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EFEITOS DA TIMULINA ULTRA-DILUÍDA NA RESPOSTA LINFÓIDE E EVOLUÇÃO
GRANULOMATOSA INDUZIDA POR BCG
RUGGERO ZALLA NETO
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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
PROGRAMA DE MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA EFEITOS DA TIMULINA ULTRA-DILUÍDA NA RESPOSTA LINFÓIDE
E EVOLUÇÃO GRANULOMATOSA INDUZIDA POR BCG
Dissertação Apresentada ao Programa de Mestrado em Medicina Veterinária da Universidade Paulista – UNIP para obtenção do Título de Mestre. Área de concentração: Imunopatologia Veterinária.
RUGGERO ZALLA NETO
São Paulo
2007
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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP
PROGRAMA DE MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA EFEITOS DA TIMULINA ULTRA-DILUÍDA NA RESPOSTA LINFÓIDE
E EVOLUÇÃO GRANULOMATOSA INDUZIDA POR BCG
Dissertação Apresentada ao Programa de Mestrado em Medicina Veterinária da Universidade Paulista – UNIP para obtenção do Título de Mestre. Área de concentração: Imunopatologia Veterinária, sob orientação da Profa. Dra. Leoni Bonamin
RUGGERO ZALLA NETO
São Paulo
2007
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Zalla Neto, Ruggero Efeitos da Timulina Ultra-diluída na Resposta Linfóide e Evolução granulomatosa
Induzida por BCG Ruggero ZallaNeto. 37p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária. Instituto de Ciências da Saúde (ICS) Universidade Paulista, São Paulo 2007.
Área de concentração: Imunopatologia Veterinária Orientadora: Leoni Bonamin 1. Homeopatia 2. Timulina 3. Granuloma 4. BCG
5
A minha orientadora: Prof. Dra. Leoni Bonamin:
“O sentido da vida consiste em que não tem nenhum sentido dizer que a vida não tem sentido” (Niels Bohr)
Sua confiança em mim tornou possível a realização do maior sonho de minha vida, meu mestrado! Conviver lado a lado com uma mente tão brilhante, uma inteligência tão privilegiada e ao mesmo tempo um ser humano com tamanha grandeza e humildade me fizeram acreditar novamente nas pessoas e nas coisas boas que podemos construir.
Obrigado por sua amizade, sua confiança, sua dedicação e acima de tudo por seu exemplo!
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Aos meus pais Ruggero Zalla Filho e Vera Regina Vilela Zalla, agradeço pelo apoio, pelo suporte, pela compreensão e todo amor a mim dedicados. Aos meus sogros John Murphy e Maria José Simões Murphy por toda força e confiança depositadas em mim durante esta jornada.
Mas acima de tudo meu agradecimento pelos exemplos de vida, de caráter, de conduta e de valores que vocês me passaram.
A vocês o meu amor e admiração eternos.
Aos meus irmãos, Lucas e Tati por sua contribuição e amizade sempre.
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A minha linda esposa Julie Murphy, mulher linda, inteligente, companheira, batalhadora, forte e dona dos olhos verdes mais lindos que existem, o meu agradecimento pela ajuda e paciência, muita paciência em todos os momentos, obrigado por me dar os melhores presentes que um homem poderia receber que são meus 2 filhos lindos e saudáveis: Pietro e Lino Zalla.
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AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Mario Mariano, pelo apoio, amizade e ensinamentos o meu reconhecimento e agradecimento.
Agradeço a todos os professores da Pós-graduação, pelos ensinamentos e lições durante esses anos.
Agradeço aos funcionários da Pós-graduação da UNIP pela amizade e convivência nesse período e um obrigado muito especial para a querida “Dadá” do Biotério UNIP Bacelar, para o Prof. Ênio Bovino do HVET UNIP Cantareira, para o Prof. José Barbosa e para os funcionários do laboratório de Patologia UNIP Paulo e Jocely.
Agradeço a Maria Isabel de Almeida Prado do Laboratório Boiron e ao Instituto Butantan pelo apoio financeiro e intelectual para realização deste mestrado.
Agradeço aos meus colegas de Pós-graduação, Veranice, Heloisa, Maria Carolina, Adriano e Renato, por tantos momentos juntos e por tantos auxílios recebidos. Hoje além de colegas sei que tenho em vocês grandes amigos.
Agradeço a todos do Laboratório de Imunologia da UNIFESP-EPM, em especial a Ricardo Russo, co-autor deste trabalho, pelo seu acompanhamento, por sua dedicação, pela sua disponibilidade, pelo compartilhamento dos seus conhecimentos. Deixo aqui um agradecimento muito especial.
Agradeço a Graziela Morante, Bruna dos Anjos e César Sato, pela amizade e presença nos momentos difíceis e que, sem suas colaborações, essa tese jamais teria acabado.
As meus familiares que direta ou indiretamente contribuíram para esta conquista, em especial meu padrinho e madrinha Tio Marco e Tia Tata o meu “muito obrigado” por todo o apoio e confiança em mim creditados.
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RESUMO
ZALLA NETO, R. EFEITOS DA TIMULINA ULTRA-DILUÍDA NA RESPOSTA LINFÓIDE E EVOLUÇÃO GRANULOMATOSA INDUZIDA POR BCG Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária, área de concentração Imunopatologia Veterinária) – Instituto de Ciências e Saúde, Universidade Paulista 2007.
Este estudo tem como objetivo verificar os efeitos da Timulina - um hormônio
tímico - em preparações ultra-diluídas na resposta linfóide e granulomatosa de
camundongos inoculados com BCG, dadas as evidências já descritas na literatura
sobre o papel imunomodulador da mesma. Em um primeiro experimento, o BCG foi
inoculado no coxim plantar de camundongos Balb/c machos e adultos (30 µL
contendo 106 bactérias) e o desenvolvimento do granuloma foi observado macro e
microscopicamente após 8 dias. Em um segundo experimento, 30 µL de BCG (8 x
104 bactérias) foram inoculados no coxim plantar dos camundongos e após 14 e 21
dias os linfonodos regionais (poplíteos) foram retirados e a reatividade dos centros
germinativos foi analisada por histometria. No terceiro experimento, 50 µL de BCG
(1,3 x 105 bactérias) foram inoculados por via intra-traqueal para a avaliação do
desenvolvimento de granulomas pulmonares e da resposta linfóide local (linfonodo
mediastínico), também avaliada por histometria. Todo o procedimento experimental
foi realizado em cego. Os animais foram tratados com Timulina 5CH – grupo
experimental - ou com solução hidro-alcóolica (0,3 ppm) – grupo controle, por livre
acesso na água de bebida. Os resultados mostram que o tratamento com Timulina
5CH aumentou a celularidade do granuloma subcutâneo, mas não dos granulomas
peri-bronquiolares. Quanto à resposta linfóide medida por histometria, observou-se
expansão dos centros germinativos em camundongos tratados com Timulina 5CH
após 28 dias de inoculação de BCG no coxim plantar. Os resultados sugerem haver
atividade imunomoduladora da Timulina em preparações ultra-diluídas, considerando
o modelo experimental em questão.
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ABSTRACT ZALLA NETO, R. EFFECTS OF ULTRA-DILUTED THYMULIN IN THE BCG INDUCED LYMPHOID RESPONSE AND GRANULOMA DEVELOPMENT
The aim of this study is to know some aspects of lymphoid response and
granuloma development in mice inoculated with BCG and treated with Thymulin – a
thymus hormone – in high dilution preparations. In a first experiment, the BCG was
inoculated into the footpad of male and adult Balb/c mice (30 µl with 106 bacteria)
and the development of granuloma was observed macro and microscopically after 8
days. In a second experiment, 30 µL of a BCG suspension (7.8 x 104 bacteria) were
inoculated into the footpad and, after 14 and 28 days, the local lymph node was
harvested to analyze the reactivity of their germinative center, by histometry. In the
third experiment, 50 µL of BCG (1.3 x 105 bacteria) were inoculated by intra tracheal
way to evaluate both the development of pulmonary granuloma and the local lymph
node response. All experimental procedures were made in blind. Animals were
treated with Thymulin 5CH – experimental group – or with hydro-alcoholic solution
(0.3 ppm) – control group – by free access into the drink water. The results show that
the treatment with Thymulin 5CH increased the cellular turn-over of subcutaneous
granuloma, but not in lungs. Significant expansion of germinative centers of lymph
nodes was seen after 28 days from BCG footpad inoculation. The strongly suggest
an immunomodulatory effect of Thymulin 5CH, considering the experimental model
used.
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Lista de Figuras e Quadros
Figura 1. Linfonodo poplíteo (grupo experimental, 21 dias de inoculação) de
camundongo em que se observam os folículos linfóides, cujo eixo maior é
representado por B e seus respectivos centros germinativos, cujo eixo maior é
representado por A. HE, objetiva de 200X.
Figura 2. Variação da espessura da pata (mm) – durante oito dias – de
camundongos tratados com Timulina 5CH (tratado) ou veículo diluído na água
de bebida (controle). O tecido subcutâneo dos coxins plantares foi inoculado
com 30 µL de BCG contendo 106 bactérias. Teste “t” de Student, p=0,05.
Figura 3. Fotomicrografias de tecido subcutâneo plantar inoculado com 30 µL
de BCG contendo 106 bactérias, após oito dias de inoculação. A = tratado com
Timulina 5CH por via oral, em livre acesso na água de bebida; B= tratado com
o veículo nas mesmas condições. V = vênula, M = monócito, D = células
degeneradas, E = célula epitelióide. Coloração por Hematoxilina-eosina. HE,
objetiva de 10 X.
Figura 4. Variação da espessura da pata (mm) – durante vinte e um dias – de
camundongos tratados com Timulina 5CH (tratado) ou veículo diluído na água
de bebida (controle). O tecido subcutâneo dos coxins plantares foi inoculado
com 30 µL de BCG contendo 8 x 104 bactérias. * Mann Whitney, p=0,03.
Figura 5 – Tecido subcutâneo plantar de camundongos controle inoculados
com BCG (30 µL contendo 8 x 104 bactérias) há 21 dias. Notar ausência de
granuloma. HE, objetiva de 20x.
Figura 6 – Linfonodos políteos de camundongos tratados com Timulina 5CH
ou controle e inoculados ou não com BCG (30 µL contendo 8 x 104 bactérias)
há 21 dias no coxim plantar correspondente. A) animal tratado com Timulina
5CH e inoculado com BCG; B) animal tratado com Timulina 5CH– linfonodo
contralateral; C) animal controle e inoculado com BCG; D) animal controle –
linfonodo contralateral. HE, objetiva de 10 X.
12
Figura 7. Proporção (valores em porcentagem) entre os diâmetros do centro
germinativo e do folículo correspondente, obtida por análise histométrica. Os
linfonodos foram colhidos em dois tempos – 14 e 21 dias - após a inoculação
de 30 µL de BCG contendo 8 x 104 bactérias nos coxins plantares respectivos.
Os camundongos foram tratados com Timulina 5CH (tratado) ou veículo
diluído na água de bebida (controle). * Teste “t” de Student, p= 0,02.
Figura 8 - Centro germinativo de linfonodos popíteos de camundongos
controle (A) ou tratados com Timulina 5CH (B). Notar a presença de células em
apoptose em B. HE, objetiva de 20X.
Figura 9. Escores de intensidade de lesão granulomatosa peri-bronquiolar e
peri-vascular obtidos de método semi-quantitativo a partir de cortes histo-
patológicos corados com Hematoxilina-eosina. Os pulmões foram colhidos
após 40 dias da inoculação intra-traqueal de 50 µL de BCG contendo 1,3 x 105
bactérias. Os camundongos foram tratados com Timulina 5CH (tratado) ou
veículo diluído na água de bebida (controle). Os dados entre parênteses
representam os valores mínimo e máximo. Mann-Whitney.
Figura 10. Proporção (valores em porcentagem) entre os diâmetros do centro
germinativo e do folículo correspondente, obtida por análise histométrica. Os
linfonodos foram colhidos após 40 dias da inoculação intra-traqueal de 50 µL
de BCG contendo 1,3 x 105 bactérias. Os camundongos foram tratados com
Timulina 5CH (tratado) ou veículo diluído na água de bebida (controle). Teste
“t” de Student.
Quadro 1. Parâmetros visuais de granulomas peri-bronquiolares e peri-
vasculares utilizados para a atribuição de escores. HE, objetiva de 20X.
13
Lista de Abreviações
BCG Bacilo de Calmette-Guérin
CH Centesimal hahnemaneana
NaCl Cloreto de Sódio
ACTH Hormônio adenocorticotrófico
% Porcentagem
et al Colaboradores
Ltda Limitada
TNF-a Fator de Necrose Tumoral a
NGF Fator de crescimento neural
PGE 2 Prostaglandina E2
IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
mg Miligrama
g Grama
ppm Partes por milhão
µL Microlitros
AAF Acetil-amino-fluoreno
DNA Ácido Dexoxiribonucleico
L6J1 Linhagem de células mieloblastos permanentes de rato
LLC-PK1 Células epiteliais renais
HgCl2 Cloreto de Prata
CO2 Dióxido de carbono
14
Sumário (índice)
1. Introdução......................................15
2. Revisão de Literatura....................18
3. Objetivos.........................................25
4. Materiais e Métodos.......................26
5. Resultados......................................32
6. Discussão........................................41
7. Conclusão........................................44
8. Referências Bibliográficas.............45
9. Anexo...............................................53
15
1. INTRODUÇÃO
A utilização de medicamentos na forma homeopática vem se difundindo cada
vez mais ao redor do mundo devido a sua eficácia curativa, tendo em vista a
simplicidade de sua farmacotécnica e o custo irrelevante de suas matérias-primas e
insumos. Contudo, a abordagem científica da homeopatia permaneceu latente - ou
até mesmo negligenciada – durante muitos anos, talvez pelo fato de ser considerada
como método “não-científico”. O principal motivo para a não cientificidade do tema
diz respeito às diluições ultramoleculares utilizadas como “potências superiores a
12CH” (ou décima-segunda diluição centesimal Hahnemaneana), as quais
apresentam, de acordo com a lei de Avogadro, probabilidade infinitamente pequena
de conservar alguma molécula do soluto original (BONAMIN, 2001).
Tradicionalmente, as preparações homeopáticas baseiam-se na diluição
seriada centesimal, seguida de cem sucussões. Este método farmacotécnico foi
desenvolvido por Samuel Hahnemann no final do século XVIII e hoje é considerado
o método clássico preconizado pela Farmacopéia Homeopática Brasileira. Assim
sendo, a primeira diluição é chamada de 1 CH (CH = centesimal Hahnemaneana), a
segunda é chamada de 2 CH e assim por diante. Tais diluições recebem também o
nome de “potências homeopáticas”. A aplicação de tais preparações tem como base
o “princípio de similitude”, em que substâncias diluídas desta forma são utilizadas
para tratar doenças que produzam sintomas semelhantes àqueles provocados pela
própria substância (BRUNINI, 1993).
Da mesma forma, aplica-se o “princípio de isopatia”, ou igualdade, em que o
próprio agente causador de sintomas (em casos de intoxicação) é utilizado em
potências homeopáticas para inibir seus efeitos. Assim, os bioterápicos, ou
isoterápicos, representam um aspecto particular no contexto da medicina
homeopática. São preparações medicamentosas obtidas a partir do tratamento
farmacotécnico homeopático de produtos biológicos, quer sejam quimicamente
definidos ou não, por exemplo: secreções, excreções, tecidos e órgãos - patológicos
ou não - produtos de origem microbiana e alérgenos (DAY, 1987; SAXTON, 1991).
O bioterápico Timulina e seu papel na evolução da inflamação granulomatosa
consistem o objeto do presente estudo.
16
A Timulina é um hormônio tímico nonapeptídico produzido pelas células
epiteliais do timo e que se une ao zinco, o qual confere atividade biológica a esta
molécula. É bem estabelecido que o sistema imune é unido funcionalmente aos
sistemas nervoso e endócrino, e que todos constituem uma cadeia homeostática
integrada (GOYA et al., 2004). HADDEN (1998) e GOYA et al. (2004) mostram que
sua secreção pode ser regulada pela IL -1, prolactina, hidrocortisona, esteróides
sexuais e hormônios da tireóide e do crescimento (GH). Os hormônios da tireóide
estimulam secreção de Timulina por uma ação direta no tecido epitelial do timo.
Um dos primeiros estudos publicados sobre possíveis aplicações terapêuticas
da Timulina foi desenvolvido por KALLEN (1986), em que ratos tratados com
ciclofosfamida tiveram a função linfocitária T restabelecida após tratamento com
Timulina. Este trabalho, portanto, serve de base para o presente estudo,
considerando-se o uso de Timulina homeopática, conforme escrito por BASTIDE e
colaboradores (1987).
A escolha da inflamação granulomatosa como patologia a ser desafiada no
presente trabalho se deu pelo aumento significativo principalmente da tuberculose
nos últimos anos decorrentes de doenças que agem na depreciação do sistema
imune celular, como a AIDS.
A co-infecção tuberculose-HIV é um problema emergente em todos os
continentes. Em 1995 estimou-se que aproximadamente seis milhões de pessoas
estavam co-infectadas por tuberculose e pelo vírus HIV. Destes, 8% (450.000)
estavam na América Latina. No ano 2000 estima-se que 14% dos casos de
tuberculose no mundo foram atribuídos ao vírus HIV.
O impacto do aumento do número de casos de tuberculose devidos à infecção
pelo HIV foi primeiramente notado na década de 80, nos países africanos abaixo do
Saara. Também, após 1985 houve alteração da curva de declínio da tuberculose nos
EUA, com aumento dos casos de tuberculose, tendo como causa não só a
associação com infecção pelo HIV como também o aumento da imigração para os
EUA de habitantes de países com alta prevalência de tuberculose, assim como falta
de moradia e inadequação dos programas de controle clínico da tuberculose.
Estudos da prevalência da infecção pelo HIV nos EUA em pacientes com
tuberculose em 1991 mostraram média de 9,5% (0-46%), existindo tendência para
17
aumento da taxa de co-infecção que, em 1993-1994, foi de 14%. Na África abaixo do
Saara, em 1992, a prevalência variou de 20 a 67% (GARCIA, 2000).
No Brasil, a taxa de co-infecção tuberculose/HIV é estimada em 3 a 4%, com
amplas diferenças regionais, variando entre pacientes ambulatoriais e internados.
Em revisão de 1995, avaliando-se dados de 1987 a 1992, a taxa de pacientes com
tuberculose e infecção pelo HIV em regime ambulatorial variou de 0,5 a 12% e, em
regime hospitalar, de 1,9 a 20,7%, sendo a maior prevalência encontrada no Rio de
Janeiro. Em outra publicação de 1996, no Rio de Janeiro, a prevalência de infecção
pelo HIV em pacientes internados com tuberculose chegou a 42% (GARCIA, 2000).
A relevância em se estudar os efeitos da Timulina em preparações ultra-
diluídas nas respostas teciduais - inflamatória e linfóide local - frente à estimulação
por BCG (Bacilo Calmette-Guérin) está em delinear diferentes padrões de
comportamento tissular associados a seus efeitos terapêuticos.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
Pesquisa em homeopatia
Com mais de 200 anos, a medicina homeopática é indubitavelmente uma
terapêutica de sucesso. Criada no século XVIII por Samuel Hahnemann, na
Alemanha, a homeopatia é um sistema terapêutico baseado na “Lei dos
Semelhantes”, cujos medicamentos são preparados em doses infinitesimais. Este
sistema teria como hipótese mecanística a deflagração pelo próprio organismo de
uma reação secundária aos estímulos da enfermidade e do medicamento, o que
geraria a cura da enfermidade (DANTAS,1987).
A homeopatia, além de ser uma especialidade metodológica no ramo da
terapêutica médica, também propõe uma concepção médica peculiar, abordando de
forma integrada os binômios saúde-doença e doença-doente. Ela é uma terapêutica
médica da pessoa doente dentro do seu mundo, com enfoque para o aspecto
pessoal de suas reações mórbidas diante das agressões que sofre (COSTA, 1945).
A homeopatia está cada vez mais difundida no mundo, mesmo sendo sua
eficácia controversa. No Brasil, tal abordagem terapêutica é utilizada oficialmente
pelo sistema público de saúde e também tem sido utilizada de maneira crescente em
criações animais extensivas, cujos produtos alimentícios de origem animal têm
importância particular para a pecuária orgânica. Estes fatos mostram a necessidade
premente de se estabelecer métodos adequados de pesquisa nesta área.
Em 1988 surgiu na comunidade científica a maior polêmica sobre pesquisa
com substâncias infinitesimais (ultra-diluídas). Davenas e colaboradores publicaram
na revista Nature dados sobre a degranulação de basófilos in vitro induzida por
preparações UHD de anti-IgE. Mas este estudo, primeiramente desenvolvido pelo
grupo de Jacques Benveniste (DAVENAS et al., 1988), não pôde ser reproduzido
por outros grupos, em outros laboratórios (HIRST et al., 1994; WIEGANT, 1994).
Contudo, em trabalho anterior publicado no European Journal of Pharmacology,
Davenas e colaboradores (1987) mostraram que a “potência” 9CH de Silicea era
capaz de reduzir, de maneira estatisticamente significante (28 a 61%), a atividade de
macrófagos peritoneais de camundongos, o que não acontecia com os controles
9CH de NaCl e 9C de lactose.
19
Alguns anos mais tarde, BELON et al. (2004) e LORENZ et al. (2003)
demonstraram de forma indubitável os efeitos inibidores da histamina ultra-diluída
sobre a degranulação de basófilos in vitro. Observou-se, então, a necessidade de se
estabelecer modelos experimentais adequados para que o fenômeno pudesse ser
demonstrado de maneira reprodutível. Então, pergunta-se, por que o anti-IgE ultra-
diluído não produz efeitos consistentes tal como a histamina ultra-diluída o faz? A
análise destas particularidades experimentais tem sido objeto de estudo para a
construção de bases racionais sólidas nesta área do conhecimento (BASTIDE;
LAGACHE, 1997; BASTIDE, 2005; BONAMIN, 2005). Embora este sistema
terapêutico seja bastante antigo, ao longo dos últimos 200 anos todo o
embasamento teórico da homeopatia esteve ancorado em uma doutrina. A mudança
para uma racionalidade científica, portanto, é um fator crítico.
A despeito da polêmica deflagrada nos anos 80, vários estudos científicos
conduzidos com profundo rigor metodológico têm sido conduzidos por diversos
grupos científicos, em vários países, nos últimos 20 anos. Neste período, organizou-
se a primeira - e única - sociedade científica internacional sobre o tema: o GIRI –
Groupe International de Recherche sur l´Infinitésimal (www.giriweb.com).
Recentemente, o estudo das diluições acima do número de Avogadro em modelos
físicos e biológicos tem crescido drasticamente em diversas universidades pelo
mundo, com resultados surpreendentes (BONAMIN et al., 2001; BELON et al., 2004;
LORENZ et al., 2003; SAINTE-LAUDY; BELON, 2006).
Alguns estudos laboratoriais clássicos mostram dados que apontam para
possíveis modificações nas propriedades físico-químicas do solvente, de certa forma
determinadas pelo soluto altamente diluído (DEMANGEAT, 1994; ENDLER et al.,
1994; 1997; DEL GIUDICE, 1994; LOBYSHEV et al., 1999). Os grupos de Endler, na
Áustria, e de Del Giudice, na Itália, têm desenvolvido estudos que reforçam a idéia
da existência de um carreador eletromagnético como transdutor de informações
soluto-água-organismo (ENDLER et al.,1995; DEL GIUDICE & PREPARATA, 1998).
Vários estudos experimentais realizados in vitro sobre altas diluições e que
apresentam boa reprodutibilidade são, em geral, elaborados segundo o princípio de
isopatia, em que uma substância ultra-diluída modifica a resposta biológica
deflagrada pela mesma substância em doses ponderais (SAINTE LAUDY et al.,
1986; CHIRUMBOLO et al., 1993; DELBANCUT et al., 1997).
20
REBER et al. (1996) observaram que doses infinitamente pequenas (10-13 M)
de picrotoxina eram capazes de antagonizar os efeitos provocados por doses
maiores (10-3 M) do mesmo princípio ativo sobre o reflexo vestibulo-ocular em ratos.
A atividade bloqueadora dos efeitos citotóxicos e anti-inflamatórios da
dexametasona por preparações isoterápicas obtidas a partir da própria
dexametasona foi demonstrada por BONAMIN et al., 2001. YOUBICIER-SIMO et al.
(1993, 1996, 1997) observaram que o tratamento de embriões de galinha com altas
diluições de bursina – um peptídeo produzido pela bursa de Fabricius, fundamental
para a maturação dos linfócitos B nas aves - preparadas na concentração de 10-27
M, restaurava a resposta linfocitária B de frangos bursectomizados in ovo, bem como
os níveis plasmáticos de corticosterona e ACTH.
REILLY et al. (1994) desenvolveram um estudo com 24 pacientes humanos
apresentando processos alérgicos do trato respiratório, onde 12 receberam nosódios
(isoterápicos) na potência 30CH (Centesimal Hahnemaniana), preparados a partir da
substância alergena e 12 receberam placebo, constituído de glóbulos impregnados
pelo solvente submetido ao mesmo método de diluição utilizado para o alergeno. Os
pacientes submetidos ao tratamento com nosódio apresentaram melhora nos testes
de função respiratória, reatividade brônquica à histamina e estado clínico geral
(p=0,003).
Timulina
ABBAS, 2003 descreve que o timo é o principal sítio de amadurecimento das
células T. Esta hipótese foi originariamente sugerida em razão das deficiências
imunológicas que resultam da falta do timo. Se o timo de um camundongo neonatal
for removido, esse animal permanece deficiente em células T maduras por toda sua
vida.
O timo involui com o progredir da idade e é virtualmente indetectável no
homem pós-púbere, porém, algum amadurecimento das células T prossegue
durante toda a vida adulta, conforme é detectado pela reconstituição bem-sucedida
dos sistemas imune em adultos receptores de transplante de medula óssea. Pelo
fato de que as células T de memória têm uma vida longa (talvez superior a 20 anos
no homem) e se acumulam com a idade, a necessidade de gerar novas células T
decresce com a idade do indivíduo (ABBAS, 2003).
21
A Timulina foi descoberta em 1970, caracterizada por ser um nonapeptídeo
zinco-dependente produzido pelas células epiteliais do timo e de fundamental
importância para a maturação dos linfócitos T (BROWN, 2000; GOYA et al, 2004).
Sabe-se que as concentrações séricas de Timulina variam de acordo com a idade do
indivíduo, acompanhando a atrofia fisiológica do órgão. Assim, em seres humanos, a
Timulina já é detectável desde o nascimento, tem seu pico entre 05 e 10 anos de
idade, começa a decrescer na adolescência até a terceira década de vida e então,
se estabiliza até a senilidade (CONSOLINI et al., 2000).
Sabe-se, hoje, que o papel fisiológico da Timulina é muito mais abrangente,
envolvendo mecanismos endócrinos, além dos parácrinos já estabelecidos. A
maturação dos linfócitos T, por exemplo, pode ser feita tanto intra quanto extra-
tímica (INAGAKI-OHARA, 1996). A atividade de células NK, PMN e monócitos, bem
como a produção de citocinas, tais como: IL 1, NGF, IL 6, TNF e PGE2 são
moduladas pela Timulina (SAFIEH-GARABEDIAN, 2000; 2002; KANAAN, 2002;
MERLINO E MARSH, 2001; 2002; KOSAKA, 1996). O aumento da Timulina sérica
determina desvio da resposta imune para o padrão celular (via Th1), em detrimento
ao padrão humoral (via Th2). A falta de zinco, dessa forma, determina desvio para a
resposta humoral (SPRIETSMA, 1997).
SAFIEH-GARABEDIAN et al (2003) relatam que, além de seu papel
imunomodulador, a Timulina mostrou ser capaz de interagir direta e indiretamente
com o sistema nervoso. Considerando-se o eixo neuro-imuno-endócrino, a Timulina
exerce também um importante papel no início da puberdade, em várias espécies
animais, estimulando a secreção de gonadotrofinas (GARCIA et al., 2005; GARCIA
et al., 2000; BROWN, 2000; HINOJOSA et al., 1999). Outros hormônios hipofisários
são também modulados pela Timulina, como a prolactina, o ACTH e o LH (HADLEY
et al., 1997). Vários modelos de hiper-algesia foram estudados, mostrando que a
Timulina induz aumento de sensibilidade dolorosa (DARDENNE et al., 2006;
KANAAN, 2002; SAFIEH-GARABEDIAN, 1999; 2000).
O controle da secreção e a atividade da Timulina envolvem a participação de
fatores imunitários e extra-imunitários, tais como hormônios tiroideanos, hormônio do
crescimento, prolactina, melatonina, endorfina, hormônios sexuais, gonadotrofinas e
zinco (BARBOUR, 2001; MOLINERO, 2000; MOCCHEGIANI, 1999; BROWN, 1998;
1999; HEAD, 1999; FABRIS et al., 1997; FOLCH et al., 1991; SAVINO et al., 1990).
22
Do ponto de vista patológico, várias são as situações conhecidas como sendo
capazes de interferir na fisiologia deste hormônio. Por exemplo, indivíduos aidéticos
apresentam redução na concentração de Timulina circulante, independente da
população de linfócitos CD4+ presente no sangue (CONSOLINI et al., 2000b).
Pacientes com câncer também apresentam redução na concentração sérica de
Timulina (CONSOLINI, 1986; MOCCHEGIANI, 1990). A exposição crônica a baixas
concentrações de mercúrio induz aumento na produção de Timulina in vitro
(VALENTINO et al., 2001).
Um dos primeiros estudos publicados sobre possíveis aplicações terapêuticas
da Timulina foi desenvolvido por KALLEN (1986), em que ratos tratados com
ciclofosfamida tiveram a função linfocitária T restabelecida, após tratamento com
Timulina.
AONO et al. (1997) observaram que ratos portadores de artrite experimental e
tratados com Timulina apresentavam redução do edema e do tecido de granulação,
com facilitação da ossificação. HIRAI et al. (1995) produziram a recuperação da
resposta imune humoral e da resposta macrofágica em bovinos e leporídeos
submetidos a imuno-depressão viral. KOBAYASHI et al. (1992) obtiveram a proteção
da hemopoiese esplênica e medular de camundongos irradiados. OLIVER e MARSH
(2003), em estudos conduzidos em aves, mostraram que o tratamento com Timulina
in vivo aumenta a citotoxidade das células NK.
GUENNOUM et al. (1997) demonstraram que a administração de Timulina
ultra-diluída em camundongos hígidos induziu uma diminuição na sua performance
imunológica (o que foi denominado como mimese passiva), ao contrário do que
acontecia em camundongos imuno-deprimidos, os quais apresentavam um re-
equilíbrio da resposta imune (mimese ativa) (BASTIDE et al., 1987; DAURAT et al.,
1988).
O modelo experimental: granuloma
Segundo GUIDUGLI-NETO (1997), Granuloma pode ser definido
como: "Hiperplasia focal, avascular, do sistema mononuclear macrofágico, como
resposta a agentes agressores de baixa virulência". São compostos
fundamentalmente por macrófagos ou pela fusão destas células - as chamadas
células gigantes ou multinucleadas. Essas células estão com quantidade aumentada
(daí o conceito "hiperplasia", embora a rigor trata-se de infiltrado inflamatório) e
23
restritas a um mesmo local (“padrão focal"). Não existem vasos na estrutura do
granuloma, somente em sua periferia (daí o termo "avascular"). Linfócitos em grande
quantidade e granulócitos escassos também podem fazer parte de sua constituição.
Por fim, os agentes causadores de lesão granulomatosa são de baixa virulência, isto
é, possuem poucas propriedades de agressão ao tecido (por exemplo, produção de
toxinas), mas são de alta patogenicidade, ou seja, provocam ampla resposta no
tecido.
Na formação dos granulomas, inicialmente, há a migração de macrófagos na
tentativa de fagocitar o agente; essas células maturam e podem adquirir um padrão
semelhante a célula epitelial, passando a se chamar célula epitelóide; podem ainda
se fusionar, originando as células gigantes multinucleadas. Essas células ocupam,
inicialmente, a porção central do granuloma. Na periferia, são observados linfócitos
do tipo T, os quais caracterizam uma resposta de hipersensibilidade tardia; acredita-
se que modulem a resposta dos macrófagos. Também na periferia proliferam
fibroblastos e vasos sangüíneos, os primeiros para dar suporte à estrutura
granulomatosa e os segundos, para nutri-la. Com o passar do tempo sua porção
central pode sofrer necrose caseosa, devido à carência nutricional. Forma-se, então,
um centro necrótico (GUIDUGLI-NETO, 1997).
Existem classificações para os granulomas utilizando critérios anatômicos e
morfológicos, de etiologia (envolvendo a causa do processo) ou de patogenia
(envolvendo os mecanismos de origem). Podem ser difusos e focais, conforme se
distribuam pelos limites agredidos; simples e compostos, quando apresentam
apenas macrófagos ou macrófagos associados a células gigantes, respectivamente;
complexos (ou tuberculóides), quando se considera um padrão de granuloma
composto associado aos fenômenos de defesa imunitária do paciente; imunitários e
não-imunitários, em que se mede principalmente o padrão de manutenção da
estrutura granulomatosa a partir de elementos de defesa imune, como linfócitos;
supurativos ou não-supurativos, quando exibem pus associado (ou
piogranulomas), causado principalmente por bactérias piogênicas de baixa virulência
(GUIDUGLI-NETO, 1997). O padrão imunitário caracteriza as lesões locais induzidas
pela vacinação por BCG.
A vacina BCG tem por finalidade substituir a infecção natural, potencialmente
patogênica, por uma primo-infecção artificial e inofensiva, ocasionada por bacilo não
24
virulento, na esperança de que isto contribua para aumentar a resistência do
indivíduo em face de uma infecção ulterior pelo bacilo virulento.
No início do século XX, na tentativa de obter suspensões homogêneas (e não
grumosas) nas culturas de um bacilo tuberculoso bovino, muito virulento, isolado por
Nocard, no Instituto Pasteur de Paris, Albert Calmette obteve casualmente um
fenômeno de mutação, repicando as culturas em batata impregnada em bile de boi.
Guérin, que era seu auxiliar e fazia as repicagens, observou que após 231
passagens, as culturas ainda se mantinham grumosas, com o mesmo aspecto
morfológico e as mesmas propriedades físicas, apresentando, porém, atenuação
progressiva da virulência para os roedores de laboratório. Essa amostra de bacilos
foi batizada com o nome de BCG (bacilo de Calmette-Guérin) e utilizada com
sucesso na imunização ativa de bovinos, provocando ausência de virulência
(LETONTURIER, 1981).
Em 1921, a pedido de um médico francês que desejava proteger um recém-
nascido de mãe tuberculosa e que teria que conviver com a avó tuberculosa,
Calmette administrou por via oral a sua vacina BCG em três doses de 2 mg. Depois
deste, outros recém-nascidos receberam a mesma vacina durante três anos, mas só
em julho de 1942 Calmette se considerou autorizado a proferir, diante da Academia
Nacional de Medicina de Paris, a primeira comunicação oficial sobre o emprego da
BCG oral em recém-nascidos, como tentativa de imunização ativa contra a
tuberculose. A partir daí, o Instituto Pasteur passou a distribuir para os laboratórios
estrangeiros as culturas do BCG (RUFINO-NETTO; VILLA, 2000).
25
3. OBJETIVOS
Objetivo geral
O presente trabalho visa estudar os efeitos da Timulina em preparações ultra-
diluídas nas respostas granulomatosa e linfóide local induzidas por BCG (Bacilo
Calmette-Guérin).
Objetivos específicos
a) Estudar os efeitos da Timulina em preparações ultra-diluídas no
desenvolvimento de granulomas subcutâneo e pulmonar induzidos
por BCG
b) Estudar os efeitos da Timulina em preparações ultra-diluídas na
resposta linfóide local através de análise morfométrica dos linfonodos
regionais.
26
4. MATERIAL E MÉTODOS
Animais
Foram utilizados camundongos machos e adultos (25 a 35 g de peso) da
linhagem Balb/c, provenientes do biotério da UNIFESP e alojados no biotério da
UNIP em gaiolas convencionais (5 animais por gaiola) e submetidos a regime de
ciclo de luz controlado (12 h escuro / 12h claro, luz às 6:30h), com temperatura
fixada em 22 ± 3oC e alimentação ad libitum.
Timulina e procedimento “em cego”
A Timulina homeopática (matriz) foi obtida dos laboratórios Boiron (França),
na potência 4CH, preparada em solução hidro-alcoólica 30% a partir de fator tímico
sérico sintético, com grau de pureza de 98,66% (Anexo 1).
Uma alíquota de 20 mL desta matriz foi transferida para um frasco âmbar
previamente etiquetado (“Timulina”). Da mesma forma, uma alíquota de 20 mL de
solução hidro-alcoólica 30% foi transferida para um frasco âmbar similar, também
etiquetado previamente (“Controle”).
Em seguida, em sala fechada, um técnico do laboratório que NÃO participou
do projeto substituiu as etiquetas - uma a uma, para evitar trocas – por A e B. As
etiquetas originais foram coladas num formulário com os respectivos códigos (A e B),
o qual foi lacrado em envelope pardo que permaneceu em poder do técnico até o fim
dos experimentos. A revelação dos códigos só foi feita após a execução da análise
estatística.
A partir dos frascos A e B preparava-se a potência 5CH, sempre no momento
da administração aos animais. Esta última diluição seguia as normas estabelecidas
pela Farmacopéia Homeopática Brasileira – 2a Edição, sendo água destilada o
solvente utilizado.
Os tratamentos (A ou B) foram feitos via água de bebida, com livre acesso
dos animais durante todo o período experimental. Assim, 0,1 mL de cada preparação
5CH (A ou B) foi adicionada para cada litro de água de bebida. Desta forma, a
concentração final de álcool oferecida nunca foi maior que 0,3 ppm, para ambos os
27
grupos. A reposição da água (com a medicação adicionada) foi feita a cada sete
dias.
Grupos e etapas experimentais
Em todos os experimentos, os animais foram divididos em dois grupos:
Grupo Tratado – tratados com Timulina 5CH (frasco A, N= 5 a 10).
Grupo Controle – tratados com veículo (frasco B, N = 4 a 8).
Os ensaios foram divididos em três etapas:
EXPERIMENTO 1 – Avaliação do desenvolvimento do granuloma subcutâneo
induzido por BCG.
EXPERIMENTO 2 – Avaliação do edema inflamatório e da resposta linfóide
local induzidos por BCG inoculado no tecido subcutâneo.
EXPERIMENTO 3 – Avaliação do desenvolvimento de granulomas
pulmonares e da resposta linfóide local induzidos por BCG inoculado por via intra-
traqueal.
Inoculação de BCG e avaliação das respostas teciduais
O onco-BCG liofilizado fornecido pelo Instituto Butantan contém 2 x 106
bactérias viáveis (CFU) por mg de pó. Assim, cada frasco (40 mg) de onco-BCG
contém 8 x 107 bactérias viáveis. As diluições, portanto, foram feitas
proporcionalmente à quantidade de inoculo desejada para cada experimento,
sempre utilizando solução salina (NaCl 0,9%) estéril.
O BCG (bacilo Calmette-Guérin) foi inoculado nos camundongos por
diferentes vias, em diferentes concentrações, a fim de induzir diferentes padrões de
resposta. Este protocolo foi baseado na capacidade ou não de diferentes escalas de
CFUs em formar colônias bacterianas in vitro (Tomita et al., 2004).
No EXPERIMENTO 1, o BCG foi inoculado por via subcutânea no coxim
plantar esquerdo (30 µL contendo 106 bactérias viáveis), para a indução de
granuloma. Os animais foram sacrificados 8 dias após para colheita e
processamento histopatológico da lesão. Este tempo é suficiente para o
28
desenvolvimento satisfatório da lesão granulomatosa com todos os seus
componentes.
Antes da inoculação do BCG, a espessura inicial da pata a ser inoculada foi
medida com um micrômetro (Mitutoyo®) e, em seguida, medida diariamente para
avaliação do aumento da espessura da mesma, o que reflete o crescimento do
granuloma.
No EXPERIMENTO 2, o BCG foi inoculado por via subcutânea (30 µL
contendo 8 x 104 bactérias viáveis) no coxim plantar esquerdo, para a indução de
resposta linfóide local, observada pela reatividade do linfonodo poplíteo. Neste
experimento, o aumento de volume plantar foi medido diariamente nos primeiros 9
dias e em dias alternados até o dia do sacrifício. Os animais foram sacrificados após
14 ou 28 dias, tempos necessários para o desenvolvimento de resposta linfóide
adequada. Amostras das lesões foram encaminhadas para processamento
histopatológico.
No EXPERIMENTO 3, o BCG foi inoculado por via intra-traqueal (50 µL
contendo 1,3 x 105 bactérias viáveis), para a indução de granulomas pulmonares e
resposta linfóide local. Neste caso, o BCG foi inoculado no lúmen traqueal após
abertura da pele para exposição dos anéis cartilaginosos, na altura do no segundo
terço da traquéia. A injeção do conteúdo foi feita através de agulha e seringa
hipodérmica inserida entre dois anéis. Para este procedimento, os animais foram
anestesiados com uma associação Xilasina (Xilazin®), 15 mg/kg e Ketamina
(Vetaset ®), 150 mg/kg. O pulmão e o linfonodo mediastínico foram colhidos após 40
dias, quando os animais foram sacrificados. Este conjunto de órgãos foi, então,
encaminhado para processamento histopatológico.
Avaliação histopatológica
Todo o material colhido foi fixado em formol 10% e processado para posterior
exame histopatológico. Foram utilizados métodos convencionais de inclusão e
coloração por hematoxilina-eosina.
Nos dois primeiros experimentos as amostras de coxim plantar foram
avaliadas por método qualitativo-descritivo.
No experimento 3 a evolução granulomatosa foi analisada através de método
semi-quantitativo. Cortes histopatológicos de todos os lobos pulmonares foram
29
observados e a extensão das lesões granulomatosas peri-bronquiolares e peri-
vasculares foi avaliada através de um sistema de escores, variando de zero a
quatro. Face ao caráter subjetivo da avaliação, a mesma foi executada por dois
observadores independentes. O escore registrado para cada animal correspondeu,
então, ao escore médio. O quadro 1 mostra os parâmetros visuais utilizados para a
atribuição dos escores.
30
Quadro 1. Parâmetros visuais de granulomas peri-bronquiolares e peri-
vasculares utilizados para a atribuição de escores. HE, objetiva de 20X.
Ausência de granulomas Escore zero
Raros focos isolados Escore um
Vários focos isolados Escore dois
Focos evidentes e densos Escore três
Focos densos e
interligados
Escore quatro
31
Avaliação da resposta linfóide local (linfonodos poplíteo e
mediastínicos)
A análise microscópica dos linfonodos consistiu na mensuração da proporção
entre os diâmetros do centro-germinativo (A) e dos folículos linfóides (B), tomados
pelo eixo maior de ambas as estruturas (Figura 1). As medidas foram feitas com o
auxílio de uma ocular com retículo graduado de 1 a 100, com aumento de 10X. A
objetiva utilizada foi de 4 X (aumento to tal: 40 X). Os valores finais obtidos foram
expressos em porcentagem (P), de acordo com a fórmula:
P = A x 100 / B
Figura 1. Linfonodo poplíteo (grupo experimental, 21 dias de inoculação) de
camundongo em que se observam os folículos linfóides, cujo eixo maior é
representado por B e seus respectivos centros germinativos, cujo eixo maior é
representado por A. HE, objetiva de 200X.
A
B
32
Análise estatística:
Foram utilizados: Teste “t” de Student ou Mann-Whitney, de acordo com a
distribuição Gaussiana ou não das variáveis estudadas. O valor de p≤0,05 foi
considerado como sendo estatisticamente significativo.
Critérios de bioética
Os experimentos foram conduzidos de acordo com a Lei 6.638, de 08 de maio
de 1979, sobre “Normas para prática Didático-Científica da vivissecção de animais” e
com a Lei Estadual no 11.977/05 que institui o Código de Proteção aos Animais do
Estado de São Paulo.
O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UNIP (protocolo 07/05) em 06 de Dezembro de 2005 (anexo 2).
33
5. RESULTADOS
Experimento 1
Os animais tratados com Timulina 5CH apresentaram aumento significativo
(p=0,05) da espessura da pata inoculada com BCG (106 bactérias), do quinto ao
oitavo dias de avaliação (Figura 2).
A análise histopatológica descritiva revelou maior celularidade nos
granulomas de animais tratados com Timulina, sobretudo no que se refere aos
monócitos recém migrados, adensados por toda a área da lesão. As células
epitelióides presentes apresentavam distribuição esparsa (Figura 3A). Este aspecto
sugere um alto turn-over (renovação) celular no foco granulomatoso. Já os animais
controle apresentaram menor celularidade, com predomínio de células epitelióides,
estas mais adensadas. Ainda se observou maior incidência de focos de
degeneração celular. Estes aspectos, portanto, sugerem menor turn-over celular em
relação ao grupo tratado (Figura 3B).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 2 4 6 8 10
tempo / dias
vari
ação
da
espe
ssur
a da
pat
a /
mm
controle
tratado
**
*
* * teste "t" de Student, p=0,01 * teste "t" de Student, p=0,05
** ** *
Figura 2. Variação da espessura da pata (mm) – durante 8 dias – de
camundongos tratados com Timulina 5CH (tratado) ou veículo diluído na água
de bebida (controle). O tecido subcutâneo dos coxins plantares foi inoculado
com 30 µL de BCG contendo 106 bactérias.
34
A
B
Figura 3. Fotomicrografias de tecido subcutâneo plantar inoculado com 30 µL
de BCG contendo 106 bactérias, após 8 dias de inoculação. A = tratado com
Timulina 5CH por via oral, em livre acesso na água de bebida; B= tratado com
o veículo nas mesmas condições. M = monócito, D = células degeneradas, E =
célula epitelióide. Coloração por Hematoxilina-eosina. HE, objetiva de 10 X.
E
D
M
E
M
35
Experimento 2
Os animais tratados com Timulina 5CH apresentaram redução no aumento de
volume da pata em relação ao controle após a inoculação de BCG (104 bactérias
viáveis) no tecido subcutâneo. Esta redução foi mais evidente após 14 dias de
inoculação (p=0,03) (Figura 4). Clinicamente, durante este período, os animais do
grupo controle apresentaram maior sensibilidade dolorosa na pata inoculada –
facilmente perceptível durante a medição, a qual também apresentava hiperemia
evidente. Desta forma, a inoculação do BCG nesta concentração induziu processo
inflamatório agudo, que também foi modulado pelo tratamento com Timulina 5CH.
Aos 14 e 28 dias, fragmentos de tecido subcutâneo das patas inoculadas e
dos linfonodos poplíteos correspondentes foram colhidos para serem processados
histopatologicamente. O exame microscópico do tecido subcutâneo plantar revelou
ausência completa de lesão granulomatosa em todos os animais em ambos os
tempos (Figura 5), contudo, o aspecto microscópico dos linfonodos das patas
inoculadas diferiram significativamente dos linfonodos das patas contra-laterais não
inoculadas, em ambos os grupos e em ambos os tempos analisados. Assim, os
linfonodos correspondentes às patas inoculadas apresentaram-se reativos, com
evidências de maior atividade proliferativa dos centros germinativos, como a
presença de grande número de linfócitos blásticos (maior proporção núcleo-
citoplasma, cromatina frouxa, citoplasma amplo e claro, nucléolo evidente) e
expansão de seu diâmetro em relação ao diâmetro folicular (Figura 6). Quanto a este
último parâmetro, a análise histométrica revelou aumento estatisticamente
significante do centro germinativo nos animais tratados com Timulina 5CH, aos 28
dias de inoculação (p= 0,02) (Figura 7).
Alguns linfócitos presentes nos centros germinativos apresentaram morfologia
compatível com apoptose (redução do volume celular, fragmentação nuclear
homogênea e maior acidofilia citoplasmática), com maior evidência nos animais
tratados com Timulina 5CH, sobretudo aos 14 dias (Figura 8).
36
-0,6
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1 2 3 4 7 8 9 14 15 16 17 18 21
tempo / dias
vari
ação
da
espe
ssur
a da
pat
a /
mm
tratado
controle*
* Mann Whitney, p=0,03
*
* * * * * *
Figura 4. Variação da espessura da pata (mm) – durante 21 – de camundongos
tratados com Timulina 5CH (tratado) ou veículo diluído na água de bebida
(controle). O tecido subcutâneo dos coxins plantares foi inoculado com 30 µL
de BCG contendo 8 x 104 bactérias.
Figura 5 – Tecido subcutâneo plantar de camundongos controle inoculados
com BCG (30 µL contendo 8 x 104 bactérias) há 21 dias. Notar ausência de
granuloma e discreto edema subcutâneo. HE, objetiva de 20x.
37
A B
C D
Figura 6 – Linfonodos políteos de camundongos tratados com Timulina 5CH
ou controle e inoculados ou não com BCG (30 µL contendo 8 x 104 bactérias)
há 21 dias no coxim plantar correspondente. A) animal tratado com Timulina
5CH e inoculado com BCG; B) animal tratado com Timulina 5CH – linfonodo
contralateral; C) animal controle e inoculado com BCG; D) animal controle –
linfonodo contralateral. HE, objetiva de 10 X.
38
05
10
152025
30
3540
45
50
pro
po
rção
cen
tro
ger
min
ativ
o /
folíc
ulo
(%
)
14 dias 21 dias
tratado
controle
*
* p = 0,02, teste "t" de Student
Figura 7. Proporção (valores em porcentagem) entre os diâmetros do centro
germinativo e do folículo correspondente, obtida por análise histométrica. Os
linfonodos foram colhidos em dois tempos - 14 e 21 dias - após a inoculação
de 30 µL de BCG contendo 8 x 104 bactérias nos coxins plantares respectivos.
Os camundongos foram tratados com Timulina 5CH (tratado) ou veículo
diluído na água de bebida (controle). * Teste “t” de Student, p= 0,02.
39
A
B
Figura 8 - Centro germinativo de linfonodos popíteos de camundongos
controle (A) ou tratados com Timulina 5CH (B). Notar a presença de células em
apoptose em B. HE, objetiva de 20X.
40
Experimento 3
Os animais tratados com Timulina 5CH e inoculados com BCG (1,3 x 105
bactérias) por via intra-traqueal há 40 dias não apresentaram aumento
estatisticamente significativo dos escores de evolução granulomatosa peri-bronquilar
e peri-vascular em relação ao controle (Figura 9). Da mesma forma, a histometria do
linfonodo mediastínico não mostrou diferenças estatisticamente significativas entre
os grupos (Figura 10).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
esco
res
par
a le
sões
g
ran
ulo
mat
osa
s (m
edia
na)
tratado controle
(1,5 - 3,0)
(0,5 - 4,0)
Figura 9. Escores de intensidade de lesão granulomatosa peri-bronquiolar e
peri-vascular obtidos de método semi-quantitativo a partir de cortes histo-
patológicos corados com Hematoxilina-eosina. Os pulmões foram colhidos
após 40 dias da inoculação intra-traqueal de 50 µL de BCG contendo 1,3 x 105
bactérias. Os camundongos foram tratados com Timulina 5CH (tratado) ou
veículo diluído na água de bebida (controle). Os dados entre parênteses
representam os valores mínimo e máximo. Mann-Whitney.
41
0
10
20
30
40
50
pro
po
rção
cen
tro
ger
min
ativ
o /
folíc
ulo
(%)
tratado controle
Figura 10. Proporção (valores em porcentagem) entre os diâmetros do centro
germinativo e do folículo correspondente, obtida por análise histométrica. Os
linfonodos foram colhidos após 40 dias da inoculação intra-traqueal de 50 µL
de BCG contendo 1,3 x 105 bactérias. Os camundongos foram tratados com
Timulina 5CH (tratado) ou veículo diluído na água de bebida (controle). Teste
“t” de Student.
42
6. DISCUSSÃO
Lesões granulomatosas caracterizam-se pela não digestibilidade do agente
causal – resistência à fagocitose – e pela particular dinâmica de migração e
diferenciação celular, a qual organiza o tecido lesado no sentido de isolar o agente
agressor. Dentre os tipos celulares presentes num granuloma – sendo este o caso
do granuloma induzido por BCG – destacam-se as células epitelióides. Tais células,
embora de origem histiocitária, não mais apresentam atividade fagocítica; ao
contrário, apresentam marcada atividade secretora. Essas mudanças morfo-
funcionais estão condicionadas a uma combinação de estímulos químicos (sabe-se
que o TNFalfa tem especial importância no desenvolvimento das células epitelióides)
e também ao tempo de permanência dos histiócitos na lesão. Por este motivo, as
células epite lióides são consideradas “células velhas” (BRASILEIRO FILHO, 2004).
O influxo de monócitos para o sítio do granuloma, bem como sua atividade,
estão intimamente vinculados às interações destas células com os linfócitos
presentes. Assim, a atividade linfocitária local é fator crítico para a dinâmica celular
nas lesões granulomatosas, otimizando a migração e a atividade dos monócitos. Em
contra-partida, macrófagos e células dendríticas perpetuam o ciclo através da
apresentação de antígenos aos linfócitos T presentes (TSUCHIYA et al., 2002).
Sabe-se que inúmeros mediadores participam deste processo, em particular o INF
gama, o TNF alfa, a IL -12 e IL -18, os quais desempenham papel estimulador da
migração monocitária, bem como a IL-4, a IL -10 e o TGF beta, que participam de
maneira a inibir a inflamação (BRASILEIRO-FILHO, 2004; BOPST, et al., 2001;
SHARMA, S.; BOSE, M., 2001; SUGAWARA, 2000).
No presente estudo, a inoculação de BCG em concentrações ideais (106
bactérias) produziu um granuloma subcutâneo típico. Após 8 dias da inoculação, os
animais tratados com Timulina 5CH (aproximadamente 10-11 M) apresentaram
resposta granulomatosa exuberante, em que se observou grande concentração de
células jovens e células epitelióides (células “velhas”) menos adensadas, em
comparação ao grupo controle. Tal achado sugere fortemente um possível efeito
estimulante da Timulina 5CH sobre os linfócitos presentes na lesão, os quais seriam
os responsáveis por orquestrar o maior turn-over (renovação) celular observado.
Os efeitos estimulantes da Timulina sobre linfócitos circulantes são bem
conhecidos (SAVINO et al., 2003). Da mesma forma, a ação moduladora linfóide da
43
Timulina ultra-diluída foi descrita há duas décadas (BASTIDE, DOUCET-JABOEUF,
1983; DAURAT et al., 1988b). Assim, as alterações observadas neste modelo são
compatíveis com os dados obtidos da literatura.
No segundo experimento, com a inoculação de uma quantidade menor de
BCG no tecido subcutâneo da pata, nenhuma inflamação granulomatosa foi vista
após 14 e 21 dias. Contudo, sinais típicos de inflamação aguda foram observados no
coxim inoculado e sinais locais de resposta linfóide foram observados nos linfonodos
poplíteos das patas inoculadas. Assim, os linfonodos correspondentes às patas
inoculadas apresentaram-se reativos, com evidências de maior atividade proliferativa
dos centros germinativos, como a presença de grande número de linfócitos blásticos
(maior proporção núcleo-citoplasma, cromatina frouxa, citoplasma amplo e claro,
nucléolo evidente) e expansão do centro-germinativo em relação ao diâmetro
folicular (PARODI, 1989).
Estima-se que a menor densidade celular nesta preparação de BCG tenha
gerado maior quantidade de antígenos solúveis no inóculo, o que acarretaria a não
evolução do granuloma local bem como a deflagração da resposta linfo-proliferativa
no linfonodo regional. Este processo de estimulação linfóide regional também foi
potencializado pelo tratamento dos animais com Timulina 5CH, sobretudo após 21
dias. A expansão de centros germinativos corrobora a hipótese de estimulação
linfocitária, mas estudos futuros utilizando técnicas imuno-histo-químicas devem ser
feitos para melhor elucidação deste achado, em que será possível discriminar o tipo
celular predominante nos linfonodos estimulados. A ação da Timulina ultra-diluída
sobre a resposta imune humoral já havia sido descrita por Bastide e Doucet-Jaboeuf,
desde 1983.
Um achado curioso neste experimento foi a facilidade de visualização de
células em processo degenerativo no centro germinativo dos linfonodos
provenientes de animais tratados com Timulina 5CH por 14 dias. Tais células
apresentaram morfologia típica de apoptose, embora o diagnóstico definitivo também
dependa de ensaios imuno-histo-químicos. Nota-se que o período em que se
observa mais claramente tal degeneração coincide com a redução do volume da
pata, ou seja: com o término da fase aguda do processo inflamatório local. Uma
possível hipótese para explicar este achado seria a interação entre produtos
liberados pelos próprios bacilos e os linfócitos presentes nos linfonodos locais.
NORIMATSU et al. (1995) observaram que a exposição de linfócitos ao LPS induz
44
apoptose por mediação de TNF-alfa e hormônios corticosteróides. A possível
estimulação da produção destes ou outros mediadores sob a influência da Timulina
ultra-diluída, portanto, seria um mecanismo plausível.
Outra possibilidade explicativa para este achado seria o “efeito-rebote”
induzido pela hiper-estimulação linfocitária no centro germinativo de animais tratados
com Timulina 5CH. Sabe-se que o processo de apoptose pode ser considerado
como ocorrência normal durante várias fases do desenvolvimento e diferenciação
linfocitária (HESS et al., 1997; LEEMANS, 2005; MUSTAFA, 2006). Também se
deve considerar a provável apoptose linfocitária como sendo um processo local, uma
vez que no terceiro experimento, em que se fez a inoculação do BCG por via intra-
traqueal (105 bactérias), não foram observadas alterações quantitativas ou
qualitativas no perfil histopatológico do linfonodo mediastínico. Ainda neste último
caso, observou-se não mais que certa tendência de aumento na celularidade das
lesões granulomatosas peri-bronquiolares nos animais tratados com Timulina 5CH, à
semelhança do que fora observado no linfonodo poplíteo, mas sem significância
estatística.
Os resultados sugerem fortemente que a Timulina em preparações ultra-
diluídas exerce efeito imuno-modulatório, considerando o modelo experimental em
questão. Por este motivo, representa potencial recurso terapêutico de baixo custo
para processos patológicos associados a condições de imuno-deficiência.
45
7. CONCLUSÃO
Os dados tomados em conjunto permitem concluir que o tratamento de
camundongos com Timulina 5CH por livre acesso na água de bebida potencializa as
respostas linfóide e granulomatosa locais induzidas pela inoculação de BCG.
O modelo de granuloma subcutâneo permitiu melhor evidenciar tais efeitos,
contudo, os mecanismos e os mediadores envolvidos neste processo merecem
estudos futuros.
46
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXO 1
55
ANEXO 2
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