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UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA
THIAGO NACK FEUSER
EFEITOS DA ELETROESTIMULAÇÃO NEURO MUSCULAR SOBRE
PARAMETROS MOTORES E DE ESTRESSE OXIDATIVO NO QUADR ÍCEPS
APÓS IMOBILIZAÇÃO DO JOELHO DE RATOS
Tubarão, 2007
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THIAGO NACK FEUSER
EFEITOS DA ELETROESTIMULAÇÃO NEURO MUSCULAR SOBRE
PARAMETROS MOTORES E DE ESTRESSE OXIDATIVO NO QUADR ÍCEPS
APÓS IMOBILIZAÇÃO DO JOELHO DE RATOS
Projeto de Pesquisa apresentado à disciplina de Metodologia da Pesquisa em Fisioterapia como requisito à elaboração do Trabalho de Conclusão de Curso.
Orientador: Prof. Aderbal Aguiar Junior
Tubarão, 2007
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SUMÁRIO
1 Introdução ......................................................................................................................... 3
1.2 Objetivos......................................................................................................................... 4
1.2.1 Geral ............................................................................................................................. 4
1.2.2 Específicos.................................................................................................................... 4
1.3.3 Estrutura.........................................................................................................................4
2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 5
2.1 Efeitos da imobilização ................................................................................................... 5
2.2 Causas que podem levar a imobilização ..........................................................................6
2.3 Estresse oxidativo ............................................................................................................7
2.4 Fisiologia dos processos oxidativos .................................................................................9
2.5 Eletroestimulação neuro muscular ...................................................................................11
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ .13
3.1 População/amostra .........................................................................................................13
3.2 Materiais..........................................................................................................................13
3.3 Métodos........................................................................................................................... 13
3.4 Caixa de atividade...........................................................................................................14
3.5 Nível de TBARS..............................................................................................................15
3.6 Nível de carbonil.............................................................................................................15
3.7 Determinação de proteínas............................................................................................15
3.8 Tratamento estatístico...................................................................................................15
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................................17
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS...........................................................................................21 6 REFERÊNCIAS...............................................................................................................22
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RESUMO O objetivo do trabalho foi estudar os efeitos eletroestimulação neuro muscular após a
imobilização sobre parâmetros de estresse oxidativo, analisar os níveis de oxidação de
proteínas no quadríceps, verificar os níveis de oxidação de lipídios do quadríceps, avaliar a
atividade locomotora dos animais. A amostra foi de 15 ratos Winstar machos com idade entre
6 e 8 semanas fornecida pelo biotério da UFSC. Os animais foram divididos em três grupos de
cinco, sendo um grupo controle, grupo imobilização e grupo imobilização mais eletro
estimulação neuro muscular. Foi avaliado a atividade locomotora dos camundongos,
carbonilação de proteínas e lipoperoxidação. A imobilização do membro inferior dos ratos
reduziu a atividade locomotora dos mesmos e após a aplicação da EENM foi possível
recuperar em parte a atividade perdida. Provavelmente se a EENM fosse por um período
maior de tempo alcançaríamos resultados ainda mais satisfatórios. Em relação a carbonilação
de proteínas obtivemos respostas semelhantes as da atividade locomotora. Foi visto que a
imobilização levou a oxidação de proteínas e que com a EENM conseguimos diminuir essa
oxidação. A lipoperoxidação obteve resultados não satisfatórios provavelmente devido ao
pouco tempo de EENM.
Palavras chave: estresse oxidativo, imobilização, eletro estimulação neuro muscular.
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ABSTRACT
The objective of the work was to study the effects electro stimulation neuromuscular after
detention on parameters of oxidative stress, examine the levels of protein oxidation in the
quadríceps femoralis , check the levels of lipid oxidation of the quadríceps femoralis, assess
the motor activity of the animals. The sample was of 15 rats winstar males aged between 6
and 8 weeks provided by biopterin of UFSC. The animals were divided into three groups of
five, with a control group, group detention and detention group more electro stimulation
neuromuscular. It was estimated the motor activity of the rats, carbonylation of protein and
lipid peroxidation. The immobilization of the lower limb of rats reduced the motor activity of
the same and after the application of EENM was able to recover in part the activity lost.
Probably the EENM were for a greater period of time to take results even more satisfactory.
For carbonylation of proteins obtained similar responses of the motor activity. It has been seen
that led to the detention of protein oxidation and that the EENM we reduce the oxidation. The
lipid peroxidation received unsatisfactory results probably due to the short time of EENM.
Keywords: Oxidative stress, detention, neuro electro muscle stimulation.
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1 INTRODUÇÃO
Lesões nos desportos, doenças degenerativas articulares, fraturas ósseas, rupturas
ligamentares ou desnervação são situações clínicas que podem levar a imobilização do
membro, acarretando, atrofia e alterações no metabolismo muscular (DIAS et al., 2005).
Para haver o metabolismo energético das fibras musculares, deve-se ter uma
integridade entre as estruturas musculares e a placa motora, além de uma constância do
suprimento de substâncias metabólicas (DIAS et al., 2005).
Estudos mostram que, a imobilização, induz prejuízos ao metabolismo mitocondrial do
músculo esquelético, comprometendo a síntese de proteínas miofibrilares, afetando a
dinâmica contrátil e integridade das vias metabólicas, que juntas precedem o processo de
atrofia (DIAS et al., 2005).
O metabolismo mitocondrial é dependente do oxigênio e este representa um paradoxo
por ser elemento essencial, e ao mesmo tempo, potencialmente destrutivo para a saúde
(CANCELLIERO, 2004). As espécies reativas de oxigênio são também produzidas durante o
metabolismo normal e serem envolvidas em reações enzimáticas, transporte mitocondrial do
elétron, sinal de transducão, ativação de fatores nucleares da transcrição, expressão do gene, e
a ação anti-microbial dos neutrófilos e macrófagos (BAYIR, 2005).
Os radicais livres de oxigênio são formados pela redução incompleta do oxigênio,
gerando espécies que apresentam alta reatividade para outras biomoléculas, principalmente
lipídios e proteínas das membranas celulares e até mesmo, o DNA (SCHNEIDER;
OLIVEIRA, 2004).
Um radical livre é definido como qualquer espécie que contém um ou mais elétrons
desemparelhados. Espécie Reativa do oxigênio (EROs) é um termo coletivo que inclui ambos
radicais do oxigênio, tais como o anion superóxido, radical hidroxil, e determinados agentes
de oxidação não radical, tais como o peróxido de hidrogênio , ácido hipocloroso , e ozônio,
que pode ser convertido facilmente nos radicais.
No geral, o ambiente redutor ajuda internamente as células a impedir os danos
mediados por radicais livres. Este ambiente redutor é mantido pela ação do antioxidante
enzimático e não-enzimático, tais como o superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa
peroxidase, glutationa, ascorbato (vitamina C), alfa-tocoferol (vitamina E), e tioredoxina.
Alterações do estado de diminuição redox dos antioxidantes pela exposição aos oxidantes
conduzem a stress oxidativo e dano oxidativo resultante (BAYIR, 2005).
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Os radicais livres e a oxidação são tópicos importantes a serem considerados, na
EENM para manutenção do equilíbrio químico muscular. No intuito de minimizar os eventos
desencadeados pelo desuso muscular, diversas técnicas têm sido utilizadas, buscando
melhorar as condições homeostáticas das fibras musculares, com destaque para estimulação
elétrica neuromuscular (DURIGAN, 2006). A atrofia do músculo induzida pela imobilização é
também acompanhada pelo stress oxidativo; substância reativa ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) e glutationa oxidado (GSSG) foram aumentados e o glutationa total (GSH) foi
diminuído no músculo atrofiado (KONDO et al., 1993).
[...] Estimulação eletro neuro muscular (EENM) a longo prazo da panturrilha com as
freqüências do impulso que eliciam contrações tetânicas mostram a sessão transversa do
músculo e o aumento da área e força, melhorando também resistência a fadiga (NUHR et al.,
2003).
Qual o efeito da imobilização e EENM sobre o metabolismo oxidativo músculo-
esquelético?
1.3 Objetivos
1.3.1 Geral
Estudar os efeitos eletroestimulação neuro muscular após a imobilização sobre
parâmetros de estresse oxidativo.
1.3.2 Específicos
- Analisar os níveis de oxidação de proteínas no quadríceps ;
- Analisar os níveis de oxidação de lipídios do quadríceps;
- Avaliar a atividade locomotora dos animais.
1.3.3 Estrutura
O trabalho apresenta 5 partes dentre elas, introdução que inclui justificativa e objetivos
do trabalho, revisão de literatura, materiais e métodos, resultados encontrados e discussão dos
resultados e considerações finais.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
Será abordado na revisão de literatura alguns conceitos importantes de estresse
oxidativo. O mesmo, dará um melhor compreendimento sobre o tema que será abordado.
2.1 EFEITOS DA IMOBILIZAÇÃO
A homeostasia celular está diretamente relacionada com a capacidade de adaptação a
novas condições, uma vez que, as modificações anatomo-funcionais dependem de um
constante redirecionando do fluxo de energia de acordo com a disponibilidades de substratos
metabolilizáveis. Neste contexto, a plasticidades metabólica das fibras musculares permite
ajustes constantes e seqüenciais buscando adaptar-se a tríade
atividade/demanda/disponibilidade de substratos (DURIGAN et al, 2005).
Apesar de ser benéfica à lesão musculoesquelética, a imobilização apresenta efeitos
colaterais como atrofia da célula muscular, fibrose intramuscular, perda de extensibilidade
muscular e limitação de movimento articular (CANCELLIERO, 2004). Diversos estudos
demonstraram que concomitante à atrofia muscular, ocorrem grandes modificações na
homeostasia do músculo esquelético, comprometendo a síntese de proteínas miofibrilares ou
não fibrilares, afetando a dinâmica contrátil bem como a efetividade das vias metabólicas.
A plasticidade das fibras musculares esqueléticas permite que estas sejam capazes de
se adaptar deflagrando mudanças na tipagem de fibras ou tamanho. Múltiplos estímulos
podem promover estas mudanças merecendo destaque a desnervação, imobilização,
inatividade prolongada, alterações hormonais, nutrição, estimulação elétrica entre outros
(CANCELLIERO, 2004). Mesmo frente a uma diversidade de observações contidas na
literatura, Matthews e St. Pierre (1996) ressaltaram que tanto a atrofia muscular quanto a
redução da força ocasionada pela imobilização ou ato cirúrgico nem sempre volta ao normal
mesmo frente a um extensivo processo de reabilitação.
Segundo Cancelliero (2004) a atrofia induzida por imobilização inclui alterações
bioquímicas e morfofuncionais das fibras tipo I e II. Essas alterações podem indicar mudanças
na área de secção transversa bem como na composição do tipo de fibra (CANCELLIERO,
2004).
Não somente o tipo de fibra muscular interfere no graus de atrofia, mas também a
posição articular sendo que dependendo do tipo de imobilização o músculo pode se encontrar
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encurtado ou alongado, estimulando a diminuição ou aumento do número de sarcômeros em
série (CANCELLIERO, 2004). Os estudos se diferenciam em relação à posição articular,
sendo que alguns mantêm a posição neutra do tornozelo (CANCELLIERO, 2004).
Outro aspecto observado em pacientes inativos fisicamente ou imobilizados é a
presença de resistência à insulina, porém ainda não está claro como o desuso muscular crônico
ou a imobilização alteram a sinalização de insulina, embora sejam, situações conhecidas em
diminuir a captação de glicose estimulada pela insulina (CANCELLIERO, 2004). Há uma
diminuição dos transportadores GLUT4 pelo desenvolvimento da resistência ao transporte de
glicose estimulado pela insulina (CANCELLIERO, 2004).
Vários modelos experimentais são propostos no intuito de identificar os eventos
desencadeados pelo desuso muscular e deflagração dos processos precursores da atrofia,
merecendo destaque, a desnervação neuromuscular, a suspensão dos membros posteriores do
animal ou ainda imobilização unilateral de membros por órteses (CANCELLIERO, 2004).
Há concordância entre os estudos de que a perda muscular com ausência de descarga
de peso e outros modelos de desuso é um produto de atrofia das fibras musculares esqueléticas
e aumento da degradação protéica (CANCELLIERO, 2004). Porém, os mecanismos
desencadeadores celulares e moleculares que levam a essa perda ainda não são bem
entendidos (CANCELLIERO, 2004).
2.2 CAUSAS QUE PODEM LEVAR A IMOBILIZAÇÃO
Lesões nos desportos, doenças degenerativas articulares, fraturas ósseas, rupturas
ligamentares ou desnervação são situações clinicas que podem levar à imobilização do
membro, acarretando, inevitavelmente. Atrofia e alterações no metabolismo muscular
(CHINGUI, et al, 2005).
Para haver uma homeostasia energética das fibras musculares, deve se ter uma
integridade entre as estruturas musculares e a placa motora, além de uma constância do
suprimento de substratos metabólicos (CHINGUI, et al, 2005).
O principal substrato energético utilizado pelas fibras musculares é a glicose, cuja
absorção é de caráter multifatorial, dependente da insulina do metabolismo dos tecidos ou da
elevação da atividade contrátil das fibras (CHINGUI, et al, 2005).
Sabe-se que a atrofia muscular induzida por desuso ocorre em associação com
desordens ortopédicas como na osteoartrite crônica ou frente a imobilização no tratamento de
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fraturas, rupturas ligamentares, lesão medular, tratamento com glicocorticóides ou ainda em
situações de manutenção por longos períodos no leito por razoes médicas ou cirúrgicas
(CANCELLIERO, 2004).
A posição de imobilização também é fator determinante para a quantificação do
processo de atrofia muscular. O número de sarcomeros é ajustado de forma que seja permitido
um comprimento ótimo destas estruturas, acorrendo assim um “overlap” ideal dos filamentos
para desenvolver tensão durante as contrações. Se o músculo for imobilizado em posição de
encurtamento, ocorre uma diminuição significativa do comprimento muscular por diminuição
do numero de sarcomeros. Se o músculo for imobilizado em posição de alongamento, ocorre
aumento de tamanho através da elevação do numero de unidades sarcoméricas (CHINGUI, et
al, 2005).
O desuso muscular promove redução na área das fibras musculares, bem como na
densidade dos capilares. Simultaneamente, ocorre proliferação do tecido conjuntivo
intramuscular tanto no perimísio quanto no endomísio, além de aumento do "turnover" do
colágeno no tecido (DURIGAN, 2006).
A atrofia por desuso varia de 15% a 70%, dependendo dos animais utilizados e das
fibras avaliadas. Alguns autores sugerem que a maioria das mudanças ocorre nos primeiros
sete dias. Porém, outros trabalhos demonstram atrofia significativa no período de 14 dias em
diferentes modelos de desuso muscular (DURIGAN, 2006).
2.3 ESTRESSE OXIDATIVO
Radicais livres são moléculas instáveis ou fragmentos de moléculas sem um par de
elétrons em suas órbitas exteriores. Incluem-se o radical superóxido, o peróxido de hidrogênio
e o radical hidroxila. Os radicais hidroxila atuando sobre os lipídios, carboidratos, proteínas e
ácidos nucléicos, em um fenômeno chamado "estresse oxidativo", levam a modificações da
função e da estrutura celular podendo levar a célula a morte. O estresse oxidativo, que
corresponde a produção de radicais livres sobrepujando a defesa antioxidante, provoca uma
rápida degeneração da função da célula endotelial (NETO et al, 2005).
Os radicais livres formam-se em condições fisiológicas em proporções controladas
pelos mecanismos defensivos celulares. Entretanto, em situações patológicas, essa produção
pode aumentar substancialmente. O estresse oxidativo pode resultar de uma situação em que a
uma diminuição nos níveis das enzimas antioxidantes, uma elevada velocidade de produção
13
ERO ou uma combinação de ambas condições. Distúrbios do equilíbrio entre a formação e a
remoção de ERO são importantes na patogênese de muitas doenças, por exemplo
arterosclerose, diabetes, mal de Alzheimer, câncer, desordens neurológicas e envelhecimento,
entre outras patologias (SALVADOR; HENRIQUES, 2004).
O termo estresse oxidativo é utilizado em circunstancias nas quais o “desafio” por
radicais livres resulta em dano tecidual ou na produção de compostos tóxicos ou danosos aos
tecidos. Pode se dizer que um organismo encontra-se sob estresse oxidativo (EO) quando
ocorre um desequilíbrio entre os sistemas prooxidantes e anti oxidantes, de maneira que os
primeiros sejam predominantes. Um dos principais mecanismos de lesão é a lipoperoxidação (
LPO ), ou seja a oxidação da camada lipídica da membrana celular. Além disso o EO pode
gerar danos a proteínas e ao DNA provocando diversas alterações na função celular e,
portanto, tecidual (SCHENEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Os radicais livres de oxigênio (RLO) são produzidos naturalmente em nosso
organismo através de processos metabólicos oxidativos e, muitas vezes, são de extrema
utilidade, como nas situações em que há necessidade de ativação do sistema imunológico
(como exemplo, os macrófagos utilizam o peróxido de hidrogênio para destruir bactérias e
outros elementos estranhos); na desintoxicação de drogas; e na produção do fator relaxante
derivado do endotélio, o óxido nítrico, extremamente importante nos processos que
desencadeiam o relaxamento dos vasos sanguíneos (SCHENEIDER; OLIVEIRA, 2004).
O organismo se defende da agressão de espécies reativas de oxigênio e dos danos
celulares (impacto que se conhece como Paradoxo do Oxigênio), utilizando diferentes
mecanismos. Um deles é o do compartimento intracelular, no qual o radical hidroxila, que
apresenta grande reatividade, reage com as estruturas vizinhas e não se difunde, ficando
limitado ao compartimento no qual foi originado (GARCIA, 2002).
No interior das células, onde está sendo utilizado o oxigênio, estão presentes o
superóxido dismutase, a catalase e o glutatião peroxidase. O superóxido dismutase elimina o
radical superóxido produzindo água oxigenada, sobre a qual atua a catalase e o glutatião
peroxidase, decompondo-se em oxigênio e água (GARCIA, 2002).
Outro dispositivo intracelular eficaz na defesa contra os radicais livres do oxigênio são
os antioxidantes, principalmente a vitamina E e o caroteno, livres na superfície interna e
lipofílica das membranas (GARCIA, 2002).
Os antioxidantes são substâncias que auxiliam na redução das reações que conduzem à
produção dos radicais livres. As células e os tecidos utilizam um exaustivo estaleiro de
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enzimas protetoras citoplasmáticas e mitocondriais, como o superóxido dismutase (SOD),
glutatião peroxidase (GSH), a catalase, e antioxidantes não enzimáticos como a vitamina E,
vitamina C, coenzima Q, betacarotenos e o glutatião e seus precursores (Institute of Medicine,
Dietary Reference Intake, 2000). Na ocorrência dos carotenóides e coenzima Q, a função
antioxidante é alcançada atraindo o elétron que não está pareado e estabilizando assim o
composto. A vitamina E faz o mesmo de anteriormente e converte o composto num radical,
que precisa da vitamina C que o regenera através das enzimas ascorbato-reductases. Os
polifenóis que serão estudados nessa pesquisa demonstram este mecanismo (GARCIA, 2002).
Além desta atividade própria, é preciso que exista uma regeneração constante da
capacidade antioxidante; se isto não se consegue, as lesões que acontecem através da oxidação
se acumulam e podem conduzir a transtornos fisiopatológicos (GARCIA, 2002).
2.4 FISIOLOGIA DOS PROCESSOS OXIDATIVOS
Os radicais livres de oxigênio (RLO) são produzidos naturalmente em nosso
organismo através de processos metabólicos oxidativos e, muitas vezes, são de extrema
utilidade, como nas situações em que há necessidade de ativação do sistema imunológico
(como exemplo, os macrófagos utilizam o peróxido de hidrogênio para destruir bactérias e
outros elementos estranhos); na desintoxicação de drogas; e na produção do fator relaxante
derivado do endotélio, o óxido nítrico, extremamente importante nos processos que
desencadeiam o relaxamento dos vasos sanguíneos (SCHENEIDER; OLIVEIRA, 2004).
O oxigênio (O2) que respiramos é metabolizado em nosso organismo da seguinte
maneira: aproximadamente 85 a 90% são utilizados pela mitocôndria, através da cadeia de
transporte de elétrons, e os 10 a 15% restantes são utilizados por diversas enzimas oxidases e
oxigenases e também por reações químicas de oxidação diretas. Na parte terminal da cadeia
de transporte de elétrons, a enzima citocromo oxidase (reação 1) remove um elétron de cada
uma das quatro moléculas reduzidas de citocromo c, oxidando-as, e adiciona os quatro
elétrons ao O2 para formar água (em torno de 95 a 98% dos 85 a 90% citados acima). Os 2 a
5% restantes são reduzidos univalentemente em metabólitos denominados espécies reativas de
oxigênio (SCHENEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Durante a atividade muscular, a demanda energética pode superar em 35 vezes a
demanda de repouso. Dessa forma, durante sua realização ocorre um grande aumento no
consumo de oxigênio, na sua maior parte em decorrência do aumento de trabalho muscular.
15
Pelo fato ERO serem produzidas através do metabolismo intermediário, o exercício provoca
um aumento da sua produção (SCHENEIDER; OLIVEIRA, 2004).
Em razão da sua configuração eletrônica, o oxigênio tem forte tendência a receber um
elétron de cada vez. A conversão univalente do oxigênio à água processa-se da seguinte
maneira:
A adição de um elétron a uma molécula de oxigênio no estado fundamental gera a
formação do radical superóxido (O2•-) (reação 2).
O superóxido ao receber mais um elétron e dois íons hidrogênio forma peróxido de
hidrogênio (H2O2), através do processo chamado dismutação. Essa reação é catalisada pela
enzima superóxido dismutase (SOD) que é encontrada em quantidades elevadas nas células de
mamíferos e que acelera a reação a 104 vezes a freqüência para dismutação espontânea num
pH fisiológico (reação 3).
Quando o H2O2 recebe mais um elétron e um íon hidrogênio, é formado o radical
hidroxil (OH•), que é o mais reativo dos intermediários, pois pode reagir e alterar qualquer
estrutura celular que esteja próxima e assim influenciar enzimas, membranas ou ácidos
nucléicos.
O radical hidroxil pode ser formado quando o H2O2 reage com íons ferro ou cobre
(reação 4). A reação é conhecida como Reação de Fenton.
Os íons de metais de transição podem também catalisar a reação entre H2O2 e
superóxido, conduzindo à produção de radical hidroxil (reação 5), a chamada Reação de
Haber-Weiss (SCHENEIDER; OLIVEIRA, 2004).
As espécies reativas de oxigênio são átomos íons ou moléculas que contem oxigênio
com um elétron não pareado em sua órbita externa. São caracterizadas por grande
instabilidade e por isso elevada reatividade, e tendem a ligar o elétron não pareado com outros
presentes em estruturas próximas de sua formação comportando-se como receptores
(oxidantes) ou como doadores (redutores) de elétrons. As espécies reativas de oxigênio são
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constantemente formadas no organismo humano, tal como ocorre, por exemplo, durante a
fagocitose realizada pelos neutrófilos, monócitos e macrófagos, no combate a
microorganismos invasores (KOURI; DONANGELO, 2003).
2.5 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO MUSCULAR
A estimulação elétrica para ativação do músculo esquelético é uma técnica terapêutica
que tem sido utilizada na medicina física por mais de meio século. No inicio dos anos 60 o
uso da estimulação elétrica direcionou-se, principalmente, para o controle da atrofia
musculoesquelética por desnervação. Poucos estudos estavam disponíveis sobre o uso de
estimulação elétrica para ativar nervo e, normalmente, músculo inervado via nervo periférico.
Um interesse renovado nos efeitos da estimulação nervosa e, normalmente, da musculatura
inervada (estimulação elétrica neuro muscular), gradualmente, desenvolve-se com o
ressurgimento da estimulação elétrica no controle da dor e com o desenvolvimento de novos e
mais sofisticados tipos de estimulador (ROBINSON; MACKLER, 2001).
A centelha que despertou esse grande interesse na EENM não surgiu até meados de
1970. em 1976, nos jogos Olímpicos, em Montreal, atletas soviéticos formam observados
utilizando EENM associada a exercícios voluntários como técnica de treinamento de força.
Em 1977, o pesquisador russo Kots de acordo com Robinson e Mackler , que desenvolveu a
técnica de estimulação, relatou q EENM produziria ganho de força muscular nos atletas de
elite que estão 30 a 40% melhor preparados em relação ao incremento de força adquirida
através de exercícios isso isolados. Esses incrementos acentuados por força adquiridos pela
elicitação de contrações musculares foram 10 a 30% maiores que aqueles conseguidos pela
contração muscular voluntária máxima. Pesquisadores ocidentais reconheceram rapidamente o
potencial de tal técnica e logo iniciaram estudos planejados pra comprovar os relatos de Kots
de acordo com Robinson e Mackler (ROBINSON; MACKLER, 2001).
Embora os resultados desses estudos ocidentais não tenham confirmado todos os
achados originais de Kots de acordo com Robinson e Mackler, eles sustentaram o ponto de
vista de que a EENM no músculo normal, como também sua utilidade no controle de uma
variedade de desordens musculares, comumente encontradas em pacientes nesse quadro
clinico (ROBINSON; MACKLER, 2001).
Limitações na amplitude ativa e passiva do movimento articular podem resultar de
varias desordens. Procedimentos ortopédicos, tais como imobilização articular após fraturas
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ou entorses severos, resultam frequentemente de estreitamento de estruturas da cápsula
articular e de músculos que cruzam as articulações afetadas. As desordens neurológicas, tais
como trauma na medula espinhal, acidente vascular cerebral ou traumatismo craniano levam
comumente à perda o controle desordenado da contração músculo esquelética e, subseqüente,
a contraturas musculares e articulares. Tradicionalmente as técnicas de alongamento isoladas
ou associadas a agentes térmicos têm sido empregadas para prevenir ou resolver encurtamento
anormal das estruturas dosa tecidos moles. Mais recentemente, vários outros procedimentos
manuais tem sido também utilizado para incrementar a amplitude do movimento. Estudos
recentes indicaram, entretanto, que EENM coadjuvante apropriada na prevenção e no controle
do movimento articular diminuído (ROBINSON; MACKLER, 2001).
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3 MATERIAIS E MÉTODO
A pesquisa trata-se de um estudo experimental. A pesquisa experimental, segundo
Rudio (1998) “[...] está interessada em verificar a relação de casualidade que se estabelece
entra as variáveis, isto é, em saber se a variável X (independente) determina a variável Y
(dependente)”. Para isso, cria-se uma situação de controle rigoroso neutralizando todas
influências alheias que Y pode sofrer.
3.1 POPULAÇÃO/AMOSTRA
A amostra foi de 15 ratos Winstar machos com idade entre 6 e 8 semanas pesando
200-250g fornecidos pelo biotério da UFSC. Os animais foram divididos em três grupos de
cinco, sendo um grupo controle, grupo imobilização e grupo imobilização mais eletro
estimulação neuro muscular.
3.2 MATERIAIS
Foi utilizado um eletro estimulador neuromuscular Nemesys 941 (figura 1), os
eletrodos utilizados foram uma caneta estimuladora, um jacaré, eletrodos metálicos e uma tala
confeccionada pelo autor (figura 2).
Figura 1 Eletroestimulador Nemesys 941 Figura 2 Caneta estimuladora, jacaré e eletrodo
3.3 MÉTODOS
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Os animais foram divididos em três grupos (n=5) grupo controle, grupo imobilização e
grupo imobilização mais eletro estimulação neuro muscular.
Os animais foram anestesiados com quetamina, 3 µl, via sub-cutânea para poder se
realizar a imobilização.
Foi imobilizado todo membro inferior durante 1 semana, sendo utilizado para
imobilização uma tala confeccionada pelo autor, utilizando tala gessada. (figura 3 e 4).
Figura 3 membro inferior imobilizado
Após 1 semana de imobilização os animais foram submetidos a EENM durante 2 dias.
O local a ser colocado os eletrodos foi tricotomizado para garantir um melhor posicionamento
dos eletrodos. No eletrodo metálico foi colocado gaze umidificada em soro fisiológico para
melhor condução, prendendo o eletrodo na pata. Com a caneta foi estimulado o quadríceps.
Na ponta da caneta foi colocado um algodão umidificado em soro fisiológico.
Os animais receberam sessões diárias de 10 minutos, por um período de 2 dias,
iniciando 24 horas após a retirada da tala. Os parâmetros do EENM foram os seguintes:
tempo on de 0,5 o tempo off de 0,5, a largura de pulso de 0.4 ms, e a intensidade a partir da
visualização da contração muscular, parâmetros adaptados de CANCELLIERO, 2004.
Após 2 dias de EENM os animais foram sacrificados, dissecado o quadríceps e
retirado amostra de tecidos.
3.4 CAIXA DE ATIVIDADE
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A avaliação da atividade locomotora dos ratos foi realizada em uma caixa de madeira
com dimensões 40 x 25 x 20 cm. Esta apresenta três células fotoelétricas instaladas a 3 cm de
altura do assoalho em grade, espaçadas igualmente ao longo de sua extensão e acopladas a um
contador digital. Este registra o número de vezes que o animal interrompe os feixes de luz
(cada interrupção do feixe de luz constituiu em uma medida de atividade). Desta forma,
somente os movimentos horizontais dos animais são detectados pelas fotocélulas.
3.5 NÍVEL DE TBARS
Os níveis de Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) foram mensurados
pelo método de Draper e Hadley (1990) e expressos em equivalentes de malonaldeído (MDA).
1ml de ácido tricloroacético 10% e 1ml de ácido tiobarbitúrico 0,67% será acrescido às
amostras, e posteriormente aquecidos em banho maria por 15 min. Os níveis de TBARS serão
determinados pela leitura da absorbância a 535nm e os resultados em nmol MDA/mg
proteína.
3.6 NÍVEL DE CARBONIL
O conteúdo de carbonilação de proteínas foi determinado de acordo com o método de
Levine et al (1990), pela formação de derivados da proteína hidrazona utilizando 2,4-
dinitrofenilhidrazida (DNPH). Estes derivados serão extraídos sequencialmente com ácido
tricloroacético 10% seguido de tratamento com etanol/etilacetato (volume 1:1) e re-extração
com ácido tricloroacético 10%. O precipitado resultante será dissolvido em uréia 6M. A
diferença entre as leituras do espectro a 370nm de 2,4-DNPH (branco) será utilizado para
calcular o nmol de 2,4-DNPH incorporado por mg de proteína.
3.7 DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS
A concentração de proteínas foi estimada com a albumina sérica bovina (BSA) como
padrão (Lowry et al, 1951). Nos ensaios de imunodetecção, as proteínas serão determinadas
pelo método de Petersen (1952) (Lowry modified) e BSA também como padrão.
3.8 TRATAMENTO ESTATÍSTICO
Os dados forão descritos em media±erro padrão médio e analisados estatisticamente
pela análise de variância (ANOVA) two-way, seguido pelo teste post hoc Duncan. O nível de
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significância estabelecido para o teste estatístico é de p<0,05. Será utilizado o SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versão 12.0 como pacote estatístico.
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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A figura 4 apresenta a atividade locomotora dos camundongos, comparando o grupo
controle, imobilização e imobilização mais EENM, demonstrando que os resultados
obtiveram significância estatística (P<0,05). A figura 4 demonstra que a imobilização
diminuiu a atividade locomotora dos camundongos, e que com a aplicação da EENM, após a
retirada da imobilização melhorou a atividade locomotora.
Figura 4 demonstrando resultados da caixa de atividade * P<0,05 do grupo controle # P<0,05 do grupo imobilização. Fonte: Pesquisa realizado pelo autor.
No intuito de minimizar os eventos desencadeados pelo desuso muscular, diversas
técnicas tem sido utilizadas, buscando melhorar as condições homeostáticas das fibras
musculares, com destaque para estimulação elétrica neuro muscular (DURIGAN et al, 2005).
De acordo com Durigan et al, 2005 a estimulação elétrica neuromuscular por meio de
eletrodos de superfícies é um procedimento terapêutico não invasivo de grande utilidade
clínica, que tem sido usado frequentemente na reabilitação de diversas patologias.
Clinicamente, a estimulação elétrica é usada para o fortalecimento e hipertrofia muscular em
casos envolvendo imobilização ou onde haja contra-indicação para o exercício dinâmico, não
somente em patologias, mas também no ambiente espacial. Neste sentido, esse recurso vem
sendo utilizado para recuperar a força muscular, reduzir o tempo de reabilitação e prevenir a
atrofia muscular decorrente da imobilização.
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Fuchs, cita ainda que a EENM é efetiva em músculos anormais ou imobilizados.
Durigan et al, 2005 fala que dentre os estudos com animais a estimulação elétrica com
freqüência de 10 Hz aplicada 8 horas por 21 dias diariamente promove redução da atrofia
muscular induzida por suspensão em ratos. Isso comprova os achados da figura acima e ainda
nos mostra que os resultados poderiam ser ainda mais significantes. Se o período de
eletroestimulação fosse maior e durante mais dias, os resultados obtidos seriam ainda mais
significantes, aumentaria também a atividade locomotora dos ratos.
Autores como Durigan, Cancelliero, demonstram ótimos resultados com a EENM
utilizando períodos maiores de aplicação da estimulação.
A figura 5 apresenta a oxidação das proteínas, mostrando que a imobilização aumenta
a oxidação das proteínas e que com a EENM foi possível reverter um certo grau de oxidação
com significância estatística (P<0,05).
Figura 5 demonstra carbonilação de proteínas * P<0,05 do grupo controle # P<0,05 do grupo imobilização. Fonte: Pesquisa realizada pelo autor.
Há tempos vem se observando que a imobilização promove fraqueza e atrofia
muscular, e só nos anos 90 foi verificado o comprometimento nas vias sinalizadoras de
insulina e no transporte de glicose. Estudos mostram que, de forma concomitante com a
imobilização, existe modificação na homeostasia do músculo esquelético, comprometendo ou
não a síntese de proteínas miofibrilares, afetando a dinâmica contrátil e integridade das vias
metabólicas, que juntas precedem o processo de atrofia (DIAS et al, 2004).
Segundo Dias et al, o desuso muscular causa progressivo decréscimo na força,
associado ao decréscimo na área de secção transversa das fibras musculares. A atrofia
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muscular é o resultado do decréscimo da síntese de proteínas musculares, seguido da quebra
de proteínas e, essa atrofia resulta em diminuição do conteúdo de proteínas musculares.
Ficou claro que a imobilização causa diminuição da atividade motora, com isso
aumentando a oxidação de proteínas, levando a mais diminuição da atividade motora, e que
com a EENM foi possível aumentar a atividade motora, aumentando a força e diminuindo a
oxidação. Esses resultados poderiam ser ainda mais significantes se houvesse um período
maior de estimulação e também se houvesse a administração de um antioxidante como cita
Zarzhevsky e Reznick, 1998 que o pré-treinamento associado a vitamina E pode melhorar o
nível de oxidação de proteínas durante a atividade do músculo.
Zarzhevsky e Reznick, 1998 citam que a oxidação protéica mensurada pela dosagem
da proteína carbonil é aumentada nos músculos de ratos submetidos a exaustão, tanto quanto
exercícios de longa duração. Usando ratos como modelo para a imobilização muscular pode-
se observar maiores efeitos deletérios, incluindo lesão oxidativa medida por oxidação protéica
e peroxidação lípidica. A administração da vitamina E o aumento do hormônio pode retardar
os efeitos deletérios em animais.
A figura 6 demonstra oxidação de lipídios que teve um aumento com a imobilização e
que a EENM não teve melhora significativa (P<0,05).
Figura 6 demonstra lipoperoxidação * P<0,05 do grupo controle # P<0,05 do grupo imobilização Fonte: Pesquisa realizada pelo autor.
Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação das espécies reativas do
metabolismo do oxigênio (ERMO), porém a membrana é um dos mais atingidos em
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decorrência da peroxidação lipídica, que acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade
das membranas celulares (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
A lipoperoxidação também pode estar associada aos mecanismos de envelhecimento,
de câncer e à exacerbação da toxidade de xenobióticos. Assim como na formação das ERMO,
nem sempre os processos de lipoperoxidação são prejudiciais, pois seus produtos são
importantes na reação em cascata a partir do ácido aracdônico (formação de prostaglandinas)
e, portanto, na resposta inflamatória (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Segundo Ferreira e Matsubara a lipoperoxidação pode ser catalisada por íons ferro, por
conversão de hidroperóxidos lipídicos em radicais altamente reativos e peroxila, que, por sua
vez iniciam nova cadeia de reações, denominada ramificação. Essas reações, que podem ser
rápidas ou lentas, dependem da valência do ferro. Aqui entra a importância da deferoxamina
onde Kondo et al, 1993 diz que alguns metais de transição, como o ferro e o cobre, estão
relacionados a produção de radicais livres. Foi encontrado o nível de ferro aumentado no
músculo esquelético atrofiado pela imobilização, e sugeriram a possibilidade que o aumento
de ferro pode ser responsável para o estresse oxidativo realçado no músculo atrofiado. O papel
da deferoxamina, que é um agente quelante de ferro, é de ser utilizado para suprimir o estresse
oxidativo aumentado.
Talvez se fosse administrado algum antioxidante associado a EENM nos animais
testados, teríamos conseguido um resultado mais significante, o qual não foi alcançado com a
EENM.
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5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A imobilização do membro inferior dos ratos reduziu a atividade locomotora dos
mesmos e após a aplicação da EENM foi possível recuperar em parte a atividade perdida.
Provavelmente se a EENM fosse por um período maior de tempo alcançaríamos resultados
ainda mais satisfatórios. Em relação a carbonilação de proteínas obtivemos respostas
semelhantes as da atividade locomotora. Foi visto que a imobilização levou a oxidação de
proteínas e com a EENM conseguimos diminuir essa oxidação. A lipoperoxidação obteve
resultados não satisfatórios provavelmente devido ao pouco tempo de EENM. Fica aqui uma
sugestão para novos estudos traçando objetivos semelhantes, e que o período de EENM seja
maior, alcançando melhores resultados.
O trabalho mostra que a EENM tem efeitos benéficos no processo de imobilização.
Durante a realização do trabalho foi observado em alguns estudos que o tipo de fibra
muscular também interfere nos efeitos do tratamento, como também a posição do membro
imobilizado influi nos resultados. Sendo esses parâmetros não traçados nesse trabalho mas
fica como sugestão para novas pesquisas.
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