Upload
dinhkien
View
214
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS INTEGRADAS
EDINEI ROCHA DE ALMEIDA BOCARDI
Cuiabá 2017
EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS SUBMETIDOS AO
ESTRESSE CRÔNICO
EDINEI ROCHA DE ALMEIDA BOCARDI
EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS SUBMETIDOS AO
ESTRESSE CRÔNICO
Cuiabá 2017
Dissertação apresentada à UNIC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências Odontológicas Integradas. Orientadora: Profa. Dra. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff. Co-orientador: Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo.
FICHA CATALOGRÁFICA Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Ficha catalográfica Valéria Oliveira dos Anjos Bibliotecária - CRB1-1713
B664e Bocardi, Edinei Rocha de Almeida.
Efeito protetor da sinvastatina na progressão da doença periodontal induzida em ratos submetidos ao estresse crônico / Edinei Rocha de Almeida Bocardi – Cuiabá, 2017.
59 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas) - Programa de Pós-Graduação em Ciências Odontológicas Integradas, Universidade de Cuiabá.
Orientadora: Profª. Drª. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff. Co-Orientador: Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo. 1. Odontologia. 2. Periodontite. 3. Compostos Químicos e Drogas. 4. Sinvastatina I. Título.
CDU 616.314
Porque Eu, o SENHOR teu Deus, te seguro pela mão
direita e te declaro: Não temas, Eu te ajudarei.
Isaías 41;13
Dedico esse trabalho a minha família, em especial ao
meu esposo Antônio Bocardi Junior, pela paciência,
doação, compreensão, que muitas vezes renunciou aos
seus sonhos, para que eu pudesse realizar os meus, aos
meus filhos: Camila, João Vitor e Antônio Neto, que me
incentivaram, me ajudando a todo momento. Quero
dizer que essa conquista não é só minha, mas nossa.
Obrigada.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que me deu sabedoria, coragem, discernimento, paciência e
pessoas maravilhosas que me ajudaram a concluir esse trabalho.
Ao meu esposo Antônio Bocardi Junior, esposo exemplar em todos os momentos e
aos meus filhos Camila, João Vitor e Antônio Neto, pela compreensão por uma mãe
ausente quando tanto precisaram de um carinho de mãe. Tudo que consegui só foi
possível graças ao amor, apoio e dedicação que vocês sempre tiveram por mim.
Agradeço pela paciência e compreensão com minha ausência durante essa longa
jornada.
A minha família em especial, meus pais Pedro Cruz de Almeida e Evaldina Cardoso
Rocha, mesmo distante intercederam em oração por mim, incentivando a não
desanimar, meus irmãos Selson Rocha de Almeida, Gilsom Rocha de Almeida e
minha irmã Marinei Almeida de Azevedo sempre com o pensamento confiante que
serei capaz, minhas cunhadas e meu cunhado, Luciene Souza Cunha, Lucilé Ferreira
de Almeida e Wilson Azevedo de Oliveira, a família do meu esposo minhas cunhadas
Adele Maria Miglioli Bocardi, Vânia Maria Bocardi Patrão, Larissa de Oliveira Bocardi,
Fabiana Cristina Azevedo Bocardi, um círculo de amor onde a realização de um sonho
de uma é a felicidade de todas; aos meus cunhados; Sergio Luís Bocardi , Ricardo
bocardi, Renato Bocardi, Junior, obrigado pelo carinho que sempre tiveram por mim;
A todos os meus sobrinhos, sinto no dever de ser um exemplo de nunca desistir diante
das dificuldades; A minha sogra Maria Aparecida Jobim Bocardi, que esteve presente
nas minha decisões, meu muito obrigado.
Aos meus amigos(as); Cláudia da Fonseca Granjeiro, Cleiner Neves Ribeiro,
Christiane Marques Nogueira de Lima, Edinei Rocha de Almeida Bocardi, Elaine
Patrícia Alves de Araújo Gomes, Everton José da Silva, Gilberto Siebert Filho, Gislaine
Figueiredo Zarza Arguello Gonçalves, Joana Guimarães Freitas Silva, Kellin Pivatto,
Leniéser Fajardo Nunes, Leticia Lazzari Fantin, Natalino Francisco da Silva, Panmella
Furlan Alegria Zaffari, Thaise Ayres Bezerra Zuli, sinto privilegiada em fazer parte
dessa turma, agradeço a Deus pela amizade de cada um de vocês.
A todo o corpo docente do programa de mestrado, pela dedicação, educação e
atenção com que exercem seu ofício de ensinar.
Ao Prof. Dr. Alex Semenoff Segundo, pelo seu comprometimento e dedicação como
professor de pesquisa, demostrando seu conhecimento com toda gentileza, auxiliando
quando mais precisei, minha eterna admiração.
A minha querida orientadora Profa. Dra. Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff,
que Deus colocou no meu caminho, pessoa maravilhosa que transmite humildade,
sabedoria, agradeço pela paciência em receber-me, em sua casa em finais de semana
e com muita tranquilidade e respeito orientando e ensinando nas minhas inúmeras
duvidas, minha profunda gratidão e admiração.
À Universidade de Cuiabá – UNIC nas pessoas do Reitor Fernando Ciriaco Dias Neto,
do Pró Reitor Acadêmico José Cláudio Perecin, e, sobretudo, ao Diretor da Faculdade
de Odontologia da Universidade de Cuiabá – UNIC, Fábio Luís Miranda Pedro pelo
apoio irrestrito em oferecer todo apoio necessário para a realização deste trabalho.
Ao Programa de Mestrado da Universidade de Cuiabá – UNIC nas pessoas do Diretor
de Pós-Graduação Stricto Sensu da Kroton, Hélio Suguimoto e à Coordenadora de
Pesquisa e Pós-Graduação - Stricto Sensu da Universidade de Cuiabá – UNIC,
Lucélia de Oliveira Santos pelo esforço em conduzir o processo educativo e de
construção do conhecimento científico nesta Instituição.
À secretaria do Programa de Pós-Graduação da Universidade de Cuiabá nas pessoas
do José Bohnenberger e Jonielson Dias pela atenção e prontidão ao atendimento,
solucionando nossos pedidos e esclarecendo sempre as nossas dúvidas. A vocês
todo meu carinho.
E finalmente, agradeço profundamente o Coordenador do Programa de Mestrado em
Ciências Odontológicas Integradas, Prof. Dr. Álvaro Henrique Borges pelo seu
incentivo, determinação, orientações e preocupação com cada aluno, o meu muito
obrigado.
LISTA DE ABREVIATURAS
Cels/mm2 Células por milímetros quadrados
TNF-α Fatores de necrose tumoral alfa
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
HO-1 Heme oxigenase1
PDGF Platelet-derived growth factor
PLGA Poli-lático-co-ácido glicólico
LC3-II Phosphatidylethanolamine conjugate - marcador de autofagia
MC3T3E1 Linhagem de células pré osteoblásticas da calvária de ratos
PARP Poly (ADP-ribose) Polymerase
SVT Sinvastatina
RANKL Receptor ativador de fator nuclear kappa-β ligante
AST Aspartato aminotransferase
ALT Alanina aminotransferase
ATV Atorvastatina
RAR Raspagem e alisamento radicular
ISG Índice de sangramento gengival
IP Índice de placa
PS Profundidade de sondagem
NIC Nível de inserção clínica
SS Sangramento à sondagem
PRP Plasma rico em plaquetas
PRGF Plasma rico em fatores de crescimento
LPS Lipopolissacarídeo
SM Síndrome metabólica
DP Doença periodontal
OVX Ovariectomizado
Ti-6Al-4V Mini implante de titânio
MEV Microscopia eletrônica de varredura
BMP-2 Expressão de proteína morfogenética óssea 2
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR-2 Receptor de VEGF 2
Vwf Fator de von Willebrand
CD31 Cluster de diferenciação 31
PLGA Ácido co lactic- -glycolic
TC Tetraciclina
NPs Net Promoter Score
HA Hidroxiapatita
Βtcp β-fosfato tricálcico
GP Grupo Periodontite
GPE Grupo Periodontite e Estresse
GPES Grupo Periodontite, Estresse e Sinvastatina
GPS Grupo Periodontite e Sinvastatina
GC Grupo Controle
HPA Hipotálamo- pituitário-adrenal
PVC Poli cloreto de polivinila
JCE-PIH Perda de Inserção Histológica
JCE-PO Perda Óssea Histológica
ANOVA Análise de variância univariada
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 –
Demonstra as mensurações para: Perda de Inserção Histológica (JCE - PIH); Perda Óssea (JCE-PO) e as estruturas analisadas: PC - Polpa Coronária; PR - Polpa Radicular. JCE - Junção Cemento Esmalte; LP - Ligamento Periodontal; CO - Crista Óssea.
45
FIGURA 2 – Demostra médias e desvio padrão para perda de inserção histológica(JCE-PIH) nos grupos analisados
47
FIGURA 3 – Demonstra médias e desvios padrão para perda óssea histológica (JCE-PO) nos grupos analisados
47
–
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 19
1.1 REFERÊNCIA DA INTRODUÇÃO 21
2 REVISÃO DE LITERATURA 24
2.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA 35
3 EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO
DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS
SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO
38
3.1 PÁGINA TÍTULO 39
3.2 RESUMO 40
3.3 ABSTRACT 41
3.4 INTRODUÇÃO 42
3.5 MATERIAIS E MÉTODOS 43
3.6 RESULTADOS 46
3.7 DISCUSSÃO 48
3.8 CONCLUSÃO 49
3.9 REFERÊNCIAS 50
4 ANEXOS 55
19
1 INTRODUÇÃO
O estresse crônico tem sido investigado como um fator de risco para a
progressão da doença periodontal por gerar uma série de reações orgânicas. Inclusive
no eixo hipotálamo-pituitário-adrenal1, conduzindo a diversas alterações nos sistemas
de defesa do organismo, aumentando sua suscetibilidade a infecções virais como
gripe2 e herpes3, além de estar relacionado com aumento da pressão arterial4 e infarto
do miocárdio5.
As estatinas têm sido amplamente utilizadas na prática médica para
controle dos níveis de colesterol6,7. Com o aprofundamento das pesquisas científicas
sobre os efeitos deste fármaco, percebeu-se que além de sua função hipolipemiante8,
apresentam também efeitos antioxidantes9, anti-inflamatórios10 e imunomodulatório11.
De igual modo, estas substâncias têm sido relacionadas a indução de angiogênese12,
estímulo na diferenciação dos osteoblastos13 e formação óssea14-16.
Na odontologia, vários estudos têm buscado relacionar a sinvastatina ao
reparo e à regeneração óssea14,15. A partir destes achados, é plausível que essa
estatina possa influenciar o curso de doenças inflamatórias crônicas que acometam
tecido ósseo, como é o caso das periodontites crônicas17.
De modo que, o presente trabalho foi elaborado com o objetivo de verificar
se a sinvastatina é capaz de modular o processo de doença periodontal induzida em
ratos submetidos ou não ao estresse crônico.
21
1.1 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO
1. Hueston CM, Deak T. The inflamed axis: the interaction between stress, hormones and the expression of inflammatory-related genes within key structures comprising the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. Physiol Behav. 2014 Jan 30;124:77-91.
2. Segerstrom SC, Miller GE. Psychological stress and the human immune system: a meta-analytic study of 30 years of inquiry. Psychol Bull. 2004 Jul;130(4):601-30.
3. Cohen S, Janicki-Deverts D, Miller GE. Psychological stress and disease. JAMA 2007; 298(14): 1685-7.
4. Carrive P. Orexin, Stress and central cardiovascular control. A Link with Hypertension? Neurosci Biobehav Rev. 2016 Jul 29. pii: S0149-7634(16)30159-2.
5. Edmondson D, Newman JD, Whang W, Davidson KW. Emotional triggers in myocardial infarction: do they matter? Eur Heart J. 2013 Jan; 34(4):300-6.
6. Liu M, Jin YH, Li TH, Shi LH, Zhu BQ. Effect of simvastatin on atherosclerosis and central aortic pressure in ApoE gene knockout mice. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2014 May; 43(3):293-7.
7. Delahoy PJ, Magliano DJ, Webb K, Grobler M, Liew D. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes: an updated meta-analysis. Clin Ther. 2009 Feb;31(2):236-44.
8. Hörl G, Froehlich H, Ferstl U, Ledinski G, Binder J, Cvirn G et al. Simvastatin efficiently lowers small LDL-IgG immune complex levels: A therapeutic quality beyond the lipid-lowering effect. PLoS One. 2016 Feb 3;11(2):e0148210.
9. Mhaidat NM, Ali RM, Shotar AM, Alkaraki AK. Antioxidant activity of simvastatin prevents ifosfamide-induced nephrotoxicity. Pak J Pharm Sci. 2016 Mar;29(2):433-7.
10. Fu CH, Tsai WC, Lee TJ, Huang CC, Chang PH, Su Pang JH. Simvastatin inhibits IL-5-induced chemotaxis and CCR3 expression of HL-60-derived and human primary eosinophils. PLoSOne. 2016 Jun 8;11(6):e0157186.
11. Alam S, Ueki, K, Nakagawa K, Marukawa K, Hashiba Y, Yamamoto E et al. Statin induced bone morphogenetic protein (BMP)-2 expression during bone regeneration. An immunohistochemical study. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009 Jan;107(1):22-9.
12. Tan J, Yang N, Fu X, Cui Y, Guo Q, Ma T et al. Single-dose local simvastatin injection improves implant fixation via increased angiogenesis and bone formation in an ovariectomized rat model. Med Sci Monit. 2015 May 18;21:1428-39.
13. Chuang SC, Liao HJ, Li CJ, Wang GJ, Chang JK, Ho ML. Simvastatin enhances human osteoblast proliferation involved in mitochondrial energy generation. Eur J Pharmacol. 2013 Aug 15;714(1-3):74-82.
22
14. Du Z, Chen J, Yan F, Xiao Y. Effects of Simvastatin on bone healing around titanium implants in osteoporotic rats. Clin Oral Implants Res. 2009 Feb;20(2):145-50.
15. Faraco-Schwed FN, Mangueira LM, Ribeiro JV, Antao Ada S, Shibli JA. Removal torque analysis of implants in rabbit tibia after topical application of simvastatin gel. J Oral Implantol. 2014 Feb; 40(1):53-9.
16. Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen D, Rossini G et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 1999 Dec 3;286(5446):1946-9.
17. Dalcico R, de Menezes AM, Deocleciano OB, Oriá RB, Vale ML, Ribeiro RA, et al. Protective mechanisms of simvastatin in experimental periodontal disease. J Periodontol. 2013 Aug;84(8):1145-57.
24
2 REVISÃO DE LITERATURA
Nas últimas décadas a população mundial tem apresentado maiores
índices de hipercolesterolemia, (MacDonald e Morant, 2008; Al Rasadi et al., 2016)1,2
fato que tem sido relacionado com o aumento das doenças cardiovasculares e óbitos
em diferentes países (Delahoy et al., 2009)3.
Diversas opções terapêuticas têm sido propostas com o intuito de sanar
este problema de saúde. Neste sentido, a sinvastatina, fármaco da classe das
estatinas, promove a inibição da enzima 3-hidroxi-3-methyl-glutaril-CoA redutase
(HMG-CoA redutase) que é responsável pela síntese do colesterol em células
humanas, tem sido amplamente utilizada (Mundy et al., 1999)4.
A partir de estudos in vivo que tentam avaliar os efeitos colaterais,
secundários e interações medicamentosas deste medicamento, percebeu-se uma
associação entre a administração da sinvastatina e estímulo de formação e
regeneração óssea (Bradley, 2007; Park, 2009)5,6. Destaca-se ainda, nos mesmos
trabalhos, a descrição do aumento da atividade da fosfatase alcalina e seu
consequente efeito mineralizador, bem como, aumento de alguns componentes da
matriz óssea como a sialoproteína óssea, a osteocalcina e o colágeno tipo I. Além
disso, constatou-se efeitos anti-inflamatórios, provavelmente por reduzir a produção
de interleucina-6 e interleucina-8 e capacidade de estímulo na angiogênese.
Por essa razão, Junqueira et al. (2002)7 buscaram avaliar os efeitos da
sinvastatina sobre a regeneração óssea guiada em mandíbulas de ratas
ovariectomizadas e observar o nível de colesterol no sangue. Nos resultados
observaram que os animais ovariectomizados tinham níveis de colesterol mais
elevados do que os animais normais tratados com sinvastatina. Nas análises
densitométrica, histológica e morfométrica notaram que os animais ovariectomizados
tratados desenvolveram mais tecido ósseo do que os ratos ovariectomizados do grupo
controle, mas não foi observada diferença significativa entre os períodos de
tratamento. Com isso concluíram que a deficiência de estrogênio aumentou o nível de
colesterol no sangue e que a sinvastatina auxiliou a formação de tecido ósseo nos
animais ovariectomizados.
Com o intuito de analisar a neoformação óssea induzida por sinvastatina,
Wu et al. (2006)8 realizaram a extração de dentes de ratos e inseriram a sinvastatina
25
associada a um dispositivo de liberação lenta denominado poli-lático-co-ácido glicólico
(lactic-co-glycolic acid - PLGA) no interior do alvéolo dental, o que possibilitou a
avaliação do processo de reparo em diferentes tempos experimentais. Os resultados
demonstram o potencial biológico deste produto no estímulo da formação inicial das
fibrinas, bem como, a ação osteoindutiva e de antirreabsorção, minimizando-se a
cascata inflamatória ligada à destruição óssea ou ao atraso em caso de presença de
doenças como a diabetes e o uso do tabaco.
Marcondes et al. (2008)8, avaliaram o efeito da sinvastatina na perda óssea
causada por periodontite induzida por ligadura nos primeiros molares inferiores. Os
animais do grupo tratado receberam, por via oral, 30 mg/kg de sinvastatina e os
animais do grupo controle receberam o mesmo volume de água filtrada, diariamente
por quatro semanas. Para a demarcação da junção cemento-esmalte, as
hemimandíbulas direitas permaneceram durante 30 minutos em solução de azul de
metileno a 1% e em seguida foram posicionadas sobre lâminas de vidro com cera
utilidade. As imagens captadas por lupa estereoscópica, em aumento de 20 vezes,
foram digitalizadas, e desse modo, permitiu-se realizar a demarcação das áreas entre
a junção amelo-cementária e o topo da crista alveolar lingual do primeiro molar inferior.
Após análise estatística, não foi observada diferença entre os grupos. Com isso os
autores concluíram que a sinvastatina não foi eficiente para a redução da perda óssea
relacionada à periodontite.
Lin et al. (2009)10 buscaram avaliar o efeito da sinvastatina em células
osteoblásticas humanas e na periodontite apical em ratos. Para tanto, uma linha
celular de osteossarcoma humano, com um fenótipo osteoblástico foi incubada em
meio adequado e semeadas a uma densidade de 5.105cels/mm2 em placas de cultura
de 10cm de diâmetro, tratadas com 20Ng/mL de fator de necrose tumoral alfa (TNF-
α). Após esse procedimento, as células foram avaliadas em 0, 4, 8, 12, e 24 horas.
Para análise da periodontite apical, os animais foram submetidos à abertura coronária
e às injeções subcutâneas de 20 miligramas de sinvastatina por cada quilograma de
peso corporal (Grupo experimental com 10 animais) ou a solução salina normal
(Grupo controle com 10 animais) diariamente até o sacrifício. Os animais foram
sacrificados 20 dias após a indução da lesão apical. As peças foram submetidas ao
sistema de análise de imagens Digora. As mandíbulas foram fixadas em
paraformaldeído a 4% em 4ºC durante 48 horas, descalcificadas com ácido
26
etilenodiamino tetra-acético (EDTA) a 14% e incorporados em cera de parafina. Foi
possível observar que a sinvastatina atenuou os níveis de TNF-α e atenuou
significativamente a reabsorção óssea periapical em comparação com o grupo
controle.
Min et al. (2010)11 investigaram o efeito da sinvastatina adicionada na polpa
dentária de células humanas na estimulação odontogênica, na diferenciação
odontoblástica e no mecanismo de crescimento de novos vasos sanguíneos,
angiogênico. Após 14 dias de cultura celular na presença de sinvastatina, as células
foram fixadas em etanol a 70% arrefecido com gelo durante 1 hora e lavadas com
água destilada. As células foram coradas com 40 mmol/L de vermelho de alizarina sal
sódica. As amostras foram separadas e transferidas para membranas de nitrocelulose
e foi utilizado um estojo de quimiluminescência aumentada. As imagens foram então
captadas por uma câmera digital. A intensidade da cor vermelha de alizarina e cada
expressão de proteínas após normalização com β-actina foram quantificadas
utilizando um densitômetro. Este estudo demonstra que a sinvastatina é capaz de
induzir angiogênese e odontogênese e estes efeitos são mediados através da via de
Heme oxigenase1 (HO-1). Os dados ressaltam fortemente os efeitos da sinvastatina
na regeneração de polpas dentárias danificadas e na estimulação no reparo
dentinário.
Apesar dos fatores positivos, alguns trabalhos apontam alguns insucessos
nas tentativas de osteoindução por sinvastatina na superfície de implantes dentários,
e algumas repostas negativas ao associar a sinvastatina com matriz óssea bovina em
defeitos críticos realizados em calota craniana (Lima, Calixto e Anbinder, 2011)12.
Em 2012, Chang et al.13 associaram a sinvastatina ao fator de crescimento
de plaquetas (PDGF -platelet-derived growth factor) e inseriram esta mistura em
alvéolos dentários de ratos, recém-submetidos à exodontia, utilizando-se também o
mecanismo de liberação lenta de PLGA. Ao observar os diferentes tempos
experimentais, percebeu-se que aos 28 dias, tempo protocolar para verificação de
reparo ósseo alveolar, a osteoblastogênesis e a maturação óssea estavam mais
completas que nos outros grupos de análise - grupo controle negativo, grupos onde
somente a sinvastatina ou o PDGF foram utilizados.
Lai et al. (2012)14 desenvolveram um estudo com intuito de observar o
efeito de sinvastatina em autofagia/apoptose em osteoblastose e também o
27
significado desta ação sobre a progressão da periodontite apical induzida em rato. Os
autores examinaram a expressão do marcador proteolítico de cadeia leve - Light
ChainLC3-II (um marcador de autofagia) e de uma cultura de osteoblastos
provenientes de calvária de ratos MC3T3E1 (um marcador de apoptose) por análise
de Western Blott. A Sinvastatina causou o aumento da formação LC3-II induzida por
água oxigenada e simultaneamente diminuiu a fragmentação da enzima denominada
poly-ADP-ribose polymerase (PARP). Radiografia e exames imunopatológicos
demonstraram que a sinvastatina reduziu o número de osteoblastos apoptóticos e a
extensão das lesões periapicais em ratos. O número de osteoblastos sintetizados
também aumentou acentuadamente após tratamento com sinvastatina. Os autores
puderam concluir que há uma relação negativa entre a autofagia e apoptose em
células osteoblásticas.
Com objetivo de avaliar o efeito da sinvastatina (SVT) em ratos submetidos
à indução de periodontite induzida através de ligadura, Dalcico et al. (2013)15,
administraram doses de SVT em diferentes concentrações através de gavagem. Para
avaliação da perda óssea foram utilizadas mensurações de perda óssea morfológica
e histológica. Além disso, realizou-se a análise das metaloproteinases 1 e 8; do
receptor ativador de fator nuclear kappa-β ligante (RANKL), de proteínas ósseas
morfogenéticas e osteoprotegerin. Os resultados da pesquisa demonstram que o uso
de SVT melhorou os indicadores de perda óssea alveolar nos parâmetros histológicos
e histométricos, além de todos os parâmetros imunoinflamatórios estudados
demonstrarem atividade anti-inflamatória e antioxidante. Um fator relevante, é que
apenas na maior concentração, de 30 miligramas por quilograma (mg/kg) houve um
aumento no tempo de atividade de protombina comparado com o grupo controle. Para
os indicadores de atividade do fígado, com importante papel na resposta inflamatória,
não houve diferenças nos níveis de aminotransferase aspartato (AST) e alcalino
fosfatase (ALT). As conclusões dos autores clarificam o potencial da SVT em
promover uma resposta anti-inflamatória local e sistêmica com repercussões
significativas de periodonto de ratos com indução de periodontite.
Lin et al., (2013)16 estudaram se a sinvastatina era capaz de modular
anticorpos e proteínas policlonais em osteoclastos cultivados em ratos, além de
verificar o efeito da sinvastatina sobre a quimiotaxia de macrófagos. Estes marcadores
foram analisados na progressão da doença em um modelo de rato com periodontite
28
apical. Injeções subcutâneas de sinvastatina (20mg/kg de peso corporal) ou solução
salina normal (como controle) foram ministradas entre o primeiro e o vigésimo primeiro
dia, quando os animais foram eutanasiados. Os maxilares foram dissecados e
radiografados. As radiografias obtidas foram colhidas e analisadas pelo sistema de
análise de imagem Digora. Os resultados deste estudo demonstram que a sinvastatina
pode diminuir lesões periapicais por ativar a os anticorpos analisados e suprimir a
síntese de osteoblastos. Tomando o conjunto de dados in vitro e in vivo, observou que
a sinvastatina pode retardar a progressão de lesões periapicais.
Pradeep et al., (2013)17 buscaram investigar a efetividade de 1,2% de
atorvastatina (ATV) como adjuvante do tratamento periodontal convencional de
raspagem e alisamento radicular (RAR) em dentes com bolsas intraósseas. Para
tanto, sessenta indivíduos foram randomicamente divididos em dois grupos de
tratamento: RAR associado a 1,2% de ATV ou RAR associado a placebo gel. No início
do estudo, aos 3, 6 e 9 meses, os parâmetros clínicos, que incluíam índice de
sangramento gengival (ISG), índice de placa (IP), profundidade de sondagem (PS) e
nível de inserção clínica (NIC), foram registrados nas fichas clínicas. A avaliação
radiográfica para a análise dos defeitos intraósseos foi feita usando software
computadorizado no início do estudo em 6 e 9 meses. Os autores verificaram que a
redução média da PS e o ganho médio de NIC foram maiores no grupo ATV do que
no grupo placebo aos 3, 6 e 9 meses. Uma média significativamente maior de
preenchimento ósseo radiográfico foi encontrada no grupo ATV (35,49% ± 5,50%) em
comparação com o grupo placebo (1,82% ± 1,32%) após 9 meses. Fato que levou os
autores a concluírem que a ATV pode oferecer novas perspectivas de tratamento para
os defeitos intraósseos.
Rao et al. (2013)18 realizaram um ensaio clínico, em humanos, com o uso da
sinvastatina como coadjuvante ao tratamento da periodontite. Para esta finalidade, os
autores avaliaram pacientes portadores de periodontite e fumantes distribuídos em
dois grupos: Grupo teste - 20 participantes foram submetidos a raspagem e
alisamento radicular, instrução de higiene bucal através de duas escovações dentais
diárias pela técnica e uso tópico de gel de sinvastatina a 1,2%. Grupo Controle – 20
participantes foram submetidos aos mesmos procedimentos clínicos e aplicação
tópica de gel placebo. Os pacientes foram avaliados por exame clínico periodontal
através de: profundidade de sondagem (PS), do sangramento à sondagem (SS), nível
29
de inserção clínica (NIC) e exame radiográfico um dia após o tratamento, aos três,
seis e nove meses. Nenhum anti-inflamatório ou antibiótico pode ser ingerido pelos
pacientes seis meses antes ou durante o tempo experimental nem qualquer
complemento de higiene. Os resultados demonstram que 35 dos 40 pacientes
completaram o estudo e estes não apresentaram qualquer reação à droga ou ao
placebo. O grupo teste apresentou redução significativa da PS, do SS e ganho no NIC
comparado ao grupo placebo. Radiograficamente o grupo que usou sinvastatina
demonstrou maior frequência de preenchimento de defeitos ósseos vertical aos 6 e 9
meses se comparado ao placebo nos períodos de seis e nove meses.
Rivera et al. (2013)19 avaliaram os efeitos de tratamento da combinação da
sinvastatina, com plasma rico em plaquetas (PRP) ou plasma rico em fatores de
crescimento (PRGF), na regeneração e reparação de osso alveolar. Os animais foram
divididos em seis grupos de três ratos cada, em dois Grupos: Água (placebo) e Água
associada a sinvastatina. Após anestesia foi induzida uma lesão de dois milímetros
na distal do incisivo inferior. No dia seguinte da indução da lesão óssea, iniciou a
dosagem de 20 mg/kg/dia de sinvastatina diluída em água destilada, administrada por
via oral durante 6 semanas. Para análise, os maxilares dos ratos foram
hemiseccionados, fixados com formalina a 10%, descalcificados em ácido nítrico a 5%
durante sete dias e submetidos a coloração com hematoxilina e eosina. Após análise
histológica as imagens foram capturadas através de uma câmera digital conectada ao
microscópio e, em seguida, conectado a um computador para mensuração e
tabulação dos dados. Os autores puderam observar que não houve nenhuma
diferenciação entre os dois tratamentos, não dando para determinar qual preparação
foi mais produtiva em seus processos de regeneração do osso.
Jin et al. (2014a)20 ultilizaram um modelo de indução da doença periodontal
por meio de lipopolissacarídeo (LPS) em ratos, associando o efeito da sinvastatina
uma estatina comumente prescritos em problemas de inflamação gengival e perda de
osso alveolar. Foram selecionados 28 ratos e divididos em 3 grupos; grupo 1 (PBS) -
n= 7, grupo 2 (LPS) n= 8; grupo 3 (LPS + Sinvastatina) - n= 13. Nos grupos 2 e 3
foram injetados na gengiva 20 µg/ml de (LPS) entre o 1º e 2º molar superior três vezes
por semana por um período de 8 semanas, no grupo 3, foram administrados 20ml de
sinvastatina diariamente por 8 semanas por meio de gavagem. Após este período de
tratamento, a perda óssea alveolar foi analisada com tomografia computadorizada. Os
30
resultados deste estudo mostrou que a indução LPS aumenta acentuadamente a
perda óssea, estimulando as citoquinas inflamatórias, mas a administração de
sinvastatina diminui significativamente a perda óssea, inibindo significativamente o
efeito de LPS, dificultando assim a progressão da doença periodontal.
Jin et al. (2014b)21 estudaram a relação entre a síndrome metabólica (SM)
e doença periodontal (DP). Para tanto, 20 ratas fêmeas obesas Zucker e 22 ratas
fêmeas magras de 12 semanas de idade foram selecionadas. As ratas fêmeas obesas
apresentavam a SM incluindo a obesidade, resistência à insulina, a dislipidemia e a
hiperinsulinemia. A DP foi induzida nas ratas obesas e nas ratas magras por injeção
Actinobacillus Aggregatibacter e de lipopolissacarídeo (LPS) no periodonto. Para
metade dos animais de cada grupo, a sinvastatina foi administrada por meio de
gavagem. Após 4 semanas de tratamento, foram feitas tomografias e a perda óssea
alveolar foi calculada. Os resultados mostraram que a perda de osso alveolar foi
aumentada nos grupos que usou LPS, e foi significantemente maior no grupo de ratas
obesas com SM. Os resultados também mostraram que a sinvastatina foi capaz de
diminuir a osteoclastogênese em comparação aos grupos que não fizeram uso do
medicamento.
Montero et al. (2014)22 desenvolveram uma revisão sistemática sobre o uso
tópico da sinvastatina na regeneração óssea. O objetivo foi resumir os artigos bem
delineados sobre o uso da sinvastatina na promoção da regeneração óssea, além de
evidenciar o que suporta estas descobertas. Diante dos achados, percebe-se que
76,2% dos artigos são dos últimos 5 anos e envolveram estudos em animais, sendo
estes 66,6% com ratos ou coelhos, utilizando regiões extra orais. Os autores ainda
informam que apenas quatro ensaios clínicos randomizados demonstraram que a
administração tópica da SVT no local de análise obteve sucesso nos achados clínicos.
Os referenciados autores22 relatam que a sinvastatina parece contribuir
efetivamente para a formação óssea e para regeneração periodontal no local da
liberação de SVT; existem ainda vários estudos sobre a associação de fórmulas
poliméricas biodegradáveis e sinvastatina. Este fator ocorre pelo fato da sinvastatina
ser insolúvel em água, tal como um hidrogel gelatinoso ou microesferas de PLGA, que
ao lado de outros transportadores, mostraram-se capazes de liberar biomoléculas
formadoras de osso. Os autores destacam que os resultados da aplicação tópica de
SVT são favoráveis, quer seja ela introduzida sozinha ou combinada com biomateriais.
31
Xu et al. (2014)23 estudaram o efeito local e sistêmico da sinvastatina no
maxilar em ratos com osteoporose e periodontite. Foram usados 36 ratas Sprague
Dawley de 4 meses de idade e divididos em seis grupos: 1-grupo Sham; 2-grupo
ligadura; 3-grupo ovariectomizado (OVX) + ligadura; 4-sinvastatina local + OVX +
ligadura; 5-sinvastatina oral + OVX + ligadura; 6-sinvastatina oral e local em ratos OVX
+ ligaduras. Foi realizada a ovariectomia bilateral nos grupos 3, 4, 5 e 6. Após um
mês, realizou-se indução de periodontite por inserção de ligaduras nos sulcos
gengivais dos primeiros e segundos molares superiores dos animais dos grupos de 2,
3, 4, 5 e 6. Foi administrado a sinvastatina (25 mg/kg) ou placebo oral e/ou local por
um período de dois meses. Foram colhidos os resultados através da Tomografia
computadorizada para avaliação do osso alveolar. Os resultados mostraram que
através da administração de sinvastatina local houve aumento na altura da crista
alveolar e impediu a perda óssea alveolar em locais sem alteração da perda óssea
sistêmica. A administração oral preveniu a perda óssea local e sistêmica, sem efeito
na altura da crista alveolar. Com este estudo os autores concluíram que a sinvastatina
tem o potencial de promover a formação óssea e reduzir a perda óssea alveolar.
Fang et al. (2015)24 utilizaram um processo eletroquímico para depositar
sinvastatina como revestimento da superfície de implantes porosos para avaliar a
formação e integração do implante com o tecido ósseo de ratos com osteoporose.
Foram utilizados 72 implantes em 36 ratos divididos em três grupos: Grupo controle,
Grupo de ratos com osteoporose e Grupo de ratos sadios. Após 12 semanas da
ovariectomia bilateral dois implantes diferentes foram inseridos na tíbia de cada
animal. Após 2, 4 e 12 semanas, os animais foram sacrificados e o tecido em torno
dos implantes foram submetidos a avaliação histomorfométrica. A porcentagem de
contato osso-implante ao longo das espiras dos implantes e a percentagem da área
óssea no interior das mesmas foram medidas. Após análise dos resultados, os autores
concluíram que as superfícies de implantes com sinvastatina melhoram a
osseointegração de implantes em ratos com osteoporose.
Tan et al. (2015)25 avaliaram o efeito da sinvastatina utilizada como uma
única injeção local quanto à formação e reparação óssea, promovendo
osseointegração e melhorando assim a fixação dos implantes. Para essa pesquisa
foram utilizadas 48 ratas fêmeas, com 3 meses de idade e aproximadamente
260,68±16,85 gramas de peso. Após um período de 2 semanas de adaptação ao
32
ambiente, os animais foram submetidos a ovariectomia bilateral para induzir a
osteoporose por doze semanas, após esse período, os animais foram divididos em
três grupos com 16 ratas em cada grupo: 1) implante com 5 mg sinvastatina; 2)
implante com 10 mg de sinvastatina; 3) implante sem sinvastatina. Com uma broca de
baixa velocidade e irrigação salina fria, foi realizada um orifício no osso cortical
contralateral, perfurado perpendicular ao eixo longo do fêmur esquerdo, em seguida
foi inserido um mini implante de titânio Ti-6 Al-4V na perfuração, e a pele foi suturada.
Após quatro semanas, quatro ratos foram separados aleatoriamente de cada grupo e
eutanasiados para a análise histológica e microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Com o presente estudo os autores concluíram que a injeção única de sinvastatina
tanto em 5mg como em 10mg aumenta a formação óssea e evidencia a regeneração
e osseointegração dos implantes em ratas ovariectomizadas.
Wang et al. (2015)26 utilizaram nano partículas para elaboração de PLGA e
tetraciclina (TC-PLGA). Foi escolhido a Sinvastatina (SVT) para induzir o aumento da
osteogênese. Foi enxertada - SVT carregado de TC PLGA PN (SVT / TC- PLGA PN)
para aumentar a quantidade de SVT no osso, tendo um melhor efeito de regeneração
do osso com osteoporose. Todos os ratos, foram submetidos a cirurgia de
ovariectomia bilateralmente sob anestesia com pentobarbital de sódio (40 mg/kg),
exceto os ratos do grupo 1 que foram submetidos a uma operação simulada a
ovariectomia sob as mesmas condições de anestesia e invasão abdominal. Após um
mês da cirurgia começou a injeção de SVT, percorrendo por 2 meses. Após os 2
meses de injeção, todos os animais foram eutanasiados e feita a remoção dos fêmures
para análise radiográfica. Os autores concluíram que as NPs de direcionamento do
osso, com base na conjugação de TC para os copolímeros de PLGA, teve a
capacidade de segmentar osso, e a sua utilização para o tratamento da osteoporose
com a SVT foi conseguida com sucesso.
Bradley et al. (2016)27 avaliaram o efeito da sinvastatina na perda óssea e na
inflamação da periodontite experimental. 50 ratas Sprague Dawley fêmeas foram
divididas igualmente em cinco grupos: 1) apenas sinvastatina; 2) 0,5 mg de
sinvastatina e ligadura; 3) 1,0 mg de sinvastatina e ligadura; 4) 1,5 mg de sinvastatina
e ligadura; 5) apenas ligadura. Os animais dos grupos 2, 3, 4, e 5 foram submetidos à
indução de periodontite experimental por ligadura entre o primeiro e segundo molares
superiores. Quatro semanas após o início do experimento os animais foram
33
eutanasiados, e os molares superiores foram avaliados histopatologicamente e com
tomografia micro computadorizada. Os autores perceberam que o grupo submetido à
ligadura, sem sinvastatina, teve uma perda óssea média de 1,01 ± 0,06 mm. Todas
as doses de sinvastatina reduziram a perda óssea, especialmente 1,5 mg que levou a
uma perda óssea de 0,68 ± 0,05 mm, que, inclusive, não foi estatisticamente diferente
do controle contralateral (0,47 ± 0,06 mm). A dose de 1,5 mg de sinvastatina também
reduziu a percentagem de neutrófilos em comparação com os animais que tiveram
apenas indução por ligadura. Os autores concluíram que múltiplas doses locais de 1,5
mg de sinvastatina diminuem a quantidade de perda óssea e de células inflamatórias
na periodontite experimental em ratos.
Encarnação et al. (2016)28 avaliaram a resposta tecidual da calvaria de ratos à
implantação de sinvastatina associada a hidroxiapatita e β-fosfato tricálcico inseridos
em um dispositivo de liberação lenta (PLGA + SVT + HA + βTCP). Para tanto, foram
realizados dois defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos, que foram
distribuídos nos grupos experimentais e no controle. As amostras de tecido foram
colhidas nos dias 1, 7, 15, 30 e 60 após a cirurgia. A inflamação foi avaliada pela
quantificação da interleucina-1β e do fator de necrose tumoral alfa e por um
hemograma, enquanto a reparação óssea foi avaliada por densitometria e microscopia
eletrônica de varredura. Os autores verificaram que houve aumento da expressão de
citocinas nos grupos que usaram sinvastatina no dia 1 após a cirurgia, porém não
foram observadas alterações no hemograma. Aos 60 dias após a cirurgia todos os
grupos apresentaram valores de densitometria e características morfológicas
semelhantes, apesar da ocorrência de atraso na formação óssea no grupo
sinvastatina.
35
2.1 REFERÊNCIAS DA REVISÃO DE LITERATURA
1. MacDonald TM, Morant SV. Prevalence and treatment of isolated and concurrent hypertension and hypercholesterolaemia in the united kingdom. British Journal of Clinical Pharmacology 2008;65:775- 86.
2. Al Rasadi K, Almahmeed W, Al Habib KF, Abifadel M, Ali Farhan H, Al Sifri S at al. Dyslipidaemia in the middle east: current status and a call for action. Atherosclerosis. 2016;252:182-18.
3. Delahoy PJ, Magliano DJ, Webb K, Grobler M, Liew D. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes: an updated meta-analysis. Clin Ther 2009 Feb;31(2):236-44.
4. Mundy G, Garrett R, Harris S, Chan J, Chen D, Rossini G et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science 1999 Dec 3;286(5446):1946-9.
5. Bradley AD, Zhang Y, Jia Z, Zhao G, Wang X, Pranke L, Schmid MJ, Wang D, Reinhardt RA. Effect of simvastatin prodrug on experimental periodontitis. J Periodontol. 2016 May;87(5):577-82.
6. Park JB. The use of simvastatin in bone regeneration. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2009 Sep 1;14(9):e485-8. Review. PubMed PMID: 19415061.
7. Junqueira JC, Mancini MNG, Carvalho YR, Anbinder AL, Balducci I, Rocha RF. Effects of simvastatin on bone regeneration in the mandible of ovariectomized rats and on blood cholesterol levels. J Oral Sci. 2002; 44(3/4):117-124.
8. Wu Z, Sun HC, Liu ST, Wang Y. Effect of simvastatin on residual ridge resorption after tooth extraction. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2006 Dec; 41(12):747-50. Chinese. PubMed PMID: 17349198.
9. Marcondes MS, Gomes FC, Anbinder AL. Influência do tratamento com sinvastatina na periodontite induzida em ratos Rev. bras. odontol., Rio de Janeiro, v. 65, n. 1, p.122-125, jan./jun. 2008.
10. Lin SK, Kok SH, Lee YL, Hou KL, Lin YT, Chen MH, et al. Simvastatin as a novel strategy to alleviate periapical lesions. J Endod 2009 May; 35(5):657-62.
11. Min KS, Lee YM, Hong SO, Kim EC, Press enter key for correspondence information simvastatin promotes odontoblastic differentiation and expression of angiogenic factors via heme oxygenase-1 in primary cultured human dental pulp cells. Journal of Endodontics March 2010; 36(3):447-52.
12. Lima CE, Calixto JC, Anbinder AL. Influence of the association between simvastatin and demineralized bovine bone matrix on bone repair in rats. Braz Oral Res 2011 Jan-Feb; 25(1):42-8.
36
13. Chang PC, Chung MC, Lei C, Chong LY, Wang CH. Biocompatibility of PDGF-simvastatin double-walled PLGA (PDLLA) microspheres for dentoalveolar regeneration: a preliminary study. J Biomed Mater Res A 2012 Nov; 100(11):2970-8.
14. Lai EH, Hong CY, Kok SH, Hou KL, Chao LH, Lin LD, et al. Simvastatin alleviates the progression of periapical lesions by modulating autophagy and apoptosis in osteoblasts. J Endod 2012 Jun; 38(6):757-63.
15. Dalcico R, de Menezes AM, Deocleciano OB, Oriá RB, Vale ML, Ribeiro RA, Brito GA. Protective mechanisms of simvastatin in experimental periodontal disease. J Periodontol. 2013 Aug; 84(8):1145-57.
16. Lin LD, Lin SK, Chao YL, Kok SH, Hong CY, Hou KL, et al. Simvastatin suppresses osteoblastic expression of Cyr61 and progression of apical periodontitis through enhancement of the transcription factor Forkhead/winged helix box protein O3a. J Endod 2013 May; 39(5):619-25.
17. Pradeep AR, Kumari M, Rao NS, Martande SS, Naik SB. Clinical efficacy of subgingivally delivered 1.2% atorvastatin in chronic periodontitis: a randomized controlled clinical trial. J Periodontol. 2013 Jul; 84(7):871-9.
18. Rao NS, Pradeep AR, Bajaj P, Kumari M, Naik SB. Simvastatin local drug delivery in smokers with chronic periodontitis: a randomized controlled clinical trial. Australian Dental Journal 2013; 58: 156–162 doi: 10.1111/adj.12042
19. Rivera C, Monsalve F, Salas J, Morán A, Suazo I. Platelet-rich plasma, plasma rich in growth factors and simvastatin in the regeneration and repair of alveolar bone. Exp Ther Med. 2013 Dec;6(6):1543-1549.
20. Jin J, Zhang X, Lu Z, Li Y, Lopes-Virella MF, Yu H, Haycraft CJ, Li Q, Kirkwood KL, Huang Y. Simvastatin inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis and reduces alveolar bone loss in experimental periodontal disease. J Periodontal Res. 2014a Aug; 49(4):518-26.
21. Jin J, Machado ER, Yu H, Zhang X, Lu Z, Lin Y, Lopes-Virella MF, Kirkwood KL, Huang Y. Simvastatin inhibits LPS-induced alveolar bone loss during metabolic syndrome. J Dent Res 2014b Mar; 93(3): 294–299.
22. Montero, J; Manzano, G; Albaladejo, A. The role of topical simvastatin on bone regeneration: A systematic review. J Clin Exp Dent 2014 Jul; 6(3): e 286-90.
23. Xu XC, Chen H, Zhang X, Zhai ZJ, Liu XQ, Qin A, Lu EY. Simvastatin prevents alveolar bone loss in an experimental rat model of periodontitis after ovariectomy. J Transl Med. 2014 Oct 1;12:284.
24. Fang W, Zhao S, He F, Liu L, Yang G. Influence of simvastatin-loaded implants on osseointegration in an ovariectomized animal model. Biomed Res Int. 2015; 2015:831504.
25. Tan J, Yang N, Fu X, Cui Y, Guo Q, Ma T, Yin X, Leng H, Song C. Single-dose local simvastatin injection improves implant fixation via increased angiogenesis and
37
bone formation in an ovariectomized rat model. Med Sci Monit. 2015 May 18;21:1428-39.
26. Wang H, Liu J, Tao S, Chai G, Wang J, Hu FQ, Yuan H. Tetracycline-grafted PLGA nanoparticles as bone-targeting drug delivery system. Int J Nanomedicine. 2015 Sep 8;10:5671-85.
27. Bradley AD, Zhang Y, Jia Z, Zhao G, Wang X, Pranke L, Schmid MJ, Wang D, Reinhardt RA. Effect of simvastatin prodrug on experimental periodontitis. J Periodontol. 2016 May; 87(5):577-82. doi: 10.1902/jop.2016.150599. PubMed PMID:26799395.
28. Encarnação IC, Xavier CC, Bobinski F, dos Santos AR, Corrêa M, de Freitas SF, Aragonez A, Goldfeder EM, Cordeiro MM. Analysis of bone repair and Inflammatory process caused by simvastatin combined with PLGA+HA+βTCP scaffold. Implant Dent. 2016 Feb;25(1):140-8. doi: 10.1097/ID.0000000000000359. PubMed PMID: 26606285.
38
3 EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA
NA PROGRESSÃO DA DOENÇA
PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS
SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO.
39
3.1 PÁGINA DE APRESENTAÇÃO - TITLE PAGE
EFEITO PROTETOR DA SINVASTATINA NA PROGRESSÃO DA DOENÇA PERIODONTAL INDUZIDA EM RATOS SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO
Edinei Rocha de Almeida Bocardi*
Alex Semenoff Segundo**
Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff**
*Pós-Graduanda do Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas da Universidade de Cuiabá – MT, Brasil. **Professores do Programa de Pós-Graduação da Universidade de Cuiabá – UNIC. Mestrado em Ciências Odontológicas Integradas. CORRESPONDING AUTHOR
Tereza Aparecida Delle Vedove Semenoff Avenida Manoel José de Arruda, 3100. Bairro Jardim Europa. CEP 78065-900. Cuiabá – MT, Brasil.Telefone:+ 55 065981131377. E-mail: [email protected]
40
3.2 RESUMO
Objetivou-se avaliar histologicamente o efeito do uso da sinvastatina na modulação
da periodontite induzida por ligadura em ratos submetidos ao estresse crônico.
Cinquenta ratos Wistar foram divididos em cinco grupos (N=10): grupo periodontite
(GP), grupo periodontite e estresse (GPE), grupo periodontite, estresse e sinvastatina
(GPES), grupo periodontite e sinvastatina (GPS) e grupo controle (GC). Entre o
primeiro e o trigésimo dia experimental, os animais dos grupos GPS e GPES foram
submetidos à ingestão oral diária de sinvastatina (6mg/dia). No segundo dia,
procedeu-se a indução da periodontite nos GP, GPE, GPES e GPS, através da
inserção de um fio de sutura em torno do segundo molar superior direito. Entre o
terceiro e o trigésimo dia o GPE e o GPES foram submetidos ao modelo de estresse
crônico - imobilização por 12 horas. Não houve intervenção no GC, apesar deste grupo
permanecer no mesmo local e sob as mesmas condições climáticas e de nutrição que
os outros animais. Após 30 dias foi realizada a eutanásia de todos os animais. As
maxilas foram coletadas e processadas para análise histológica. As imagens
histopatológicas foram capturadas por uma câmera acoplada ao microscópio de luz
branca binocular e transferidas para um televisor. A histometria foi realizada através
da mensuração, em centímetros, das perdas de inserção histológica e de osso
alveolar, (Anova – Post Hoc, Tuckey). Os resultados do trabalho demonstram que o
GPE obteve a maior destruição comparado aos outros grupos, tanto para o nível de
inserção periodontal como para osso alveolar (p<0,05). O GPES e GP não tiveram
diferenças estatísticas entre si (p<0,05), entretanto tiveram diferenças estatísticas
comparado aos GPE e GC (p<0,05). O GC obteve os menores resultados de perda
de inserção, sendo similar apenas com o GPS (p>0,05). Concluindo, a sinvastatina é
capaz de diminuir a progressão da periodontite induzida por ligadura em ratos
submetidos ao estresse crônico.
Palavras-chave: Sinvastatina, Periodontite induzida, Estresse, Ratos.
41
3.3 ABSTRACT
This article aimed to evaluate histologically the effect of simvastatin use on the
modulation of ligature induced periodontitis in rats submitted to chronic stress. Fifty
Wistar rats were divided into five groups (N=10): Periodontitis Group (PG),
Periodontitis and Stress Group (PSG), Periodontitis, Stress and Simvastatin Group
(PSSiG), Periodontitis and Simvastatin Group (PSiG) and Control Group (CG).
Between first and thirtieth experimental day, animals from PSiG and PESiG groups
were submitted to daily intake of simvastatin (6mg/day) via gavage. On the second
day, PG, PSG, PSSiG and PSiG were submitted to periodontitis induction by insertion
of a suture wire around the second right upper molar. Between third and thirtieth day,
PSG and PSSiG were submitted to the chronic physical stress - immobilization model
for 12 hours. Nothing was done in the CG, although the animals in this group remained
in the same place and under same climatic and nutritional conditions as the other
animals. After 30 days, all animals were euthanized. Jaws were collected and
processed for histological analysis. The histopathological images were captured by a
camera coupled to the binocular optical microscope and transferred to a television set.
Histometry was performed by measuring, in centimeters, the losses of fiber and
alveolar bone insertion (Anova - Post Hoc, Tuckey). The results showed that PSG
obtained the highest destruction of all groups for both periodontal insertion and alveolar
bone (p<0.05). GPSSi and PG did not have statistical differences among themselves
(p<0.05), however they had statistical differences compared to PSG and GC (p<0.05).
The CG obtained the lowest results of insertion loss, being similar only with GPS
(p>0.05). In conclusion, simvastatin is able to decrease the progression of ligature-
induced periodontitis in rats subjected to chronic stress.
Keywords: Simvastatin, Induced periodontitis, Stress, Rats.
42
3.4 INTRODUÇÃO
O estresse é biologicamente descrito como uma ativação do eixo
hipotálamo-pituitário-adrenal (HPA), parte do sistema nervoso autônomo (Marques-
Deak, 2004)1.
Apesar de ainda não se conhecer amplamente a magnitude das alterações
provocadas por um evento estressante, sabe-se que tal acontecimento tem a
capacidade de induzir modificações no sistema imunológico e no comportamento do
indivíduo. A intensidade dessas alterações pode variar, consideravelmente, entre as
pessoas. Uma das possíveis explicações para isto é a forma como cada indivíduo lida
ou interpreta diferentes estímulos (Ayub et al., 2010)2.
Atualmente, esta situação fisiológica tem grande importância nas diversas
áreas de pesquisa, por estar relacionada com a piora nos fatores preditores das
doenças autoimunes como o lúpus eritematoso (Williams et al., 2014)3 e a artrite
reumatoide (Marcenaro et al., 1999)4 quanto as de ordem emocionais como a
depressão, a ansiedade, a síndrome bipolar, entre outras, que desestabilizam o
organismo e proporcionam grandes malefícios para a humanidade (Marques-Deak,
2004, Hamester et al., 2016)2,5.
Na odontologia há estudos epidemiológicos que descrevem a relação de
doenças de origem emocionais com piora em indicadores de saúde periodontal
(Genco et al., 1999; Ng 2006)6,7. Com a liberação elevada de cortisol (hormônio do
estresse) na saliva e no fluído crevicular ligam-se a maior presença de periodontite
agressiva (Cakmak et al., 2016)8.
O estudo da biologia do estresse, sobretudo, trabalhos experimentais em
animais submetidos a protocolo de estresse oriundo de 12 horas de contenção física
por um período mínimo de 30 dias têm produzido evidências de que o estresse é
capaz de acelerar a progressão da doença periodontal (Takada et al., 2004; Semenoff-
Segundo et al., 2012; Siqueira et al., 2015)9-11.
Breivik et al. (2014)12 observaram que o eixo hipotálamo-pituitário-adrenal
(HPA), poderia ser modulado, tanto para uma maior destruição, como para evitar uma
destruição do periodonto (Breivik et al., 2011)13. Em uma revisão da literatura Breivik
et al. (1996)14 descreve a neurobiologia do eixo HPA e levanta uma hipótese
neurofisiológica, que o sistema nervoso, o sistema endócrino e o sistema imunológico
retroalimentam-se em relação à progressão da periodontite.
A partir da modulação do estresse sobre a periodontite já apresentada
43
(Semenoff et al., 2014)15 observa-se que outros fármacos como a sinvastatina poderia
interferir na progressão da doença. Na odontologia observa-se uma série de
evidências demonstrando que este fármaco foi capaz de contribuir na diminuição e
regeneração da periodontite (Xu et al., 2014; Bradley et al., 2016)16,17.
O desfecho no periodonto com o uso oral através de gavagem pode ser
importante, visto que, a sinvastatina é indicada no tratamento da hipercolesterolemia,
nos níveis de colesterol ligados a doenças cardiorrespiratórias (Delahoy et al., 2009)18.
Além de trabalhar na hipercolesterolemia, o agente atua na resposta
imunoinflamatória e no tecido conjuntivo (Kumari et al., 2016)19 e desta forma espera-
se que seu efeito em uso sistêmico, seja capaz de diminuir o efeito deletério da
indução de periodontite associado a estresse físico.
Desta forma o objetivo deste trabalho foi avaliar histologicamente o efeito
do uso da sinvastatina na modulação da periodontite induzida por ligadura em ratos
submetidos ao estresse crônico.
3.5 MATERIAIS E MÉTODOS
Inicialmente, 50 ratos adultos, machos, com 2 meses de idade, da espécie
Rattus Novergicus da linhagem Wistar, com peso inicial de aproximadamente 220
gramas, foram selecionados no biotério da Universidade de Cuiabá, Cuiabá-MT. Os
mesmos passaram por uma adaptação ao novo ambiente durante duas semanas e
foram mantidos em dez caixas moradia (polietileno 60x40x35) em número de 5
animais por caixa, com ração padronizada e água ad libitum, sob ciclo claro/escuro de
12 horas, temperatura controlada a 23°C e umidade ± 60%. (Ceua – UNIC protocolo
003/2014).
Os animais foram randomicamente divididos, por um auxiliar técnico que
desconhecia os objetivos da pesquisa em cinco grupos experimentais (N=10): grupo
periodontite (GP), grupo periodontite e estresse (GPE), grupo periodontite, estresse e
sinvastatina (GPES), grupo periodontite e sinvastatina (GPS), e grupo controle (GC).
Entre o primeiro e o trigésimo dia de experimento, os animais dos grupos:
PES e PS foram submetidos à ingestão diária de seis miligramas de sinvastatina
(Cápsulas com 6 mg, Natupharma – Farmácia de Manipulação, Cuiabá–MT), através
de gavagem – realizada através de seringa de 10 ml (BD do Brasil, Curitiba-PR)
acoplada a 10 cm de cânula para injeção (Scalp vein 18G, Venescalp, Feira de
Santana – BA, Brasil).
44
No segundo dia do experimento, procedeu-se a indução da periodontite em
todos os grupos, com exceção do GC. Para isto, os animais receberam anestesia,
através da administração intramuscular de 0,1 mL de cloridrato de cetamina (Dopalen,
Agribrands, Saúde Animal, Paulínia, SP, Brasil) associado a 0,05 mL de cloridrato de
xilazina (Rompun, Bayer. Saúde Animal, São Paulo, SP. Brasil), para cada 100
gramas de peso corporal e um fio de sutura de seda estéril (número 4, ETHICON,
Johnson e Johnson, São Paulo – SP, Brasil), foi colocado envolvendo o segundo molar
superior direito de cada rato20. Após o ato operatório, uma dose de dipirona sódica
(2,5 mg para cada 100 g de peso corporal) foi injetada intramuscularmente em cada
animal.
Entre o terceiro e o trigésimo dia experimental os animais do GPE e do
GPES foram submetidos ao modelo de estresse crônico por imobilização física
durante 12 horas46. Para tanto, os animais foram acondicionados em tubos de poli
cloreto de polivinila (PVC), compatíveis com seu tamanho e, posteriormente,
interrompeu-se a passagem de ambos os lados com fio metálico, de forma a
possibilitar a respiração. O GC não recebeu nenhum tipo de intervenção, porém foi
mantido no mesmo ambiente dos demais grupos9.
Após 30 dias experimentais foi realizada a eutanásia dos animais por
excesso de anestésico. Em seguida, as hemimaxilas direitas e esquerdas foram
removidas e fixadas em formol a 10% por 48 horas. Os espécimes foram então
descalcificados em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) por um período de cinco
semanas (totalizando seis trocas) e em ato contínuo, foram lavadas, desidratadas,
diafanizadas e incluídas em parafina para que fossem realizados os cortes
histológicos de 6 μm de espessura ao longo eixo dos dentes no sentido mésio–distal.
As lâminas foram coradas com hematoxilina de Harris e eosina alcoólica e analisadas
em microscópio de luz.
Para análise histológica, foram selecionadas dez lâminas seriadas, nas
quais necessariamente deveriam ser observados o 1° e 2° molares superiores D e E,
e as seguintes estruturas: a) polpa coronária (PC), b) polpa radicular (PR), c) junção
cemento esmalte (JCE) na face mesial do segundo molar, d) crista óssea interproximal
(CO) e) inserção conjuntiva histológica do ligamento periodontal (LP).
O parâmetro da análise histométrica foi definido ao mensurar em
centímetros a distância entre a junção cemento esmalte na face mesial do segundo
molar e a porção mais coronal da inserção conjuntiva histológica do ligamento
45
periodontal. Este parâmetro foi estabelecido como Perda de Inserção Histológica
(JCE-PIH). Para a distância, também em centímetros, entre a junção cemento esmalte
e a crista óssea foi estabelecido como Perda Óssea Histológica (JCE-PO) (Figura -1).
A histometria foi realizada através da mensuração das imagens com uma
régua escolar de 60 cm em um televisor de 29 polegadas (Semp Toshiba, Santo
Amaro, SP, Brasil), após as imagens serem captadas por uma câmera Samsung SDC
– 415 (Manaus, AM, Brasil) acoplada em um Microscópio Binocular E200, Nikon (São
Paulo, SP, Brasil) (Figura - 1).
O pesquisador estava calibrado em relação às análises realizadas e
desconhecia os grupos analisados.
Figura 1 - Demonstra as mensurações para: Perda de Inserção Histológica (JCE - PIH); Perda Óssea (JCE-PO) e as estruturas analisadas: PC - Polpa Coronária; PR - Polpa Radicular. JCE - Junção Cemento Esmalte; LP - Ligamento Periodontal; CO - Crista Óssea.
46
Para análise estatística dos resultados, os dados originais foram
submetidos a testes preliminares (Shapiro–Wilk), visando verificar a normalidade da
amostra, e, em seguida, procedeu-se as comparações entre as médias de Perda de
Inserção Histológica e de Perda Óssea Histológica obtidas nas imagens
microscópicas com o uso da análise de variância univariada (ANOVA) e teste Post
Hoc de Tuckey. Para verificação da calibragem do examinador, utilizou-se o teste t de
Student. O intervalo de confiança escolhido no estudo foi de 95% e a significância
estatística de 5%.
3.6 RESULTADOS
Os resultados em relação à perda de inserção histológica (JCE-PIH)
demonstram que o GP (18,16±8,28) e o GPES (16,77±8,08) se diferenciaram de todos
os grupos (p<0,05), porém não apresentaram diferenças entre si (p>0,05). O GPE
(29,11±7,72) foi o que apresentou maior destruição com significância estatística
comparado com os demais grupos (p<0,05). O GPS (7,00±6,39) e o GC (5,15±4,65)
foram os que obtiveram os menores resultados comparado com todos os grupos
(p<0,05), entretanto sem diferenças entre si (p>0,05) (Figura 2).
Para perda óssea histológica (JCE-PO), o GP (36,88±9,66), o GPSE
(36,66±8,06) e o GPS (32,25±9,16) foram semelhantes p>0,05. O GPE (51,00±10,28)
foi o grupo com maior destruição da crista óssea histológica, diferenciando-se dos
demais grupos (p<0,05). Além disso, o GPS foi estatisticamente semelhante ao GC
(22,27±9,99) (p>0,05) (Figura 2).
47
Figura 2 – Gráfico demonstra médias e desvios padrão para perda de inserção
histológica (JCE-PIH) nos grupos analisados.
Figura 3 – Gráfico demonstra médias e desvios padrão para perda óssea histológica
(JCE-PO) nos grupos analisados.
48
3.7 DISCUSSÃO
Os resultados demonstram que em ambas as mensurações, tanto para
perda de inserção histológica, quanto para perda óssea histológica, o estresse foi um
fator de modulação no aumento da progressão da doença periodontal induzida.
Todavia, quando os animais foram submetidos à ingestão de sinvastatina foi possível
perceber que a progressão da doença periodontal foi minimizada. Ao se observar a
associação no uso de sinvastatina, indução de periodontite e estresse crônico notou-
se que a sinvastatina agiu como fator protetor na periodontite induzida.
É estabelecido na literatura que o estresse crônico em ratos é capaz de
modular a periodontite para uma maior destruição periodontal (Nakajima et al., 2006;
Semenoff-Segundo et al., 2010; Semenoff-Segundo et al., 2012)10,20,21. Os resultados
do trabalho demonstram inicialmente o que já foi descrito, o estresse foi capaz de
proporcionar maior destruição nas estruturas periodontais comparado com o grupo
com apenas indução de doença.
O estresse crônico é uma das causas de grandes malefícios para o
organismo. Atua direta ou indiretamente como um fator de progressão de doenças
(Lin et al., 2016; Clapes et al., 2016)22,23 e, inclusive, tem sido relacionado com
maiores taxas de mortalidade (Sumner et al., 2016)24. Buscar maiores informações
sobre este tema em animais pode ser uma interessante ferramenta para futuros
ensaios clínicos. Os resultados deste estudo demonstram que os animais que usaram
sinvastatina e foram submetidos a doença periodontal e ao estresse, tiveram menores
destruições nas estruturas periodontais comparado com o grupo que foi submetido a
doença periodontal e estresse. Dessa forma, foi possível inferir que a sinvastatina
interferiu na progressão da periodontite marginal protegendo o periodonto.
É conhecido que a aterosclerose é um processo inflamatório no interior das
artérias. A hipercolesterolemia tem sido enfrentada pelos médicos como um problema
sério de saúde pública. Quando o colesterol LDL (Low density lipoprotein) e as
triglicérides estão em altos níveis no sangue, podem conduzir a arteriosclerose (Libby,
2002)25 e até a um colapso do sistema cardiorrespiratório (Galve et al., 2016; Quero
et al., 2016)26,27. Neste sentido, o uso contínuo e em larga escala do fármaco
sinvastatina, cujo propósito é minimizar a quantidade dos colesteróis e triglicérides do
interior das artérias, proporcionou inúmeras investigações e descobertas de outras
49
indicações além da sua proposição inicial (Jain, 2005; Schönbeck, 2005; Miner et al.,
2008; de Oliveira et al., 2015; Ishihara et al., 2016)28-32.
Na odontologia intensifica-se sua utilização como um agente de atuação
capaz de modular as respostas do tecido conjuntivo. No caso da implantodontia, há
diversos trabalhos (Rivera et al., 2013; Fang et al., 2015; Tan et al., 2015, Wang et al.,
2015; Encarnação et al., 2016)33-37 que demonstram sua ação aumentando a
angiogênese, o número de osteoblastos e diminuindo a quantidade de osteoclastos.
Fato que impacta diretamente em maior formação óssea (Papadimitriou et al., 2015;
Yue et al., 2016)38,39.
Na periodontia tem-se analisado sua capacidade anti-inflamatória e,
portanto, protetora em relação à progressão da periodontite apical e marginal (Bradley
et al., 2016; Xu et al., 2014; Kumari et al., 2016; Nassar et al., 2014; Jung et al.,
2016)16,17,19,40,41.
Os mecanismos de ação do estresse são complexos. Inicialmente há um
estímulo químico e/ou físico capaz de produzir de impulsos elétricos e hormonais
capazes de determinar a produção de cortisol e de adrenalina (Breivik et al., 1996)14
atuantes nas respostas imunológicas inata e específica, proporcionando respostas
inflamatórias capazes de serem determinantes na progressão da periodontite (Breivik
et al., 2014; Breivik et al., 2011)13,14.
Na atualidade sabe-se que o estresse interfere no sistema nervoso central
e por consequência nas respostas de defesa, dentre elas as células T Helper 1 (TH1)
e T Helper 2 (TH2) (Leff-Gelman et al., 2016)42. Estes dois padrões de resposta
adaptam-se em estabelecer uma apropriada resposta de defesa para diversas
necessidades, dentre elas contra as infecções (Heinzel, 1995)43 como a periodontite
(Semenoff-Segundo et al., 2014)15 proporcionando uma mudança no perfil
imunoinflamatório determinando uma menor progressão de doença.
3.8 CONCLUSÃO
O uso de sinvastatina foi capaz de agir como fator protetor para a
periodontite induzida em ratos submetidos ou não ao estresse cônico.
50
3.9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Marques-Deak A, Sternberg E. Psiconeuroimunologia: a relação entre o sistema
nervoso central e o sistema imunológico. Rev. Bras. Psiquiatr. 2004;26(3): 143-144
1. Marques-Deak A, Sternberg E. Psiconeuroimunologia: a relação entre o sistema nervoso central e o sistema imunológico. Rev. Bras. Psiquiatr. 2004;26(3): 143-144
2. Ayub LG, Novaes Jr AB, Moraes Grisi MFM, de Souza SLS, Palioto DB, Leite-Panissi CRA, Taba Jr M. Estresse como possível fator de risco para a doença periodontal – revisão da literatura. R. Periodontia 2010;20(3):28-36.
3. Williams EM, Bruner L, Penfield M, Kamen D, Oates JC. Stress and depression in relation to functional health behaviors in african american patients with systemic lupus Erythematosus. Rheumatology (Sunnyvale). 2014; 2014(Suppl 4). pii: 005. PubMed PMID: 26618072; PubMed Central PMCID: PMC4662575
4. Marcenaro M, Prete C, Badini A, Sulli A, Magi E, Cutolo M. Rheumatoid arthritis, personality, stress response style, and coping with illness. A preliminary survey. Ann N Y Acad Sci. 1999;876:419-25. PubMed PMID: 10415637.).
5. Hamester L, Souza EN, Cielo C, Moraes MA, Pellanda LC. Effectiveness of a nursing intervention in decreasing the anxiety levels of family members of patients undergoing cardiac surgery: a randomized clinical trial. Rev Lat Am Enfermagem. 2016; 24:e2729
6. Genco RJ, Ho AW, Grossi SG, Dunford RG, Tedesco LA. Relationship of stress, distress and inadequate coping behaviors to periodontal disease. Journal of Periodontology. 1999;70(7):711-23.
7. Ng SK, Keung Leung W A. Community study on the relationship between stress, coping, affective dispositions and periodontal attachment loss. Community Dent Oral Epidemiol. 2006; 34(4):252-66
8. Cakmak O, Tasdemir Z, Aral CA, Dundar S, Koca HB. Gingival crevicular fluid and saliva stress hormone levels in patients with chronic and aggressive periodontitis. Journal of Clinical Periodontology. 2016 Aug 11, Epub ahead of print.
9. Takada T, Yoshinari N, Sugiishi S, Kawase H, Yamane T, Noguchi T. Effect of restraint stress on the progression of experimental periodontitis in rats. J. Periodontol 2004;75:306-315.
10. Semenoff-Segundo A, Porto AN, Semenoff TA, Cortelli JR, Costa FO, Cortelli SC et al. Effects of two chronic stress models on ligature-induced periodontitis in wistar rats. Arch Oral Biol. 2012;57(1):66-72.
11. Siqueira CR, Semenoff TA, Palma VC, Borges ÁH, Silva NF, Segundo AS. Effect of chronic stress on implant osseointegration into rat's mandible. Acta Cir Bras. 2015; 30(9):598-603.
51
12. Breivik T, Gundersen Y, Gjermo P, Opstad PK. Chronic treatment with the glucocorticoid receptor antagonist RU486 inhibits diabetes-induced enhancement of experimental periodontitis. Journal of Periodontal Research. 2014; 49(1):36-44.
13. Breivik T, Gundersen Y, Gjermo P, Taylor SM, Woodruff TM, Opstad PK. Oral treatment with complement factor C5a receptor (CD88) antagonists inhibits experimental periodontitis in rats. Journal of Periodontal Research. 2011; 46(6):643-7.
14. Breivik T, Thrane PS, Murison R, Gjermo P. Emotional stress effects on immunity, gingivitis and periodontitis. Eur J Oral Sci. 1996; 104 (4(Pt 1)):327-34.
15. Semenoff-Segundo A, Borges ÁH, Bandeca MC, Porto AN, Pedro FL, Santos RS et al. Effect of chronic stress on ligature-induced periodontitis in inbred and noninbred rats: a radiographic study. J Contemp Dent Pract. 2014;15(5):556-60.
16. Bradley AD, Zhang Y, Jia Z, Zhao G, Wang X, Pranke L et al. Effect of simvastatin prodrug on experimental periodontitis. Journal of Periodontol. 2016;87(5):577-82
17. Xu XC, Chen H, Zhang X, Zhai ZJ, Liu XQ, Qin A, Lu EY. Simvastatin prevents alveolar bone loss in an experimental rat model of periodontitis after ovariectomy. J Transl Med. 2014;12:284.
18. Delahoy PJ, Magliano DJ, Webb K, Grobler M, Liew D. The relationship between reduction in low-density lipoprotein cholesterol by statins and reduction in risk of cardiovascular outcomes: an updated meta-analysis. Clin Ther 2009; 31(2):236-44.
19. Kumari M, Martande SS, Pradeep AR, Naik SB. Efficacy of subgingivally delivered 1.2% atorvastatin in the treatment of chronic periodontitis in subjects with type 2 diabetes: A randomized controlled clinical trial. Journal of Periodontology. 2016;21:1-12
20. Semenoff Segundo A, Semenoff TA, Borges AH, Pedro FL, Sakai VT. Methodological model of chronic stress associated with ligature-induced periodontitis in rats: a radiographic study. Braz Oral Res. 2010;24(4):455-9
21. Nakajima K, Hamada N, Takahashi Y, Sasaguri K, Tsukinoki K, Umemoto T et al. Restraint stress enhances alveolar bone loss in an experimental rat model. J Periodontal Res. 2006; 41(6):527-34
22. Lin YH, Kao CC, Wu SF, Hung SL, Yang HY, Tung HY. Risk factors of post-traumatic stress symptoms in patients with cancer. J Clin Nurs. 2016 Nov 22. doi: 10.1111/jocn.13662
23. Clapes T, Lefkopoulos S, Trompouki E. Stress and non-stress roles of inflammatory signals during HSC emergence and maintenance. Front Immunol. 2016; 7:487. Review
24. Sumner JA, Khodneva Y, Muntner P, Redmond N, Lewis MW, Davidson KW, Edmondson D, Richman J, Safford MM. Effects of concurrent depressive symptoms and perceived stress on cardiovascular risk in low- and high-income participants:
52
findings from the reasons for geographical and racial differences in stroke (REGARDS) Study. J Am Heart Assoc. 2016;5(10). pii: e003930.
25. Libby P. Inflammation in atherosclerosis. Nature 2002;420:868–874
26. Galve E, Guijarro-Herraiz C, Masana-Marin L, Cordero-Fort A. Consensus on objectives and action guidelines on low density lipoproteins-cholesterol control in very high risk cardiovascular patients Clin Investig Arterioscler. 2016; 28(1):31-42
27. Quero Alfonso AI, Fernández Gallegos R, Fernández Castillo R, Gomez Jimenez FJ, García Rios Mdel C, García García I. Study of the metabolic syndrome and obesity in hemodialysis patients. Nutr Hosp. 2014; 31(1):286-91.
28. Jain MK, Ridker P. M. Anti-inflammatory effects of statins: clinical evidence and basic mechanisms. Nature Reviews Drug Discovery 2005; 4:977–987
29. Schönbeck U, Libby P. Inflammation, immunity, and HMG-CoA reductase inhibitors: statins as anti-inflammatory agents? Circulation 2004;109, II-18–II-26
30. Miner M, Billups KL. Erectile dysfunction and dyslipidemia: relevance and role of phosphodiesterase type-5 inhibitors and statins. J Sex Med. 2008;5(5):1066-78.
31. de Oliveira DM, de Oliveira EM, Ferrari Mde F, Semedo P, Hiyane MI, Cenedeze MA et al. Simvastatin ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis by inhibiting Th1/Th17 response and cellular infiltration. Inflammopharmacology. 2015; 23(6):343-54.
32. Ishihara T, Miyazaki M, Notani N, Kanezaki S, Kawano M, Tsumura H. Locally applied simvastatin promotes bone formation in a rat model of spinal fusion. J Orthop Res. 2016 Nov 11. [Epub ahead of print]
33. Rivera C, Monsalve F, Salas J, Morán A, Suazo I. Platelet-rich plasma, plasma rich in growth factors and simvastatin in the regeneration and repair of alveolar bone. Exp Ther Med. 2013 Dec;6(6):1543-1549.
34. Fang W, Zhao S, He F, Liu L, Yang G. Influence of simvastatin-loaded implants on osseointegration in an ovariectomized animal model. Biomed Res Int. 2015; 2015:831504.
35. Tan J, Yang N, Fu X, Cui Y, Guo Q, Ma T, Yin X, Leng H, Song C. Single-dose local simvastatin injection improves implant fixation via increased angiogenesis and bone formation in an ovariectomized rat model. Med Sci Monit. 2015; 21:1428-39.
36. Wang H, Liu J, Tao S, Chai G, Wang J, Hu FQ, Yuan H. Tetracycline-grafted PLGA nanoparticles as bone-targeting drug delivery system. Int J Nanomedicine. 2015; 10:5671-85.
37. Encarnação IC, Xavier CC, Bobinski F, dos Santos AR, Corrêa M, de Freitas SF, Aragonez A, Goldfeder EM, Cordeiro MM. Analysis of bone repair and inflammatory process caused by simvastatin Combined With PLGA+HA+βTCP Scaffold. Implant Dent. 2016; 25(1):140-8.
53
38. Papadimitriou K, Karkavelas G, Vouros I, Kessopoulou E, Konstantinidis A. Effects of local application of simvastatin on bone regeneration in femoral bone defects in rabbit. J Craniomaxillofac Surg. 2015; 43(2):232-7.
39. Yue X, Niu M, Zhang T, Wang C, Wang Z, Wu W, Zhang Q, Lai C, Zhou L. In vivo evaluation of a simvastatin-loaded nanostructured lipid carrier for bone tissue regeneration. Nanotechnology. 2016; 27(11):115708
40. Nassar CA, Battistetti GD, Nahsan FP, Olegário J, Marconato J, Marin CF et al. Evaluation of the effect of simvastatin on the progression of alveolar bone loss in experimental periodontitis-an animal study. J Int Acad Periodontol. 2014; 16(1):2-7.
41. Jung JY, Woo SM, Kim WJ, Lee BN, Nör JE, Min KS et al. Simvastatin inhibits the expression of inflammatory cytokines and cell adhesion molecules induced by LPS in human dental pulp cells. Int Endod J. 2016 (In Press).
42. Leff-Gelman P, Mancilla-Herrera I, Flores-Ramos M, Cruz-Fuentes C, Reyes-Grajeda JP, García-Cuétara Mdel P et al. The immune system and the role of inflammation in perinatal depression. Neurosci Bull. 2016; 32(4):398-420.
43. Heinzel CJ. Th1 and Th2 cells in the cure and pathogenesis of infection disease. Curr Op Infec Dis 1995;8:151-155.
44. Weits-Schmidt G, Welzenbach K, Brink-mann V, Kamata T, Kallen J, Bruns C, Cottens S, Takada Y, Hommel U. Statins selectively inhibit leukocyte function antigen-1 by binding to a novel regulatory integrin site. Nature Medicine 2001;7:687-692.
45. Saxlin T, Suominen-Taipale L, Knuuttila M, Alpha P, Ylöstalo P. Dual effect of statin medication on periodontium. J Clin Periodontol 2009;36:997-1003.
46. Rovin S, Costich ER, Gordon HA.The influence of bacteria and irritation in the initiation of periodontal disease in germe free and conventional rats. J Periodontal Research 1966; 1: 193-203.
56
Normas do Journal of International Academy of Periodontology (ISSN 1466-2094 - Web Qualis B2).
Information for Authors All authors submitting papers to the Journal of the International Academy of Periodontology are encouraged to become members of the International Academy of Periodontology. Academy membership can be obtained by completing the registration form at http://www. perioiap.org/register.aspx. Manuscripts Manuscripts for publication and all correspondence should be sent by e-mail to Dr. Mark R. Patters, Editor, Journal of the International Academy of Periodontology, e-mail: [email protected]. Electronic submissions (required) written entirely in Microsoft Word (PC or Mac) will be accepted at the above e-mail address. All submissions must be written in English and will be subject to peer and editorial review. Articles for publication will be considered under the following headings: original research, novel clinical case reports and review articles relevant to all aspects of periodontology and implantology. Articles must be original and may not be pending consideration or accepted for publication elsewhere, with the exception of presentation at a scientific meeting and publication as an abstract. A signed statement to this effect should be included with the submission of the manuscript. Research that involves studies on humans must conform to the Declaration of Helsinki of 1975, as revised in 2013, and the authors must indicate that the protocol was approved by their institutional review committee for human subjects and that appropriate informed consent was obtained. For research involving the use of animals, the authors must indicate that the protocol was approved by the author’s institutional animal experimentation committee or was in accordance with guidelines approved by the Council of the American Psychological Society (1980) for the use of animals in experiments. Research reports State the problem and objectives clearly, describe the methods and materials in detail, report the results clearly using the minimum number of figures and tables; and, bearing in mind previously published work, discuss the results, the conclusions, and the clinical implications. Editorials Editorials may be solicited from authorities to provide a unique perspective on published articles, or to comment on other items of interest to the membership Copyright statement A copyright transfer statement will accompany the galley proofs of accepted, typeset manuscripts. The form must be signed by at least one of the authors and returned with the corrected proofs. Manuscript preparation Manuscripts must be submitted in Microsoft Word (PC or Mac), double-spaced and set to A4 or 8.5 x 11-inch paper, with at least 25-millimeter (1 inch) margins on all four
57
sides. Articles generally should not exceed 10-12 pages (excluding references, tables, figure legends and figures) and should be limited to no more than six authors. Additional contributing authors will be listed as an addendum to the manuscript. Abbreviations should be placed in parentheses after the first complete use of the term(s) to be abbreviated. Use generic names for drugs and for dental materials. Give trade names and manufacturers’ names and addresses in parentheses within the text. Title page Should include for each author the full name and institutional affiliations. The corresponding author should also include a street address, telephone and fax numbers, and e-mail address. Only individuals who have made a substantial contribution to the work and who agree to take public responsibility for the content of the work should be included. The Editor may request justification for authorship for all individuals listed. If the work was supported by a grant, the name of the supporting organization and the grant number should appear on the title page. The address for reprint requests will be assumed to be that of the corresponding author unless otherwise specified. Abstract and key words Abstracts are required for all articles, and should be limited to 250 words typed double spaced on a separate page. The abstract should serve as a concise summary of the manuscript, including objective, methods, results and conclusions. Abbreviations should not be used in the abstract. Please provide three to six key words (Dental Descriptors, Index to Dental Literature and/or Index Medicus) to be used for indexing purposes. Text The body of the manuscript should contain an introduction, a detailed statement of the materials and methods, a description in logical sequence of results, and a discussion section with conclusions.
Acknowledgments and conflict of interest Include acknowledgment of those individuals who contributed to the publication, source of financial support, and any financial relationships of any of the authors that may pose a perceived conflict of interest. References Authors are advised to read the following requirements for the reference format, as the Journal of the International Academy of Periodontology does not use the reference format of other popular journals of periodontology. In the text the author’s (authors’) name(s) and date of publication should be used as either: “in a similar study (Anderson and Morgan, 1992)”, or “Conversely, Blinkhorn (1994) found that...” If there are more than two authors, the first author and year are cited in the text; for example, “(Spencer et al., 1995)”. Citation of authors of more than one paper in a single year is shown as 1995a; 1995b; etc. Multiple references in the text should appear in chronological order separated by semicolons. Authors of unreferenced work should appear in the text only.
58
The list of references at the end of the text should be double-spaced, unnumbered and arranged alphabetically by name of first author. All authors should be listed unless there are more than six, whereas only the first three should be given followed by et al. The word ‘and’ should be used before the last author of papers with multiple authors. No comma is used between the last name and initials and no period is used in the initials of the authors. The authors should be followed by the title of the article, the full name of the journal (in italics); the year of publication followed by a semicolon and a space; the volume number (in bold) followed by a colon; and the complete first and last page numbers. Please follow the punctuation used in the examples below. Papers submitted with an incorrectly formatted reference list will be held without review until a corrected reference list is provided
Examples: Reference to an article: Shiloah J, Patters MR and Waring MB. The prevalence of pathogenic periodontal microflora in healthy young adult smokers. Journal of Periodontology 2000; 71:562-567. Reference to a book: Schuster GS. Oral Microbiology and Infectious Diseases, 3rd ed. Philadelphia: B. C. Decker, 1990; 516–522. Reference to a chapter in a book: Chesney J, Patters MR and Budreau-Patters A. Oral infections. In Long S, Prober C and Pickering L (Eds): Principles and Practice of Pediatric Infectious Disease. New York. John Wiley and Sons, 1996. Reference to a dissertation or thesis: James A. On the Immune Response to GTR Membranes in Periodontics. PhD, Liverpool, UK. 1994; 15–25. Reference to a report: Committee on Mercury Hazards in Dentistry. Code of Practice for Dental Mercury Hygiene. London: Department of Health and Social Security, 1979; Publication No. DHSS 79-F372. Reference to an abstract: Patters, MR., Shiloah, J, Dean, JW, Bland, P and Toledo, G. The consequence of infection of treated periodontal pockets by microbial pathogens. Journal of Dental Research 1997; 76 (special issue), 111 (Abst)
Tables Each table must be submitted on a separate sheet of paper, double-spaced throughout, including column heads, footnotes, and data. They should be numbered with Arabic numerals according to their order of mention in the text. Tables should be self-explanatory and supplement, not duplicate, the text. All footnotes should immediately follow the table, and all abbreviations should be defined in the footnote Illustrations Illustrations should be numbered with Arabic numerals in order of their mention in the text. They may be submitted in color or black and white. In general, the Editor will
59
require that clinical photographs and stained histologic specimens be submitted and published in color. Figures should be submitted electronically in jpeg format as separate files and not pasted into the Microsoft Word document. Figure legends All illustrations should be listed by legend on a separate page, double-spaced, and numbered to correspond with the numbering in the text. Permissions Direct quotations, tables, and illustrations that have appeared in copyrighted material must be accompanied by written permission for their use from the copyright owner, along with complete information as to the source. Photographs of identifiable persons must be accompanied by signed releases showing informed consent. If an illustration is taken from previously published material, the legend must give full credit to the original source. Statements and opinions expressed in the articles and communications herein are those of the author(s) and not necessarily those of the Editor(s) or publisher, and the Editor(s) and publisher disclaim any responsibility or liability for such material. Authors must disclose to the Editor any financial interest they may have in products mentioned in their article. The Journal will endeavor to provide a decision to the authors within 16 weeks of arrival of a properly formatted paper at the editorial office. Again, authors should read and follow the reference format required by the Journal. Manuscripts submitted for review that do not follow these instructions may be delayed until corrected or returned without review. Membership and subscriptions Questions regarding membership in IAP or a subscription to the Journal should be addressed to the IAP Business Office in Boston by contacting Alecha Pantaleon at [email protected].