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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
FRANSÉRGIO AMÉRICO RIBEIRO ALVES
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE Plectranthus spp. E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS E DE
EXTRATOS FRENTE À DERMATÓFITOS E LEVEDURAS
FORTALEZA 2015
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FRANSÉRGIO AMÉRICO RIBEIRO ALVES
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE Plectranthus spp. E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS E DE
EXTRATOS FRENTE À DERMATÓFITOS E LEVEDURAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da
Faculdade de Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, como requisito parcial
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e
Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade
de carnívoros, onívoros, herbívoros e aves.
Orientadora: Profa. Dra. Selene Maia de
Morais
FORTALEZA
2015
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Dedico a minha família sempre por acreditar e me incentivar em todos os momentos, principalmente os momentos difíceis.
0
AGRADECIMENTOS
À Deus primeiramente, por me enviar sabedoria e calma em todos os momentos,
principalmente nos momento de angústia e ansiedade. Obrigado por estar sempre ao meu
lado.
À minha esposa Meliane Maria Tomaz, pela paciência, dedicação, compreensão,
cumplicidade e por me ajudar quando mais precisava.
À minha mãe, minha irmã e meus familiares por se fazerem presentes em momentos e
situações em que não pude estar presente e que fora suprida pela bondade e generosidade de
vocês.
À minha orientadora de mestrado Professora Dra. Selene Maia de Morais, pelos seus
ensinamentos, direcionamentos, grande paciência e por entender a minha pouca
disponibilidade de horários. Sou muito grato por fazer parte do meu crescimento como
estudante e profissional.
Antônio Adailson Silva, amigo encontrado no início desta minha jornada, agradeço o tempo
dispensado a mim, nas minhas dúvidas, trabalhos, experimentos, debates e conversas. Mesmo
que de maneira descontraída, sempre incentivando e apoiando, também sei que será em breve
um grande Doutor, obrigado meu amigo.
Aos membros da banca. Dr. Ícaro Gusmão Pinto Vieira por sempre dar suas colaborações,
Dra. Raquel de Oliveira dos Santos Fontenelle e Dr. Isaac Neto Goes da Silva, sendo
decisivos no momento final do meu curso. Meu muito e sincero obrigado.
À Universidade Estadual do Ceará e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária,
na figura de todos os seus professores e coordenadores, que contribuíram com minha
formação.
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Aos Profissionais, Professores e alunos do Laboratório de Microbiologia da Universidade
Estadual Vale do Acaraú, do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária da Universidade
Estadual do Ceará, Vettings - Serviços Laboratoriais Especializados – PTBI/INCUBAUECE.
Aos meus colegas e alunos de iniciação científica do Laboratório de Química de Produtos
Naturais e do Curso de Química.
A todos os meus colegas de turma de Pós-Graduação, onde ao longo de dois anos fizeram
parte da minha vida, contribuindo para o meu desenvolvimento profissional, principalmente
ao amigo prestativo Francisco Bergson.
Aos animais que poderão ser beneficiados com esse estudo. Estou realizando muitos
sacrifícios e abdicando de momentos pessoais trabalhando para um bem maior.
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RESUMO
Grande parte da população mundial que vive em países em desenvolvimento depende essencialmente das plantas medicinais como primeiro tratamento de saúde. Diversos estudos sobre tratamentos com produtos naturais, vem mostrando boa perspectiva para o desenvolvimento de novos produtos antifúngicos. A proximidade entre animais e homens é um fator de risco para transmissão de zoonoses. As infecções fúngicas são enfermidades crônicas e parasitárias de grande relevância. Apesar do amplo espectro de ação dos antifúngicos sobre dermatófitos, alguns autores relatam resistência e recorrência da micose, consistindo-se em um problema clínico e de saúde pública. Em cães, as micoses com maior frequência são causadas principalmente pelos dermatófitos Microsporum canis e Trichophyton mentagrophytes e pelas leveduras Malassezia pachydermatis e Candida albicans. O intuito deste estudo foi avaliar a atividade antioxidante e antifúngica de óleos essenciais e de extratos de Plectranthus grandis e Plectranthus ornatus frente a cepas de dermatófitos e leveduras. Para isso, foram extraídos os óleos essenciais e preparados extratos etanólicos das folhas. Após o isolamento e identificação das substâncias, foram realizados os testes fitoquímicos, o teste antioxidante pelo método (2,2-difenil-1-picrilhidrazila – DPPH), o teste de inibição da enzima colinesterase e a citotoxicidade em Artemia sp. A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, os testes foram feitos em duplicata e a CIM foi definida como a menor concentração capaz de inibir 100% do crescimento visível do fungo. A concentração fungicida mínima (CFM) foi á determinada pela subcultura de 100µl da solução do poço sem turbidez em Agar batata, a 28 ºC. Os testes fitoquímicos mostraram presença de fenóis. Na espécie P. grandis, o composto majoritário foi o óxido de cariofileno, com 35,99% e em P. ornatus foi o Eugenol com 31%. A toxicidade foi observada no óleo, decoto liofilizado, fração acetato de decoto de P. grandis e óleo de P.ornatus. A atividade antioxidante dos extratos apresentou valores de IC50 entre 12,35 e 16,28 µg/mL. A CIM foi de 0,15mg/mL para cepas de Trichophyton rubrum, Microsporum canis e Malassezia pachydermatis, as cepas de Candida albicans não foram inibidas pelos óleos e extratos. O sinergismo entre compostos ocorreu na combinação 1, entre extrato etanólico de folhas de Plectranthus grandis com cetoconazol e a concentração inibitória fracionária foi 0,37mg/mL. Os testes in vitro dos óleos e extratos de Plectranthus spp. têm atividade antifúngica e antioxidante, sendo promissores no combate às dermatofitoses.
Palavras-chave: Plectranthus spp., Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Candida
albicans, Malassezia pachydermatis.
3
ABSTRACT
Much of the world's population living in developing countries depends largely on medicinal plants as a first health care. Several studies on treatments with natural products, is showing good prospects for the development of new antifungal products. The proximity between animals and men is a risk factor for zoonotic transmission. Fungal infections are chronic and parasitic diseases of great importance. Despite the wide spectrum of action of antifungals on dermatophytes, some authors have reported resistance and recurrence of ringworm, consisting in a clinical problem and public health. In dogs, fungal infections most often are caused primarily by dermatophytes Microsporum spp. and Trichophyton spp. and the yeast Malassezia pachydermatis and Candida albicans. The purpose of this study was to evaluate the antioxidant and antifungal activity of essential oils and extracts of Plectranthus spp. drematófitos against strains and yeasts. For this, the essential oils and prepared ethanol extracts of the leaves were extracted. After isolation and identification of substances, tests were carried out phytochemical, the antioxidant pattern by the method (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl - DPPH) test the inhibition of cholinesterase enzyme and cytotoxicity Artemia sp. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the microdilution broth method, tests made in duplicate and the MIC was defined as the lowest concentration able to inhibit 100% of visible fungal growth. The minimum fungicidal concentration (MFC) was determined by the will subculture of 100 µl of the well solution without turbidity Agar potatoes, at 28 °C. Phytochemicals tests showed the presence of phenols. P. grandis species is the majority compound was caryophyllene oxide, with 35.99% and P. ornatus eugenol was 31%. The toxicity was observed in oil, lyophilized decoct, acetate fraction decoct P. grandis and P.ornatus oil. The antioxidant activity of the extracts showed IC50 values between 12.35 and 16.28 mg/ml. The MIC was 0.15mg/ml to Trichophyton rubrum strains, Microsporum canis and Malassezia pachydermatis, the strains of Candida albicans were not inhibited by the oils and extracts. The synergism between compounds occurred in the combination 1, between ethanol extract of leaves of Plectranthus grandis with ketoconazole and the fractional inhibitory concentration was 0,37 mg/mL. The in vitro tests of oils and Plectranthus spp extracts have antifungal and antioxidant activity, and promising to combat dermatophytoses.
Keywords: Plectranthus spp., Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Candida albicans,
Malassezia pachydermatis.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Fotografia do Aparelho de Clevenger para extração dos óleos e hidrolatos ....... 17 Figura 2 – Representação das estruturas químicas dos compostos de óleos essenciais ....... 18 Figura 3 – Representação das estruturas químicas dos compostos majoritários de P. grandis .................................................................................................................................. 19 Figura 4 – Fotografia da planta Plectranthus grandis Cramer ............................................. 20 Figura 5 – Representação das estruturas químicas dos constituintes identificados por CG/MS no óleo essencial de P. grandis................................................................................ 21 Figura 6 – Estruturas químicas da Barbatusina e Hidroxi-barbatusina ................................ 22 Figura 7 – Fotografia da planta Plectranthus ornatus Cood ................................................ 22 Figura 8 – Representação das estruturas químicas dos constituintes identificados por CG/MS no óleo essencial de P. ornatus................................................................................ 23 Figura 9 – Biossíntese dos terpenóides ................................................................................ 24 Figura 10 – Representação da estrutura química básica de um flavonóide .......................... 25 Figura 11 – Representação das estruturas químicas do canferol e miricetina ...................... 26 Figura 12– Representação das estruturas químicas da rutina (A) e quercetina (B)............... 26 Figura 13 – Fungo dermatófito Microsporum canis ............................................................. 28 Figura 14 – Fungo dermatófito Trichophyton rubrum ......................................................... 28 Figura 15 – Fungo leveduriforme Malassezia pachydermatis ............................................. 29 Figura 16 – Fungo leveduriforme Candida albicans............................................................ 30 Figura 17 – Representação da estrutura química da griseofulvina....................................... 34 Figura 18 – Representação da estrutura química do cetoconazol ........................................ 35 Figura 19 – Representação das estruturas químicas de terbenafina e naftifina .................... 36 Figura 20 – Representação química da estrutura da anfotericina B ..................................... 37
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AB – Anfotericina B. ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas. AChE – Enzima Acetilcolinesterase. ATCI – Iodeto de Acetilcolina. BB – Barbatusina. BBOH – Hidroxi-Barbatusina. CFM – Concentração Fungicida Mínima. CGL – Cromatografia de gás liquida. CIM – Concentração Inibitória Mínima. CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. CLSI – Clinical and Laboratory Standards Isntitute. DL – Dose Letal. DPPH – Radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazila. EM – Espectrômetro de Massas. FeLV – Vírus da Leucemia Felina. IC – Inibition Concentration. KOH – Hidróxido de Potássio. LABMIC – Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual Vale do Acaraú. mL – Mililitro. mg – Miligrama. O.E. – Óleo essencial. OMS – Organização Mundial de Saúde. P.A. – Puro Analito. WHO – World Health Organization µg – Micrograma. µl – Microlitro. µm – Micrômetro
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 15 2.1 Plantas medicinais ........................................................................................................ 15 2.2 Óleos essenciais ............................................................................................................. 16 2.3 Família Lamiaceae......................................................................................................... 19 2.3.1 Plectranthus grandis Cramer....................................................................................... 20 2.3.2 Plectranthus ornatus Cood........................................................................................... 22 2.4 Metabólitos secundários ............................................................................................... 23 2.4.1 Terpenóides.................................................................................................................. 23 2.4.2 Flavonóides................................................................................................................... 25 2.5 Micoses superficiais....................................................................................................... 27 2.5.1 Dermatófitos................................................................................................................. 27 2.5.2 Leveduras..................................................................................................................... 29 2.6 Diagnóstico dos dermatófitos e leveduras................................................................... 31 2.7 Drogas de importância terapêutica na Clínica........................................................... 33 2.7.1 Griseofulvina................................................................................................................ 33 2.7.2 Derivados azólicos........................................................................................................ 34 2.7.3 Alilaminas..................................................................................................................... 36 2.7.4 Anfotericina B.............................................................................................................. 36 2.8 Teste de toxicidade em Artemia sp. ............................................................................. 37 3 JUSTIFICATIVA............................................................................................................. 39 4 HIPOTESE CIENTÍFICA............................................................................................... 40 5 OBJETIVOS..................................................................................................................... 41 5.1 Objetivo geral................................................................................................................. 41 5.2 Objetivos específicos...................................................................................................... 41 6 CAPÍTULO 1.................................................................................................................... 42 7 CONCLUSÕES................................................................................................................. 58 8 PERSPECTIVAS.............................................................................................................. 59 REFERÊNCIAS.................................................................................................................. 61 ANEXOS ............................................................................................................................. 71
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1. INTRODUÇÃO
A utilização de plantas com fins medicinais para tratamento, cura e prevenção de
doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (VEIGA
JUNIOR et al., 2005). Em algumas regiões, os medicamentos tradicionais feitos de plantas
são muitas vezes a única fonte disponível e acessível para o tratamento de várias doenças
(KAVITHA et al., 2010). Segundo a Organização Mundial de Saúde 70-95% da população
mundial nos países em desenvolvimento depende principalmente de plantas para os seus
cuidados de saúde primários (WHO, 2011). (NAIDOO; COOPOOSAMY, 2011; MABONA,
2013).
As plantas representam uma fonte importante de produtos naturais biologicamente
ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de
fármacos. Os produtos vegetais apresentam uma gama de diversidades em termos de estrutura
e de propriedades físico-químicas e biológicas (YUNES; CALIXTO, 2001; PINTO et al.,
2002; CLEFF, 2008). Há um grande potencial para novas descobertas de drogas
com base na coleta e caracterização de plantas medicinais tradicionais em todo o mundo
(CALO et al., 2015).
As plantas medicinais, usadas na preparação de remédios tradicionais, trouxeram
para a medicina moderna drogas de comprovada eficácia para o tratamento de algumas
doenças microbianas (MACIEL et al., 2002). Neste contexto, os óleos essenciais de plantas
tem se destacado devido às propriedades antioxidantes e antimicrobianas apresentadas em
diversos ensaios (CARDOSO et al., 2000; HENTZ; SANTIN, 2007). O controle de
deterioração dos alimentos e bactérias patogênicas é principalmente obtido através do controle
químico, mas o uso de produtos químicos sintéticos é limitado devido a aspectos indesejáveis,
incluindo carcinogenicidade, aguda toxicidade, teratogenicidade e períodos de degradação
lenta, o que poderia levar a problemas ambientais, como a poluição (FALEIRO, 2011; CALO
et al., 2015).
A população de animais de companhia, nos últimos anos, tem aumentado
significativamente, estando esses cada vez mais inseridos no cotidiano. Seguindo esta
tendência, estima-se que a população de animais de estimação seja de 82 milhões (MATTEI
et al., 2014).
As micoses superficiais são zoonoses com distribuição mundial, sendo os animais
potencias reservatórios dos dermatófitos zoofílicos. É uma infecção comum dos tecidos
superficiais (estrato córneo da pele, unha e pêlo), caracterizada por alopecia multifocal,
13
descamação e lesões de distintas configurações (CAFARCHIA et al., 2006). Muitos fungos
são patogênicos e podem ter um impacto importante sobre a saúde humana ou levar a graves
perdas econômicas devido a culturas infectadas ou a doenças animais (GLADIEUX, 2011).
Neste contexto, as pesquisas com produtos naturais, são relevantes do ponto de
vista da saúde, na tentativa de analisar ou descobrir compostos com atividade frente aos
microrganismos, sendo possível o desenvolvimento de novos fitoterápicos com aplicabilidade
nas doenças de interesse da medicina veterinária e humana.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Plantas medicinais
O tratamento por meio de plantas, denominado fitoterapia (do grego phyton =
plantas e therapeia = tratamento), não é recente (BETTEGA et al., 2011). Alguns manuscritos
datados de 1500 anos a.C. relatam essa prática (LIMA, 2006; BETTENGA et al., 2011),
sendo seu primeiro relato um manuscrito denominado Papiro de Ébers (RATES, 2001).
Indícios arqueológicos demonstraram que por volta de 4000 a.C. os sumérios já utilizavam a
Papaver somniferum (papoula), de onde é extraído o ópio, conhecido há séculos por suas
propriedades soporíferas e analgésicas (HOSTETTMANN, 2003).
Desde a pré-história o homem procurou aproveitar os princípios ativos
encontrados nos vegetais, embora de modo totalmente empírico ou totalmente intuitivo,
baseado em descobertas ao acaso. Isso pode ser observado em povos ainda em estágio muito
primitivo, isolado em grau de cultura correspondente a Idade da Pedra. Em todas as partes do
mundo estão sendo realizadas as pesquisas sobre produtos de origem natural (ROCHA;
ROCHA, 2006).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), países desenvolvidos
que atualmente apresentam uma grande disponibilidade de medicamentos alopáticos ainda
recorrem ao uso de plantas medicinais devido às razões históricas e culturais. Já em alguns
países em desenvolvimento, até 80% da população depende exclusivamente das plantas
medicinais para os cuidados primários da saúde (CALIXTO, 2003; MACHADO et al., 2014).
Também é fato que um quarto de todas as prescrições médicas é de formulações
de substâncias derivadas de plantas ou de seus análogos sintéticos (MARTINS et al., 2003;
TANG; HALLIWELL, 2010).
O Brasil hospeda em seus vários ecossistemas grande diversidade de plantas,
constituindo-se uma das mais ricas floras do mundo e, portanto, um arsenal de matéria-prima
para a produção de fitofármacos e fitoterápicos (PINTO et al., 2013). No estado do Ceará,
região semi-árida, a Caatinga é o principal bioma, ocupando cerca de 60% do território do
nordeste, representando assim a quarta maior área coberta por uma única forma de vegetação
no Brasil (SILVA, 2012). Neste contexto, extratos de plantas ou derivados de partes de
plantas são apropriados para o desenvolvimento de novos agentes medicinais, o que estimula
15
uma busca por tratamentos alternativos derivados de produtos naturais (SUFREDINI et al.,
2004).
Inúmeras pesquisas têm comprovado o efeito da atividade antimicrobiana de
plantas da caatinga, com destaque para as espécies de Croton sp., típica do semi-árido
brasileiro (FONTENELLE et al., 2008). As atividades antimicrobias e antioxidantes dos
extratos de Zataria multiflora, foram demonstradas em estudo frente à bactérias, onde ocorreu
em 4-6% de inibição em todas os gêneros (AKRAMI, 2014).
A atividade antifúngica de produtos naturais vem sendo demonstrada em vários
estudos, dentre eles o da atividade de um extrato etanólico de própolis contra três espécies de
Trichophyton spp. (T. rubrum, T. tonsurans e T. mentagrophytes), e extratos metanólicos de
própolis cubanos contra T. rubrum e C. albicans. Houve atividade contra T. rubrum em baixas
concentrações, já contra a C. albicans nem mesmo as mais altas concentrações testadas
exerceram atividade (SOUZA et al., 2013). Desta forma, a pesquisa avaliando plantas
medicinais na busca de novos princípios ativos realmente efetivos no tratamento
animicrobiano torna-se de relevante na medicina veterinária.
2.2 Óleos essenciais
Os óleos são antioxidantes naturais que são bem conhecidos pela sua
antimicrobiana e propriedades biodegradáveis, ganham popularidade devido à sua natureza
volátil, o que facilita a utilização de pequenas concentrações que são seguros para consumo.
Muitos óleos essenciais (O.E.) mostram baixa toxicidade para mamíferos e menos efeitos
ambientais e podem ser utilizados como alternativas para fungicidas químicos.
(SIVAKUMAR; BAÑOS, 2014). A grande maioria dos óleos essenciais é constituída de
derivados fenil-propanóides e terpenos, sendo que esses últimos são predominantes na
composição (RAUT, 2014).
Dessa forma, os óleos podem ser constituídos de quase todos os tipos de funções
orgânicas, como álcoois simples e terpênicos, cetonas, aldeídos, éteres, óxidos, ésteres, fenóis,
peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e até compostos com enxofre
(SIMÕES; SPITZER, 2002). Poucos são os óleos que possuem apenas um único componente
em alta percentagem.
Estudos variados demonstram que a composição do óleo essencial do Origanum
vulgare (orégano) varia conforme alguns fatores tais como, localização geográfica, época da
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colheita, estação do ano, variedade e espécie, solo, estágio de crescimento da planta, além do
método de extração (VAGI et al., 2005). Os métodos de extração de óleos essenciais variam
conforme a localização do óleo volátil na planta e com a proposta de utilização do mesmo. As
técnicas mais utilizadas para a extração incluem a destilação por arraste a vapor, uso de
solventes orgânicos e fluido supercrítico (SIMÕES; SPITZER, 2002). O aparelho de
Clevenger (Figura 1) é menos utilizado, entretanto é mais vantajoso por ser mais compacto e
permitir determinações mais precisas do teor de óleo, além de ser Recomendado pela
Farmacopéia Brasileira (RODRIGUES, 2002; SIMÕES; SPITZER, 2002).
Figura1: Aparelho de Clevenger adaptado para obtenção dos óleos e hidrolatos. Fonte: ALVES, F. A. R., 2015.
Os óleos essenciais podem possuir uma notável atividade antimicrobiana, e por
esta razão, seus produtos derivados podem ser usados para retardar ou inibir o crescimento de
microrganismos patogênicos e/ou deteriorantes (MARINO et al., 2001; MACHADO, 2004).
Estudo mostrou atividade antifúngica de compostos como o timol, eugenol, timol, metiltimol,
metil-eugenol, anetol, estragol (Figura 2) contra M. canis e contra Candida spp.
(FONTENELLE, 2011).
17
Figura 2: Representação das estruturas químicas de óleos essencias dos compostos
Em estudos anteriores, Morais e Braz-Filho (2007) mostraram que os constituintes
majoritários dos óleos essenciais de P. grandis são eugenol, -copaeno, trans-cariofileno,
germacreno D e óxido de trans-cariofileno e para P. ornatus timol, carvacrol, eugenol, beta-
cubebeno, germacreno-D (Figura 3) e os óleos exibiram bom potencial antioxidante contra o
radical DPPH .
CH3
OH
CH3CH3
timol
OH
OCH3
CH2
eugenol
OCH3
OCH3
CH2
metil eugenol
CH3
OCH3
CH3CH3
metil timol
OCH3
CH3
anetol
OCH3
CH2
estragol
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Figura 3: Representação das estruturas químicas dos compostos majoritários de P.grandis.
2.3 Família Lamiaceae
A família Lamiaceae possui 235 espécies (VAN VUUREN, 2008). Contem vários
gêneros, tais como sálvia (Salvia), manjericão (Ocimum) e hortelã (Mentha), com uma rica
diversidade de usos etnobotânicos (PATON et al., 2004). Estudos sobre antimicrobianos de
constituintes de três espécies de Salvia spp. demonstraram atividade antimicrobiana frente
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus cereus e Staphylococcus aureus (VAN
VUUREN, 2008).
Outro importante gênero é o Plectranthus, contendo cerca de 350 espécies
encontradas na África tropical, Ásia e Austrália. Este gênero é constituído por plantas de
interesses econômico, ornamental e medicinal. Diversas espécies são usadas em todo o mundo
como vermicidas, anti-sépticos e purgantes, para o tratamento de infecções do ouvido, dor de
estômago e dor de dente, como um remédio para vómitos e náuseas, e contra
OH
OCH3
CH2
eugenol
CH3
CH3CH3
CH3
-copaeno
CH3
CH2 CH3
CH3
trans-cariofileno
CH3 CH3
CH3
CH2
germacreno-D
CH3
CH3CH3
CH2
-cubebeno
19
uma vasta gama de outras doenças (LUKHOBA et al., 2006). O gênero Plectranthus é um
arbusto sendo encontrado principalmente no Velho Mundo. Um recente estudo do gênero
revelou a presença de dois grupos, o grupo 'Coleus', que integra a maior das espécies que
costumava ser chamado de Coleus, e um segundo grupo contém as demais espécies de
Plectranthus (PATON et al., 2004).
2.3.1 Plectranthus grandis Cramer (Willense)
Plectranthus grandis (Figura 4) é popularmente conhecida no Brasil pelas
denominações de boldo-grande ou boldo-da-folha-grande, falsa malva-santa e boldo
mexicano. O P. grandis é um arbusto com flores com corola maior do que 2,0 cm de
comprimento de coloração azul. Esta espécie é capaz de florescer no Nordeste nas regiões
serranas, litorâneas ou sertão central, no que diferem das outras espécies que necessitam de
clima mais ameno ou temperado como ocorrem nas chamadas serras frescas (MATOS, 2002).
É utilizada largamente pela população no combate a dispepsia, mas se utiliza
popularmente a planta para combater problemas gastrintestinais. Essa espécie possui
características morfológicas semelhantes as da Plectranthus barbatus, cujos extratos são
extensivamente estudados no sistema gastrintestinal. As diferenças morfológicas são
pequenas, diferindo principalmente no “amargor” dos talos e folhas da espécie P. grandis em
relação a P. barbatus (MATOS, 2002).
Figura 4: Plectranthus grandis Cramer Fonte: ALVES, F. A. R., 2015.
20
Em estudo recente foi evidenciada uma forte atividade antioxidante, com CI50
16µm/mL reduziu a produção de citocinas pró-inflamatórias indicando ação antiinflamatória
em pacientes com HIV-1 (KAPEWANGOLO; HUSSEIN; MEYER, 2013). Entre os vários
constituintes encontrados no óleo de P. grandis, os majoritários são o eugenol, β-bisaboleno,
trans-β cariofileno, germacreno D e α-copaeno, (Figura 5) entre outros (ALBUQUERQUE et
al., 2007).
Figura 5: Representação das estruturas químicas dos compostos Constituintes identificados por CG/MS no óleo essencial de P. grandis.
O efeito protetor em úlcera gástrica induzida por etanol dos diterpenos barbatusina
(BB) e hidroxi-barbatusina (BBOH) (Figura 6), isolados a partir do extrato etanólico de
Plectranthus grandis, foi verificado e os dois diterpenos revelaram diferentes mecanismos de
ação (RODRIGUES, 2010).
OH
OCH3
CH2
eugenol
CH3CH3
CH2
CH3
-bisaboleno
CH3
CH2 CH3
CH3
trans-cariofileno
CH3 CH3
CH3
CH2
germacreno-D
CH3
CH3CH3
CH3
-copaeno
21
Figura 6: Estruturas químicas da barbatusina e hidroxi-barbatusina
2.3.2 Plectranthus ornatus Codd
Estudos anteriores sobre os metabólitos secundários de Plectranthus ornatus
Codd (Figura 7) referiram o isolamento de labdano e clerodânicos diterpenos, alguns dos
quais demonstraram possuir uma moderada atividade antimicrobiana contra a Candida,
espécies e estirpes de bactérias Gram negativas e positivas (RIJO et al., 2002). O estudo
fitoquímico de P. ornatus levou ao isolamento de três novos diterpenóides, neoclerodane e
dois derivados labdano obtidos pela primeira vez como naturais produtos (RIJO et al., 2002;
OLIVEIRA et al., 2005). Entre os vários constituintes encontrados no óleo essencial de P.
ornatus, os majoritários são o eugenol, timol, trans-β-cariofileno, carvacrol, germacreno D e
α-copaeno (Figura 8) (ALBUQUERQUE et al., 2007).
Figura 7: Plectranthus ornatus Codd Fonte: ALVES, F. A. R., 2015.
CH3
O
OH
H
OAc
CH3
CH3
O
OAc
O
CH3
CH3
CH3
O
OH
H
OAc
CH3
CH3
O
OAc
OH
CH3
CH3
22
OH
OCH3
CH2
eugenol
CH3
OH
CH3CH3
CH3
OH
CH3CH3
timol carvacrol
CH3
CH2
O
CH3CH3
CH3
H
CH3
óxido de cariofileno
CH3 CH3
CH3
CH2
germacreno-D
CH3
CH3CH3
CH3
-copaeno
CH3
CH3CH3
CH2
-cubebeno
Figura 8: Representação das estruturas químicas dos constituintes identificados por CG/MS no óleo essencial de P. ornatus. 2.4 Metabólitos secundários
2.4.1 Terpenóides
23
Os terpenóides formam uma larga família com estruturas bastantes diversas
derivadas das unidades isoprênicas C5. Na sua biossíntese (Figura 9), 3 moléculas de Acetil-
CoA formam o ácido mevalônico, este ácido sofre descarboxilação e desidratação para formar
pirofosfato isopentenil que se condensa com pirosfofato de dimetilalil para dar origem aos
monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20) e triterpenos (C30) e assim por
diante são formados os outros terpenos.
Monoterpeneos e sesquiterpenos são compostos gerados pela condensação de duas
e três unidades isoprênicas de pirofosfato de dimetilalila respectivamente. Estes compostos
estão entre os principais constituintes dos óleos essenciais. Os diterpenos são formados pela
união de quatro unidades de isopreno e são encontrados principalmente nas resinas de plantas.
Estudos mostraram que alguns diterpenos possuem propriedades biológicas importantes
como: atividades espasmolítica e hipotensiva (TANDON et al., 1977) e atividade anti-
hipertensiva (KELECOM, 1983).
Figura 9: Representação da biossíntese dos terpenóides.
Prirofosfato de dimetilalila Pirofosfato isopentenil
24
2.4.2 Flavonóides
Compostos fitoquímicos que apresentam em sua estrutura um anel aromático
(Figura 10) com uma ou mais hidroxilas recebem a denominação de compostos fenólicos e,
geralmente apresentam propriedade antioxidante. Dentre eles desatacam-se os flavonóides, os
ácidos fenólicos e otocoferol como os mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural
(MELO; GUERRA, 2002). Flavonóides são compostos formados pela condensação dos
ácidos cinâmicos com 3 unidades de malonil-CoA. A estrutura química de um flavonóide
apresenta as unidades C6-C3-C6, sendo dois anéis benzênicos (C6) ligados pela unidade C3 que
pode formar um ciclo ou não. Trabalhos recentes têm demonstrado que flavonóides
encontrados em frutos e vegetais são importantes e diversificados entre os produtos de origem
natural. Encontra-se em abundância nas angiospermas, tais compostos podem também agir
como antioxidantes (MELO; GUERRA, 2002).
Figura 10: Representação da estrutura química básica de um flavonóide. Anéis fenólicos substituídos (A e B) e um pirano (cadeia heterocíclica C) acoplado ao anel A.
Os flavonóides atuam como antioxidantes primários reagindo com os radicais
livres, e também como quelantes de metais. Flavonas e flavonóis são as duas principais
classes de flavonóides encontradas universalmente na natureza. Os mais comuns flavonóis
antioxidantes são canferol (figura 11–A), quercetina e miricetina (Figura 11–B) (
(HARBORNE; WILLIAMS, 2000). Os flavonóides são utilizados por botânicos para
classificação taxonômica. Eles regulam o crescimento da planta pela inibição da exocitose da
auxina (ácido indol acético), assim como pela indução da expressão gênica e influenciam
outras células em numerosas vias. Flavonóides inibem o crescimento ou matam muitas cepas
bacterianas, inibem importantes enzimas virais como transcriptase reversa e proteases, bem
como destroem alguns protozoários patogênicos. Todas essas atividades são exercidas com
baixa toxicidade em células animais (HAVSTEEN, 2002).
O
O
A C
B
25
Figura 11: Representação das estruturas químicas do A - canferol e B - miricetina.
A análise qualitativa e quantitativa de flavonóides comuns em extratos polares de
plantas como, por exemplo, rutina, isoquercitrina, quercetina, catequinas e canferol podem ser
realizadas através da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando-se de
padrões destas substâncias. Nesta técnica utiliza-se em geral um detector de ultravioleta. A
rutina (Figura 12–A) é largamente utilizada em fitoterápicos para fragilidade capilar
prevenindo varizes e derrames de retina. A quercitina apresenta atividade antiinflamatória em
colite experimental, associada com ação antioxidante e melhoramento da absorção de água in
vivo (SÁNCHEZ et al., 2002). Quercetina (Figura 12 – B), o principal flavonóide presente em
vegetais e frutas, exerce potenciais efeitos anticarcinogênicos em modelos de animais e
culturas de células (SALUCCI et al., 2002).
Figura 12: Representação das estruturas químicas da rutina (A) e quercetina (B).
A B
O
O
O
OH
OH
OH
O
OHOH
OH
OH
O
O
O
OHOH
OH
rutina
A B
O
O
OH
OH
OH
OH
canferol
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
miricetina
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
quercetinaRutina
26
2.5 Micoses superficiais
Doenças fúngicas em humanos são denominadas micoses. De acordo com o grau
de envolvimento do tecido e o local da infecção do hospedeiro as micoses são classificadas
em micoses superficiais, cutâneas, subcutâneas, sistêmicas ou oportunistas (TORTORA,
FUNKE, CASE, 2012).
Os fungos podem fazer uso de fontes nutricionais de três formas diferentes:
Sapróbios, simbiontes e parasitas. Os sapróbios utilizam matéria orgânica em vias de
decomposição (macromicetos em jardins e florestas). Os simbióticos realizam trocas de
nutrientes e líquidos e no parasitismo um dos indivíduos tira proveito da relação levando a
infecções em humanos e animais (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Segundo Machado (2004), em estudo no Brasil, as micoses cutâneas, que atacam
os cães com maior freqüência são causadas principalmente pelos dermatófitos Miscroporum
spp e Trichophyton mentagrophytes e pelas leveduras Malassezia pachydermatis e Candida
albicans.
2.5.1 Dermatófitos
O estudo das dermatofitoses teve início em 1839, quando Robert Remak elucidou
a etiologia do favus. Em seguida, em 1842, David Gruby redescobre o agente etiológico do
favus ratificando a etiologia das tinhas. Já em 1934 Chester W. Emmous englobou os gêneros
Achorion e Trichophyton em um único gênero Trichophyton. Os dermatófitos ficaram
classificados em três gêneros Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum, utilizados até os
dias atuais. Em 1969, Whittaker et al., evidenciando o fato de que os fungos não atendiam as
características básicas para permanecerem no reino vegetal, resolveu criar um reino a parte, o
reino Fungi (SIDRIM; ROCHA, 2004).
As dermatofitoses são micoses cutâneas causadas por fungos pertencentes aos
gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton. Geralmente, essas infecções
costumam invadir os tecidos queratinizados, como epiderme da pele, unhas e cabelos,
utilizando-os como fonte alimentar (ADIMI et al., 2013). Reproduzem-se de forma assexuada,
através de macroconídios e microconídios. O processo infeccioso primário clássico está
relacionado, principalmente, a enzimas produzidas pelo dermatófitos e a forças mecânicas. A
enzima queratinase pode estar ou não ativa, podendo desenvolver ou não quadros clínicos de
dermatofitose (SIDRIM; ROCHA, 2004).
27
Apesar de existir mais de 40 espécies diferentes nesses três gêneros, as principais
espécies representantes destes gêneros são Microsporum canis (Figura 13), M. gypseum, T.
mentagrophytes, T. rubrum, T. verrucosum e E. floccosum entre outros, sendo considerados
de fácil disseminação, tornando-se um problema de saúde pública (LACAZ et al., 2002;
MEDEIROS et al., 2009; ADIMI et al., 2013).
Figura 13: Fungo dermatófito Microsporum canis. Fonte: www.micologia.com.br/imagens.
Excepcionalmente, dermatófitos antropofílicos como o T. rubrum (Figura 14), têm
sido isolados na pelagem de gatos saudáveis. A provável explicação para esta ocorrência é o
fato do íntimo contato desses animais com proprietários infectados pelo T. rubrum, tornando-
se, assim, carreadores e propagadores desse dermatófitos (CABAÑES, 2000). Em um estudo
no Japão, foi relatado o isolamento do Trichophyton rubrum pela primeira vez a partir de
animais com dermatofitose, sendo identificado morfologicamente e fisiologicamente como, T.
rubrum var. raubitschekii sem relatos no Japão, embora tenha sido isolado a partir de humano
dermatofitoses na Europa, África, Brasil, Vietnã e China (KANO et al., 2010).
Figura 14: Fungo dermatófito Trichophyton rubrum. Fonte: www. microbewiki.kenyon.edu
28
Animais assintomáticos portadores de M. canis são considerados um fator crítico
na epidemiologia das dermatofitoses, considerando-se que 50% dos humanos expostos a esses
animais, especialmente gatos, poderão ser infectados (MANCIANTI et al., 2003). O M. canis
foi isolado em 36,4% dos cães, cujos proprietários foram diagnosticados com tinea corporis
(CAFARCHIA et al., 2006).
2.5.2 Leveduras
O gênero Malassezia compreende leveduras lipofílicas que fazem parte da
microbiota cutânea do homem e dos animais. A Malassezia pachydermatis (Figura 15) é uma
levedura que tem sido isolada no conduto auditivo externo de cães e gatos sadios e portadores
de otite externa. Esse fungo pode ser um organismo comensal em alguns animais, ou ainda ser
um invasor secundário ou patógeno em outros. A prevalência de M. pachydermatis nas
orelhas pode-se relacionar com a excessiva produção de cerúmen ou acúmulo de umidade, ou
seja, modificações no ecossistema. (CRESPO, 2002; MACHADO et al., 2003). O
envolvimento de M. pachydermatis é um fator perpetuante ou desencadeante de otite externa,
em cães, vem sendo bastante discutido (MACHADO et al., 2003). O seu isolamento a partir
do meio ambiente é excepcional, uma vez que para sua sobrevivência necessita da presença de
uma fonte lipídica, excetuando-se a M. pachydermatis, única espécie capaz de crescer em
Sabouraud sem a adição de suplemento lipídico (GUÉHO, 1996; SIDRIM; ROCHA, 2004;
GIRÃO et al., 2006).
Figura 15: Fungo leveduriforme Malassezia pachydermatis Fonte: www.wackes-tieraerzte.de
Uma barreira epidérmica deficiente por danos nos queratinócitos, leva a um
aumento da umidade na superfície cutânea, favorecendo a proliferação de leveduras do gênero
29
Malassezia. Ademais, essa ruptura da barreira epidérmica permite a exposição cutânea aos
antígenos e produtos da levedura, desencadeando reações inflamatórias e de
hipersensibilidade (CHEN; HILL, 2005). A levedura elabora lipáses que alteram o equilíbrio
sebáceo, liberando ácidos graxos, e o zimogênio (uma pro enzima inativa) contido na parede
celular da levedura é capaz de ativar o sistema complemento, promovendo danos na
integridade epidérmica, gerando a inflamação e o prurido (SCOTT, 2001).
O gênero Candida é composto por leveduras que vivem como comensais na
microbiota de homens e animais. Em geral, não causam nenhum dano aos seus hospedeiros,
entretanto, em virtude de desequilíbrios nas defesas química, física e imunológica, esses
microrganismos podem se tornar patogênicos. Infecções por Candida spp. são pouco
freqüentes na Medicina Veterinária no entanto, nos últimos anos, tem sido observado aumento
considerável de relatos de enfermidades causadas por essas leveduras, acometendo diferentes
animais (BRITO, 2009).
As leveduras do gênero Candida são consideradas oportunistas, porém devido aos
distúrbios nas proteções física, química e imunológica de seres humanos e animais, acabam
tornando-se patogênicas e causadoras de dermatomicoses conhecidas como candidíase
(MORETTI et al., 2004). A espécie C. albicans (Figura 16) é a mais freqüentemente isolada
em casos de candidíases animais (MORETTI et al., 2004). Acomete a pele e locais de
umidade persistente como membranas mucosas, junções muco-cutâneas, dobras ungueais e
perineais (MEDLEAU; HNILICA, 2003; BRITO et al., 2009). A C. albicans, também é
integrante da microbiota normal do trato intestinal de muitos mamíferos e aves, tais como
pombos, perus, aves de rapina, aves migratórias, aves industriais, dentre outras
(CAFARCHIA et al., 2006; FULLERINGER et al., 2006; CAFARCHIA et al., 2008; BRITO
et al., 2009).
Figura 16: Fungo leveduriforme Candida albicans. Fonte: www.judytsafrirmd.com
30
As lesões clássicas em casos de dermatomicoses por Candida spp. apresentam
contornos irregulares e são levemente edemaciadas, com vesículas preferencialmente
localizadas em áreas com dobras cutâneas, como: espaços interdigitais, prepúcio e região
perianal. Pode haver, no entanto, a ocorrência de lesões com alopecia, crostas, úlceras e
edema (MORETTI et al., 2004; BRITO et al., 2009). O curso clínico é crônico, e em alguns
casos a doença é refratária ao tratamento (THOMPSON, 1990; WILLEMSE, 1995;
MULLER, 1996). Nos cães, a candidíase pode se apresentar, também, na forma septicêmica
com lesões nos músculos, ossos e na pele (THOMPSON, 1990; SIDRIM; ROCHA, 2004).
No Brasil, um estudo foi realizado para verificar a ocorrência de Candidíase em
felinos e sua possível associação com o vírus da leucemia felina (FeLV), tratamentos com
glicocorticóides ou antimicrobianos. Os autores concluíram que a candidíase felina pode estar
relacionada a uma depressão do sistema imune, pois os gatos FeLV positivos sintomáticos, ou
aqueles tratados com glicocorticóides, foram os mais susceptíveis à colonização por C.
albicans (FERREIRO et al., 2002).
2.6 Diagnóstico dos dermatófitos e leveduras
A Lâmpada de Wood foi criada, em 1903, pelo físico Robert W. Wood, e desde
então, tem importância na prática da medicina humana e veterinária. A fluorescência ocorre
quando a luz de comprimento de onda curta é absorvida e a radiação de comprimento de onda
longa é emitida, tornando-se visível. Essa fluorescência, visualizada em animais com
dermatofitose, ocorre devido à presença de pteridina, uma substância secretada pelo fungo
(ASAWANONDA; TAYLOR, 1999).
Exame de microscopia direta é a etapa inicial do processamento laboratorial. Essa
técnica é aceitável para diagnósticos de rotina, apesar de ser menos sensível que a cultura
fúngica. A principal vantagem do exame direto é a possibilidade de se obter um diagnóstico
imediato (MACHADO et al., 2003). No exame direto das lesões produzidas por C. albicans,
utilizando hidróxido de potássio (KOH) ou pelo método de Gram são observadas células
leveduriformes Gram positivas, ovais, com gemulação de base fina, dividindo em duas células
e presença de pseudo-hifas (MULLER et al.,1996; LACAZ et al., 2002).
Para as leveduras do gênero Candida, são realizadas provas de tubo germinativo,
fermentação e assimilação de açúcares, bem como o microcultivo, onde se analisa a
micromorfologia. O tubo germinativo é uma projeção alongada que emerge da levedura
31
quando esta entra em contato com soro humano ou de outros animais, à temperatura de 37°C,
durante duas a três horas (LACAZ et al., 2002; BRILHANTE et al., 2005).
Em cultura e tecidos têm reprodução assexuada, através da formação de
blastoconídios, pseudo-hifas e, ocasionalmente, hifas verdadeiras. A C. albicans é um fungo
leveduriforme quando saprófita e assume forma de pseudohifas ou hifas, quando invade os
tecidos. Pode ser cultivada em ágar sangue e em ágar Sabouraud, apresentando um
crescimento rápido. Não é sensível a cicloheximida e após 24 a 48 horas a uma temperatura
de 25°C apresenta colônias cremosas e pastosas de coloração creme com odor característico.
As células da C. albicans obtidas através de cultivo em meio de cultura, caracterizam-se por
paredes finas, ausência de cápsula e formam blastoconídios esféricos (8-12μm) ou levemente
ovais (6-10μm x 3,6-6μm) (LACAZ et al., 2002)
A assepsia prévia local, bem como os cuidados com o manuseio e conservação
das amostras são fatores primordiais para que haja fidelidade dos resultados (SIDRIM;
ROCHA, 2004). Em geral, se utilizam lâminas de bisturi estéreis para escarificar as lesões,
removendo pêlos e escamas das bordas lesionais. Pinças estéreis também poderão ser
utilizadas para remover os pêlos sob tração, favorecendo assim a positividade do exame, uma
vez que estruturas fúngicas poderão estar localizadas na região da raiz pilosa (BRILHANTE
et al., 2003). Uma outra forma de colheita bastante utilizada em cães e, principalmente, em
gatos assintomáticos é através da fricção com uma escova de dente previamente esterilizada
sobre a pelagem, removendo assim fragmentos de pêlos tonsurados e escamas contendo
estruturas fúngicas (SCOTT et al., 2001).
Faz-se a repicagem do espécime clínico em diferentes meios de cultivo. Este
procedimento exige um ambiente igualmente asséptico. Os meios de cultivo preconizados
para o isolamento de dermatófitos são: Ágar Sabouraud; ágar Sabouraud + cloranfenicol (com
a finalidade de inibir o crescimento de bactérias) e ágar Sabouraud + cloranfenicol +
cicloheximida (ágar Mycosel), Ao concluir a semeadura, os tubos deverão ser incubados em
temperatura ambiente, em torno de 25 a 28 °C, durante um período de quinze dias, e deverão
ser observados diariamente, avaliando-se o crescimento fúngico (SIDRIM; ROCHA, 2004).
A identificação final é feita através de provas bioquímicas e fisiológicas,
adequadas para cada espécie fúngica, tais como: a prova de requerimentos vitamínicos
(tiamina, ác. nicotínico, histidina, inositol), o teste da urease, o microcultivo em ágar batata e
o teste de perfuração de pêlo in vitro (BRILHANTE et al., 2005).
A M. pachydermatis cresce bem em 48 horas, sob temperaturas entre 25 e 37°C,
emágar-sangue, ágar Sabouraud dextrose, Agar infusão de cérebro e coração, além de outros.
32
Para outras espécies de Malassezia é utilizado também o isolamento em meio Dixon. A
coloração de Gram é usada para visualização dos blastoconídios. A maioria destas leveduras
produz colônias glabras, de coloração branca ou bege, textura cremosa e superfície lisa. Após
o crescimento da colônia deve-se proceder ao exame microscópico através de preparações
com solução salina, lactofenol azul de algodão ou corante de Gram. Estruturas arredondadas
ou ovais em brotamento, associadas ou não à presença de hifas e pseudo-hifas, devem ser
observadas (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Para as leveduras desse gênero, são feitas provas de assimilação de Tween 20,
40,60 e 80, A utilização do Tween interpreta-se pelo halo de crescimento e a formação de
precipitado ou anel ao redor da Tween (CABAÑES et al., 2007).
2.7 Drogas utilizadas no tratamento de dermatófitos e leveduras
O arsenal terapêutico antifúngico tem aumentado muito nestes últimos anos. Com
o incremento de novos métodos diagnósticos, aumento das septicemias por leveduras e novas
enfermidades em aumentado as pesquisas por novas alternativas de fármacos para o
tratamento das infecções fúngicas. Dentre a grande variedade de drogas utilizadas na
terapêutica contemporânea, podemos destacar algumas categorias: os compostos peliênicos
(nistatina e anfotericina B), a griseofulvina, os derivados azólicos (miconazol, tiaconazol,
cetoconazol, fluconazol, itraconazol entre outros) e as alilaminas representadas pela
terbenafina e naftifina (SIDRIM; ROCHA, 2004).
2.7.1 Griseofulvina
A griseofulvina (Figura 17) é um antibiótico fúngico desprovido de atividade
antibacteriana, e mesmo com o aparecimento de outras drogas, ainda é uma droga de primeira
escolha nos tratamentos de dermatofitoses. Seu mecanismo de ação ocorre através da
penetração do fungo, e no núcleo age nos microtúbulos interrompendo o fuso mitótico,
impedindo assim sua multiplicação. A griseofulvina é bem distribuída em tecidos
queratinizados, assim com a mudança da queratina infectada, ocorrendo a mudança para um
tecido saudável. Sofre intensa biotransformação hepática, por conjugação e oxidação,
originando a 6-metilgriseofulvina (metabólito inativo) sendo excretada por via renal
(SIDRIM; ROCHA, 2004).
33
Figura 17: Representação da estrutura química da griseofulvina.
Estes resultados sugerem que a griseofulvina é eficaz em o tratamento da tinea
capitis, se dada pela primeira vez, já na terapia repetida com griseofulvina, ocorrre aumento
da resistência da infecção por fungo pela droga. Outro estudo mostrou que a resistência em 40
% dos pacientes que utilizade griseofulvina tratamento da tinea capitis em um ambiente nos
Estados Unidos (TAGHREED, 2007).
A griseofulvina mostra uma atividade fungistática seletiva sobre espécies de
fungos dos gêneros Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton, sendo portanto, utilizada
exclusivamente em infecções dermatofíticas (SIDRIM; ROCHA, 2004). Tal fármaco pode,
ainda, ser utilizado em associação com medicamentos tópicos, como clotrimazol, miconazol,
cetoconazol entre outros, em casos de dermatofitoses por M. canis em gatos (SPARKER et
al., 2000). Os distúrbios gastrintestinais, tais como: náuseas, vômitos, dor epigástrica e
diarréia, têm sido seus efeitos colaterais mais freqüentes. A griseofulvina pode causar, ainda,
hepatotoxicidade e atividade teratogênica (SIDRIM; ROCHA, 2004).
2.7.2 Derivados azólicos
Os azóis formam um grupo de compostos sintéticos, com estrutura química
semelhante e com amplo espectro de atividade antifúngica, sendo, muitos deles, também,
ativos contra algumas bactérias Gram positivas, o surgimento dos derivados imidazólicos e os
triazólicos, partiu dos estudos da atividade antifúngica dos benzimiazois (FARIAS;
GIUFFRIDA, 2002; SIDRIM; ROCHA, 2004).
O
O
Cl
H3CO
OCH3
CH3
O
OCH3
griseofulvina
34
A maior família de drogas antifúngicas é representado pelos compostos azólicos
ou seja imidazoles (Miconazol, clotrimazol e cetoconazol) e triazóis (fluconazol, itraconazol,
e as últimas agentes, voriconazol e posaconazol). Os Azóis bloqueiam a biossíntese fúngica
do ergosterol na membrana da célula através da inibição da atividade da lanosterol-
desmetilase 14α, a enzima necessária para converter lanosterol para o ergosterol (MORACA,
2014).
O mais significativo fármaco do grupo dos imidazólicos é o cetoconazol (figura
18), este apresenta espectro de atividade contra vários fungos causadores de micoses
profundas; bem como é eficaz para várias espécies de Candida e dermatófitos. Ouso dos
imidazóis tópicos, como: clotrimazol, econazol, bifonazol, isoconazol, oxiconazol,
sertaconazol etc., restringem-se às micoses superficiais, em especial as dermatofitoses. O
itraconazol tem sido utilizado com sucesso no tratamento de dermatofitoses refratárias, e tem
sua máxima biodisponibilidade, quando ingerido com alimentos (SIDRIM; ROCHA, 2004).
Figura 18: Representação da estrutura química do cetoconazol.
O cetoconazol é bem absorvido por via oral, sofre biotransformação hepática,
dando origem a vários metabólitos inativos, que são eliminados principalmente através da
bile; porém, cerca de 10% destes são excretados por via renal e, por último, cerca de 2-4% da
droga é eliminada inalterada (SIDRIM; ROCHA, 2004).
NN O
CH3
O
O
O
H
N
N
Cl Cl
cetoconazol
35
Em estudo utilizando o cetoconazol demonstrou que o uso por via oral,
desencadeou uma maior hepatotoxicidade, o estudo concluiu que é comum distúrbios hepático
relacionado à este medicamento (YAN et al., 2013).
2.7.3 Alilaminas
Este grupo de antifúngico são inibidores da biossíntese de ergosterol e tem como
representantes a naftifina e terbenafina (figura 19) é um composto sintético e análogo da
naftifina, e dependendo da espécie atua de maneira fungicida e fungistática (SIDRIM;
ROCHA, 2004). A principal indicação para a terapia oral de terbinafina em seres humanos é
para o tratamento de dermatofitose. Em medicina veterinária, a monoterapia com terbinafina é
eficaz para o tratamento de dermatofitose em gatos, cavalos e cães (KELLER, 2012). Em teste
in vitro contra T. rubrum, a terbenafina foi a droga mais potente, seguido de itraconazol,
cetoconazol e griseofulvina (SANTOS; HAMDAN, 2007).
Figura 19: Representação das estruturas químicas da terbenafina e naftifina.
2.7.4 Anfotecina B
A anfotericina B (AB), um antibiótico poliênico produzido naturalmente pelo
actinomiceto Streptomyces nodosus (FILIPPIN; SOUZA, 2006). Atua como fungicida
ligando-se ao ergosterol, esteróide presente na membrana de fungos sensíveis, alterando a
permeabilidade desta e causando a perda de constituintes citoplasmáticos. Adicionalmente,
leva a uma lesão oxidativa que resulta em alterações metabólicas prejudiciais à sobrevida
N
CH3 CH3
CH3 CH3
terbinafina
N
CH3
naftifina
36
celular. Seu espectro de ação antifúngica abrange os agentes etiológicos das principais
micoses endêmicas: Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Coccidioides
immitis, Blastomyces dermatitidis, Cryptococcus neoformans var. neoformans e var. gattii e
Sporothrix schenckii. Tem boa atividade contra espécies de Candida, embora algumas poucas
amostras de Candida não albicans possam ser resistentes. Atua contra Aspergillus fumigatus,
mas a sensibilidade de outras espécies de Aspergillus é variável. Susceptibilidade variada
também é observada para zigomicetos (Mucor, Rhizopus) e Fusarium spp. Certos
microorganismos causadores de infecções fúngicas oportunistas são geralmente resistentes à
anfotericina B (figura 20), a exemplo de Trichosporon spp., Pseudallescheria boydii,
Cladosporium spp. e Phialophora spp. (MARTINEZ, 2006). As reações adversas agudas a
AB tais como febre, calafrios, tremores, náusea, vômitos e dor de cabeça ocorrem
freqüentemente e estão principalmente relacionadas à infusão. O tratamento com AB quase
sempre resulta em algum grau de disfunção renal, que varia em gravidade de um paciente para
outro, sendo claramente uma função da dose total (FILIPPIN; SOUZA, 2006).
Figura 18: Representação da estrutura química da anfotericina B.
2.8 Teste de Toxicidade com Artemia sp.
As plantas possuem em seu mecanismo de defesa compostos biologicamente
ativos utilizados em resposta ao ataque de patógenos ou stress, ou ainda no seu crescimento e
OCH3
CH3
CH3
CH3
O OH OH
OH
OH OH
OH
O
H
O
OH
OH
OH
NH2OH
CH3
anfotericina B
37
desenvolvimento. Dentre esses compostos destacam-se os antimicrobianos, antifúngicos e
antioxidantes (SGARIGLIA et al., 2011). No entanto, o uso de produtos naturais também
pode resultar em efeitos tóxicos evidenciando a necessidade de compreender os efeitos
biológicos de compostos naturais (LIMA et al., 2006).
Artemia sp., também conhecida como a larva do camarão salmoura, é um
microcrustáceo zooplanctônico que vive nas águas salgadas de praticamente todos os
ambientes marinhos da Terra (GRINEVICIUS, 2006). Por se tratar de um animal de fácil
cultivo (facilidade na obtenção de seus cistos) e de ampla distribuição, Artemia sp. tem sido
largamente utilizada em testes de toxicidade (PIMENTEL, 2008). Este ensaio é considerado
um método seguro, prático, econômico e de rápida implementação para determinar a
toxicidade dos compostos de produtos naturais (BARBOSA et al., 2009).
38
3. JUSTIFICATIVA
As plantas representam uma fonte importante de produtos naturais biologicamente
ativos, muitos dos quais, se constituem em modelos para a síntese de um grande número de
fármacos. Cada vez mais, novos estudos estão sendo desenvolvidos na área de produtos
naturais contra os microrganismos causadores de micoses superficiais em homens e animais.
Muitas drogas sintéticas são produzidas atualmente, entretanto vem apresentando resistência
além de serem tóxicas e possuírem efeitos adversos em tratamentos das micoses superficiais
de seres humanos e animais, prejudicando os pacientes.
A participação dos animais de companhia como potenciais transmissores de
dermatófitos é motivo de preocupação, uma vez que é crescente o contato do homem com
cães e gatos. Os dermatófitos e leveduras são fonte de zoonoses e de fácil disseminação,
sendo considerados problemas de saúde pública. Este trabalho é justificado pela importância
da busca de novos compostos para combater as infecções fúngicas, diminuindo assim a
possibilidade de resistência dos agentes fúngicos.
39
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
Os óleos essenciais e extratos provenientes das folhas de Plectranthus grandis e
Plectranthus ornatus apresentem atividade antioxidante e antifúngica sobre os dermatófitos e
as leveduras.
40
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo Geral
Avaliar a atividade antioxidante e antifúngica de óleos essenciais e de extratos de Plectranthus spp. frente a cepas de drematófitos e leveduras.
5.2 Objetivos específicos
1 - Extrair óleos essenciais de folhas de Plectranthus ornatus e Plectranthus grandis;
2 - Fazer a caracterização química dos componentes dos óleos essenciais dos Plectranthus
ornatus e Plectranthusr grandis;
3 - Preparar extrato etanólico das folhas das espécies Plectranthus ornatus e Plectranthus
grandis;
4 - Avaliar a atividade antioxidante por meio do teste de 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH);
5 – Analisar a toxicidade dos compostos em Artemia sp.;
6- Pesquisar o efeito antifúngico in vitro dos óleos e extratos dos Plectranthus spp. contra
Trichophyton rubrum, Microsporum canis, Candida albicans e Malassezia pachydermatis.
41
6. CAPITULO 1
CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DE Plectranthus spp. E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E ANTIFÚNGICA DE ÓLEOS ESSENCIAIS E DE
EXTRATOS FRENTE À DERMATÓFITOS
Chemistry characterization of Plectranthus spp. and antioxidant evaluation and
antifungal activity of essential oils and extracts front dermatophytes.
Fransérgio Américo Ribeiro Alves1, Selene M. Morais1,2*, Raquel Oliveira dos Santos
Fontenelle3, Isaac Neto Geos da Silva4, Clécio G. Martins2, Antonio Adailson S. Silva5,
42
1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias - Faculdade de Veterinária,
Universidade Estadual do Ceará. Avenida Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi,
60714-903, Fortaleza, Ceará, Brazil. 2Curso de Química, Universidade Estadual do Ceará, Campus do Itaperi, Av. Dr. Silas
Munguba, 1700, CEP 60714-903, Fortaleza, Ceará, Brazil. 3Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual Vale do Acaraú – UVA . Av: da
Universidade, 850, Betânia - Sobral/CE.
4Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual do Ceará – Faculdade de
Veterinária, Universidade Estadual do Ceará. Avenida Dr. Silas Munguba, 1700, Campus do
Itaperi, 60714-903, Fortaleza, Ceará, Brazil. 5Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal
do Ceará. Rua Cel. Nunes de Melo, 1127, Rodolfo Teófilo, CEP, 60430-270, Fortaleza,
Ceará, Brazil
*E-mail: [email protected]
Submetido a revista Brazilian Journal Microbiology em 08 de junho de 2015.
43
Abstract
Two plants of Plectranthus species, P. grandis and P.ornatus were chosen due to large
popular use in gastrintestinal disorders. Plactranthus species were submitted to chemical
analysis and antioxidant tests. Essential oils were obtained by hydrodistilation and ethanol
extracts by maceration. All extracts were evaluated the antioxidant potential by DPPH test.
The goal of this study was to characterize essential oils and Plectranthus spp. extracts and
evaluate antioxidant and antifungal activities against Trichophyton rubrum and Microsporum
canis dermatophytes. So, it was extracted and isolated essential oils and ethanolic extracts of
leaves. After substances identification cytotoxicity and antioxidant Artemia sp..
Phytochemicals tests were made and Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was
determined. Tests were made in duplicate. Minimum Fungicidal Concentration (MFC) was
determined by subculturing 100 ul from without turbidity. Phytochemical tests showed the
presence of phenols. Toxicity was observed in lyophilized decoct oil, P. grandis acetate
fraction decoct and P.ornatus oil. extracts antioxidant activity showed IC50 between 12.35 and
16.28 µg/ml. MIC was 0.15 mg/ml T. rubrum strain. Synergism between compounds occurred
in 1 combination, between EELPG with ketoconazole and FICI was 0,37 mg/ml. Plectranthus
spp. extracts oils vitro tests have antifungal and antioxidant activities, promising to combat
dermatophytoses.
Keywords: Plectranthus spp., Trichophyton rubrum, Microsporum canis,
44
Introduction
Plants are an important source of biologically natural products active, in which
many of them constitute models for synthesis of a large number of drugs. Several studies have
shown great potential for new drugs discovery based on collection and characterization of
traditional medicinal plants worldwide (Calo et al., 2014). Essential oils (EO) and their main
components show antimicrobial activity, properties of low toxicity to mammals and less
environmental effects and can be used as alternatives to chemical fungicides. Oils are natural
antioxidants well known for its antimicrobial and biodegradable properties. They have great
popularity, due to their volatile nature, which facilitate the use of small safe concentrations for
consumption (Sivakumar; Baths, 2014). According to World Health Organization 70-95% of
the population in developing countries depends primarily on plants for their primary health
care (Who, 2011). The use of medicinal plants for skin infections treatment is very common
in many rural areas (Naidoo; Coopoosamy, 2011; Mabona, 2013). Generally, these infections
usually invade keratinized tissues such as skin epidermis, nails and hair. Dermatophytoses are
mycoses caused by fungi belonging to Trichophyton, Microsporum and Epidermophyton
genera. (Adimi et al., 2013).
Material and methods
Obtaining plant material, essential oils extraction and preparation of extracts.
Plectranthus grandis and Plectranthus ornatus leaves of these plants were
collected in Francisco José de Abreu Matos Medicinal Plants Garden set in Federal University
of Ceará (FJAMPG/FUC) identified and deposited in Prisco Bezerra Herbarium set in Federal
University of Ceará with numbers 28377 (P. grandis) and 31929 (P. ornatus). Extracts were
obtained from leaves infusion in ethanol (96%) during 7 days. Solvent was evaporated in a
rotary evaporator to obtain extracts: ethanol extract from Plectranthus leaves (EEPGL) and
ethanolic extracts from Plectranthus ornatus leaves (EPOL).
Essential oils and hydrolates were extracted from distillation in Clevenger
machine, heating during 4 hours. Oils The constituents identification was performed by
analysis using a gas chromatograph coupled to mass spectrometer (GC/MS). Lyophilization
and decoct acetate fraction.
Decoct (decoction of the product) after frozen was lyophilized to an average
temperature of - 51 ° C, at a negative pressure in a device model 101 (Liobras). Decoct
acetate fraction was made from 50 ml washed decoct (4x) with 50 ml of PA ethyl acetate in
45
separatory funnel. Acetate ethyl fraction was dried with Na2SO4 and rota-evaporated to
remove solvent.
Phytochemical of Plectranthus spp. extracts.
Phytochemicals tests were done following the methodology proposed by Matos
(2009). Phenols, steroids, triterpenes, flavonoids and alkaloids qualitative phytochemicals
tests were based on visual observation of color change or precipitate formation after addition
of specific reagents.
Antioxidant test by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DPPH method
Antioxidant activity was determined based on Brand Wiliams (1995). In a test
tube, it was placed 3.9 ml of a methanol solution 6.5 x 10-5 M DPPH free radical. Then the
tube was added 0.1 ml of the methanolic solution from nine samples tested concentrations
(250 mg/ml - 0.025 mg/ml). Tests were performed in triplicate for each concentration.
Absorbance was measured in a Spekol spectrophotometer at a wavelength of 515 nm. Results
were used to calculate scanner rate of the sample in percent (% SR), using formula: SR% =
(ADPPH – A sample / ADPPH) x 100 where A is the absorbance at the end of 60 minutes.
These values were applied in Origin 7.0 statistical program, in order to calculate concentration
that inhibited 50% of free radical solution (IC50).
Artemia sp. toxicity.
Extracts toxicity was assessed using lethality test against Artemia sp. according to
the method proposed by Meyer et al. (1982) with some modifications. Artemia sp. eggs were
incubated in saline solution at room temperature during 48 hours. Drugs were diluted in four
concentrations (1000 to 1/ml) and incubated using larvae during 24 hours. A control group
was prepared containing only DMSO (2%), brine and larvae. After this period it was made
dead larvae counting number and this number was used to calculate LD50, the method used
probit program SDS Statistic Determination Software
Inhibitory minimum concentration species of dermatophytes and yeasts.
Dermatophytic fungal strains of Trichophyton rubrum and Microsporum canis
were used. T. rubrum strains were obtained from Mycology Center of Recife. M. canis strains
46
and were isolated from dogs treated at Veterinary Hospital Unit from State University of
Ceará.
Minimum inhibitory concentration (MIC) for fungi was determined by the
microdilution broth method in accordance with the Clinical and Laboratory Standards
Isntitute - CLSI (NCCLS, 2002). Minimum fungicidal concentration (MFC) was determined
according to Fontenelle et al. (2007). Extracts were prepared in 5% DMSO in concentrations
ranging from 2,5 to 0,003 mg/ml.
Broth microdilution method was performed in 96 well plates. Control of growth
and sterility in the wells were included in each tested strain. Plates were incubated at 37 ° C
and were read after 48 hours for yeast and 10 days for dermatophytes fungus. All tests were
done in duplicate and MIC was defined as the lowest concentration able to inhibit 100% of
visible fungal growth. It was determined that minimum fungicidal concentration (MFC) by
subculturing 100 ul of the well solution without turbidity potato Agar at 28 ° C.
Fractional inhibitory index Test
The method used to determine interaction of the drug by calculating was Fractional Inhibitory
Concentration Index (FICI).
FICI is calculated by adding Fractional Inhibitory Concentration (FIC) for each of
tested compounds is defined as the addition of the minimum inhibitory concentration (MIC)
of each drug in the combination and MIC drug alone. Turbidity of the fungal suspensions
were prepared and adjusted to 0.5 McFarland scale (10-5 CFU/ml). Solutions of tested
products were used at certain concentrations of respective. Initially 50 µl RPMI culture was
added to all 96 wells of microdilution plate. They were then added in the first column and 50
µl of serial dilutions of compounds were made from this concentration. In lines 50 µl
commercial antifungal were placed in different concentrations. Finally, 100 µl of inoculum
were added to all wells. It was used as a negative control in the form of inoculum and
commercial antifungal MIC controls and MIC of compound tested. Dermatophyte plates are
incubated at 36 °C during 10 days.
FICI index was calculated by adding FICA + FICB, where A represents the
samples of P. grandis natural products and P. ornatus and B, commercial antifungal
compound. FICA, in turn, was calculated from the formula (FICA = combined UP / UP alone),
while FICB was calculated from the formula (FICB = combined CIMB / CIMB alone).
47
Synergism was defined as ICIF index <or = 0.5, additive effect when index is ICIF = 0.5 to
1.0, regardless ICIF> 1.0 and <or = 4.0 and ICIF antagonism> 4.0 (White et al., 1996).
Results
Phytochemicals tests from Plectranthus spp. extracts, based on visual observation
of color change or precipitate formation after addition of specific reagents showed the
presence of tannins, phenols, flavones, favonóides and the ethanolic extract of the leaves of
P.grandis (EEPGL) and ethanol extract from P. ornatus leaves (EEPOL). Besides these
compounds, EEPOL and EEPGL presented free steroids and saponins, respectively (Table 1).
Tabela 1 – Phytochemical tests of Plectranthus spp. ethanol extracts.
Compouds Plant extracts
EEPGL EEPOL
Phenols (Phlobaphenes tannins) + +
Flavonoids + +
Flavonols + -
Free esteroids _ +
Saponins + _
EEPGL – Ethanolic extract leaves of Plectrantus grandis; EEPOL – Ethanolic extract leaves of Plectrantus
ornatus.
Essential oils of P. grandis (EOPG) and P. ornatus (EOPO) were chemically
characterized by spectrometric methods by GC / MS. They were identified 25 constituints in
P. grandis and P. ornatus especies: α-Pipene, β-Pinene, Myrcene, o-Cymene, 1,8-Cineole
Ocimene (E)- β, Terpinen-4-ol, Terpinen-4-ol acetate, α-copaene, β-Bourbunene, β-
Cubebene, β-Elemene, β-caryophyllene, β-Duprezianene, α-Humulene, Germacrene, β-
Bisabolene, Zingiberene, δ-Cadinene, Nerolidol, Caryophyllene oxide, Globulol, α-Muurolol
and α-Cardinol in essential oils of Plectranthus spp. In P. grandis species, β-Caryophyllene,
Germacrene and α-copaene were the constituents with the highest percentage: 38.25%,
13.23% and 11.38% respectively. In P. ornatus Caryophyllene oxide and β-Caryophyllene
were the main constituents, percentages of 61.74 and 10.65% were respectively (Table 2).
48
Table 2 – Percentual composition of the essential oils from Plectranthus spp. leaves.
Constituent P. grandis P ornatus
IK literature IK calulated Yield (%) Yield (%)
-Pinene 932 934 3.72 -
-Pinene 979 971 0.66 -
Myrcene 998 994 2.04 -
o-Cymene 1024 1022 - 1.79
1,8-Cineole 1026 1029 0.73 -
Ocimene (E)- 1044 1037 1.30 -
Terpinen-4-ol 1177 1138 - 6.20
Terpinen-4-ol
acetate
1300 1359 - 3.57
-Copaene 1376 1385 11.38 1.94
-Bourbunene 1387 1394 - 4.54
-Cubebene 1388 1399 2.32 -
-Elemene 1390 1401 1.15 -
-Caryophyllene 1419 1428 38.25 10.65
-Duprezianene 1423 1510 - 4.27
-Humulene 1459 1460 3.61 -
Germacrene 1484 1487 13.23 -
Zingiberene 1493 1498 4.19 -
-Bisabolene 1505 1510 3.32 -
-Cadinene 1522 1524 4.09 -
Nerolidol 1561 1558 3.83 -
Caryophyllene oxide 1583 1579 4.10 61.74
Globulol 1585 1601 3.39
-Muurolol 1646 1628 0.73 1.91
-Cadinol 1652 1639 1.35 -
IK – Kovat’s índex; (-) – not found.
A major obstacle found in research to develop new drugs is toxicity of many
molecules with bioactivity. In this context, it was evaluated toxicity of of Plectranthus spp.
compounds against Artemia sp. larvae (Table 3). It was found that EEPGL, EELPO, hydrolate
49
P. ornatus (HPO), hydrolate of P.grandis (HPG), lyophilized decoct of P. ornatus (LDPO)
and fraction acetate of P. grandis (DAFPG) showed no bioactivity against microcrustacean.
However, EOPG, EOPO, LDPG and DAFPO showed bioactivit front microcrustacean.
Table 3 - Toxicity tests of Artemia sp.
Drugs LC50 [µg/ml] (IC 95%)
EEPGL > 1000
EOPG 321.85 (15.76)
DAFPG > 1000
HPG > 1000
LDPG 862.63 (200.27)
EEPOL > 1000
EOPO 403.11 (13.08)
DAFPO 358.92 (10.25)
HPO > 1000
LDPO > 1000
EEPGL – Ethanolic extract of Plectrantus grandis leaves; EOPG – Essential Oil of P. grandis; DAFPG – Decoct
acetate fraction of P. grandis; HPG – Hidrolate P. grandis; LDPG – Lyophilization decoct P. grandis; EEPOL –
Ethanolic extract of P.ornatus leaves; EOPO – Essential Oil of P. ornatus; DAFPO – Decoct acetate fraction of
P.ornatus; HPG – Hidrolate P. ornatus; LDPO – Lyophilization decoct P. ornatus.
Antioxidant activity values of essential oils and extracts expressed as inhibitory
concentration (IC50) and culture is showed in Table 4. Extracts showed antioxidant activity
were DAFPO, DAFPG and LFPG with IC50 values of 12.35 µg/ml, 15.60 µg/ml and 16.28
µg/ml, respectively, showing good antioxidant potential. In this study, EOPG, EOPO, HPG
and HPO had a lower antioxidant potential, with IC50 higher than 1000 µg/ml. EEPOL and
LDPO show potential with IC50 values of 67.04 µg/ml and 66.72 µg/ml, compared to standard
quercetin (IC50 4.77 µg/mL).
50
Tabela 4 – Antioxidant DPPH Tests.
Drugs *IC50 [µg/ml] (CI 95%)
EEPGL 18.01 (17.58 – 18.44)
EOPG > 1000
DAFPG 15.60 (15.11 – 16.09)
HPG > 1000
LDPG 16.28 (15.64 – 16.92)
EEPOL 67.04 (66.27 – 67.81)
EOPO > 1000
DAFPO 12.35 (12.05 – 12.65)
HPO > 1000
LDPO 66.72 (63.16 – 70.21)
Quercetin** 4.77 (4.24 – 5.30)
* Confidence interval. ** Standard compouds; EEPGL – Ethanolic extract of Plectrantus grandis leaves; EOPG
– Essential Oil of P. grandis; DAFPG – Decoct acetate fraction of P. grandis; HPG – Hidrolate P. grandis;
LDPG – Lyophilization decoct P. grandis; EEPOL – Ethanolic extract of P.ornatus leaves; EOPO – Essential
Oil of P. ornatus; DAFPO – Decoct acetate fraction of P.ornatus; HPG – Hidrolate P. ornatus; LDPO –
Lyophilization decoct P. ornatus.
Assessment tests from minimum inhibitory concentration for fungi was
determined by microdilution method broth against dermatophytes strains (Trichophyton
rubrum and Microsporum canis) shown in Table 5. Results of their tests to Microsporum
canis showed a growth inhibition fungus in a concentration of 0.0097 mg/ml for all the
samples and it was also performed by positive control. MFC related results against strains of
M. canis concentrations ranged between 0.019 and 0.039 mg/ml, which were observed in
EELPG, and EELPO FADPO the best results with concentrations of 0,019 mg/ml. (table 5).
51
Table 5 - Evaluation of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal
concentration (MFC) Plectranthus spp. against T. rubrum and M. canis.
Drugs
Strains
T. rubrum
LABMIC 0201
T. rubrum
LABMIC 0202
Isolated M. canis
MIC MFC MIC MFC MIC MFC
EELPO 0.15 0.31 0.078 0.15 0.0097 0.019
EELPG 0.15 0.31 0.15 0.31 0.0097 0.019
DPO 2.5 5.0 5.0 5.0 0.0097 0.039
DPG 5.0 >5.0 2.5 5.0 0.0097 0.039
FADPO 0.15 0.31 0.15 0.31 0.0097 0.019
FADPG 5.0 >5.0 2.5 5.0 0.0097 0.039
OEPO 1.25 2.5 >5.0 >5.0 0.0097 0.039
OEPG >5.0 >5.0 5.0 >5.0 0.0097 0.039
HPG - - - - 0.0097 0.039
HPO - - - - 0.0097 0.039
Concentrations of MIC and MFC obtained in mg/mL; EEPGL – Ethanolic extract of Plectrantus grandis leaves;
EOPG – Essential Oil of P. grandis; DAFPG – Decoct acetate fraction of P. grandis; HPG – Hidrolate P.
grandis; LDPG – Lyophilization decoct P. grandis; EEPOL – Ethanolic extract leaves of P.ornatus; EOPO –
Essential Oil of P. ornatus; DAFPO – Decoct acetate fraction of P.ornatus; HPG – Hidrolate P. ornatus; LDPO
– Lyophilization decoct P. ornatus.
The test aimed to verify synergistic action of natural products with ketoconazole.
Tests were performed with EEPOL and EEPGL against 0202 T. rubrum strain, since they
showed better MIC (Table 6). In combination 1 with EEPGL and ketoconazole gave a result
of FICI of 0,37 mg/ml showing the existence of synergism. The value of 1.2 mg/ml from
combination 2 belonging to EEPOL with ketoconazole, according to interpretation of values
was indifferent.
52
Table 6 - Synergism results of Plectranthus spp and Ketoconazole against Trichophyton
rubrum dermatophyte.
Trichophyton rubrum
Combination 1 Combination 2
FIC EEPGL 0.12 EEPOL 0.2
ketoconazole 0.25 ketoconazole 1.0
FICI 0.37 1.2
Interpretation Synergism Indifferent
EELPG – Ethanolic extract of Plectrantus grandis leaves; EELPO – Ethanolic extract of P.ornatus leaves; FIC –
Inhibitory Concentration Fraction; FICI –Inhibitory Concentration Fraction Index; Interpretation of values -
Synergism – (< ou = a 5,0); Additive – (0,5 a 1,0); Indifferent – (>1,0 e < ou= 4,0); Antagonism – (>4,0).
Discussion
The survey of natural products trying to find new drugs to combat T. rubrum and
M. canis dermatophyte, filamentous microorganisms that cause skin diseases in humans and
animals, is a therapeutic alternative that aims to reduce existing resistance and collateral
effects of commercial antifungal compounds. Lamiaceae family is known by the richness of
species with medicinal properties, which have been used since ancient times and many of
these species are common in Mediterranean region. This family stands out in the use of
culinary spices and folk medicine. Antimycotic activity of the oil taken from Ocinum
gratissimum leaves was obtained in minimum concentration of 78 mg/l and Microsporum
gypseum and Trichophyton rubrum (Pandey, 2014). Antifungal activity against O. sanctum
dermatophytes was described in concentration of 200 mg/ml. With this activity extracts leaves
can be a useful source for fighting against infections using dermatophytes (Balakumar, 2011).
Studies indicate that EO are rich in terpenes and phenols, with strong antioxidant properties
and some of them also show antimicrobial properties (akrami, 2015). In this study
phytochemicals testing of extracts from Plectranthus spp. leaves showed the presence of
tannins, phenols, flavonoids and flavones, however, it is expected that antioxidant and
antinflammatory possible action of such compounds act similarly to other oils. The
constituents present in oils of Plectranthus spp, were similar to those found by other
researchers. The observed variations in the composition of the oils studied species compared
to other studies, can generally be attributed to factors edafoclimatic.
53
Of the 25 identified compounds, caryophyllene oxide was one of the major
compounds identified in EOPO as demosntrados in other trials, showing a good antioxidant
activity. Essential oil of Artemisia scopariae herb from China, rich in caryophyllene oxide
(19.1%) and spathulenol (9.9%) showed strong antioxidant activity (Jiang et al., 2012). In this
context, tests show better results against the other studies.
As in EOPO, the β-caryophyllene constituent was one of the major constituents of
the oils A. panurensis and L. martiniana, with concentrations ranging from 21.4% (L.
martiniana stems) to 41.7% (L . martiniana sheets). This volatile metabolic, influence on its
aroma and has many biological activities such as anti-inflammatory, anti-allergic, local
anesthetic, antifungal and anticarcinogenic. (Alcantara, 2010)
Other constituents such as α-Pinene, Myrcene, α-Humulene found in the
Plectranthus genus (P.rugosus, P. fruticosus, P. coleoides, P. tenuiflorus, P.incanus and P.
defoliatus) which according to the literature, present antibacterial activity, fungicides and
insecticides (Bandeira et al., 2011), were also detected in small amounts in the analysis of P.
grandis and P. ornatus.
It was found that EEPGL, EEPOL, hydrolate of P. ornatus (HPO), hydrolate of
P.grandis (HPG), lyophilized decoct of P. ornatus (LDPO) and the fraction of acetate P.
grandis (DAFPG) showed no toxicity against microcrustacean. EOPG, EOPO, LDPG and
DAFPO showed toxicity. However, EO are effective alternatives to antimicrobial agents
(akrami, 2015). Plectranthus spp. oils described in this test showed antifungal activity similar
to other essential oils rich in phenolic compounds, such as those cited in the species Thymus
vulgaris, Thymus zygis, which are widely used in herbal medicine, and suggests the use of
oils, mainly in treatment of dermatophytosis. (Valente, 2013)
Studies have shown the MIC of Cymbopogon winterianus oils at a concentration
of 156 ug / ml T. rubrum LM63 (Pereira et al., 2011). The lowest inhibitory concentration of
oils and extracts of Plectranthus spp against to strains of T. rubrum was EELPO and EELPG
found in the concentrations of 0.078 mg / ml and 0:15 mg / ml is similar to other studies.
Various authors have studied the effect of two or three types of antifungal agents
combinations that act as inhibitors on the same or different metabolic pathways such as
combinations of azoles, allylamines and azoles in ergosterol biosynthesis pathway. In this
study, combination of EEPOL and EEPGL with ketoconazole compound was evaluated
against LABMIC 0202 T. rubrum strain, where EEPOL presented Fractional Inhibitory
Concentration Index (FICI) of 1.2, indicating that the combination is irrelevant, however,
54
FICI value from EEPGL was 0.37, showing synergism between compounds. These results are
very interesting suggesting potential for development of new antifungal drugs.
References
Adimi P, Hashemi SJ, Mahmoudi M, Mirhendi H, Shidfar MR, Emmani M, Rezaei-
Matehkolaei A, Gramishoar M, Kordbacheh P (2013) In-vitro Activity of 10 antifungal
Agents against 320 Dermatophyte Strains Using Microdilution Method in Tehran. Iranian
Journal of Pharmaceutical Research 12:537–545.
Akrami F, Rodríguez-Lafuente A, Bentayeb K, Pezo D, Ghalebi SR, Nerín C (2015)
Antioxidant and antimicrobial active paper based on Zataria (Zataria multiflora) and two
cumin cultivars (Cuminum cyminum). LWT - Food Science and Technology 60:929-933.
Alcântara JM, Yamaguchi KKL, Veiga Junior VF (2010) Composição Química de óleos
essenciais de espécies de Aniba e Licaria e suas atividades antioxidante e Antiagregante
Plaquetária, Quimica Nova, 33:141-145.
Balakumar S, Rajan S, Thirunalasundari T, Jeeva S (2011) Antifungal activity of Ocimum
sanctum Linn (Lamiaceae) on clinically isolated dermatophytic fungi. Asian Pacific Journal of
Tropical Medicine 654-657.
Bandeira JM, Barbosa FF, Barbosa LMP, Rodrigues ICS, Bacarin MA, Peters JA, Braga EJB
(2011) Composição do óleo essencial de quatro espécies do gênero plectranthus. Revista
Brasileira de Plantas Madicinais. 13:157-164.
Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C (1995) Use of and free radical method to evaluate
antioxidant activity, Lebensmittel-Wissenchaft und-Technologie. Food Science Technology
28:25-30.
Calo JR (2006) curso popular de plantas medicinais popular use of medicinal plants gisele
marcelino rocha. Ciências Biológicas, – IBC, UNIGRANRIO. Saúde & Ambiente em
Revista, Duque de Caxias. 1:76-85.
55
Fontenelle ROS, Morais, SM, Brito E, Kerntopf M, Brilhante RSN, Cordeiro RA, Tomé A,
Queiroz MG, Nascimento NR, Sidrim JJC, Rocha MFG (2007) Chemical composition,
toxicological aspects and antifungal activity of essential oil from Lippia sidoides. Journal of
Antimicrobial Chemotherapy 59:934-940.
Jiang S, Lai P, Li J, Wang G (2012) Antioxidant Activities and Essential Oil Composition of
Herb Artemisia escopariae from China. Journal of Oleo Science 61:291 -295.
Mabona U, Van Vuuren SF (2013) Southern African medicinal plants used to treat skin
diseases. South African Journal of Botany 87:175–193.
Matos FJA (2009) Introdução à Fitoquímica Experimental. Ed. UFC. Fortaleza-Ceará. 45.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnana JE, Jacobsen LB, Nichols DE, Mc claughlin J (1982) Brine
shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Medica 45:31-34.
Naidoo KK, Coopoosamy RM (2011) A comparative analysis of two medicinal plants used to
treat common skin conditions in South Africa. African Journal of Pharmacy and
Pharmacology 5:393–397.
National Committee Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (2002) Reference Method for
Brath Dilution Antifungal Susceptibility Testinjg of Filamentous Fungi Approved Standard
M38A NCCL. Wayne 22-16.
Pandey AK, Singh P, Tripathi NN (2014) Chemistry and bioactivities of essential oils of some
Ocimum species: an overview. Asian Pacific Journal Tropical Biomed 2014; 4(9): 682-694
Pereira FO, Wanderley PA, Cavalcanti FA, Lima RB, Sousa FB, Lima EO (2011) Growth
inhibition and morphological alterations of trichophyton rubrum induced by
Essential oil from cymbopogon winterianus jowitt ex bor. Brazilian Journal of Microbiology
42:233-242.
Sivakumar D, Baños SB (2014) A review on the use of essential oils for postharvest decay
control and maintenance of fruit quality during storage. Crop Protection 64:27-37.
56
Valente J, Zuzarte M, Gonçalves MJ, Lopes MC, Cavaleiro C, Salgueiro L, Cruz MT (2013)
Antifungal, antioxidant and anti-inflammatory activities of Oenanthe crocata L. essential oil.
Food and Chemical Toxicology 62:349-354.
World health organization (2011) The world medicines situation traditional medicines: global
situation, issues and challenges. Geneva 12.
57
7. CONCLUSÕES
As plantas da família Lamiaceae e suas espécies são conhecidas na literatura e na
medicina popular por suas propriedades antioxidantes, antinflamatórias e antifúngicas. A
identificação química dos Plectranthus grandis e Plectranthus ornatus mostrou nos extratos
presença de fenóis entre seus compostos e substâncias como o β-cariofileno, óxido de
cariofileno, Germacreno, α-Copaeno nos óleos. Tais compostos são descritos por
apresentarem comprovadamente atividade contra microrganismos como fungos
leveduriformes e dermatofíticos. Foi verificado que os extratos etanólicos de P. grandis e
P.ornatus, Hidrolato de P. ornatus, Hidrolato de P.grandis, decoto liofilizado de P. ornatus e
a fração acetato de P. grandis não apresentaram toxicidade. Os extratos etanólicos mostraram
boa atividade antifúngica frente aos dermatófitos e ainda uma boa atividade sinérgica de
extrato de P. grandis com cetoconazol. Dessa forma os extratos de Plectranthus spp
apresentam um bom potencial para a produção de um fitoterápico para utilização frente os
dermatófitos Trichophyton rubrum, Microsporum canis e o agente leveduriforme Malassezia
pachydermatis.
58
8. PERSPECTIVAS
Foram realizados também os ensaios para a avaliação da concentração inibitória
mínima e a Concentração Fungicida Mínima das amostras dos óleos e extratos de P. grandis e
P. ornatus contra fungos leveduriformes de Candida albicans e Malassezia pachydermatis
(Tabela 7). Nos ensaios frente às cepas LABMIC 0101 e LABMIC 0102 de C. albicans, não
foram observadas inibição do crescimento dos fungos nas concentrações testadas, mostrando
assim um grau de resistência da C. albicans aos extratos e óleos dos Plectranthus spp. Os
testes de sinergismo não foram realizados, entretanto poderão ser realizados posteriormente
para verificar o comportamento com outras drogas sintéticas. Em relação aos testes frente ao
fungo leveduriforme M. pachydermatis, estes mostraram uma CIM na concentração de 0,0097
mg/mL para todos os extratos e óleos de P. grandis e P. ornatus. Os resultados da CFM foram
observados entre as concentrações de 0,019 e 0,039 mg/mL. As amostras dos hidrolatos não
foram testadas em C. albicans, devido a problemas relacionados a problemas de diluição das
amostras para realização dos testes, podendo posteriormente ser testado para a obtenção dos
resultados em C. albicans.
Tabela 7 – Avaliação da concentração minima inibitória (CIM) e concentração fungicida
mínima (CFM) de Plectranthus spp. frente C. albicans e M. pachydermatis.
Drogas
(Compostos)
Cepas
C albicans
LABMIC 0101
C albicans
LABMIC 0102
M. pachydermatis
isolada
CIM CFM CIM CFM CIM CFM
EEFPO N.I* N.I N.I N.I 0.0097 0.019
EEFPG N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.019
DLPO N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.019
DLPG N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.039
FADPO N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.019
FADPG N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.019
OEPO N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.019
OEPG N.I N.I N.I N.I 0.0097 0.019
HPG - - - - 0.0097 0.039
HPO - - - - 0.0097 0.039
59
* Não inibição do fungo. Concentrações de CIM e CFM obtidas em mg/mL; EEFPG – Extrato Etanólico de
folhas de Plectrantus grandis; OEPG – Óleo Essencial de P. grandis; FADPG – Fração Acetado do Decoto de P.
grandis; HPG – Hidrolato P. grandis; DLPG – Decoto Liofilizado de P. grandis; EEFPO – Extrato Etanólico de
folhas de P.ornatus; OEPO – Óleo Essencial de P. ornatus; FADPO – Fração Acetato do Decoto de P.ornatus;
HPG – Hidrolato P. ornatus; DLPO – Decoto Liofilizado de P. ornatus.
Mesmo havendo relatos na literatura da atividade antioxidante e antifúngica dos
compostos β-cariofileno, óxido de cariofileno, Germacreno, α-Copaeno e fenóis e atividade
dos extratos e óleos de Plectranthus spp. frente aos fungos, entende-se a necessidade de novos
ensaios in vitro e in vivo em para determinação da interação entre as drogas comerciais e as
amostras contribuindo para diminuição da resistência e efeitos adversos.
60
REFERÊNCIAS
ADIMI, P. HASHEMI, S. J.; MAHMOUDI, M.; MIRHENDI, H.; SHIDFAR M. R.; EMMANI, M.; REZAEI-MATEHKOLAEI, A.; GRAMISHOAR, M.; KORDBACHEH, P. In-vitro Activity of 10 antifungal Agents against 320 Dermatophyte Strains Using Microdilution Method in Tehran. Iranian Journal of Pharmaceutical Research v. 12, p. 537–545, 2013. AKRAMI, F.; RODRÍGUEZ-LAFUENTE, A.; BENTAYEB, K.; PEZO, D.; GHALEBI, S. R.; NERÍN, C. Antioxidant and antimicrobial active paper based on Zataria (Zataria multiflora) and two cumin cultivars (Cuminum cyminum). LWT - Food Science and Technology, v.60, p. 929-933, 2015. ALBUQUERQUE, U. P.; MUNIZ DE MEDEIROS, P.; ALMEIDA, A. L. de; MONTEIRO, J. M.; LINS NETO, E. M. de F.; MELO, J. G.; SANTOS, J. P dos. Medicinal plants of the Caatinga (semi-arid) vegetation of NE Brazil: a quantitative approach. Journal of Ethnopharmacology, v.114, n. 3, p. 325–354, 2007. ASAWANONDA, P.; TAYLOR, C. R. Wood’s light in dermatology. International Journal of Dermatology, v.38, p.801-807, 1999. BARBOSA, T. P.; JUNIOR, C. G. L.; SILVA, F. P. L.; LOPES, H. M.; FIGUEIREDO, L. R. F.; SOUSA, S. C. O.; BATISTA, G. N.; SILVA, T. G.; SILVA, T. M. S.; OLIVEIRA, M. R.; VASCONCELOS, M. L. A. A. Improved synthesis of seven aromatic Baylise Hillman adducts (BHA): evaluation against Artemia salina Leach and Leishmania chagasi. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 44, p. 1726–1730, 2009. BETTEGA, P. V. C.; CZLUSNIAK, G. R.; PIVA, R.; NAMBA, E. L.; RIBAS, C. R.; GRÉGIO, A. M. T. Phytotherapy: from greenhouses to drugstore’s bench. Arch Oral Res, v. 7, n. 1, p. 89-97, 2011. BRAND-WILLIAMS, W.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C. Use of and free radical method to evaluate antioxidant activity, Lebensmittel-Wissenchaft und-Technologie.Food Science Technology. v. 28, p. 25-30, 1995. BRILHANTE, R. S. N.; CAVALCANTE, C. S. P.; SOARES-JUNIOR, F. A.; CORDEIRO, R. A.; SIDRIM, J. J.C.; ROCHA, M. F. G. High rate of Microporum canis feline and canine dermatophytoses in Northeast Brazil: Epidemiological and diagnostic features. Mycopathologia, v.156, n.4, p.303-8, 2003. BRILHANTE, R. S. N.; CORDEIRO, R. A.; MEDRANO, D. J. A.; ROCHA, M. F. G.; MONTEIRO, A. J.;CAVALCANTE, C. S. P.; MEIRELES, T. E. F.; SIDRIM, J. J. C.
61
Onychomycosis in Ceará (NortherastBrazil): epidemiologic aland laboratory aspects. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. v. 100, n. 2, 2005. BRITO, E. H. S. de; FONTENELLE, R. O. dos S.; BRILHANTE, R. S. N.; CORDEIRO, R. de A.; SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Candidose na medicina veterinária: um enfoque micológico, clínico e terapêutico. Ciência Rural, v. 39, n. 9, p. 2655-2664, 2009. CABAÑES, F. J. Dermatofitosis animales. Recientes avances. Revista Ibero americana de Micologia, v.17, n. 1, p.8-12, 2000. CABAÑES, F. J.; THEELEN, B.; CASTELLA, G.; BOEKHOUT, T. Two new lipid-dependent Malassezia species from domestic animals. FEMS Yeast Research. v. 7, p. 1064-1076, 2007. CAFARCHIA, C.; ROMITO, D.; CAPELLI, G.; GUILLOT, J.; OTRANTO, D. Isolation of Microsporum canis from the coat of pet dogs and cats belonging to owners diagnosed with M. canis tea corporis. Veterinary Dermatology, v. 17, n. 5, p. 327-331, 2006. CAFARCHIA, C.; ROMITO, D.; COCCIOLI, C.; CAMARDA, A.; OTRANTO, D. Phospholipase activity of yeasts from wild birds and possible implications for human disease. Medical Mycology, v.46, n. 5, p.429-434, 2008. CALIXTO, J.B. Biodiversidade como fonte de medicamentos. Cienc Cult, v. 55, n. 3, p. 37-9, 2003. CALO, J. R.; CRANDALL, P. G.; O’BRYAN, C. A.; ROCKE, S. C. Essential oils as antimicrobials in food systems – A review. Food Control, v. 54, p. 111-119, 2015. CARDOSO, M. et al. Óleos Essenciais. Lavras: Editora UFLA, p. 42, 2000. CHEN, T.; HILL, P. B. The biology of Malassezia organisms and their ability to induce immune responses and skin disease. Veterinary Dermatology, v.16, n. 1, p.4-26, 2005. CLEFF, M. B. Avaliação da atividade antifúngica do óleo essencial de Origanum vulgare L. frente a fungos de importância em veterinária com ênfase em Candida spp. Porto Alegre: 2008. 115f. Tese (Doutorado em Ciências Veterinária). Faculdade de Ciências Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
62
CRESPO, M. J.; ABARCA, M. L.; CARBANES, F. J. Occurrence of Malassezia spp. in the external ear canals of dogs and cats with and without otitis externa. Medical Mycology. v. 40, n. 2, p. 115-121, 2002. FALEIRO, M. L. The mode of antibacterial action of essential oils. Science Against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances, v. 2, p. 1143-1156, 2011. FARIAS, M. R., GIUFFRIDA, R. Antifúngicos. Manual deTerapêutica Veterinária. Rio de Janeiro: Ed Rocca, 2002. FERREIRO, L.; MOREIRA JR., J. P. R.; APPELT, C. E.; BERG, V.; OLIVEIRA, I. A.; MUSCHNER, A. C.; REISCHAK, D.; CHERMETTE, R. Associações entre o isolamento de Candida albicans com a infecção pelo vírus da leucemia felina (FeLV), tratamentos com corticosteróides ou antimicrobianos em gatos. Acta Scientiae Veterinariae, v.30, n.3, p.179-183, 2002. FILIPPIN, F. B.; SOUZA, L. C. Eficiência terapêutica das formulações lipídicas de anfotericina B. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 42, n. 2, 2006. FONTENELLE, R. O. S.; MORAIS, S. M.; BRITO, E. H.; BRILHANTE, R. S.; CORDEIRO, R. A.; NASCIMENTO, N. R.; KERNTOPF, M. R.; SIDRIM, J. J.; ROCHA, M. F. Antifungal activity of essential oils of Croton species from the Brazilian Caatinga biome. Journal of Applied Microbiology, v. 104, n. 5, p. 1383-90, 2008. FONTENELLE, R. O. S.; MORAIS, S. M.; BRITO, E. H.; BRILHANTE, R. S.; CORDEIRO, R. A.; LIMA, Y. C.; BRASIL, N. V.; MONTEIRO, A. J.; SIDRIM, J. J.; ROCHA, M. F. Alkylphenol Activity against Candida spp. and Microsporum canis: A Focus on the Antifungal Activity of Thymol, Eugenol and O-Methyl Derivatives. Molecules, v. 16, n. 8, p. 6422-6431, 2011. FULLERINGER, S. L.; SEGUIN, D.; WARIN, S.; BEZILLE, A.; DESTERQUE, C.; ARNÉ, P.; CHERMETTE, R.; BRETAGNE, S.; GUILLOT, J. Evolution of the environmental contamination by thermophilic fungi in a turkey confinement house in France. Poultry Science, v. 85, n. 11, p. 1875-1880, 2006. GIRÃO, M. D.; PRADO, R. S. N.; CORDEIRO, R. A.; MONTEIRO, A. J.; SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Malassezia pachydermatis isolated from normal and diseased external ear canals in dogs: a comparative analysis. The Veterinary Journal, v. 172, n. 3, p. 544-548, 2006.
63
GLADIEUX, P.; BYRNES, E. J.; AGUILETA, G.; FISHER, M. C.; HEITMAN, J.; GIRAUD, T. Epidemiology and Evolution of Fungal Pathogens in Plants and Animals. In: TIBAYRENC, M. (Ed.). Genetics and Evolution of Infectious Disease. Elsevier, p. 59-132, 2011. GRINEVICIUS, V. M. A. S. Avaliação da remediação de efluentes de uma indústria têxtil utilizando bioindicadores e biomarcadores. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal De Santa Catarina, Florianópolis, 179 f., 2006. GUÉHO, E.; MIDGLEY, G.; GUILLOT, J. The genus Malassezia with description of four new species. Antonievan Leeuwenhoe, v. 69, n. 1, p. 337-355, 1996. HARBORNE, J. B.; WILLIAMS, C. A. Advances in flavonoid research since. Phytochemistry, v. 55, n. 6, p. 481-504, 2000. HAVSTEEN, B. H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology & Therapeutics, v. 96, n. 2, p. 67- 72, 2002. HENTZ, S. M.; SANTIN, N. C. Avaliação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de alecrim (Rosmarinus officinalis l.) contra Salmonella sp. Evidência – Biotecnologia e Alimentos, v. 7, n. 2, p. 93-100, 2007. HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas superiores. São Carlos: Ed. UFSC, v. 9, p. 60-61, 2003.
KANO, R.; NAGATA, M.; SUZUKI, T.; WATANABE, S.; KAMATA, H.; HASEGAWA, A. Isolation of Trichophyton rubrum var. raubitschekii from a dog. Medical mycology, v. 48, n. 4, p. 653-655, 2010. KAPEWANGOLO, P.; HUSSEIN, A. A; MEYER, D. Inhibition of HIV-1 enzymes, antioxidant and anti-inflammatory activities of Plectranthus barbatus. Journal of ethnopharmacology, v. 149, n. 1, p. 184–190, 2013. KAVITHA, C.; RAJAMANI, K.; VALDIVEL, E. Coleus forskohlii: a comprehensive review on morphology, phytochemistry and pharmacological aspects. Journal of Medicinal Plants Research, v. 4, n. 4, p. 278-285, 2010. KELECOM, A. 6 β-hydroxycarnosol, a new minor diterpene from the false boldo Coleus barbatus Bentham (Labiatae). Química Nova, v. 6, p. 117-118, 1983.
64
KELLER, K. A. Therapeutic Review: Terbinafine. Journal of Exotic Pet Medicine, v. 21, n. 2, p. 181-185, 2012. LACAZ, C. S. et al. Tratado de Micologia Médica Lacaz. 9. ed. São Paulo: Sarvier, 1104p, 2002. LIMA, J. R.; DIMENSTEIN, J. F. M. A. Fitoterapia na Saúde Pública em Natal/RN: visão do odontólogo. Saúde Rev, v. 8, p. 1937-1944, 2006. LUKHOBA, C. W.; SIMMONDS, M. S. J.; PATON, A. J. Plectranthus: a review ofethnobotanical uses. Journal of Ethnopharmacology, v. 103, n. 1, p. 1–24, 2006. MABONA, U.; VAN VUUREN, S. F. Southern African medicinal plants used to treat skin diseases. South African Journal of Botany, v. 87, p. 175–193, 2013. MACHADO, M. L. S.; APPELT, C. E.; FERREIRA, L.; GUILLOT, J. Otites e dermatites por Malassezia spp. em cães e gatos. Clínica Veterinária, v. 44, p. 27-34, 2003. MACHADO, M. L. S.; APPELT, C. E.; FERREIRA, L.. Dermatophytes and yeasts isolated from the skin of dogs with diverse dermatopathies. Acta Scientiae Veterinariae, v. 32, p. 225-232, 2004. MACHADO, A. C.; OLIVEIRA, R. C. Medicamentos Fitoterápicos na odontologia: evidências e perspectivas sobre o uso da aroeira-do-sertão (Myracrodruon urundeuva Allemão). Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 16, n. 2, p. 283-289, 2014. MACIEL, M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA-JUNIOR, V. F.; GRYNBERG, N. F.; ECHEVARRIA, A. Plantas Medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, v. 25, n. 3, p. 429-438, 2002. MANCIANTI, F.; NARDONI, S.; CORAZZA, M.; D’ACHILLE, P.; PONTICELLI, C. Environmental detection of Microsporum canis arthrospores in the households of infected cats and dogs. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 5, n. 6, p. 323-328, 2003. MARINO, M.; BERSANI, C.; COMI, G. Impedance measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. International Journal of Food Microbiology, v. 67, n. 3, p. 187-195, 2001.
65
MARTINEZ, R. Atualização no uso de agentes antifúngicos An update on the use of antifungal agents. Jornal Brasileiro de Pneumologia v. 32, n. 5, p. 449-60, 2006. MARTINS, E. R.; CASTRO, D. M.; CASTELLANI, D. C.; DIAS, J. E. Plantas medicinais. 5 ed. Viçosa-MG: Editora UFV, 2003. MATOS, F. J. A. Plantas Medicinais - guia de seleção e emprego de plantas usadas em fitoterapia no nordeste do Brasil. Fortaleza-CE: Edições UFC, p. 344, 2002. MATOS, F. J. A. Introdução à Fitoquímica Experimental. Fortaleza-CE: Edições UFC, p. 45, 2009. MATTEI, A. S.; MADRI, I. M.; SANTIN, R.; SCHUCH, D. L. F.; MEIRELES, M. C. A. Presença de fungos com potencial patogênico em instrumentos de tosa. Archives of Veterinary Science, v. 19, n. 2, p. 40-45, 2014. MEDEIROS, F.;CREPALDI, N.; TOGNOLI, L.; PEREIRA, R. E. P. Dermatófitos – Revisão de literatura. Revista científica eletrônica de medicina veterinária. v. 12, 2009. MEDLEAU, L.; HNILICA, K. A. Dermatologia de Pequenos Animais – Atlas Colorido e Guia Terapêutico. São Paulo: Editora Roca, p. 353, 2003. MELO, A. E.; GUERRA, N. B. Ação antioxidante de compostos fenólicos naturalmente presente em alimentos. Boletim Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 36, n. 1, p. 1-11, 2002. MEYER, B. N.; FERRIGNI, N. R.; PUTNANA, J. E.; JACOBSEN, L. B.; NICHOLS, D. E.; MC CLAUGHLIN, J. Brine shrimp: a convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Medica, v. 45, p. 31-34, 1982. MORACA, F.; DE VITA, D.; PANDOLFI, F.; DI SANTO, R.; COSTI, R.; CIRILLI, R.; D’AURIA, F. D.; PANELLA, S.; PALAMARA, A. T.; SIMONETTI, G.; BOTTA, M.; SCIPIONE, L. Synthesis, biological evaluation and structure-activity correlation study of a series of imidazol-based compounds as Candida albicans inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 83, p. 665-673, 2014. MORAIS, S. M.; BRAZ FILHO, R. Produtos Naturais: Estudos Químicos e Biológicos, Fortaleza-CE: Ed UECE, p. 240, 2007.
66
MORETTI, A.; POSTERARO, B.; BONCIO, L.; MECHELLI, L.; GASPERIS, E.; AGNETTI, F.; RASPA, M. Diffuse cutaneous candidiasis in a dog. Diagnosis by PCR-REA. Revista Ibero americana de Micologia, v. 21, n. 3, p. 139-142, 2004. MULLER, G. H.; KIRK, R. W.; SCOTT, D. W. Dermatologia dos Pequenos Animais. 5 ed. Rio de Janeiro: Interlivros Edições Ltda. p. 1130, 1996. NAIDOO, K. K.; COOPOOSAMY, R. M. A comparative analysis of two medicinal plants used to treat common skin conditions in South Africa. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, v. 5, p. 393–397, 2015. National Committee Clinical Laboratory Standards (NCCLS) M27A. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: Approved Standard, M27A2; NCCLS: Wayne, PA, USA, v. 27, p. 9, 2002. OLIVEIRA, P. M.; FERREIRA, A. A.; SILVEIRA, D.; ALVES, R. B.; RODRIGUES, G. V.; EMERENCIANO, V. P.; RASLAN, D. S. Diterpenoids from the aerial parts of Plectranthus ornatus. Journal of Natural Products, v. 68, n. 4, p. 588-591, 2005. PATON, A. J.; SPRINGATE, D.; SUDDEE, S.; OTIENO, D.; GRAYER, R. J.; HARLEY, M. M.; WILLIS, F.; SIMMONDS, M. S. J.; POWELL, M. P.; SAVOLAINEN, V. Phylogeny and evolution of basils and allies (Ocimeae, Labiatae) based on three plastid DNA regions. Molecular Phylogenetics and Evolution, v. 31, n. 1, p. 277–299, 2004. PIMENTEL, M. F. Análise ecotoxicológica do efluente da indústria de beneficiamento da castanha de caju antes e após tratamento em reator aeróbio inoculado com fungos. Dissertação (mestrado em Ciências Veterinárias) – Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, 2008. PINTO, A. C.; SILVA, D. H. S.; BOLZANI, V. S.; LOPES, N. P.; EPIFANIO, R. A. Produtos Naturais Atualidades, Desafios e Perspectivas. Química Nova, v. 25, n. 1, p. 45-61, 2002. PINTO, F. C. L. et al. Constituintes químicos de Solanum buddleifolium Sendtn. Química Nova, v. 36, n. 8, p. 1111-1115, 2013. RATES, S. M. K. Plants as source of drugs. Toxicon, v. 39, p. 603-613, 2001. RAUT, J. S.; KARUPPAYIL, S. M. A status review on the medicinal properties of essential oils. Industrial Crops and Products, v. 62, p. 250-264, 2014.
67
RHEE, I. K.; MEEN, M.; INGKANINAN, K.; VERPOORTE, R. Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin-layer chromatography in combination with bioactivity staining. Journal of Chromatography, v. 915, n. 1-2, p. 217-223, 2001. RIJO, P.; GASPAR-MARQUES, C.; SIMÕES, M. F.; DUARTE, A.; APREDA-ROJAS, M. C.; CANO, F. H.; RODRÍGUES, B. Neoclerodane and labdane diterpenoids from Plectranthus ornatus. Journal of Natural Products, v. 65, n. 10, p. 1387-1390, 2002. ROCHA, G. M.; ROCHA, M. E. do N. Uso popular de plantas medicinais. Saúde & Ambiente em Revista, v. 1, n. 2, p. 76-85, 2006. RODRIGUES, M. R. A. Estudo dos Óleos Essenciais Presentes em Manjerona e Orégano. Porto Alegre: 2002. 143 f. Tese (Doutorado em Química) –Programa de Pós-Graduação em Química, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. RODRIGUES, P. de A.; MORAIS, S. M. de; SOUZA, C. M. de; SILVA, A. R.; ANDRADE G. M. de; SILVA, M. G.; ALBUQUERQUE, R. L.; RAO, V. S.; SANTOS, F. A. Gastroprotective effect of barbatusin and 3-beta-hydroxy-3-deoxibarbatusin, quinonoid diterpenes isolated from Plectranthus grandis, in ethanol-induced gastric lesions in mice. Journal of Ethnopharmacology, v. 127, n. 3, p. 725-730, 2010. SALUCCI, M.; STIVALA, L. A.; MAIANI, G.; BUGIANESI, R.; VANNINI, V. Flavonoids uptake and their effect on cell cycle of human colon adenocarcinoma cells. British Journal of Cancer, v. 86, n. 10, p. 1645-1651, 2002. SÁNCHEZ DE MEDINA, F.; VERA, B.; GÁLVEZ, J.; ZARZUELO, A. Effect of quercetin on thee arly stages of hapten induced colonic inflammation in the rat. Life Sciences, v. 70, n. 26, p. 3097-3108, 2002. SANTOS, D. A.; HAMDAN, J. S. In vitro activities of four antifungal drugs against Trichophyton rubrum isolates exhibiting resistance to fluconazole. Mycoses, v. 50, n. 4, p. 286-289, 2007. SCOTT, D. W.; MILLER, W. H.; GRIFFIN, C. E. Fungal skin diseases. In: Muller and Kirk’s Small Animal Dermatology. W.B. Saunders Co., p. 336-361, 2001. SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica à luz de autores contemporâneos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 135-161, 2004.
68
SILVA, M. S.; BRANDÃO, D. O; CHAVES, T. P.; FORMIGA FILHO, A. L. N.; COSTA, E. M. M. B.; SANTOS, V. L.; MEDEIROS, A. C. D. Study bioprospecting of medicinal plant extracts of the semirarid Northeast: Contribution to the control of oral microorganisms. Evidence-based complementary and alternative medicine, 2012. SIVAKUMAR, D.; BAUTISTA-BAÑOS, S. A review on the use of essential oils for postharvest decay control and maintenance of fruit quality during storage. Crop Protection, v. 64, p. 27-37, 2014. SGARIGLIA, A. M. et al. Isolation of antibacterial components from infusion of Caesalpinia paraguariensis bark. A bio-guided phytochemical study. Food Chemistry, v. 126, n. 2, p. 395-404, 2011. SIMÕES, C. M. O.; SPITZER, V. Óleos Essenciais, Em Farmacognosia: da Planta ao Medicamento. Universidade/UFRGS/UFSC, p. 397-420, 2002. SOUZA, F. B. R.; FISCHER, G. D.; VARGAS, G. D. Efeito antimicrobiano da própolis contra agentes infecciosos de interesse veterinário. Science and animal health, v. 1, n. 1, p. 24–37, 2013. SPARKES, A. H.; ROBINSON, A.; MACKAY, A. D.; SHAU, S. E. A study of the efficacy of topical and systemic therapy for the treatment of feline Microsporum canis infection. Journal of Feline Medicine and Surgery, v. 2, p. 135-142, 2000. SUFFREDINI, I. B.; SADER, H. S.; GONCALVES, A. G.; REIS, A. O.; GALES, A. C.; VARELLA, A. D.; YOUNES, R. N. Screening of antibacterial extracts from plants native to the Brazilian Amazon Rain Forest and Atlantic Forest. Brazilian Journal Medical and Biological Research, v. 37, n. 3, p. 379-84, 2004. TAGHREED, A. A. General Resistance of Dermatophytes to Griseofulvin. BSc Pharm JRMS, v.14 n. 1, p. 76-78, 2007. TANDON, J. S., et al. Structure of coleonol, a biologically active diterpene from Coleus forskohlii. Indian Journal of Chemistry, v. 15, p. 880-883, 1977. TANG, S. Y., HALLIWELL, B. Medicinal plants and antioxidants: what do we learn from cell culture and caenorhabditis elegans studies? Biochemical and biophysical research communications, v. 394, n. 1, p. 1-5, 2010.
69
THOMPSON, R. G. PatologiaVeterinária Especial. São Paulo: Editora Manole Ltda. p. 753, 1990. TORTORA, G. J.; FANKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 10ª edição, Porto Alegre: Artmed, 2012. VÁGI, E.; RAPAVI, E.; HADOLIN, M.; VÁSÁRHELYNÉ PERÉDI, K.; BALÁZS, A.; BLÁZOVICS, A.; SIMÁNDI, B. Phenolic and tripterpenoid antioxidant from Origanum majorana L. herb and extracts obtained with different solvents. Journal of Agricultural and Food Chemistry , v. 53, n. 1, p. 17-21, 2005. VAN VUUREN, S. F. Antimicrobial activity of South African medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, v. 119, n. 3, p. 462-472, 2008. VEIGA JÚNIOR, V. F.; PINTO A. C.; MACIEL, A. M. Plantas medicinais: Cura segura? Química Nova, v. 28, n. 3, p. 519-528, 2005. WHITE, R. L.; BURGESS, D. S ; MANDURU M.; BOSSO J. A. Comparasion of three different in vitro methods of detecting synergy: Time-kill, checkerboard and E-test. Antimicrobial agents and chemotherapy v. 40, p. 1914-1918, 1996. WILLEMSE, T. Dermatologia clínica de cães e gatos. São Paulo: Editora Manole Ltda, p. 141, 1995. YAN, J. Y.; NIE, X. L.; TAO, Q. M.; ZHAN, S. Y.; ZHANG, Y. Ketoconazole Associated Hepatotoxicity: A Systematic Review and Meta- analysis. De Biomed Environ Sci, v. 26, n. 7, p. 605-610, 2013. YUNES, R. A.; CALIXTYO, J. B. Plantas Medicinais sob a ótica da moderna química medicinal. Chapecó: Editora Argos, p. 550, 2001.
