INSTITUTO DE ENSINO E PESQUISA DA SANTA CASA DE BELO HORIZONTE Núcleo de Pós Graduação e Pesquisa

Efeito dos estímulos adrenérgico e colinérgico na produção de

espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e fagocitose por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2

Pollyanna Stephanie Gomes

Belo Horizonte Fevereiro/2013

2

POLLYANNA STEPHANIE GOMES

Efeito dos estímulos adrenérgico e colinérgico na produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e fagocitose por

granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2

Dissertação apresentada ao programa de Pós

Graduação em medicina e biomedicina do

Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa

de Belo Horizonte, como requisito parcial para

obtenção do título de mestre em biomedicina.

Orientador: Dr. José Augusto Nogueira

Machado

BELO HORIZONTE

Fevereiro/2013

3

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente ao prof. Dr. José Augusto por tudo que fez por mim,

pela orientação, disponibilidade, paciência e ensinamento. Por ter permitido extrair

seus conhecimentos e por me fazer ser uma profissional melhor!

As amigas queridas de laboratório Kelzinha, Nanda, Carol, Paulinha, Luh,

Elisa e Fabi, por todo apoio, conversas impagáveis e por toda amizade dedicada.

À todos dos laboratórios vizinhos pela disponibilidade, ajuda e empréstimo de

aparelhos.

Ás minhas amigas queridas Kelly e Raquel que mesmo com a distância fazem

parte da minha vida. Amo vocês!

Aos colegas da faculdade Pitágoras!

Aos professores da graduação que foram alicerces importantes na minha

jornada acadêmica. Em especial a profa. Christiane Contigli e ao Xavier Prous, que

foram extremamente importantes e decisivos pra que eu continuasse a minha

jornada.

Aos professores da Pós Graduação, pelos ensinamentos em todos os

momentos.

Às secretárias da Pós Graduação, Shirley, Zélia e Mariana pela colaboração e

paciência.

A todos os doadores de sangue, diabéticos e não diabéticos.

Aos participantes da banca examinadora, por aceitarem o convite e pela

dedicação.

Aos órgãos financiadores, CAPES, FAPEMIG e CNPq.

Aos familiares, pelo apoio e por todos os momentos de alegria.

À Deus por estar sempre ao meu lado, por me permitir enxergar o melhor lado

das coisas, por guiar meus passos, por permitir que eu seja um ser humano melhor

a cada dia e não fazer com que eu perca a fé...

Obrigada!

4

“Eu sou é eu mesmo.

Divêrjo de todo o mundo.

Eu quase que nada sei.

Mas desconfio de muita coisa...”

Guimarães Rosa “Grande Sertão: Veredas”

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RESUMO

No presente trabalho avaliamos o efeito da catecolamina (adrenalina),

neurotransmissor (acetilcolina) e de nucleotídeos cíclicos (AMPc e GMPc) em

granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2 (DM2) e seus controles não diabéticos

(ND). Estudou-se as respostas oxidante (ROS e RNS), antioxidante redutora

(redução de MTT) e fagocitose de partículas opsonizadas. A produção de ROS foi

avaliada pelo teste de quimiluminescência, a dosagem de óxido nítrico foi

mensurada pela reação de Griess e o potencial redutor (antioxidante) foi avaliado

pela técnica da redução do sal tetrazólio MTT. Nossos resultados demonstraram que

na presença de adrenalina, houve interferência na função de granulócitos, inibindo a

produção de ROS, tanto nas células em repouso quanto durante processo fagocítico

(modulação negativa da fagocitose). Estes resultados foram similares tanto em DM2,

quanto em ND. Ao contrário, a carbamilcolina (acetilcolina) não teve efeito

significativo na produção de ROS ou fagocitose em ND (p>0,05), mas ativou

significativamente ambos os processos em granulócitos de DM2 (p<0,05). Para

avaliar o efeito da ativação adrenérgica e colinérgica, testamos os segundos

mensageiros (nucleotídeos cíclicos AMP e GMP) como efetores prontos por serem

mediadores intracelulares das respostas adrenérgica e colinérgica, respectivamente,

devido à ativação adrenérgica pela adrenalina ou colinérgica pela acetilcolina. Os

resultados com AMPc e GMPc não mimetizaram os dados previamente obtidos com

adrenalina e acetilcolina. Nestes experimentos observamos que AMPc ativa

granulócitos de DM2, ao contrário da adrenalina e que o GMPc ativou tanto DM2

quanto ND. Desta forma podemos concluir com os nossos resultados, que ativação

adrenérgica ou colinérgica pode interferir com a resposta imune inata e que

granulócitos de DM2 apresentam respostas distintas em relação a indivíduos

saudáveis, possivelmente como resultado de adaptação de sinalização metabólica

induzida pela hiperglicemia.

Palavras Chave: Adrenalina, carbamilcolina, diabetes tipo 2, granulócitos, óxido

nítrico, nucleotídeos cíclicos e fagocitose.

6

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Vias de modulação neural da inflamação.

Figura 2: Espécies reativas de nitrogênio.

Figura 3: Representação esquemática do sistema NADPH oxidase.

Figura 4: Curva dose-resposta adrenalina.

Figura 5: Curva dose-resposta carbamilcolina.

Figura 6: Avaliação da produção de ROS em granulócitos em meio contendo

Adrenalina 1000nM.

Figura 7: Avaliação da produção de ROS em granulócitos em meio contendo

Carbamilcolina 1000nM.

Figura 8: Avaliação da produção de ROS expresso em mediana por granulócitos em

meio contendo Adrenalina 1000nM e AMPc 10-4.

Figura 9: Avaliação da produção de ROS em granulócitos em meio contendo

Carbamilcolina 1000nM e GMPc 10-4.

Figura 10: Produção de óxido nítrico.

Figura 11: Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob

estímulo adrenérgico e ZC3b.

Figura 12: Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob

estímulo colinérgico e ZC3b.

7

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.

Tabela 2: Características clínicas e bioquímicas da população em estudo.

Tabela 3: Efeito do estímulo adrenérgico e colinérgico em granulócitos não ativados

de DM2.

Tabela 4: Produção de ROS e RNS por granulócitos de ND e DM2. Índice de

predisposição inflamatória.

8

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Interação entre os sistemas nervoso, imune e endócrino.

Esquema 2: Obtenção de granulócitos.

9

LISTA DE ABREVIATURAS

ADA: American Diabetes Association

AC: adenilato ciclase

ADRE: Adrenalina

AMPc: 3’:5’- adenosina monofosfato cíclico

CARB: Carbamilcolina

CEPCEM : Centro de Estudos e Pesquisas em Endocrinologia e Metabologia

DM2: diabetes tipo 2

EP: erro padrão

GMPc: 3’:5’- guanosina monofosfato cíclico

HbA1c (%): hemoglobina glicada

IMC: índice de massa corpórea

Kg/m2: kilogramas por metro quadrado

KH2PO4 = fosfato de potássio monobásico

mg/dL: miligramas/decilitro

MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difenil-tetrazolium

n = número de amostras

Na2HPO4 = fosfato de sódio bibásico anidro

NaCl = cloreto de sódio

NADPH: nicotamida adenina dinucleotídeo fosfato

ND: Não diabético

NOS: óxido nítrico sintase

NS: não significativo

PBS: tampão fosfato salino

PKC: proteína cinase C

PLC: Fosfolipase C

RNS: espécies reativas de nitrogênio

ROS: espécies reativas de oxigênio

SNA: Sistema Nervoso Autônomo

SC-BH: Santa Casa de Belo Horizonte

SI: Sistema Imune

SN: Sistema Nervoso

SNC: Sistema Nervoso Central

10

ZC3b: Zymosan opsonizado com fragmentos C3b

11

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 12

1.1 A Cooperação Sistema Nervoso – Sistema Imune: Hipóteses e Evidências12

1.2 Mediadores Neuroimunes ............................................................................ 15

1.2.1 Catecolaminas .............................................................................................. 15

1.2.2 Nucleotídeo cíclico - AMPc: 3’:5’- adenosina monofosfato cíclico ................ 16

1.2.3 Neurotransmissor Colinérgico (Acetilcolina) ................................................. 16

1.2.4 Nucleotídeo cíclico - GMPc: 3’:5’- guanosina monofosfato cíclico ................ 17

1.3 Diabetes e o estresse oxidativo ................................................................... 17

2 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 21

3 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 22

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 22

4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 23

4.1 Pacientes ..................................................................................................... 23

4.2 Coleta de sangue ......................................................................................... 23

4.2.1 Obtenção de granulócitos ............................................................................. 24

4.2.2 Teste de viabilidade celular: incorporação de Azul de Trypan ...................... 25

4.3 Ensaio de quimiluminescência dependente de luminol: Quantificação das espécies reativas de oxigênio (ROS) ........................................................................ 25

4.4 Reagentes e soluções .................................................................................. 26

4.5 Produção de Óxido nítrico ............................................................................ 27

4.6 Opsonização de Zymosan ............................................................................ 28

4.7 Redução do sal tretrazólio (MTT) ................................................................. 28

4.8 Análise Estatística ........................................................................................ 30

5 RESULTADOS ............................................................................................. 31

6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 42

7 CONCLUSÃO ............................................................................................... 48

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 49

12

1 INTRODUÇÃO

1.1 A Cooperação Sistema Nervoso – Sistema Imune: Hipóteses e Evidências

Os sistemas imune e nervoso fornecem ferramentas de forma coordenada e

independente no controle dos processos biológicos [1]. Ambos os sistemas atuam

modulando-se entre si apontando uma via de mão dupla através do reconhecimento

de efetores celulares como citocinas, neurotransmissores e hormônios que podem

ser detectados tanto por células do sistema imune quanto do sistema nervoso [2].

Hans Selye, em 1936 foi o primeiro autor a descrever a cooperação entre os

sistemas nervoso e imune ao abordar o estresse em condições clínicas e associado

pela influência do meio. O seu trabalho ficou conhecido como Síndrome Geral de

Adaptação em três fases. Em seus experimentos ele demonstrou o aumento da

incidência de doenças como úlcera péptica, hipertensão arterial, artrites e lesões

miocárdicas em animais estressados após períodos de mudança de vida drástica [3].

Esses resultados sugeriram a existência de interrelação entre o sistema imune e o

sistema nervoso [4-6].

Nas décadas de 1970 a 1990 foram realizados inúmeros experimentos

laboratoriais para comprovar a comunicação entre o sistema imune e o sistema

nervoso central. Dentre os experimentos, naqueles que realizaram o bloqueio de

algum componente do sistema nervoso, foi demonstrado relação direta com o

sistema imune. A ablação do hipotálamo dorsal suprimiu a produção de anticorpos.

Observou-se ainda que a retirada ou o bloqueio farmacológico da hipófise impediu a

resposta imunológica em animais [5, 7-8]. Em 1984 Blalock [9] referiu-se ao sistema

imunológico como o sexto sentido orgânico, responsável por unir as informações do

ambiente com os cinco sentidos do cérebro.

Estudos demonstraram que a resposta imune frente ao estresse emocional

também envolve participação do sistema endócrino, dessa forma a resposta ocorre

pela ação conjunta entre os sistemas imune, nervoso e endócrino [10-11]. A

intensidade ou duração desse estresse pode originar doenças atreladas a algum

desses sistemas [12]. Para que a relação entre os sistemas nervoso, imunológico e

endócrino exista é necessário considerar fatores como [13]:

13

Expressão de receptores nas células imunes, endócrinas e neuronais

capazes de reconhecerem citocinas, hormônios e neurotransmissores

Efetores imunes e neuroendócrinos coexistindo em tecidos linfóides, neurais e

endócrinos

Mediadores endócrinos e neurais capazes de estimular o sistema imune

Mediadores imunes capazes de estimular estruturas endócrinas e neurais [14].

Um exemplo de como estas interações podem acontecer são expressas no

esquema 1.

Esquema 1: Interação entre os sistemas nervoso, imune e endócrino (Alves, G.J & Parlemo-Neto,

J.2007)

Onde neste esquema demonstra-se bem que, em decorrência de um estímulo

qualquer será captado pelo sistema nervoso central e, este por sua vez induz

através de neuropeptídeos e neurotransmissores, ativar sistema endócrino e imune

à liberar hormônios e citocinas que vão atuar tanto em seus próprios sistemas

quanto em outros. Demonstrando uma rede de comunicação de mão dupla.

14

O sistema nervoso se divide anatomicamente em sistema nervoso central (SNC)

e sistema nervoso periférico. Funcionalmente o sistema nervoso periférico é dividido

em somático e autônomo (SNA).

O SNA regula as atividades fisiológicas involuntárias dos mamíferos e é

subdivido em sistema nervoso simpático (SNS) e parassimpático (SNP) [14]. Os

sistemas simpático e parassimpático atuam em oposição para a homeostase

fisiológica através da interação com o cérebro primitivo, incluindo o sistema límbico

(importante na função da memória), o tronco cerebral e o hipotálamo [15]. Estudos

têm demonstrado que o SNA conecta o sistema imune com outros órgãos e

orquestra a resposta imunológica de acordo com as necessidades fisiológicas,

regulando a resposta inflamatória [16].

A interação entre o sistema nervoso e o sistema imune ocorre pela atuação de

efetores, como neurotransmissores, hormônios e outros efetores solúveis, que são

liberados por um desses sistemas e atuam no outro sistema [1]. As catecolaminas e

as citocinas são importantes efetores desses sistemas. A hipófise controla a

produção das catecolaminas, sendo capaz de sintetizar, liberar e induzir sua

produção através da glândula supra-renal. As citocinas são efetores característicos

das células do sistema imune e medeiam os processos inflamatórios [17].

Estudos demonstraram que o SNA foi capaz de regular algumas funções de

células do sistema imune, como os leucócitos, através da liberação de sinais que

ativaram o hipotálamo e as glândulas pituitária e adrenal (eixo HPA) [14, 16, 18]. A

ativação do eixo HPA induz a liberação de efetores, como a adrenalina, pelo SNS

(via adrenérgica), e a acetilcolina, pelo SNS (via colinérgica), que ao interagirem

com seus receptores levam a modulação do SI.

A figura 1 ilustra a cooperação entre o sistema nervoso e imune.

15

Figura 1: Vias de modulação neural da inflamação (MATTHAY, 2004).

1.2 Mediadores Neuroimunes

1.2.1 Catecolaminas

As catecolaminas são moléculas derivadas do aminoácido tirosina, as principais

catecolaminas são: adrenalina, noradrenalina e dopamina [15, 19]. Estas moléculas

são liberadas no organismo após momentos de estresse pelas fibras simpáticas pós-

ganglionares e pela medula da adrenal. As catecolaminas são capazes de mediar

respostas celulares por interação com seus receptores específicos, os

adrenoreceptores, que pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína

G [20]. Os receptores adrenérgicos são divididos em α (1,2) e β (1,2,3) apresentam

diferentes afinidades. Existem três subtipos de α 1 (A,B,D) e três de α 2 (A,B,C) [21].

A estimulação de α receptores ativam a cascata da fosfolipase C, (PLC) levando

a produção de diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3) [22].

Os β receptores ativam a via adenilato ciclase promovendo aumento dos níveis

intracelulares de adenosina monofasto cíclico (AMPc), importante regulador de

funções intracelulares [23].

16

As catecolaminas funcionam como agentes moduladores do sistema imune [15],

alterando o número e função de leucócitos. O receptor adrenérgico β2, presente em

quase todos os tipos de células imunes, é o receptor mais importante do sistema

imune.

1.2.2 Nucleotídeo cíclico - AMPc: 3’:5’- adenosina monofosfato cíclico

Adenosina monofosfato cíclico (AMPc) é um tipo de nucleotídeo cíclico. Os

nucleotídeos cíclicos são segundos mensageiros que exercem diversas funções nos

mecanismos fisiológicos [24-25]. O AMPc é sintetizado pela enzima adenilato ciclase

(AC) a partir do ATP, após ativação do receptor β pela adrenalina [26].

O aumento intracelular de AMPc está associado com diversas funções

fisiológicas como a redução da liberação de histaminas e leucotrienos de mastócitos,

liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS), regulação de diversas citocinas,

[27] óxido nítrico por macrófagos, [28] regulação de diferentes processos biológicos

como, mecanismos metabólicos, proliferação, apoptose, diferenciação, migração,

desenvolvimento, transporte iônico, regulação de pH e expressão gênica [52].

1.2.3 Neurotransmissor Colinérgico (Acetilcolina)

Na via parassimpática a comunicação é mediada principalmente pela acetilcolina.

A acetilcolina é sintetizada no interior das terminações nervosas a partir do precursor

colina [29].

A Acetilcolina é capaz de mediar respostas celulares por interação com os

receptores nicotínicos e muscarínicos acoplados à proteína G. Os receptores

nicotínicos são ionotrópicos [30], ou seja, são influenciados pelos canais iônicos, e os

receptores muscarínicos são da classe dos metabotrópicos e não dependem de íons

[31].

A estimulação desses receptores ativa a via guanilato ciclase promovendo

aumento dos níveis intracelulares de guanosina monofasto cíclico (GMPc),

importante regulador de funções intracelulares [32].

17

1.2.4 Nucleotídeo cíclico - GMPc: 3’:5’- guanosina monofosfato cíclico

Guanosina monosfosfato cíclico(GMPc), assim como o AMPc, é um nucleotídeo

cíclico. A produção de GMPc acontece a partir do sistema enzimático das guanilato

ciclases e fosfodiesterases (PDEs) que convertem o GTP citosólico em GMP em

resposta a diferentes sinais, tais como o óxido nítrico (NO), alguns peptídeos e

também devido ao fluxo intracelular de cálcio [33]. O sistema guanilato ciclase está

presente em células do sistema imune, tais macrófagos, neutrófilos e linfócitos [32].

A literatura tem demonstrado a existência de um balanço entre os nucleotídeos

cíclicos, sendo que o aumento de um pode resultar na redução do outro. Esse

balanço permite a hipótese de que AMPc e GMPc podem exercer atividades

regulatórias opostas sobre determinadas funções celulares [34-35].

Esses mediadores metabólicos têm função definida em células do sistema

nervoso, entretanto, pouco se conhece sobre a ação colinérgica ou adrenérgica

sobre células da imunidade inata.

A interação entre os sistemas imune e nervoso tem sido amplamente estudada

em diferentes patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Autores

demonstraram essa interação na depressão melancólica e na hipercortisolemia.

Nessas patologias, o aumento de hormônios do estresse levam o indivíduo à

imunossupressão, predispondo-o à infecções [13, 36]. Além disso, outros estudos

demonstraram essa interação no Lupus Eritromatoso, na asma e em úlceras [36].

Com bases nesses relatos e nas informações sobre os mediadores da

interação entre os sistemas, resolvemos estudar a ação colinérgica e adrenérgica

em células do sistema imune de pacientes diabéticos.

1.3 Diabetes e o estresse oxidativo

O Diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada pela hiperglicemia

associada à ativação do sistema imune, anormalidades funcionais das células,

alterações metabólicas e inflamação [37-38]. Por consequência tem sido considerado

18

como uma patologia inflamatória [39]. Por ter caráter inflamatório, é possível supor

que esta patologia sofra regulação endócrina, imunológica e do sistema nervoso.

O diabetes tipo 2 é uma doença grave a nível mundial com características

multifatoriais resultando de fatores ambientais e genéticos; que tem principal

característica a hiperglicemia induzida pela deficiência na secreção e/ou ação da

insulina [40-41].

Estudos demonstram que a hiperglicemia é a base de muitas complicações

do diabetes, como nefropatia, neuropatia e retinopatia. A hiperglicemia altera

diferentes vias de sinalização celulares, como a alteração da produção de espécies

reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS) que parecem ter papel crucial no

desenvolvimento e progressão das complicações [42-43].

Tabela 1: Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.

Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)

Radicais Não radicais

Superóxido O-2 Peróxido de hidrogênio H2O2

Hidroxila OH. Ácido hipocloroso HClO

Peroxila LO.2 Ozônio O3

Alkoxila LO. Oxigênio “singlet”

Hidroxiperoxila HO.2 Peróxidos lipídicos

Espécies Reativas de Nitrogênio (RNS)

Óxido nítrico NO. Ácido nitroso HNO2

Dióxido nítrico NO2. Trióxido de nitrogênio N2O3

Tetróxido de nitrogênio N2O4

Peroxinitrito ONOO-

Alkil peroxinitritos LOONO

As fontes celulares de geração de ROS são a mitocôndria e o complexo

enzimático NADPH oxidase. O complexo enzimático NADPH oxidase é a principal

fonte de ROS em células fagocíticas e é formado por subunidades que estão

19

localizadas tanto na membrana celular, como a gp91phox e p22phox, quanto no

citosol, p47phox e p67phox (figura 3).

Sob estimulação, a sub-unidade citosólica p47phox é fosforilada e todo o

complexo citosólico é translocado para a membrana formando a oxidase ativa para a

produção de ROS [44].

No diabetes, a hiperglicemia aumenta os níveis de diacilglicerol (DAG) que

ativam a PKC e, consequentemente, ativam o complexo NADPH oxidase [45-46].

O excesso de ROS e a hiperglicemia alteram moléculas biológicas

importantes tais como lipídeos, proteínas e DNA, modificando suas funções [47].

Além do aumento da produção de ROS pela NADPH oxidase, estudos

demonstram que o processo de fagocitose, principal evento celular da imunidade

inata, também está alterado em pacientes diabéticos devido ao estado

hiperglicêmico [42-43].

A fagocitose é caracterizada pelo englobamento de partículas e

microrganismos que são digeridos pela liberação de enzimas hidrolíticas, produção

de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS) conforme exemplificado

na tabela 1 [48].

A alteração da fagocitose, assim como a ativação da NADPH oxidase,

aumenta a produção de espécies oxidantes, como demonstrado nas figuras 2 e 3. O

aumento destas espécies caracteriza o estresse oxidativo, condição causada pelo

aumento das espécies oxidantes, sem o aumento equivalente na resposta

antioxidante neutralizadora. O estresse oxidativo é um dos principais fatores

relacionados à patogênese do diabetes, gerando danos endoteliais e teciduais que

levam às complicações macro e microvasculares, além de danos há algumas

moléculas como, DNA e lipídios conforme mostrado na figura 2. O estudo do

balanço entre as respostas oxidante e redutora é importante para o entendimento

sobre a patofisiologia do diabetes.

Desta forma, pretendemos avaliar se a sensibilidade ou reatividade de células

do sistema imune de pacientes diabéticos frente a estímulos adrenérgicos ou

colinérgicos poderia estar alterada devido à hiperglicemia crônica.

A hiperglicemia do diabetes pode ser considerada como indutor de ativação

metabólica, dessa forma, é possível levantar a hipótese que as células de pacientes

diabéticos respondam aos estímulos adrenérgico/colinérgico de forma diferente das

células oriundas de doadores não diabéticos.

20

Com estas informações sobre o eixo neuroimune-endócrino e sobre a

produção de espécies oxidantes, resolvemos avaliar se a sensibilidade ou

reatividade de células do sistema imune de pacientes diabéticos frente a estímulos

adrenérgicos ou colinérgicos poderia estar alterada devido à hiperglicemia crônica.

Figura 2. Representação dos efeitos de espécies reativas de nitrogênio em macromoléculas.

Figura 3: Representação esquemática do sistema NADPH oxidase. Adaptado [37]

.

21

2 JUSTIFICATIVA

O diabetes mellitus é uma doença inflamatória sujeita à ação de diferentes

efetores solúveis (citocinas, neurotransmissores, neuro-hormônios). Isso sugere que

o eixo neuro-imune tenha participação na patogênese desta patologia. Por isso o

estudo do efeito de catecolaminas e acetilcolina pode fornecer subsídios importantes

sobre os mecanismos moleculares envolvidos no diabetes tipo 2. Neste estudo

avaliamos a ação dos efetores adrenalina e acetilcolina na produção e modulação

de mediadores inflamatórios, tais como: ROS e NO em granulócitos além de avaliar

o balanço oxidante/redutor; bem como a capacidade fagocítica que será avaliada

com Zymosan contendo partículas opsonizadas pelo sistema completo, pelo

fragmento C3b. Onde pretendemos através dos ensaios realizados dar suporte as

afirmações que apontam que sistema nervoso e sistema imune atuem em via de

mão dupla bem como sofrendo influencias mutuas, como em patologias como no

caso do diabetes do tipo2.

22

3 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito da estimulação adrenérgica e colinérgica em granulócitos de

pacientes diabéticos do tipo 2 e não diabéticos.

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Quantificar a resposta oxidante (produção de ROS) em granulócitos de DM2 e

ND na ausência/presença de efetores adrenérgico, colinérgico e partículas

opsonizadas de Zymosan (ZC3b);

Avaliar o efeito dos nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc na geração de ROS

em granulócitos de DM2 e ND;

Mensurar a produção de óxido nítrico (NO) em granulócitos de DM2 e ND na

ausência/presença de efetores adrenérgico, colinérgico.

Quantificar a resposta antioxidante em granulócitos de DM2 e ND na

presença/ausência de efetores adrenérgico/colinérgico e ZC3b;

23

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Pacientes

O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa (CEP) da Santa

Casa de Belo Horizonte (SC-BH). Os pacientes foram selecionados pelas Dra.Maria

Regina Calsolari, no Centro de Estudos e Pesquisas em Endocrinologia e

Metabologia (CEPCEM) da SC-BH, Dra. Janice Sepúlveda Reis, no consultório do

plano de saúde da SCM-BH, Dra. Adriana Aparecida Bosco, no ambulatório de

diabetes da SC-BH.

Critérios de inclusão: foram incluídos os doadores que concordaram em

assinar o Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Foram selecionados

pacientes de ambos os sexos, com diagnóstico de diabetes tipo 2, conforme os

critérios estabelecidos pela American Diabetes Association (ADA) e doadores do

grupo controle, sabidamente normoglicêmicos. A idade dos doadores variou entre 30

e 70 anos.

Critérios de exclusão: foram excluídos do trabalho, os pacientes com doenças

inflamatórias ou auto-imune, câncer, demência, gestantes, fumantes e aqueles que

não concordaram em assinar o Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE).

4.2 Coleta de sangue

Foram coletadas aproximadamente 10mL de sangue venoso periférico dos

pacientes através da punção venosa, em tubos vacuntainer, um tubo contendo

heparina como anticoagulante. Neste estudo foram selecionados 40 indivíduos.

24

4.2.1 Obtenção de granulócitos

Esquema 2: Obtenção dos granulócitos.

Os granulócitos foram obtidos a partir do sangue periférico, de acordo com a

técnica adaptada de Bicalho, H. M. S. et al.[49]. Quatro mililitros de sangue periférico

heparinizado foram adicionados a três mililitros de gradiente monopaque e três

mililitros de leucopaque (BION LTDA). O tubo foi centrifugado à temperatura

ambiente (100 x g) por 30 minutos, originando dois anéis formados por células

mononucleares e mais abaixo o anel de granulócitos conforme demonstrado no

esquema 2.

Este anel de granulócito foi transferido para um tubo siliconizado e lavado três

vezes em PBS. Após as lavagens, os granulócitos foram ressuspensos em 1 mL de

PBS. A contagem destas células foi feita no microscópio usando-se uma câmara de

Neubauer e o número expresso em nº de células/mL, foi calculado pela fórmula:

células/mL = nº/4 x 10 x diluição (100) x 103. A viabilidade celular de cada amostra

foi superior a 90%, como determinado pelo teste de exclusão por incorporação de

azul de Trypan.

30 minutos após a centrifugação

25

4.2.2 Teste de viabilidade celular: incorporação de Azul de Trypan

O teste de viabilidade celular foi feito com o Azul de Trypan a 1%. As células,

contadas na câmara de Neubauer, que incorporam o Azul de Trypan foram

consideradas mortas. Foram utilizadas no experimento apenas as amostras que

continham, pelo menos, 90% de células vivas.

4.3 Ensaio de quimiluminescência dependente de luminol: Quantificação das

espécies reativas de oxigênio (ROS)

O ensaio de quimiluminescência permite avaliar, indiretamente, a atividade da

NADPH oxidase, a enzima responsável pela geração de ROS durante a fagocitose

das células. As células produzem uma luminosidade definida como

quimiluminescência nativa ou natural. Contudo, esta luminosidade pode ser

amplificada, usando-se reagentes químicos que, ao reagirem com o ROS produzido,

passam a emitir a luminescência amplificada, conforme a reação abaixo:

A reação ocorre no interior de um sistema cátodo-ânodo, o que permite a

captação e registro dos fótons emitidos pelo aminofitalato.

Para a leitura basal, foram colocados em um tubo específico para o

luminômetro, 200 µL de luminol 10-4 M, 300 µL de PBS e 100 µL de granulócitos (1 x

105/mL). A leitura foi a cada minuto, durante 30 minutos. Os resultados foram

expressos em unidades relativas de luz (RLU) por minuto. Após este tempo foi

acrescido os estimuladores (adrenalina 1000 nM, carbamilcolina 1000 nM, AMPc 10-

4 M, GMPc 10-4 M e/ou ZC3b). E para cada item acrescido ao tubo foi realizada

leituras complementares de 30 minutos.

26

4.4 Reagentes e soluções

- PBS (Tampão fosfato salino): a solução salina tamponada foi preparada como

abaixo, pH= 7,3

Na2HPO4 anidro ------------- 8,12 g

KH2PO4 ------------------------ 1,35 g

NaCl ------------------------------ 8,0 g

H2O destilada, q.s. -------------1 litro

- Luminol (5 – amino – 2, 3 – dihydro- 1,4 phthalozinedione) – SIGMA Co.

1,77 g de luminol foram diluídos em 1,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) originando

uma concentração de 10-2 M. A partir daí, a solução foi diluída em PBS e usada a 10-

4 M.

- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Sigma Co.) pH 7,3: o meio de

cultura foi preparado, em capela de fluxo laminar e filtrado adicionando:

10 mL de antibiótico-antimicótico: 10000 unidades/mL de penicilina 6 sódio

(Invitrogen) diluído 10 vezes em H2Od (água deionizada); 10000 µg/mL de sulfato

de streptomicina; 25 µg/mL anfotericina B (0,85% salina)

2 mL de sulfato de gentamicina 80 mg (Schering-Plough)

2 g de bicabornato de sódio (Farmax)

q.s.p. 1L de água destilada.

O meio de cultura foi suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sorali

Biotecnologia).

- Solução de leucopaque

A solução de leucopaque foi adquirida pela BION LTDA.

-Azul de Trypan (SIGMA Co.)

O azul de Trypan foi usado a 1% em PBS.

- AMPc (3’:5’- adenosina monofosfato cíclico)

O AMPc foi comprado da Sigma Chemical Co.

27

A solução estoque foi preparada a 10-2 M, sendo estocada ao abrigo da luz.

Para uso, foi realizada diluição para 10-4M em PBS.

- GMPc (3’:5’- guanosina monofosfato cíclico)

O GMPc foi comprado da Sigma Chemical Co. Essa solução (10-2 M) foi estocada ao

abrigo da luz. Para uso, dilui-se 100x (1:100) a solução estoque em solução salina

balanceada de PBS.

- Adrenalina

A adrenalina foi comprada da Sigma Chemical Co. e reconstituído com NaCl a 0,9%.

- Carbamilcolina

O Carbachol foi comprado da Sigma Chemical Co.e reconstituído com NaCl a 0,9%.

- Luminômetro: 20/20n – Turner Byosystems24

- Microscópios: Edu VU 1300 – WESCO; Ken – A vision TT – 1500 N acoplado a

câmera digital color SDC- 312 (Samsung) e ao monitor de computador Pro view.

- Centrífugas: Centrifugador Excelsa Fanem Ltda; Bio Eng – 6000

- Banho Maria: Hemoquímica

- Leitor de ELISA - STAT FAX – 2100

- Espectrofotômetro – BIO PLUS 2000

4.5 Produção de Óxido nítrico

O óxido nítrico é um mediador gasoso responsável por uma variedade de

fenômenos fisiológicos. A l-arginina é a precursora da síntese do óxido nítrico, na

presença de óxido nítrico-sintase. Dessa forma então, mensuramos a produção

deste mediador na presença, ausência de adrenalina e carbamilcolina.

28

A produção de Oxido Nítrico foi avaliada em sobrenadante de cultura celular

(18 horas em estufa de 5% CO2/37ºC) de granulócitos, pelo método de Griess. Na

presença/ausência carbachol, adrenalina e Zymosan C3b.

Método de Griess: Os sobrenadantes da cultura de granulócitos (18 horas em estufa

de 5% CO2/37ºC) foram analisados quanto à produção de nitrito pela reação de

Griess, como medida da produção de óxido nítrico (Green et al, 1982) [50]. Para

medir a produção de nitrito, alíquotas de 100uL das amostras foram incubadas com

100uL dos reagentes (50uL da solução de sulfanilamida 1% e 50uL de solução de N-

naphthylethylenediamine dihydrocloride 0,1% em 2,5% de H3PO4) à temperatura

ambiente por 10 minutos. A leitura foi realizada no espectrofotômetro com

absorbância de 570nm.

4.6 Opsonização de Zymosan

Para a produção de Zymosan opsonizado (Zc3b) foi coletado sangue venoso

periférico humano em tubos vacuntainer sem anticoagulante, e armazenados em

geladeira por 2 horas. Após o repouso, o sangue foi então, centrifugado a 3000 rpm

por 15 minutos, formando no tubo 2 camadas, sendo a primeira de cor amarelada

translúcida correspondente ao soro. Para cada mL de soro é acrescentado 50ul de

Zymosan (13mg), formando uma nova solução que foi incubada a 37ºC por 2 horas.

4.7 Redução do sal tretrazólio (MTT)

Este ensaio baseia-se na medida do dano induzido pelo composto/extrato em

estudo no metabolismo celular de glicídeos usualmente através da avaliação da

atividade de desidrogenases mitocondriais. A viabilidade mitocondrial, e

consequentemente, a viabilidade celular, é quantificada pela redução do MTT (um

sal de coloração amarela) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em

água) pela atividade daquelas enzimas. Dessa forma, a redução do MTT a

formazan, será diretamente proporcional à atividade mitocondrial e a viabilidade

celular.

29

Para avaliar a redução do 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide (MTT) foi utilizando granulócitos [1x105/10uL], partículas de Zymosan

opsonizado (Z-C3b)[100uL de suspensão a 13mg/mL] com fragmento C3b, Dibutiril

AMP cyclic (10-4 M) e 8-Bromo-cyclic GMP (10-3 M). O MTT é um sal de tetrazólio,

que pode ser reduzido pelas desidrogenases, formando cristais de formazan

solúveis em isopropanol. Desta forma, o MTT passa de uma cor amarela (forma

oxidada) para uma cor púrpura (forma reduzida).

Em tubos de ensaio os granulócitos foram incubados à 37 ºC durante 4 horas,

na presença e ausência (leitura basal) e presença adrenalina, carbamilcolina e Zc3b,

acrescidos de 25ul de MTT em cada tubo. Após incubação, foi adicionado 1,5 mL de

uma solução de isopropanol (HCl 0,04N) aos tubos, e estes foram fortemente

homogeneizados no Vortex, durante 1 minuto, para dissolução dos cristais de

formazan, produto da redução do MTT. Os tubos foram centrifugados durante 10

minutos e os sobrenadantes foram analisados no Stat Fax, no comprimento de onda

de 570 nm e os resultados expressos em densidade óptica (D.O) 570nm.

30

4.8 Análise Estatística

Na análise estatística foi realizada pelo teste “t” de Student, Mann Whitney e

Qui-quadrado (X2) dependendo dos dados em estudo. Onde p<0,05 foi considerado

como estatisticamente significativo.

31

5 RESULTADOS

A tabela 2 demonstra as características clínicas e bioquímicas dos pacientes

diabéticos e seus controles não diabéticos. Observamos diferença significativa

(p<0,05) entre DM2 e ND nos seguintes parâmetros: Idade dos indivíduos, IMC,

glicose jejum, HbA1c e ureia.

Tabela 2: Características clínicas e bioquímicas da população em estudo.

Parâmetros

Média ± EP

Não diabéticos p Diabéticos tipo 2

Amostra (n) 40 - 40

Idade (anos) 45,6±1,31 p<0,05 52,8±1,52

Sexo (F/M) 22/18 - 27/13

Tempo da doença (anos) NA - 8,91±0,97

Índice de massa corporal (kg/m2) 24,1±0,54 p<0,05 33,7±1,44

Glicose jejum (mg/dL) 81,7±1,56 p<0,05 162,9±10,05

HbA1c (%) 6,4±0,08 p<0,05 8,1±0,41

Triglicérides (mg/dL) 145,0±8,75 NS 165,6±18,11

Colesterol total (mg/dL) 156±16,82 NS 192,4±4,92

Colesterol LDL (mg/dL) 112,4±2,39 NS 126,8±3,87

Colesterol HDL (mg/dL) 51,4±0,9 NS 58,0±2,54

Creatinina (mg/dL) 1,02±0,02 NS 1,57±0,37

Ureia (mg/dL) 29,4±2,58 p<0,05 46,7±3,85

32

n = número de amostra; IMC = índice de massa corpora; mg/dL = miligramas/decilitro; kg/m2 =

kilograma/metro2; mmHg = milímetros de mercúrio; HbA1c = hemoglobina glicada; NS = não

significativo

Os resultados serão apresentados em forma de figuras, tabelas e quadro.

Para determinação da dose ideal a ser usada nos experimentos, realizamos curva

dose-resposta para definição de concentrações ideais para uso nos teste

subsequentes.

Primeira pergunta: Qual a melhor dose de adrenalina ou carbamilcolina

capaz de interferir na produção de ROS por granulócitos?

Figura 4: Curva dose-resposta do efeito da adrenalina na produção de ROS por granulócitos de ND

(n=4) e DM2 (n=4). ND =Não diabético; DM2= pacientes com diabetes mellitus do tipo 2. Cada dose

foi comparada com a leitura basal (ausência de adrenalina). Valores expressos em média. NS=Não

significativo; p<0,05= significativo estatisticamente. RLU/min: unidades relativas de luz por minuto.

33

Figura 5: Curva dose-resposta do efeito da carbamilcolina na produção de ROS por granulócitos de

ND (n=4) e DM2 (n=4). ND=Não diabético; DM2= pacientes com diabetes mellitus do tipo 2; NS= não

significativo. Cada dose foi comparada com a leitura basal (ausência de carbamilcolina). Valores

expressos em média. NS=Não significativo; p<0,05= significativo estatisticamente. RLU/min: unidades

relativas de luz por minuto.

Os resultados das figuras 4 e 5 demonstraram o efeito de diferentes

concentrações de adrenalina e carbamilcolina na produção de ROS por granulócitos

de pacientes diabéticos e não diabéticos. Após comparações, verificamos que a

melhor concentração tanto para adrenalina quanto para carbamilcolina foi de

1000nM, concentração utilizada em todos os testes.

Segunda pergunta: Granulócitos de diabéticos e não diabéticos se

comportam de forma semelhante sob ativação adrenérgica ou colinérgica?

Os resultados são demonstrados na tabela 3.

Tabela 3: Efeito do estímulo adrenérgico e colinérgico sobre a produção de ROS em

granulócitos não ativados de DM2.

EXPERIMENTOS

Produção de ROS (RLU/min) expresso em Mediana

NÃO DIABÉTICOS DIABÉTICOS P

1) G + PBS 216 417 p<0.05

2) G + ADRENALINA 114* 241* p<0.05

3) G + CARBAMILCOLINA 272 633* p<0.05

Avaliação da produção de ROS em granulócitos na presença ou ausência de adrenalina 1000nM e Carbamilcolina 1000nM. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para diabéticos tipo 2. p<0,05 significativo. NS = não significativo (p>0,05). G=Granulócitos. Valores expressos em mediana. Análise estatística realizada pelo teste de Mann-Whitney. *=p<0,05 em relação à produção de ROS basal (G+PBS). Ensaio de quimiluminescência.

A produção basal de ROS em DM2 foi maior quando comparado com ND

(p<0,05), indicando que o metabolismo do DM2 está possivelmente ativado pela

34

hiperglicemia. Na presença de carbamilcolina observamos que os granulócitos de

ND não mostraram alteração significativa (p>0,05) na produção de ROS, no entanto

em DM2 houve aumento significativo (p<0,05) na produção de ROS. Na presença de

adrenalina houve inibição significativa (p<0,05) da produção de ROS tanto em

diabéticos quanto em não diabéticos.

Esse resultado foi realizado em células em repouso. Para verificarmos o efeito

colinérgico e adrenérgico em células ativadas, estimulamos o processo fagocítico

nos granulócitos de diabéticos e não diabéticos com partículas opsonisadas de

Zymozan (ZC3b). É sabido que a fagocitose é um processo importante da imunidade

inata. Neste contexto, a fagocitose pode sugerir que granulócitos apresentam

ativação de diversas vias metabólicas. Dessa forma, fizemos nossa próxima

pergunta.

Terceira pergunta: O sistema adrenérgico pode exercer algum efeito sobre

granulócitos durante o processo fagocítico?

Baseado nesta questão realizamos o experimento com objetivo de observar o

efeito da adrenalina ou carbamilcolina na produção de ROS em granulócitos durante

a fagocitose de partículas de Zymosan opsonizado com partícula C3b. Os resultados

estão dispostos na figura 6, expresso pela relação experimento [E] dividido pelo

controle [C] (leitura basal).

Figura 6: Avaliação do processo fagocítico em granulócitos na presença de Adrenalina 1000 nM. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para diabéticos tipo 2. DM2= diabéticos do tipo 2; ND= não diabéticos; ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b. Análise estatística realizada pelo teste Qui-quadrado. E/C= valor do experimento /valor do controle (média 194 ND, 394 DM2). ±Erro padrão. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. Ensaio de quimiluminescência.

35

A figura 6 mostra redução significativa (p<0,05) na produção de ROS por

granulócitos de ND e DM2 na presença de adrenalina comparada com a leitura

basal (média: ND =194 e DM2=394). Entretanto, não foi observada diferença dessa

inibição entre os grupos (E/C= 0,6 e 0,6 respectivamente). A estimulação da

fagocitose por ZC3b aumentou significativamente (p<0,05) a produção de ROS em

ND e DM2. Esse aumento foi significativamente maior (p<0,05) em células de ND

(4,9±1,0) comparado com células de DM2 (3,7±0,75). Na presença de adrenalina

houve redução significativa (p<0,05) da fagocitose, avaliada pela produção de ROS,

nos grupos em estudo (0,5 ND e 0,3 DM2). O percentual de inibição foi de 95% e

97% para ND e DM2, respectivamente. Portanto estes resultados demonstram que a

ativação adrenérgica modula negativamente o processo fagocítico.

Assim, resolvemos avaliar o mesmo fenômeno usando ativação colinérgica.

Quarta pergunta: O sistema colinérgico pode exercer algum efeito sobre

granulócitos durante o processo fagocítico?

Figura 7: Avaliação do processo fagocítico em granulócitos em meio contendo Carbamilcolina 1000 nM. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para diabéticos tipo 2. DM2= diabéticos do tipo 2; ND= não diabéticos, p<0,05 estatisticamente significativo. CARB1mM = Carbamilcolina Sigma; ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b; Análise estatística realizada pelo teste Qui-quadrado. E/C= valor do experimento/valor do controle (média 194 ND, 394 DM2). ±Erro padrão. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. Ensaio de quimiluminescência.

A figura 7 mostra os resultados, expressos pela relação E/C ± EP, da

produção de ROS por granulócitos de ND e DM2 na ausência e presença de

36

carbamilcolina e/ou ZC3b. Verificamos que na presença de carbamilcolina houve

aumento significativo (p<0,05) da produção de ROS em células de pacientes

diabéticos quando comparado à produção basal (média: ND =194 e DM2=394), essa

ativação não foi observada em células de controles não diabéticos. Os valores foram

de 1,2±0,08 para ND e 1,7±0,1 para DM2. A estimulação da fagocitose por ZC3b

aumentou significativamente (p<0,05) a produção de ROS em ND e DM2. Esse

aumento foi significativamente maior (p<0,05) em células de ND (4,9±1,0)

comparado com células de DM2 (3,7±0,75). Na presença de carbamilcolina houve

redução da fagocitose nos grupos em estudo, a inibição foi de 23% para ND e de

36% para DM2 (p<0,05) em relação ao controle G+ZC3b.

Sabe-se que a adrenalina ativa o receptor β adrenérgico em granulócito induz

a adenil ciclase a hidrolisar o ATP em AMPc (segundo mensageiro)[23]. Nesse

contexto, fizemos nossa próxima pergunta.

Quinta pergunta: O AMPc tem efeito comparável à adrenalina sobre a

produção de ROS em granulócitos de ND e DM2?

Figura 8: Avaliação da produção de ROS expresso em mediana por granulócitos na presença de Adrenalina 1000nM e AMPc 10

-4. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para

diabéticos tipo 2. Valores expressos em mediana. Análise estatística realizada pelo teste Mann-Whitney. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. RLU/min=Unidades relativas de luz por minuto. Ensaio de quimiluminescência.

A figura 8 mostra os resultados da produção de ROS, expressa em Mediana,

na ausência e presença de AMPc ou Adrenalina. Verificamos que na presença de

37

AMPc não houve alteração na produção de ROS em granulócitos de ND quando

comparada com a produção basal (média: ND =184 e DM2=385). Contudo, em DM2

a presença do AMPc aumentou significativamente (p<0,05) a produção de ROS em

aproximadamente 200% quando comparada à produção basal. Como demonstrado

anteriormente (tabela 3 e figura 8), houve diminuição significativa (p<0,05) da

produção de ROS na presença de adrenalina tanto em células de ND quanto de

DM2.

Dentro do mesmo raciocínio, a acetilcolina (carbamilcolina) ativa receptor

muscarínico (guanil ciclase) que é associado ao GTP que origina a formação de

GMPc. Com estas informações fizemos a mesma indagação anterior, mas agora em

relação à carbamilcolina.

Sexta pergunta: O ativador colinérgico (carbamilcolina) e GMPc apresentam

semelhanças no efeito na produção de ROS em granulócitos de diabéticos?

Figura 9: Avaliação da produção de ROS expresso em mediana por granulócitos na presença de Carbamilcolina 1000 nM ou GMPc 10

-4. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para

DM2. Valores expressos em mediana. Análise estatística realizada pelo teste Mann-Whitney. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. RLU/min=Unidades relativas de luz por minuto. Ensaio de quimiluminescência.

A figura 9 mostra os resultados da produção de ROS, expresso em Mediana,

na ausência e presença de GMPc ou Carbamilcolina. A produção basal de ROS está

significativamente maior (p<0,05) em DM2 comparado com ND. Quando analisamos

a produção de ROS em presença de GMPc verificamos que houve aumento

38

significativo (p<0,05) para ambos os grupos comparado com a leitura basal (média:

ND=184 e DM2=385). Em presença de carbamilcolina a produção de ROS por

granulócitos de ND e DM2 foi significativamente maior (p<0,05) em comparação com

a leitura basal.

Como vimos, a estimulação adrenérgica ou colinérgica tem efeito sobre a

produção de espécies reativas de oxigênio liberado por granulócitos. Será que este

efeito se repete em espécies reativas de nitrogênio (RNS)? Neste contexto

formulamos a pergunta seguinte.

Sétima pergunta: Ativação colinérgica e adrenérgica interferem com a

produção de óxido nítrico por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2 ?

Figura10: Produção de óxido nítrico por granulócitos de DM2 e ND na ausência ou presença de adrenalina ou carbamilcolina. ND=não diabéticos (n=10), DM2=diabetéticos tipo 2 (n=10). Resultados expressos em umol/L ±Erro padrão (EP). Letras iguais p>0,05; letras diferentes p<0,05.

Na figura 10 estão dispostos os resultados, expressos em umol/L ± EP, da

produção de óxido nítrico em granulócitos de DM2 e ND sob estímulos adrenérgico

(adrenalina) e colinérgico (carbamilcolina). Observamos que a produção basal (sem

estímulo) de NO em ND foi significativamente maior (p<0.05) do que em DM2. Na

presença de adrenalina houve redução significativa (p<0,05) da produção de NO em

ND comparado com a leitura basal. Em granulócitos de DM2 a presença de

adrenalina aumentou significativamente (p<0.05) a produção de NO comparado com

39

a leitura basal, este aumento foi de aproximadamente 110%. Na presença de

carbamilcolina houve inibição significativa (p<0,05) da produção de NO em ND, e em

pacientes diabéticos houve ativação significativa (p<0.05) quando comparado a

produção de NO na ausência de estímulo.

A tabela 4 demonstra o índice de predisposição inflamatória, que representa a

relação entre a produção de ROS e a produção de NO, nos pacientes diabéticos e

controles não dibéticos. Realizamos um balanço comparativo entre a produção de

espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS e RNS).

Os resultados apresentados na tabela 4 demonstram o perfil inflamatório dos

pacientes diabéticos e controles não diabéticos de acordo com a relação entre a

produção de NO e ROS. Essa relação foi sugerida por Darley-Usmar [47].

Tabela 4: Produção de ROS e RNS por granulócitos de ND e DM2. Índice de predisposição inflamatória (IPI).

EXPERIMENTOS E/C Razão

NO ROS NO/ROS

G+ADRENALINA - ND 0,9 0.7 1.3

G+ADRENALINA - DM2 3,9 0,5 7,8

G+CARBAMILCOLINA - ND 1,0 1,2 0,8

G+CARBAMILCOLINA - DM2 2,0 1,0 2,0

IPI: índice de predisposição inflamatória, determinado pela razão NO/ROS o perfil anti-inflamatório

será sempre > 1,0 e pró-inflamatório < 1. Onde E=Experimento (adrenalina ou carbamilcolina) e

C=Controle (leitura sem estímulo).

Os resultados apresentados na tabela 4 mostram que os granulócitos de ND

em presença de adrenalina produziram menos ROS quando comparados com o NO,

porém esta diferença não foi significativa (p>0,05), que segundo descrito por Darley-

Usmar (1995) [47] é um perfil anti-inflamatório.

Em granulócitos de ND em presença de adrenalina a relação de E/C, o NO foi

maior que o ROS (p>0,05), porém em carbamilcolina o oposto foi percebido,

40

demonstrando uma tendência de granulócitos de ND em presença de carbamilcolina

ser pró-inflamatório. Em granulócitos de DM2 tanto em presença de adrenalina

quanto carbamilcolina houve tendência a um aumento na produção de NO quando

comparado ao E/C da produção de ROS, no entanto esta diferença não foi

significativa (p>0,05).

Até aqui analisamos a resposta oxidante pela produção de ROS e RNS (NO)

extracelular. Como se comportaria na resposta redutora frente à estimulação

adrenérgica e colinérgica?

Oitava pergunta: A ativação adrenérgica interfere com a resposta anti-

oxidante ou redutora dada por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2?

Figura 11: Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob estímulo adrenérgico e ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b Número de amostra (n)= 10 DM2 e 10 para ND. Valores expressos em E/C (E=experimento/C=controle). Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. G=granulócitos e ADRE=adrenalina.

Os resultados expressos em E/C aparecem na figura 11 nos mostra a

capacidade redutora de granulócitos de doadores ND e DM2. Granulócitos de DM2

e ND apresentaram resultados semelhantes (p>0,05). No experimento contendo

granulócitos mais ZC3b houve ativação significativa (p<0,05) em ND e quando com

DM2, esta relação não foi significativa (p>0,05).

Nos experimentos contendo adrenalina e ZC3b houve um aumento

significativo do poder redutor em ambos os grupos (p<0,05) mas quando

comparados entre eles este aumento não foi significativo (p>0,05). Estes dados

41

mostram que a fagocitose de DM2 é menor e que a adrenalina potencializa a

resposta redutora ou antioxidante tanto em ND quanto DM2.

Nona pergunta: A ativação colinérgica interfere com a resposta antioxidante ou

redutora dada por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2?

Figura 12. Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob estímulo colinérgico e ZC3b. ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b; Número de amostra (n)= 10 para diabéticos tipo 2 e 10 para não diabéticos. Valores expressos em E/C. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. G=granulócitos e CARB=carbamilcolina.

A figura 12 nos mostra a capacidade redutora na presença de carbamilcolina

em granulócitos de ND e DM2. A resposta redutora ou antioxidante em DM2 teve

uma tendência a ativação quando comparado com ND, mas esta diferença não foi

significativa entre eles (p>0,05). No experimento contendo granulócitos mais ZC3b

houve ativação significativa (p<0,05) em ambos os grupos e quando comparados

entre eles a ativação foi significativa (p<0,05).

No experimento com ZC3b na presença de carbamilcolina houve um

aumento significativo em ambos os grupos (p<0,05) quando comparado com seu

basal e, quando comparados entre eles, este aumento também foi significativo

(p<0,05). Além disto, a comparação entre G+ZC3b com G+ZC3b+Carb mostrou

inibição da capacidade redutora, no entanto esta capacidade foi significativa apenas

em ND (p<0,05). Isto sugere que a ativação colinérgica interfere na reposta anti-

oxidante produzida por granulócitos e que DM2 e ND.

42

6 DISCUSSÃO

O presente trabalho mostra que o sistema imune é sensível à estimulação

adrenérgica e colinérgica.

Em nossos experimentos avaliamos o efeito de neurotransmissor

(acetilcolina) e da catecolamina (adrenalina) sobre a função de granulócitos de DM2

e controle não diabético. Existem poucos resultados na literatura que associam o

efeito de modulação adrenérgica ou colinérgica sobre efetores celulares ou solúveis

da imunidade inata.

As figuras 4 e 5 representam curvas dose–resposta que definiram a melhor

dose in vitro tanto para adrenalina quanto para carbamilcolina (acetilcolina). As

concentrações extrapoladas das curvas da figura 4 e 5 estão de acordo com dados

descritos na literatura [51-52].

Na tabela 3, granulócitos de DM2 produziram maiores quantidades de ROS

quando comparado com ND (p<0,05). Na presença de adrenalina a houve

diminuição da produção de ROS nos dois grupos em estudo, a inibição foi de 50%

para ND e 58% para DM2. A carbamilcolina (acetilcolina) não exerceu nenhum efeito

sobre a produção de ROS em granulócitos de ND, mas uma significativa ativação foi

observada em células de pacientes diabéticos DM2 (p<0,05).

Isto pode sugerir que a maior produção de espécies reativas de oxigênio por

células de diabéticos seja consequência do efeito da hiperglicemia e que os testes,

mesmo in vitro, envolvem granulócitos pré ativados, in vivo pelos altos teores de

glicose sanguínea.

Wenisch et al. [53] já relataram que catecolaminas estão associadas com a

diminuição da geração da produção de ROS bem como a capacidade fagocítica.

Nos experimentos com fagocitose, observamos que a adrenalina foi capaz de

inibir a fagocitose de partícula opsonizada por C3b tanto em diabéticos quanto não

diabéticos. A inibição foi maior em granulócitos de DM2 (fig. 6). Este aumento de

adrenalina, se associado ao estresse emocional, físico ou crônico pode abrir portas

para infecções oportunistas por patógenos. Sobretudo porque o estresse emocional

e físico pode aumentar os níveis de adrenalina, podendo interferir negativamente na

imunidade inata.

43

Os nossos resultados são corroborados por outros achados disponíveis na

literatura reforçando esta sugestão [2, 53-54]. Os resultados da figura 7 mostram que o

estímulo colinérgico com a carbamilcolina (acetilcolina) não impediu a capacidade

fagocítica, se levarmos em consideração a comparação entre G+CARB e

G+CARB+ZC3b; porém se compararmos o G+ZC3b e G+CARB+ZC3b foi possível

identificar uma diminuição da capacidade fagocítica de 23% e 36% para ND e DM2.

Podemos sugerir que a falta de ação da acetilcolina possa ser devido à ação da

hiperglicemia.

Esta sugestão encontra suporte nos trabalhos de Mowat et al [55] que

demonstrou baixa taxa de atividade quimiotática de neutrófilos devido a altas taxas

de glicose no soro. Outros trabalhos também destacam que polimorfonucleares de

pacientes diabéticos apresentam uma redução da atividade fagocítica [56-57] que

parece estar diminuída quando associada à hiperglicemia [58-59]. Rocha et al.[60]

demonstraram que nos pacientes diabéticos ocorre diminuição da atividade

fagocítica das células polimorfonucleares, diretamente relacionada aos níveis de

hiperglicemia, alteração na aderência, quimiotaxia e opsonização leucocitária.

Como teoricamente o efetor bioquímico da ação da adrenalina é o AMPc,

resolvemos testar diretamente este nucleotídeo cíclico. Na presença de AMPc os

granulócitos do grupo ND diminuíram a produção de ROS, comparável ao observado

a adrenalina (Fig.6 e 8). Estes dados são semelhantes a trabalhos na literatura [60].

Coffey, R. G. [61] abordou as várias funções de granulócitos além de modular a

expressão de receptores celulares e eventos dependentes de cálcio, mas não

aqueles sinalizados pela ativação da PKC.

Observamos que houve aumento da produção de ROS em DM2 na presença

de AMPc possivelmente esse resultado tenha ocorrido devido a alteração na

reatividade celular devido à hiperglicemia [60, 62-63]. Brandt et al. [64] relataram em seus

estudos que as citocinas potencializam a degranulação de neutrófilos em resposta a

citocinas produzidas por neutrófilos ativados por peptídeos 2 (NAP-2) e IL-8

modulando níveis de AMPc intracelular.

Analisamos comparativamente os granulócitos de ambos os grupos

estimulados com adrenalina e a inibição se manteve, não denotando nenhuma ação

mimética do AMPc e adrenalina, nestas condições. Podendo sugerir que neste

intervalo compreendido entre a ativação da adenil ciclase/proteína G e a formação

44

de AMPc, outros fatores possam sofrer ação desta estimulação interferindo na

formação de ROS.

Os resultados sugerem que esta inibição seja modulada negativamente pelas

mudanças de vias metabólica com predominância de um dado receptor de AMPc

(PKA) em relação aos outros (Epac) além da possibilidade de interferência direta na

via PKC/NADPHoxidase. Usando raciocínio análogo, testamos o efeito de GMPc e

comparamos com a ação da acetilcolina.

Observamos que a produção de ROS em granulócitos na presença de GMPc,

foi aumentada tanto em ND quanto DM2 porém houve tendência a ativação em ND

do que em DM2 mas este, não foi significativo (p>0,05). O GMPc parece apresentar

função antagonista em relação ao AMPc [65].

Em presença de adrenalina a produção de NO em DM2 foi maior do que

aquela produzida por granulócitos de ND, o percentual de ativação foi de 100%

quando comparado a ND (p<0,05). Podemos sugerir uma ativação da iNOS,

isoforma induzível da enzima óxido nítrico sintase, possa ser ativada pela

hiperglicemia do diabetes, justificando os nossos achados. Uma vez que a iNOS não

está expressa sob condições normais, mas pode ser induzida por citocinas e/ou

endotoxinas em vários tipos celulares como macrófagos, linfócitos T, células

endoteliais, miócitos, hepatócitos, condriócitos, neutrófilos e plaquetas [66] isto reforça

os nossos achados.

A hiperglicemia tratando-se de um fator que naturalmente desequilibra vias

metabólicas, vai levar a injúrias e complicações micro e macrovasculares a longo

prazo. A produção de NO em excesso também pode levar a injúrias endoteliais e

teciduais [67].

Neste mesmo contexto, observamos que a produção de NO em meio

contendo carbamilcolina por granulócitos de DM2 teve uma tendência a aumentar

em relação à ND, no entanto esta diferença não foi significativa (p>0.05).

Tomando por base estudos de Darley-Usmar [47], estabelecemos uma relação

matemática entre a produção de NO e ROS (NO/ROS), para determinar a

predominância de NO e ROS na presença de estímulo colinérgico ou adrenérgico.

Observamos que granulócitos de ND e DM2 apresentaram um perfil anti-

inflamatório quando estimulados por adrenalina. Já na presença de carbamilcolina

controles não diabéticos apresentaram perfil pró-inflamatório e doadores DM2

45

apresentaram um perfil anti-inflamatório. O quadro abaixo resume as conclusões

encontradas pelos resultados apresentados.

Quadro 1: Resumo resultado NO.

NO/ROS

ADR CAR

ND anti-inflamatório pró-inflamatório

DM2 anti-inflamatório anti-inflamatório Perfil apresentado pelos indivíduos amostrados nos experimentos de óxido nítrico e produção de

ROS. Neste cálculo estabelecemos a relação entre a produção de NO e ROS, dos experimentos [E]

em relação aos seus respectivos controles [C]. A relação E/C foi usado para calcular NO/ROS e

definir o perfil.

Podemos sugerir que a ausência da hiperglicemia em ND leva a um perfil

anti-inflamatório quando em condições homeostáticas e, no seu balanço oposto a

carbamilcolina aponte para um perfil pró-inflamatório.

Em DM2 houve determinação de perfil anti-inflamatório na presença de

adrenalina e também com a carbamilcolina.

Darley-Usmar [47], já descreveu que na relação NO/ROS a maior produção de

ROS e menor produção de NO pode originar o peroxinitrito, substância tóxica que

indica perfil pró-inflamatório [68]. Quando acontece o inverso, aumento de NO e

diminuição de ROS denota-se um perfil anti-inflamatório. Este conjunto de resultado

deixou claro o efeito da ativação colinérgica ou adrenérgica sobe a resposta

oxidante.

A adrenalina mostrou um aumento similar na resposta redutora em células de

ND e DM2. Durante o processo fagocítico o poder redutor foi maior em ND (9.4

vezes) do que em DM2 (4.4 vezes) (p<0.05) fig.11. Na presença de adrenalina

houve uma super estimulação no poder redutor de células de ND e DM2, o aumento

foi de 17.2 vezes em ND e 16.9 vezes em DM2, demonstrando que durante a

fagocitose a resposta antioxidante foi semelhante na presença de adrenalina.

46

Na fig.12 avaliamos o potencial redutor, durante a estimulação fagocítica e na

presença de carbamilcolina. Os resultados encontrados demonstram que houve

ativação da capacidade redutora na presença de carbamilcolina (E/C= 1.3 e 1.5

respectivamente ND e DM2), entretanto esta ativação não foi significativa (p>0.05).

Na presença de carbamilcolina houve aumento da atividade fagocítica tanto para ND

quanto para DM2, no entanto em ND a capacidade fagocítica foi de 7,7 vezes e em

DM2 4.6 vezes.

A capacidade redutora na presença de efetores colinérgicos durante o

processo fagocítico foi menor nos pacientes diabéticos isso sugere que, nessas

condições a hiperglicemia influencia o potencial redutor dos granulócitos durante a

fagocitose, diferentemente do que foi apresentado na produção de ROS.

47

No seu conjunto, os nossos resultados demonstram que a hiperglicemia do

diabetes tem efeito sobre a reatividade celular e sobre efetores solúveis da

imunidade inata.

48

7 CONCLUSÃO

Os nossos resultados sugerem que os efetores adrenérgico e colinérgico têm

uma ação direta sobre efetores da imunidade inata tanto na produção de ROS

quanto na produção de NO. A capacidade fagocítica também está alterada em

presença destes efetores. Demonstrando também que a capacidade

redutora/antioxidante pode estar diminuída em função de fatores exógenos tal como

a hiperglicemia, no caso do diabetes do tipo2. Sugerindo um efeito metabólico

adaptativo devido à hiperglicemia.

49

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