα), estimulando, assim, o GMPc (MATSUMI et al., 1998a).
Segundo ANTEBY et al. (1996), num estudo realizado em fluido folicular de
humanos, a geração de NO (medido pelas concentrações basais de nitrito e nitrato)
aumentou tanto com os níveis de estradiol quanto com o tamanho do folículo. Estas
observações sugerem que há uma possível relação entre E2 com a concentração de
NO, assim como em suínos (GRASSELI et al., 1998), como em bovinos (BASINI et al.,
1998).
Vários fármacos que inibem a síntese de NO vêm sendo utilizados em estudos
sobre a fisiologia ovariana, como, por exemplo, a aminoguanidina (AG), que inibe
seletivamente a produção de NO pela inibição da enzima iNOS (CORBETT et al., 1992;
NAKAMURA et al., 2002; TAO et al., 2004; 2005; HUO et al., 2005). Este inibidor da
síntese de NO é estruturalmente similar à L-arginina por apresentar dois grupos
nitrogênio guanidina equivalentes quimicamente e competitivamente inibem a síntese
de NO (CORBETT et al., 1992).
25
2.2.6.2. Papel do óxido nítrico na maturação oocitária
No processo de maturação oocitária, várias pesquisas indicam que o NO inibe
(camundongos, JABLONKA-SHARIFF e OLSON, 1998; ratas, JABLONKA-SHARIFF et
al., 1999a; NAKAMURA et al., 2002) ou estimula (camundongos, SENGOKU et al.,
2001; BLASHKIV et al., 2001; BU et al., 2004; HUO et al., 2005; suínos, TAO et al.,
2004; 2005; bovinos, MATTA et al., 2001; 2002; VIANA et al., 2005) a maturação
nuclear, dependendo de sua concentração.
Um mecanismo pelo qual o NO pode participar na maturação oocitária envolve
a regulação da síntese de nucleotídeos cíclicos. O NO é conhecido como regulador da
guanilato ciclase (MILLER et al., 2003) e estimula a produção de GMPc em células alvo
(NATHAN, 1992). Nucleotídeos cíclicos sintetizados pelas células do cumulus têm sido
reconhecidos como importantes moduladores da maturação de oócitos (TORNELL et
al., 1991).
O óxido nítrico se liga e ativa a guanilato ciclase e aumenta a concentração de
GMPc nas células alvo. O GMPc foi localizado nas células da granulosa de ovários de
ratas e está envolvido na retomada da meiose (TORNELL et al., 1991). Sua influência
na sinalização celular é através da ativação ou inibição de fosfodiesterases (PDE).
Existem 11 famílias conhecidas da PDE, e a atividade da PDE classe 3, expressa no
oócito, é inibida pelo GMPc (CONTI et al., 1995). Alguns estudos mostram que o GMPc
aumenta os níveis de AMPc pela inativação da fosfodiesterase AMPc do tipo 3 (AMPc-
PDE3), resultando no aumento da concentração de AMPc, impedindo a retomada da
meiose (KURTZ et al., 1998).
MATTA et al. (2001), pela primeira vez na literatura, demonstraram que o
inibidor da síntese de NO (L-NAME), nas concentrações utilizadas na maturação in vitro
de oócitos bovinos, não inibiu a meiose. Observaram, também, que a maturação
citoplasmática é mais sensível do que a nuclear a concentrações reduzidas de NO no
meio de maturação e que o NO está envolvido na regulação da concentração de
proteínas, possivelmente relacionadas com a inibição da maturação citoplasmática e,
conseqüentemente, com o desenvolvimento embrionário inicial. Além disso, MATTA et
al. (2002) comprovaram que a utilização de concentrações mais elevadas de L-NAME
resultou numa menor taxa de oócitos em MII após 24h de cultivo e que os oócitos que
26
não alcançaram a MII apresentaram-se degenerados com alterações no rearranjo dos
cromossomos, sugerindo que concentrações adequadas de NO são essenciais para
que a maturação nuclear de oócitos bovinos in vitro ocorra.
YAMAGATA et al. (2002) sugeriram que a diminuição da produção de NO
derivado da iNOS pode exercer um papel importante na maturação nuclear do oócito de
ratas. Ainda neste estudo, foi verificado que o inibidor da iNOS diminuiu a produção de
GMPc em folículos pré-ovulatórios e que a adição de um doador de NO bloqueou esta
supressão, sugerindo que o NO derivado da iNOS produz alta concentração de GMPc
nestes folículos, capaz de inibir o processo de maturação meiótica em oócitos de ratas.
O GMPc mantém a parada meiótica de oócitos de folículos pré-ovulatórios por meio de
2 vias: uma envolvendo a sustentação dos níveis de AMPc pela inibição da AMPc-PDE
no oócito e outra envolvendo a ativação da proteína cinase dependente de GMPc
(TORNELL et al., 1991). A MAPK exerce um papel importante na maturação inicial de
oócitos mamíferos (FISSORE et al., 1996; YAMASHITA et al., 2000) e o interessante é
que o NO inibe a atividade da MAPK via geração de GMPc via tirosina cinase (INGRAM
et al., 2000). Segundo DHAUNSI et al. (1997), o NO inibe diretamente a MAPK via
ativação da tirosina cinase, mas esses mecanismos ainda não são totamente
conhecidos.
Estudos realizados por HUO et al. (2005), em camundongos, utilizando AG nas
concentrações de 1, 10 e 50 mM revelaram a localização subcelular da iNOs nos
diferentes estádios da maturação meiótica e na fertilização, usando microscopia
confocal e micro-injeção de anticorpo específico da AG e por meio da inibição
específica da iNOS e concluíram que há uma localização específica da iNOS no oócito
maturado. Em oócitos em estádio de VG, a imunoreatividade da iNOS foi principalmente
localizada na VG. Logo após da VGBD, iNOS acumulou-se ao redor dos cromossomos
condensados. Na MI e MII, já com a organização da placa equatorial dos cromossomos,
a iNOS estava concentrada ao redor dos cromossomos alinhados. O acúmulo da iNOS
na região do fuso não pôde ser detectado nas fase A e na fase T, estava concentrada
entre os cromossomos separados. O processo de VGBD e da liberação do primeiro
corpúsculo polar foi, significantemente, inibido pela AG de uma maneira dose-
dependente, ou seja, quando utilizaram a concentração de 50 mM de AG observaram
que houve uma completa inibição da VGBD, além de terem visto que essa
27
concentração também inibiu, completamente, a fosforilação da MAPK, sugerindo que o
NO derivado da iNOS exerce um papel crucial na maturação meiótica de oócitos de
camundongos.
Outros trabalhos também mostraram que a AG inibiu o processo de retomada
da meiose (NAKAMURA et al., 2002; TAO et al., 2004; 2005) e que inibidores da NOS
também influenciam a maturação do oócito em ratas (JABLONKA-SHARIFF et al.,
1999a; NAKAMURA et al., 2002) e em coelhas (YAMAUCHI et al., 1997). Segundo
NAKAMURA et al. (2002), num experimento feito com oócitos de ratas, foi observado
que, quando eles utilizaram as concentrações de 10 e 100 mM de AG, houve um
significante aumento na porcentagem de oócitos com estádio de VG, inibindo a
retomada da meiose e que esse efeito foi revertido quando adicionaram NO no meio de
cultura (500 µM de SNAP, s-nitroso-L-acetil penicilamina, um doador de NO), sugerindo
que o NO derivado da iNOS seja um inibidor da maturação meiótica de oócitos de ratas.
Foi também observado que a AG diminuiu a produção de GMPc em folículos pré-
ovulatórios e que a adição de SNAP bloqueou esta supressão. Em suínos, foi
observado que 10 mM de AG inibiu o rompimento da VG (TAO et al., 2004; 2005).
28
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4. TRABALHO
O trabalho a seguir foi elaborado para futura publicação, segundo as normas
da revista: Animal Reproduction Science.
Título: Efeito da inibição da enzima óxido nítrico sintase sensível à aminoguanidina na
maturação in vitro de oócitos bovinos.
49
EFEITO DA INIBIÇÃO DA ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE SENSÍVEL À AMINOGUANIDINA NA MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da inibição da enzima óxido
nítrico sintase (NOS) sensível à aminoguanidina (AG) na maturação nuclear e
citoplasmática in vitro de oócitos bovinos. Os COCs foram cultivados com diferentes
concentrações de AG (0, 1, 10 e 100 mM) e 10-5 M de nitroprussiato de sódio (SNP,
doador de NO) adicionado a 100 mM de AG, durante 24 h. No experimento 1, foi
avaliado o grau da expansão das células do cumulus, o estádio de maturação nuclear,
a integridade da membrana plasmática das células do cumulus e do oócito. As
concentrações de NO2-,/NO3
-, P4 e E2 foram determinadas no meio de maturação pelo
método de Griess e por quiluminescência, respectivamente. A adição de diferentes
concentrações de AG no meio de maturação promoveu um efeito dose-resposta na
expansão das células do cumulus de COCs bovinos (P<0,05). A adição de 1 e 10 mM
de AG no meio de MIV não afetou a integridade da membrana plasmática dos oócitos
nem a maturação nuclear (P>0,05), contudo, diminuiu a integridade da membrana das
células do cumulus. A concentração de 100 mM inibiu a transição da metáfase I (MI)
para a metáfase II (MII), promoveu lesão da membrana plasmática dos oócitos (P<0,05)
e aumentou a concentração de NO2-,/NO3
- quando comparada com o controle (P<0,05)
e com 1 e 10 mM de AG (P>0,05). A adição de 10-5 M de SNP a 100 mM de AG não
reverteu os efeitos causados por 100 mM de AG, mas aumentou a concentração de
NO2-/NO3
-. Nenhuma concentração adicionada ao meio de maturação alterou a
concentração de E2. A adição de 100 mM de AG diminuiu a concentração de P4
(P<0,05), quando comparada ao controle e demais concentrações. Este efeito foi
revertido pela adição de SNP. No experimento 2, foi avaliado o efeito da adição de
diferentes concentrações de AG na maturação citoplasmática in vitro pela avaliação da
taxa de migração dos grânulos corticais, clivagem e produção de blastocistos. Houve
um efeito dose-resposta na migração dos grânulos corticais, onde 1 mM (83,9 ± 6,2%)
não diferiu do controle (83,6 ± 8,2%; P>0,05), 10 mM inibiu parcialmente (3,8 ± 6,4%) e
100 mM inibiu totalmente a migração dos grânulos corticais (P<0,05). A adição de SNP
(10-5 M) não reverteu o efeito inibitório da migração dos grânulos corticais dos oócitos
50
tratados com 100 mM. Somente as concentrações de AG que não inibiram a MIV foram
utilizadas para avaliar a taxa de clivagem e produção de blastocistos. A adição de 10
mM de AG no meio de maturação diminuiu (73,0 ± 8,1%; P<0,05) a taxa de clivagem e
produção de blastocistos, quando comparada com grupo controle (89,1 ± 3,4%; 37,6 ±
7,3%, respectivamente), mas não diferiu, (P>0,05), do grupo tratado com 1 mM de AG
(80,9 ± 8,4%; 41,5 ± 10,5%, respectivamente). Os resultados do presente experimento
demonstram que o NO derivado da NOS sensível à AG modula a maturação nuclear e
citoplasmática in vitro de oócitos bovinos.
Palavras-chave: óxido nítrico, aminoguanidina, maturação nuclear, grânulos corticais,
desenvolvimento embrionário inicial.
ABSTRACT
The aim of the present study was to investigate the effects of inhibition of the
enzyme nitric oxide synthase (NOS) sensitive to aminoguanidine (AG) on nuclear and
cytoplasmic maturation of bovine oocytes in vitro. COCs were cultured with different
concentrations of AG AG (0, 1, 10 and 100 mM) and to 10-5 M sodium nitroprusside
(SNP, NO donor) associated with 100mM AG for 24h. In experiment 1, the degree of
cumulus cells expansion, nuclear maturation status and plasma membrane integrity of
oocytes and granulosa cells were assessed. NO2-,/NO3
-, P4 and E2 were determined in
culture medium by Griess method and chemiluminescence, respectively. Addition of
different concentrations of AG to maturation medium promoted a dose-response effect
on cumulus expansion (P<0.05). Addition of 1 and 10mM AG to IVM medium did not
affect plasma membrane integrity of oocytes or nuclear maturation rates (P>0.05),
however, plasma membrane integrity was reduced in cumulus cells. One hundred
millimolar inhibited metaphase I (MI) to metaphase II (MII) transition, promoted plasma
membrane damage in oocytes (P<0.05) and increased NO2-,/NO3
- concentration when
compared to controls (P<0.05). Association of 10-5 M SNP to 100mM AG did not reverse
the effects of AG, but increased NO2-/NO3
-concentration. None of the AG concentrations
tested in maturation medium affected E2 concentration. Addition of 100mM AG reduced
P4 concentration (P<0.05) when compared to controls and the other concentrations
51
used. This effect was reversed by SNP. In experiment 2, the effect of different AG
concentrations on cytoplasmic maturation in vitro was assessed based on cortical
granules migration, cleavage and blastocyst development rates. There was a dose-
effect on cortical granules migration rate, in which 1mM AG (83.9 ± 6.2%) did not differ
from control oocytes (83.6 ± 8.2%; P>0.05), but 10mM partially inhibited (3.8 ± 6.4%)
and 100mM totally inhibited migration (P<0.05). SNP (10-5 M) did not revert this
inhibitory effect on cortical granules migration in oocytes treated with 100mM AG. Only
those concentrations that did not inhibit IVM were used to assess cleavage and
blastocyst rates. Addition of 10mM AG to IVM medium reduced (73.0 ± 8.1%; P<0.05)
cleavage and blastocyst rates when compared with controls (89.1 ± 3.4%; 37.6 ± 7.3%,
respectively), but did not differ, (P>0,05), from the group treated with 1mM AG (80.9 ±
8.4%; 41.5 ± 10.5%, respectively). The results from the present study demonstrate that
NO derived from NOS sensitive to AG modulates nuclear and cytoplasmic maturation of
bovine oocytes in vitro.
Keyword: nitric oxide, aminoguanidine, nuclear maturation, cortical granules, early
embryo development.
INTRODUÇÃO
O controle dos processos envolvidos na maturação do oócito é crítico para as
técnicas de reprodução assistida (ART) (FISSORE et al., 2002). As mudanças celulares
que ocorrem no oócito durante a maturação e os mecanismos relacionados não são
totalmente conhecidos. O envolvimento do NO na maturação in vitro de oócitos bovinos
tem sido demonstrado (MATTA et al., 2001; 2002; VIANA et al., 2005; NATORI et al.,
2005; SCHWARDZ et al., 2006). O NO é sintetizado pela conversão da L-arginina em L-
citrulina e NO, catalizada pela família de isoenzimas conhecida como óxido nítrico
sintase (NOS) (MITCHELL et al., 2004; HUO et al., 2005). Duas isoformas constitutivas
foram identificadas: endotelial (eNOS) e neuronal (nNOS) e induzível (iNOS) (TOTZKE
et al., 2001). Estudos recentes também mostram que o NO pode ser produzido pela
NOS mitocondrial (mtNOS) (BUSTAMANTE et al., 2004).
52
No processo de maturação oocitária, o NO inibe (camundongos, JABLONKA-
SHARIFF e OLSON, 1998; ratas, JABLONKA-SHARIFF et al, 1999a; NAKAMURA et
al., 2002) ou estimula (camundongos, SENGOKU et al., 2001; BU et al., 2004; HUO et
al., 2005; suínos, TAO et al., 2004; 2005; bovinos, VIANA et al., 2005) a maturação
nuclear, dependendo de sua concentração.
Tem sido demonstrado que a iNOS pode ser detectada em folículos de suínos
(HATTORI et al., 2001), células da granulosa (TAKESUE et al., 2003), células do
cumulus e oócitos de camundongos (MITCHELL et al., 2004). HUO et al. (2005)
demonstraram a localização subcelular da iNOs nos diferentes estádios da maturação
nuclear e na fertilização, usando micro-injeção de anticorpo específico da iNOS. O NO
sintetizado pela iNOS sensível à AG modula o processo da maturação nuclear do
oócito, incluindo a inibição da VGBD e a liberação do primeiro corpúsculo polar de
oócitos de camundongos (BLASHKIV et al., 2001; HUO et al. (2005), ratas
(VOZNESENS´KA e BLASHKIV, 2003; BU et al., 2003) e porcas (TAO et al., 2004;
2005).
Vários fármacos que inibem a síntese de NO vêm sendo utilizados em estudos
sobre a fisiologia ovariana, como por exemplo, a aminoguanidina (AG), que inibe
seletivamente a produção de NO pela inibição da atividade da iNOS (NAKAMURA et al.,
2002; TAO et al., 2004; 2005; HUO et al., 2005). Este inibidor da síntese de NO é,
estruturalmente, similar à L-arginina, por apresentar dois grupos nitrogênio guanidina
equivalentes quimicamente, inibindo, por competição, a síntese de NO (CORBETT,
1992). Em bovinos, não há nenhum trabalho mostrando qual (ais) isoformas de NOS é
(são) inibida (s) com o uso da AG.
A presença de esteróides no fluido folicular antes e também durante a
maturação sugere que esses hormônios (P4 e E2) sejam importantes para a maturação
nuclear e citoplasmática (HAMES, 2004). Em bovinos, ALI et al. (2004) relataram que a
adição de E2 ao meio de maturação provocou aumento na produção de blastocistos.
JAYAWARDANA et al. (2006) observaram, em bovinos, que o E2, juntamente com o
FSH, está envolvido na expressão do GDF-9, que é um dos principais fatores
secretados pelo oócito que está envolvido no processo de expansão das células do
cumulus durante a maturação. FATEHI et al. (2002) relataram que a falta de P4 durante
a maturação in vitro provoca diminuição nas taxas de fertilização e clivagem em
53
bovinos. Essas evidências mostram que os hormônios esteróides secretados pelo COC
durante o cultivo têm efeito significativo na maturação oocitária in vitro. Tem sido
demonstrado que o NO diminui a produção de P4 e E2 em células da granulosa em
bovinos, sendo este um dos possíveis mecanismos de ação do NO durante a MIV de
oócitos bovinos (FAES et al., 2005).
Neste estudo, nós objetivamos investigar a ação da inibição da enzima NOS
sensível à AG na maturação nuclear e citoplasmática in vitro de oócitos bovinos e a sua
relação com a esteroidogênese das células do cumulus.
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta dos ovários e obtenção dos oócitos
Ovários de vacas cíclicas foram obtidos diariamente em matadouros. Após a
coleta, foram imediatamente colocados em frascos térmicos, contendo solução salina
estéril mantida entre 35 e 37oC. Os ovários foram levados ao laboratório, onde foram
puncionados com a utilização de uma bomba a vácuo (100 mm/Hg). O período entre a
coleta e início da maturação dos ovários foi de cerca de 2 h.
Os complexos cumulus oócito (COCs) foram aspirados com uma agulha de
calibre 40 x 1,2 mm (19 G) e liberados em meio de lavagem (TCM 199 com HEPES)
acrescido de 100 UI/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina, suplementado com
5% de soro fetal bovino (SFB) numa temperatura de 30º C, contendo 3-isobutil-1-metil
xantina (IBMX) a 0,5 mM, para evitar a retomada da meiose durante o período de
manipulação dos mesmos. O IBMX inibe a síntese da enzima, que degrada o AMPc
(fosfodiesterase AMPc, AMPc-PDE) (EPPIG & DOWNS, 1984). Os COCs foram
selecionados e apenas os de categorias 1 e 2 (aparência clara, apresentando cumulus
compacto e ooplasma homogêneo) (DE LOOS et al., 1989) foram utilizados no
experimento. Após a seleção, os COCs foram lavados (4x) com o mesmo meio sem
IBMX e, em seguida, foram colocados nas gotas de maturação in vitro.
54
Maturação in vitro
Os COCs selecionados foram transferidos para gotas de 150 µl de meio de
maturação em placas de cultura (3,5 cm), sob óleo mineral e incubados a 38,5 oC em
atmosfera com 5 % de CO2 em ar durante 24 h. O meio de maturação in vitro foi o meio
de cultura de tecidos (TCM) 199 suplementado com 10 % de SFB, 0,5 µg/ml de FSH, 5
µg/ml de LH e antibióticos (100 UI/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina). Após
24 h de maturação, os oócitos foram removidos e o meio coletado (130 µl) e estocado a
-20 oC até o dia das dosagens de NO2- /NO3
-, P4 e E2
Avaliação da expansão do cumulus
A expansão do cumulus foi avaliada 24 h após o início da maturação in vitro,
utilizando-se um método de classificação subjetiva (VANDERHYDEN, 2003): 0-
nenhuma resposta observada; 1- reposta mínima; 2- expansão das camadas externas;
3- expansão de todas as camadas, exceto da corona radiata e 4- expansão de todas as
camadas (TAO et al., 2004a).
Avaliação da morfologia nuclear
Após o período de maturação, os COCs foram desnudados mecanicamente
numa solução contendo PBS e SFB a 10% para remoção das células do cumulus,
sendo colocados em microtubos com 0,5 ml de solução fisiológica (NaCl 0,9%)
acrescida de 5% de SFB, e foram delicadamente agitados no “vortex” por 5 min. Em
seguida, os oócitos foram fixados entre lâmina e lamínula por 24 a 48 h em etanol/ácido
acético (3:1), corados com orceína acética 2%, lavados com etanol e observados em
microscópio de contraste de fase da marca NIKON (400 x) para determinação dos
estádios de maturação nuclear: vesícula germinativa (VG), pré-metáfase I (pré-MI,),
metáfase I (MI), anáfaseI (AI), telófase I (TI) e metáfase II (MII) (BRUNET e MARO,
2005).
55
Avaliação da integridade da membrana plasmática
No final do período de maturação, os COCs foram desnudados mecanicamente.
O oócito e as células do cumulus foram expostos separadamente a um mix de corantes
fluorescentes, laranja de acridina e brometo de etídio na concentração de 1:1 e PBS
suplementado com 10% de SFB e incubados numa temperatura ambiente durante 5
min. Em seguida, foi feita a montagem entre lâmina e lamínula contendo glicerol, TRIS
fosfato suplementado com n-propil (0,5%). Após esse procedimento, os oócitos foram
submetidos à microscopia de fluorescência para avaliação da integridade da membrana
plasmática e da condensação da cromatina. Assim, a integridade da membrana
plasmática do oócito e das células do cumulus, foi classificada da seguinte forma:
viáveis (cromatina verde), pois houve a penetração da laranja de acridinas nas células e
não-viáveis (cromatina laranja), com penetração do brometo de etídio. Foram contadas
de 200 a 250 células do cumulus de cada COC.
Coloração de grânulos corticais
Para a coloração dos grânulos corticais, o método utilizado foi o de BEKER et al.
(2000). Após o período de 24 h de maturação, os oócitos foram desnudados
mecanicamente numa solução de PBS e SFB a 10%, lavados 3 vezes em meio TCM
199 a 39ºC, onde foi feita a remoção completa das células do cumulus. Em seguida, foi
feita a remoção da zona pelúcida com protease de Streptomices griseus, tipo XIV
diluída numa concentração de 0,1% em PBS. Após, os oócitos foram lavados por mais
3 vezes, de 5 min cada, em meio contendo TCM 199 para retirar o resto da zona
pelúcida, lavados em solução bloqueio (SB), que consistiu em PBS suplementado com
0,1% de BSA, fração V e 0,75% de glicina. Em seguida, foram fixados em solução de
paraformaldeído dissolvido em PBS a 3% numa temperatura ambiente por 30 min,
lavados em SB (3 vezes de 5 min cada) e permeabilizados em 0,1% de Triton X-100
diluído em PBS por extritamente 5 min a 39ºC, lavados novamente em SB (3 vezes de
5 min cada), incubados com 100 µg/mlde amedoim aglutinina conjugada a FITC (FITC-
PNA) a 37ºC, durante 30 min. Após a coloração, os oócitos foram lavados por mais 2
vezes (de 5 min cada) em SB e 1 vez em água destilada. A montagem das lâminas foi
56
feita utilizando-se um meio contendo glicerol a 90% e TRIS suplementado com 0,5% de
n-propil a 10% e levadas para o microscópio de fluorescência (400x, Eclipse
TE300/TE200, Nikon) para visualização dos grânulos corticais.
Dosagem de nitrito e nitrato
O reagente de Griess é composto de uma mistura de sulfanilamida 2% e N-(1-
naphthyl) ethylene-diamine 0,2% em água Milii Q. A primeira reação na amostra ocorreu
com o nitrito para formar o sal diazonium que reagiu com o segundo reagente para
formar a cor púrpura com um pico de absorbância a 540 nm. Para reduzir o nitrato a
nitrito, as amostras (40 µl) foram incubadas com uma mistura contendo 1000 µl da
enzima nitrato redutase (100 µl da enzima 10 UI diluída em água Milli Q + 900 µL de
água Milli Q) oriunda de bactéria, 1000 µl do cofator NADPH (5mg/mL) diluído em água
Milli Q, 1000 µl de tampão fosfato de potássio (0,5 M). Em seguida, as amostras foram
incubadas a 37 oC por 14-16 h. O método foi desempenhado em placa de 96 poços.
Posteriormente, 80 µl do reagente de Griess foram adicionados às amostras. Todas as
soluções foram protegidas da luz. Uma curva padrão de nitrito de sódio diluída em
DMEM/Ham`s-F12 contendo valores conhecidos de nitrito foi realizada, onde o valor
mínimo de nitrito foi de 0,5 µM e o máximo de 100µM. Com os valores da absorbância
foi montado um gráfico de dispersão. A relação entre a absorbância e a concentração
de nitrato/nitrito foi linear (R2=0,98; P<0,05).
Dosagem de17β-estradiol e progesterona
No final de 24 h, o meio de cultura foi coletado e armazenado a -20oC para
dosagem de E2 e P4 pelo sistema automatizado de quimioluminescência ACS:180®. O
teste é um imunoensaio competitivo que usa uma tecnologia de quimioluminescente
direta. O anticorpo anti-P4 e anti-E2 monoclonal é marcado com éster de acridina. A
curva de P4 variou de ng/ml e a de E2, de pg/ml. As amostras para dosagem de P4
foram diluídas em meio de cultivo (1/40) e para a dosagem de E2, não foi realizada
nenhuma diluição.
57
Fecundação e cultivo in vitro
Foi utilizado sêmen congelado de um mesmo touro e de uma mesma partida, o
qual foi preparado segundo a técnica de gradiente Percoll (Pharmacia) para a
fecundação in vitro. Os espermatozóides vivos foram separados por gradiente de
Percoll 45-90% (Percoll diluído em Talp SP). O gradiente foi mantido na estufa de CO2
até o momento de sua utilização. O sêmen foi descongelado a uma temperatura de 36
– 37°C durante 1 minuto e, em seguida, adicionado na porção superior do gradiente de
Percoll e centrifugado por 8 min a 600 x g. Após a retirada do sobrenadante, uma nova
centrifugação de 2 min a 150 x g com 5 ml de meio TALP-SP foi realizada para remover
o excedente do Percoll. A concentração espermática final foi ajustada para 2,0 x 106 /ml
acrescido com meio de fertilização.
Após a maturação, 30 min antes do início da FIV, os oócitos foram lavados (4x)
em meio de fertilização e incubados juntamente com os espermatozóides a uma
temperatura de 38,5oC em atmosfera de 5% de CO2 durante 18 h. Depois desse
período de cultivo, os supostos zigotos foram lavados 4 vezes em meio de cultivo (TCM
199 sem Hepes suplementado com SFB a 10% acrescido de antibióticos: penicilina e
estreptomicina) para remoção das células do cumulus e espermatozóides e, em
seguida, transferidos para gotas de 100µl de meio de cultivo em placas de cultura sob
óleo mineral, onde foram mantidos por 8 dias a 38,5 oC, em atmosfera de 5% de CO2
em ar, sendo avaliada a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário inicial.
O meio de fecundação in vitro utilizado foi o Talp-fecundação (Talp-fec)
suplementado com 6 mg/ml de BSA livre de ácidos graxos, 100 UI/ml de penicilina e
100 µg/ml de estreptomicina, 2 mM de penicilamina, 1 mM de hipotaurina e 25 mM de
epinefrina. O Talp-SP consistiu numa mistura de BSA, piruvato e nistatina. Todos os
meios foram preparados no dia dos experimentos. Todos os reagentes utilizados foram
da marca Sigma (USA), exceto o etanol, da marca Merck (Damstadt, Alemanha).
58
Delineamento experimental
Experimento 1: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação nuclear
Experimento 1a: Foram adicionadas diferentes concentrações (0, 1, 10 e 100 mM) de
AG ao meio de maturação para avaliação da ação da AG na maturação in vitro de
oócitos bovinos. Somente no tratamento de 100 mM foram adicionados 10-5 M de SNP
(nitroprussiato de sódio) para observar se o efeito inibitório da atividade da iNOS
sensível à AG poderia ser revertido, pois VIANA et al. (2005) observaram, em bovinos,
que esta concentração melhorou, significativamente, a taxa de blastocistos produzidos
in vitro.
Após o período de maturação (24 h), foi feita a avaliação do grau de expansão
das células do cumulus. Em seguida, os oócitos foram desnudos, fixados e corados
para a observação do estádio de maturação nuclear.
Experimento 1b: As mesmas concentrações da AG foram utilizadas para avaliar o seu
efeito na integridade da membrana plasmática do oócito e das células do cumulus.
O meio de maturação de todos os tratamentos foi coletado e armazenado a -
20o C até o dia da dosagem de NO2-/NO3
-, P4 e E2.
Experimento 2: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação citoplasmática
Após a maturação, foi avaliada a localização dos grânulos corticais nos oócitos
tratados com as diferentes concentrações de AG.
Experimentos subseqüentes foram realizados somente com os oócitos tratados
com concentrações do inibidor que não interferiram no processo de maturação nuclear.
Estes oócitos foram fertilizados e foi observada a taxa de clivagem 48 horas após e de
desenvolvimento embrionário até blastocisto 7 e 8 dias depois.
Foram utilizados 30 a 40 oócitos em cada gota para cada concentração testada
e este procedimento foi repetido 6 a 8 vezes, mantendo-se sempre a mesma relação
(30 oócito/150 µl de meio de MIV).
59
Análise estatística
Para verificar o efeito da adição de diferentes concentrações de AG, inibidor da
síntese de NO, na maturação nuclear e citoplasmática, foi realizada uma análise de
variância (ANOVA) a 5% de probabilidade, com exceção para as características da
expansão das células do cumulus onde o tratamento de 10 mM de AG apresentou
100% de COCs com expansão do cumulus, com classificação 2, aplicando-se o teste
Quiquadrado a 5% de probabilidade.
Os resultados obtidos da expansão do cumulus com classificação 3 foram
transformados devido ao fato de apresentarem coeficiente de variação alto.
RESULTADOS
Experimento 1: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação nuclear
Células do cumulus
Expansão
A adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação promoveu
um efeito dose-resposta na expansão das células do cumulus de COCs bovinos
(Tabela 01, Figura 01). Não houve diferença significativa no grau de expansão das
células do cumulus de COCs tratados com 1 mM (92,1 ± 6,3%, classificação 4) quando
comparados com o controle (92,0 ± 7,9%, classificação 4, P>0,05). Contudo, quando se
adicionaram 10 mM de AG, verificou-se que 100% dos oócitos cultivados
apresentavam-se com expansão somente das camadas mais externas das células do
cumulus (100%, classificação 2), havendo diferença quando comparado com os
resultados obtidos no controle e nas demais concentrações utilizadas (P<0,05). Este
efeito da inibição da expansão das células do cumulus foi aumentado quando se
adicionaram 100 mM de AG, onde 92,8 ± 2,8% dos COCs não apresentaram nenhuma
expansão das células do cumulus (classificação 0) e 7,2 ± 2,8% dos COCs
60
apresentaram uma expansão mínima (classificação 1), havendo diferença significativa
entre o controle e demais concentrações utilizadas (P<0.05). O mesmo efeito foi
observado foi adicionado 100 mM de AG com 10-5 M de SNP, pois a adição de SNP
não reverteu o efeito inibitório de 100 mM de AG na expansão das células do cumulus.
Tabela 01: Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na expansão das
células do cumulus de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h.
Expansão das células do cumulus
(classificação em %) Tratamento/AG
(mM) n
0 1 2 3 4
Controle 240 0,0 ± 0,0b 0,0 ± 0,0b
0,0 ± 0,0a 8,0 ± 7,9b 92,0 ± 7,9b
1 240 0,0 ± 0,0b 0,0 ± 0,0b
0,0 ± 0,0a 7,9 ± 6,2b 92,1 ± 6,3b
10 240 0,0 ± 0,0b 0,0 ± 0,0b 100± 0,0b 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
100 240 92,8 ± 2,8a 7,2 ± 2,8a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
AG + SNP
(100 mM+10-5M)
240 93,5 ± 2,7a 6,5 ± 2,7a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
ab Valores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de seis experimentos com gotas de 40 oócitos.
61
Figura 01: Efeito dose-resposta da adição de diferentes concentrações de AG no meio de
maturação na expansão das células do cumulus de oócitos bovinos. Figura 1, painel A:
Controle; painel B, C e D: mostram COCs tratados com diferentes concentrações de
AG (1, 10 e 100 mM, respectivamente) durante 24 horas de maturação. Escala de
barra de aproximadamente de 250 µm.
Viabilidade
A adição de 1 mM de AG não alterou a viabilidade das células do cumulus, pois
96,0 ± 2,8% das mesmas encontraram-se sem lesão de membrana quando comparado
com os resultados obtidos do controle (94,6 ± 3,1%, P>0,05). Houve um efeito dose-
resposta, ou seja, as células do cumulus de COCs tratados com 10 mM de AG
apresentaram 26,8 ± 4,8% de células intactas, diferenciando (P<0,05) do controle e das
demais concentrações adicionadas no meio de maturação. A adição de 100 mM de AG
diminuiu a porcentagem de células do cumulus intactas (2,6 ± 1,1%) quando comparada
com o controle e as demais concentrações (Tabela 02).
C D
A B
62
Tabela 02: Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na viabilidade das
células do cumulus de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h.
abc Valores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de sete experimentos com gotas de 40 oócitos.
Oócito
Estádio da maturação nuclear
Nenhuma diferença significativa foi observada entre as concentrações de 1 e
10 mM e entre estas e o controle (P>0,05), todas atingiram MII após 24 horas de
maturação (Tabela 03). A adição de 100 mM de AG no meio de maturação diminuiu (P<
0,05) a porcentagem de oócitos em MII, 100% dos oócitos permaneceram em pré-MI
(cromossomos encontravam-se condensados e não havia formado a placa metafásica)
quando comparada ao grupo controle e as demais concentrações. Verificou-se que a
adição de 10-5 M de SNP a 100 mM de AG causou o mesmo efeito da adição de 100
mM de AG sem SNP, não revertendo o efeito inibitório da AG quando utilizada na
concentração de 100 mM (Tabela 03).
Integridade da membrana Tratamento/AG
(mM) n
Intacta (%) Lesada (%)
Controle 230 94,6 ± 3,1a 5,5 ± 3,2c
1 276 96,0 ± 2,8a 4,0 ± 2,8c
10 216 26,8 ± 4,8b 73,3 ± 4,7b
100 260 2,6 ± 1,1c 97,3 ± 1,1a
63
Tabela 03: Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na progressão da
meiose de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h .
Estádio de maturação Tratamento/AG
(mM)
n
% Pré-MI %MII
Controle 210 0,0 ± 0,0b 100,0 ± 0,0b
1 204 0,0 ± 0,0b 100,0 ± 0,0b
10 220 0,0 ± 0,0b 100,0 ± 0,0b
100 219 100,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
AG + SNP
(100 mM+10-5M)
221 100,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
ab Valores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de oito experimentos com gotas de 30 oócitos.
Viabilidade
Não houve diferença entre o controle e o tratamento com 1 e 10 mM de AG
(P>0,05), todos os oócitos apresentaram membrana plasmática íntegra. Os COCs
tratados com 100 mM de AG com e sem SNP apresentaram aumento de lesão da
membrana plasmática quando comparados com as demais concentrações (P<0,05,
Tabela 04), porém não houve diferença entre 100 mM de AG com e sem 10-5 M de
SNP.
64
Tabela 04: Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na integridade da
membrana plasmática de oócitos bovinos maturados in vitro por 24 h.
Integridade da membrana Tratamento/AG
(mM) n
Intacta (%) Lesada (%)
Controle 235 100,0 ± 0,0b 0,0 ± 0,0b
1 250 100,0 ± 0,00b 00,0 ± 0,00b
10 231 100,0 ± 0,00b 00,0 ± 0,00b
100 216 00,0 ± 0,00a 100,0 ± 0,00a
ab Valores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de sete experimentos com gotas de 40 oócitos.
Concentração de NO2-/NO3
-
A adição de 1 e 10 mM de AG não alterou (13,7 ± 1,7 mM; 17,0 ± 2,7 mM,
respectivamente) as concentrações de NO2-/NO3
- no meio de maturação quando
comparada com o grupo controle (13,0 ± 4,0 mM, P>0,05). Entretanto, a adição de 100
mM no meio de maturação aumentou significativamente (20,1 ± 3,1 mM) a
concentração de NO2-/NO3
- quando comparada ao controle e aos grupos tratados com
1 e 10 mM de AG (P<0,05). A adição de 10-5 M de SNP ao grupo tratado com 100 mM
de AG ao meio não reverteu a inibição da progressão de pré-MI para MII e aumentou
(29,7 ± 3,0 mM) a concentração de NO2-/NO3
- em relação ao controle e demais
concentrações de AG (P<0,05; Tabela 05).
65
Tabela 05 - Efeito da adição da AG no meio de maturação de oócitos bovinos in vitro na
concentração de NO2-/NO3
- (média ± DP).
Tratamento/AG (mM)
n NO3
-/NO2-
(µM)
Controle 210 13,0 ± 4,0c
1 204 13,7 ± 1,7c
10 220 17,0 ± 2,7bc
100 219 20,1 ± 3,1b
AG + SNP
(100 + 10-5 M)
221 29,7 ± 3,0a
abcValores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (p<0,05). Todos os valores representam os resultados obtidos em oito experimentos com gotas de 30 oócitos.
Concentração de P4 e E2
A concentração de E2 no meio de maturação não apresentou diferença
significativa (P>0,05) entre o controle (337,2 ± 117,8) e as demais concentrações de
AG. Porém, quando adicionamos SNP (10-5 M) a 100 mM de AG, houve um aumento
(29.450,7 ± 17.669,9) na concentração de E2 (P<0,05) em relação ao controle e às
demais concentrações (Tabela 6).
A adição de 1 e 10 mM de AG não alterou (P>0,05) a concentração de P4 (4,03 ±
2,00 ng/ml; 3,85 ± 1,33 ng/ml, respectivamente) no meio de maturação quando
comparada com a concentração observada no controle (3,71 ± 1,23 ng/ml). A
concentração de 100 mM de AG diminuiu a concentração deste esteróide no meio de
maturação (1,44 ± 0,47 ng/ml, P<0,05) quando comparada ao controle e demais
concentrações de AG. Contudo, quando se adicionaram 10-5 M de SNP a 100 mM de
AG esta inibição foi revertida, pois não houve diferença significativa entre a
concentração de P4 quando comparadas com o controle e com as demais
concentrações (P>0,05; Tabela 06).
66
Tabela 06- Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na concentração de E2
e P4 no meio de maturação de oócitos bovinos.
Concentração Tratamento Concentração
(mM) n
E2 (pg/ml) P4 (ng/ml)
Controle - 235 337,2 ± 117,8a 3,71 ± 1,23a
AG 1 250 212,7 ± 160,1a 4,03 ± 2,00a
10 231 370,3 ± 169,2a 3,85 ± 1,33a
100 216 539,3 ± 46,9a 1,44 ± 0,47b
AG + SNP 100 + 10-5 M 245 29.450,7 ± 17.669,9b 2,74 ± 1,63ab
ab Valores com diferentes letras na mesma coluna são significativamente diferentes (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de sete experimentos com gotas de 40 oócitos.
Experimento 2: Efeito de diferentes concentrações da AG na maturação citoplasmática
Migração dos grânulos corticais
Houve um efeito dose-resposta na adição de AG no meio de MIV quando se
avaliou a migração dos grânulos corticais (Tabela 07). Os COCs tratados com 1 mM de
AG não apresentaram diferença significativa quando comparados ao controle (P>0,05);
83,9 ± 6,2 % x 83,6 ± 8,2%, respectivamente. A concentração intermediária de AG (10
mM) promoveu migração parcial em 96,1 ± 6,4 % dos oócitos tratados, ou seja, os
grânulos se apresentaram na região medular central do oócito, diferindo,
significativamente, do controle e dos oócitos tratados com 1 e 100 mM de AG (P<0,05).
Os COCs tratados com 100 mM de AG apresentaram grânulos corticais distribuídos
somente na zona medular central, indicando que estes apresentavam um padrão de
oócitos imaturos (100% com nenhuma migração). O mesmo efeito foi observado
quando se adicionou 10-5 M de SNP a 100 mM de AG, pois a adição de SNP não foi
capaz de reverter o efeito inibitório de 100 mM de AG (Tabela 07).
67
Tabela 07: Efeito da adição de diferentes concentrações da AG na migração dos
grânulos corticais de oócitos bovinos.
Migração dos grânulos corticais (%) Tratamento/AG
(mM)
n nenhuma parcial total
Controle 118 0,0 ± 0,0b 16,3 ± 8,3c 83,6 ± 8,2c
1 111 0,0 ± 0,0b 16,0 ± 6,2c 83,9 ± 6,2c
10 97 0,0 ± 0,0b 96,1 ± 6,4b 3,8± 6,44b
100 89 100,0 ± 0,0a 00,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
AG + SNP
(100 mM+10-5M)
90 100,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a 0,0 ± 0,0a
abc Valores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (P < 0.05). A média ± S.E.M foi calculada de seis experimentos com gotas de 30 oócitos.
Porcentagem de clivagem e produção de blastocistos
Não houve diferença na taxa de clivagem e produção de blastocistos entre o
grupo tratado com 1 mM de AG e o grupo controle (P>0,05). A adição de 10 mM de AG
diminuiu (P<0,05) a taxa de clivagem e blastocistos (73,0 ± 8,1%; 15,0 ± 8,9%,
respectivamente) quando comparada com grupo controle (89,1 ± 3,4%; 37,6 ± 7,3%,
respectivamente) e com o grupo tratado com 1 mM de AG (80,9 ± 8,4%; 41,5 ± 10,5%,
respectivamente; Tabela 08).
68
Tabela 08 - Efeito da adição da AG no meio de maturação de oócitos bovinos in vitro na
taxa de clivagem e produção de blastocistos (média ± DP).
Tratamento/AG (mM)
n %
clivagem %
Blastocistos
Controle 210 89,1 ± 3,4b 37,6 ± 7,3b
1 204 80,9 ± 8,4 ab 41,5 ± 10,5b
10 220 73,0 ± 8,1a 15,0 ± 8,9a
100 219 - -
AG + SNP
(100 + 10-5 M) 221 - -
abValores com diferentes letras na mesma coluna diferem significativamente (p<0,05). Todos os valores representam os resultados obtidos em oito experimentos com gotas de 30 oócitos.
DISCUSSÃO
Neste estudo, demonstramos a ação do NO na maturação nuclear e
citoplasmática in vitro de oócitos bovinos por meio da inibição da NOS sensível à
aminoguanidina. Tem sido demonstrado que o NO derivado da iNOS atua na
maturação nuclear de oócitos de ratas, camundongos e suínos, (NAKAMURA et al.,
2002; BU et al., 2004; TAO et al., 2004; 2005) por meio da inibição desta enzima com o
uso de AG. No entanto, não há nenhum trabalho na literatura sobre o papel da NOS
sensível à AG em bovinos.
A adição de concentrações crescentes de AG apresentou um efeito dose-
resposta na inibição da expansão das células do cumulus, onde a concentração de 10
mM de AG inibiu a expansão das camadas mais externas das células do cumulus (grau
2). TAO et al. (2005) verificaram que 10 mM de AG inibiu a expansão das células do
cumulus de suínos, apresentando expansão mínima (grau 1). Isto demonstra que as
células do cumulus de suínos são mais sensíveis à inibição da iNOS pela AG do que as
de bovinos. A adição de 100 mM de AG inibiu 92,8 ± 2,8% da expansão total das
69
células do cumulus (grau 0). Não há na literatura nenhum relato da adição de
concentração maior do que 10 mM de AG em relação à expansão do cumulus. Estes
dados demonstram que a NOS sensível à AG, modula a expansão das células do
cumulus em bovinos.
Estudos têm mostrado que alguns fatores de crescimento e diferenciação,
sintetizados pelo oócito como o GDF-9, estão associados com a expansão in vitro das
células do cumulus em bovinos (VANDERHYDEN, et al., 2003; SHIMIZU et al., 2004a).
Os dados do nosso trabalho sugerem que a AG nas concentrações de 10 e 100 mM
possam estar inibindo a síntese da GDF-9 pelo oócito e, conseqüentemente, não estar
havendo a passagem desse fator para as células do cumulus, não havendo produção
do ácido hialurônico, evitando, assim, que ocorra a expansão das mesmas.
A adição de 10 mM de AG diminuiu tanto a viabilidade das células do cumulus
em relação ao controle, como a expansão das mesmas. O fato de ter havido uma
diminuição do número de células viáveis em relação ao controle permitiu que houvesse
expansão somente das camadas mais externas, mesmo assim, houve a progressão da
meiose até MII. TAO et al. (2005) observaram que a concentração de 10 mM de AG não
influenciou na viabilidade das células do cumulus em suínos, quando comparada ao
grupo controle, diferindo dos nossos resultados. A adição de 100 mM de AG aumentou
a porcentagem (97,3 ± 1,1) de células do cumulus lesadas e isto pode ter sido o motivo
principal da não-expansão das células do cumulus. Todavia, a lesão da membrana do
oócito ocorreu, provavelmente, após a retomada da meiose, visto que houve a VGBD,
que ocorre ao redor das 6 horas em oócitos bovinos (DODE e ADONA, 2001; MATTA et
al., 2002). Mais estudos são necessários para se avaliar a cinética ao nível de lesão
celular em COCs tratados com AG para comprovarmos se a lesão ocorreu antes ou
depois do rompimento da VG.
Os nossos resultados demonstram que a retomada da meiose não é
dependente da viabilidade das células do cumulus, visto que esta ocorreu somente em
2,6 ± 1,1% das células quando houve a adição de 100 mM de AG. Contudo, para que
houvesse a progressão de MI para MII, foi necessário que, pelo menos, houvesse 26,8
± 4,8% de células viáveis, como ocorreu no grupo de oócitos tratados com 10 mM de
AG. Mais estudos são necessários para se avaliar se a NOS sensível à AG está
envolvida no processo de proteção contra substâncias que causam peroxidação
70
lipídica, pois os danos induzidos pelos radicais livres podem afetar muitas moléculas
biológicas, incluindo os lipídeos, evitando assim a formação de lesões e perda da
integridade celular (BIANCHI e ANTUNES, 1999).
Sabe-se que a maturação nuclear de oóctos de mamíferos está associada
temporalmente com a expansão das células do cumulus sob condições tanto in vivo
quanto in vitro. Numerosas junções comunicantes estão presentes entre as células do
cumulus e entre estas e o oócito, contribuindo para a retomada da meiose (ISOBE e
TERADA, 2001). Tem sido demonstrado que o rompimento dessas junções induz a
ativação da MAPK e da p34cdc2 cinase, resultando na progressão da meiose até MII
em suínos e em bovinos (FISSORE et al., 1996; SHIMADA e TERADA, 2001), pois a
atividade da MAPK é essencial para a retomada da meiose e expansão das células do
cumulus induzida por gonadotrofinas, pois, segundo SU et al. (2003), após o estímulo
pelo FSH, há aumento na atividade da MAPK que aumenta a atvidade da PKA e
conseqüentemente, a ativação da cdc25b, que desfosforila a subunidade regulatória do
MPF, fazendo com que haja a retomada da meiose. Mais estudos são necessários para
se avaliar se as células da corona radiata estavam viáveis ou não e se as mesmas
mantiveram as projeções transzonais com as junções comunicantes entre os oócitos e
as mesmas durante a progressão para a MII (mais ou menos até as 12 h) em oócitos
tratados com 100 mM de AG.
Quando avaliamos os dados referentes à maturação nuclear, observamos que
100% dos oócitos apresentaram-se em estádio de pré-MI quando foram adicionados
100 mM de AG e este efeito não foi revertido com a adição de SNP. Segundo
NAKAMURA et al. (2002), o efeito da AG foi revertido quando adicionaram 500 µM de
SNAP (s-nitroso-L-acetil penicilamina), um doador de NO, no meio de cultura,
mostrando que o NO derivado da iNOS é um inibidor da maturação nuclear de oócitos
de ratas. Estes resultados diferem dos observados no presente experimento. Mais
estudos são necessários para se avaliar se esta divergência de resultados se deve ao
uso de diferentes doadores de NO ou diferentes vias de sinalização ligadas ao NO
entre bovinos e ratas.
Verificou-se que não houve diferença significativa na concentração de NO2/
NO3- 24 h após a adição de 1 e 10 mM de AG, mas a adição de 100 mM aumentou
significativamente a concentração quando comparada ao controle e demais
71
concentrações de AG. Provavelmente, houve uma retroalimentação negativa entre a
isoforma sensível à AG e à eNOS, sendo a iNOS inibida, haveria um aumento da
atividade da eNOS. Assim, a adição de NO no meio de maturação não reverteria a
inibição da progressão de MI para MII, pois não houve diminuição da síntese de NO e
sim um bloqueio de uma via ligada à síntese de NO pela iNOS.
De acordo com HUO et al. (2005), o processo de VGBD e da liberação do
primeiro corpúsculo polar foi significantemente inibido pela AG de maneira dose-
dependente, onde a concentração de 50 mM de AG inibiu a VGBD (100%), além de
terem visto que houve a fosforilação da MAPK, tornando-a inativa, sugerindo que o NO
derivado da iNOS exerce um papel crucial na maturação nuclear de oócitos de
camundongos, utilizando a via MAPK.
A aminoguanidina não inibiu, neste experimento, a retomada da meiose, como
observado por NAKAMURA et al. (2002) em ratas e TAO et al. (2004; 2005) em suínos.
Estes dados mostram que a ação inibitória da AG na progressão da meiose difere de
acordo com a espécie e que oócitos da espécie bovina são menos sensíveis ao
tratamento com AG, visto que observamos, neste experimento, que apenas a
concentração de 100 mM inibiu a progressão de MI para MII e não a retomada da
meiose.
O fator promotor da maturação (MPF) é ativado para que ocorra a VGBD e
aumenta no final da primeira fase M (VERLHAC et al., 1994). Quando ativo, o MPF
ativa a MAPK, que é responsável pela manutenção da progressão da meiose em
camundongos e em bovinos (FISSORE et al., 1996; BRUNET e MARO, 2005). A
atividade do MPF requerida durante a VGBD (suficiente para o oócito entrar na fase M)
é somente necessária para a formação da áster do fuso mitótico ao redor dos
microtúbulos dos cromossomos condensados, formando uma estrutura bipolar. A
migração dos cromossomos para o plano equatorial não é dependente das
concentrações do MPF, que, conseqüentemente, só é requerido no final da MI
(BRUNET et al., 1999). Os dados do nosso trabalho mostram que a adição de 100 mM
de AG possa não estar inibindo quantidade necessária de MPF ativo para a retomada
da meiose.
Segundo TAO et al. (2004 e 2005), a concentração de 10 mM de AG causou
um aumento no grau de degeneração dos oócitos (15,94 ± 4,57%), havendo uma
72
diminuição no número de oócitos que alcançaram a MII. No nosso trabalho,
observamos que, com esta mesma concentração, não se influenciou a VGBD e nem
houve lesão da membrana plasmática das células do cumulus e do oócito, mostrando
que há diferenças entre espécies quanto à sensibilidade da membrana plasmática do
oócito à inibição da NOS sensível à AG.
Não houve alteração na concentração de E2, quando foram adicionados ao
meio de maturação diferentes concentrações de AG. Contudo, quando adicionamos 10-
5 M de SNP a 100 mM de AG, houve um aumento significativo da concentração de E2,
porém não houve reversão do efeito deletério da inibição da NOS sensível à AG. A
síntese de E2 não está envolvida no mecanismo pelo qual o NO atua na maturação
nuclear e citoplasmática de oócitos bovinos. Mais estudos são necessários para se
comprovar o envolvimento deste esteróide na maturação de oócitos, pois os dados da
literatura ainda são controvérsos.
A adição de 100 mM de AG, além de promover uma inibição da MI para MII,
diminuiu as concentrções de P4 no meio. Vários trabalhos têm demonstrado que a P4
tem sido um importante mediador da maturação de oócitos de Xenopus (WANG e LIU,
2004; HAMMES, 2005), de suínos (LI et al., 2004), ratas (DAVE et al., 1997) e de
bovinos (FATEHI et al., 2002). Segundo WANG e LIU (2004), a P4 está envolvida na
retomada da meiose, diminuindo as concentrações de AMPc. No entanto, ainda há
algumas controvérsias em relação aos níveis de AMPc durante a maturação do oócito
induzida pela P4. DUCKWORTH et al. (2002) demonstraram que a P4 diminui a
atividade da PKA, ativando o MPF e por fim, a MAPK.
No presente experimento, observamos que a concentração de 100 mM inibiu a
progressão da meiose, sugerindo que a diminuição na concentração de P4, possa estar
influenciando neste processo de maturação do oócito, ativando o AMPc e,
conseqüentemente, inibindo o processo de maturação nuclear. Em suínos, DODE e
GRAVES (2001) mostraram que a P4 não teve efeito nas taxas de maturação e
fertilização, mesmo quando a adição de P4 foi feita em conjunto com a adição de E2
(DODE e GRAVES, 2002). LI et al. (2004) também obtiveram resultados semelhantes.
No entanto, outro trabalho mencionou que o bloqueio da síntese de P4 em suínos
provocou efeitos negativos na retomada da meiose (SHIMADA e TERADA, 2002).
Apesar de ter havido reversão da síntese de P4 pelas células do cumulus e não ter
73
havido reversão do bloqueio da progressão da meiose no grupo tratado com 10-5 M de
SNP mais 100 mM, isto não exclui o envolvimento da P4 no bloqueio da meiose, pois
pode ter havido inibição irreversível da síntese ou atividade de proteínas importantes
neste processo. Mais estudos são necessários para se avaliar o papel da P4 durante a
maturação nuclear ligada à via NOS/NO em bovinos.
A migração dos grânulos corticais tem sido usada como critério na avaliação da
maturação citoplasmática. Este é um fenômeno comum que ocorre em oócitos de
mamíferos durante a maturação tanto in vivo quanto in vitro (TERADA et al. 2000;
HOODBHOY et al., 2001) e está associado com um aumento no desenvolvimento da
competência do oócito (SUN e SCHATTEN, 2006).
Em oócitos imaturos em estádio de VG, os grânulos corticais estão distribuídos
por todo o citoplasma. Com a retomada da meiose, os filamentos de actina translocam
os grânulos corticais para o córtex, que, por sua vez, ocupam uma área linear ao
oolema. Há uma correlação temporal da migração dos grânulos corticais com a
maturação nuclear, pois no estádio de MII, o fuso meiótico do oócito permanece
ancorado paralelamente à membrana plasmática por meio dos microfilamentos,
estabelecendo, assim, a polaridade e a migração dos grânulos corticais para o córtex
do oócito (SUN e SHATTEN, 2006). Além disso, HOODBHOY et al. (2001)
demonstraram em hamster que duas proteínas (p62 e p25), presentes nos grânulos
corticais, também foram encontradas em embriões pré-implantados, sugerindo que
estas proteínas exerceram um papel importante na regulação da clivagem em óocitos
fertilizados e em embriões em pré-Implantação.
Houve um efeito dose resposta da migração dos grânulos corticais promovido
pela inibição da NOS sensível à AG. Apesar da concentração de 10 mM de AG ter
causado uma migração parcial dos grânulos corticais, não promoveu efeito na
maturação nuclear, sugerindo que a utilização das concentrações de 10 e 100 mM de
AG possam estar inativando o MPF, que, conseqüentemente, não estimula a
associação entre a VG com os microfilamentos, inibindo, assim, a migração coordenada
dos grânulos corticais para o córtex do oócito, mostrando que a NOS sensível à AG
está relacionada com a diminuição da migração dos grânulos corticais e,
conseqüentemente, influenciando algumas proteínas resposáveis pela regulação da
clivagem dos óocitos fertilizados, diminuindo a taxa de blastocistos. Mais estudos são
74
necessários para se avaliar o mecanismo de ação pelo qual o NO atua no controle da
migração dos grânulos corticais.
Os resultados do presente experimento nos permitem concluir que a inibição da
atividade da isoforma da NOS sensível à AG afeta tanto a maturação nuclear, quanto a
maturação citoplasmática de oócitos bovinos. O NO modula a viabilidade das células do
cumulus e do oócito, a progressão da meiose, a migração dos grânulos corticais, a taxa
de clivagem e produção de blastocistos.
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5. CONCLUSÕES GERAIS
Os resultados do presente estudo nos permitem concluir que:
1) A adição de diferentes concentrações de AG no meio de maturação promoveu
um efeito dose-resposta na expansão e na viabilidade da membrana plasmática
das células do cumulus e oócitos de COCs bovinos;
2) A diminuição na concentração de P4 no meio de maturação está relacionada
temporalmente com a progressão da MI para MII;
3) A regulação da atividade da NOS sensível à AG está envolvida na regulação da
maturação nuclear, citoplasmática e, conseqüentemente, no desenvolvimento
embrionário inicial em bovinos.