INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES AUTARQUIA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE DE SAO PAULO

EFEITOS DA RADIAÇÃO GAMA NO VENENO DE Gottlus duríssus ttrríficus

Y O K O M U R A T A

Dlajartaçlo aprasantada como parto dos raquMtoa para obtenção do grau da Mastro am Taenologia i-

Orlentodort Or. i—t taècrfa Rafara.

SAO PAULO 1 9 8 8

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES

AUTARQUIA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

EFEITOS DA RADIAÇÃO GAMA NO VENENO DE

Crotalus durissus terrificus

YOKO MURATA

Di»eriaca*o aprnentatla como paru

dot requisito* para obtanç.To do grau

dn M*sir« orr» T«ci>oloijía Nucliur.

Orientador: Dr. Jo$i Roberto Roger o

SAO PAULO

1980

A mtuA pcuU,

qui me Vian&nuAOuun a vida. e

tern habido xuptUax meu&

camínhoò.

AGRADECIMENTOS

Ao VIL. JOSÍ ROBERTO ROGERO,

oiUuitado*, peta paciência *tmpu premente e p e t o eA^oHco* que

toHHUum po*iL*tl a tuotizaçõo dtÁia. díMAvUacão.

Ao4 Qiu. CLÂUVIO RODRIGUES, SupvUntvtdtHtt do InAtiXuto de VtAqaUaà Energético* e Nucleate*,

ROBERTO FdlFARO,

OinttoK dt ApUcacõe* dt Técnico* Nucleate*,

IAERCI0 ANTÜNIO MINHAS,

Pireio* de Segurança Nucleax e

NÍLIPA IÜCIA PEL MASTRO,

Cfte$e da Pivi*ão dt ftadiobiotoaia,

ptlo intvttAòt e apoio na execução dtòtt txabalha.

X CAPES,

Coordenação de Aperfeiçoamento de PeMoa£ de Mcvet Supvúox,

pela, botia concedida.

A TOPOS out de, um maneira ou oupta contribuirá* na reafiração

do tfuúoaüio.

em e*pecia£.

Ao meu guia tApltUuai, peta àua luz.

EFEITOS EA RABHCffl K * ?fl VEEO DE

GrvtaZu* <atrt««ii« Urrificus

vão ruwçm

R E S U M O

As radiações ionizantes podem promover alterações na estrutu­

ra proteica levando ã perda de sua atividade biológica. Desta forma é rn

portante verificar se estas radiações podem reduzir a toxicidade sen al­

terar a capacidade immngênica do veneno de serpentes, pela escolha das

condições de irradiação adequadas. Estes dados poderão ser explorados co

no método rápido de preparação de toxóides.

l*i "pool" de veneno de Crotalu» durisgus ttrrifieu* crotamina

positivo, foi dissolvido em cloreto de sódio 0,15 M e o sobrenadante irra

diado com radiação gana de una fonte de 60Co. Foram utilizadas doses de

100, 250, 500, 750, 1.000, 1.500 e 2.000 Gv ruma taxa de dose de

1.190 Çy/h. As determinações de grupos sulfidrílicos livres, enzimas ca-

seinolíticas, eletroforese em gel de poliacrilardda e cronatografia por

exclusão molecular foram analisadas para verificar as possíveis rodifica-

çSes estruturais nas proteínas, presentes no sobrenadante das amostras ir

radiadas, assim como a toxicidade en camundonços foi testada em todas as

amostras, As propriedades antiçjênicas do veneno irradiado foram avalia-

das por inunodifusao e por irunoprecipitação. Os resultados indicam que

as características bioquímicas nantên inalterada até a dose de 500 Gy.

\ras doses acira desta, há modificações estruturais, assin como aumento

das doses letais SOt, de modo proporcional a dose.

EFFECTS OF G A W RADIATIGN ON

Crotahu durisaus terrifiaua VENOM

A B S T R A C T

Exposure to ionizing radiation is known to cause loss of

protein activity function due to destruction of critical structures of

the imlecule. It was of interest to know if one could reduce the toxicity

of snake venon proteins with the retention of their immmogenicity by a

suitable choice of radiation dose. If so, the method could be profitably

exploited for the rapid preparation of venom toxoid.

A pool of crotamine positive Crotalua duriseus tmvificua ven

om was dissolved in 0.15 M NaCl and the supernatant irradiated using

60Co. Doses of 100, 250, 500, 750, 1.000, 1.500 and 2.000 Cy were used

at a dose rate of 1.190 Gy/h. Hie presence of free SH, casein hydrolytic

degradation, SDS-PAGE and molecular exclusion chromatography analysis to­

gether with LOeg determination in nice were used to test the structural

properties of irradiated and non irradiated fractions. Hie antigenic

properties of samples were investigated by immunodiffusion and iimunonre-

cipitation. The results indicate that the biochemical characteristics

'.;ere maintained up to SCO Gy. On the other hand hi-rher radiation doses

ÍDICE

Página

I - INTSODUÇSO 1

1.1. I Tadiaçâb de toxinas 1

1.2, Característica do veneno de Crotalua durissus teir£fi~

eus 3

II - OBJETIVO 6

III - MATERIAIS E MÉTODOS 7

111.1. Preparo e irradiação das amostras de veneno de

cascavel 7

111.2. Dosagem de proteínas 8

II 1.3. Determinação de grupos sulfidrilicos livres 9

III.4. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sul

fato de sódio EGPA-SDS 10

IIII.5. Cromatografia de exclusão molecular 14

II 1.6. Espectro de absorção na região ultravioleta 16

111.7. Determinação das enzimas caseinolíticas 17

111.8. Imunodifusãb 19

111.9. Intunoprecipitação 20

111.10. Determinação da atividade tóxica 23

IV - RESULTADOS E DISCUSSÕES 25

V - CONCLUSÕES 52

VI - r£FERÊNfCIAS 3I3LIOC^FICA3 53

i. immçk

I.l. IRSADIAC30 TC TOXINAS

A espécie Crotálus duns3us, conhecida como cascavel, se acha

disseminada pelos distritos secos e áridos do nordeste, leste, centro ,

oeste e sul do Brasil1.

Na zona alta e seca da porção sul-oriental e meridional, que

inclui São Paulo até o Rio Grande do Sul, encontramos a subespécie C. d.

tenrifiaus1.

Os acidentes com esta serpente são muito freqüentes, sendo

letais quando não são socorridos de forma rápida e adequada. Nestes ca­

sos, o único tratamento de eficácia comprovada ê a soroterapia.

0 soro anticrotilico é obtido em cavalos por hiperimuniza-

ção, estimulando a produção de anticorpos. Entretanto a baixa imunogeni

cidade somada a alta toxicidade do veneno de cascavel, impede a inocula-

ção de doses canazes de fornecer una resposta inunolo^ica adequada, além

de prejudicar o animal produtor, tendo como conseqüência una baixa produ

tividade do soro21.

Por essas razões é necessário o desenvolvimento de técnicas

que reduzam a toxicidade e aumentem a resposta imunológica, as quais di­

minuirão o tempo de resposta e o custo disnensado na manutenção dos ani­

mais e consequentemente, uma melhora acentuada na produção de antisoro.

Ma literatura, podemos encontrar exerolos de diferentes agen

tes utilizados nas mais diversas toxinas, na tentativa de se obter pro­

dutos menos tóxicos com todas as suas propriedades imunogSnicas.

No trabalho de Tejasen e colaboradores67, o veneno de AaHs-

2

trodon piscivorus foi submetido ã radiação ultravioleta e teve a toxici

dade reduzida e as atividades fosfolipSsica, proteinásica e fosfodieste-

rãsica inativadas, com manutenção da inuno^enicidade. Baride e colabora­

dores5, verificaram as mudanças dos parâmetros bioquímicos dos venenos

de NcLJa naja, Bungarus cheruleua, Eokis oarinatus e Vipera ruaselli, sub

metidos a radiação gana ou formalina, observando a polimerização das pro

teínas. Os autores concluem que a natureza dos polímeros produzidos pe­

la radiação gama é mantida por ligações fracas envolvendo forças secunda

rias, enquanto que a formalina envolve ligações químicas fortes, além da

observação da retenção da capacidade de reagir com o antisoro correspon

dente. Daniel e colaboradores21 detoxificaram o veneno de C. d, tervi-

Hcu8 por iodação, mantendo a imunogenicidade do veneno.

A radiação gama também vem sendo empregada como agente ate­

nuante pois observamos que ela provoca alterações nas estruturas primá­

ria, secundaria, terciâria e quaternária das proteínas, que são detectá-

veis pelas mudanças nas propriedades químicas e físico-químicas. As mo­

dificações se devem a excitação e ionização das proteínas ao interagirem

com a radiação ionizante, ou quando em meio aquoso, essas substâncias

reagem com as espécies resultantes da radiólise da água (0H*,e~ aquoso ,

H 20 2 e H#) altamente reativas13.

Os produtos da radiõlise da água podem, por exemplo, reagir

com proteínas abstraindo o hidrogênio do carbono alfa, o hidrogênio de

grupos sulfidrilas, reagir com anéis aromaticos de triptofano, tirosina

e fenilalanina, formando radiacais livres altamente reativos13*16. As

modificações podem estar ligadas as atividades enzimlticas, tóxicas e

imunológicas das proteínas.

Podemos citar alguns trabalhos neste sentido: Puranananda1*9

verificou que soluções do veneno de ofídeos da família Elaoidae, quando

3

irradiadas con raios «ara na dose de 30 ICGy, perdem a toxicidade e man-

tên a capacidade de imunização. Salafranca58 subreteu solução de veneno

de Haja naja philiminensis em 60Cò nas doses de 2,5; 5,0 e 10,0 KGy

rcantendo a toxicidade de 33, 66 e 43 por cento respectivamente em rela­

ção ao não irradiado, enquanto os componentes antigênicos mantiveram-se

praticamente inalterados. Kankonkar e colaboradores35 observaram que

nas soluções de veneno de flaja nafa, a dose de irradiação necessária pa­

ra a detoxificação depende da concentração da solução, e que até a dose

de 20 KGv a imuno^enicidade mantém-se inalterada. Herrera e colaborado­

res32 verificaram o efeito da radiação gama sobre a atividade biológica

e enzimáticas nos venenos de Lacheeis muta e Botkrops atrox, irradiados

a seco, nas doses de 1,0; 5,0 e 10,0 KGv; observando que o efeito hemor­

rágico foi reduzido proporcionalmente com o aumento da dose, assim como

há inativação das atividades exonucleásica, fosfòlipasica, caseinolítica,

tamesterásica, da enzima trombina-sSnile , fibrinolítica, 5'nucleoti-

dâsica e endonucleasica, sendo estas ultimas as mais sensíveis.

Desta ferra, as características como rapidez e facilidade de

padronização, somadas aos resultados de atenuação con manutenção da imu-

nogenicidade das diferentes toxinas, nos estimula a verificar a possível

utilização da metodologia de detoxicação por irradiação em veneno crota-

lico.

1.2. CARACTERÍSTICA DO VENENO DE CROTAUB DURISSU5 TCRRIFICUS

0 veneno de cascavel tem características neurotoxicas1*»10»57

associadas em menor escala com a capacidade hemolítica1*, proteolítica^ ,

coagulâsica50, nefrotóxica'' e imtmodepressoTa59. Até agora foram isola­

das as seguintes neurotoxinas: crotoxina8»9»11»23»25»26»27*28»31»33» 38» W >f5 55 63 6b

' * * * , orotamina9»18»19»20'30'37»60, convulxina9»*8, giroxi-

na6»9»61 e deltatoxina10.

4

A crotoxina é a responsável pela alta toxicidade, atuando a

nível de junção neuromuscul?.r, bloqueando a transmissão de ispulsos nervo

sos10»23. A administração via parenteral era carundongos provoca paralisia

flãcida e norte por paralisia respiratória, sendo a dose letal 50% por

via intra-venosa 82 yg/Kg em média?» Seu peso molecular é estimado em

23.000 daltons, sendo composta por duas subunidades» uma básica, a fòsfòli

pase, ccn cerca de 13.400 daltons; e uma ácida, a crotapotin, com peso mo

lecular por volta de 8.300 daltons.

A crotamina ê un polipentídeo básico com pi 10,3 e peso nole-

cular de 4.S80 daltons37, característica de uma variedade do veneno de

C. d terrifiaus encontrada no território Argentino, Boliviano, e no norte

do Paraná e parte do estado de São Paulo1*10*60. Esta toxina altera a

permeabilidade ao sódio nas membranas das fibras musculares, dando lu­

gar a respostas iterativas10. A dose letal 50* em camundongos ê em média

1.500 ug/Kg quando injetada por via intra venosa9.

A convulxina produz convulsões, perturbações respiratórias e

circulatórias assim como agrega e lisa plaquetas10. Sua DL-Q en camundon

gos é estimada em 524 ug/Kg por via intravenosa9.

A giroxina provoca uma síndrome convulsiva peculiar en canun-

dongos, caracterizada pelos movimentos circulatórios do corpo ao longo de

un eixo longitudinal9. A deltatoxina e pouco conhecida, altera acentuada

mente a permeabilidade vascular causando hemoconcentraçâb10.

0 quadro clínico do envenenamento crotálico S, em resumo, o

seguinte: no local da picada, dor de intensidade variável, seguida de na

restesias locais ou regionais (desordem nervosa caracterizada por sensa­

ções anormais e alucinaçSes sensorials). Freqüentemente não se observa

nenhuma lesão local, podendo, entretanto, ocorreT em alguns casos, discre­

to edema. Cerca de una hora após a picada, iniciam-se as manifestações

o

neurotoxicas, com aconetimento inicial da motricidade ocular extrinseca e

ptose palpebral. En casos extremamente graves, esses sintomas progridem

rapidamente e levam ao õbito em poucas horas10.

6

II. OBJETIVO

Desenvolver üietodologia para irradiação de veneno bruto de

cascavel em solução aquosa, particularizando os seguintes parâmetros:

a) estudo das alterações bioquímicas e biológicas produzidas

pela radiação no veneno total»

b) determinação da dose de radiação gama para reduzir ativida

de tóxica e manutenção da atividade antigênica e imunogênica.

III.^TEUAISE^ÉRDOS

III.l. PREPA3P E iraADIAÇft) DAS A'PSTSAS DE VENENO PE CASCAVEL

Em função da metodologia de produção do soro no Instituto Bu-

tantan, foi escolhida a dissolução do veneno seco e cristalizado em solu­

ção de NaQ 0,15 M, como etapa inicial. A irradiação de proteínas em so­

lução apresenta vantagem em relação a irradiação a seco, pois, requer uma

dose de radiação menor para ocorrer modificações estruturais nas proteí­

nas devido aos produtos da radiolise da água, que são altamente reativos

e provocam alterações seletivas na proteína13^9.

A - REAGENTES

a) Veneno de cascavel - Crotàlua duríssus terrifiaus - , cro-

tamina positivo, na forma seca e cristalizada.

b) Solução de NaQ 0,15 M, em água destilada

c) Fonte de radiação - Fonte de 60Co Gammacell 220 da Atomic

Energy- of Canada Ltda.

B - PROCEDir SENTO

a) Foram preparados 120 ml de solução de veneno de cascavel

na concentração de 2 mg/ml em solução de N a Q 0,15 M.

b) A solução foi filtrada em papel Whatman n ' l e distribuída

em tubos de ensaio de 12,5 x 1,5 ml cada.

c) A amostra foi submetida â radiação gama nas doses de 100 ,

250, 500, 750, 1.000, 1.500 e 2.000 Gy numa taxa de dose

de 1.190 Gy/h.

d) Foram separados 2 tubos de amostra não irradiada para se­

rem utilizados como referência nos ensaios.

8

III.2. roSAGEM DE P^OTEftAS

Método de Lowry39 modificado por 'üller1*0.

Para quantificar as possíveis perdas por precipitação e pa­

dronizar as concentrações nas reações, foram determinadas as concentra­

ções protéicas das amostras irradiadas ou não irradiadas.

A - REAGgTCES

a) Na2C03 10'. em solução de NaCH 0,5 M.

b) CaS04 51, m água destilada.

c) Tartarato de Na e K U , em água destilada.

d) Reagente de tartarato de cobre

0,5 ml de b

4,5 ml de c

50,0 ml de a

e) Reagente de Folin Ciocauteau 0,17 N.

B -PADRÃO

Foram utilizadas soluções de soro albunina bovina (Sigma) nas

concentrações de 0,0625; 0,125; 9,250; 0,375 e 0,500 roj/ml.

C - PROCEDIMENTO

a) Em 200 vi de amostra foi adicionado 1 ml do reagente de

tartarato de cobre. Após agitação foi deixado ã teroeratu

ra ambiente por 10 min.

b) Adicionou-se 3 ml do reagente de Folin Ciocauteau. Agitou

-se e incubou-se a 50°C por 10 minutos.

c) Após esfriamento foi lido a ábsorvância em 650 im.

9

D - TRATAMENTO DOS DADOS

Os pontos uti l izados na construção da curva padrão assim cano

as amostras foram fe i tas em quintuplicatas.

Os dados da curva padrão foram ajustados a una função linear

do tipo:

Y - AX • B (1)

onde

Y - concentração e o Y • erro da concentração;

X - absorvincia observada e o X » erro da absorvãncia;

A * coeficiente angular da reta e a A • erro do coeficiente angular;

B - coeficiente linear da reta. e o B * erro do coeficiente linear.

Pelo método dos «ânimos quadrados do Program SAS51 bplanta

do no Departamento de Processamentos dr; Dados do IPEN, obtivemos os valo­

res de A e B.

A • 248,08 o A - 1,67

B • 0,00 o B • 0,00

A partir das absorváncias obtidas experimentalmente tonos as

concentrações das amostras, utilizando a curva padrão. O erro da concen­

tração (o cone), resultante da propagação de erros foi calculado segundo

a equação 2:

o Y • Y ( X . o A) * • CA . a X ) 2 • a B 2 ' (2)

I I I . 3 . DETE!?iIN/VC30 DE GRUPOS SULFIDRÍLI03S LIVRES

'iétodo de Elfcnan22.

Para determinar grupamentos SH-livres que podem se formar du-

10

rante a irradiação pela quebra de pontes S-S, empregou-se o processo co-

lorinétrico de Ellman ?rodificado,,'\ que utiliza o ácido 5,5* ditiobis-2-

nitrobenzõico.

A - REAGENTES

a) Tampão Tris-HCl 0,1 V p» 8,0

b) EDTA 0,1 M em tampão Tris-HCl 0,1 ?! pH 8,0

c) Reativo de Ellman ( 20 mg de ácido 5,5' ditiobis-nitroben

zóico em 5 ml de tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0).

3 - RADRJto

Foram utilizadas soluções de cisteína dissolvida em solução

de Nad 0,15 Mnas concentrações de 0,83; 1,00; 1,25; 1,67; 2,50 e

5,00 x IO"* M.

C - PR0CEDP1ENIP

a) 0,5 ml de amostra

b) 0,88 ml de tampão Tris-HQ 0,1 M pH 8,0

c) 0,03 ml de solução de EDTA

d) Completou-se o volune para 3,0 ml com água destilada

e) Colocou-se 0,02 ml de Reativo de Ellman

f) Após 10 minutos, leu-se a absorvância a 412 nm

III.4. ELETTOFORESE El GEL DE POLIACRIUMIDA CCH TTJDECIL SULFATO DE Srt-

DIO - EfiPA-SDS

A EGPA-SDS foi utilizada para detectar as variações de peso

molecular decorrentes da formação de agregados e quebras das proteínas, in

duzidas pela radiação. Essa técnica apresenta boa sensibilidade e alto

poder de resolução, baseando-se m características de car»a e/ou peso no-

11

lecular da «nostra1*»2'.

Os géis de poliacrilamida fornan-se a partir de polinerizaçãb

via radical livre, do ronômero acrilamida e de ligações cruzadas do co-mo

nómero N,>í-netileno-bis-acrilamida. Variando-se a concentração destes re

agentes obtém-se diferentes çraus de polimerizacão, e consequentemente

usa matriz COR poros maiores ou menores» Assim, o tamanho dos poros pode

ser ajustado de forma a se otimizar a separação dos componentes da amos

tra»S2».

A - PREPARAÇ») DO GEL2»

i. Reagentes

a) Solução de acrilamida e bis-acrilamda (30:0,8), en água

destilada.

b) Solução do gel de eapilhamento: tampão Tris-HCl 0,5 ?•' pH

6,8.

c) Solução do gel de resolução: tampão Tris-HCl 3,0 >! pll 8,8.

d) Solução do reservatório superior e inferior: tampão Tris

0,025 WGlicina 0,192 M nH 8,3 com 11 de Dodecil Sulfato d»

Sódio.

e) Solução de Dodecil Sulfato de Sódio 10* em água destilada.

f) TESD (N.N.N', N' tetrametil etilenodiamina).

g) Persulfato de amónia 1,5* em água destilada.

i.i. Preparação do gel de eletroforese

Para obtermos o gel de empilhamento a 2,5* en tannão Trís-

H Q 0,125 ?I pH 6,8; e o gel de resolução a 15* em tampão Tris-HCl 0,375 M

pH 8,8, seguimos o esquema:

12

Gel de eanilhanento Gel de resolução

(volume c i ?il) (volune er» ml)

acrilanida/bis-acrilanica

tanpao de ennilhsciento

tanpab de resolução

SUS 101

Igua destilada

TESED

persulfato de amôniz. 1,51

2.5

5,0

-

0.2

11,3

0,015

1.0

15.0

-

3,75

0,3

9.45

0,015

1.5

Voluae final 20,015 30,015

; . i . i . Tampão de Corrida

Foi utilizado nos reservatórios o tampão Tris 0,025 M, gli<d

na 0,192 N, pH 8,3.

B - PREPARAÇflC DA JCOSTEA PARA APLIQVÇ»)

Inicialmente tratams a amostra segundo o esquema:

a) 0,1 g de uréia

b) 0,1 ai de tampão Tris-Hd 0,0625 ?! pH 6,8 com 2,0* de SOS

• 2,01 de beta-nercaptoetanol.

c) 0,1 ml de amostra na concentração de 600 vç/"il*

d) Aquecer por 2 minutos cm banho-maria fervente.

En seguida foram preparadas as aaostras para aplicação:

a) 10 ul de azul brcnofenol 0f0S\ em água destilada.

b) 1 gota de glicerina*

c) S ul de beta-nercantoetanol.

d) 50 ul da amostra tratada.

13

Forsra aplicados 50 wl de anostra sobre o gel de eppilharento.

A nlsca de rei de poliacrilacdda foi subwstida a ura diferença de poten­

cial de 150 V por 3 horas cora variação de corrente entre 30 e 40 mA.

C - ODL0RAÇ3Q DO GEL DE ELETHPFOSESE

*5etocb de tfray70

A coloração pelo nétodo de nitrato de prata foi escolhida por

apresentar sensibilidade até 0,07 ng/mn2 de soro albundna bovina85»70, cer

ca de 100 vezes nais sensível que o método tradicional de coloração con

Goomassie Blue29.

i. Procedimento

Foras elaboradas as seguintes etapas:

a) Fixar as proteínas no gel com solução de metanol 501 em í-

cido acético 101 est água destilada, por pelo menos 1 noite,

b) Lavar o gel con metanol 501 est água bidestilada alternando

COR água bidestilada, por várias vezes.

c) Hetirar a água e adicionar solução de prata anoniacal fres

ca:

NaOH 0,361 on água bidestilada 21,0 nl

WfH 14,8 !! 1,4 nl

AgNOj 19,4% cm água bidestilada 4.0 nl

água bidestilada q.s.p. 100,0 nl

Deixar nesta solução por 15 rtinutos sob constante e lenta agi

tação.

d) Lavar o gel ert água bidestilada durante 5 minutos.

e) Colocar o gel em solução fresca de ácido cítrico 0,0O5l e

formaldefdo 9,019% m água bidestilada.

14

f) Deixar a placa nesta solução ate o anarecinento das ban­

das.

g) Colocar o »el es» solução de metanol 50* e ácido acético

10*j en água bidcstilada para parar a reação, lavando vá­

rias vezes nesta solução.

h) Colocar o gel en solução de metanol 51, ácido acético 7% ,

glicerol 31 em água destilada para conservação.

Observação: A prata anoniacal decompõe-se e torna-se altamen­

te explosiva. Portanto, depois de usar, coletar

a solução de prata amoniacal en U B frasco e nreci

pitar a prata com cloreto, adicionando M a Q satu­

rado e m o v e r o sobrenadante aquoso por aspira­

ção.

III.5. QCTtMDQRAFIA DE EXCLÜ5SP MOUCOIAR

A cromatografia de exclusão molecular foi utilizada nur. siste

na tampão não denaturante, para detectar as variações de peso molecular,

decorrentes da foraaçãb de agregados e quebras das proteínas introduzidas

pela radiação, além de possibilitar una avaliação send-quantitativa.

A - REAGECTES

a) Gel Sephadex G-75 "fine", com partículas de 40-120 y. Phar

macia Upsalla, Suécia.

b) Tampão de equilíbrio: tampão fosfato de sódio 0,05 M pH

6.4S com N a a 0,15 \f.

c) Coluna de 100 x 0,9 ei.

B - PADRÕES

Fòran utilizadas soluções de "Blue dextran" 2 ng/ml e "Azul

15

bromo fenol" 0,2 ng/rrl para o cálculo de Y 0 e Vg respectivanente.

C - PSOCEPriNTO

a) 0 gel foi entunescido em tampão por 24 horas.

b) A coluna foi devidamente empacotada ate a altura de 38 cm

e calibrada num fluxo de 9,9 ml por hora.

c) Fbran colocadas amostras no volume de 1 ml na concentração

de 980 ug/ml.

d) As amostras foram coletadas no coletor de frações LKB, mo­

delo 7000, nun volume de 1,1 ml/tubo, m m fluxo de

9,9 ml/h.

e) Nas frações coletadas foram lidas as absorvâncias e*.

230 nm.

Obs.: A técnica foi realizada a temperatura ambiente.

D - TRATA'EOT) DOS DADOS

A partir das curvas de eluiçãb, foram calculados os coeficien

tes de partição (K ) dos três picos com áreas relevantes, denominados

"a", "b" e "c", de cada amostra conforme figuras 2 a 9, segundo a equação

3.

ve " vo Kav" — — (?)

vt - v0

onde

V. - volume efluente da proteína e a V * erro do volurte efluente;

V • volume vazio e a V0 • erro do volume vazio;

Vt • volume total da coluna de gel e a Vt • erro do volune total,

0 erro de K^.u K^.foi calculado secando a equação 4:

16

/o Vg - o V a Yt - a Vc\

• Kw » (—2 2. • _ 5 x V (4) V Ve-V0 Vt-V0 J

0 coeficiente de partição das substâncias entre a fase líqui­

da e sólida é uma variável independente da compactação do gel na coluna e

permite avaliar o tamanho molecular.

A área de cada pico de absorção era 230 nm foi calculada pelo

Programa "Analysis"69 em operação no Departamento de Processamentos de

Dados do IPEN, considerando a absorvância obtida em cada fração eluida.

III.6. ESPECTRO DE A3S0R(?Q XA REGIÃO ULTRAVIOLETA

A absorção molecular na região do ultravioleta depende da

estrutura eletrônica da molécula, principalmente os sistemas conjuga­

dos62. Em alguns comprimentos de onda, certos grupos químicos dominam o

espectro observado. Estes grupos são chamados cromóforos. Os cromóforos

típicos encontrados em proteínas e ácidos nucleicos absorvem luz somente

em comprimento de ondas inferiores a 300 nm e podem ser divididos em três

classes: ligação peptídica, cadeias laterais e os grupos prostéticos15.

As cadeias laterais dos aminoàcidos: Asp, Glu, Asn, Gln, Arg

e His têm transições eletrônicas na mesma região espectral onde ocorre

forte absorção da ligação peptídica, sendo quase impossível distingui-las.

Por este motivo as propriedades ópticas das cadeias laterais mais utiliza

das são aquelas que ocorrem em comprimentos de onda superiores a 230 nm,

onde a absorção da ligação peptídica ê mínima15.

Entre 230 e 300 nm, ultravioleta próximo, os efeitos dos anú

noacidos aromaticos (Phe, Tyr e Trp) são os nais considerados, além da

histidina e dissulfetos (cisteina)1".

A estrutura da cadeia de aminoãcidos permite uma maior ou me-

17

nor exposição destes .<prupos, que pode ser alterada pela radiação ionizan-

te.

A - PROCEDIMENTO

Foram analisadas amostras na concentração de 500 yg por ml,

no intervalo de 240 a 350 nm, no espectrofotómetro Cary Modelo 118. A

leitura foi obtida contra uma solução de N a Q 0,15 M, que foi utilizada

como solvente.

III.7. EETERMINAfflO DE ENZPíftS CASEINOLÍtlCAS

Método de Kunitz36

A capacidade do veneno de cascavel digerir a caseína se deve

a presença de enzimas proteolíticas53. 0 método de dosagem da atividade

caseinãsica foi utilizado com o objetivo de avaliar os efeitos da radia­

ção neste grupo de enzimas.

A - REAGENTES

a) Tampão Tris-HCl 0,2 M pH 8,8 em água destilada.

b) CaCl2 0,08 M em água destilada.

c) Ácido Tri-dorc-acético 51, em água destilada.

d) Caseína segundo Hammarsten 2% em tampão Tris-HCl 0,2 M pH

8,8; fervido durante 20 minutos.

B - AMOSTRAS PADRÕES

Foram utilizadas soluções de tripsina nas concentrações de

2,4, 6 e 8 yg/0,9 ml de tampão Tris-HCl 0,05 M pH 7,5 em água destilada

como padrões.

IS

C - PftCCEDrPTO

Foran realizadas as seguintes etapas:

a) En 0,1 nl de CaCl, °t08 M» colocar 0,9 ml de amostra

b) Adicionar 1,0 ml de caseína fervida. Incubamos por 30 ni-

nutos em banho-maria a 37°C.

c) Parar a digestão da caseína adicionando 3,0 ml de TCA S%.

d) Agitar e incubar por 1 hora em banho de gelo.

e) Filtrar em papel '.fhatman n* 1.

f) Ler a absorvância do filtrado em 280 nm.

D - TKA.TAMENTO DOS DADOS

Os pontos utilizados na construção da curva padrão foram fei­

tos em quadruplicatas e as amostras em triplicatas.

Os dados da curva padrão foram ajustados a uma função linear

do tipo Y * AX • B, assim como foram tratados os dados do item III.2.D.

0btivemos os valores de A e B.

A - 13,09 a A » 0,38

B « 0,00 a B » 0,00

As concentrações correspondentes a tripsina nas amostras fo­

ram estimadas a partir das absorvâncias.

Com o intuito de ter valores comparáveis, utilizou-se as con­

centrações proteicas determinadas no iten II1.2 e obteve-se as concentra­

ções correspondentes de tripsina por m% de proteína presente na amostra.

Os erros destes valores foram calculados segundo a equação 5.

T . 1000 a T

Proteína ( a trinsina a nroteíha\

• " 1 (5) tripsina proteína /

19

onde:

T * valor correspondente a tripsins en vg para cada nilijrana de proteí­

na

o T • erro do valor de T

Proteína • valor encontrado na dosagen, en cada amostra

o proteína • erro da dosagen de proteína

Tripsina* valor encontrado na determinação (yg/ml)

o tripsina • erro do valor encontrado

III.8. rtUNODIFUSáP

yütodo de Ouchte^lony2,*•,*6•,•7

A imunodifusãb foi utilizada para observar, qualitativamente,

a capacidade antigênica das principais frações proteicas do veneno, subme

tido as varias doses de radiação.

A - REAGENTES

a) A"gar-áear 21, dissolvido em tampão fosfato 0,1 M, nH 7,0.

b) Soro anticrotãlico com capacidade de neutralizar 1,5 mg

de veneno por ml, cedido pelo Instituto Butantan.

c) Solução de NaCl 0,15 M, en água destilada.

d) Solução de Negro de amido 0,4% em ácido acético 10%,

e) Ácido acético 51

f) Amostras na concentração de 600 yç/ml.

B - PROCEDIMENTO

Foram efetivadas as seguintes etapas:

a) Distribuir 4 ml de Igar-ãçar dissolvido sobre uma lâmina

de microscópio 7,0 x 2,5 cm.

20

b) Deixar a lâmina a temperatura ambiente "over night".

c) .?azer poças de 2 mm de diâmetro, numa distância de 1 cm.

d) Aplicar as amostras e o soro nas poças adjacentes.

e) Deixar em câmara úmida "over night", a temperatura ambien­

te.

f) Lavar a lâmina com solução de NaCl 0,15 M, pelo menos 15

vezes.

g) Lavar a lâmina com água destilada por 15 vezes,

h) Secar a lâmina a 45°C.

i) Corar a lâmina com Negro de amido 41, por 10 minutos.

j) Descorar com ácido acético 5%.

1) Lavar a lâmina com água destilada e deixar a temperatura an

biente.

III.9. PttKOPRECIPITACK)

^?étodo segundo Kabat31*

A imunoprecipitaçâb foi utilizada para observar quantitativa­

mente, a capacidade antigenica das proteínas do veneno submetido às vá­

rias doses da radiação2i7»2'%M,.68#

A - KEAGENTES

a) Soro anticrotalico com capacidade para neutralizar 1,5 mg

de veneno por ml, cedido pelo Instituto Butantan.

b) Solução de NaCl 0,15 M em água destilada.

c) NaOH 0,1 N em água destilada.

d) Amostra de veneno nas concentrações de 93,75; 137,50 ;

250,00; 375,00; 500,00; 750,00 wg/ml.

21

Foran realizadas as seguintes etapas:

a) En 0,8 ml de amostra adicionar 0,2 ml de soro anticrotáli-

co, a 37°C.

b) Incubar por 1 hora a 37°C.

c) Incubar por 24 horas a 4°C.

d) Centrifugar por 10 minutos a 2.000 rpm.

e) Lavar o precipitado por 3 vezes com solução de NaCl 0,15 M

a 2.000 rpm.

f) Ressuspender o precipitado com 2 ml de NaQH 0,1 N.

g) Ler a absorvância em 280 nn.

C - TRATAMETO DOS DADOS

As amostras em diferentes concentrações permitiram obter uma

curva da quantidade de precipitado, dada pela absorvância (abs), em fun­

ção da concentração de veneno. Porém para comparar os resultados nas di­

ferentes doses de irradiação, foi necessária uma transformação logísti­

ca12 (equação 6):

abs/10 Y - In (6)

1 - abs/10

obtendo assim uma função linear (equação 7);

Y • A . concentração de veneno • B (7)

onde

A • coeficiente angular da reta

B • coeficiente linear da reta

22

Os valores de A e 3 forart calculados pelo rcétodo dos níninos

quadrados do programa SAS51.

Duas retas são consideradas paralelas quando apresentam o mes

•no coeficiente, ou seja, quando A, • A,.

Para verificar o paralelismo das curvas, utilizou-se o teste

pi3,i7 entje a soma de quadrados dos resíduos dos nodelos completo e redu

zido, comparando os valores de Fa

"odeio Completo ÇC)

YNI * A,»00110 * Bi

Y i r ' A 2- c o n c * B2

^íodelo Reduzido ÇK)

YpíI » A.conc • B,

Y. » A.conc + B2

H o : \ ' h

0 valor de F_ é obtido pela relação da equação S:

F a ' (SQRr - SQRc)/(ar - GLç)

CS)

onde:

SQR « soma dos quadrados dos resíduos do modelo reduzido

SQR * soma dos quadrados dos resíduos do modelo completo

GL • graus de liberdade do modelo reduzido

GL • graus de liberdade do modelo completo

QMR. • quadrado médio dos resíduos para o modelo completo

Para verificar se as retas são coincidentes, comparou-se os

valores de B, utilizando o teste F entre a soma de quadrados dos resíduos

dos nodelos reduzido e reduzidíssimo, comparando-se os valores de F. .

23

Modelo deduzido C?0 'tadelo TÍeduzidíssrno C^)

Y ., * A . cone • B,

Y « A . cone • B Y. * A . cone • B, Ir <.

Ko ; Bl " B2

0 valor de Fb é obtido pela relação da equação 9:

(SQTL - SQR)/(GL_ - GLJ R - 2 5 EL (9)

onde:

SQR * a soma dos quadrados dos resíduos do «rodeio reduzidíssiro

GL_ - graus de liberdade do modelo reduzidíssimo

ÇJPÍRj. * o quadrado médio dos resíduos para o modelo reduzido

111.10. EElEflMDMÇS) DA ATIVIDADE TfflgCA

A determinação da toxicidade das amostras irradiadas ou não

irradiadas foi feita pelo cálculo da dose letal 50*, pelo método de Reed e

ttiench52.

A medida da DL™ foi realizada em camundongos albinos agrupa­

dos em pesos entre (21 ± l)g e (24 t l)g cada un, pela via intraperito­

neal, utilizando 5 grupos de 4 camundongos cada, mais un grupo controle.

De cada amostra foram feitas diluições adequadas, (tabela 1)

obtendo SI, depois em série de 3:4, e injetadas num volume de 0,2 ml en

cada animal.

As mortes e sobrevidas foram anotadas 24 horas após as inje­

ções. 0 cálculo foi realizado segundo as equações 10 e 11

50 - Y d.p. - (10)

X-Y

24

c « log 2 • (d.p. x los 1,33) (11)

onde:

X • \ de TTwrtalidade na diluição loco aeina do valor que nrovocou 501 de

rorte ou mais.

Y • l de mortalidade na diluição logo abaixo do valor que provocou 50% de

morte ou mais

Z • % diluição inferior ao valor que provocou S0% de norte

d.p. * distância proporcional

log 1,33 » logarítimo decimal do fator de diluição.

0 antilog de "c" (equação 11) forneceu a diluição exata em

que ocorreu 501 de norte, e consequentenente a concentração en wj/te; de

peso.

zs

IV. 2SÜLTCX5 E DISCUSSES

Avaliando a quantidade de proteína presente no veneno irradia

do, podemos observar pela tabela 2 que a partir Je 750 Gv, ocorrer, perdas

parciais das proteínas solúveis. Supcnos que este fato seja conseqüência

da formação de radicais na superfície protéica, possibilitando assrâ a

fòmação de agregados, ou aesco rela mudança conforracienal que reduz

sua solubilidade5»13»35. Neste trabalho apenas estudamos a parte solúvel

das amostras.

Alguns autores corn Puranananda*9, Xankonkar e colaborado­

res35, também irradiaram veneno de diferentes serpentes (na faixa de 20 a

30 KGv), eci solução, não observando precipitaçãb na anostra. Isto mostra

a importância das diferentes condições de irradiação (dose, taxa de dose,

tipo de amostra, concentração) em cada experimento.

Sabendo-se que a radiação ionizante pode proporcionar redu­

ções das ligações dissulfetos13. tentamos detectar a presença de possí­

veis grupos sulfidrílicos, imediatamente após a irradiação. De acordo

com o método de Ellman, não foram observados jrupos sulfidrílicos livres

neste experimento, discordando parcialmente com o trabalho realizado ante

riormenteH3f onde na dose de 1.000 Gy (taxa de dose 1.250 Gv/h), detec­

tou-se grupos sulfidrílicos livres. Estes resultados sugerem que a redu­

ção das ligações dissulfetos podem ocorrer, nas sua oxidação muito rápi­

da, pode por vezes inviabilizar sua quantificação.

Assim como as ligações dissulfetos, erc princípio as ligações

da cadeia polipeptídea também podem ser rompidas, embora seja normal una

dificuldade maior em rompê-las. Os efeitos mais esperados a nível molecu

lar são a descarboxilaçab, desaminaçãb e a saturação de ligações duplas35.

Com o intuito de observar as possíveis quebras nas proteínas, utilizamos

26

a técnica de eletroforese nu-, sistera torção denaturante, onde as cadeias

são separadas de acordo con seu tamanho.

Na figura 1 observaaos que o padrão dos perfis eletroforéti-

cos das anostras não se altera, erbora seja observada uaa difusão discre­

ta e crescente das bandas, a medida que a dose de irradiação auaenta.

Portanto os dados fornecidos pela eletroforese (BGPA-SD5) assegura-nos de

que não há rompimento das cadeias polipeptídicas de nodo a produzir frag­

mentos de determinados tacanhos, ncn agregados, que possam ser detecta-

veis nas condições do experimento. £ conveniente lerbrar que Baride e co

laboradores5 observaraa através da comparação entre a eletroforese nun

sistena catiõnico, nun sistera denaturante e pela filtração CM Rei, que a

radiação gana dá origem a ligações fracas envolvendo forças secundárias ,

enquanto que a formalina ocasiona ligações químicas fortes ca soluções de

veneno de Mojo- naja, Bungaru» ehrnndtu», Eekis earinatut « Vipcra ntãttl-

li.

Além de analisadas nun sistera denaturante, as anostrás foran

submetidas também a una técnica não denaturante, â croratografia por ex­

clusão molecular, que perna te a análise de cada fração separadanente5**66.

0 perfil da amostra não irradiada (figura 2) é senelhante àquelas obtidas

por Rogero55, Takeda e colaboradores'6, evidenciando a nresença de diver

sos componentes, As amostras irradiadas (figuras 3 a 9) foran analisadas

e comparadas com a não irradiada pelas áreas e pelos coeficientes de par­

tição dos picos considerados relevantes (figuras 2 a 9, picos "a", "b" e

"c"). A observação das três principais áreas indicaram que até a dose de

1.000 Gy as frações presentes no veneno não forar* alteradas de foma sig­

nificativa (figura 10 e tabela 3). Nas doses de 1.500 a 2.090 Gy observa

nos una redução das áreas das frações "a" nas proporções aproximadas de

40 e 701 respectivairente. A fração "b" na dose de 2.000 Gy apresentou u-

*ia redução por volta de 50* en relação ao não irradiado. As frações "c"

27

das doses de 1.500 e 2.000 Gy, sofreram un auaento estreado de 50 e S0^

respectivamente, en relação ac não irradiado. As diferentes proporções

encontradas provavelnente são conseqüências das precipitações observadas.

Por outro lado. pela tabela 4 poecros verificar que não oconeiaa varia*

ções significativas nos coeficientes de partição, confinando a manuten­

ção do tacanho molecular das proteínas*1.

Mo espectro de absorção na região ultravioleta (figura 11) r»

demos observar que ocorreu un aumento de absorção na região de 230 a

350 nm ã medida que se aunentou a dose de radiação, assin cano ocorreu a

diminuição da diferença entre o pico de absorção «abona e enhim, er> 280

e 250 nm, respectivãmente, ilustrada na tabela 5. Estes resultados são

súrdlares aos obtidos por Baride e colaboradores5 nas soluções de venenos

de Haja naja, B. ehmdeu», E, carinatu» e V. rutaãlli, os quais indicam

u'a maior exposição dos grupos cromóforos, possivelnente devido aos desdo

bramentos das cadeias polipeptídicas.

Nas amostras, as enzimas caseinolíticas, dosadas para verifi­

car a manutenção do poder catalítico, continuai presentes, mesmo naquela

submetida à dose de 2.000 Gv. Observou-se a manutenção da proporcionali­

dade entre a concentração correspondente de tripsina e a concentração pro

téica. indicadas na tabela 6.

Por outro lado. nos venenos de Botrop* atrox e LaehtHa -mta,

submetidos a dose de 1.000 Gy, a seco, a radio-sensibilidade das ativida­

des enzimáticas em ordem crescente é: exonucleásica, fosfòlipásica. pro-

teolítica (caseinolítica). esterásica, enzima trombina-sísdle, fibrinolíti

ca32. De modo que observando os resultados acina do veneno de Crotalus

àtrUsu» terrificus, nota-se que este grupo de enzi»?as tambè™ está entre

os mais radic-resistentes.

Cs vários experimentos realizados com a parte solúvel do vere

2S

no, en cloreto de sódio 0,15 ", tiver» cano objetivo principal verificar

o conportapcnto desta face a radiação, em temos de possíveis alterações

estruturais significativas nos seus constituintes. As determinações de

grunos sulfidrílicos, eletroforese em gel de poliacrilaeúna (EíyA-SDS) ,

cronatografia por exclusão nolecular, absorção na região ultravioleta e

enzinas caseinoliticas, sugeren que nas doses estudadas os conponen—

tes sofre» nodificações discretas, que são diretanente proporcionais £ do

se de radiação recebida.

Após temos una noção do cuHyoitawento do veneno, testanos

sua capacidade antigênica, baseados na especificidade da reação antígeno-

anticorpo2*. pela innodifusãb e irmoprecipitaçãb. O netodo de iaunodi-

fusão dupla radial descrito por Ouchterlony**.*7, pemite cooperar vários

antigens contra o nesno sistena de anticorpos, assi» cono o «todo de

inunoprecipitaçãb3* auxilia na visualização da honologia entre os antíge-

nos 2. 7.".

Observando as linhas de precipitação nas figuras 12 a 16, ve-

rificanos que as linhas renanescentes nantén a identidade con o veneno

não irradiado, até a dose de 2.000 Gv, porén nas doses aciraa de 750 Cy ,

essas se toxnan nenos intensas e difusas com o aunento da dose de radia­

ção.

No que diz respeito â iaunoprecipitação, para possibilitar u-

ma conparação entre as curvas representadas nas figuras 17 a 24, foi ne­

cessário obter una reta pela transformação logística, para então aplicar-

nos o teste F nos coeficientes angulares e lineares (tabela 7). Xa tabe­

la 8 encontramos os parânetros utilizados nos cálculos de "Fa" e "Fj,", na

ra verificar o paralelismo e a coincidência, respectivanente, entre as re

tas. Con os valores de "Fa", "Fb" e os "F crítico" da tabela 9, foi pos

sível verificar que as amostras irradiadas com 100, 250 e 500 Gy tiveram

os coeficientes angulares irradiadas con 750, 1.000 e 1.500 Gy, e*ora as

29

curvas sejan paralelas, houve necessidade do aunento de concentração dove

neno para obter o mesrao valor de absorvância. N'a dose de 2.000 Gy pode-

nos verificar que houve usa rrudança brusca no comportapíento da curva.

Por esses nétodos, concluímos que a antiçenicidade das proteí

nas presentes na solução não são alteradas ate a dose de 500 Gy. Mas do­

ses de 750, 1.000 e 1.500 Gy, embora ocorra reconhecimento dos antígenos

pelo anticorpo, nota-se modificações nesta interação. Já na dose de

2.000 Gy a formação do complexo está bastante alterada.

Os resultados obtidos "in vitro" foram complementados pela

avaliação da atividade toxica. A DL™ do veneno não irradiado, via intra­

peritoneal, en camundongos machos foi de 203 ± 3 wg/kg e 173 t 17 ug/kg .

Estes resultados concordaw com os valores encontrados por Brazil9, cuja

Ijn situa-se entre 135,7 e 209,85 wgAg, embora estes tenham sido ava­

liados pela via intravenosa, sem distinção de sexo.

Gomo podemos observar pela tabela 10 há aumento de cerca de

1,6; 2,4; 2,7 e 4,6 vezes da DLJQ em machos, em comparação a amostra não

irradiada, nas amostras de 750, 1.000, 1.500 e 2.000 Gy, respectivamente.

Também foi possível verificar um aumento de aproximadamente 1,7 e 3,1 ve

zes da DLÇQ em fêmeas, em comparação a amostra não irradiada, nas amos­

tras de 500 e 1.000 Gy respectivamente, e que não há alterações significa

tivas nas «nostras de 100 e 250 Gy.

Embora tenha sido observado variação na resposta entre grupos

de camundongos machos e fêmeas, esta não é relevante para verificação da

redução da toxicidade determinada. Cabe aqui citar una das conclusões ob

tidas por Rosa e colaboradores9', "A O L ^ do veneno de Crotàlua duriaaua

Urrifieua (Lautenti, 176S), de coloração branca, crotamino-positivo, po­

de ser determinada através de inoculações, por via intravenosa, em camun­

dongos Hua mtaeulua Linnaeus, 1758 - de 18 a 22 g, sem distinção de sexo".

30

Desta forma, foi possível verificar que com o aumento da dose de radia­

ção há aumento da DL-n do veneno de cascavel, en cammdongos.

Pela somatória dos resultados obtidos "in vitro" e de redução

de toxicidade "in vivo", podemos concluir que as respostas do veneno cro-

tálico frente a radiação gana seguem os mesmos padrões das diferentes pe-

çonhas, já citados, submetidos ao mesmo processo físico. Desta forma po­

demos supor que também ocorra um paralelo quanto sua imunogenicidade, pos_

sibilitando a utilização deste processo na obtenção de anticorpos.

Gomo complemento, tanftém podemos citar alguns parâmetros veil

ficados no estudo das toxinas de cascavel isoladas. Souza e colaborado­

res63»6'* submeteram a crotoxina em solução a diferentes doses de radiação

60Co, observando que nas doses de 250 e SOO Gy, não ocorrem variações si£

nificativas nas concentrações, antigenicidades e doses letais 50%, em ca-

mundongos. Nas doses de 1.000 e 1.500 Gy foram observadas precipitações

de 15 e 401, respectivamente, além do aumento da DL~0 de 2,0 e 3,5 vezes

nas amostras em relação a toxina não irradiada. Em 2.000 Gy, 65*« das pro

telhas presentes na solução precipitaram, sendo que as remanescentes apre

sentaram grandes modificações. A crotamina irradiada, estudada por Costa

e colaboradores18»19»20, não mostrou alterações na antigenicidade e no

perfil eletroforetico, quando submetida a dose de 100 Gy; porém na dose

de 2.000 Gy a autora observou mudanças no perfil eletroforetico, além da

perda da capacidade antigênica. Desta forma, encontramos um paralelo en­

tre o comportamento de soluções das toxinas isoladas e o veneno total ,

quando o submetemos â radiação gama.

Estudando toxinas isoladas. Ham hiro e colaboradores31 obser

varam que a fosfolipase A (subunidade da crotoxina) foi capaz de induzira

produção de anticorpos com opacidade de neutralizar o veneno total "in

vitro". Recentemente, Santos e colaboradores59 concluíram que imunidade

31

induzida pela fosfolipase ^ , resulta na produção de anticorpos capazes

de neutralizar o efeito letal do veneno C. d. t*rrificust em camundongos.

Esta seria uma forma tentativa de se obter soro anticrotálico.

Considerando que este trabalho ê um estudo preliminar para a

obtenção de antígenos atóxLcos para a produção de soros pela atenuação do

veneno total, sugerimos que o próximo passo seja de testar as amostras ir

radiadas em animais de laboratório, com o intuito de avaliar o anticorpo

produzido, Para tal, inicialmente propomos a utilização da faixa de dose

entre 750 e 1,000 Gy, onde pudemos notar menor variação estrutural com a

detoxicação do mesmo. Posteriormente, testar tarrbém doses iguais ou aci­

ma de 2.000 Gy, onde já observamos alterações na antigenicidade, baseados

no estudo de Puranananda'*9, no qual observou-se que mesmo as amostras on­

de as características antigênicas não puderam ser detectadas pela imunodi

fusão, elas foram capazes de induzir a produção de anticorpos, que são e-

fetivos na proteção contra o veneno homólogo, em camundongos.

32

Tabelr. 1 - Condições iniciais para o teste da DL,

Carundonsos Concentração de SI .\mostra

sexo peso (3) ivzfal)

NI

750

1.000

1.500

2.000

* r

:i

M

:?

> t

(21 ± 1)

(24 ± 1)

(21 ± 1)

(24 ± 1)

(27 t 1)

( 35 ±

( 97 ±

(107 ±

(184 ±

(282 ±

D

2)

D

6)

6)

?íl

100

250

500

1.000

F

F

F

F

F

(21 t 1)

(24 t 1)

(24 t 1)

(21 ± 1)

(21 t 1)

( 34 ± 3)

( 37 ± 4)

( 53 ± 4)

( 66 ± 6)

(103 ± 11)

NI - amostra não irradiada

Tabela 2 - Determinação da concentração proteica

Concentração Amostra Absorvância

(Mg/200 yl)

NI

100

250

500

750

1.000

1.500

2.000

(0,212 ± 0,003)

(0,217 ± 0,004)

(0,212 ± 0,003)

(0,206 ± 0,004)

(0,351 ± 0,004)

(0,323 ± 0,003)

(0,260 l 0,008)

(0,199 ± 0,004)

(53 ± 1

(54 ± 1

(53 ± 1

(51 ± 1

(87 ± 1

(80 ± 1

(65 ± 2

(49 ± 1

Cone.corrigida Diluição % relativa

Mg/ml

8

8

8

8

4

4

4

4

(2120 ± 40)

(2160 ± 40)

(2120 ± 40)

(2040 1 40)

(1740 ± 20)

(1600 ± 20)

(1300 ± 40)

( 980 ± 20)

100

102

100

96

82

75

61

46

NI * amostra não irradiada

34

Tabela 3 - Areas dos

Amostra

NI

100 Gy

250 Gy

500 Gy

750 Gy

1.000 Cf

1.500 Gy

2.000 Gy

Pico "a"

área

(2527 ± 130)

(2459 ± 200)

(2475 ± 224)

(2236 ± 147)

(2273 ± 177)

(1643 ± 227)

(1526 ± 162)

( 822 ± 102)

Tabela 4 - Coeficiente de

.Amostra

NI

100 Gy

250 Gy

500 Gy

750 Gy

l.P'0 Gy

1.500 Gy

2.000 Gy

Pico "a"

Kav

(0,33 ± 0,02)

(0,33 ± 0,02)

(0,33 ± 0,02)

(0,36 ± 0,04)

(0,36 t 0,04)

(0,37 ± 0,04)

(0,35 ± 0,04)

(0,34 t 0,02)

picos ue absorção

Pico "b" Pico "c"

área área

(640 ±

(804 ±

(707 ±

(520 ±

(861 ±

(638 ±

(731 ±

(318 ±

76)

82)

92)

50)

74)

147)

120)

87)

(433 ±

(391 ±

(403 ±

(315 ±

(513 ±

(395 ±

(643 ±

(781 ±

63)

58)

72)

42)

59)

121)

114)

126)

partição dos principais picos

Pico "b"

Kav

(0,73 t 0,03)

(0,71 ± 0,03)

(0,70 t 0,03)

(0,72 ± 0,05)

(0,73 t 0,05)

(0,72 t 0,06)

(0,71 ±*0,06)

(0,77 t 0,04)

Pico "c"

Kav

(0,84 t 0,04)

(0,82 ± 0,04)

(0,82 t 0,04)

(0,86 t 0,06)

(0,86 ± 0,06)

(0,86 t 0,07)

(0,86 t 0,06)

(0,90 ± 0,04)

NI • amostra não irradiada

35

Tabela 5 - Absorvancia no pico maxino e rnínino na Região II.Y.

Absorvancia Absorvancia Amostra A Absorvancia

max . (280 nm) nin . (250 nm)

NI

100

250

500

750

1.000

1.500

2.000

0,640

0,640

0,655

0,655

0,680

0,730

0,745

0,780

0,350

0,375

0,395

0,425

0,480

0,520

0,545

0,595

0,290

0,265

0,260

0,230

0,200

0,210

0,200

0,185

NI • amostra não irradiada

36

Tabela 6 - Concentrações correspondentes cie trinsina nas anostras

Cone. tripsin? Conc* ^ p s i n a amostra Absorvância * corrigida

(ws/0,3 P 1 ) (PR/míO

XI

100

250

SOO

750

1.000

1.500

2.000

(0,248 ± 0,005)

(0,223 ± 0,003)

(0,237 t 0,002)

(0,203 ± 0,006)

(0,198 ± 0,020)

(0,163 ± 0,002)

(0,138 ± 0,011)

(0,119 ± 0,017)

(3,3 ± 0,1)

(2,0 ± 0,1)

(3,1 ± 0,3)

(2,7 i 0,1)

(2,6 ± 0,3)

(2,1 ± 0,1)

(1,8 ± 0,2)

(1,6 ± 0,2)

(1.7 ± 0,1) .

(1.5 ± 0,1)

(1,6 ± 0,1)

(1.4 ± 0,1)

(1,6 ± 0,1)

(1.5 ± 0,1)

(1.6 ± 0,1)

(1.8 ± 0,3)

Tabela 7 - Coeficientes angulares e lineares das retas

de inunoprecipitação

Amostra Coef. Angular A Coef. Linear B

:ÍI

100

250

500

750

1.000

1.500

2.000

(0,014 ± 0,002)

(0,014 ± 0,003)

(0,015 ± 0,002)

(0,016 t 0,002)

(0,017 ± 0,002)

(0,017 ± 0,002)

(0,017 ± 0,002)

(0,032 ± 0,004)

( -6,672 ± 0,568)

( -6,780 ± 0,702)

( -7,190 ± 0,605)

( -7,668 ± 0,337)

( -8,075 ± 0,460)

( -8,632 ± 0,511)

( -8,999 ± 0,388)

(-14,403 ± 0,997)

N'I • amostra não irradiada

Trbeln 3 - Parâmetros utilizados nos cálculos de F„ e F,

Amostras "todelo GL SÇR (£IP.

NI ?1C 1 6 13,332 0,333

e ?ai 17 13,343 0,735

100 Gy MZ 1 3 13,344 0,741

NI MC 1 6 11,264 0,704

e MR 1 7 11,395 0,670

250 Gy MZ 1 8 11,592 0,644

NI ?£ 16 9,982 0,624

e Ml 17 10,297 0,606

500 Gy MZ 1 8 11,554 0,642

NI ?C 16 8,729 0,546

e MR 17 9,342 0,550

750 Gy :E 18 11,878 0,660

NI MC 16 9,545 0,597

e MR 17 10,471 0,616

1.000 Gy MZ 18 16,641 0,925

NI ,MC 16 7,735 0,483

e MR 17 8,328 0,490

1.500 Gy :Z 18 21,905 1,217

NI :C 16 21,532 1,346

e 'E 17 43,094 2,535

2.000 Gy MZ 1 3 109,094 6,061

Tabela 9 - Valores de " e R,

.Amostras F„ F.

a b

MI e 100 Gy 0,01 0,00

NI e 250 Gy 0,19 0,29

NI e 500 Gy 0,51 2,07

NI e 750 Gy 1,12 4,61

NI e 1.000 Gy 1,55 10,02

NI e 1.500 Gy 1,23 27,71

NI e 2.000 Gy 16,02 26,04

F crítico Fx 16 - 4,49 Fx 1 ? - 4,45

Grau de liberdade o • 0,05 o = 0,05 NI * amostra não irradiada

Tabela 10 - Toxicidade das anostras não irradiadas (MI) e irradiadas

% de 'tortalidndo

^ V ^ O S t T O

d i l u i ç a Í N ^ MI 750 Oy

maios 1.000 Cy 1.500 Gy 2.000 fiy NI 100 Oy

FlTtGAS

250 fiy 500 Gy 1.000 Oy

SI - 1:1 100 93 100 100 100 100 100 100 100 100

1:1,33 83 92 89 100 100 75 100 100 100 100

1:1,78 33 78 83 100 83 57 67 78 100 60

1:2,37 11 57 20 67 40 14 29 63 25 17

1:3,16 8 14 0 33 0 0 11 29 0 0

l)L,n (wp/Kj-) 207 1 3 324 * 4 492 i 5 561 t 18 942 t 20 173 i 17 152 * 17 167114 291 * 27 540 t 56

•tn

:.'rs £ií»uras cue se serjcv. as crostras estão identificadas cor

a serainte nwcração:

1 - Veneno não irradiado

2 - Veneno irradiado ccr. 10" Gy

5 - Veneno irradiado ccr» 2SC Cy

4 - Veneno irradiado COR 50C Gy

5 - Veneno irradiado ccn 750 Gy

6 - Veneno irradiado con 1.C0C Gy

7 - Veneno irradiado con 1.500 Gy

S - Veneno irradiado con 2.000 Gy

Fi-^ra 1 - Eletroforese cr ^el <ie -oliacrilnrica er.

sistema descontínuo ccn S?S, corada cor. n^

trate de prata. As «Tícstras foran nré-tra-

tndas cor uréia c reta—ercntoctar.cl

41

'."rs fi^urts 2 a '.-, as ccrv'i^ces .'e crc-rtcrnrt'' -icr cxclu-

-cleculnr fomr rs sc.iir.tes:

- ~cl ^cnhaJcx Z-7Z fino

- "i'crsres ;'a ccluna: ?,? x CS.? <r*

- Vcliro ca rrcstrz: 1 r l (CZn, vz)

- Ycrxr ccletailas frações ce 1,1 -1/ttiv?

- Fluxo: D,9 rl/!i

- Efluentes: Trrpâc fosfato 3,"5 "', vi 5,5 err *,13

rrto òe sóV-ie

- Terr:en!tura: 5-S°C

- As anostras forar? lidas tubo a tubo CR 230 IF».

de c lo-

•M

«L«

* * .«

o S 7

"1 'r*«é«s

Tiiura 2 - Perfil arrato-ráfico da amostra nro irradiada

S 'o

• •

• H

» P • » ^ — — • » • ~ ~ " ~ T ~ ^ * »

•at Fractvs

Figura 3 - Perfil cnratosrãfico da nostra írraii*» con ym Uy

S f.H

•.•

«*

•a

* *

s *

»

/ X

?i<nira 4 - ?crfil cnnstornfico tia nrcstrn irrali.Va con 25° Zy

e

0 *

ft»

ft*

ftt

• t F r a * « « *

Fi'jura S - Perfil cronnto«rSfico ia arostra irradiada cor SOO Cy

1.»

• •

ft*

ft*

ft»

• * t -M

a *

- |1 \ \

i \ /V / \ I \

_ .J-..I-' ^ W

<w >raca«*

Figure f> - Perfil crorntoTnfico dn. .Trestra irradiada con 750 Gy

4t

o , ,

a»

OLS

a*

0.3

o.»i

0.1

\ ;U t :

10 20 30 «O SO TO

«» F ra fãas

Filtra 7 - Perfil croriitcjrãfico da anostra irradiada cor» 1.000 Gy

« 0 #

o.»

o.H

0 3

0 2

ft c

VI

0.1'

0 '

u L. *• -vA

• 0 70 00

n? F r * « i « «

Figura 8 - Perfil cronatoirafico da amostra irradiada con 1.500 Qy

° » « OS

0 4'

0 3

02

01

4S

::f *

\f % M

10 20 30 SO «0 TO | 0

nf Fraçôat

Filara 9 - Perfil cronatosráfico dn amostra irradiada con 2.000 Gy

ração •

Fração b

:;$ Fração e

Fieura 10 - AYea das trcs principais frações dos r»erfis cronatosrá

ficos, ào veneno de cascavel on 230 nn, das arostras

nno irradiadas (NI) e submeti:'as as varias doses do ra

diação «na, esticadas ~>elo ProTrnra "analysis"69

if-

Figura 11 - Espectro de absorção na região ultravioleta de arostras de

veneno crotálico cn solução de NaCl 0,15 ,f, na concentra­

ção de 500 u^/^1. \:a leitura do espectro utilizou-se o in­

tervalo de absorvancia de 0 a 1,0, ccn una variação de ecr

^ri^ente de onda (A) de 0,5 n-i/soTundo, entre 240 e 350 nr.

A velocidade do papel foi c*e 23 nr/nolerada.

47

Os resultados ce irunodifusãc dupla radial representadas nas

figuras 12 a 16, feran obtidos en lâr±n?s cor. agarose 2" er. ta"não fosfa­

to 0,1 M, pi! 7,0. As lâminas após lavarçcr e secarren, foran coradas cen

:.'ciro de Anidc. 0 scro anticrotálico está renresentado nor S.

F i ^ r a 12 - Irrunodi fusão dupla radial des

sobrenadantes das nnostras i r

radiadas ou não

43

Figura 13 Fiíjura 14

6 8

Ficura 13 rifUiTa 16

Figuras 13 a 16 - .\s amostras r.a concentração de 600 wj-n fora-n anali

sadas frente ao soro nnticrotalico

•P

As curvas de irur.opreciyntaçno representadas nas figuras 17 a

24 nnstran os produtos de interação dos ver.enos irradiados ou não cor o

soro anticrotalico. '<s mostras foran incubadas nor 1 hora a 37°C e rnis

24 horas a 0CC. Os precipitados foram dissolvidos en hidróxido de sódio

0,1 X c lidos en 2S0 rct.

as­

sa *» a* (mg)

Figura 17 - Oirva de inunoprecipitaçao

da amostra não irradiada

, 1

1

1.0"

«••

0"

, -"••!..

/ 0

f i i

• • t

J • *

S 011 014 «•

(Mfl)

Fijjura 18 - Curvas de i-nunoprecipi tação

das arostras: 1 - não irra­

diada; 2 - irradiada 100 Hy

••.->

».<H .•?.'

n Curves de inunoprecipitação

das amostras:

1 - não irradiada;

3 - irradiada 25C Gy

o\ *•'

o.a 0.4 am (m»)

Figura 19

'.oi

Ml

U

1

4 X*

CuTvas de imunoDrecipitação

das amostras:

1 - não irradiada;

4 - irradiada 500 Gy

03 0.4 <x« lm«)

Fieura 20

vi

OM

/r '<?

: I

Curvas de irunoprecipitação

das anostTas:

1 - não irradiada

5 - irradiada 759 Gy

*<£*-/ /

0.1 04 O.»

(m#>

Figura 21

51

'.OH A X.

054

Curvas de inunoprccipitnçio

das arostrás:

1 - não irradiada

6 - irradiada 1.000 Gy

o-l *•*--•* . . * •

02 0.4 0* «•nane (nif)

Fiçura 22

'.OH

OJ»1

.-+

.4 /T

Curvas de inunoprecipitacao

das amostras:

1 - não irradiada

7 - irradiada 1.500 Gy

o ' o> o»

Fijrura 23

o* I M I

W1

o»1

$£**-<"

; * • .

/ •

«3 W 0* »•«•(»• (ma)

Curvas de inrunoprecipitação

das amostras:

1 - não irradiada

8 - irradiada 2.000 Gy

Figura 24

52

V. CONCUEÍS

.Vas amostras de Crotalus durissus terrifiaus irradiadas en

fonte de 60Co, en soluções de 2 mg/ml de cloreto de sódio 0,15 :r, a tenne

ratura anbiente, sob pressão atmosférica, concluímos que:

- Nas doses de 100, 250 e 500 Gy não há alterações bioquími­

cas, antigênicas e tóxicas significativas.

- Há diminuição de toxicidade com manutenção da antigenicida-

de nas doses de 750 e 1.000 Gy.

- Nas doses de 1.500 e 2.000 Gy há modificações bioquímicas e

antigênicas significativas, com perda parcial da toxicidade.

- A irradiação ê una técnica promissora na obtenção do vene­

no de cascavel atenuado.

J J

EFBÊCMS BBLTOFIGS

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ERRATA

Abstract - 2» parágrafo, 3t linha, leia-se:

... Doses of 100, 250, 500, 750, 1,000, 1,500, and 2,000 Gy

«ere used at a dose rate of 1,190 Qr/h.

Pagina 7 - B - PRDCEDDCKID, itea b, leia-se:

A solucio foi filtrada en papel Whatman n » l e distribuída en

tubos de ensaio de 12,5 x 1,5 en con 7,5 nl cada.

Página 8 - A - REAÍBiTES, itea b, leia-se: CuSO^ 51, em água destilada.

Pagina 19 - B - PROdDDOflD, leia-se:

Fbran efetuadas as seguintes etapas:

Pagina 22 - 3* parágrafo, leia-se:

Para verificar o paralelisa» das curvas, utilizou-se o teste

F3'17 entre...

Página 25 - 4* parágrafo, 2? linha, leia-se:

... da cadeia polipeptídica...

Página 28 - Última linha, leia-se:

... os coeficientes angulares e lineares considerados iguais

â amostra não irradiada. Já nas amostras irradiadas con 750,

1.000 e 1.500 Of, embora as ...

Página 29 - 3* parágrafo, 3? linha, leia-se:

... « B camundongos amenos foi de 203 ± 3 wg/kg e 173± 17 pg/kg

em fêmeas*

5* parágrafo, 5? linha, leia-se:

... (Laurenti, 1768),.,.

Smvtc* M AMI* DMMC*

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