Efeito do 6- benzilaminopurina (BAP) e do ácido ... · 1 Doutoranda do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, ... Mini-Campus, Aleixo-Manaus, AM, 69077-000. * [email protected]

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Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.10, n.1, p.76-81, 2008.

Recebido para publicação em 27/11/2006Aceito para publicação em 04/04/2007

Efeito do 6- benzilaminopurina (BAP) e do ácido indolacético (AIA) na propagação invitro da caapeba [Pothomorphe peltata (L.) Miq.]

SCHWERTNER, A.B.S.1*; NAGAO, E.O.2; HIDALGO, A.F.2; ZAFFARI, G.R.31 Doutoranda do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Av. Gen.Rodrigo Otávio Jordão Ramos, 300, Mini-Campus, Aleixo-Manaus, AM, 69077-000. * [email protected] Professor do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, UFAM, Av. Gen. Rodrigo Otávio Jordão Ramos,300, Mini-Campus, Aleixo - Manaus, AM, 69077-000. E-mails: [email protected], [email protected]. 3Professor do curso de Ciências Biológicas/Biotecnologia da Universidade do Vale do Itajaí – UNIVALI/Epagri,Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, Rua Uruguai, 458, caixa postal 360. Itajaí, SC, 88302-202. E-mail:[email protected].

RESUMO: Caapeba ou pariparoba é um arbusto considerado medicinal pelas populaçõestradicionais da Região Amazônica e é utilizado no tratamento de inflamação, dor, infecções,úlceras, hepatite, leishmaniose e malária. Estudos comprovam que diferentes extratos de folhasde Pothomorphe peltata apresentam atividade antioxidante, antiinflamatória, antimalárica e inibitóriacontra HIV-I. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diversas concentrações do 6-benzilaminopurina (BAP) e do ácido indolacético (AIA), na regeneração in vitro de brotos a partirde folhas de P. peltata. Sementes foram desinfestadas com etanol e hipoclorito de sódio egerminadas in vitro em meio de cultura MS. Das plantas in vitro com 60 dias de idade, foramexcisatas folhas e inoculadas em meio MS suplementado ou não com BAP e AIA. A respostamorfogenética de folhas usadas como explantes resultou na proliferação de brotos adventíciospor organogênese direta em todos os meios de cultura MS, acrescidos ou não dos reguladoresde crescimento. O melhor tratamento para a proliferação de brotos foi com meio de cultura MSadicionado de 0,5 mg L-1 de BAP. Os brotos separados, inoculados e mantidos por 30 dias emmeio MS isento de reguladores de crescimento apresentaram 100% de enraizamento.

Palavras-chave: Pothomorphe peltata, micropropagação, reguladores de crescimento, plantamedicinal

ABSTRACT: Effect of 6-benzylaminopurine (BAP) and indole-3-acetic acid (IAA) on invitro propagation of caapeba [Pothomorphe peltata (L.) Miq.]. Caapeba or pariparoba is asmall shrub used in traditional medicine for treating inflammation, pain, infections, ulcers, hepatitis,leishmaniasis and malaria in different locations in the Amazon region. Recent studies on leafextracts revealed that this plant has a high antioxidant activity, antiinflammatory, antimalarial andinhibitory activity against HIV-I. The objective of this work was to evaluate the effect of differentconcentrations of the 6-benzylaminopurine (BAP) and indole-3-acetic acid (IAA) on in vitroregeneration of shoots from leaf explants. Seeds were disinfested and inoculated on a solid MSmedium. After 60 days, this leaf explants were removed from seedlings, and inoculated on solidMS medium supplemented with various concentrations of growth regulators (BAP and IAA). Thegrowth and development were evaluated 45 days after inoculation. Shoots were formed from leaveson all types of medium. The MS medium supplemented with 0.5 mg L-1 of BAP presented a highershoot proliferation. Plantlets mainteined for 30 days on MS medium without growth regulatorsshowed 100% rooting.

Key words: Pothomorphe peltata, micropropagation, growth regulators, mediicinal plant

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INTRODUÇÃOAs piperáceas têm sido alvo de muitas

pesquisas devido às características importantes queincluem a utilização na área alimentar, de fármacos,de cosméticos e perfumaria (Lemos, 2003; Silva &Oliveira, 2000). Pothomorphe peltata (L.) Miq.(Piperaceae), é um arbusto popularmente conhecidocomo caapeba ou pariparoba utilizadotradicionalmente em vários locais da RegiãoAmazônica no tratamento de inflamação (Di Stasi etal., 1994; Desmarchelier et al., 1996), dores hepáticas(Braga, 1976; Van Den Berg, 1993), infecções eúlceras (Desmarchelier et al., 1995; Desmarchelieret al., 1996), e malária (Adami et al., 1998). Estudostêm demonstrado que diferentes extratos de folhasP. peltata exercem significante atividade antioxidante(Desmarchelier et al., 1997a e b), antiinflamatória(Desmarchelier et al., 2000), antimalárica (Sala-Netoet al., 1992; Adami et al., 1998), inibitória contra HIV-I(Gustafson et al., 1992) e apresenta citotoxidadecontra células tumorais em proliferação (Mongelli etal., 1999), inibindo também o crescimento celulardessas células (Pinto, 2002).

Particularmente, em biotecnologia vegetal autilização de técnicas de cultura de tecidos como amicropropagação possibilitou a multiplicação demuitas espécies medicinais, assim como algumaspiperáceas já estabelecidas in vitro: Piper nigrum(Mathews & Rao, 1984; Philip et al.,1992); P. longume P. betle (Bhat et al., 1995); Piper hispidinervium(Pescador et al., 2000) e Pothomorphe umbellata(Viana et al., 2000; Pereira et al., 2000). As mudassão produzidas em larga escala, com qualidadesuperior, sem destruir a planta-mãe. As plantasobtidas são fáceis de transportar para diversos paísessem preocupações com introdução de novas doenças.

Neste trabalho, estudaram-se os efeitos dediferentes concentrações de 6-benzilaminopurina e3-ácido indolacético (AIA) na proliferação de brotosregenerados a partir de folhas de Pothomorphe peltatacultivadas in vitro.

MATERIAL E MÉTODO

Desinfestação de sementes de P. peltataAs sementes foram obtidas a partir de

espigas, coletadas no mês de setembro (época deseca), de plantas localizadas no Mini-campus BlocoV, da Faculdade de Ciências Agrárias (FCA) e daUFAM em beira de mata, nas coordenadasgeográficas 03° 05' 59.5" S e 059° 58' 36.3" W.

As espigas foram lavadas em água correntee detergente neutro. Foram retiradas sementes daparte mediana da espiga e tratadas com soluçãoBenomil 0,1% durante dezesseis horas. Em câmarade fluxo laminar (CFL) as sementes foram lavadas

em água destilada esterilizada e imersas em etanol70% em três tempos (1, 3 e 5 minutos) e em doistempos de imersão ao hipoclorito de sódio 0,9% (15e 30 minutos), num fatorial 3x2. Em seguida, assementes foram lavadas e secas em placas de Petri,contendo papel de filtro esterilizado, e inoculadas emmeio de cultura Murashige & Skoog (1962) (MS)contido em placa de Petri. Cada tratamento foiconstituído por 4 repetições sendo cada repetiçãocomposta de 4 placas de Petri contendo de 50 a 100sementes. As culturas foram mantidas em sala decrescimento com temperatura de 25 ± 20C, emfotoperíodo de 16 horas com intensidade de luz cercade 40 mmol cm-2 s-1.

A cada trinta dias após a germinação asplântulas foram transferidas para novo meio de culturaMS para crescimento e desenvolvimento.

Regeneração de brotos a partir de folhasde P. peltata

Plântulas in vitro com 60 dias de idade,serviram como fontes de explantes. Folhas com 1cm de tamanho (sem pecíolo) foram inoculadas emmeio Murashige & Skoog (1962), adicionado de 3%de sacarose e 0,9% de ágar, e suplementado comdiferentes concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,5; 3,0;5,0 mg L-1) e AIA (0,0; 0,5; 1,5; 3,0 mg L-1).

O delineamento experimental foi em blocoscasualizados, num fatorial de 4x5, com quatroconcentrações de AIA e cinco concentrações de BAPtotalizando 20 tratamentos, com 4 repetições portratamento.

Aos 45 dias após a inoculação foramavaliados: número e tamanho dos brotos, número defolhas e de raízes. Os dados obtidos foramsubmetidos à análise de variância e as médias foramcomparadas pelo teste de Tukey ao nível designificância de 5% no sistema de análise estatísticaSANEST®.

RESULTADO E DISCUSSÃO

Desinfestação de sementes de P. peltataO tratamento de desinfestação de sementes

mais eficiente foi o de imersão em etanol 70% (5min) e em hipoclorito de sódio 0,9% (30 min). Durantetodo o ensaio a maior incidência de contaminação foipor fungos do gênero Fusarium, patógenos estes decomum incidência em outras piperáceas como Pipernigrum (Lemos, 2003).

Regeneração de brotos a partir de folhasde P. peltata

De acordo com o resumo da análise devariância os tratamentos com apenas BAP adicionadoao meio de cultura apresentaram diferenças

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significativas para todos os itens analisados (Tabela 1).Os melhores resultados para o número médio debrotos e número médio de folhas foram obtidos comfolhas inoculadas em meio MS adicionado de 0,5;1,5 e 3,0 mg L-1 do regulador de crescimento BAP(Tabela 2 e Figura 1). No entanto, a regeneração debrotações adventícias a partir de folhas de P. peltatafoi induzida por todas as combinações dosreguladores de crescimento BAP e AIA adicionadasao meio de cultura MS, e ainda em menor grau emmeio de cultura MS isento de reguladores decrescimento.

A regeneração de brotações adventícias foipor organogênse direta e muito similar ao que foidescrito por Pereira et al. (2000) em segmentos defolhas de P. umbellata. Aos 45 dias da cultura foiobservada a presença de pelo menos uma folha emcada broto (Figura 1).

Verificou-se a regeneração de brotosadventícios a partir de folhas em meio MS isento de

TABELA 1. Resumo da análise de variância dos tratamentos de proliferação com BAPxAIA referente ao número etamanho de brotos, número de folhas e de raízes regenerados de folhas de Pothomorphe peltata cultivadas in vitro.UFAM, Manaus. 2005.

Q. M. Causas da variação G. L. Número

de brotos Tamanho dos brotos

Número de folhas

Número de raízes

BAP 4 5,20** 0,02 ** 3,23 ** 14,13 **

AIA 3 0,27 NS 0,01 ** 0,36 NS 0,06 NS

BAPxAIA 12 0,3 NS 0,00 ** 0,41 NS 0,11 NS

Blocos 3 - - - -

Resíduo 57 0,23 0,00 0,27 0,05

Média Geral 2,31 1,14 2,45 1,48

C.V 5,94% 2,99 % 21,13% 14,51%

TABELA 2. Efeito do BAP sobre o número médio de brotos, de folhas e de raízes regenerados a partir de folhas dePothomorphe peltata cultivadas in vitro. UFAM, Manaus. 2005.

Número de brotos Número de folhas Número de raízes Níveis de BAP (mg L-1)

Médias originais Médias originais Médias originais

0 1,963 c 2,831 d 9,091 a

0,5 8,772 a 8,243 a 0,189 b

1,5 7,379 ab 6,376 ab 0,210 b

3,0 8,391 ab 5,431 bc 0,054 b

5,00 5,805 b 3,276 cd 0,100 b

Médias com letras iguais: os tratamentos não diferem significativamente ao nível de 5% pelo teste de Tukey.

** Significativo ao nível de 1% NS Não significativo

reguladores de crescimento, principalmente nasáreas correspondentes as nervuras próximas àinserção do pecíolo (Figura 1A), porém, o númeromédio de brotos formados foi dependente apenas dapresença de BAP. Pereira et al. (2000) verificaramque a regeneração de brotos adventícios em P.umbellata foi dependente de 6-benziladenina e ácidonaftalenoacético verificando também que emexplantes foliares, com 1 cm2 de tamanho, inoculadosem meio de cultura com apenas um dos reguladoresde crescimento não ocorreu a indução deorganogênese. Estas diferentes respostasmorfogenéticas podem estar relacionadas ao tipo deexplante utilizado. Diferente de Pereira et al. (2000),neste trabalho foram usadas folhas sem pecíolo comoexplantes. Considerando o grande potencial deregeneração de explantes de pecíolo de Pipercolubrinum (Kelkar & Krishnamurthy,1998) e da basede folha de Piper longum (Soniya & Das, 2002), foiconstatado que a presença de tecidos que formam

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as nervuras próximas à área de inserção do pecíolonos explantes utilizados, produziu um maior potencialmorfogenético nas respostas aos meios de cultura,principalmente nos explantes inoculados em meioMS isento de reguladores de crescimento.

Quanto ao número médio de raízes houvediferenças significativas entre os tratamentos. Omelhor resultado foi observado em folhas inoculadasem meio com ausência de reguladores decrescimento (Figura 1A). Porém algumas folhasinoculadas em meio MS adicionado de AIAregeneraram raízes independentemente dos brotos,mas os brotos regenerados também emitiram raízes(Figura 1B-D). Pereira et al. (2000) tambémobservaram a formação de raízes independentementedos brotos em meio MS adicionado de diversasconcentrações de ácido naftalenoacético e 6-benziladenina.

Para o tamanho médio dos brotos houveinteração entre os diferentes tratamentos com ambosreguladores de crescimento, as médias comparadasconstam na Tabela 3. Foi observado que nas folhasinoculadas em meio de cultura com ausência de

FIGURA 1. Regeneração de brotações adventícias de Pothomorphe peltata a partir de folhas inoculadas em meiode cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) com 3-ácido indolacético (AIA) Regeneração de brotações adventíciasde Pothomorphe peltata a partir de folhas inoculadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) com 3-ácido indolacético (AIA) ou 6-benzilaminopurina (BAP). UFAM, Manaus. 2005. Letras correspondentes a diferentestratamentos. (A) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS. (B) Brotos e raízes formados da base dafolha em meio MS com 0,5 mg L-1 de AIA. (C) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS com 1,5 mgL-1 de AIA. (D) Brotos e raízes formados da base da folha em meio MS com 3,0 mg L-1 de AIA. (E) Brotos formadosem meio MS com 0,5 mg L-1 de BAP. (F) Brotos formados em meio MS com 1,5 mg L-1 de BAP. (G) Brotosformados em meio MS com 3,0 mg L-1 de BAP. (H) Brotos formados em meio MS com 5,0 mg L-1 de BAP.

reguladores de crescimento o tamanho médio dosbrotos foi maior (0,6 cm), quando comparado aosoutros tratamentos (Tabela 3). Entre os tratamentoscom a presença de reguladores, os brotosregenerados em meio de cultura MS com 0,5 e 1,5mg L-1 de AIA apresentaram o tamanho médio dosbrotos significativamente maior quando comparadosaos brotos regenerados em meio de cultura MScontendo BAP ou ambos os reguladores decrescimento. Entretanto, o tamanho médio dessesbrotos foi menor que 0,5 cm conforme o observadotambém por Pereira et al. (2000).

CONCLUSÃOOs agentes desinfestantes etanol 70% e

hipoclorito de sódio 0,9% foram eficientes nadesinfestação superficial das sementes dePothomorphe peltata.

A presença de reguladores de crescimentopromoveu o processo de morfogênese de brotaçõesadventícias a partir de folhas de P. peltata obtida pormeio da organogênese direta.

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TABELA 3. Interação para os níveis de BAP x AIA referente ao tamanho médio dos brotos regenerados a partir defolhas de Pothomorphe peltata cultivadas in vitro. UFAM, Manaus. 2005.

AIA (mg L-1) BAP (mg L-1)

0 0,5 1,5 3,0 Médias de BAP

0 0,611 A a 0,414 A b 0,442 A b 0,227 A c 0,424 a

0,5 0,302 B a 0,297 AB a 0,277 B a 0,225 A a 0,275 b

1,5 0,270 B a 0,317 AB a 0,314 AB a 0,210 A a 0,278 b

3 0,235 B a 0,264 AB a 0,252 B a 0,267 A a 0,255 b

5 0,240 B a 0,235 B a 0,230 B a 0,232 A a 0,234 b

Médias de AIA 0,332 A 0,305 A 0,303 A 0,232 B

Na vertical, colunas referentes ao AIA: para letras maiúsculas iguais, os tratamentos não diferem significativamente.Na horizontal, linhas referentes ao BAP: para letras minúsculas iguais, os tratamentos não diferem significativamente.Nível de significância de 5% pelo teste de Tukey.

A adição de BAP ao meio MS induziu maiornúmero médio de brotos adventícios em folhas de P.peltata. Entretanto, o BAP inibiu o crescimento edesenvolvimento dos brotos, os quais apresentarammenor tamanho se comparados aos brotosproliferados em meio MS isento de reguladores decrescimento ou adicionado de AIA.

AGRADECIMENTOAos professores da Universidade Federal do

Amazonas e da Universidade do Vale do Itajaí pelaorientação e colaboração no Mestrado. À Fundaçãode Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas peloapoio financeiro.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ADAMI, Y.L. et al. In vitro antimalarial activity of crudeextracts of Pothomorphe peltata and P. umbellata(Piperaceae). Tropical Medicine, v.40, p.91-4, 1998.BRAGA, R. Plantas do Nordeste, especialmente doCeará. 3.ed. Mossoró: Coleção Mossoerense, 1976.540p.BHAT, S.R.; CHANDEL, K.P.S.; MALIK, S.K. Plantregeneration from various explants of cultivated Piperspecies. Plant Cell Reports, v.14, n.6, p.398-402, 1995.DESMARCHELIER, C. et al. Etnobotanica y bioactividadde plantas medicinales utilizadas por un grupo indígenaTakana de la Amazonía peruana. Acta FarmaceuticaBonaerense, v.14, p.195-208, 1995.DESMARCHELIER, C. et al. Ritual and medicinal plantsof the Eseíejas of the Amazonian rainforest (Madre deDios, Perÿ). Journal of Ethnopharmacology, v.52, p.45-51, 1996.DESMARCHELIER, C. et al. 4-Nerolidylcatechol fromPothomorphe spp. scavenges peroxyl radicals and

inhibits Fe(II)-dependent DNA damage. Planta Medica,v.63, n.6, p.561-3, 1997a.DESMARCHELIER, C. et al. Inhibition of lipid peroxidationand iron (II)-dependent DNA damage by extracts ofPothomorphe peltata (L.) Miq. Brazilian Journal ofMedical and Biological Research, n.30, p.85-91, 1997b.DESMARCHELIER, C.; SLOWING, K.; CICCIA, G. Anti-inflammatory activity of Pothomorphe peltata leafmethanol extract. Fitoterapia, v.71, n.5, p.556-8, 2000.DI STASI, L.C. et al. Medicinal plants popularly used inBrazilian Amazon. Fitoterapia, v.65, p.529-40, 1994.GUSTAFSON, K.R. et al. The peltatols, novel HIV-inhibitorycatechol derivatives from Pothomorphe peltata. Journalof Organic Chemistry, v.57, p.2809-11, 1992.KELKAR, S.M.; KRISHNAMURTHY, K.V. Adventitious shootregeneration from root, internode, petiole and leafexplants of Piper colubrinum Link. Plant Cell Reports,v.17, p.721-5, 1998.LEMOS, O.F. Mutagênese e tecnologia in vitro nomelhoramento genético da pimenta-do-reino (Pipernigrum L.). 2003. 159 p. Tese (Génética e Melhoramentode Plantas)-Escola Superior de Agronomia Luiz deQueiroz - Universidade de São Paulo, Piracicaba.MATHEWS H.V.; RAO, P.S. In vitro responses of black pepper(Piper nigrum). Current Science, v.53, p.183-6, 1984.MONGELLI, E. et al. Cytotoxic 4-nerolidylcatechol fromPothomorphe peltata inhibits topoisomerase I activity.Planta Medica, v.65, n.4, p.376-8, 1999.MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapidgrowth and bioassays with tobacco tissue culture.Physiologia Plantarum, v.15, p.473-97, 1962.PEREIRA, A.M.S. et al. Micropropagation of Pothomorpheumbellata via direct organogenesis from leaf explants.Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.60, p.47-53, 2000.PESCADOR, R. et al. Biotecnologia da Piperhispidinervium - Pimenta Longa. Protocolos paraobtenção de Safrol. Revista Biotecnologia, Ciência &Desenvolvimento, v.15, p.18-23, 2000.PHILIP, V.J. et al. Micropropagation of black pepper (Pipernigrum L.) through shoot tip cultures. Plant Cell Report,v.12, p.41-4, 1992.

81


PINTO, A.C.S. Estudo fitoquímico e biológico dePothomorphe peltata (L.) Miquel (Piperaceae). 2002.159p. Dissertação (Mestrado-Área de Concentração emQuímica de Recursos Naturais)-Departamento deQuímica, Universidade Federal do Amazonas, Manaus.SALA-NETO, F. et al. Uma nova metodologia paraavaliação da atividade Antimalárica de ProdutosVegetais: Aplicação ao Estudo de 83 Espécies da FloraBrasileira. Anais do 2º Simpósio de Malária. Revista daSociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.25, supl.2, p.92, 1992.SILVA, A.C.P.R.; OLIVEIRA, M.N. Caracterização botânicae química de três espécies do gênero Piper no Acre. Rio

Branco: Embrapa Acre, 2000. 13p. (Boletim de Pesquisa,23).SONIYA, E.V.; DAS, M.R. In vitro micropropagation of Piperlongum – an important medicinal plant. Plant Cell, Tissueand Organ Culture, v.70, p.325-7, 2002.VAN DEN BERG, M.E. Piperaceae. In: VAN DEN BERG,M.E. Plantas medicinais na Amazônia: contribuição aoseu conhecimento sistemático. 2. ed. Belém: PR/MCT/CNPq, 1993. p.58-133.VIANA, V.R.C. et al. Propagação in vitro de Pothomorpheumbellata para obtenção de clones produtores de 4-nerolidilcatecol. Revista Brasileira de Farmacologia,v.81, n.1/2, p. 43-7, 2000.

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