Embed Size (px)
Citation preview
Cystoisospora felis (WENYON,
1926) FRENKEL, 1977
(APICOMPLEXA: SARCOCYSTIDAE):
CARACTERIZAÇÃO, INFECÇÃO
EXPERIMENTAL E RESPOSTA
IMUNE EM CAMUNDONGOS ALBINOS
R O N A L D B A S T O S F R E I R E
I T A G U A Í , R IO DE J A N E I R O
1993
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
I N S T I T U T O DE B I O L O G I A
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA V E T E R I N Á R I A
PARASITOLOGIA V E T E R I N Á R I A
Cystoisospora felis (WENYON,1926) FRENKEL, 1977
(APICOMPLEXA: SARCOCYSTIDAE):CARACTERIZAÇÃO, INFECÇÃO
EXPERIMENTAL E RESPOSTAIMUNE EM CAMUNDONGOS ALBINOS
R O N A L D B A S T O S F R E I R E
SOB ORIENTAÇÃO DO PROFESSOR
CARLOS WILSON GOMES LOPES
Tese submetida como requisitop a r c i a l para obtenção do grau de Philosophiae Doctor emMedicina Veterinária - ParasitologiaVeterinária.
I T A G U A Í , RIO DE JANEIRO
1 9 9 3
TÍTULO DA TESE
Cystoisospora felis (WENYON, 1926) FRENKEL, 1977 (APICOMPLEXA:
SARCOCYSTIDAE): CARACTERIZAÇÃO, INFECÇÃO EXPERIMENTAL E RES-
POSTA IMUNE EM CAMUNDONGOS ALBINOS
AUTOR
RONALD BASTOS FREIRE
APROVADA EM: 12/03/1993
iii
AGRADECIMENTOS
Especialmente a DEUS, que me deu a oportunidade de
estar realizando a interpretação dos fenômenos por Ele
criados.
Ao meu orientador, Carlos Wilson Gomes Lopes por
sua amizade e confiança.
Ao Departamento de Microbiologia e Imunologia
Veterinária, Instituto de Veterinária, UFRRJ, que concedeu-
me o direito de realizar este trabalho.
minha esposa Marcia Freire, por sua compreensão,
paciência e amor.
iv
B I O G R A F I A
RONALD BASTOS FREIRE, nascido em Leopoldina, Minas
Gerais, em 21 de agosto de 1953, iniciou sua carreira
acadêmica no Instituto de Microbiologia, do Centro de
Ciências da Saúde, na Universidade Federal do Rio de Janeiro.
No ano de 1975, cursando a faculdade de Farmácia, foi
selecionado para monitor do referido Instituto, sob a
supervisão da Professora Maria Genoveva von Hubinger, com
quem desenvolveu trabalhos relativos ao isolamento e
caracterização sorológica de enterovirus isolados de crianças
do Estado do Rio de Janeiro. Graduou-se em farmácia em 1977 e
em Bioquímica em 1978, tendo sido contratado como Pesquisador
ligado ao projeto de Grandes Endemias, do Instituto de
Microbiologia - CCS - UFRJ, onde estabeleceu, juntamente com
o Profesor João Ciribelli Guimarães, o laboratório de
Quimioterapia Antiviral. Em Janeiro de 1977 participou do
CURSO DE APERFEIÇOAMENTO E REVISÃO DE MÉTODOS EM
MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA. Prestou concurso público de
seleção para o Mestrado em Ciências Biológicas
(Microbiologia) e foi selecionado na primeira colocação.
Desenvolveu Tese de Mestrado intitulada Ação dos derivados do
imizadol sobre Trypanosoma cruzi, defendia e aprovava, com
grau máximo, em agosto de 1981. Neste mesmo ano foi convidado
V
a chefiar o laboratório de Microbiologia e Imunologia do
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde-
FIOCRUZ, onde permaneceu até 1983, quando, a convite do
Professor Hugo Rezende, foi contratado como professor
visitante para ministrar a disciplina Imunoparasitologia no
Curso de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Parasitologia
Veterinária) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
Neste mesmo ano, ingressou na área de Microbiologia do
Departamento da Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, como
Professor de Imunologia, na categoria de visitante. Prestou
Concurso Público para o Magistério Superior em 1984, tendo
sido selecionado em primeira colocação, na categoria de
Professor Assistente.
Atualmente é Professor Adjunto do Departamento de
Microbiologia e Imunologia Veterinária, do Instituto de
Veterinária da UFRRJ.
casado com Márcia de Fátima Inácio Freire e tem
dois filhos, Sulamita Inácio Freire e Aaron Inácio Freire.
vi
R E S U M O
Neste trabalho, caracterizou-se morfologicamente
oocistos, esporocistos, esporozoítas e Hipnozoítas de
cystoisospora felis, os quais foram obtidos e purificados de
acordo com metodologias particularmente desenvolvidas para
cada caso. O número de oocistos eliminados nas fezes de gatos
neonatos, recém desmamados e infectados experimentalmente com
vísceras contendo Hipnozoítas de C. felis, assim como sua
capacidade de esporulação à temperatura ambiente, foram
avaliados. Infectou-se experimentalmente, 374 camundongos
albinos com 106 oocistos esporulados de C. felis e comprovou-
se o impacto do parasitismo sobre o desenvolvimento ponderal
destes hospedeiros intermediários. O peso relativo das
vísceras dos animais infectados, comparativamente no que se
observou nos animais controles, foi bastante afetado. Da
mesma forma, a existência de formas císticas extra-
intestinais foi pesquisada. A distribuição de hipnozoítas por
órgão infectado foi estimada em função do número total de
hipnozoítas recuperados pot animal. Os hipnozoítas
apresentaram tropismo especial por linfonodos merentéricos,
baço e fígado. A maior quantidade de hipnozoítas visualizados
minoscopia ótica, ocorreu no 9º dia após a infecção.
vii
A influência do parasitismo sobre os processos de
fagocitose, foi avaliada e comprovou serem os fagócitos
importantes para a disseminação de formas extra-intestinais
de Cystoisospora felis. O título de anticorpos circulantes,
no camundongo e em gatos, foi avaliado através de
hemaglutinação indireta, sugerindo uma associação entre os
níveis séricos de anticorpos e o desenvolvimento do ciclo
biológico extra-intestinal. Os resultados obtidos comprovam
ser o camundongo hospedeiro intermediário para Cystoisospora
felis.
viii
S U M M A R Y
In the present work, oocysts, sporocysts,
sporozoites and Hipnozoites of Cystoisospora felis were
morphologically characterized. THese forms Had been obtained
and purified according to methodologies particulary developed
in each case. THe oocysts number, eliminated in the feces of
experimentally infected kittens feeded on visceras containing
hipnozoites of C. felis, as well as its capability of
sporulation at room temperature, was evaluated. 374 albino
mice were infected with 106 sporulated oocysts of C. felis,
demonstrating the impact of the parasitism on the ponderal
development of this intermediary Host. THe relative body
weigh of the infected animals, comparatively to the control
one, was drastically affected. By the same way, the presence
of extra-intestinal forms was quantified. The hipnozoite
spreading trough each organ was estimated on the basis of the
total of hipnozoites recovered in each animal. Hipnozoites
have a epecial predilection for mesenteric lynphonodes,
spleen and liver. "The major Hipnozoitas counts occurred on
the 9 th day post infection. THe parasitism influence on
phagocytosis was studied, and the importance of phagocytes to
C. felis Hipnozoites spreading trough the Host's body was
determined. Circulating antibodies detected by indirect
haemagglutination suggested an association between antibodies
IX
between antibodies and the extra-intestinal life cicle of the
parasite. These data reinforce that mice are intermediary
hosts to Cystoisospora felis.
1- INTRODUÇÃO
O gênero Cystoisospora (Schneider, 1881) Frenkel,
1977 apresenta as espécies C. felis (Wenyon, 1926) Frenkel,
1977 e C. rivolta (Grassi, 1879) Frenkel, 1977 como coccidias
da família Sarcocystidae Poche, 1913, que tem o gato como
hospedeiro definitivo.
Este gênero é assim definido, porque em seu ciclo
biológico formam-se cistos monozóicos, extra-intestinalmente,
tanto no hospedeiro definitivo como no intermediário, o que
não ocorre com os membros do gênero Isospora Schneider, 1881.
Além disto, observam.se diferenças estruturais na parede de
seus esporocistos (fraturas), típicas dos Sarcocystidae, as
quais justificam plenamente esta denominação.
Nos hospedeiros definitivos, assim como nos
intermediários, o ciclo extra-intestinal ocorre após ingestão
de oocistos esporulados, que liberam for mas infectantes
(esporozoítas) que evoluem para hipnozoítas, os quais
distribuem-se por diferentes órgãos do hospedeiro infectado.
Embora o ciclo biológico destes coccídios seja bem
conhecido, poucos trabalhos foram realizados com o intuito de
estudar seu comportamento, distribuição, epidemiologia,
infectividade, ou mesmo a patologia decorrente de sua ação
parasitária. Isto deve-se ao fato de que apenas recentemente
comprovou-se a existência de um estado patogênico, decorrente
da infecção por estes organismos. Outro aspecto relevante,
a dificuldade para se obter oocistos purificados de C. felis
ou de C. rivolta. Na maioria das vezes, ambas as espécies são
eliminadas nas fezes do hospedeiro definitivo.
Do mesmo modo, os conhecimentos sobre imunologia
destes coccídios são bastante restritos, fundamentando-se,
quase que exclusivamente, em dados obtidos para outros
gêner os, tais como: Eimeria Schneider, 1875, Sarcocystis
Lankester, 1882, ou Toxoplasma Nicole & Manceaux, 1909.
Os hospedeiros intermediários conhecidos até o
momento são: ratos, camundongos, hamsters, cães, bovinos e o
próprio gato. Em todas estas espécies encontrou-se a formação
de cistos monozóicos (contendo um hipnozoíta), localizados
extra-intestinalmente.
Embora vários trabalhos tenham sido realizados com
o intuito de caracterizar morfologicamente os estágios
extras-intestinais, as infecções experimentais são, na
maioria das vezes, confirmadas à partir de ensaios biológicos
indiretos.
Nestes ensaios, gatos livres" (que não estão
eliminando oocistos) são alimentados com hospedeiros mortos
ou com suas vísceras e que são considerados positivos, desde
que os gatos "livres" passem a eliminar oocistos em suas
fezes.
A resposta ilnunológica de animais infectados por
protozoários do gênero Cystoisospora, foi inicialmente
descrita por ANDREWS (1996). Segundo este autor, a
resistência à re-infecção deve estar relacionada com o mesmo
mecanismo envolvido na resistência a espécies do gênero
Eimeria. Apesar disto, comparações cuidadosas sobre a
imunidade relativa em diferentes espécies de animais,
passíveis de serem infectados, ainda não foram realizadas.
Embora saiba-se que C. ohioensis (Dubey, 1975)
Frenkel, 1977, do cão, seja bastante imunogênica, os dados de
imunidade relativos à reinfecção por C. Felis são bastante
incongruentes. Além disto, deve-se ressaltar o fato de que os
estudos da imunidade a parasita s do gênero Cystoisospora
foram realizados, em sua totalidade, com gatos e nunca com
qualquer dos possíveis hospedeiros intermediários.
Este trabalho é decorrente de uma linha de
investigação científica e visa, principalemente, elucidar
fenômenos importantes relacionados às formas extra-
intestinais de C. felis.
Os aprofundamentos destas avaliações são
contribuições para o conhecimento a evolução do parasitismo
no organismo do hospedeiro, assim como para a caracterização
de estágios de desenvolvimento de C. felis e de sua relação
com a resposta imune, que ocorre durante as infecções.
2- PARTE I. CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA, ISOLAMENTO,
OUANTIFICAÇÃO E VIABILIDADE DE ZOÍTAS DE
Cystoisospora felis
2. 1. REVISÃO DE LITERATURA
2. 1. 1. Posição taxonômica
O gênero Isospora Schneider, 1881 pertence
família Eimeriidae Ninchin, 1903. Este gênero é constituído
de, aproximadamente, 200 espécies de parasitas homoxenos, com
oocistos gue têm em seu interior, dois esporocistos
tetrazóicos. Os seus hospedeiros são animais vertebrados. Até
o presente, não se demonstrou a multiplicação assexual em
hospedeiros gue não os definitivos. A merogonia é endógena e
a esporogonia ocorre fora do hospedeiro (LONG, 1982).
Embora considere-se que os isosporídeos sejam
bastante semelhantes aos parasitos do gênero Eimeria
Schneider, 1875, várias espécies, como Isospora canis
Nemeseri, 1923, Isospora bigemina (Stiles, 1891) Lüke 1906 e
Isospora arctopitheci Rodhain, 1933, não apresentam
esporocistos com corpo de "Stieda", sugerindo um processo
distinto de excitação (SPEER et al., 1976).
Alguns isosporídeos apresentam um ciclo extra-
intestinal que, a exemplo do que ocorre com os gêneros de
coccidias pertencentes à família Sarcocystidae Poche, 1913,
origina cistos viscerais. Estudos de formas invasivas do
gênero Isospora, em canários, demonstraram que estas, ao
contrário de outros isosporídeos, apresentavam uma eliminação
crônica de oocistos esm a autolimitação infecciosa, clássica
para os membros da família Eimeridae. Morologicamente, estas
formas cistogênicas geram oocistos, esporocistos e
esporozoítas diferentes daqueles que não produzem cistos
(BOX, 1981).
Ao longo dos últimos vinte anos, vários autores
dedicaram-se ao estudo de isosporídeos capazes de originar,
no hospedeiro definitivo, cistos extra-intestinais. Tais
estudos culminaram com a determinação, em alguns gêneros, de
um ciclo biológico alternativo, onde o parasita é capaz de
infectar outras espécies de animais domésticos, diferentes do
hospedeiro definitivo, também gerando formas císticas extra-
intestinais (DUBEY & FRENKEL, 1972; FRENKEL & DUBEY, 1972;
DUBEY, 1979; FAYER & FRENKEL, 1979; FAYER, 1980; BROSIGKE,
1981 e BROSIGKE et al., 1982).
Embora os membros da família Sarcocystidae Poche,
1913 tenham sido originalmente classificados de acordo com os
tipos de cistos extra-intestinais que formam, seus oocistos
assemelham-se aos dos isosporídeos. Assim, sugeriu-se
nova classificação taxinômica para os isosporídeos
cistogênicos: aqueles eliminados sob a forma de oocistos não
esporulados e capazes de originar cistos em hospedeiros
intermediários, seriam denominados de Isospora; os que são
eliminados sob a forma de oocistos esporulados, à partir dos
hospedeiros definitivos (Sarcocystis e Frenkelia, Biocca,
1968) receberiam a denominação de Endorimospora (Tadros &
Laarman, 1976). De maneira mais consistente, DUBEY (1977),
assim como FRENKEL. (1977), propuzeram a criação de um novo
gênero para a família Sarcocystidae, ao qual denominaram de
Levineia e Cystoisospora, respectivamente. Neste caso, deve-
se considerar que o hospedeiro definitivo é passível de
infecção e que os hospedeiros intermediários são infectados
facultativamente. Além disto, deve-se ter em conta que em
ambos os casos originam-se formas císticas extra-intestinais
(FAYER, 1980).
LONG (1982), afirmou que o gênero Cystoisospora
pode ser considerado sinônimo de Isospora, porque a
existência de formas extra-intestinais foi demonstrada para
todos os isosporídeos para os quais se buscou esta
característica. De outro modo, SMITH (1981), considerando a
existência de hospedeiros intermediários, sugeriu que o
gênero Cystoisospora fosse colocado na subfamília
Cystoisosporinae Smith, 1981, pertencente à família
Sarcocystidae.
2. 1. 2. Produção e caracterização de oocistos
O gato (Felis catus domesticus) tem sido
considerado como hospedeiro definitivo dos gêneros Besnoitia
Henry, 1913, Hammondia Frenkel, 1974, Toxoplasma, Sarcocystis
e Cystoisospora (BROSIGKE, 1981; BROSIGKE et al., 1982).
Estes protozoários parasitos são eliminados por gatos
adultos, assintomáticamente. Gatos jovens ou gestantes, sob
condições de esgotamento (estresse), podem eliminar oocistos
não esporulados e reinfectarem-se com freqüência (LOSS, 1991).
Os membros da subfamília Cystoisosporinae passíveis
de parasitar felinos são C. felis e C. rivolta. Estes
parasitas, em seu ciclo alternativo, podem infectar uma
grande variedade de hospedeiro intermediários (FRENKEL,
1977). Os hospedeiros intermediários conhecidos até o
presente são: camundongos, ratos, hamsters, cães e bovinos
(BROSIGKE, 1981). Em todos estes, assim como no gato,
encontra-se a formação de cistos monozóicos, denominados de
hipnozoítas, localizados extra-intestinalmente (DUBEY, 1979).
A cistoisosporose clínica manifesta-se
preferencialmente como resultado do confinamento dos
hospedeiros sensíveis. A manutenção do ciclo biológico, com
eliminação de oocistos pelos hospedeiros definitivos, depende
também de outros fatores, tais como: capacidade de reprodução
do parasita, resistência desenvolvida pelo hospedeiro,
competição com outros organismos pelo mesmo nicho ecológico,
estado nutricional do hospedeiro, diferenças genéticas entre
as cepas de microorganismos, estado de esgotamento do
hospedeiro, ação e uso de drogas (FAYER, 1980; LOSS, 1991).
A identificação das espécies de Cystoisospora e de
outros coccídios ainda é baseada na morfolometria de seus
oocistos. Por existirem variações intraespecíficas nas
infecções oriundas de grande número de parasitas, é freqüente
presença de formas bizarras e inviáveis (COUDERT el al.,
1979; LONG, 1982; BOMFIM, 1989; LOSS, 1991).
Oocistos de C. felis e de C. rivolta, eliminados à
partir de infecções mistas, podem apresentar índices
morfométricos próximos (LOSS, 1991). Poucos autores descrevem
metodologia para obtenção de formas isoladas de C. felis ou
de C. rivolta; quando o fazem, lançam mão de métodos de
centrifugação diferencial, os quais sabidamente alteram
características morfológicas e biológicas de boa parte da
população parasitária (COUDERT, et al., 1979).
Uma vez que a maioria dos ensaios experimentais
visando o estudo de infecções por Cystoisospora retratam o
efeito de populações mistas, são necessários estudos mais
aprofundados sobre o comportamento de cada uma das espécies
deste gênero, para que se possa, com segurança, esclarecer
aspectos ainda não definidos, no presente, sobre sua biologia
e relação parasito-hospedeiro (LONG, 1982).
2. 1. 3. Formas extra-intestinais: Caracterização
m o r f o l ó g i c a
A digestão enzimática tem sido amplamente utilizada
para a detecção de zoítas (MARKUS, 1976 e 1978; FRENKEL,
1977; DUBEY, 1979).
Dentre as enzimas, a tripsina tem sido a mais
utilizada. Esta enzima elimina as associações celulares,
destruindo as células parenquimatosas e, conseqüentemente,
liberando formas infectantes dos cistos e intracelulares
(DUBEY & FRENKEL., 1972; FRENKEL & DYBEY, 1972; BROSIGKE,
1981; BROSIGKE et al., 1982). Este procedimento tem sido
também utilizado para, a obtenção e estudos de formas
intrateciduais de várias coccídas do gênero Cystoisospora.
Os hipnozoítas de C. canis, C. burrowsi, C.
laidani, C. felis e C. rivolta foram avaliados, tanto
qualitativa quanto quantitativamente, após obtenção à partir
de digestões trípticas de vísceras contaminadas (HEINE, 1981;
BROSIGKE, 1981; BROSIGKE et al., 1982).
A ausência de patogenicidade para os hospedeiros
intermediários (FAYER & FRENKEL, 1979; FAYER, 1980; BROSIGKE,
1981), pode ser decorrente de uma ação lesiva do processo de
digestão enzimática sobre as formas parasitárias.
SHARMA & DUBEY (1981), desenvolveram estudo
quantitativo relativo à sobrevivência de bradizoítas e de
taquizoítas de T. gondii, após incubação em tripsina ou
pepsina. Embora nenhuma redução da infectividade tenha sido
detectada entre bradizoítas tratados com pepsina aqueles
submetidos ao tratamento com solução de tripsina (120 minutos
a 37ºC) tiveram uma redução de cerca de cem vezes em sua
infectividade. O mesmo se deu com os taquizoítas que, sob a
ação da tripsina, tiveram uma redução de 105 em seu título
in feccioso. Isto indica uma ação degradativa da tripsina
sobre a super fíc ie parasitária, ocasionando alterações
indesejáveis em seu comportamento em relação ao hospedeiro.
Não existe na literatura qualquer citação sobre a ação de
tripsina ou pepsina sobre os protozozários do gênero
Cystoisospora. Uma vez que todos os experimentos sobre
biologia destes parasitos são baseados em digestões
trípticas, muitos dados possivelmente não foram obtidos em
função de efeitos deletérios do processo de digestão
enzimática utilizado na obtenção e isolamento das formas
e x t r a - i n t e s t i n a i s .
Estudos realizados com hipnozoítas de C. rivolta
obtidos através de digestão tríptica, levaram à presença de
formas monozóicas com ou sem envoltório (vacúolo
parasitóforo). Neste estudo, as formas envoltas pela membrana
parasitófora tiveram dimensões maiores que aquelas
desprovidas de tal organela (BROSIGKE, 1981). Aos sete dias
após a inoculação, as formas recuperadas, desprovidas de
envoltórios, mediram 15,4 a 17,4 x 3,0 a 4,6 µm, enquanto que
os hipnozoítas providos desta organela mediram 21,7 a 25,0 x
11
9,3 a 10,0 um, dos quais 10% do tamanho seriam relativos ao
envoltório ao 28 ° dia da infecção, chegando a 50-70% no 84º
dia da infecção. Assim sendo, o aumento relativo das
dimensões (comprimento e largura) dos hipnozoítas, foi
proporcional ao tempo de infecção e à reserva endógena
existente nestas formas de resistência.
De acordo com estudos realizados ao microscópio
eletrônico de transmissão, à partir de preparados a fresco de
vísceras contaminadas, os hipnozoítas de Cystoisospora estão
sempre providos de vacúolo parasitóforo (MEHLHORN & MARKUS,
1976, DUBEY & MEHLHORN, 1978).
As diferentes apreciações sobre as dimensões, assim
como aguelas relalivas à presença ou ausência de vacúolo
parasitóforo (FRENKEL & DUBEY, 1972; DUBEY, 1979 e BROSIGKE,
1981), parecem estar relacionadas às diferentes metodologias
utilizadas na obtenção de hipnozoítas e não a um estágio
parasitário especificamente distinto.
12
2 . 2 . MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. Oocistos
a. Obtenção de oocistos de Cystoisospora
felis
Oocistos de Cystoysosopora felis foram obtidos à
partir de fezes eliminadas por cinco gatos (duas fêmeas e
três machos) de 6 semanas de idade, oriundos da Zona Oeste da
Cidade do Rio de Janeiro. Os gatos foram previamente
vermifugados1 e mantidos em gaiolas individuais. Sua
alimentação consistiu de ração comercial2 e camundongos
infectados experimentalmente com Cystoisospora felis. Folhas
de papel jornal foram colocadas no piso de cada gaiola e
trocadas diariamente, entre 14 e 15 horas. Estas folhas eram
umidecidas com água destilada, afim de evitar o ressecamento
das fezes eliminadas durante a noite. As fezes eram coletadas
o mais rapidamente possível, na manhã seguinte, uma vez que a
eliminação de oocistos é maior entre 15 e 22 horas. O
material fecal coletado era pesado e, aproximadamente duas
partes (P/V) de PBS 0, 15 M (8 gl-1 NaCl; 0,2 gl-1 KCl; 1,15
gl-1 Na2HPO4; 0,2 gl-1 KH2PO4 - pH 7,2) era adicionada em uma
parte de fezes, em frascos limpos, sob aeração.
1 DRONTAL, Bayer, São Paulo, Brasil 2 GATSY, Purina, São Paulo, Brasil
13
Em alguns experimentos, utilizou-se solução de
bicromato de potássio a 2,5% em PBS (P/V) ou solução de
hipoclorito de sódio a 1% (V/V) para conservarção do material
fecal. A aeração da suspensão foi realizada à temperatura
ambiente, através de borbulhamento de ar, proveniente de uma
bomba de aquário convencional3.
Após três dias à temperatura ambiente e sob
aeração, uma gota da suspensão era retirada e examinada ao
microscópio, entre lâmina e lamínula, para se estabelecer a
presença de oocistos de Cystoisospora felis, assim como o
índice de esporulação (IOE).
n º de oocistos esporulados IOE = . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . X 100
total de oocistos
Sempre que o IOE atingia valor superior a 80%, a
suspensão fecal era diluída (volume a volume) com PBS e
centrifugada a 300 x g durante 10 minutos. Os oocistos eram
recuperados, à partir do sedimento, pela flutuação em solução
saturada de açúcar (SPEER, 1983).
A pr esença de oocistos de outros gêneros, ou
espécies que não Cystoisospora felis, determinaram a
eliminação do material e a exclusão do felino doador, em
rodas as oportunidades em que se observou tal fato.
3 BOMBA ElE AQUÁRIO ALPHA II, Vigo Ar, São Paulo. Brasil
14
Os oocistos esporulados eram concentrados através
de ressuspensão em solução saturada de açúcar (sacarose),
seguida de nova centrifugação (200 x g/20 minutos/4ºC). O
sobrenadante obtido era vertido para uma placa de Petry com
25 cm de diâmetro, sobre a qual se depositava uma das partes
de uma placa de Petry de material plástico, descartável, de
modo a criar-se uma interface entre o fundo da placa
descartável e a superfície da solução saturada de sacarose,
onde os oocistos estariam flutuando. Em intervalos de 60
minutos, durante quatro horas, removia-se a placa superior,
para que o fundo da mesma fosse "lavado" com jatos de PBS
gelado (4-10ºC). O PBS era jorrado através de seringa de 10
ml acoplada a uma agulha hipodérmica. A suspensão de oocistos
esporulados obtidos à partir do fundo da placa descartável,
era colocada em um recipiente previamente resfriado em banho
de gelo. Estes oocistos eram submetidos a nova centrifugação,
seguida de ressuspensão em PBS por duas vezes consecutivas,
afim de se eliminar o excesso de sacarose. O sedimento final,
contendo elevada concentração de oocistos, era ressuspendido
em pequeno volume de PBS.
b. Quantificação
Uma alíquota de suspensão de oocistos purificados
era diluída a 1:10 ou 1:20 e colocada em câmara de contagem
15
(Neubauer). Os oocistos quantificados na área reticulada
externa, onde se quantificam leucócitos, correspondia ao
número presente em 0,1 mm 3 do material diluído. Desta f o r m a ,
o número de oocis tos em cada suspensão era obtido pela
multiplicação de dez vezes o número médio de parasitas
contados nos quatro quadrantes (x), a diluição (d) e o volume
final da suspensão (v): n° de oocistos = 10 .x.d.v.
c. Morfometria
Foram realizadas duzentas mensurações em ocular
micrométrica4 e aumento de 400x, nas quais os diâmetros
equatorial e polar foram calculados em micrômetros. O índice
morfométrico, obtido pela divisão do maior diâmetro pelo
diâmetro menor, era calculado, tanto para os oocistos
esporulados quanto para os esporocistos contidos nos dos
oocistos.
4PZO - Polônia
16
2. 2. 2. Esporozoítas
a. Obtenção de esporozoítas de Cystoisospora
f e l i s
Iniialmente, procedeu-se à esterilização dos
oocistos, através da adição de Hipoclorito de sódio (NaCIO) à
suspensão de oocistos, de modo a obter-se uma concentração
final de 5,5%. A suspensão obtida era mantida à temperatura
ambiente (aproximadamente 2.5°C) durante trinta minutos.
Os esporocistos eram liberados através da adição de
PBS, seguida de centrifugações5 (600xg/4ºC/20min.) por quatro
vezes consecutivas e maceração da suspensão final em
Homogeneizador Potter6 durante dez minutos (oito acoplamentos
por minuto). A liberação significativa de esporozoítas era
conseguida pela exposição dos esporocistos, durante 120
minutos, a uma solução de excistação (tripsina a 0,5%,
adicionada de bile bovina a 10% em PBS pH 7,2), na
temperatura de 37°C (Banho-Maria7).
O processo de liberação de esporozoítas era
acompanhado microscopicamente, sendo interrompido com adição
de igual volume de PBS gelado (4°C), seguida de centrifugação
por três vezes consecutivas. O sedimento final era
5 BECKMAN, modelo J2-21 E. U. A. 6 WARREN BLENDER tissue grinder, E. U. A. 7 Fanem Ltda, São Paulo, Brasil
17
ressuspendido em 0,5 ml de PBS. Este procedimento de
excistação de esporozoítas era interrompido quando se obtinha
cerca de 80% de esporozoítas livres.
b. Quintificação
O número de esporozoítas por mililitro de suspensão
foi estimado em hemocitômetro, como descrito anteriormente
(TURNER & BOX, 1970; CAWTHORN et al., 1986).
c. Morfometria
As medidas morfométricas eram realizadas, em todos
os casos, utilizando-se uma ocular micrométrica a uma
magnitude de 400 x. Eram realizadas 100 medidas, onde os
diâmetros polar e equatorial foram calculados em micrômetros.
18
2. 2. 3. Hipnozoítas
a. Obtenção de hipnozoítas de Cystoisospora
felis
Os hipnozoítas de Cystoysospora felis eram obtidos
de acordo com a metodologia descrita por SHARMA & DUBEY
(1981).
Camundongos, pesando 20 a 25 gramas, eram
inoculados oralmente com 105 a 107 oocistos esporulados de
Cystosoispora felis obtidos à partir de fezes de gatos e
concentrados através de flutuação em sacarose.
Os animais infectados foram sacrificados nos dias
1°, 3º, 6°, 7°, 9º, 12º, 24º e 31° após a infecção (DPI).
Os hipnozoítas eram obtidos através de digestão
péptica do baço, fígado, rins, pulmões, linfonodos
mesentéricos e placas de Peyer.
pequenos fragmentos e acondicionadas em ehlenmeyers
estéreis, previamente resfriados em banho de gelo, nos quais
adicionava-se solução enzimática (5,2 mg.ml-1 de Pepsina8,
As vísceras eram cuidadosamente cortadas em
com atividade de ensaio de 1:10000; 10 mg.ml-1 de NaCl e HCl
a 1,4% em água destilada). Os homogeneizados resultantes eram
incubados a 37ºC (Banho-Maria) durante 60 minutos.
8 PEPSINA - SIGMA, St. Louis, E. U. A.
1 9
Os hipnozoítas eram obtidos pela filtração do
material digerido, previamente neutralizado pela adição de
PBS a 4°C, seguida de filtrações sequenciais (três), em gaze
dupla e através de lã de "nylon"9, com o intuito de se
retirar os restos celulares aderidos aos protozoários. Os
eluatos eram concentrados por centrifugação (600 x g/4°C/20
minutos) e ressuspendidos em PBS (05 a 1,0 ml).
b. Quantificação
O número de hipnozoítas por órgão infectado foi
estabelecido de acordo com a metodologia descrita por
BROSIGKE (1981) para Cystoysospora rivolta, com ligeiras
m o d i f i c a ç õ e s .
Alíquotas de 10 microlitros de suspensão de
hipnozoítas eram colocadas entre lâmina e lamínula e
observadas em microscópio de contraste de fase10. O número de
hipnozoítas era obtido pela seguinte fórmula:
H = n. 100. v
9 L.Ã ACRYLON, Santista, São Paulo, Brasil 10 JENAVAL, Zeiss-jena, República Democrática Alemã
20
Onde n é o número de. hipnozoítas contidos na
alíquota de 10 microlitros, 100 é a correção para 1000
microlitros e v o volume total da amostra do órgão digerido.
c. Morfometria
Realizada em ocular mocrométrica PZO, como descrito
anteriormente para oocistos e esporozoítas.
Para facilitar as mensurações, fixou-se as formas
hipnozoíticas em solução a 25%, de glutaraldeído11 (FGT).
Através deste procedimento, impediu-se a movimentação e
manteve-se a forma original dos estágios intrateciduais de
d. Testes de viabilidade
A determinação da viabilidade das preparações
obtidas foi realizada através de metodologia descrita por
GEYSEN et al. (1991) para Eimeria tenella, com ligeiras
m o d i f i c a ç õ e s .
Os hipnozoítas viáveis eram facilmente visualizados
através da simples mistura de igual volume de solução de
11 GLUTARALDEÍDO - SIGMA, St. Louis, E. U. A.
21
acridina orange12 e de suspensão parasitária, que após 5
minutos de incubação à temperatura ambiente conferia às
células parasitárias uma fluorescência amarelo-esverdeada,
quando vivas.
O percentual de células viáveis era calculado
através de quantificação visual, em microscópio de
imuno fluorescência, de uma série de campos óticos (50),
representando, no mínimo, 200 células avaliadas.
12 ACRIDINA ORANGE, Riedel, Hannover, Republica Federal Alemã
22
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
2. 3. 1. Eliminação de oocistos
O número de oocistos eliminados pelos cinco felinos
neonatos (duas fêmeas e três machos), com 35 dias de idade,
mantidos em cativeiro, foi de 1,37 x 109.
As eliminações de oocistos quando detectados logo
após no desmame, em todos os casos observados, sempre
iniciou-se pela eliminação exclusiva de oocistos de
Cystoisospora felis.
LOSS (1991), estudando a eliminação de oocistos de
espécies de Cystoisospora à partir de gatos neonatos,
confinados 60 dias após ao desmame, verificou que as
dimensões dos oocistos de Cystoisospora felis e Cystoisospora
rivolta foram distintas, em função de infecções naturais,
ingestão tie vísceras contaminadas ou infecções experimentais
através da ingestão de oocistos. Além disto, os índices
morfométricos (diâmetro polar/diâmetro equatorial) foram
diferentes à razão do tipo de infecção nas duas espécies de
Cystoisospora estudadas.
A infecção experimental dos felinos, utilizando
vísceras de camundongos contendo hipnozoítas de Cystoisospora
felis, foi realizada em três etapas nos dias do confinamento
e aos 11 e 21 dias após aprisionamento dos animais.
23
Após o primeiro inóculo, a eliminação média passou
de 6,2 x 103 (± 1,2 x 103) para 1,4 x 108 (± 0,59 x 108) em
quatro dias. À partir deste ponto, a quantidade de oocistos
nas fezes decaiu progressivamente até ao 11º DPI, quando a
média de oocistos por grama de fezes foi de 1,6 x 105. O
segundo inóculo, mais uma vez foi acompanhado de aumento da
eliminação de oocistos, que passam a um valor médio de 1,4 x
108 em um período bem mais curto (dois dias) (Figura 1).
O número médio de oocistos eliminados por grama de
fezes manteve-se em declínio até ao 21 ° DPI (3,3 x 104).
Neste dia realizou-se uma terceira inoculação que,
entretanto, não foi suficiente para ampliar o número de
oocistos eliminados, que se mantesse estabilizado até ao 27°
DPI (1,1 x 103). Coincidentemente, neste período começaram
aparecer oocistos típicos de Cystoisospora rivolta,
misturados aos de Cystoisospora felis.
O crescente aumento de oocistos de Cystoisospora
felis na ausência de outros coccídios e, especialmente de
Cystoisospora rivolta, após administração de vísceras
contendo hipnozoítas de Cystoisospora felis, pode ser
indicativo de um ciclo biológico que, diferentemente dos
membros da família Eimeriidae, não parece ser auto-limitante
(BOX. 1981).
24
FIGURA 1: Eliminação de oocistos de Cystoisospora felis, porde gatos confinados durante 35 dias após onascimento e então inoculados com vísceras decamundongos, contendo hipnozoítas.
25
A ausência de aumento do número de oocistos
eliminados que ocorreu à partir do terceiro inóculo, é
indicativo de que pode ter havido uma reação imunológica,
capaz de interferir no ciclo biológico sexuado deste coccidia
(FAYER, 1980 e SPEER, 1983).
O aparecimento de oocistos de Cystoisospora
rivolta, que coincidiu com a não elevação do número de
oocistos de Cystoisospora felis nas fezes, sugere, a exemplo
de outros coccidias, uma competição natural pela mesma área
de infecção (FAYER, 1980).
Deve-se ainda ressaltar o fato de que os gatos já
estavam naturalmente infectados com Cystoisospora felis,
imediatamente após ao desmame (aos trinta e cinco dias de
nascidos), sem a ocorrência de outros oocistos de espécies ou
gêneros diferentes.
2. 3. 2. Morfometria
a. Oocistos
Os oocistos de Cystoisospora felis, obtidos de
gatos 35 dias após o nascimento, apresentaram-se com
morfologia piriforme característica, dentro das seguintes
dimensões: 36,12 ± 3,00 x 25,59 ± 2,5 µm, com índice
morfométrico de 1,33 ± 0,58 (Tabela 1).
26
TABELA 1: Médias, desvios-padrão das dimensões de oocistos, esporocistos, esporozoítas, hipnozoítas e dosrespectivos índices morfométricos de Cystoisospora felis.
27
LOSS (1991) encontrou as dimensões de 33,43 ± 1,58
a 41,55 ± 2,19 x 26,72 ± 1,3 a 33,2 ± 1,75 um para oocistos
de Cystoisospora felis obtidos 60 dias após o nascimento,
oriundos de diferentes formas de infecção.
As diferenças nas dimensões destes oocistos podem
estar restritas ao perúodo em que foram realizadas as
respectivas colheitas dos mesmos.
Quando submetidos à aeração, os oocistos de
Cystoisospora felis esporularam na seguinte proporção: 40%
nas primeiras 24 horas; 60-65% após 48 horas e 80-87% após 72
horas à temperatura ambiente.
Quatro dos cincos felinos utilizados apresentou
sintomatologia semelhante à descrita por LOSS (1991),
ocorrendo a morte de dois destes animais no 28° e 30º DPI,
respectivamente.
b. Esporocistos
Os esporocistos, contidos no interior dos oocistos,
apresentaram uma morfologia elipsóide. As suas dimensões
foram de 19,37 ± 2,2 x 17,39 ± 2,1 µm, com um índice
morfométrico de 1,16 ± 0,54 µm (Tabela 1).
28
c. Esporozoítas
Os esporozoítas, obtidos através de excistação
artificial (in vitro) tiveram morfologia característica
(forma de banana) com dimensões de 17,46 ± 2,0 x 3,69 ± 0,96
um. O índice morfométrico calculado foi de 4,73 (Tabela 1).
d. Hipnozoítas
Os hipnozoítas (Figura 2), também elipsóides, em
forma de banana, obtidos à partir de digestões enzimáticas de
vísceras de camundongos, infectados oralmente, foram medidos
nos dias 7, 9, 10 e 21 após a infecção. A média das medidas
realizadas nos diferentes DPI foi de 24,03 ± 2,4 x 9,09 ± 1,5
nanômetros, com um índice morfométrico de 2,64 (Tabela 2).
Suas dimensões naqueles dias foram de 12,62 a 16,42
x 4,52 a 6,98 µm aos sete DPI; 16 a 20,3 x 5,49 a 8,09 µm aos
nove DPI; 24,42 a 29,62 µm x 9,56 a 12,96 µm aos dez DPI e
32,81 a 38,79 µm x 10,59 a 14,11 µm aos 21 DPI (Tabela 2).
Comparando-se as dimensões dos hipnozoítas ao longo
do período de infecção, pode-se facilmente perceber que houve
um aumento em suas medidas, proporcionalmente ao tempo, na
ausência de outros agentes capazes de competir pelo mesmo
nicho ecológico, tal como descrito por FAYER (1980) e
BROSIGKE (1981).
29
FIGURA 2: Hipnozoítas de Cystoisospora felis. Formas longa(A) e larga (B). F.G.T. 1250x.
30
TABELA 2: Médias e desvios padrão das dimensões e índice mrfométrico hipnozoítas de Cystoisospora felisem linfonodos mesentércos de camundongos, subutidos à digestão péptica, em diferentesintervalos de tempo à partir de infecção experimental com 104 oocistos por via oral. Medidas emum.
31
Estes resultados indicam haver, à semelhança do que
o ocorre com os oocistos, variações nas dimensões dos
hipnozoítas de Cystoisospora felis. Em consequência, tais
características morfométricas não parecem ser suficientes
para caracterizar a espécie de Cystoisospora isolada nesta
pesquisa.
As dimensões reportadas por BROSISKE (1981) para
hipnozoítas de Cystoisospora rivolta, obtidos através de
digestão triptica de linfonodos mesentéricos de camundongos
albinos experimentalmente infectados foram de 15,5 a 17,4 x
3,0 a 4,6 um aos 7 DPI, para estruturas desprovidas de
vacúolo parasitóforo e 21,7 a 25,0 x 9,3 a 10,0 um para
aquelas que apresentavam aquela estrutura. À partir do 28°
DPI esta autora encontrou dimensões de 24,8 a 28,0 x 11,6 a
12,4 µm, com um índice morfométrico de 1,46.
e. Viabilidade
Os hipnozoítas, assim como os esporozoítas tinham
grande motilidade ao microscópio ótico comum.
A viabilidade, quintificada pela absorção de
acridina orange a 0,1% em PBS, com emissão de fluorescência
verde-amarelada, indicam que em ambos os casos houve
viabilidade, que oscilou entre 98 e 100% dos organismos
avaliados.
32
3-PARTE II. INFECÇÃO EXPERIMENTAL DE CAMUNDONGOS COM
Cystosospora felis
3. 1. REVISÃO DE LITERATURA
3. 1. 1. Infecção experimental
a. Freqüência de hipnozoítas
Ao descreverem um ciclo alternativo para o gênero
Cystoisospora, FRENKEL & DUBEY (1972) observaram a existência
de cistos monozóicos, localizados extra-intestinalmente.
Posteriormente, MARKUS (1976) denominou-os de Hipnozoítas.
Estudos sobre a freqüência de hipnozoítas de
Cystoisospora rivolta nas diferentes vísceras de camundongos
experimentalmente infectados, demonstraram que estas formas
estão largamente distribuídas pelo organismo do hospedeiro
infectado. Pode-se afirmar que estas se distribuem por quase
todos os órgãos do hospedeiro, excetuando o cérebro
(BROSIGKE, 1981; BROSIGKE et al., 1982). Os órgãos de maior
incidência de formas latentes (hipnozoítas) foram o fígado,
baço e linfonodos mesentéricos.
A presença e quantidade de parasitas por órgão de
um animal infectado, irá depender da carga do inóculo (dose
3 3
infectante). BROSIGKE (1981), pontificou sobre a dificuldade
de se encontrar hipnozoítas de Cystoisospora rivolta em
cortes de vísceras, oriundas de animais inoculados com menos
do que 2 x 106 ou 1 x 107 de oocistos por animal. Da mesma
forma, FRENKEL & DUBEY (1972.) e DUBEY & FRENKEL (1972) fazem
citações factuais sobre a dificuldade na detecção destes
protozoários quando envoltos pelas células do hospedeiro,
embora tenham demonstrado a presença de estágios extra-
intestinais de Cystoisospora rivolta em baço e linfonodos
mesentéricos de camundongos e gatos infectados com 1 x 103 e
104 oocistos por animal. Levando-se em consideração o estado
infectante teórico de oito esporozoítas viáveis por oocisto,
estes, quando liberados, poderiam seguir dois caminhos:
multiplicação sexuada no intestino do hospedeiro definitivo e
multiplicação, por endodiogenia, no hospedeiro intermediário,
ocorrendo extra-intestinalmente (MARKUS, 1975).
A multiplicação assexuada para os coccídias do
gênero Cystoisospora foi estudada por vários pesquisadores
(FRENKEL & DUBEY, 1972; DUBEY E FRENKEL. 1972 e MARKUS,
1975), todos afirmando que esta ocorra ao nível de células
linforreticulares. O encontro de hipnozoítas em outros órgãos
linfóides, além dos linfonodos mesentéricos e placas de
Peyer, sugere uma via linfática de disseminação no organismo
do hospedeiro (BROSIGKE, 1981).
MEHLHORN & MARKUS (1976), estudando hipnozoítas de
Cystoisospora felis em tecidos à microscopia eletrônica,
34
observaram que após dois dias da infecção, havia presença de
cistos monozóicos característicos no fígado e baço, sugerindo
a existência de uma via sanguínea. Apesar disto, estes
autores não conseguiram demonstrar hipnozoítas no sangue
circulante dos animais parasitados.
HERNANDEZ et al. (1978), detectaram formas
monozoíticas de Isopora lacazei em células do sistema
fagocítico mononuclear (SFM) de. fígado e baço.
A fagocito se de formas invasivas do parasita
originária, secundariamente, hipnozoítas através de um
processo semelhante ao que ocorre com Toxoplasma (BROSIGKE,
% - . , . 1981; BROSIGKE et al 1982) Deste modo, a possibilidade de
se encontrar formas hipnozoíticas no sansue ou líquor, seria
unicamente dependente da dose infectante necessária para tal
(JONES et al., 1972).
BROSIGKE (1981), estudando formas e×tra-intestinais
de Cystoisospora rivolta, encontrou formas intracelulares em
cortes de fígado e de baço. O mesmo foi demonstrado para
Cystoisospora felis e Cystoisospora ohioensis Dubey, 1975
(DUBEY & FRENKEL, 1972; FRENKEL & DUBEY, 1972; MEHLHORN &
MARKUS, 1976; DUBEY & MEHLOHRN, 1978; DUBEY, 1979), com a
presença de hipnozoítas, tanto intracelular como
e x t r a c e l u l a r m e n t e .
Infecções experimentais com Cystoisospora felis,
realizadas por diversos autores, não foram bem sucedidas em
determinar um estado patogênico decorrente da cistoisosporose
35
(FAYER & FRENKEL, 1979; FAYER, 1980; BROSIGKE, 1981; BROSIGKE
et al., 1982).
LOSS (1991), estudando aspectos clínicos,
epidemiológicos e quimioterapêuticos da cistoisosporose
felina, detectou, pela primeira vez, a ocorrência de
manifestações clínicas características da doença. A síndrome,
caracterizada neste trabalho, consistiu de diarréia,
desidratação, pêlos arrepiados e morte, principalmente de
gatos jovens, submetidos a condições de estresse.
Sobre os hospedeiros intermediários, LOSS (1991)
observou haver um comprometimento no ganhoo de peso de
camundongos suiço-albinos, submetidos a infecções
experimentais com oocistos eliminados nas fezes de gatos.
36
3. 2. MATERIAL E MÉTODOS
3. 2. 1. Animais
Foram utilizados 150 camundongos albinos da estirpe
C57/B6, procedentes da Fundação Instituto Oswaldo Cruz - RJ,
machos e fêmeas, pesando entre 19 e 21 gramas.
3. 2. 2. Inoculações
Dez grupos de cinco animais cada, foram inoculados
oralmente com 106 oocistos de Cystoisospora felis por
c a m u d o n g o .
Foram estabelecidos dois grupos de animais
controles, cada um contendo 50 camundongos. Um destes grupos
foi denominado de qrupo de alimentação pareada ("PAIR FED"),
que recebeu, ao longo de todo o experimento a mesma
quantidade de ração consumida pelo grupo de animais
inoculados com oocistos esporulados de Cystoisospora felis.
O grupo de controle restante recebeu ração ad-
libitum.
Ambos os grupos de animais controles foram
inoculados com o veículo (PBS), utilizado para efetuar-se a
suspensão de oocistos esporulados.
37
3. 2. 3. Avaliação do peso
O peso relativo entre os indivíduos, infectados ou
não, foi avaliado proporcionalmente, através de aferições
diárias do peso de cada indivíduo, durante trinta dias.
A influência da ingestão de alimento no peso foi
aquilatada através de comparações entre a média ponderal do
grupo inoculado e a dos grupos controles.
3. 2. 4. sacrifícios
Grupos de cinco animais, oriundos de cada sistema
experimental, foram anestesiados através de inalação de éter
etílico e exsangüinados individualmente até a morte, através
de incisão no plexo mamário. O soro, resultante da coagulação
sangüínea, foi identificado e guardado à -20°C, para uso
posterior.
Os sacrifícios foram realizados nos dias 1, 3, 6,
7, 8, 9, 16, 21, 28 e 30, após a infecção (DFI).
Os animais foram necropsiados e eviscerados. Cada
um de seus órgãos: coração, pulmões, rins, cérebro placas de
Peyer e linfonodos mesentéricos, foram retirados,
38
identificados e pesados em balança de precisão13.
Para cada indivíduo determinou-se o peso
proporcional das vísceras, em relação no peso vivo do animal.
Da mesma forma, o peso das carcaças resultantes da
evisceração foi comparativamente avaliado.
3. 2. 5. Quantificação de hipnozoítas
A quantificação de hipnozoítas por víscera
analisada segui a metodologia descrita por BROSIGKE (1981).
O material resultante de digestão enzimática dos
órgãos foi filtrado, lavado e ressuspendido em um volume de
0,5 a 1,0 ml de PBS. Alíquotas de 10 ul de cada amostra foram
quantificadas ao microscópio ótico de contraste de fase de
modo a determinar o número de hipnozoítas existentes em cada
v í s c e r a .
A quantidade total de hipnozoítas por animal foi
obtida pelo somatório do número de hipnozoítas encontrados no
baço, fígado, linfonodos mesentéricos (LM), placas de Peyer
(PP), rins, coração e pulmões.
À partir da quantidade total de hipnozoítas,
relativa a cada animal, estabeleceu-se o percentual de
hipnozoítas/víscera analisada.
13 BALANÇA METTLER PE 360 E. U. A.
39
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1. Avaliação do peso
Os camundongos inoculados com 106 oocistos
esporulados de Cystoisospora felis, quando comparados com os
animais no sistema de controle com alimentação ad libitum,
foram comprometidos em relação ao ganho de peso durante 44
dias de avaliação do ganho ponderal (Figura 3).
De outro modo, ao compare-los corn o grupo de
animais que receberam alimentação pareada (PF), verificou-se
que, em realidade, a perda de peso dos animais inoculados
manifestou-se somente na primeira semana após a infecção
(Figura 4).
A perda de peso relativa unicamente ao parasitismo,
parece ser temporária e está relacionada com a evolução das
formas infectivas, para o conseqüente estabelecimento de
hipnozoítas extra-intestinais.
As diferenças relativas ao ganho de peso dos
animais inoculados e aqueles que receberam ração ad libitum,
devem estar relacionadas à anorexia que se segue à infecção,
como descrito por LOSS (1981).
LOSS (1981), ao comparar o ganho de peso de
camundongos suiço-albinos experimentalmente inoculados com
105 oocistos de Cystoisospora felix, com um grupo de animais
não inoculados, encont rou ao fim de quatro semanas de
40
FIGURA 3: Ganho médio de peso (GMP/g) de camundongosinoculados com 106 oocistos esporulados deCystoisospora felis (A), em relação a grupos decontroles (B) e "pair fed" (C), não inoculados.
4 2
FIGURA 4: Ganho peso negativo (GPM) de camundongos de
camundongos inocuIados com 106 oocistos esporuladosde Cystoisospora felis (A), em relação a gruposde controles, "pair fed" (B) e controle(C), não inoculados.
42
experimento uma diferença de no ganho de peso (20 a 30
gramas) maior do que conseguiu-se no presente trabalho (10
gramas). Esta diferença pode estar associada ao fato de que
os grupos de controles foram também inoculados com PBS no
mesmo dia em que os camundongos infectados receberam, através
de canulação, 106 oocistos por animal. O estresse imposto
pelo procedimento de inoculação pode ter como conseqüência o
comprometimento da ingestão de alimentos repercutindo no
ganho médio ponderal dos grupos de controles (NEEDHAN, 1979)
e diminuindo as diferenças entre o peso dos controles em
relação aos camundongos inoculados.
3. 3. 2. Avaliação do peso médio das vísceras
Camundongos inoculados ou não com Cystoisospora
felis, foram sacrificados e coração, pulmões, rins, placas de
Peyer, linfonodos mesentéricos, fígado, baço e cérebro, foram
pesados separadamente.
Levando-se em consideração o peso vivo de cada
indivíduo, estabeleceu-se a proporção média de cada víscera e
os resultados percentuais obtidos foram analizados
comparativamente.
Não se observou diferenças marcantes em relação aos
pesos médios obtidos para o coração, pulmões, rins e cérebro
de animais infectados em relação aos grupos de controles. Uma
4 3
vez que não existem dados na literatura relativos a este tipo
de análise para animais infectados por espécies do gênero
Cystoisospora, pode-se afirmar que o coração, os pulmões, os
rins e o cérebro são órgãos nos quais estes parasitas são
raramente encontrados.
BROSIGKE (1981), estudando a freqüência de
hipnozoítas de C. rivolta no organismo de camundongos suiço-
albinos convencionais determinou que, embora largamente
distribuídos pelo organismo do hospedeiro, estes parasitas
não se desenvolviam no cérebro.
De maneira concordante, as vísceras para as quais
sabidamente o parasita tem sido observado: fígado, baço,
1infonodos mesentéricos e placas de Peter (DUBEY, 1979;
BROSIGKE, 1981; BROSIGKE et al., 1982 e LOSS, 1991), tiveram
alterações em relação à proporcionalidade do peso vivo dos
animais inoculados, quando comparações foram feitas em
relação aos grupos controles.
Observou-se discreta alteração dimensional nas
placas de Peyer no período entre o 2º e o 16° DPI. Aos 16
DPI, este órgão tinha dimensões semelhantes quando comparadas
com aquelas dos grupos de controles (Figura 5).
Os linfonodos mesentéricos, por sua vez, foram
bastante alterados à partir do 4º DPI. A maior alteração
ocorreu no 6° DPI, onde esta víscera chegou a representar
mais que 1,0% do peso vivo dos animais infectados. Os grupos
de controles mantiveram a mesma proporcionalidade para estes
44
Peso médio percentual (PM%) das placas de Peyer decamundongos inoculados com 106 oocistos esporuladosde Cystoisospora felis (A), em relação aosgrupos de controles, "pair fed" (B) e controle (C),não inoculados.
FIGURA 5:
45
do peso vivo dos animais. Nos camundongos infectados
experimentalmente, os linfonodos mesntérios mantiveram-se
alterados no 12° DPI e no 18º quando suas dimensões foram
semelhantes àquelas dos sistemas de controles (Figura 6)
Este retorno à proporcionalidade parece estar
relacionado com o ciclo biológico do parasita, sendo uma
conseqüência da distibuição de formas parasitárias pelo
organismo do hospedeiro.
Alterações também foram observadas no baço dos
animais infectados experimentalmente, entre os dias 3 e 6,
retornando à normalidade aos 12 DPI. Aos 18 DPI, mais uma vez
constatou-se o aumento do volume deste órgão linfóide (Figura
7).
Possivelmente estas alterações cíclicas se devam a
um afluxo espontâneo de formas párasitárias durante a
evolução de seu ciclo biológico no hospedeiro intermediário.
Placa de Peyer linfonodos mesentéricos e fígado
tiveram alterações ao longo do experimento, sendo que o volume
do fígado aos 18 DPI chegou a representar quase 9% do peso
vivo nos animais inoculados (Figura 8).
Estas alterações sugerem existir duas vias de
difusão do parasita no organismo do hospedeiro: uma via
linfática e uma via sangüínea.
Estes dados são concordantes com conclusões de
vários pesquisidores (MEHLHORN & MARKUS, 1976; HERNANDEZ et
Peso médio percentual (PM%) dos linfonodosmesentéricos de camundongos inoculados com 106
oocistos esporulado de Cystoisospora felis (A). emrelação a grupos de controles, "pair fed" (B) econtrole (C), não inoculados.
FIGURA 6:
47
Peso médio percentual (PM%) do baço de camundongos,inoculados com 106 oocitos esporulados deCystoisospora felis (A), em relação a grupos decontroles, "pair fed" (B) e "controle" (C), nãoinoculados.
FIGURA 7:
48
Peso médio percentual (PM%) do fígado de camundongos inoculados com 10 6 oocistos esporulados de Cystoisospora feIis (A), em relação aos grupos de controles, "pair fed" (B) e controle (C), não inoculados.
FIGURA 8:
49
al., 1978; BROSIGKE, 1981 e BROSIGKE et al., 1982), os quais
sugerem que a veiculação do parasita de órgão para órgão deva
se processar através de fagócitos.
As carcaças, resultantes da evisceração dos animais
estudados foram pesadas e seus pesos diminuídos do peso vivo
de cada indivíduo que as originou. Os animais inoculados
apresentaram diferenças crescentes em relação ao peso vivo,
representando uma espoliação que, sem dúvida é a tradução de
uma má conversão devida ao parasitismo, tal como ocorre em
infecções por Sarcocytsis (SPEER, 1983) (Figura 9 Deve-se
ressaltar que não houveram diferenças marcantes entre os
camundongos dos sistemas controles quando suas vísceras ou
carcaças foram avaliadas em relação a seus pesos vivos.
3. 3. 3. Quantificação de hipnozoítas
O número de hipnozoítas recuperados através de
digestão péptica das vísceras de camundongos infectados, foi
crescente até ao 6º DPI, quando foram obtidos, em média,
3,4 x 104 hipnozoítas e no 9º DFI, onde se detectou
104, sendo que o número inicial de parasitas
encontrados foi de 1,25 x 104 hipnozoítas no 3º DPI e, ao
final de 30 DPI, 1,9 x 104.
BROSIGKE (1981), estudando a distribuição de
hipnozoítas de Cystoisospora rivolta em camundongos
50
Diferença média entre o peso vivo e o peso dacarcaça (PV-PC/g) de camundongos, inoculados com106 oocistos esporulados de Cystoisospora felis(A), em relação aos grupos de controles, "pair fed"(B) e controle (C), não inoculados.
FIGURA 9:
51
experimentalmente infectados, detectou uma média de 2,9 x 104
hipnozoítas no 28° DPI, como sendo a maior quantidade de
parasitas detectada.
A quantificação de formas hipnozoíticas de
Cytoisospora felis sugere um ciclo biológico mais rápido do
que aquele desenvolvido pela Cystoisospora rivolta, uma vez
que o pico de desenvolvimento de formas císticas intra-
teciduais ocorre em torno de 10 dias.
A distribuição de hipnozoítas no fígado de
camundongos inoculados mostrou-se crescente até o 7º DPI e
entre o 8° e o 28º DPI (Tabela 3).
NO 3º DPI, as vísceras que apresentaram maior
quantidade de hipnozoítas foram as placas de Peyer (40%).
Esta proporção caiu progressivamente, mostrando 26% no 6º DPI
e quantidades bem menores à partir do 7° DPI.
OS lifonodos mesentéricos mostraram-se como órgãos
de eleição à partir do 6º DPI, até aos 16 DPI, chegando a
concentrar cerca de 98% das formas parasitárias no 8º DPI.
O fígado, por sua vez, estava intensamente
parasitado à partir do 21º DPI. Antes deste período, dividiu
com o linfonodo mesentérico e o baço a maior número de
hipnozoítas, reforçando a possibilidade de uma via sangüínea,
além da via linfática, de disseminação do parasita no
organismo do hospedeiro intermediário. Embora com resultados
semelhantes, estudos relativos à distribuição de hipnozoítas
de Cystoisospora rivolta demonstraram que esta espécie
52
TABELA 3: Números médios de hipnozoítas quantificados em vísceras de camundongos inoculados com 106
oocistos esporulados de Cystoisospora felis.
a- Os resultados são a média dos valores obtidos de cinco animais para cada dia de experimento. b- Números entre parênteses representam o percentual de hipnozoítas em cada dia de avaliação.
53
apresenta tropismo diferenciado em relação àquele observado
para Cystoisospora felis (BROSIGKE, 1981).
BROSIGKE (1981) observou uma grande predileção
pelos linfonodos mesentéricos no 2°, 4º, 14º, 84º e 168º DPI.
O fígado, por sua vez, foi o órgão de predilção somente no
3° e no 7º DPI. Assim sendo, Cystoisospora rivolta, embora
distribua-se também por duas vias (linfática e sangüínea),
parece ser mais linfotrópica que Cystoisospora felis.
Desta foram, as suspeitas de que os parasitas da
espécie Cystoisospora rivolta seriam mais facilmente
regulados imunologicamente que Cystoisospora felis (FAYER &
FRENKEL, 1979 e LONG., 1982), parecem ter fundamento.
A presença de hipnozoítas em outras vísceras foi
rara. Resultados mais expressivos foram determinados no 3°,
6º e 16º DPI, onde registrou-se uma quantidade proporcional a
20%, 6% e 3%, respectivamente.
A presença de hipnozoítas ao nível de rins,
pulmões, coração e outros, pode estar relacionada a uma
distribuição acidental e não a uma via normal de acesso
p a r a s i t á r i o .
54
4. PARTE III. AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE FRENTE À INFECÇÃO
POR Cystoisospora felis
4.1. REVISÃO DE LITERATURA
A imunidade relativa às infecções por parasitas do
gênero Cystoisospora não foi definitivamente estudada
(CHESSUM, 1972; DUBEY & FRENKEL, 1972; DUBEY, 1979). Na
verdade, os estudos existentes foram totalmente realizados
com gatos, e nunca com qualquer dos outros hospedeiros
intermediários (ROSE, 1982).
O aparecimento de sinais clínicos característicos e
até mesmo a morte de alguns indivíduos, pode representar a
interrupção de resistência dos indivíduos que, desta forma,
seriam mais susceptíveis à cistoisosporose (LOSS, 1991).
A ausência de dados sobre a resposta imune nos
hospedeiros intermediários, asssociada à não observação de
sinais clínicos levaram, durante muito tempo, a acreditar-se
que estes seriam, em realidade, hospedeiros paratênicos,
representando desta forma, apenas um meio de transporte
intermediário entre gatos (FAYER, 1980).
Contra isto, a perda progressiva de peso, detectada
em camundongos experimentalmente infectados com cystoisospora
felis, foi indicativa de que ocorre efeitos deletérios também
55
nestes hospedeiros (LOSS, 1991). Uma vez que Cystoisospora
felis pode, além de roedores, infectar outras espécies
(BROSIGKE, 1981) de importância econômica, a possibilidade de
ocorrerem efeitos deletérios à saúde animal, torna
imprescindível o aprofundamento de estudos relativos à
resposta imunológica a estes parasitas.
Suspeita-se que estes parasitas podem disseminar-se
pelo organismo dos hospedeiros, utilizando macrófagos como
elementos de transporte endógeno (HERNANDEZ et al., 1978;
BROSIGKE, 1981). Além disto, o tropismo apresentado por estes
agentes por órgãos linfóides (BUBEY, 1979; BROSIGKE, 1981;
LOSS, 1991) representa, sem dúvida, um impacto na resistência
à Cystoisospora, assim como a outros agentes associados.
Anticorpos específicos podem causar inibição da
penetração e da multiplicação de esporozoítas de Eimeria e
toxoplasma (HSU, 1971; KLAINER et al., 1973 e BENDRNIK 1977),
entretanto, tem estimulado a formação de cistos contendo
bradizoítas (SPEER, 1983). Assim, mesmo que os anticorpos
específicos não sejam necessários para a iniciação da
formação de cistos, devem participar intensamente na espansão
do número destes no organismo do Hospedeiro (SPEER, 1983).
Macrófagos alveolares e peritoniais tratados com
antisoros específicos, ampliaram o poder de fagocitose para
T. gondii (STADTSBAEDER et al., 1975). Apesar disto, a
evolução do parasitismo intracelular irá depender da cêpa do
parasita em questão (ANKISHINA et al., 1976).
56
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1. Papel da fogocitose
O papel da fogocitose no estabelecimento da
infecção por Cystoisospora felis em camundongos foi avaliado
de acordo com adaptação à metodologia descrita por NAKANISHI
et al. (1990).
15 gramas foram utilizados neste experimento. O primeiro
grupo de animais recebeu inóculo de uma suspensão de carvão
Dois grupos de 20 camundongos, pesando entre 12 e
vegetal (0,1% em PBS) pela via intra-peritonial, duas horas
antes de serem infectados com 103 esporozoítas de
Cystoisospora felis, administrados através da mesma via.
O segundo grupo (controle) foi submetido somente
inoculação com 103 esporozoítas por via intra-peritonial.
Animais (cinco) de cada grupo experimental, foram
sacrificados nos dias 1, 3, 5 e 7 após inoculação.
Após evisceração, determinou-se o número total de
hipnozoítas, em cada animal, presentes nos linfonodos
mesentéricos, placas de Peyer, baço, fígado coração pulmões
e rins.
As diferenças, relativas ao grupo de animais cujos
macrófagos peritoniais foram bloqueados através da inoculação
prévia com carvão vegetal, foram comparativamente analizadas
em relação ao grupo controle.
57
4.2.2. Supressão da fogocitose
Foi utilizado o teste de avaliação da função de
neutrófilos (LIMA et al., 1977).
Camundongos inoculados oralmente com 106 oocistos
de Cystoisospora felis, foram exsangüinados em diferentes
dias após a inoculação (3, 6, 12, 15, 20, 30, 45), através de
corte ao nível do plexo mamário. Cerca de 1 ml foi retirado
de cada indivíduo e rapidamente acondicionado em recipiente
contendo citrato de sódio (concentração final de 0,3%).
Foram utilizados grupos de cinco animais por dia de
experimento, fazendo-se concomitantemente a mesma avaliação
em camundongos não inoculados (controles).
Em 0,75 ml de sangue citratado foram adicionados,
assepticamente, em câmara de fluxo laminar14, de 5 ul de
endotoxina bacteriana15 na dose de 1mg.ml-1 (dose
estimuladora da fogocitose). Esta suspensão foi incubada
37ºC/10 minutos e adicionada de 60 ul de solução de azul de
tetrazólio16 (NBT) a 4 mM e 340 mM de sacarose, em PBS.
Após adequada mistura, o material foi passado
através de uma coluna de 2,5 cm de altura e 1,5 cm de
diâmetro, contendo em seu interior lã sintética. (ACRYLON).
14 VECO, São Paulo, Brasil 15 Institut für Bakteriologie und Immunologie Fb. Veterinärmedizin Giessen, República Federal Alemã
16 SIGMA, St. Louis, E.U.A.
58
A lã sintética foi duas vezes eluida com PBS e uma
vez com água destilada estéril, cuja finalidade era carrear
os complexos existentes no interior das células, presas às
fibras de ACRYLON.
A lã de ACRYLON, contendo fagócitos aderidos, foi
colocada em ehlemmeyer, adicionando-se em 1 ml de dioxana17.
Este reajente, na presença de NBT origina um produto corado,
após incubação à temperatura de 10ºC, durante 20 minutos.
Os resultados foram obtidos à partir da avaliação
da coloração desenvolvida, nas amostras cuja função de
neutrófilos é positiva (avaliação ótica a 460nm)18.
4.2.3. Dosagem de anticorpos anti - Cystoisospora
felis
Soros de camundongos primo-infectados, obtidos em
diferentes dias pós-infecção (2º, 3º, 6º, 7º, 8º, 20º e 60º
DPI), foram avaliados quanto à presença e título
(concentração) de anticorpos circulantes anti - Cystoisospora
felis, através do método de hemaglutinação indireta (iHA)
(RAWLS, 1979).
Estes ensaios foram realizados em duas etapas
sensibilização de eritrócitos de carneiro com antígenos
17 Merck, E.U.A. 18 Bauch & Lomb. R.F.A.
59
parasitários e, 2º Hemaglutinação dos eritrócitos tratados,
na presença dos soros coletados em diferentes períodos de
infecção.
Os antígenos de Cystoisospora felis utilizados
foram obtidos à partir de esporozoítas, os quais foram
rompidos por sonicação 19 (40 wats, durante 30 segundos),
seguida de congelamentos e descongelamentos sucessivos.
O lisado parasitário obtido foi esterelizado
através de membrana 20 com 0,22 micra de diâmetro e submetido
à diálise 21 contra PBS.
Este preparado parasitário foi adicionado a
eritrócitos de carneiro previamente taninizados (ácido
tânico 22 a 1:20000), na proporção de 0,5 mg de proteínas
parasitárias para uma suspensão conteúdo 2,5% de eritrócitios
taninizados. A sensibilização se deu pela incubação à
temperatura ambiente, durante 60 minutos.
Os testes de hemaglutinação indireta (iHA) foram
realizados à partir de diluições sucessivas de amostras de
soros (de 1:8 a 1:4096), em microplacas 23 de sorologia. Sobre
cada diluição dos soros testados, adicionou-se 25 ul de
eritrócitos sensibilizados e, após cobrir-se as placas de
19FISCHER, Modelo 300, E.U.A. 20MILLIPORE, E.U.A. 21MEMBRANA DE DIÁLISE, SPECTRAPOR, Arthur Thomas,Filadelphia, E.U.A.
22HERZOG, Rio de Janeiro, Brasil 23MICROPLACAS DE SOROLOGIA, fundo "U", PETÉCIL São Paulo,
B r a s i l .
60
sorologia com plástico, homogeneizou-se (através de
movimentos circulates e horizontais) e deixou-se em repouso,
à temperatura ambiente, durante 3 horas.
Os títulos de anticorpos foram determinados pelo
exame visual das placas de sorologia.
A maior diluição do soro capaz de originar a
aglutinação das células sensibilizadas, foi considerada como
sendo o título de anticorpos do soro testado.
61
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A deficiência da resposta imune em animais de
laboratório tem sido uma das mais importantes causas da
grande susceptibilidade dos neonatos às doenças infecciosas
(NEEDHAM, 1979).
A baixa capacidade de responder imunologicamente,
em camundongos muiLo jovens, é devido normalmente a problemas
de maturidade dos linfócitos tímicos, ou deficiências
funcionais ao nível de fagócitos, ou, ainda, a um excesso de
células supressoras circulantes (PIQUET et al., 1981).
As alterações decorrentes do parasitismo, podem
gerar fenômenos extremamente semelhantes às deficiências
imunológicas naturais em camundongos albinos (NEEDHAM, 1979).
No presente experimento, o bloqueio da atividade
fagocítica dos macrófagos peritoneais com carvão vegetal,
levou a uma supressão total da infectividade relativa aos
esporozoítas de Cystoisospora felis inoculados Desta forma,
nenhum dos animais testados apresentou formas hipnozoíticas
em qualquer das vísceras analisadas.
Contrastantemente, o grupo controle apresentou
grande quantidade de hipnozoítas, recuperados em vários dias
do experimento: 0,7 x 103 no 1º DPI, 2,2 x 102 no 3º DPI, 3,4
x 103 no 5º DPI e 1,04 x 104 no 7º DPI.
O efeito do bloqueio da fagocitose pr partículas
de carvão vegetal, sugere que estas células desempenham
6 2
importante papel na cistoisosporose. Como os macrófagos são
efetivamente células reguladoras da resposta imune, o
bloqueio de suas funções deve afetar a capacidade imunológica
do hospedeiro (NAKANISHI et al., 1990). Da mesma forma, se os
macrófagos encontraram-se infectados, é de se esperar gue
algumas funções imunológicas sejam perdidas.
A avaliação da supressão da fagocitose, através da
redução de NBT, em animais infectados, não foi demonstrada
para os animais infectados com Cystoisospora felis. Os
resultados obtidos foram idênticos àqueles dos animais
controles.
Talvez, as formas intracelulares de Cystoisospora
felis, a exemplo do gue ocorre com Leishmania Ross, 1903 ou
com T. gondii, sofram eliminação dependente do teor de
citocinas circulantes, ou decorrente de falhas genéticas
individuais no sistema Complemento, que parecem ser
fundamentais para o estabelecimento do parasitismo (FUHRMAN &
JOINER, 1989).
O título de anticorpos anti-esporozoítas de
Cystoisospora felis, progressivamente aumentou nos sete
primeiros dias de infecção, estabilizando-se entre o 8° e o
20º DPI. Aos 60 DPI foi 1:64 (Tabela 4).
Levando-se em consideração que o método de
hemaglutinação indireta pode ser tão específico quanto a
imunofluorescência indireta, com a única desvantagem de
possíveis variações nos eritrócitos de carneiro, ou na
63
TABELA 4: Título1 de anticorpos anti-esporozoítas, através de Hemaglutinação indireta, emsoros de camundongos, experimentalmente infectados com 106 oocistos esporulados deCystoisospora felis.
1 Os resultados em cada período assinalado representam a média de 6 ensaios com soros de 10 indivíduos.
6 4
qualidade dos antígenos (WILSON et al., 1990), pode-se
afirmar que o desenvolvimento do ciclo biológico extra-
intestinal é decorrente de uma resposta imunológica humoral
efetiva que favorece a fagocitose e, consequentemente a
formação de formas de resistência (hipnozoíticas).
É digno de nota o fato de que soros de felinos com
sintomatologia clássica de cistoisosporose, foram também
testados pelo método de hemaglutinação indireta, não
apresentando qualquer quantidade de imunoglobulinas
circulantes capazes de reagir contra esporozoítas de
grandes concentrações de oocistos, é provável que, no
hospedeiro definitivo, a exemplo do que ocorre com outros
coccídias, a ausência de anticorpos seja importante para a
eliminação dos mesmos (FAYER, 1980).
6 5
5- CONSIDERAÇÕES GERAIS
Este trabalho foi realizado com o intuito de
responder algumas das questões fundamentais, relativas ao
comportamento de Cystoisospora felis no organismo de
hospedeiro intermediário, tendo sido utilizado camundongo
albino como modelo experimental. Assim, estudou-se aspectos
da biologia deste parasito, os quais ainda não haviam sido
explorados e que são fundamentais para o aprofundamento de
estudos em ciências correlatas à parasitologia, tais como a
patologia e a imunologia.
São raros os pesquisadores que pensam ser a
cistoisosporose uma síndrome capaz de afetar espécies animais
de interesse econômico. Ao contrário, demonstrou-se que este
parasita causa espoliações significativas no organismo de
seus hospedeiros. Com base nestas verificações,
estabeleceram-se parâmetros de distribuição, patogênese e
imunidade, para os quais, infelizmente, não se encontram
detalhes de esquemas similares.
Este trabalho mostrou existir uma freqüência na
eliminação de oocistos de Cystoisospora felis à partir de
gatos recém desmamados, sendo que há maior chance de
eliminação destes durante os primeiros 57 dias de vida.
Tendo-se em conta que, na maioria das vezes, os
testes de diagnóstico são realizados à partir de exames "post
66
mortem", torna-se difícil julgar benefícios de metodologias
modernas aplicadas ao diagnóstico de certas coccidioses.
Particularmente em relação à imunologia aplicada com este
intuito, é importante ressaltar que a detecção prematura
destas síndromes é de alta relevância. No presente trabalho,
mostrou-se existir uma correlação entre a evolução do
parasitismo e a presença de anticorpos circulantes, no
hospedeiro intermediário camundongo albino. Este fato
caracteriza a existência de um ciclo alternativo, onde a
interferência do hospedeiro intermediário deve ocasionar
alterações as quais merecem ser cuidadosamente avaliadas
Adiciona-se a isto, o fato de que os gatos recém desmamados,
no período em que estão eliminando grandes quantidades de
oocistos, não apresentam anticorpos circulantes em
quantidades detectáveis. Da mesma forma, a fagocitose,
associada ao impacto da cistoisosporose sobre a resposta
imune, é fundamental para a disseminação destes protozoários
no organismo de seus hospedeiros. Provavelmente, os gatos
neonatos sejam prematuramente infectados através de fagócitos
maternos, transferidos passivamente durante o aleitamento.
Este trabalho não se esgota com os resultados aqui
apresentados, sendo, claramente, o início para o
desenvolvimento de novas frentes de pesquisa. À partir disto,
espera-se alcançar, num futuro próximo, uma cooperação
efetiva entre veterinários e laboratórios de diagnose para
6 7
que medidas profiláticas e tratamento possam ser utilizados
em benefício da saúde animal.
68
6- CONCLUSÕES
Os resultados obtidos na execução do presente
trabalho dão subsídios às seguintes conclusões:
a- O crescente aumento de oocistos de Cystoisospora felis nas
fezes de gatos, após administração de vísceras contendo
hipnozoítas, é indicativo de um ciclo biológico que, ao
contrário dos membros da família Eimeriidae, não parece
ser auto-limitante.
b- Quando submetidos à aeração, os oocistos de Cystoisospora
felis esporulam nas seguintes proporções: 40% nas
primeiras 24 horas, 60 a 65% após 48 horas e 80 a 87% após
72 horas de incubação à temperatura ambiente.
c- Existem variações nas dimensões
Cystoisospora felis que, não são suficientes para
caracterizar a espécie de Cystoisospora isolada em
camundongos.
d- A infecção experimental em camundongos causou perda de
peso, especialmente durante a primeira semana de infecção,
chegando a 10 gramas de diferença em relação aos grupos
controles. Esta perda de peso é temporária e está
69
relacionada com a evolução do parasitismo para a
cronicidade.
e- O aumento do peso vivo dos animais inoculados está
diretamente relacionado ao aumento de tamanho das
vísceras, principalmente com a hepatomegalia.
f- O ciclo biológico de Cystoisospora felis, na forma extra-
intestinal, ocorreu em torno da 1ª semana de infecção,
quando houve maior concetração de hipnozoítas nos
linfonodos mesentéricos (8° e 9º DPI) e baço (7º DPI).
g- Os hipnozoítas de Cystoisospora felis têm grande afinidade
pelos linfonodos mesentéricos e um tropismo
proporcionalmente crescente pelo fígado, que à partir do
21º dia após infecção, passou a ser o órgão de eleição.
h- Camundongos infectados tiveram má conversão, como pode
ser verificado no peso proporcionalmente decrescente de
suas carcaças. Este fato reflete uma ação deletéria do
parasitismo sobre camundongos.
i- A movimentação de fagócitos no organismo é um importante
meio de disseminação das formas extra-intestinais de
Cystoisospora felis.
70
j- O título de anticorpos circulantes, no camundongo C57/B6,
foi maior no 7º dia após infecção e está associado ao
desenvolvimento do ciclo biológico extra-intestinal de
Cystoisospora felis.
k- Os felinos, quando eliminam grandes quantidades de
oocistos de Cystoisospora felis em suas fezes, não
apresentam anticorpos circulantes.
I- Camundongos são hospedeiros intermediários para
Cytoisospora felis, podendo ser utilizados como modelo
experimental para outras espécies de importância
econômica.
71
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANDREWS, J.M. 1926. Coccidiosis in mammals. Amer.J.hiq.,
6: 784-789.
ANKISHINA, G.T.; ABAKAROVA, E.G. & KIRILLOVA, F.M. 1976. Fate
of Toxoplasma gondii in macrophages "in vitro" depending
on the virulence oH the parasti es. Byull EKsp. biol. Med.
80: 60-65.
BENDRNIK, P. 1977. Attempts oH transfer of immunity against
Eimeria tenella "in vitro" and "in vivo", Folia Parasitol.
24; 227-279.
BOMFIM, T.C.B. do. 1989. Cryptosporidium muris Tizzer, 1907
(Apicomplexa: Cryptosporidiidae) em suínos; identificação,
diagnóstico e alguns aspectos epidemiológicos. Tese de
Mestrado, UFRRJ, 117 p.
BOX, E.D., 1981. Isospora as an extraintestinal parasite of
passerine birds. J. Protozool., 28:244-246.
BROSIGKE, S. 1981. Unter suchungen an extraintestinallen
entwicklungstadien (Dormozoiten) von Cystoisospora rivolta
der Katze in der Maus. Dissertation zur Erlangung der
tiermedizinnischen Doktor der Tierarztlichen, Muchen, 37p.
BROSIGKE, S.; HEINE, J. & BOCH, J. 1982 Der Nachweis
extraintestinallen Entwixklungstadien (Dormozoiten) in
experimentall mit Cystoisospora rivolta oozysten
infizierten Mausen. Kleintier Praxis, 27:25-34.
7 2
CAWTHORN, R.J., REDUKER, D.W., SPEER, C.A. & DUBEY, J.P.
1986. In vitro excystation of Sarcocystis capracanis,
S. cruzi and S. tenella. J. Parasitol., 72:880-884.
CHESSUM, B.S. 1972. Reactivation of Toxoplasma oocysts
production in the cat by infection with Isospora felis.
Br. Vet. J., 1,2_8:33-36.
COUDERT, P., LICOIS, D. & STREUN, A. 1979. Characterization
of Eimeria species: I. Isolation and study of
pathogenicity of a pure strain of Eimeria perforans
(Leuckart, 1879 Sluiter and Swel legrebel, 1912). Z.
Parasitenkd. , 59:227-234.
DUBEY, J.P. 1977 Taxonomy of Sarcocystis and other coccidia
of cats and dogs. J. Amer. Vet. Med. Assoc., 170; 778-782.
DUBEY, J.P. 1979. Life cycle o Isospora rivolta (Grassi,
1879) in cats and mice. J.Protozool., 26:433-443.
DUBEY, J.P. & FRENKEL, J.K. 1972. Extraintestinal stages of
Isospora felis and Isospora rivolta (Protozoa: Eimeriidae)
in cats. J.Protozool., 19:89-92.
DUBEY, J.P. & MEHLHORN, H. 1978. Extraintestinal stages of
Isospora ohioensis from dogs in mice. J. Parasitol.,
64:689-695.
FAYER, R. 1980. Epidemiology of protozoan infection: The
coccidia. Vet. Parasitol., 6:75-103.
FAYER, R. & FRENKEL, J.K. 1979. Comparative infectivity for
calves of oocyst of feline coccidia: Besnoitia,
73
Hammondia, Cystoisospora, Sarcocystis and Toxoplasma. J.
Parasitol., 65:756-762.
FRENKEL, J.K. 1977. Besnoitia wallacei of cats and rodents:
with a reclassification of other cyst-forming isosporid
coccidia, J. Parasitol 63:611-628.
FRENKEL, J.K. & DUBEY, J.P. 1972. Rodents as vectors for
feline c occidia, Isospora felis and Isospora rivolta, J.,
Inf. Dis., 125:69-72.
FUHRMAN, S.A. & JOINER, K.A. 1989. Complement evasion by
protozoa. Exp. Parasitol., 68:474-481.
GEYSEN, J. AUSMA, J. & VANDEN-BOSSCHE, H. 1991. Simultaneous
purification of merozoites and schizonts of Eimeria
tenella (Apicomplexa) by percoll flotation and assessment
of cell viability with a double fluorescent dye assay. J.
Parasitol., 77:989-993.
HEINE, J. 1981. Die tryttische Organverdaung als Methode zum
Nachweis extraintestinaler Stadien bei Cystoisospora spp.
Infektionen. Berl.Munch.Tierarztl.Wsch., 94:103-104.
HERNANDEZ, S., NAVARRETE, R. CALERO, R. BECERRA, C. &
MARTINEZ, F. 1978. Electron microscopical study of
extraintestinal stages of Isospora lacazei in Carduelis
carduelis. 4th Intern.Congr.Parasitol., warsaw, 8:19-26.
HSU, K.Y. 1971. Studies on the tissue culture of Toxoplasma
parasites into cultured cells. Br.J.Exp.Pathol. 46:189-
193.
74
JONES, T.C., YEH, S. & HIRSCH, J.G. 1972. The interaction
between Toxoplasma gondii and mammal ian cells. I.
Mechanism of entry and intracellular fate of the. parasite.
J. Exp. Med., 136:1157-1172.
KLAINER, A.S., KRAHENBUHL, J.L. & REMINGTON, J.S. 1973.
Scanning electron microscopy of Toxoplasma gondii. J.Gen.
Microbiol. 75:111-115.
LIMA, A.P., SOARES, J.B., GRECO, J.B., GALIZZI, J. & CANÇADO.
Guanabara Koogan Ed. - Brasil, 669p.
J.R. 1977. Métodos de laboratório aplicados à clínica.
LIN, D.S. & BOWMAN, D.D. 1991. Cellular response of cats with
primary toxoplasmosis. J.Parasitol., 77:272-279.
LONG, P.L. 1982. The biology of coccidia. Univ. Park Press.
USA, 502p.
LOSS, Z.G., 1991. Cistoisosporose felina. Tese de Doutorado,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 104p.
MARKUS, M.B. 1975. Studies on isosporan coccidia of mammals
including man. In: BROSIGKE, S. 1981. Untersuchungen an
extraintestinallen entwicklungstadien (Dormozoiten) von
Cystoisospora rivolta der Katze in der Maus.
MARKUS, M.B. 1976. A term for extraintestinal stages of
mammalian Isospora (protozoa, Coccidia, Eimeriidae). S.
Afr. J. Sci., 72:220.
MARKUS, M.B. 1978. Ter minology for invasive stages of
Protozoa of the suphylum Apicomplexa (Sporozoa). S.Afr.
J. Sci., 74:105-106.
75
MEHLHORN, H. & MARKUS, H.B. 1976. Electron microscopy of
stages of Isospora felis of the cat in the mesenteric
linphnode of the mouse. 7.Parasitenkd., 51:15-24.
NAKANISHI, H. HORII, Y., TERASHIMA, K. & FUJITA, K. 1990. Age
related changes of the susceptibility to infection with
Brugia pahangi in male and female BALB/c mice. J.
Parasitol., 76:283-285.
NEEDHAM, J.R. 1979. Handbook of microbiological investigation
for laboratory animal health. Academic Press - USA, 174p.
PIQUET, P.F., IRLE, C. KOLLATTE, E. & VASSALLI, P. 1981.
Post-thymic T lymphocyte maturation during ontogenesis. J.
Exp. Med. , 154:581-593.
RAWLS, W.E. 1979. Herpes simplex virus types 1 and 2 and
Herpes simiae. In: LENETTE, E.H. e SMIDT, N.J. (ed.)
diagnostic Procedures for Viral, rickettsial and
chlamydial infections, Am. Publ. Health Assoc., Inc. ed,
EUA. 1138p. 309-373.
ROSE, H.E. 1982. Host immune response. In: The biology of the
coccidia. LONG, P. (ed.), Iniv. Park Press, USA, 502p.
SHARMA, S.P. & DUBEY, J.P. 1981. Quantitative survival of
Toxoplasma gondii tachyzoites and bradyzoites in pepsin
and trypsin solutions. Am.J.Vet.Res., 42:128-130.
SMITH, D.D. 1981. The Sarcocystidae: Sarcocystis, Frenkelia,
Toxoplasma, Besnoitia, Hammondia and Cystoisospora. J.
Protozool., 28:262-266.
76
SPEER, C.A. 1983. The coccidia. In: In vitro cultivation of
protozoan parasites. J.B. Jensen Ed. CRC Press Inc.
Florida. 297p.
SPEER, C.A., MARCHIANDO, A.A., DUZYNSK I, D.W. & FILE, S.
1976. Ultrastructure of the sporocyst wall during
excystation of Isospora endocallimici. J. Parasitol.,
67 : 9 8 4- 9 8 7 .
STADTSBAEDER, S., NGUVEN, B.T. & CALVIN-PREVAL., M.C. 1975.
Respective role of antibodies and immune macrophages
during aequired immunity against toxoplasmosis in
TADROS, W. & LAARMAN, J.J. 1976. Sarcocystis and related
cocidian parasites: A brief review, together with a
discussion on some biological aspects of their life cycles
and a new proposal for their classification. Acta
Leidensia, 44:1-107.
TURNER, M.B.F. & BOX, E.D. 1970. Cell culture of Isospora
from the english sparrow Passer domesticus domesticus. J.
Parasitol., 56:1218-1223.
WILSON, M., WARE, D. & JURANEK, D.D. 1990. Serologic aspects
of toxoplasmosis. J.Amer.Vet.Med.Assoc., 196:277-281.
A P Ê N D I C E
78
APÊNDICE 1
"IN VITRO" E XCYSTATION OF CYSTOISOSPORA FELIS (WENYON 1926)
FRENKEL, 1977 (APICOMPLEXA: SARCOCYSTIDAE)
RONALD B. FREIRE1 CARLOS WILSON G. LOPES2
1Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, IV
2Departamento de Parasitologia Animal, IB. Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, KM 47 da Antiga Estrada Rio
São Paulo - 23.851-970, Seropédica - RJ, Brasil. Projeto
Sanida de Animal (EMBRAPA/UFRRJ).
S U M M A R Y
The action of different NaCIO concentration, as well as the
effect of sodium taurocholate, crude bovine bile and triton x
100, were analysed in what concern to Cystoisospora felis
oocysts excystation. The best way to obtain good yelds of
free sporozoites was determined. The best NaCIO concentration
used as a pre-treatment to sporocysts liberation was at 5.5%.
Following NaCIO, tryptic digests associated to sodium
taurocholate showed high efficience (80% of excystation in 2
7 9
hours). The association of trypsin with bovine bile lead to
the best results (90% excystation in 2 hours).
RUNNING HEAD: FREIRE, R. B. & LOPES, C. W. G excystation of
Cystoisospora felis.
KEY WORDS: Cystoisospora felis, sporozoites, excystation.
S U M Á R I O
Pela primeira vez se estudou o processo de excitação in
concentrações de hipoclorito de sódio, assim como a ação de
vitro em Cystoisospora felis. A ação de diferentes
diferentes surfactantes: taurocolato de sódio, bile bovina
crua e triton x 100, foram utilizados para a determinação de
uma metodologia que permitisse obter o melhor rendimento para
concentração de esporozoítas livres. O tratamento de oocistos
com NaClO a 5,5% foi a maneira mais eficiente de promover a
liberação de esporocistos. A digestão trípica associada ao
taurocolato de sódio, quando aplicada aos esporocistos
isolados mostrou alta eficiência (80% de excistação em 2
horas). De outra forma, a associação de tripsina e bile
bovina levou aos melhores resultados (90% de excistação em 2
horas).
80
FRASE CHAVE: FREIRE, R. B. & LOPES C. W. G. Excistação de
Cystoisospora felis
PALAVRAS CHAVE: Cystoisospora felis, esporozoítas, excistação
INTRODUCTION
There are many reports about excystation of various
species of Eimeria and Isospora. On the other hand, nothing
Have been done with Cystoisospora felis, an Isospora-like
organism that infects cats and rodents, specially,
originating extraintestinal hipnozoites. Altough SPEER (1983)
reported Cystoisospora felis excystation using 5.25 per cent
sodium hipochloride (NaCIO), followed by trypsin-bile
solution digestion during 20 minutes at 37ºC, no discussion
have been done about the yelding of sporozoites in such
opportunity.
In this paper, it was evaluated the action of
different NaClO concentrations, and the effect of surfactants
sodium taurocholate, bovine bile and triton x 100, in order
to obtain a good rate of sporozoites liberated in vitro.
81
MATERIAL AND METHODS
Oocysts of C. felis obtained from experimentally
infected kittens were stored at 4ºC in PES (8 gl-1 NaCl, 0,2
gl-1 KCL, 1,15 gl-1 Na2HPO4 and 0.2 gl-1 KH2PO4, pH 7.2) until
weeks. Oocysts were placed in 16 x 15 screwed capped
sterile centrifuge tube and concentrated by centrifugation
(600 x g/20 minutes/4ºC) in order to give 5 x 105 oocysts,
wich were ressuspended in 7 ml of different NaClO (Indústrias
Químicas Ribeiro Ltda-Rio de Janeiro, Brasil) concentrations
(5.46%, 2.73%, and 1.36%,) and incubated during 30,60 or 120
minutes at 4°C. Sporocysts yelds were evaluated
microscopically and their liberation calculed by the number
of free sporocysts in relation to the integral oocysts
v i s u a l i z e d .
nb of free sporocysts Sporocysts = ................................ x 100
nb of integral oocysts
Sporocysts were washed sequentially four times in cold
PBS to remove traces of NaClO, and added of 2,5% trypsin
(SIGMA, 1:250) combinated to 0.75% taurcholic acid, 10%
final volume of bovine bile, or 1% solution of triton x 100,
in PBS, in order to give a final volume of 1 ml for each tube
containing 0.5 x 105 sporocysts. All reagents were
solubilized in cold PBS pH 7.2. Bovine bile was sterelized by
82
a MILLIPORE 0.22 u membrane filter and stored at -20ºC. All
the mixtures were incubated equally at 37ºC (water bath)
during 6 hours, under agitation. Aliquots were withdrawed at
30 and 60 minutes intervals during the first 3 hours
incubation. Slides contain ing different mixtures were
analysed by bright field microscopy The excystation rate was
determinated by the formula:
Free sporozoites ..............................................................................................x 100 free zoites + zoites insid sporocysts
Each result obtained was a median value of four
repetitions.
RESULTS AND DISCUSSION
The excystation process seems to be very similar to
that described by SPEER (1983) for Cytoisospora canis. The
sporocysts wall shows rupture in a site of apposition between
two of the four curved plates constuting the inner layer.
With the excystation fluid (EF) action a splitting of the
outer plate takes place, with a break of the sporocyst wall.
The sporozoites are freeded by splitting on the internal part
of sporocyst trough the outside (Figures 1 and 2).
83
FIGURE 1: Cystoisospora felis. Sporulated (A) and usporulated
(B) oocysts. Saturated sugar solutiuon. Oocystswith fractures after treatment with 5.5% NaClO (Cand D). 1250x.
84
Cystoisospora felis Sporocyst freeded aftertreatment with 5.52 NaClO (A); sporozoite duringdesencystation (B), and free (C), after treatmentwithg Trypsin-bile solution, 1258x.
FIGURE 2:
85
Sporozoites of Cystoisospora felis excysted in the
presence of different surfactants (taurocholic amid, triton x
100, and bovine bile) associated or not to trypsin
Pretreatment of sporocysts with NaClO enhanced the
sporozoites liberation.
Sporozoites obtained by treatment with NaCIO showed a
direct relationship between NaClO concetration and the rate
obtained (TABLE 1). It may be done by the NaClO remotion of
the outer layer from the oocysts as previously demonstrated
for Eimeria (ROBERTS et alli, 1970) and Isospora (SPEER et
alli, 1983). The best excystation was obtained when
sprocysts were treated with 5.5% NaClO. With 2.7% NaClO, the
excystation rate was approximately 50% inferior (TABLE 2).
As demonstrated to Cryptosporidium spp (REDUKER &
SPEER, 1985 it was observed some excystation without
addition of EF. This aspect seems to be relevant since this
characterist ic was not demonstrated to Sarcocystis spp.
(CAWTHORN et alii, 1986).
Taurocholic acid showed a positive surfactant action,
stimulating the excystation process. Triton x 100, a very
well known anionic surfactant was not so good, leading to a
rapid death of sporozoites.
Following the 5.5% NaClO treatment, the association
of trypsin with taurocholic acid was higly efficient (80% of
excystation in 2 hours) giving rise to results as good as
86
TABLE 1: Cystoisospora felis sporocysts rate1 obtainedaccordinq to oocysts treatment with diferentconcentratios of NaClO, at 4ºC.
1- The values presented are the median of five experiments.
2- NO = not determined.
TABLE 2: Excystation rate of sporozoites of Cystoisospora felis from oocysts submited to differentexcytation fluids at 37ºC, following pretreatmente with 2.7% (A) or 5.5% (B) NaClO1.
88
that obtained when trypsin were associated to bovine bile
(90% of excystation in 2 hours).
The greatest activity of trypsin-bile association may
be related to other different enzimes presents in the bile,
once bile itself, without trypsin association gave 73% of
excystation in 2 hours oh incubaion (TABLE 2). By the same
reason, pehaps, the association of trypsin with taurocholic
acid and bovine bile showed the same action as did bovine
bile alone.
Excystation obtained with 2.7% NaClO pretreatment gave
rise to more consistent results, showing that incubation with
EF consisting of 2.5% trypsin plus 10% bovine bile is the
best way for getting Cystoisospora felis sporozoites
excystation.
It is important to point out that the storage
conditions are determinant to excystation of Cystoisospora
felis, as well as other coccidia (CAWTHORN et alli, 1986).
K2Cr2O7, for example, has a deleterious effect on Sarcocystis
cruzi yelding to a decrease of 60% in the excystation rate,
after 2 weeks storage. In these experiments, oocysts
maintened in 2.5% K2Cr2O7 gave rise to, at least, 30%
excystation. By the same way, storages manteined in 1% NaClO
were also affected, giving low rates oh excystation (40% to
50% The Optimum storage conditions were in a sterile saline
solution, free from calcium and magnedium, and added of
antibiotics and fungistatics.
89
R E F E R E N C E S
CAWTHORN, R. J., REDUKER, D. W., SPEER, C. A and DUBEY, J.
P. 1986. In vitro excystation of Sarcocystis caprianis,
S. cruzi and S. tenella. J. Parasitol. 72:880-884.
REDUKER, D. W. and SPEER, C. A. 1985. Factors influencing
excystation in Cryptosporidium oocysts from cattle. J.
Parasitol. 71:112-115.
ROBERTS, W. L., SPEER, C. A. and HAMMOND, D. M. 1970.
Electron and light microscopy studies of the oocysts
walls, sporocysts and excysting sporozoites of Eimeria
callospermophili and E. larimerensis. J. Parasitol. 56:
9 1 8 - 9 2 6 .
SPEER, C. A. 1983. The Coccidia. In: Jensen J. B. (Ed.) "In
vitro" cultivation parasites. J. B. Jensen Ed. CRC Press
Inc., Florida, pp. 1 - 64.
90
APÊNDICE 2.
AVALIAÇÃO DA DIGESTÃO ENZIMÁTICA POR PEPSINA E TRIPSINA NA
OBTENÇÃO DE HIPNOZOÍTAS DE Cytoisospora felis (WENYON, 1926)
FRENKEL, 1977 (APICOMPLEXA: SARCOCYSTIDAE)
RONALD B. FREIRE1 and CARLOS WILSON G. LOPES2
1Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, IV
2Departamento de Parasitologia Animal, IB. Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, KM 47 da Antiga Estrada Rio
São Paulo - 23.851-970, Seropédica- RJ, Brasil. Projeto
Sanidade Animal (EMBRAPA/UFRRJ).
S U M M A R Y
Study of the enzimatic digestion by pepsin and trypsin
were used in order to obtain hipnozoites of Cystoisospora
felis. Hipnozoites of C. felis survived in pepsin, as well in
trypsin solutions, for at least 2 hours. Viability,
integrity, and infectivity were beret mantained when pepsin
were used to digest organs containing the parasite.
91
RUNNING HEAD: FREIRE & LOPES, Avaliations of enzimatic
digestion of Cystoisospora felis.
KEY WORDS: Cystoisospora felis, Hipnozoites, Enzimatics
Digestion, Trypsin Pepsin.
S U M Á R I O
Hipnozoítas de Cystoisospora felis mantiveram-se
viáveis, tanto em solução de tripsina, como em solução de
pepsina, durante pelo menos duas horas. A viabilidade,
integridade e infectividade foram melhor mantidas quando se
utilizou pepsina para a digestão de vísceras contendo o
parasita. A digestão tríptica teve rendimento, em número de
hipnozoítas, sempre inferior àquele observado para pepsina.
PALAVRAS CHAVE: Cystoisospora felis, hipnozoítas, digestão
enzimática, pepsina, tripsina.
FRASE CHAVE: FREIRE & LOPES, Avaliação da digestão
enzimática sobre Cystoisospora felis.
92.
I NTRODUÇÃO
A digestão enzimática de vísceras contendo cistos, de
coccidas, é amplamente utilizada (FAYER & FRENKEL,
1979; BROSIGKE, 1981; SPEER, 1983).
O insucesso em se demonstrar a patogenicidade de
Cystoisospora felis (FAYER & FRENKEL, 1979; BROSIGKE, 1981;
BROSIGKE et alii, 1992), em contraste com os achados clínicos
de LOSS (1991), sugeriram a possibilidade de haver uma ação
deletéria no processo de digestão tríptica, capaz de alterar
as características biológicas (viabilidade e infectividade)
do parasita.
SHARNA & DUBEY (1981), desenvolveram estudo
quantitativo para avaliação da viabilidade e infectividade de
formas císticas de Toxoplasma gondii, através de digestão
péptica ou tríptica. Embora não se tenha detectado nenhuma
alteração em bradizoítas ou traquizoítas de T. gondii
oriundos de digestão péptica, a digestão tríptica foi
responsável por alterações nestas formas parasitárias.
Uma vez que todos os experimentos realizados com
Cystoisospora felis, em sua forma extra-intestinal, foram
oriundos da digestão tríptica de vísceras de hospedeiros
infectados, muitos aspectos não foram devidamente
esclarecidos, provavelmente em decorrência da ação deletéria
do processo de digestão empregado.
93
Neste trabalho procura-se estabelecer o melhor
procedimento a ser utilizado na obtenção de hipnozoítas de
Cystoisospora felis. Para tanto, os processos de digestão
tríptica e péptica foram avaliados comparativamente.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram realizados três experimentos: o primeiro, um
relativo à influência da digestão enzimática na quantidade de
hipnozoítas recuperados à partir de vísceras infectadas
experimentalmente; o segundo, vinculado à viabilidade das
formas parasitárias obtidas através de digestão péptica ou
tríptica; e o terceiro, vinculado à patogenicidade inerente
às formas parasitárias recuperadas.
No primeiro experimento, camundongos foram inoculados,
por via oral, com 107 oocistos esporulados de
Cystoisospora felis e sacrificados no sétimo dia após a
infecção (DPI). Seus baços foram retirados, abertos
longitudinalmente e acondicionados em frascos previamente
esterelizados.
Sobre cada fragmento de baço, adicionou-se 5 ml de
solução isotônica (NaCl 0,85%). Este material foi submetido à
ruptura em homogeneizador Potter (Warren-blender tissue
grinder - USA), originando homogeneizados, os quais foram
9 4
devidamente identificados e acondicionados em ehrlenmeyers
estéreis.
Os ehrlenmeyrs, contendo os homogeneizados, foram
divididos em grupos idênticos e submetidos a um aquecimento
prévio a 37ºC (BANHO - MARIA) durante 15 minutos.
Soluções de digestão, previamente aquecidas a 37ºC,
foram adicionadas aos ehrlenmeyers, os quais foram incubados
a 37ºC durante 120 minutos. As concentrações finais das
soluções de digestão foram as mesmas preconizadas por JACOBS
et alii (1960). Foram realizados controles, constituídos de
igual volume de salina, ao invés de solução enzimática.
Alíquotas de 1 ml foram retiradas de cada frasco, em
intervalos de 30 minutos, durante 120 minutos e processadas
de acordo com metodologia descrita para obtenção e
quantificação de hipnozoítas, por BROSIGKE (1981).
Os experimentos foram realizados com seis repetições,
as quais forneceram um número médio de hipnozoítas,
recuperados por digestão tríptica, em comparação com àqueles
recuperados por digestão péptica.
O segundo experimento foi realizado a partir de
alíquotas obtidas no experimento inicial, as quais foram
processadas de acordo com GEYSEN et alii (1991). A
viabilidade foi calculada pela contagem de células capazes de
incorporar acridina-orange a 0, 1%, visualizadas ao
microscópio de fluorescência.
95
O terceiro experimento consistiu da administração de
hipnozoítas oriundos de cada um dos processos de digestão, a
camundongos, por via oral. Neste caso, os inóculos continham
igual número de formas parasitárias, ajustadas através de
cálculo quantitativo previamente determinado (BROSIGKE,
1 9 8 1) .
Os camundongos inoculados com 1 x 104 parasitas
oriundos de cada um dos processos de digestão enzimática
pertenciam a grupos de 24 animais, os quais foram
sacrificados em lotes de três animais por dia de
experimentação, nos dias 0, 3, 6, 12, 15, 18, 21 e 24, após a
infecção. O número de hipnozoítas provenientes das vísceras
(baço, fígado, linfonodos mesentéricos e placas de Peyer) dos
animais sacrificados, foi calculado em função do processo de
digestão que ofereceu melhor rendimento no primeiro
experimento, de acordo com a metodologia descrita por
BROSIGKE (1981).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A obtenção de hipnozoítas a partir da digestão
enzimática do baço de camundongos infectados com 107
oocistos, por via oral, no 7º DPI, indicou ser a tripsina a
0,5% menos eficiente que a pepsina a 0,52% (TABELA 1).
96
TABELA 1: Quantificação de hipnozoítas de Cystoisospora felisobtidos a partir da digestão péptica ou tríptica deboço de camundongos C57/B6 inoculados com 107
oocistos esporulados.
9 7
A digestão péptica teve um rendimento 1,47 vezes maior
nos primeiros 30 minutos, 2,38 vezes maior aos 60 minutos e,
1,78 vezes maior aos 90 minutos de incubação a 37°C.
Aos 120 minutos de incubação, tanto a tripsina quanto
a pepsina digeriram em demazia os tecidos, não permitindo uma
avaliação adequada da quantidade de hipnozoítas presentes.
A pepsina é uma protease, existente no estômago de
todos os vertebrados (exceto das carpas). Sua atividade
máxima se dá em pH entre 2 e 4, sendo inativada em pH
superior a seis. Esta enzima, preferencialmente, cataliza a
hidrólise de ligações peptídicas entre dois aminoácidos
hidrofóbicos, como fenilalanina-leucina; fenilalanina-
fenilalanina e fenilalanina-tirozina. Com exceção das
protaminas, queratina, mucina e outras proteínas ricas em
carboidratos, a maioria das proteínas é atacada por esta
enzima (JAKUBKE & JESCHKEIT, 1981).
A tripsina é uma protease serínica, presente sob a
forma de zimogênio (tripsinogênio) no pâncreas de todos os
vertebrados. O tripsinogênio é liberado, via ducto
pancreático, no duodeno. A conversão de tripsinogênio em
tripsina se dá no intestino delgado, pela ação da
enteroquinase e de traços de tripsina. Entre todas as
endopeptidases digestivas, a tripsina é a que apresenta a
mais pronunciada especificidade em relação ao substrato,
catalizando a hidrólise das ligações lisina e arginina, bem
9 8
como em arginil ou lisil derivados, assim como as amidas de
lisina e arginina (JAKUBKE & JESCHKEIT, 1981).
Provavelmente, neste experimento, a tripsina tenha
atuado em ligações glicoprotéicas, fundamentais para a
integridade das estruturas parasitárias, o que não ocorreu
com a pepsina que, por sua vez, mantem a integridade de tais
estruturas.
Este mesmo raciocínio pode ser utilizado para uma
análise da presença, ou ausência, da membrana que compõe o
vacúolo parasitóforo, que mostrou-se muito mais frequente
(90%) nas formas parasitárias obtidas por digestão péptica,
quando comparadas com aquelas por digestão tríptica (45%).
A viabilidade mostrou-se bastante pronunciada em ambos
os processos de obtenção de hipnozoítas (entre 90 e 97% para
os dois procedimentos).
Se houve algum processo deletério em função da
digestão tríptica, este não envolveu a viabilidade dos
hipnozoítas recuperados durante o experimento.
A infectividade, por sua vez, foi mais pronunciada nas
preparações decorrentes da diqestão péptica (FIGURA 1).
A contagem de hipnozoítas nas vísceras de animais
inoculados com preparações pépticas, foi sempre superior em
relação àquelas obtidas por digestão tríptica.
Possivelmente, as questões relativas à capacidade de
infecção entre hospedeiros intermediários, através do
carnivorismo, possam ser melhor esclarecidas no futuro, uma
99
FIGURA 1: Infectividade de vísceras contendo Hipinozoítas de
Cystoisospora felis Camundongos C57/B6 e submetidasà digestão por pepsina (+) ou por tripsina (0).
que há controvérsias sobre se este processo se dá até ao
sétimo ou décimo dia após infecção (BROSIGKE, 1981; LOSS,
1991).
A infectividade, assim como a provável sensibilidade a
drogas coccidiostásticas ou coccidicidas, sào fenômenos que
podem ser alterados pela ação tríptica sobre glicoproteínas
de superfície parasitária, capazes de conferir
características biológicas ainda a serem esclarecidas.
SHARMA & DUBEY (1981), encontraram dados semelhantes
para cistos de T. gondii obtidos através de digestão péptica
ou tríptica.
Desta forma, conclui-se que a digestão péptica deve
ser o método de escolha na obtenção, quamtificação e estudos
de biologia de formas intra-teciduais de coccídias.
R E F E R Ê N C I A S
BROSIGKE, S. 1981. Untersuchungen an extraintest inallen
entwicklungstadier) (Dormozoiten) von Cystoisospora rivolta
der Katzen in der Maus. Dissertation zur Erlangung der
Tiermedizirlischen Doktor wurde der Tiera rstlichen, Muchen,
37 p.
BROSIGKE, S.; HEINE, J.; & BOCH, J. 1982. Der Nachweis
extraintestinallen entwicklungstadien (Dormozoiten) in
101
experimentell mit Cystoisospora rivolta oozysten
infizierten Mausen. Klentier Praxis, 27:25-34
FAYER, R. 1980. Epidemiology of protozoan infection: The
coccidia. Vet. Parasitol. 6:75-103,
FAYER, R. & FRENKEL, J. K. 1979. Comparative infectivity for
calves of oocysts of feline coccidia: Besnoitia,
Hammondia, Cystoisospora, Sarcocytis and Toxoplasma. J.
Parasitol. 65:756-762.
GEYSEN, J., AUSMA, J. & VANDEN-BOSSCHE, H. 1991. Simultaneous
purification of merozoites and schizonts of Eimeria
teneIla (Apicomplexa) by percoll flotation and assessment
of cell viability with a double fluorescent dye assay. J.
Parasitol. 77:987-993.
JACOBS, L., REMINGTON, J. S. & MELTON, M. L. 1960. A survey
of meat samples from swine, cattle and sheep for the
presence of encysted Toxoplasma. J. Parasitol. 46:23-28.
JACUBKE, H. D. & JESCHKEIT, 14. 1981. Brockhaus ABC Biochemie,
Editora Berlin, Berlin, 520 p.
LOSS, Z. G. 1991. Cistoisosporose felina. Tese de Doutorado.
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 104 p.
SHARMA, S. P. & DUBEY, J. P. 1981. Quantitative survival of
Toxoplasma gondii tachyzoites and bradyzoites in pepsin
and tripsin solutions, Am. J. Vet. Res. 42:128-130.
1 8 2
APÊNDICE 3.
INFECÇÃO EXPERIMENTAL EM CAMUNDONGOS NEONATOS COM
ESPOROZOÍTAS DE Cystoisospora felis (WENYON, 1926) FRENKEL,
1977 (APICOMPLEXA: SARCOCYSTIDAE)
RONALD B. FREIRE1 CARLOS WILSON G. LOPES2
1Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária, IV
2Departamento de Parasitologia Animal, IB. Universidade
Federal Rural do Rio de Janeiro, KM 47 da Antiga Estrada Rio
São Paulo - 23.851-970, Seropédica - RJ, Brasil. Projeto
Sanidade Animal (EMBRAPA/UFRRJ).
S U M M A R Y
The ability of sporozoites of C. felis to infect
infant mice was examined. One thousand sporozoites were
inoculated intraperitoneally in neonate mice. The resistance
of infant mice to C. felis has been observed during 12 days
following the inoculation. No resistance was observed to C.
felis when macrophages, obtained from resistent adults,
primed with sporozoites, were transferred to these infant
animals by intraperitoneal inoculation.
103
RUNNING HEAD: Experimental infection of Cystoisospora felis
in neonate mice.
KEY WORDS: Cystoisospora felis, neonate mice, sporozoites.
S U M Á R I O
A habilidade de esporozoítas de C. felis em infectar
camundongos neonatos foi estudada. Mil esporozoítas foram
inoculados intraperitonealmente em camundongos de 3 dias de
idade. A resistência dos neonatos à infecção por C. felis foi
acompanhada durante 12 dias a partir da inoculação.
Macrófagos obtidos a partir de adultos previamente infectados
com esporozoítas deste parasita, por via intra-peritoneal,
foram também inoculados em neonatos (via intra-
peritoneal). Não se observou, em nenhum dos casos,
resistência de indivíduos neonatos à C. felis.
PALAVRAS-CHAVE: Camundongos neonatos, Cystoisospora felis,
esporozoítas.
FRASE CHAVE: Infecção experimental em camundongos neonatos
por Cystoisospora felis.
104
INTRODUÇÃO
A cistoisosporose é uma doença espoliativa, capaz de
afetar o gato e camundongos, além de outros hospedeiros
potenciais (BROSIGKE et alii, 1982; LOSS, 1991).
Embora os efeitos da infecção por Cystoisospora tenham
sido amplamente estudados (BROSIGKE, 1981), nunca se fez
qualquer experimentação no sentido de avaliar os efeitos da
cistoisosporose em camundongos neonatos.
Uma vez que as infecções por Cystoisospora felis e
Cystoisospora rivolta apresentam uma tendência à cronificação
em indivíduos adultos (FAYER, 1980; BROSIGKE, 1981), é de se
esperar que efeitos mais significativos se manifestem em
neonatos e imunodeficientes, a exemplo do que ocorre com
outros coccidias (HARP & WITMIRE, 1991).
No presente trabalho, procurou-se estabelecer
infecções experimentais em camundongos, com 3 dias de idade.
A resistência à infecção por esporozoítas livres, ou
contidos em macrófagos peritoneais, oriundos de animais
adultos, foi estudada durante 12 dias.
105
MATERIAIS E MÉTODOS
Esporozoítas de C. felis, obtidos de acordo com a
metodologia descrita por BURGESS et alii (1988) para
Sarcocystis cruzi, foram inoculados em um lote de 14
camundongos, por via intraperitoneal
Os inóculos consistiram de 103 esporozoítas, contidos
em 0,2 ml de solução salina isotônica, aplicados abaixo do
cordão lácteo dos aniamais neonatos.
Macrófagos peritoneais, obtidos através de "lavados" em
animais adultos, da mesma linhagem, foram igualmente
inoculados em um lote de 12 camundongos neonatos, com 3 dias
de nascidos.
Os camundongos adultos, doadores de fagócitos
peritoneais, foram previamente (2 dias antes), inoculados com
103 esporozoítas de C. felis.
Os fagócitos foram retirados assépticamente, de acordo
com a metodologia descrita por GOYAL et alli (1988).
A sobrevida dos neonatos inoculatos foi acompanhada
diariamente, durante 12 dias.
Ambos os lotes de camundongos foram mantidos com as
respectivas progenitoras.
Um Grupo (lote) de camundongos neonatos foi inoculado
intraperitonealmente com diluente (solução isotônica) e
igualmente observado durante 12 dias (controle).
106
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pela primeira vez, demonstrou-se a patogenicidade de
Cystoisospora felis para camundongos.
Todos os camundongos neonatos inoculados com
esporozoítas ou macrófagos contendo formas intracelurares de
C. felis morreram, indicando haver uma ação lesiva deste
protozoário sobre roedores, como sugeriu LOSS (1991).
O grupo de animais inoculados com esporozoítas livres
despareceu no decorrer dos quatro dias que se seguiram à
inoculação (TABELA 1). Os animais que foram inoculados com
lavado peritoneal faleceram entre o sétimo dia e o décimo
segundo dias após a inoculação. Nenhum efeito deletério foi
visualizado no grupo de animais controles. Quando possível,
fez-se necrópsia e digestão enzimática (SHARMA & DUBEY, 1991)
das vísceras, no sentido de se tentar identificar
• ) • hipnozoítas, sendo que em todas as tentativas realizadas,
encontrou-se hipnozoítas, principalmente local izadas no
fígado dos neonatos inoculados.
A maior sob revida dos animais recebendo lavado
peritoneal, sugere uma possível transferência de imunidade a
partir dos adultos, uma vez que, juntamente com os fagócitos,
outras células e mediadores são transferidos (HARP & WITMIRE,
1991).
i@7
TABELA 1 : Sobrevida de camundongos C57/B6, neonatos, àinoculação de 103 esporozoítas de Cystoisosporafelis ou 106 fagócitos peritoneais oriundos decamundongos adultos previamente inoculados com 103
esporozoítas.
108
É possível que a infecção à partir dos fagócitos
transferidos passivamente da fêmea para suas crias seja a
principal via de contágio, entre felinos, para o
estabelecimento das infecções naturais por Cystoisospora.
A morte dos neonatos inoculados representa um
importante dado sobre Cistososporose, caracterizando-a como
uma doença típica de animais neonatos, além de reforçar a
possível ação deletéria sobre espécies animais passíveis de
se infectar com C. felis.
R E F E R Ê N C I A S
BROSIGKE, S. 1981. Unter suchungen an exttaintestinallen
entwicklungstadien (Dormozoiten) von Cystoisospora rivolta
der Katzen in der Maus. Dissertation zur Erlangung der
Tiermedizinischen Doktor wurde der Tierarstlichen, Muchen,
37 p.
BROSIGKE, S., HEINE, J. & BOCH, J. 1982 Der Nachweis
extraintestinallen entwicklungstadien (Dormozoiten) in
experimental mit Cystoisospora rivolta oozysten
infizierten Mausen. Kleiter Praxis, 27:25-34.
BURGES, D. E., SPEER, C. A. & REDUKER, D. W. 1988.
Identification of antigens of Sarcocystis cruzi
sporozoites, and bradizoites with monoclonal antibodies.
J. Parasitol 74:828-832.
109
FAYER, R. 1980. Epidemiology of protozoan infection: The
coccida. Vet. Parasitol. 6:73-103.
GOYAL, M., GANGULY, N. K. & MAHAJAN, R. C. 1988 Cytotoxic
activity of monocytes against Toxoplasma gondii in acute
and reactivated murine toxoplasmosis. Med. Microbiol.
Immunol., 177; 339-248.
NARP, J. A. & WHITMIRE, W. M. 1991. Cryptosporidium parvum
INFECTION IN MICE: Inability of Lynphoid cells
supernatants to transfer protection from resistant adults
to susceptible infants. J. Parasitol., 77:170-172.
LOSS, Z. G. 1991. Cistoisosporose felina. Tese de
Doutoramento, Universidade Federal Rural do Rio de
Janeiro, 104p.
SHARMA, S. F. & DUBEY, J. P. 1981. Quantitative survival of
Toxoplasma gondii tachyzoites and bradyzoites in pepsin
and trypsin solutions. AM. J. Vet. Res., 42:128-130.
