Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
FABIANA DA SILVA PAULA
Efeitos do extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L.
sobre funções efetoras de neutrófilos humanos ativados
Ribeirão Preto 2007
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
2
FABIANA DA SILVA PAULA
Efeitos do extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L. sobre funções
efetoras de neutrófilos humanos ativados
Dissertação apresentada ao programa de pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão preto, Universidade de São Paulo, para a obtenção do título de Mestre em Imunologia.
Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada Orientadora: Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim
Ribeirão Preto 2007
3
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Paula, Fabiana Silva Efeitos do extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L. sobre funções efetoras de neutrófilos humanos ativados – Ribeirão Preto, 2007. 128 f.: il.; 30cm
Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / USP – Área: Imunologia Básica e Aplicada. Orientadora: Lucisano-Valim, Yara Maria
1. Neutrófilos. 2. Tamarindus indica L. 3. Espécies reativas de oxigênio. 4. elastase
4
FOLHA DE APROVAÇÃO
Autora: Fabiana da Silva Paula Título: Efeitos do extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L. sobre funções efetoras de neutrófilos humanos ativados Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Área de concentração: Imunologia
Banca Examinadora Prof(a). Dr(a)______________________________________________________________
Instituição:____________________________Assinatura:___________________________
Prof(a). Dr(a)______________________________________________________________
Instituição:____________________________Assinatura:___________________________
Prof(a). Dr(a)______________________________________________________________
Instituição:____________________________Assinatura:___________________________
Aprovado pela Comissão Julgadora em: ____/____/____.
5
Dedico
Diante das dificuldades financeiras nacionais, do desequilíbrio de classes e do acesso restrito à educação superior, não podemos esquecer que trabalhos como este são realizados com o dinheiro
público. Este trabalho é dedicado à população deste país.
6
Agradecimentos
Certo dia uma pessoa me disse: “Algumas pessoas passam por nossas vidas, outras ficam...”
Aos meus pais Ildefonso e Algenira pela formação social e moral, além do imenso amor e do carinho oferecidos. Tão cedo tiveram que abrir mão de minha presença, em função de minha formação. Mesmo de longe, sempre estiveram muito presentes! À Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim, pelos ensinamentos e pela imensa paz transmitida. Obrigada por me fazer acreditar que é possível fazer ciência em um ambiente de paz, tranqüilidade e respeito mútuo. Aos voluntários, doadores de sangue, sem os quais este trabalho não seria realizado. À querida Ana Elisa Caleiro Seixas Azzolini, que é um grande exemplo de competência, dedicação, e paixão pelo que faz. À querida Prof. Dra. Cleni Mara Marzocchi Machado, pelos grandes ensinamentos, pela atenção oferecida e pelos vários momentos de descontração. Ao meu grupo de pesquisa Adriana, Alexandre, Andréa, Carolina, Daiani, Everton, Gustavo, Joel, Livia e Luciana, pela convivência agradável e pelas discussões produtivas, transmitindo e gerando conhecimento. À secretária do laboratório de bioquímica, Maria Regina de Pila Raphaloski, pela extrema competência e dedicação ao seu trabalho, além do companheirismo sincero. Aos pós-graduandos e estagiários do Laboratório de Bioquímica, pela convivência agradável e pelos momentos de descontração. Aos funcionários do laboratório de bioquímica Alcides Silva Pereira, Ana Cristina Morseli Pollizelo, Ieda Maria Razaboni Prado e Nadir Mazzucato. Pessoas fundamentais para o Laboratório de Bioquímica.
7
Aos professores do laboratório de bioquímica Prfa. Dra. Ana Isabel de Assis Pandochi, Prof. Dr. Augusto César Cropanese Sapadoro, Profa. Dra. Carem Gledes Vargas Recchia e Prof. Dr. Carlos Curti, pelo grande exemplo de professores e pesquisadores. Aos professores Dr. Carlos Alberto Oliveira e Dr. Marcelo Dias Baruffi, pelas contribuições oferecidas durante a discussão deste trabalho. Ao Prof. Dr. Sérgio Akira Uyemura e ao grupo que estuda o tamarindo, pelo fornecimento de material de trabalho, e pelas discussões produtivas. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo auxílio financiamento concedido para a realização deste trabalho. À Universidade de São Paulo, pelo oferecimento de um ensino “público”, gratuito e de qualidade. À Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto pela qualidade do ensino oferecido. Aos meus irmãos Frederico e Fernando pelo companheirismo e pelos cuidados. À minha linda sobrinha e afilhada Clara, que trouxe à nossa família ainda mais alegria, com sua doçura interminável. Ao meu amado e amigo Jomar, pelo companheirismo, pelo incentivo e pela compreensão em meus momentos de ausência. Além de tudo, tenho grande admiração por você e o tenho como um exemplo de cientista e entusiasta. Aos meus amigos de Ribeirão Preto Adriana, Andréa, Clarissa, João, Marcela, Marcos, Marília, Patrícia, Reinaldo, Rose e Tânia. Vocês me ensinaram que a vida é bem mais simples e divertida que eu imaginava. Às minhas amigas de Campina Verde, Christiane, Eliane, Francini, Karin, Kênia, Liliane e Paula, e de Uberlândia, Luciana e Renata que me fazem ter a certeza de que, independente de onde eu estiver, sempre terei um porto seguro. A todos que, mesmo não citados aqui, contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.
Obrigada!
8
Sumário
Lista de siglas e abreviaturas................................................................................................11
Resumo.................................................................................................................................15
Abstract.................................................................................................................................18
1. Introdução.........................................................................................................................21
1.1. O neutrófilo.....................................................................................................................22
1.1.1. Aspectos gerais............................................................................................................22
1.1.2. Ativação do neutrófilo e seu papel na resposta imune................................................23
1.1.3. Fagocitose...................................................................................................................28
1.1.4. Produção de espécies reativas de oxigênio (EROs)....................................................33
1.1.4.1. Quimioluminescência...............................................................................................36
1.1.5. Os grânulos e o processo de desgranulação................................................................38
1.1.5.1. Enzima elastase neutrofílica.....................................................................................39
1.1.6. Participação dos neutrófilos em doenças....................................................................41
1.2. Produtos naturais............................................................................................................42
1.3. Tamarindus indica L. ....................................................................................................44
2. Objetivos..........................................................................................................................48
3. Material e Métodos.........................................................................................................50
3.1. Soluções e reagentes empregados..................................................................................51
3.2. Preparo do extrato bruto hidroalcoólico da polpa do fruto de T. indica........................52
3.3. Preparo das frações do extrato.......................................................................................52
3.4. Padronização do extrato bruto e das frações..................................................................53
3.5. Material biológico..........................................................................................................55
3.6. Isolamento de neutrófilos (PMNs).................................................................................55
3.7. Obtenção do soro humano normal.................................................................................56
3.8. Preparo dos estímulos utilizados para ativar os neutrófilos..........................................57
3.8.1. Zimosan opsonizado (ZIops)......................................................................................57
3.8.2. Phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) e
Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin (fMLP)…………..………………………………57
3.9. Padronização das condições dos ensaios de quimioluminescência (QL)......................57
3.9.1. Padronização da concentração de fMLP....................................................................58
3.9.2. Padronização da concentração de PMA.....................................................................59
9
3.10. Avaliação dos efeitos do extrato bruto e das frações de T. indica sobre
o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados............................................................59
3.10.1. Amostras de extrato bruto e frações de T. indica......................................................60
3.10.2. Ensaio de quimioluminescência................................................................................60
3.11. Ensaios de desgranulação.............................................................................................63
3.11.1. Avaliação do efeito do extrato bruto de T. indica sobre a desgranulação
de neutrófilos ativados...........................................................................................................64
3.11.2. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a atividade da enzima elastase................65
3.11.3. Análise dos dados......................................................................................................66
3.12. Avaliação da citotoxicidade das amostras sobre os neutrófilos...................................67
3.13. Análise estatística.........................................................................................................68
4. Resultados........................................................................................................................69
4.1. Padronização da concentração de fMLP........................................................................70
4.2. Padronização da concentração de PMA.........................................................................71
4.3. Avaliação dos perfis de quimioluminescência obtidos por neutrófilos
ativados pelos diferentes estímulos.......................................................................................73
4.4. Efeitos do extrato bruto de T. indica sobre o metabolismo oxidativo
de neutrófilos ativados..........................................................................................................74
4.4.1. ZIops...........................................................................................................................75
4.4.2. PMA............................................................................................................................79
4.4.3. fMLP...........................................................................................................................81
4.5. Efeitos das frações do extrato T. indica sobre o metabolismo oxidativo
de neutrófilos ativados..........................................................................................................82
4.5.1. ZIops...........................................................................................................................82
4.5.2. PMA............................................................................................................................84
4.5.3. fMLP...........................................................................................................................85
4.6. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a desgranulação de neutrófilos
estimulados por fMLP ..........................................................................................................88
4.7. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a atividade catalítica da enzima
elastase..................................................................................................................................89
4.8. Avaliação da toxicidade do extrato bruto e das frações de T. indica
sobre os neutrófilos...............................................................................................................90
5. Discussão..........................................................................................................................93
5.1. Obtenção do extrato do fruto de T. indica L. e frações..................................................94
10
5.2. Avaliação dos perfis de quimioluminescência produzidos por neutrófilos
na presença dos diferentes estímulos....................................................................................94
5.3. Efeito do extrato bruto hidroalcoólico da polpa do fruto de T. indica e de
suas frações sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos ativados.................................100
5.4. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a desgranulação..........................................104
5.5. O fruto de T. indica como fonte natural com atividade
antioxidante..........................................................................................................................106
6. Conclusões......................................................................................................................108
7. Referências bibliográficas.............................................................................................111
8. Anexos.............................................................................................................................123
8.1. Anexo A - Metodologias Utilizadas para a caracterização do extrato..........................124
8.2. Anexo B - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa ....................................................126
8.2. ANEXO B – Termo de consentimento livre e esclarecido............................................127
11
Lista de siglas e abreviaturas
AA ácido araquidônico
Abs absorvância
�Abs variação na absorvância
AC área integrada do controle
AS área integrada da substância estudada
A1 Absorvância inicial
A2 Absorvância final
ANOVA análise da variância
Aq fração aquosa do extrato de Tamarindus indica L.
BPI proteínas que aumentam a permeabilidade bacteriana
But fração butanólica do extrato de Tamarindus indica L.
C3b, C3bi, C5a fragmentos de ativação do sistema complemento
CB citocalasina B
CD grupo de diferenciação
CFD diluente para fixação do complamento
CGD doença granulomatosa crônica
CI50 concentração da amostra que inibe 50% da atividade estudada
(quimioluminescência)
cpm fótons contados por minuto
CR1, CR3 receptores de complemento tipo 1 e 3
DAG diacilglicerol
DCM fração diclorometano do extrato de Tamarindus indica L.
DMSO dimetilsulfóxido
DP desvio padrão
EB extrato bruto hidroalcoólico da polpa do fruto de Tamarindus indica L.
EN elastase neutrofílica
EPM erro padrão da média
EROs espécies reativas de oxigênio
Fc fragmento cristalizável da molécula de imunoglobulina
FcγR receptor para a porção Fc de IgG
fMLP N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
12
FPR receptor de formilpeptídeo
GDP difosfato de guanosina
GM-CSF fator de estimulação de colônia de granulócitos/ macrófagos
Gp91phox glicoproteína de 91 kDa componente do complexo NADPH oxidase
GPI âncora de glicosil fosfatidil inositol
G-6-PD glicose-6-fosfato desidrogenase
GSH glutationa reduzida
GSH-PO glutationa peroxidase
GSH-RED glutationa redutase
GSSG glutationa oxidada
GTP trifosfato de guanosina
H fração hexano do extrato de Tamarindus indica L.
%I porcentagem de inibição da quimioluminescência
ICAM-1 molécula de adesão intracelular - 1
IFN-γ interferon gamma
Ig imunoglobulina
IgG imunoglobulina G
IL interleucina
IP3 inositol-1,4,5-trifosfato
ITAM motivo de ativação de imuno-receptor baseado em tirosina
LDH lactato desidrogenase
LPS lipopolissacarídeo
MPO mieloperoxidase
NADP+ nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida
P47phox, p67phox, comopnentes do complexo da NADPH oxidase p22phox (p= proteína; phox= “phagocyte oxidase”)
PA ácido fosfatídico
PAF fator de agregação plaquetária
PECAM-1 molécula de adesão endotélio-plaquetário tipo 1
pH potencial hidrogeniônico
PIP2 fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
PKC proteína quinase C
PLA2 Fosfolipase A2
13
PLC fosfolipase C
PLD fosfolipase D
PMA Forbol-12-miristato-13-acetato
pNA P-nitroanilina
PMN leucócito polimorfonuclear (neutrófilo)
PMP via da pentose monofosfato
p/v peso/volume
T. indica Tamarindus indica L.
QL quimioluminescência
QLlum quimioluminescência dependente de luminol
QLluc quimioluminescência dependente de lucigenina
%R porcentagem de resposta da QL em relação ao controle
RNA ácido ribonucléico
SAAVNA N-succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida
SLPI inibidor de protease secretória de leucócitos
SOD superóxido dismutase
TGF-β fator � de transformação e crescimento
TNF-� fator de necrose tumoral tipo �
v/v volume/volume
ZI zimosan A
ZIops zimosan opsonizado
Espécies reativas e íons inorgânicos
Cl- íon cloreto
Fe2+ íon ferroso
Fe3+ íon férrico
H+ íon hidrogênio
H2O água
H2O2 peróxido de hidrogênio
HO. Radical hidroxil
HOCl ácido hipocloroso
NO óxido nítrico
14
O2 oxigênio molecular
O2.- ânion superóxido
1O2 oxigênio singlete
OCl- íon hipoclorito
OH- íon hidróxido
ONOO- peroxinitrito
15
Resumo
16
PAULA, F.S. Efeitos do extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L. sobre funções
efetoras de neutrófilos humanos ativados. 2007. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão preto, 2007.
Os neutrófilos são componentes do sistema imune inato responsáveis pela primeira linha de
defesa contra patógenos invasores. Ao entrarem em contato com os microrganismos, estes são
fagocitados e degradados por mecanismos dependentes e independentes de oxigênio, os quais
correspondem aos processos denominados “burst” respiratório e desgranulação,
respectivamente. Durante “burst” respiratório ocorre a produção de Espécies Reativa de
Oxigênio (EROS) e na desgranulação são liberadas moléculas antimicrobianas, dentre as
quais estão proteases como a elastase. Embora os mecanismos efetores realizados pelos
neutrófilos tenham importância fundamental para a defesa do hospedeiro, em situações de
intensa ativação celular, grandes quantidades de moléculas citotóxicas podem ser produzidas
e liberadas no espaço extracelular, causando danos ao tecido. O acúmulo de EROs e enzimas
proteolíticas no tecido hospedeiro está relacionado com a etiologia de várias doenças
inflamatórias não infecciosas. Este fato tem levado a uma busca pelo entendimento dos
mecanismos de ativação do neutrófilo, bem como substâncias que modulem as funções
citotóxicas desta célula. Resultados promissores já foram obtidos em pesquisas com produtos
naturais, principalmente provenientes de plantas. Trabalhos recentes demonstraram que o
extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L. possui atividade antioxidante em sistemas
não celulares e diante disso, neste estudo foram analisados os efeitos do extrato bruto da polpa
do fruto de T. indica, bem como de suas frações, sobre a produção de EROs bem como sobre
a desgranulação e a atividade da enzima elastase. Para analisar os efeitos do T. indica sobre a
produção de EROs, foram realizados ensaios de quimioluminescência dependentes de luminol
(QLlum) e lucigenina (QLluc), utilizando como estímulos o zimosan opsonizado (ZIops), o
17
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) e o Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA). O
extrato bruto inibiu de forma dose dependente a produção de EROs por neutrófilos ativados
pelos três estímulos, sendo este efeito mais pronunciado ao utilizar o PMA como estímulo. As
frações hexano e diclorometano também inibiram, de forma dose dependente, a produção de
EROs induzida pelos três estímulos, sendo a hexano mais eficaz. Entretanto, as frações
aquosa e butanólica causaram fraca inibição, sem relação com a dose. O efeito do extrato
bruto de T. indica sobre um mecanismo efetor independente de oxigênio foi verificado
avaliando sua atividade sobre a liberação e a atividade da enzima elastase neutrofílica. Foi
constatado que o extrato inibiu significativamente, de forma dose dependente, tanto a
liberação quanto a atividade catalítica da enzima elastase. Utilizando os ensaios de exclusão
ao corante azul de Tripan e de determinação da atividade da enzima lactato desidrogenase,
verificou-se que o extrato bruto, bem como as frações aquosa, butanólica e dicloromentano
não possuem efeito citotóxico sobre os neutrófilos. Em concentrações elevadas, a fração
hexano foi citotóxica, entretanto, nas concentrações que causaram os CI50, este efeito não foi
verificado. Este trabalho mostra que o extrato da polpa do fruto de T. indica é capaz de
modular mecanismos efetores dos neutrófilos dependentes e independentes de oxigênio. Estes
resultados dão suporte para que sejam realizados estudos de purificação de principio ativo e
ensaios in vivo e clínicos para produção de fármacos a partir do fruto de T. indica.
Palavras-chave: neutrófilos, Tamarindus indica L., espécies reativas de oxigênio, elastase
neutrofílica.
18
Abstract
19
PAULA, F.S. The effect of Tamarindus indica L. pulp fruit extract on the effector
functions of activated human neutrophils. 2007. Master’s degree – Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão preto, 2007.
The neutrophils are key components of the inflammatory responses. On encountering
pathogens, neutrophils engulf these microbes into a phagossome and kill them by oxygen-
dependent and oxygen-independent mechanisms. These mechanisms are, respectively, the
reactive oxygen species (ROS) production by the respiratory burst and the degranulation,
which release antimicrobial molecules such as the neutrophil elastase. Despite their
importance under pathological circumstances, when the proinflammatory stimulus is
excessive, cytotoxic compounds may be released into the extracellular environment, where
they may be responsible for tissue injury during unregulated inflammation and involved in the
etiology of diverse human diseases. Studies have been done in order to find new substances
which may modulate the neutrophils functions and many results were obtained in researches
with natural products, mainly from plants. A recent study demonstrated that hidroalcoholic
fruit pulp extract of Tamarindus indica L. showed antioxidant activity in free-cell assay.
Therefore, in this work we analyzed the effect of hidroalcoholic fruit pulp extract of T. indica
on the ROS production and on elastase release from human neutrophil. The effect of T. indica
on the ROS production was analyzed using luminol- and lucigenin-enhanced
chemiluminescence and the cells were activated by three stimulus: opsonized zymosan (OZ),
N-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine (fMLP) and phorbol-12-myristate-13-acetate
(PMA). The crude extract and the hexane and diclorometane fractions inhibited in a dose-
dependent way the ROS production by neutrophils activated by the three stimulus. However,
the aqueous and butanolic fractions showed low effects on this function, independently of the
used stimuli. The effect of T. indica crude extract on an oxygen-independent effector
20
mechanism of neutrophil was also verified by analyzing its activity on the release and activity
of neutrophil elastase. The T. indica extract significantly inhibited, in a dose-dependent way,
the release and the catalytic activity of elastase enzyme. The studied crude extract and
aqueous, butanolic and diclorometane fractions of T. indica had no toxic effect on neutrophils,
as evaluated by lactate dehydrogenase release and Trypan blue exclusion assays, under the
assessed conditions. Hexane fraction was cytotoxic to neutrophils in high concentrations,
however, this effect was not observed at IC50 concentrations. This work shows that the T.
indica pulp fruit extract has substances capable to module oxygen-dependent and -
independent effector mechanisms of the neutrophils. These results give support to start studies
on purification of the active compounds and in vivo clinical assays which could be applied in
the production of new medicaments from T. indica fruit.
Key words: neutrophils, Tamarindus indica L., reactive oxygen species, neutrophil elastase.
21
1. Introdução
22
1.1. O neutrófilo
1.1.1. Aspectos gerais
O papel dos fagócitos na defesa do hospedeiro foi primeiramente relatado no século
XIX por Elie Metchnikoff o qual, ao inserir espinhos de roseira em larvas de estrela do mar,
observou que células se acumulavam no sítio da punção. Ele demonstrou que essas células
eram fagocíticas e descreveu as maiores como macrofagócitos ou macrófagos e as menores
como microfagócitos, conhecidas hoje como neutrófilos ou leucócitos polimorfonucleares
(PMNs) (BABIOR, 2000; SEGAL, 2005). Posteriormente, Paul Erlich, utilizando técnicas de
fixação e coloração, analisou as características morfológicas dos neutrófilos, diferenciando-os
dos demais tipos de células sanguíneas (ERLICH; LAZARUS, 1900 apud BORREGAARD;
COWLAND, 1997). O nome neutrófilo foi atribuído a este tipo celular por apresentar
tonalidade neutra nas colorações de Romanowsky, diferenciando-o dos eosinófilos, que
possuem grande avidez pela eosina e dos basófilos, que apresentam grandes grânulos em seu
citoplasma e coloração escura (BORREGAARD; COWLAND, 1997).
PMNs são células brancas do sangue terminalmente diferenciadas, incapazes de se
dividirem e sintetizam baixos níveis de RNA e proteínas. São gerados a partir de células-
tronco hematopoiéticas pluripotentes da medula óssea (MAYER-SCHOLL et al., 2004) e seus
estágios morfológicos de maturação incluem mieloblasto, promielócito, mielócito,
metamielócito, bastonetes e finalmente neutrófilos segmentados (ELGHETANY, 2002). Estão
presentes em abundância no sangue (em um adulto saudável são gerados, em média, 1011
neutrófilos por dia) (MOLLINEDO et al., 1999), onde possuem uma meia vida curta, de seis a
sete horas, caso não sejam recrutados para sítios de inflamação por quimiocinas e fatores
quimiotáticos específicos (ZYCHLINSKY et al., 2003).
Caracterizam-se por serem células altamente especializadas, cujas funções primárias
são a ingestão e a destruição de microrganismos invasores. Morfologicamente, são
23
distinguidos das outras células sanguíneas por possuírem um núcleo multi-lobulado e grânulos
em abundância no citoplasma (Figura 1), os quais contêm diferentes grupos de moléculas
citotóxicas, como proteases, responsáveis pela degradação do patógeno para a defesa do
hospedeiro (MAYER-SCHOLL et al., 2004; ZYCHLINSKY, 2003).
Figura 1. População de neutrófilos obtida a partir do método de gradiente de gelatina. Lâmina preparada por citocentrifugação. Coloração de Leishman (microscopia de luz com aumento de 100x). Fonte: arquivo pessoal.
1.1.2. Ativação do neutrófilo e seu papel na resposta imune.
Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do organismo, pois são os
primeiros componentes celulares do sistema imune inato que chegam aos sítios de inflamação,
onde se encontram os microrganismos invasores (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003;
BURG; PILLINGER, 2001). Estas células são essenciais para a resistência contra bactérias e
fungos, sendo que, neutropenia severa leva a infecção por uma diversidade de organismos
(SEGAL, 2005).
Os neutrófilos são recrutados para os sítios de infecção por sinais quimiotáticos de
quimiocinas, citocinas, metaloproteinases da matriz extracelular e produtos dos
microrganismos invasores (KOBAYASHI et al., 2003). Já foram identificados na superfície
dos PMNs mais de 50 tipos de receptores de quimiocinas e mais de 14 de citocinas
24
(MOLLINEDO et al., 1999). Proteases liberadas por células lesadas pelo patógeno invasor,
bem como por fagócitos ativados atuam sobre o componente 5 do complemento, liberando o
fragmento C5a, uma potente molécula quimiotática. Existem outros fatores quimiotáticos
liberados pelos fagócitos, como leucotrienos B4 e fator de agregação plaquetária (PAF). Nos
estágios mais tardios da resposta, quando linfócitos e mastócitos são recrutados, estas células
também passam a secretar fatores quimiotáticos. Finalmente, os próprios invasores se tornam
origem de atividade quimiotática ativando o complemento e, conseqüentemente, gerando mais
fragmentos C5a e liberando os lipídeos e peptídeos presentes em suas paredes celulares. A
migração do neutrófilo ocorre obedecendo a um gradiente quimioatraente em direção ao sítio
de invasão do patógeno. Ao receber o sinal, o neutrófilo deixa de circular ao acaso e segue na
direção deste gradiente (KLEIN, 1990).
O recrutamento dos neutrófilos é caracterizado por ser um processo composto por
diferentes estágios, que envolve a intervenção coordenada de várias moléculas de adesão
celular presentes nos neutrófilos e nas células endoteliais. Após receber os primeiros sinais
quimiotáticos, ocorrem interações transitórias entre moléculas de adesão das famílias das
selectinas, presentes no endotélio e no neutrófilo, que promovem o seu rolamento pela parede
do vaso sanguíneo adjacente ao sítio de inflamação. Em seguida, os PMNs se aderem
firmemente ao endotélio devido às fortes interações entre as integrinas (CD11b/CD18),
presentes nas membranas destas células e as moléculas de adesão intracelular - 1 (ICAM-1),
presentes nas células endoteliais. Após a firme adesão, o neutrófilo realiza um processo
denominado diapedese, no qual ele migra entre as células endoteliais para alcançar o sítio de
infecção extravascular. Esta transmigração é mediada por moléculas de adesão endotélio-
plaquetário do tipo 1 (PECAM-1), as quais pertencem à família das imunoglobulinas e são
encontradas nas membranas tanto dos neutrófilos, quanto das células endoteliais
(DALLEGRI; OTTONELLO, 1997; BURG; PILLINGER, 2001; LIU et al., 2004).
25
Ao encontrar o patógeno, o neutrófilo o engloba em um fagossoma, por meio de um
processo denominado fagocitose. Em seguida, ocorre a fusão do fagossoma com grânulos
citoplasmáticos, seguida pela desgranulação, formando o fagolisossoma. Dentro deste, o
microrganismo é degradado por peptídeos antimicrobianos e espécies reativas de oxigênio
(EROs) que compõem o arsenal microbicida independente e dependente de oxigênio,
respectivamente (MAYER-SCHOLL et al., 2004).
A exposição dos neutrófilos a estímulos, tais como agente promotor de tumores
Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), peptídeo quimiotático N-formil-metionil-leucil-
fenilalanina (fMLP), ácido araquidônico (AA), concanavalina A, ionóforos, complexos
imunes solúveis, e partículas antigênicas opsonizadas com anticorpos e componentes do
sistema complemento, faz com que suas funções efetoras sejam desencadeadas (BROWN,
1995). A estimulação celular ocorre via diferentes receptores de membrana, e a ativação de
cada tipo de receptor desencadeia uma via de sinalização intracelular distinta, ativando os
diferentes mecanismos efetores. Estas vias de sinalização são potenciais alvos terapêuticos
para a regulação da produção de moléculas citotóxicas liberadas pelos neutrófilos
(CATHCART, 2003).
O fMLP é um fator quimiotático, produzido por bactérias, que é capaz de ativar quase
todas as funções fisiológicas do neutrófilo (MARASCO et al., 1984). Seus efeitos são
desencadeados por meio da ligação aos receptores de formilpeptídeos (FPRs), que são
receptores clássicos acoplados a proteína G, caracterizados por possuírem sete segmentos
transmembrânicos hidrofóbicos (LIU et al., 2004). Dentre os efeitos promovidos pelo fMLP,
estão a indução do aumento de cálcio intracelular e da atividade da proteína quinase C (PKC)
(Figura 2), que estão diretamente relacionados com os mecanismos de desgranulação e de
produção de EROs (ANDERSSON et al., 1987). Estudos mostram o requerimento da ativação
26
de PKC, bem como de sua translocação do citoplasma para a membrana para iniciar a
produção de EROs pelo complexo NADPH oxidase (CATHCART, 2003).
Figura 2. Esquema simplificado de algumas vias de sinalização ativadas em neutrófilos estimulados por PMA, fMLP e ZIops, que culminam na produção de EROs. Adaptado de Caldefie-Chézet e colaboradores (2004) e Regier e colaboradores (2000). Abreviaturas: AA: ácido araquidônico; CR: receptor de complemento; DAG: diacilglicerol; EROs: espécies reativas de oxigênio; FcγR: receptor de imunoglobulina G; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; FPR: receptor de formilpeptídeo; G: proteína G; IP3: inositol-1,4,5-trifosfato; PA: ácido fosfatídico; PAPK: proteína quinase ativada por ácido fosfatídico; PKC: proteína quinase C; PLA2: fosfolipase A2; PLC: fosfolipase C; PLD: fosfolipase D; PIP2: fosfatidilinositol 4,5-bifosfato; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; ZIops: zimosan opsonizado.
O estímulo sintético PMA, ativa transdução de sinal nos neutrófilos sem a necessidade
de um receptor de membrana (THELEN et al., 1993). Por se tratar de um análogo do
diacilglicerol (DAG), ele ativa diretamente a proteína quinase C (Figura 2) (EDWARDS,
1996).
Alguns receptores presentes na membrana do neutrófilo, quando estimulados induzem,
além de outras funções efetoras, o desencadeamento da fagocitose. Estes incluem lectinas, que
reconhecem manose na parede celular de microrganismos e receptores para componentes
humorais, como imunoglobulinas e moléculas do sistema complemento, que são encontrados
PLC
PLA2
PKC(membrana) NADPH oxidase
FPR CR/ FcγγγγR
PIP2
IP3
� Ca2+
PMAfMLP
ZIops
DAG
PKC(citosol)
AA
Fosforilação de componentes
reunião doscomponentes
EROs
G
PLD
PA
PAPK
PLC
PLA2
PKC(membrana) NADPH oxidase
FPR CR/ FcγγγγR
PIP2
IP3
� Ca2+
PMAfMLP
ZIops
DAGDAG
PKC(citosol)
AA
Fosforilação de componentes
reunião doscomponentes
EROs
GG
PLD
PA
PAPK
27
nas membranas dos patógenos, recobrindo-os (opsonizando-os), aumentando a resposta dos
fagócitos contra estes (STAHL et al., 1998).
As imunoglobulinas da classe G (IgG) promovem uma ligação entre imunidade inata e
adaptativa, pois reconhecem seus ligantes em agentes infecciosos com especificidade
refinada, e são reconhecidos através de sua porção Fc (fragmento cristalizável) pela família de
receptores Fc (FcγR), presentes nas membranas dos neutrófilos (UNKELESS et al., 1995;
RAVETHC; CLYNES, 1998). Em neutrófilos humanos maduros existem dois tipos de
receptores Fcγ: FcγRIIa (CD32) e FcγRIIIb (CD16). O FcγRIIa apresenta domínios
extracelulares, transmembrana e citoplasmático, este último com uma seqüência de
aminoácidos responsável pela transdução de sinal intracelular, denominada motivo de
ativação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM: “Immunoreceptor Tyrosine-based
Activation Motif”) (LOFGREN et al., 1999). Este motivo possui resíduos de tirosina, que são
fosforilados por tirosinas quinase, iniciando uma cascata de eventos bioquímicos no
citoplasma envolvendo, principalmente, a fosforilação de proteínas quinase, como a PKC,
além da ativação de fosfolipases, que culminam na ativação de respostas biológicas da célula
(Figura 2) (GESSNER et al., 1998). O receptor FcγRIIIb, não apresenta domínios
transmembrana e citoplasmático, e sua expressão na membrana do neutrófilo é mediada por
uma molécula âncora de glicosil fosfatidil inositol (GPI). Embora este receptor não possua
seqüência de sinalização no citoplasma, sua co-expressão com outros receptores, como
FcγRIIa e receptor para complemento tipo 3 (CR3), tem papel importante na ativação dos
mecanismos efetores do neutrófilo, como fagocitose, desgranulação e “burst” respiratório
(produção de EROs) (HUNDT; SCHIMIDT, 1992; LOFGREN et al., 1999).
Os receptores CR reconhecem moléculas do sistema complemento e estão amplamente
presentes nas membranas dos neutrófilos. O receptor CR3 se associa à molécula C3bi e,
quando ativado, induz atividade da fosfolipase D (PLD), polimerização de actina e “burst”
28
respiratório (LOFGREN et al., 1999). A molécula C3b se liga ao receptor CR1, e não induz
sinalização isoladamente. Entretanto, a ativação simultânea de CR1 e receptores Fcγ induz
uma exacerbação dos efeitos promovidos por estes (SENGELOV, 1995).
1.1.3. Fagocitose
Alguns tipos celulares tais como neutrófilos, eosinófilos, monócitos e macrófagos são
considerados fagócitos profissionais, por terem como principal função a defesa do hospedeiro
através da ingestão e destruição de partículas ou patógenos invasores (KLEIN, 1990). A
principal diferença, quanto à capacidade fagocítica e eficiência, entre fagócitos profissionais e
não profissionais pode ser atribuída à presença de receptores fagocíticos, que facilitam o
alcance à partícula e aumentam a velocidade da fagocitose (INDIK, et al., 1995).
A fagocitose pode ser dividida em quatro etapas sucessivas: adesão entre o fagócito e
o microrganismo, ingestão, desgranulação e destruição do microrganismo ingerido.
Durante o recrutamento de neutrófilos para os sítios de inflamação, há também a
mobilização de proteínas antimicrobianas solúveis no fluido inflamatório (WEINRAUCH et
al., 1995). Estas proteínas incluem opsoninas, que podem aumentar a eficiência e a velocidade
da fagocitose, modificando a superfície microbiana ao depositarem ligantes complementares
aos receptores de superfície dos neutrófilos, promovendo o aumento da adesão das células ao
patógeno (KLEIN, 1990; LEY, 2002; ZYCHLINSKY, 2003). As principais opsoninas
conhecidas são moléculas de IgG, fragmento C3 do sistema complemento e carboidratos ou
lectinas ligantes de carboidratos (LEE et al., 2003). Os receptores de opsoninas interagem
independentemente com seus respectivos ligantes, porém a ativação é mais acentuada quando
eles agem de forma sinérgica.
Os fagócitos podem também ingerir microrganismos e partículas como zimosan,
asbestos, partículas de poliestireno ou látex na ausência de opsoninas, porém com menor
29
indução dos mecanismos efetores (KLEIN, 1990). O zimosan é um polissacarídeo isolado da
parede celular do fungo Saccharomyces cerevisiae que, após a opsonização com componentes
do sistema complemento e anticorpos naturais presentes no soro, mimetiza um microrganismo
opsonizado e desencadeia a fagocitose envolvendo receptores CR e FCγR de membrana
(KANASHIRO, 2004). A ativação promovida por este estímulo envolve a ativação de
fosfolipase A2 (PLA2), e conseqüente produção de ácido aracdônico e ativação de PLC e de
PLD (Figura 2) (CABANIS et al, 1996; CATHCART, 2003).
Após a adesão do neutrófilo ao microrganismo ou à partícula ocorre a fase de ingestão,
onde o neutrófilo projeta pseudópodos para englobá-los em um vacúolo fagocítico
denominado fagossoma (KORN; WEISMAN, 1967). Existem dois mecanismos propostos
para descrever o englobamento de partículas pelos fagócitos, o modelo do “zíper” e o modelo
do “gatilho”. De acordo com o modelo do “zíper”, o contato entre o fagócito e a partícula
promove projeções na membrana da célula (pseudópode), para formar um fagossomo
justaposto à partícula. O avanço deste pseudópode ao redor da partícula requer a
polimerização de receptores na superfície celular, como o fechamento de um zíper, para que a
membrana plasmática, gradualmente, envolva e englobe a partícula. Neste processo existem
interações receptor-receptor e receptor-opsoninas presentes na superfície da partícula
(GRIFFIN; SILVERSTEIN, 1975 apud SWANSON; BAER, 1995). Entretanto, de acordo
com o modelo do “gatilho”, o qual foi criado como um modelo alternativo para explicar
alguns tipos de fagocitose não explicados pelo modelo anterior, a ligação inicial de uma
partícula à superfície celular é suficiente para a ingestão completa da partícula (GALÁN et
al., 1992; FRANCIS et al., 1993).
Após a internalização da partícula, os grânulos citoplasmáticos se fundem com o
fagossoma e liberam seus produtos dentro deste, formando o fagolisossoma, em um processo
denominado desgranulação (KLEIN, 1990). Finalmente o microrganismo fagocitado é
30
degradado por meio de diferentes mecanismos microbicidas os quais podem ser dependentes
ou independentes de oxigênio (Figura 3) (FAURSCHOU; BORREGAARD, 2003). A
acidificação do fagossomo, devido ao acúmulo de ácido lático e íons hidrogênio (H+)
produzidos por glicólise durante o “burst” respiratório, facilita a destruição do antígeno,
criando um pH ideal para a ação das enzimas dos grânulos.
Figura 3. Mecanismos efetores realizados pelos neutrófilos para eliminar patógenos invasores: fagocitose, “burst oxidativo” (produção de espécies reativas de oxigênio) e desgranulação. Adaptado de Ross e colaboradores (2003). Abreviaturas: O2•
�: radical ânion superóxido; NADPH: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida; NADP+: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidada.
1.1.4. Produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)
Após sofrerem estímulos ambientais ou durante o processo de fagocitose, os PMNs
realizam o “burst” respiratório. Este processo desencadeia a produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs), as quais são moléculas altamente reativas por possuírem um par de elétrons
não pareado na última camada, o que as confere a capacidade de degradar o microrganismo
fagocitado (ZYCHLINSKY et al., 2003).
O “burst” oxidativo dos fagócitos foi descoberto em 1933 por Baldridge e Gerard que
observaram que havia uma rápida “explosão” do consumo de oxigênio durante a fagocitose de
bactérias. Inicialmente, este aumento no consumo de O2 foi atribuído a um aumento na
fosforilação oxidativa pela mitocôndria, para suprir a energia adicional requerida para a
O2.-
O2
NADPHNADP+ + H+
Desgranulação
Formação do
fagossoma(Ingestão)
Adesão
O2.-
Fagolisossoma
Fagossoma
O2.-
O2.-
NADPHoxidaseGrânulos citoplasmáticos
“Burst” oxidativo
O2.-
O2
NADPHNADP+ + H+
Desgranulação
Formação do
fagossoma(Ingestão)
Adesão
O2.-
Fagolisossoma
Fagossoma
O2.-
O2.-
NADPHoxidaseGrânulos citoplasmáticos
“Burst” oxidativo
O2.-
O2
NADPHNADP+ + H+
Desgranulação
Formação do
fagossoma(Ingestão)
Adesão
O2.-
Fagolisossoma
Fagossoma
O2.-
O2.-
NADPHoxidaseGrânulos citoplasmáticos
O2.-
O2
NADPHNADP+ + H+
O2.-
O2
NADPHNADP+ + H+
Desgranulação
Formação do
fagossoma(Ingestão)
Adesão
O2.-O2.-
Fagolisossoma
Fagossoma
O2.-O2.-
O2.-O2.-
NADPHoxidaseGrânulos citoplasmáticos
“Burst” oxidativo
31
ingestão do microrganismo (BALDRIDGE; GERARD, 1933 apud BABIOR, 2000). Somente
em 1959, foi verificado que não se tratava de produção de energia, pois não era afetado por
inibidores da respiração mitocondrial. Observaram que havia um aumento no “shunt” das
pentoses e conseqüente produção de NADPH, e em 1960 descobriu-se que o H2O2 era um
produto deste processo (BABIOR, 2000; SEGAL, 2005). Estudos com pacientes com doença
granulomatosa crônica (CGD) ajudaram a descobrir a existência de uma relação entre o
“burst” respiratório e a morte de patógenos. Holmes e colaboradores (1967) verificaram que
pacientes com CGD, os quais tinham alta susceptibilidade a infecções causadas por certos
tipos de bactérias e fungos, possuíam neutrófilos capazes de fagocitar, porém não de matar os
microrganismos, e que esses neutrófilos não geravam “burst” respiratório durante a
fagocitose. Em 1973, Babior e colaboradores descobriram que o produto primário do burst
oxidativo era o radical ânion supreóxido (O2•�). Pelo fato da oxidase responsável pela
formação deste radical utilizar preferencialmente NADPH como fonte de elétrons para
redução do O2, ela foi denominada NADPH-oxidase (EDWARDS, 1996). Atualmente, sabe-
se que pacientes com CGD não são capazes de realizar o “burst” respiratório devido a defeitos
no complexo NADPH-oxidase. A susceptibilidade a alguns tipos de infecções sofrida por
esses pacientes é, dentre várias outras, uma validação da importância da produção de EROs
para a eliminação de patógenos pelos neutrófilos (MAYER-SCHOLL et al., 2004).
O burst respiratório é iniciado pelo sistema NADPH oxidase, que é um complexo
enzimático presente tanto na membrana plasmática quanto na membrana dos grânulos e é
composto por duas proteínas de membrana, gp91phox e p22phox, que coexistem em um
heterodímero denominado flavocitocromo b558 e pelas proteínas citosólicas p67phox, p47phox e
p40phox que parecem estar parcialmente pré-reunidas, além da molécula rac. Em fagócitos em
repouso, este complexo enzimático encontra-se desativado e os componentes de membrana e
citosólicos permanecem dissociados. Seguindo a uma perturbação da membrana plasmática
32
durante a fagocitose ou a interação entre a superfície celular e uma variedade de agentes,
ocorre o deslocamento dos componentes citosólicos para a membrana, e a enzima NADPH-
oxidase adquire sua forma ativa, iniciando a produção de EROs (Figura 4) (KITAGAWA et
al., 2003; DE COURSEY; LIGETI, 2005).
Figura 4. Reunião e ativação do complexo NADPH oxidase após a estimulação do neutrófilo. Fonte: BURG e PILLINGER, 2001.
O papel do complexo NADPH oxidase é transportar elétrons do NADPH no sítio
citoplasmático para o oxigênio no fluido extracelular ou no espaço intrafagossômico, para
formar o radical ânion superóxido (O2•�) (reação 1).
(1) 2O2 + NADPH � 2 O2•� + NADP+ + H+
Posteriormente, o radical O2•� sofre uma reação de dismutação, catalisada pela enzima
superóxido dismutase (SOD), na presença de cobre e zinco, que leva à produção de peróxido
de hidrogênio (H2O2) (reação 2).
(2) 2 O2•�+ 2 H+ � O2 + H2O2
33
A formação de peróxido de hidrogênio a partir do radical ânion superóxido ocorre
espontaneamente, isto é, na ausência da enzima SOD, quando o O2•� está presente em altas
concentrações (BABIOR, 2000).
O peróxido de hidrogênio formado pode ser convertido em água e oxigênio, por ação
da enzima catalase presente no citoplasma (reação 3).
(3) 2H2O2 � 2H2O + O2
O H2O2 pode também oxidar a glutationa (GSH), formando água, por ação da enzima
glutationa oxidase (reação 4).
(4) H2O2 + 2GSH � 2H2O + GSSG
A forma reduzida da glutationa (GSH) é regenerada de sua forma oxidada (GSSG) por
ação da enzima glutationa redutase (reação 5).
(5) GSSG + 2NADPH � 2GSH + 2NADP+
Os NADP+ aqui gerados, juntamente com os formados durante a produção do O2•�
entram na via das pentoses monofosfato para regenerar NADPH.
Entretanto, na presença de moléculas específicas, o peróxido de hidrogênio pode dar
origem a outras moléculas altamente reativas (KLEBANOFF et al., 2005). Um importante
composto é o ácido hipocloroso (HOCl), que é formado pela ação da enzima mieloperoxidase
(MPO), na presença de íons Cl� (reação 6).
(6) H2O2 + Cl� + H+ � H2O + HOCl
A reação do peróxido de hidrogênio com íon Fe2+ forma outro composto altamente
reativo, o radical hidroxil (OH•) (reação 7).
(7) H2O2 + Fe2+ � OH• + OH� + Fe3+
34
O oxigênio singlet (1O2) é formado nos neutrófilos pela reação entre o peróxido de
hidrogênio e um halogênio oxidado (reação 8) e é um dos principais responsáveis pela morte
de microrganismos fagocitados (KANOFSKY et al., 1984).
(8) H2O2 + OCl� � 1O2 + Cl
A seqüência de reações do “burst” respiratório, bem como as enzimas envolvidas neste
processo, estão mostrados na Figura 4.
Figura 5. Representação simplificada das reações que ocorrem durante o metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Esquema adaptado de Klein (1990). Abreviaturas: CO2: dióxido de carbono; GSSG : glutationa oxidada; GSH-PO : glutationa peroxidase; GSH-RED: glutationa redutase; GSH: glutationa (reduzida); G-6-PD: glicose-6-fosfato desidrogenase; G-6-P: glicose-6-fosfato; HOCl : ácido hipocloroso; MPO: mieloperoxidase; NO: óxido nítrico; 1O2: oxigênio singlete; O2
•�: ânion
superóxido; ONOO-: peroxinitrito; OH•: radical hidroxil; PMP: via da pentose monofosfato; SOD: superóxido dismutase.
Os radicais livres, ao reagirem com moléculas que não possuem elétrons não pareados,
podem formar outros radicais secundários, que também podem ser reativos, formando outros
radicais, e assim por diante, gerando uma cadeia de reação de radicais livres. Isso gera uma
grande variedade de compostos reativos e, assim como as espécies primárias, esses são
MPOColagenase
Lisozimaetc.
SOD
H2O2Catalase
H2O + O2
GSSG-RED
NADPHNADPG-6-PD
PMPG-6-P Pentose + CO2
GSH-PO2GSH GSSG
H2O
FAGOSSOMO
O2.-
Rec.memb.
PMP
NADP+
NADPHOxidase
NADPHO2
MPOCl -
HOCl
Fe3+
H2O2SOD
OH.
ONOO-NO
Fe3+HO2
H+
OCl�
1O2MPO
ColagenaseLisozima
etc.
SOD
H2O2Catalase
H2O + O2
Catalase
H2O + O2
GSSG-RED
NADPHNADP
GSSG-RED
NADPHNADPG-6-PD
PMPG-6-P Pentose + CO2
G-6-PD
PMPG-6-P Pentose + CO2
PMPG-6-P Pentose + CO2
GSH-PO2GSH GSSG
H2O
FAGOSSOMO
O2.-
Rec.memb.
PMP
NADP+
NADPHOxidase
NADPHO2
O2.-
Rec.memb.
PMP
NADP+
NADPHOxidase
NADPHO2
PMP
NADP+
NADPHOxidase
NADPHO2
NADP+
NADPHOxidase
NADPHO2
MPOCl -
HOCl
Fe3+
H2O2SOD H2O2SOD
OH.
ONOO-NO ONOO-NO
Fe3+HO2
H+
OCl�
1O2
35
importantes para degradar o patógeno fagocitado, mas também podem reagir com moléculas
do hospedeiro (BABIOR, 2000), como será discutido em seguida.
Embora, teoricamente, as EROs possam aparecer acidentalmente em todos os tipos
celulares como conseqüência de radiação, lesão por reperfusão, metabolismo de agentes
farmacológicos, ou em quantidades substanciais, devido à liberação durante o transporte de
elétrons na mitocôndria, apenas fagócitos possuem uma maquinaria complexa para produzir
ativamente e excretar grande quantidade de compostos tóxicos (BABIOR, 1999; CLARK,
1990).
In vivo, a geração de EROs ocorre intracelularmente na membrana do fagossomo após
a ingestão do patógeno. EROs extracelulares são gerados em resposta a agonistas solúveis,
tais como peptídeos bacterianos formilados (por exemplo, fMLP) ou partículas do sistema
complemento (C5a) (CONDLIFFE et al., 2006).
A presença de EROs no espaço extracelular é controlada por moléculas antioxidantes
naturais, como forma de impedir que estes compostos reativos causem dano ao tecido
hospedeiro. Essas moléculas previnem a formação ou seqüestram os radicais livres,
interrompendo a cadeia de reações de propagação. Dentre os antioxidantes endógenos estão:
glutationa, nicotinamida adenina dinuceotídio fosfato (NADPH), coenzima Q (ubiquinona),
ácido úrico e certas enzimas como SOD, catalase e glutationa peroxidase. Proteínas ligantes
de metais como albumina, metalotineína, ceruloplasmina e transferrina também são
considerados antioxidantes. Entre os antioxidantes dietéticos estão tocoferol, ácido ascórbico,
carotenóides, compostos fenólicos e flavonóides (HALLIWELL et al., 1992; MEYDANI et
al., 1994).
36
1.1.4.1. Quimioluminescência
Em 1972, Allen e colaboradores demonstraram que os neutrófilos possuem a
capacidade de produzir quimioluminescência durante a fagocitose, o que posteriormente foi
associado ao “burst oxidativo”. Marcadores luminescentes (sondas) são utilizados para
aumentar a quantidade de luz emitida durante a produção de EROs. Estas sondas são
substâncias orgânicas que servem de substrato para reações redox, que geram intermediários
eletronicamente excitados que, retornando a um estágio basal emitem fótons, os quais podem
ser quantificados como quimioluminescência (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1986;
ALLEN; LOOSE, 1976; LI et al., 1999).
A quimioluminescência (QL) é amplamente utilizada como um método para
quantificar a capacidade dos neutrófilos de produzir EROs (KUDOH et al., 1999). Com o
auxílio de sondas é possível quantificá-las e diferenciá-las. A Lucigenina (QLluc) é uma
sonda que detecta principalmente o radical ânion superóxido, O2•�, liberado no meio
extracelular (ANIANSSON et al., 1984), e o Luminol (QLlum) detecta a somatória de
diversos metabólitos intracelulares produzidos da ação da mieloperoxidase (DAHLGREN;
STENDAHL, 1983) (Figura 6).
37
Figura 6. Representação simplificada do mecanismo proposto para descrever a origem e a regulação da quimioluminescência (QL), produzida por neutrófilos estimulados e das reações químicas envolvidas na produção de quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e lucigenina (QLluc). Adaptação dos mecanismos descritos por Cheung e colaboradores (1983).
Formação de O2-.,
H2O2, HOCl, 1O2
Ativação da NADPH Oxidase
HH22
C N N C
O
H H
O NH Luminol
Anion Aminoftalato ( eletronicamente excitado )
Foton
QLlum Anion Aminoftalato ( estado basal )
C
C
O
O
O-
*
N
O -
N2
N- metilacridona (eletronicamente excitado)
Foton
N C 3
O
* N
C
O
N- metilacridona (estado basal)
C 3
C 3
N
N
O O
Lucigenina dioxietano
O 2 .
Lucigenina
N CH3
N
+
+
CH3
QLluc
38
1.1.5. Os grânulos e o processo de desgranulação
Além dos mecanismos microbicidas dependentes de oxigênio, ou seja, o “burst”
oxidativo (ou ainda, metabolismo oxidativo), os neutrófilos são dotados de mecanismos
independentes de oxigênio, os quais são realizados pelos constituintes dos diferentes subtipos
de grânulos. A existência de diferentes mecanismos efetores confere aos neutrófilos uma
maior eficácia na eliminação de patógenos, permitindo que falhas em algum mecanismo
sejam recompensadas, pelo menos em parte, por outro. Isso pode ser comprovado pelo fato de
alguns pacientes com CGD permanecerem livres de infecções por vários anos (SEGAL,
2005).
O englobamento de microrganismos induz a formação do fagossomo, com
conseqüente fusão de grânulos, seguida pela liberação de substâncias microbicidas dentro do
mesmo, causando a morte do patógeno (Figura 3) (PHAM, 2006). Estas substâncias
microbicidas são, principalmente, proteínas antimicrobianas como a defensina e a lisozima,
que funcionam rompendo a superfície aniônica bacteriana e proteases, que degradam
proteínas bacterianas, inclusive fatores de virulência (MAYER-SCHOLL et al., 2004).
Os grânulos são gerados durante a maturação dos neutrófilos (MOLLINEDO et al.,
1999) e possuem várias fases de desenvolvimento, sendo que cada fase se caracteriza pela
produção de diferentes componentes microbicidas (BURG; PILLINGER, 2001). Os grânulos
dos neutrófilos podem ser classificados em: azurofílicos ou primários; específicos ou
secundários; terciários ou de gelatinase; e vesículas secretoras. A segregação dos constituintes
dos diferentes grânulos reflete quando eles são produzidos durante a maturação dos
neutrófilos e proteínas sintetizadas durante o mesmo período são co-localizadas. Esta divisão
é importante para evitar o risco de degradação dos constituintes do grânulo devido à mistura
de diferentes proteases ativas (PHAM, 2006).
39
Os grânulos azurófilos são produzidos primeiramente e contêm proteínas e peptídeos
responsáveis pela morte e digestão microbiana. Seus principais componentes são:
mieloperoxidase (MPO); proteinases como elastase neutofílica (EN), catepsina G e proteinase
3; proteínas que aumentam a permeabilidade bacteriana (BPI); defensina; e lisozima (GANZ,
2003; WEISS et al., 1975; GARWICZ et al., 2005). Os grânulos secundários possuem:
lactoferrina, que liga e seqüestra ferro e cobre; grandes quantidades de lisozima; e proteínas
presentes na membrana plasmática, incluindo flavocitocromo b558 do complexo NADPH-
oxidase (BULLEN; ARMSTRONG, 1979; SEGAL; JONES, 1979). Os grânulos terciários
armazenam grandes quantidades de gelatinase, e se diferenciam dos grânulos específicos por
não possuírem lactoferrina (HIBBS; BAINTON, 1989). Finalmente, as vesículas secretórias
são reservatórios de componentes de membrana como receptores de complemento
(SENGELOV et al., 1994), flavocitocromo b558, CD11b, CD14, CD16 e receptor de
formilpeptídeo (ZAGO et al., 2001; SEGAL, 2005).
1.1.5.1. Enzima elastase neutrofílica
A elastase neutrofílica (EN) é uma serino-protease, expressa por monócitos e
mastócitos, mas principalmente por neutrófilos, onde ela é armazenada nos grânulos
azurófilos. A sua síntese ocorre durante o estágio promielocítico de diferenciação do
neutrófilo na medula. A enzima ativa é estocada nos grânulos até ser exocitada dentro do
fagolisossomo ou para fora da célula, por secreção regulada em resposta a vários estímulos
(GARWICZ et al., 2005; CHUA; LAURENT, 2006; PHAM, 2006).
Fisiologicamente, a elastase está envolvida na degradação de materiais estranhos,
ingeridos durante a fagocitose e é considerada uma molécula efetora chave no sistema imune
inato, com potente atividade contra bactérias (BELAAOUAJ et al., 1998) e fungos
(TKALCEVIC et al., 2000). Porém, sob intensa ativação celular, esta enzima é rapidamente
40
liberada no espaço extracelular, onde pode também matar patógenos ali presentes
(BRINKMANN et al., 2004). A elastase secretada pode também degradar proteínas da matriz
extracelular local, remodelar tecido danificado, além de facilitar a migração do neutrófilo
através do tecido, durante a diapedese, em direção aos sítios de inflamação (DALLEGRI;
OTTONELLO, 1997).
Dentre os componentes da matriz extracelular que podem ser alvos de sua atividade
enzimática estão uma variedade de ligantes de superfície celular, proteínas solúveis e um
grande número de importantes moléculas de adesão. A EN é capaz de digerir praticamente
todos os tipos de proteínas da matriz, incluindo alguns tipos de colágeno, fibronectina,
proteoglicanas e fibras de elastina (CHUA; LAURENT, 2006; SCHORR et al., 2005). A
secreção de elastase também modula a expressão de citocinas na superfície endotelial e
epitelial, induzindo a produção de citocinas como interleucina-6 e -8 (IL-6 e IL-8), fator � de
transformação e crescimento (TGF-β) e fator de estimulação de colônia de
granulócitos/macrófagos (GM-CSF), enquanto promove a degradação de citocinas como
interleucina-1 e -2 (IL-1 e IL-2) e fator de necrose tumoral � (TNF�) (WIEDOW; MEYER-
HOFFERT, 2005; FITCH et al., 2006).
Neutrófilos de animais deficientes em enzima elastase demonstraram um maior
número de bactérias intactas dentro de seus fagossomas, quando comparados com neutrófilos
de animais selvagens. Além disso, Weinrauch e colaboradores (2002) demonstraram
recentemente, que esta enzima é capaz de clivar fatores de virulência de enterobactérias como
Salmonella enterica, Shigella flexneri e Yersinia enterocolitica.
A liberação da elastase pode ser desencadeada pela presença de diferentes estímulos
como citocinas, endotoxinas, fator de agregação plaquetária (PAF) e fMLP (SCHORR et al.,
2005). Entretanto, em condições fisiológicas, a presença de elastase no espaço extracelular é
controlada por inibidores endógenos, como �1-antiprotease, inibidor de protease secretória de
41
leucócitos (SLPI), �2-macroglobulina, e “eglin” (LEE; DOWNEY, 2001; SCHORR et al.,
2005).
1.1.6. Participação dos neutrófilos em doenças
A inflamação neutrofílica é uma resposta caracterizada pela infiltração de neutrófilos
no tecido inflamado (MALECH; GALLIN, 1987). A infecção do tecido por bactérias
extracelulares representa o protótipo dessa resposta inflamatória (BABIOR, 1984), porém,
várias doenças não infecciosas são caracterizadas pelo recrutamento extravascular de
neutrófilos (MALECH; GALLIN, 1987).
Embora a produção de EROs e a liberação da elastase sejam importantes para a
resposta imune inata, quando grandes quantidades são liberadas ocasiona a destruição de
tecidos saudáveis e contribui para o desenvolvimento de doenças como as inflamatórias
crônicas (artrite reumatóide, vasculite, glomérulo-nefrite, outras doenças auto-imunes),
cardiovasculares (aterosclerose, isquemia miocárdica, lesão induzida por reperfusão, alguns
tipos de alveolíte por complexo imune), neurodegenerativas (esclerose múltipla, mal de
Parkinson, Alzheimer), lesão hepática, doença pulmonária obstrutiva crônica e o câncer
(PAYÁ, 1993; HALLIWELL, 1994; FITCH et al., 2006; DALLEGRI; OTTONELLO, 1997).
Durante a fagocitose, processos citotóxicos são ativados e seus produtos liberados nos
fagolisossomos intracelulares, para eliminar o patógeno e, geralmente, há pouca ou nenhuma
liberação extracelular desses agentes. Entretanto, em contraste com esta produção intracelular
e moderada das moléculas tóxicas, em algumas condições, principalmente em situações de
intensa ativação celular, os neutrófilos podem liberar ativamente grandes quantidades de
EROs e os conteúdos dos grânulos no espaço extracelular (FOSSATI et al., 2007). Os
mecanismos efetores realizados pelos neutrófilos são caracterizados pela sua inespecificidade.
Por este motivo, não há uma distinção entre o que é próprio ou não próprio, e as moléculas
42
citotóxicas produzidas podem também reagir com componentes do tecido hospedeiro,
danificando-o (KOBAYASHI et al., 2003). As moléculas antioxidantes e inibidoras de
proteases endógenas têm a função de neutralizar as EROs e as proteases presentes no espaço
extracelular. Porém, em situação de intensa ativação, a liberação de grandes quantidades de
oxidantes e proteases pelos neutrófilos nos sítios de inflamação pode sobrepor a quantidade de
inibidores presentes, bem como inativar os mesmos (CABANIS et al., 1996; FUJIE et al.,
1999; SPLETTSTOESSER; SCHUFF-WERNER, 2002; SCHORR et al., 2005). Além disso,
existem alguns mecanismos que impedem a ação de inibidores de proteases, como por
exemplo, o neutrófilo cria um “espaço de proteção” entre ele e a superfície a qual ele está
aderido, impedindo que antiproteinases presentes no tecido tenham acesso à protease liberada
(CHUA; LAURENT, 2006; LEE; DOWNEY, 2001; PHAM, 2006).
Diante dos problemas causados pela produção e liberação excessiva de moléculas
citotóxicas pelos neutrófilos, existe uma busca contínua por reguladores das funções efetoras
desta célula, para que novos fármacos com atividades antinflamatória e antioxidante sejam
produzidos (CABANIS et al., 1996; BERGENDI et al., 1999; FOOK et al., 2005). Estudos
com produtos naturais têm demonstrado resultados satisfatórios, e muitas substâncias com
efeitos sobre o metabolismo oxidativo e sobre a liberação de elastase já foram identificadas.
Os efeitos dessas substâncias podem estar relacionados com vários mecanismos, como
seqüestro (“scavenger”) de radicais livres, inibição de proteases, além de modulação direta
sobre os neutrófilos, como por exemplo, de receptores para agonistas ou de vias de
sinalização intracelular.
1.2. Produtos naturais
Produtos naturais, especialmente provenientes de plantas, são tradicionalmente
utilizados para o tratamento de uma grande variedade de doenças, e possuem papel chave no
43
cuidado da saúde em todo o mundo. Apesar do grande desenvolvimento ocorrido nos
tratamentos da medicina moderna, o interesse público por terapias naturais aumentou
drasticamente nas últimas décadas em países industrializados e em desenvolvimento (DE
SMET, 1997; GRÜNWALD, 1995). Este interesse se deve ao baixo custo dessas terapias e,
principalmente, à menor freqüência de ocorrências de efeitos colaterais em decorrência do seu
uso, quando comparada com a utilização de drogas sintéticas. Outro fator que contribui para a
grande procura por produtos naturais é a atual mudança de hábito da população, a qual, cada
vez mais, tem procurado por medicina preventiva no lugar de curativa (CALIXTO, 2000).
Estudos epidemiológicos mostram que o aumento do consumo de frutas e hortaliças
está fortemente associado com redução do risco de desenvolvimento de doenças crônicas
como câncer e doenças cardiovasculares (STEINMETZ; POTTER, 1996). O efeito protetor
atribuído a essas plantas deve-se a uma variedade de produtos do metabolismo secundário
incluindo compostos fenólicos (polifenóis) e carotenóides (LIU, 2004; MANTLEY; BUSLIG,
1998; HAVSTEEN, 2002).
Os polifenóis constituem um grupo de compostos amplamente distribuído nas plantas,
que estão presentes em frutas, legumes, sementes, flores e folhas e fazem parte integral da
dieta humana. Os principais subgrupos de polifenóis são flavonóides, taninos, ácidos
fenólicos, cumarinas, entre outros (ROSS; KASUM, 2002). Uma variedade de propriedades
farmacológicas é atribuída aos flavonóides, como anti-inflamatória, antiviral,
antiespasmódica, antitumoral e antialérgica, que são associadas às suas atividades
antioxidante “scavenger” de EROs e ação inibitória de enzimas (MIDDLETON Jr. et al.,
2000).
Antioxidantes podem proteger lipoproteínas de baixa densidade da oxidação por
radicais livres e reduzir a formação de placa de aterosclerose. Outros mecanismos pelos quais
estes compostos podem proteger contra doenças cardiovasculares, são a redução da agregação
44
plaquetária (especialmente flavonóides e vitamina E) e a redução da pressão sanguínea
(especialmente vitamina C) (HIRVONEN et al., 2000).
1.3. Tamarindus indica LINN.
Tamarindus indica L. é uma espécie de dicotiledônea arbórea, pertencente à família
das leguminosas, originária das áreas secas e quentes da África (sul do Saara) e introduzida na
Ásia. Desta última região, foi trazida há séculos para o Brasil, onde se aclimatou muito bem,
podendo ser encontrada em vários estados brasileiros. Hoje é cultivada em todas as regiões
quentes do mundo. Em regiões propícias, de clima tropical ou subtropical, esta planta se
desenvolve bem, tornando-se uma árvore de grandes proporções. Possui folhas pinadas,
alternas, com vários pares de folíolos elípticos, oblongos e glabros. Apresenta inflorescência
em racemos no ápice dos ramos, com flores de coloração amarelo-esverdeada ou mais ou
menos branca, com dois veios avermelhados. Fornece frutos tipo vagem recurvada levemente
chata, com 9 a 15 centímetros de comprimento, contendo polpa pegajosa, mais ou menos
acídula, de cor avermelhada, que envolve várias sementes (ALZUGARAY; ALZUGARAY,
1984).
45
Figura 7: Fotografias de Tamarindus indica L. A – tamarindeiro, árvore de grande porte, com detalhe do fruto em vagem; B – Frutos de tamarindo descascados, com polpa carnosa característica; C – inflorescência em racemos; D – frutos. Fonte: www.antiguamuseums.org; mapage.noos.fr.
A B
C D
A B
C D
46
É uma planta muito utilizada tanto na alimentação, quanto na medicina popular,
havendo aproveitamento de quase todas as suas partes. A polpa do fruto contém açúcares,
ácidos orgânicos como cítrico, acético, tartárico e ascórbico (vitamina C), pectinas, vitaminas
e minerais. Folhas, flores e sementes são usadas extensivamente na culinária no sul da Índia e
é uma das fontes de alimento mais importante na Nigéria. Na medicina popular o fruto de
tamarindo é utilizado como digestivo, laxante, expectorante, tônico sanguíneo, para facilitar o
trabalho de parto e para aumentar a produção de leite materno. As sementes são utilizadas
como anti-helmíntica e antidiarréica (KOMUTARIN et al., 2004; LOCKETT et al., 2000). As
flores são indicadas para a assepsia da pele, bem como para inseticida (AL-FATIMI et al.,
2007). Há relatos de que T. indica é um bom antibacteriano, anti-inflamatório e antipirético,
além de possuir atividade anti-Burkholderia pseudomallei atribuída às folhas, a qual já foi
comprovada in vitro (MUTHU et al., 2005). A planta é também tradicionalmente usada para
tratamento de diabetes mellitus, e o extrato aquoso da semente atenuou a hiperglicemia e
hiperlipidemia em ratos diabéticos (MAITI et al., 2005).
O extrato da casca da semente, o qual é rico em flavonóides, demonstrou forte
atividade antioxidante, sendo esta comprovada por ensaios que demonstraram efeitos
protetores tanto em relação à peroxidação de lipídios in vitro, quanto em relação a outros
danos oxidativos promovidos por radicais livres, in vivo (TSUDA et al., 1994). Foi também
observada a inibição da produção de óxido nítrico por macrófagos estimulados por IFN-� e
LPS, na presença do extrato da semente de tamarindo (KOMUTARIN et al., 2004). Um
polissacarídeo proveniente da semente aumentou a fagocitose de fungos por neutrófilos de
indivíduos saudáveis, e por outro lado, inibiu a migração leucocitária e a divisão celular de
leucócitos de indivíduos portadores de leucemia linfoblástica aguda (SREELEKHA et al.,
1993). Outro trabalho verificou a presença de inibidores da elastase neutrofílica na semente
(FOOK et al., 2005).
47
Os extratos do fruto e da semente possuem também atividades antibacteriana e
antifúngica (LANHERS et al., 1996), e o extrato da semente apresenta ação estimulante sobre
linfócitos (EI TAHIR et al., 1998).
Ramos e colaboradores (2003), demonstraram que o extrato hidroalcoólico da casca do
caule possui atividade “scavenger” de radical hidroxil, bem como efeito inibitório sobre a
peroxidação de lipídeos.
As flores apresentaram atividade antimicrobiana sobre Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Micrococcus flavus, bem como
ação scavenger de radicais livres (AL-FATIMI et al., 2007).
Recentemente verificou-se que o extrato da polpa do fruto tamarindo possui ação
hipolipêmica em hamsters hipercolesterolêmicos, além de inibir a instalação de aterosclerose
nestes animais. Neste mesmo trabalho verificou-se ação antioxidante do tamarindo em
sistemas de enzimas (MARTINELLO et al., 2005). Librandi (2006) demonstrou que este
mesmo extrato é capaz de modular a atividade do sistema complemento em animais
hipercolesterolêmicos.
Assim como descrito acima, estudos comprovam a existência de várias atividades
biológicas promovidas por extratos provenientes de diferentes partes desta planta. Dentre
estes efeitos podemos destacar atividade antioxidante e inibidora de protease. Entretanto, não
existem pesquisas sobre os efeitos da polpa do fruto sobre o neutrófilo. Outros estudos
mostram que o extrato da polpa do fruto do tamarindo inibe a formação de ateroma, sendo
esta uma doença de caráter auto-imune e existem indícios de que os neutrófilos estão
envolvidos em sua instalação (CHANG et al., 1997). Considerando os efeitos de extratos de
T. indica sobre mecanismos efetores genuínos dos neutrófilo, os quais são causadores de
vários tipos de doenças, bem como sobre a aterogênese, este trabalho investigou os efeitos do
extrato da polpa do fruto desta espécie sobre funções efetoras de neutrófilos ativados.
48
2.Objetivos
49
No contexto bibliográfico anteriormente citado, o objetivo deste trabalho foi avaliar os
efeitos do extrato bruto da polpa do fruto de T. indica, bem como das frações deste extrato,
sobre dois mecanismos efetores realizados por neutrófilos ativados, o metabolismo oxidativo
e a desgranulação. Com o intuito de atingir este objetivo, foram utilizadas as seguintes
estratégias experimentais:
1. Avaliação do efeito do extrato bruto hidroalcoólico da polpa do fruto de T. indica
sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos ativados por fMLP, PMA e zimosan
opsonizado, utilizando-se os ensaios de quimioluminescência dependentes de luminol
(QLlum) e lucigenina (QLluc);
2. Análise dos efeitos de frações do extrato de T. indica sobre o metabolismo oxidativo
de neutrófilos ativados por fMLP, PMA e zimosan opsonizado, empregando-se a
técnica de QLlum;
3. Avaliação do efeito do extrato bruto de T. indica sobre a desgranulação de neutrófilos
ativados por fMLP, quantificando-se a liberação da enzima elastase neutrofílica, por
meio de análise espectrofotométrica;
4. Análise do efeito do extrato bruto de T. indica sobre a atividade catalítica da enzima
elastase neutrofílica, avaliado por análise espectrofotométrica;
5. Análise da toxicidade do extrato de tamarindo e de suas frações sobre neutrófilos
isolados, utilizando-se os ensaios de exclusão ao corante azul de Tripan e de
determinação da atividade da enzima lactato desidrogenase.
50
3. Material e Métodos
51
3.1. Soluções e reagentes empregados
a) Azul de Tripan – Carlo Elba Reagenti, cód: CI 23850.
b) Butanol - Merk, Schuchardt, Hohenbrunn, Germany, cod: 0344.
c) Citocalasina B (CB) – Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA, cód: C 6762.
d) Diclorometano – Quimex, F. Maia Ind. e Com. Ltda, Brasil, cód: QX 330 1000.
e) Dimetilsulfóxido (DMSO) – Merk, Schuchardt, Hohenbrunn, Germany, cód: 802912.
f) Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) – Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA, cód:
P8139.
g) Hexano - Merk, Schuchardt, Hohenbrunn, Germany, cód: 15832.
h) “Kit” para determinação da enzima lactato desidrogenase (LDH) Liquiform – Labtest
diagnostica, Lagoa Santa, MG, Brasil, cód: 86-2/30.
i) Líquido de Turk (violeta de genciana 1% em solução de ácido acético 1%).
j) Lucigenina (10,10`-dinitrato de dimetil-bis-acrinidina) – Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO., USA, cód: M-8010.
k) Luminol (5-amino-2,3-diidro-1,4-ftalazinodiona) – Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.,
USA, cód: A-8511.
l) Metanol - Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA, cód: 67-56-1.
m) N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) – Calbiochem, Merk, Schuchardt,
Hohenbrunn, Germany, cód: 05.22-2500.
n) N-succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida (SAAVNA) – Substrato para a enzima elastase –
Calbiochem, Merck-DGaA, Darmstadt, Germany, cód: 454454.
o) Solução de Alséver (Tampão citrato com azida sódica) pH 6,1.
p) Solução de cloreto de amônio (NH4Cl) 0,83%, pH 7,2.
q) Solução de gelatina (Difco, Becton, Dickinson and company sparks, France, cód: 214340)
2,5% em NaCl 0,15M.
52
r) Solução de Hanks, pH 7,2 (PAUL, 1970).
s) Solução salina (NaCl 0,15M).
t) Tampão CFD (Diluente para fixação de Complemento, contendo 0,1% de gelatina) pH7,2.
u) Triton X-100 - sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA, cód: T 9284
v) Zimosan A (Saccharomyces cerevisiae) – sigma Chemical Co., St. Louis, MO., USA, cód:
Z4250-1G.
3.2. Preparo do extrato bruto hidroalcoólico da polpa do fruto de T. indica
Os frutos foram obtidos no CEASA de Ribeirão Preto, descascados e submetidos à
maceração em álcool 70% (v/v), na proporção de 1:3 (p/v) e mantidos à temperatura
ambiente, recebendo agitação diária, por cinco dias. O macerado obtido foi filtrado em funil
de Büchner e em seguida, submetido à evaporação rotatória a 40oC por 4 horas para extração
do solvente. Partindo de 8kg de fruto, obteve-se 2,5kg de extrato, equivalendo a um
rendimento de 31,25%. Após a obtenção do extrato bruto (EB), este foi armazenado a -4°C e
solubilizado em solução de dimetilsulfóxido (DMSO) 25% (v/v) em água, para análise de
seus efeitos sobre algumas funções do neutrófilo.
3.3. Preparo das frações do extrato
As diferentes frações do extrato hidroalcoólico do fruto de T. indica foram obtidas
utilizando-se um processo de partição sucessiva líquido-líquido, com os solventes hexano,
diclorometano e butanol. O fracionamento foi procedido da seguinte forma: 125g do extrato
bruto concentrado foram solubilizados em uma solução metanol:água (7:3), v/v, e em seguida
filtrado em funil com papel filtro. A partição foi realizada com 400mL de hexano. Separou-se
a fração orgânica em hexano (H) e eliminou-se o solvente completamente em evaporador
rotatório a vácuo. Foram adicionados ao extrato metanólico restante 400mL de diclorometano.
53
A fração orgânica em diclorometano (DCM) foi separada e o solvente completamente
eliminado em evaporador rotatório a vácuo. O metanol do extrato metanólico restante foi
eliminado por rotaevaporação a vácuo. O extrato aquoso restante foi particionado com 400mL
de butanol por três vezes. A fração orgânica em butanol (But) foi separada e o solvente
eliminado em evaporador rotatório a vácuo. A fração aquosa (Aq) restante também foi
concentrada por rotaevaporação. Os rendimentos obtidos foram de 0,1g da fração hexano
(0,08%), 0,5g da fração diclorometano (0,4%), 20g da fração butanólica (16%) e 80g da
fração aquosa (64%). As frações obtidas foram estocadas a -20°C e solubilizadas em DMSO
25% (exceto fração hexano, a qual foi solubilizada em DMSO puro), para serem analisadas
quanto às suas atividades antioxidante e scavenger de radicais livres em ensaios de
quimioluminescência.
O processo de preparo e fracionamento do extrato encontra-se resumindo na Figura 8.
3.4. Padronização do extrato bruto e das frações
As análises das concentrações de açúcares totais, polifenóis e flavonóides presentes no
extrato bruto (EB) e nas frações hexano (H), diclorometano (DCM), butanólica (But) e aquosa
(Aq) foram realizadas por Martinello (2006), e os resultados estão mostrados na tabela 3.1. As
metodologias utilizadas para estas quantificações estão no Anexo A.
54
Figura 8. Procedimento de obtenção do extrato bruto de tamarindo (EB) e das frações hexano (H), diclorometano (DCM), butanólica (But) e aquosa (Aq).
Fruto descascado
Extrato bruto hidroalcoólico concentrado
H Extratometanólico
DCM Extrato metanólico
Extrato aquoso
But Aq
Maceração com álcool 70%Rotaevaporação
Suspensão em metanol: água
Extrato metanólico
Partição com hexano
Partição com diclorometano
Evaporação do metanol
Partição com butanol
Fruto descascado
Extrato bruto hidroalcoólico concentrado
H Extratometanólico
DCM Extrato metanólico
Extrato aquoso
But Aq
Maceração com álcool 70%Rotaevaporação
Suspensão em metanol: água
Extrato metanólico
Partição com hexano
Partição com diclorometano
Evaporação do metanol
Partição com butanol
55
Tabela 3.1. Composições do extrato bruto hidroalcoólico e das frações de T. indica.
Amostra Açúcares Totais(1)
(mg/mL)
Polifenóis(2)
(mg/mL)
Flavonóides(3)
(�g/mL)
EB 1.121,27 ± 24,28 24,90 ± 1,51 122,65 ± 6,69
H 63,18 ± 13,38 9,51 ± 1,57 35,89 ± 3,00
DCM 335,26 ± 18,39 11,45 ± 0,28 30,84 ± 4,64
But 963,38 ± 18,39 3,70 ± 0,12 43,38 ± 0,12
Aq 484,87 ± 13,80 2,61 ± 0,23 29,36 ± 1,24
p<0,05 But>Aq>DCM>H DCM=H>But=Aq But>H=DCM=Aq
Métodos utilizados: (1) DUBOIS et al., 1956; (2) FOLIN-CIOCALTEU, 1927 apud SINGLENTON; ROSSI, 1965; (3) DOWD, 1959. Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; EB: extrato bruto de tamarindo; H: fração hexano. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão de duas determinações realizadas em triplicata. Dados obtidos por Martinello (2006).
3.5. Material biológico
Neste estudo foi utilizado sangue humano colhido de voluntários saudáveis, seguindo
os procedimentos éticos, de acordo com a resolução 196/96 e aprovado pelo Comitê de Ética
em pesquisa com humanos da FCFRP-USP (Anexo B). Os voluntários foram conscientizados
dos objetivos do trabalho e assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo
C). O sangue humano foi utilizado para a obtenção dos neutrófilos e do soro humano normal.
3.6. Isolamento de neutrófilos (PMNs)
Os neutrófilos foram obtidos a partir de sangue humano total de voluntários sadios e
isolados de acordo com o método descrito por Henson (1971) e modificado por Lucisano &
Mantovani (1984). O sangue foi colhido por punção venosa, utilizando-se sistema a vácuo e
solução de Alséver pH 6,1 (v/v) como anticoagulante, e centrifugado a 755 x g por 10
minutos a 4°C. O plasma foi desprezado juntamente com a camada superior de células do
sedimento que é constituída principalmente de leucócitos mononucleares, e ao sedimento foi
56
adicionada uma solução de gelatina 2,5% (p/v) em solução salina (NaCl 0,15M), em
quantidade equivalente a duas vezes o volume de sedimento. Esta mistura foi então
homogeneizada e incubada por 30 minutos a 37°C. O sobrenadante, rico em PMNs, foi
transferido para outro tubo, diluído em solução de NaCl 0,15M, e centrifugado a 270 x g por
10 minutos a 4°C. Ao sedimento, adicionou-se solução de Cloreto de Amônio (NH4Cl)
(0,83%; pH 7,2), previamente aquecido a 37°C, para a lise das hemácias ainda presentes.
Após repouso de 5 minutos a 37°C, centrifugou-se novamente a 480 x g por 10 minutos a 4°C
e, em seguida, o sedimento foi suspenso em solução de NaCl 0,15M e novamente
centrifugado a 270 x g por 8 minutos a 4°C.
As células foram suspensas em 1,0 mL de solução de Hanks (pH 7,2) contendo 0,1%
de gelatina, e uma alíquota foi diluída 1:100 em líquido de Turk para contagem do número de
células em câmara de Neubauer. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de
exclusão ao corante Azul de Tripan, obtendo-se preparações de células com viabilidade de
aproximadamente 98% , contendo cerca de 95% de neutrófilos.
3.7. Obtenção do soro humano normal
O sangue foi colhido por punção venosa e sem anticoagulante de voluntários sadios.
Deixou-se em repouso à temperatura ambiente por uma hora, para retração do coágulo
formado e, posteriormente centrifugou-se a 480 x g por 10 minutos a 4°C. O soro obtido foi
reunido em um “pool”, fracionado e estocado a -70°C para ser utilizado na opsonização do
zimosan.
57
3.8. Preparo dos estímulos utilizados para ativar os neutrófilos
3.8.1. Zimosan opsonizado (ZIops)
O preparo do zimosan foi feito de acordo como o método descrito por Cheung e
colaboradores (1983). Uma suspensão de zimosan A (ZI), a 2mg/mL em solução NaCl 0,15M,
foi mantida em banho fervente por 30 minutos e, em seguida, centrifugada a 270 x g por 5
minutos a 4°C. O precipitado foi suspenso em solução de NaCl 0,15M e centrifugado sob as
mesmas condições anteriores. Em seguida, adicionou-se 0,1mL de soro humano normal
diluído 1:2 em diluente para fixação do complemento (tampão CFD) e incubou-se a 37°C por
30 minutos. A suspensão de zimosan opsonizado (ZIops) foi centrifugada a 480 x g por 5
minutos a 4°C e, em seguida, o sedimento foi lavado duas vezes com NaCl 0,15M,
centrifugando-o sob as mesmas condições anteriores. Por fim, a concentração da suspensão de
ZIops foi ajustada para 2mg/mL em solução de Hanks (pH 7,2) contendo 0,1% de gelatina.
3.8.2. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) e N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
(fMLP)
O PMA e o fMLP foram solubilizados em DMSO, na concentração 10-2M, estocados a
-70°C, e para o uso, estes foram diluídos em solução de Hanks pH 7,2, como descrito por
Pavelkova & Kubala (2004).
3.9. Padronização das condições dos ensaios de quimioluminescência (QL)
Neste estudo foram utilizadas as sondas luminol (5-amino-2,3-diidro-1,4-
ftalazinodiona) e lucigenina (10,10`-dinitrato de dimetil-bis-acrinidina), as quais geram,
respectivamente, quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) e
quimioluminescência dependente de lucigenina (QLluc). Em todos os experimentos de QL, as
sondas foram dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO).
58
As condições experimentais dos ensaios de quimioluminescência deste estudo foram
realizadas de acordo com metodologias previamente padronizadas em nosso laboratório, com
algumas modificações. Os parâmetros previamente estabelecidos foram: quantidade de
neutrófilos (1 x 106 células por tubo de reação); concentração de zimosan opsonizado
(1mg/mL); concentrações das sondas de QL [280�M (luminol) e 150�M (lucigenina)].
Neste estudo, foram realizadas as padronizações das concentrações dos estímulos
fMLP e PMA.
3.9.1. Padronização da concentração de fMLP
Para estabelecer a concentração de fMLP a ser utilizada nos ensaios de QL, obteve-se
uma curva da concentração de fMLP x QL produzida. Neutrófilos (1×106 células) foram
incubados com a sonda quimioluminescente [luminol (280�M) ou lucigenina (150�M)] em
banho-maria a 37°C, por 2 minutos. Posteriormente, adicionou-se fMLP em diferentes
concentrações (10-8, 10�7, 10-6 ou 10-5M), em um volume final de 1mL. Imediatamente,
acompanhou-se a produção de QL, expressa em contagem de fótons por minuto (cpm), em
luminômetro Auto Lumat LB 973, EG&G Berthold, durante 15 minutos a 37°C. Os valores
de QL foram expressos como área integrada de QL (área sob a curva do perfil registrado) de 0
a 15 minutos que representa a quantidade total de EROs produzida pelos PMNs durante este
intervalo de tempo (Figura 9). A partir dos valores de QL obtidos, fez-se a curva da
concentração de fMLP x QL. Como controle mediu-se a QL produzida espontaneamente por
1×106 neutrófilos apenas na presença de sonda quimioluminescente e solução de Hanks. A
concentração ideal de fMLP foi avaliada em três experimentos independentes realizados em
duplicata.
59
0 5 10 15 200.0×10 -00
2.5×10 06
5.0×10 06
7.5×10 06
Área integradade QL de 0 a 15 min
curva de QL produzida
tempo (min)
QL
(cpm
)
Figura 9. Representação da produção de QL por 1 x 106 neutrófilos ativados, durante 15 minutos, registrada em cpm. O valor da área integrada (área sob a curva) representa a quantidade total de EROs produzida durante este intervalo de tempo. Abreviaturas: QL: quimioluminescência; cpm: contagem de fótons por minuto.
3.9.2. Padronização da concentração de PMA
A concentração de PMA utilizada nos ensaios de QL também foi determinada a partir
da obtenção de uma curva concentração de PMA x QL produzida. Para isso, os PMNs (1×106
células) na presença da sonda quimioluminescente [luminol (280�M) ou lucigenina (150�M)]
foram incubados em banho-maria a 37°C, por 2 minutos. Em seguida, acrescentou-se PMA
em diferentes concentrações (10-8, 10-7, 10-6M) em um volume final de 1mL e, imediatamente,
a QLlum ou a QLluc foram medidas por 15 minutos em luminômetro. As demais condições
experimentais empregadas para este ensaio foram semelhantes às descritas no item 3.9.1. A
concentração ideal de PMA foi avaliada em dois experimentos independentes realizados em
duplicata.
3.10. Avaliação dos efeitos do extrato bruto e das frações de T. indica sobre o
metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados
Após padronizar as condições dos ensaios, foram avaliados os efeitos do extrato bruto
e das frações sobre a produção de QL por neutrófilos estimulados com ZIops, fMLP e PMA.
60
3.10.1. Amostras de extrato bruto e frações de T. indica
As amostras do extrato e das frações de T. indica avaliadas nos experimentos de
quimioluminescência, bem como as concentrações empregadas, estão descritas a seguir.
- Extrato bruto (EB) hidroalcoólico da polpa do fruto de T. indica em concentrações
finais que variaram entre 50 – 800�g/mL, quando o estímulo utilizado foi o ZIops e
entre 25 – 400�g/mL, quando o estímulo utilizado foi fMLP ou PMA;
- Fração hexano (H) do extrato hidroalcoólico de T. indica em concentrações finais que
variaram entre 5 – 200�g/mL, em ensaios que utilizaram os estímulos ZIops e PMA e
entre 1,25 e 50�g/mL, em ensaios que utilizaram o estímulos fMLP;
- Fração diclorometano (DCM) do extrato hidroalcoólico de T. indica em concentrações
finais que variaram entre 5 – 200�g/mL;
- Fração butanólica (But) do extrato hidroalcoólico de T. indica em concentrações finais
que variaram entre 5 – 200�g/mL;
- Fração aquosa (Aq) do extrato hidroalcoólico de T. indica em concentrações finais que
variaram entre 5 – 200�g/mL.
3.10.2. Ensaio de quimioluminescência
Neutrófilos (1 x 106 células) foram pré-incubados em banho-maria a 37°C, por 2
minutos, na presença das amostras de extrato bruto ou frações de T. indica em diferentes
concentrações, e das sondas quimioluminescentes luminol (280�M) ou lucigenina (150�M)*.
Em seguida, os tubos foram transportados para o luminômetro e a eles adicionados os
estímulos [ZIops (1mg/mL), ou fMLP (10-6M), ou PMA (10-7M)] e, imediatamente,
acompanhou-se a produção de QL, em cpm, durante 10 minutos (para o extrato bruto) ou 15
minutos (para as frações), a 37°C em luminômetro. Como controle positivo utilizou-se o
DMSO nas concentrações finais 0,25 ou 1,0%.
61
* As frações foram avaliadas somente em ensaios de QLlum.
Em todos os ensaios realizados mediu-se a produção espontânea de QLlum e QLluc
dos neutrófilos (1 x 106 células) na ausência de estímulo.
A partir das curvas de QL em função do tempo (Figura 10A) foram calculados os
valores de área integrada (área sob a curva) (10B). A atividade de cada amostra foi avaliada
em cinco diferentes concentrações. Os valores da área integrada foram utilizados para
determinar a porcentagem de inibição promovida pelas diferentes concentrações das amostras
analisadas, em relação aos respectivos controles (figura 10C), de acordo com a fórmula:
% I = 100 - [(AS/AC) × 100]
onde,
%I: porcentagem de inibição da QL promovida por cada concentração avaliada em relação ao
controle (DMSO);
AS: área integrada de QL de 0 a 10 minutos, de cada amostra estudada em cada concentração
avaliada;
AC: área integrada de QL de 0 a 10 minutos, do controle.
Após a obtenção dos valores de % de inibição foi possível calcular os valores de
concentração de inibição 50 (CI50), que corresponde à concentração da amostra capaz de
inibir 50 % da atividade biológica estudada (QL), por efeito de regressão não linear (Figura
10d). A partir das análises dos valores de %I e CI50 foi possível fazer comparações entre os
resultados obtidos pelas amostras em experimentos utilizando os diferentes estímulos.
O efeito de cada amostra (EB, H, DCM, But e Aq) sobre a produção de QL foi
avaliado em no mínimo três experimentos independentes realizados em duplicatas, para cada
estímulo utilizado.
62
Figura 10. Representação da forma de obtenção dos dados dos ensaios de quimioluminescência (QL) realizados para verificar o efeito das amostras de extrato bruto ou frações de T. indica sobre a produção de EROs por neutrófilos ativados. A- perfis de QL em função do tempo produzidos por neutrófilos ativados na presença da amostra nas diferentes concentrações ou DMSO (controle); B- área integrada de QL produzida pelos neutrófilos na presença das diferentes concentrações da amostra ou DMSO; C- porcentagem de inibição da produção de QL promovida pelas diferentes concentrações da amostra em relação ao controle, calculada a partir dos valores de área integrada; D- cálculo do valor de CI50 de cada amostra por meio de regressão não-linear. Abreviaturas: QL: quimioluminescência; DMSO: dimetilsulfóxido; CI50: concentração da amostra que inibe 50% da QL.
0 250 500 750 10000
50
100
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
-5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0 -2.50
50
100
log [concentração (g/mL)]po
rcen
tage
m d
e in
ibiç
ão
CI50
A B
C D
0 150.0×10 -00
1.5×10 08
DMSO50100200400800
µµµµg/mL
tempo (min)
QL
(cpm
)
DMSO 50 100 200 400 8000.0×10 -00
1.5×10 09
concentrações (µµµµg/mL)
área
inte
grad
a de
QL
de0
a 15
min
utos
0 250 500 750 10000
50
100
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
-5.0 -4.5 -4.0 -3.5 -3.0 -2.50
50
100
log [concentração (g/mL)]po
rcen
tage
m d
e in
ibiç
ão
CI50
A B
C D
0 150.0×10 -00
1.5×10 08
DMSO50100200400800
µµµµg/mL
tempo (min)
QL
(cpm
)
DMSO 50 100 200 400 8000.0×10 -00
1.5×10 09
concentrações (µµµµg/mL)
área
inte
grad
a de
QL
de0
a 15
min
utos
63
3.11. Ensaios de desgranulação
O ensaio utilizado para avaliar a desgranulação de neutrófilos foi descrito por
Johansson e colaboradores (2002) e modificado por Kanashiro e colaboradores (2007). Tal
metodologia consiste na verificação da presença da enzima elastase neutrofílica (EN) no
meio. Esta enzima está presente nos grânulos azurófilos e é liberada durante o processo de
desgranulação após a estimulação celular. Para avaliar a quantidade de elastase liberada
utilizou-se o substrato incolor succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida (SAAVNA) o qual, na
presença desta enzima, é degradado no produto de cor amarela, P-nitroanilina (p-NA), que é
quantificado espectrofotometricamente a 405 nm. Utilizando este substrato foi possível
avaliar o efeito do EB sobre o processo de desgranulação.
O esquema apresentado na Figura 11 mostra os possíveis mecanismos que alguma
substância pode realizar para inibir a desgranulação de neutrófilos. Neste estudo, o extrato de
tamarindo foi inicialmente avaliado em um ensaio com células, para verificar se este possui
algum efeito sobre a desgranulação (item 3.11.1). A fim de verificar se o extrato age
diretamente sobre a enzima liberada, inibindo sua atividade catalítica, realizou-se o ensaio
descrito no item 3.11.2.
64
Figura 11. Esquema ilustrando as diferentes formas de atuação de substâncias sobre a desgranulação neutrofílica. Linhas tracejadas: locais de possíveis atuações do extrato. Esquema adaptado de Johansson e colaboradores (2002). Abreviatura: fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina ; CB: citocalasina B; SAAVNA: N-succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida, pNA: P-nitroanilina
3.11.1. Avaliação do efeito do EB de T. indica sobre a desgranulação de neutrófilos
ativados
Em microplaca de 96 poços, 180µL de neutrófilos (2 x 105 células/ poço) foram
incubados com 10µL de citocalasina B (CB) (1µM) e 2µL de amostra [EB de T. indica (100;
200 ou 400µg/mL), solução de Hanks (controle positivo) ou DMSO 0,25% (controle do
solvente)], por 10 minutos, a 37°C. Após adicionar 10µL de fMLP (1µM) aos poços, a
microplaca foi deixada em repouso durante 30 minutos a 37°C, para que ocorresse o processo
de desgranulação. Os valores entre parênteses correspondem às concentrações finais, em um
volume de reação de 200µL. Finalmente, adicionou-se o substrato SAAVNA (1mM), e fez-se
a leitura imediatamente (tempo zero) em leitor de ELISA (Sigma Diagnostics), em
comprimento de onda de 405nm. O sistema foi mantido a 37°C durante 20 minutos e, em
seguida, foi realizada outra leitura a 405nm para verificar a formação de p-NA durante este
fMLP + CB
Neutrófilo
Elastase
SAAVNA pNA
inibição daelastase
sinalizaçãointracelular
receptor de fMLP
outrosreceptores
efeitos citotóxicos
fMLP + CB
Neutrófilo
Elastase
SAAVNA pNA
inibição daelastase
sinalizaçãointracelular
receptor de fMLP
outrosreceptores
efeitos citotóxicos
fMLP + CB
Neutrófilo
Elastase
SAAVNA pNA
inibição daelastase
sinalizaçãointracelular
receptor de fMLP
outrosreceptores
efeitos citotóxicos
65
período. Como controle negativo mediu-se a liberação espontânea da enzima, quantificando a
degradação do substrato por 2 x 105 células apenas na presença de meio.
Para verificar se o extrato de tamarindo interfere na leitura a 405nm, foram feitos
controles contendo células (2 x 105 células) e EB nas concentrações analisadas. A partir da
absorvância (Abs) obtida nestes poços subtraiu-se a Abs do “branco” (2 x 105 células na
presença de meio), obtendo-se a interferência promovida pelo EB.
O efeito do EB de T. indica sobre a liberação da enzima elastase foi verificado em
quatro experimentos independentes realizados em triplicata.
3.11.2. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a atividade da enzima elastase
Na tentativa de esclarecer o mecanismo de ação do extrato (Figura 11), foi avaliado o
efeito do mesmo sobre a atividade catalítica da enzima elastase, utilizando a técnica descrita
por Johansson e colaboradores (2002) e modificada por Kanashiro e colaboradores (2007).
Para o isolamento da enzima elastase, em um tubo, incubaram-se 4,5mL de neutrófilos (1,1 x
106 células/mL) com 250µL de CB (1µM) a 37°C, por 10 minutos. Em seguida, a
desgranulação foi ativada pela adição de 250µL de fMLP (1µM). Simultaneamente, fez-se o
tubo controle negativo (branco), contendo apenas neutrófilos e solução de Hanks. Os valores
entre parênteses correspondem às concentrações finais, em um volume de reação de 5mL.
Após a incubação por 30 minutos a 37°C, os tubos de reação foram centrifugados a 755 x g,
por 10 minutos. O sedimento, contendo as células, foi desprezado e o sobrenadante, rico em
elastase, foi utilizado no ensaio para determinar a atividade desta enzima.
Em microplaca, 200µL de sobrenadante foram colocados na presença de 2µL de
extrato bruto de tamarindo (100; 200 ou 400µg/mL), DMSO (25%) (controle do solvente) ou
Hanks (controle positivo). Como controle negativo utilizou-se o sobrenadante do tubo
contendo neutrófilos não estimulados. Finalmente o substrato SAAVNA (1mM) foi
66
adicionado e, imediatamente, realizada a leitura da Abs (tempo zero) em leitor de ELISA
(Sigma Diagnostics), em comprimento de onda de 405nm. A placa foi mantida a 37°C por 20
minutos e, em seguida, realizada outra leitura a 405nm para quantificar a produção de p-NA
durante este período. Os valores entre parênteses correspondem às concentrações finais, em
um volume de reação de 250µL. Verificou-se a interferência do EB na Abs a 405nm
realizando-se controles contendo solução de Hanks e extrato nas concentrações analisadas. A
partir dos valores de Abs obtidos nestes poços-controle, subtraiu-se o valor de Abs do branco
(Hanks).
O efeito do EB de T. indica sobre a atividade catalítica da enzima elastase foi
verificado em três experimentos independentes realizados em triplicata.
3.11.3. Análise dos dados
Os valores de absorvância obtidos nos dois ensaios realizados para avaliar os efeitos
do EB de T. indica sobre a liberação e a atividade da enzima elastase foram tratados da
seguinte forma:
� Abs = Abs(20) – Abs(0), sendo
� Abs – variação na absorvância durante 20 minutos;
Abs(20) – absorvância em 405 nm no tempo 20;
Abs(0) - absorvância em 405 nm no tempo 0 (esta leitura é feita imediatamente após a adição
do substrato.
Os valores de � Abs obtidos nos poços-teste de cada experimento foram comparados
com os valores dos controles (DMSO) para verificar se o extrato possui atividade modulatória
sobre a liberação e/ou atividade da enzima elastase.
67
3.12. Avaliação da toxicidade das amostras sobre os neutrófilos
A avaliação da toxicidade do extrato e das frações de tamarindo foi realizada com o
intuito de verificar se as atividades modulatórias provocadas pelas amostras sobre os PMNs se
devem a efeitos tóxicos das mesmas sobre estas células. Foram utilizados dois ensaios:
exclusão ao corante Azul de Tripan e determinação da atividade da enzima lactato
desidrogenase (LDH) liberada pelos neutrófilos humanos, seguindo-se as condições
experimentais padronizadas por Kabeya (2002), descritas a seguir.
Neutrófilos (1× 106 células /mL) foram incubados por 15 minutos a 37°C na presença
de 10�L de solução Hanks (controle negativo); ou de Triton X-100 (0.2%) (controle positivo);
ou de DMSO (controle do solvente - 0,25 ou 1%); ou das amostras estudadas (extrato bruto de
tamarindo nas concentrações 400 e 800�g/mL; ou frações hexano, diclorometano, butanólica
ou aquosa a 200 �g/mL cada), em um volume final de reação de 1 mL.
Os tubos de reação foram centrifugados a 755 x g, por 10 minutos, a 4°C. Os
sobrenadantes foram transferidos para outros tubos e mantidos em banho de gelo para
determinação da atividade da LDH. Os sedimentos de células foram suspensos em 200�L de
solução de Hanks contendo 0.1% de gelatina. Uma alíquota dessa suspensão foi misturada
com igual volume de Azul de Tripan, preparado a 0.1% em NaCl 0,15M e transferida para
câmara de Neubauer. Este corante é incorporado apenas por células não viáveis, devido a
lesões na membrana plasmática. A proporção de células viáveis foi estimada pela contagem
de 200 células em microscópio óptico.
O sobrenadante foi utilizado para quantificar a atividade da LDH, uma enzima
localizada no citoplasma das células, liberada quando estas são lesadas ou necrosadas. Esta
enzima é responsável pela conversão do piruvato a lactato na presença de NADH. O ensaio é
realizado utilizando-se o Kit LDH (Liquiform), e baseia-se na medida do decréscimo da
absorvância em 340nm devido à oxidação do NADH, a qual é proporcional à atividade da
68
LDH na amostra. Alíquotas de 1mL de substrato foram pré-incubadas por 3 minutos a 37°C.
Adicionou-se 100�L da amostra de sobrenadante, homogeneizou-se a mistura e realizou-se a
leitura da absorvância em 340 nm nos tempos 1 e 3 minutos, a 37° C, em espectrofotômetro
DU – 70 (Beckman, Fullerton, CA, USA). Calculou-se a atividade da LDH nas amostras
seguindo-se a fórmula descrita pelo fabricante do kit:
A = [(A1 – A2) / 2] × 1,746
Onde:
A = atividade da LDH na amostra, em U/mL;
A1 = absorvância inicial (1minuto) em 340nm;
A2 = absorvância final (3 minutos) em 340nm;
1,746 = fator de cálculo estipulado pelo fabricante do “kit”, para volume de amostra de
100�L.
A toxicidade do extrato e das frações foi avaliada em três experimentos independentes,
com medidas em duplicata.
3.13. Análise estatística
Os resultados obtidos foram processados por meio do programa GraphPad Prism 3.00
(GraphPad Software, Inc.) (GRAPH Pad Prism, 1999) e analisados estatisticamente por meio
de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, sendo os valores de p<0,05
considerados significantes.
69
4. Resultados
70
4.1. Padronização da concentração de N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP)
A concentração de fMLP a ser utilizada nos experimentos de QL foi estabelecida
avaliando-se o estímulo nas concentrações 10-8, 10-7, 10-6 e 10-5M. A QL obtida das células
para cada concentração de fMLP avaliada foi expressa como área integrada de QL de 0 a 15
minutos e os resultados estão mostrados na Figura 12.
0.0 0.5 1.0 1.50.0
5.0×10 08
1.0×10 09
1.5×10 09
6 10
A
fMLP (×××× 10-6M)
área
inte
grad
a de
QLl
um
de 0
a 1
5 m
in
0.0 0.5 1.0 1.50
10000000
20000000
30000000
40000000
6 10
B
fMLP (×××× 10-6M)
área
inte
grad
a d
e Q
Lluc
de
0 a
15 m
in
Figura 12. Respostas de quimioluminescência (QL) dependente de luminol (A) e lucigenina (B) de neutrófilos humanos estimulados com diferentes concentrações de fMLP. Os resultados estão expressos como área integrada de QLlum e QLluc de 0 a 15 minutos. Resultados de um experimento representativo. Valores expressos em média ± DP. n=3 (n: número de experimentos independentes realizados em duplicata). Abreviaturas: DP: desvio padrão; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol.
71
Observou-se que a produção de QLlum ou QLluc aumentou com o aumento da
concentração de fMLP, até 10-6M. Poucas alterações na resposta de QL ocorreram acima
dessa concentração, indicando que 10-6M de fMLP é suficiente para estimular 1 x 106
neutrófilos. Portanto, esta concentração foi utilizada nos experimentos de QL com este
estímulo.
4.2. Padronização da concentração de Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA)
Para estabelecer a concentração de PMA para os experimentos de QL, este estímulo
foi avaliado nas concentrações 10-8, 10-7e 10-6M. A QL obtida das células para cada
concentração de PMA avaliada foi expressa como área integrada de QL de 0 a 15 minutos.
Observando os resultados, mostrados na Figura 13, é possível verificar que as respostas de
QLlum e QLluc produzidas pelos neutrófilos atingiram valores máximos quando estes foram
estimulados com PMA na concentração 10-7M, sofrendo poucas alterações ao empregar
concentração superior. Isso indica que 10-7M de PMA é suficiente para estimular 1 x 106
neutrófilos e, portanto, foi utilizada nos estudos de QL com este estímulo.
72
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.20.0
5.0×10 08
1.0×10 09
1.5×10 09
A
PMA (×××× 10-6 M)
área
inte
grad
a d
e Q
Llu
mde
0 a
15
min
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.20
50000000
100000000
150000000B
PMA (×××× 10-6 M)
área
inte
grad
a d
e Q
Lluc
de
0 a
15 m
in
Figura 13. Respostas de quimioluminescência (QL) dependente de luminol (A) e lucigenina (B) de neutrófilos humanos estimulados com diferentes concentrações de PMA. Os resultados estão expressos como área integrada de QLlum e QLluc de 0 a 15 minutos. Resultados de um experimento representativo. Valores expressos em média ± DP. n=2 (n: número de experimentos independentes realizados em duplicata). Abreviaturas: DP: desvio padrão; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol.
73
4.3. Avaliação dos perfis de quimioluminescência produzidos por neutrófilos ativados
pelos diferentes estímulos
Ao estimular os neutrófilos com os estímulos zimosan opsonizado (ZIops), PMA ou
fMLP, diferentes perfis de quimioluminescência foram observados (Figura 14A e 14B). Para
todos os estímulos empregados, os valores de QLlum foram maiores que os valores de QLluc.
Figura 14. Perfis representativos de QLlum (A e C) e QLluc (B e D) produzidos durante 10 minutos por neutrófilos ativados por ZIops, PMA e fMLP (A e B). C e D – detalhes das diferenças entre os perfis de QLlum e QLluc produzidos por neutrófilos ativados por fMLP. Abreviaturas: fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato. QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; ZIops: zimosan opsonizado.
O ZIops foi o estímulo que induziu a maior produção de quimioluminescência. Os
perfis produzidos são caracterizados por apresentarem intensa e prolongada produção de QL,
a qual se inicia em torno de dois minutos após a adição do estímulo. O PMA também
promoveu uma forte e prolongada produção de QL, porém mais imediata e menos intensa que
a promovida pelo ZIops. A QL induzida pelo fMLP caracterizou-se por atingir menores
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.50.0×10 -00
1.0×10 08
2.0×10 08
3.0×10 08
4.0×10 08
5.0×10 08
ZIopsPMAfMLP
tempo (min)
QLl
um (
cpm
)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.50.0×10 -00
2.0×10 07
4.0×10 07
6.0×10 07
8.0×10 07
fMLP
tempo (min)
QLl
um (
cpm
)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.50.0×10 -00
2.5×10 06
5.0×10 06
7.5×10 06
fMLP
tempo (min)
QLl
uc (
cpm
)
A
D C
B
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.50.0×10 -00
1.0×10 07
2.0×10 07
3.0×10 07
4.0×10 07
fMLPPMAZIops
tempo (min)
QLl
uc (
cpm
)
74
valores de cpm dentre os estímulos avaliados. Uma característica importante observada ao
estimular neutrófilos com fMLP é a notável diferença entre os perfis de QLlum e QLluc. O
perfil de QLlum é composto por dois picos, o primeiro ocorrendo no período de um a dois
minutos e o segundo é observado de 5 a 8 minutos após a adição do estímulo. Em contraste, o
perfil de QLluc verificado após a ativação por fMLP é composto por apenas um pico em torno
de dois minutos após a adição do estímulo (Figura 14C e 14D).
4.4. Efeitos do extrato bruto de T. indica sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos
ativados
Em todos os ensaios, o EB foi solubilizado em DMSO 25%, sendo que a concentração
final do solvente no tubo de reação foi de 0,25%. Em estudos de padronização realizados no
laboratório, verificou-se que o DMSO nesta concentração não interfere na produção de
QLlum ou QLluc (dados não mostrados).
Para verificar se o extrato reage diretamente com as sondas, promovendo alterações na
QL produzida, realizou-se um ensaio sem células, contendo meio, sonda e extrato. Observou-
se que o extrato de tamarindo não causou nenhuma alteração na QL, quando comparado com
o controle (dados não mostrados).
A seguir estão os resultados das análises do efeito do EB sobre a produção de
quimioluminescência dependente de luminol e lucigenina. Os dados são mostrados
separadamente para cada estímulo utilizado.
75
4.4.1. ZIops
Na Figura 15 estão representados os perfis de QLlum e QLluc produzidos por
neutrófilos ativados por ZIops na presença de EB de T. indica nas concentrações 50, 100, 200,
400 e 800µg/mL.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.50.0×10 -00
1.0×10 08
2.0×10 08
3.0×10 08
4.0×10 08
5.0×10 08
espontâneocontrole50100200400800
EB T. indica (µµµµg/mL)
tempo (min)
QLl
um (c
pm)
A
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.50
10000000
20000000
30000000
40000000espontâneocontrole50100200400800
EB T. indica (µµµµg/mL)
B
tempo (min)
QLl
uc (c
pm)
Figura 15. Perfis de quimioluminescência em função do tempo produzidos por neutrófilos estimulados por ZIops. Cada curva representa o efeito do EB de tamarindo, em diferentes concentrações, sobre a produção de QLlum (A) ou QLluc (B). Perfis produzidos em um experimento representativo de 6 (QLlum) e 5 (QLluc) outros independentes com perfis semelhantes, realizados em duplicata. controle: DMSO. Abreviaturas: cpm: contagem de fótons por minuto; DMSO: dimetilsulfóxido; EB: extrato bruto; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; ZIops: zimosan opsonizado.
76
Para cada curva de QL, determinou-se o valor de área sob a curva de 0 a 10 minutos.
Utilizando estes valores, calculou-se a porcentagem de inibição da QL promovida por cada
concentração analisada em relação ao tubo controle (DMSO) de cada experimento. Os valores
de porcentagem de inibição da produção de QLlum e QLluc obtidos para cada concentração
de EB estão mostrados nas Tabelas 4.1 e 4.2, respectivamente, e representados na Figura 16.
Pode-se observar que o extrato promoveu a modulação tanto da produção de QLlum, quanto
de QLluc de forma dose dependente.
A fim de comparar os efeitos do EB sobre a produção de QL por neutrófilos
estimulados com ZIops com os seus efeitos verificados na presença dos demais estímulos
avaliados neste estudo, foram calculados os valores de CI50 para QLlum e QLluc e estes
foram, em �g/mL ± EPM, 248,50 ± 23,05 e 324,1 ± 34,58, respectivamente (Tabelas 4.1 e
4.2).
Tabela 4.1. Efeito inibitório do extrato bruto de T. indica sobre a produção de QLlum por neutrófilos estimulados
Concentração final
(µg/mL)a Porcentagem de inibição (%)b
ZIops fMLP PMA 25 ---- 8,41 ± 3,28 14,68 ± 3,17 50 13,27 ± 3,88 12,23 ± 3,28 28,66 ± 2,21
100 26,17 ± 4,17 28,28 ± 2,70 47,55 ± 4,59 200 43,64 ± 2,58 55,59 ± 3,17 67,99 ± 3,20 400 65,83 ± 2,93 80,51 ± 2,29 85,57 ± 2,71 800 89,84 ± 2,37 ---- ---- CI50 248,50 ± 23,05 178,5 ± 12,20 115,70 ± 9,68
n 6 5 7
a: concentração final de extrato bruto (EB) de T. indica; b: porcentagem de inibição da QLlum produzida pelos neutrófilos estimulados. Os valores são expressos como média ± EPM (erro padrão da média). Abreviaturas: CI50: concentração da amostra que promove inibição de 50% da quimioluminescência; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; n: número de experimentos independentes realizados em duplicata; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; ZIops: Zimosan opsonizado.
77
Tabela 4.2. Efeito inibitório do extrato bruto de T. indica sobre a produção de QLluc por neutrófilos estimulados
Concentração final (µg/mL)a
Porcentagem de inibição (%)b
ZIops PMA 25 ---- 14,89 ± 6,93 50 14,62 ± 4,48 19,66 ± 5,60
100 24,69 ± 3,61 38,67 ± 5,94 200 41,02 ± 4,16 56,92 ± 7,23 400 57,13 ± 4,01 79,16 ± 6,94 800 72,94 ± 3,84 ---- CI50 324,1 ± 34,58 174,5 ± 25,86
n 5 5 a: concentração final de extrato bruto (EB) de T. indica; b: porcentagem de inibição da QLluc produzida pelos neutrófilos estimulados. Os valores são expressos com média ± EPM (erro padrão da média). Abreviaturas: CI50: concentração da amostra que promove inibição de 50% da quimioluminescência; n: número de experimentos independentes realizados em duplicata; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; ZIops: Zimosan opsonizado.
78
0 200 400 600 800 10000
25
50
75
100fMLPPMAZIops
EB T. indica (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição A
0 200 400 600 800 10000
25
50
75
100PMAZIops
EB T. inidica (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição B
Figura 16. Curvas de porcentagem de inibição de QLlum (A) e QLluc (B) em função da concentração de EB de tamarindo. A QL foi produzida por neutrófilos humanos estimulados por fMLP, PMA ou ZIops. Valores expressos como média ± EPM de n experimentos realizados em duplicata (n: estes dados se encontram nas tabelas 4.1 e 4.2). Abreviaturas: EB: extrato bruto; EPM: erro padrão da média; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; ZIops: zimosan opsonizado.
79
4.4.2. PMA
Avaliou-se também os efeitos do EB sobre o metabolismo oxidativo de PMNs
ativados pelo estímulo PMA, verificando a produção de QLlum e QLluc. Durante ensaios-
teste, utilizando o PMA como estímulo, observou-se que o EB na faixa de concentração 50-
800�g/mL (utilizada nos ensaios com ZIops), causou uma inibição muito grande da QL, não
sendo possível a determinação do CI50 (dados não mostrados). Portanto, para uma melhor
visualização do efeito dose-resposta, neste ensaio avaliou-se o EB nas concentrações finais
25, 50, 100, 200 e 400µg/mL.
Os perfis de quimioluminescência produzidos durante 20 minutos por neutrófilos
ativados por PMA na presença de EB estão apresentados na Figura 17. Para cada curva,
determinou-se o valor de área integrada de QL, a qual foi calculada para o intervalo de 0 a 10
minutos com o propósito de permitir a comparação dos resultados obtidos nos ensaios com os
três estímulos. A partir dos valores de área integrada, calculou-se a porcentagem de inibição
promovida pelo extrato (Figura 16 e Tabelas 4.1 e 4.2). Verificou-se que o EB de T. indica
demonstrou atividade moduladora da produção de QLlum e QLluc por neutrófilos ativados
com PMA, e que este efeito foi relacionado com a dose. Os valores de CI50 obtidos foram, em
µg/mL ± EPM: 115,70 ± 9,68 (QLluc) e 174,5 ± 25,86 (QLlum) (Tabelas 4.1 e 4.2).
80
0 5 10 15 20 250.0×10 -00
1.0×10 08
2.0×10 08
3.0×10 08
4.0×10 08
5.0×10 08
espontâneocontrole2550100200400
EB T. inidica (µµµµg/mL)
tempo (min)
QLl
um (c
pm)
A
0 5 10 15 20 250
5000000
10000000
15000000espontâneocontrole
50100200400
EB T. indica (µµµµg/mL)
25
B
tempo (min)
QLl
uc (c
pm)
Figura 17. Perfis de quimioluminescência em função do tempo produzidos por neutrófilos estimulados por PMA. Cada curva representa o efeito do EB de tamarindo em diferentes concentrações sobre a produção de QLlum (A) ou QLluc (B). Perfis produzidos em um experimento representativo de 7 (QLlum) e 5 (QLluc) outros independentes com perfis semelhantes. controle: DMSO. Abreviaturas: cpm: contagem de fótons por minuto; DMSO: dimetilsulfóxido; EB: extrato bruto; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; QLluc: quimioluminescência dependente de lucigenina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol.
81
4.4.3. fMLP
O terceiro estímulo utilizado para ativar os neutrófilos nos ensaios de QL foi o fMLP.
Assim como foi procedido nos ensaios com PMA, as concentrações de EB avaliadas foram
25, 50, 100, 200 e 400µg/mL. O ensaio de quimioluminescência dependente de lucigenina, foi
pouco sensível para quantificar a produção de EROs por neutrófilos estimulados por fMLP,
não permitindo a avaliação do extrato e, portanto, seus dados foram descartados. Na Figura 18
está representado o perfil de QLlum produzido no período de 15 minutos por PMNs ativados
por fMLP na presença do EB de T. indica. Para cada curva, determinou-se o valor de área
integrada de 0 a 10 minutos e em seguida calculou-se a porcentagem de inibição causada pelo
o extrato (Figura 16 e Tabela 4.1). O EB de T. indica também causou inibição dose-
dependente da produção de QLlum por PMNs estimulados com fMLP e o valor de CI50 foi de
178,5 ± 12,20µg/mL
0 5 10 15 200.0
1.0×10 08
2.0×10 08
3.0×10 08
4.0×10 08 espontâneo
EB T. inidica (µµµµg/mL)
controle
50100200400
25
tempo (min)
QLl
um (c
pm)
Figura 18. Perfil de quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) em função do tempo produzido por neutrófilos estimulados por fMLP. Cada curva representa o efeito do EB de tamarindo em diferentes concentrações sobre a produção de QLlum. Perfil produzidos em um experimento representativo de 5 outros independentes com perfis semelhantes. controle: DMSO. Abreviaturas: cpm: contagem de fótons por minuto; EB: extrato bruto; DMSO: dimetilsulfóxido; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina.
82
4.5. Efeitos das frações do extrato T. indica sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos
ativados
Após verificar a atividade antioxidante do EB de T. indica, foram avaliadas quatro
frações provenientes deste extrato quanto a essa mesma atividade. As frações analisadas
foram: aquosa (Aq), butanólica (But), diclorometano (DCM) e hexano (H).
O efeito antioxidante das frações foi verificado através do ensaio de QLlum e os
estímulos utilizados foram ZIops, PMA e fMLP. As frações (exceto H) foram solubilizadas
em DMSO 25% (concentração final do DMSO nos tubos de reação: 0,25%). Para solubilizar a
fração H foi utilizado DMSO puro e a concentração final do solvente no tubo de reação foi de
1%. Em estudos de padronização realizados no laboratório, verificou-se que o DMSO nestas
concentrações não interfere na produção de QLlum (dados não mostrados).
Os resultados serão mostrados separadamente para cada estímulo utilizado.
4.5.1. ZIops
As frações foram avaliadas quanto aos seus efeitos sobre o metabolismo oxidativo de
neutrófilos ativados por ZIops nas concentrações: 5, 10, 50, 100 e 200µg/mL. Para cada
curva, determinou-se o valor de área sob a curva de 0 a 15 minutos e, a partir desses valores,
calculou-se a porcentagem de inibição da QL promovida por cada concentração analisada, em
relação ao tubo controle (DMSO) de cada experimento. Como pode ser observado na Figura
19 e na Tabela 4.3, as frações hexano e diclorometano causaram maior inibição da QLlum e
esta inibição foi dependente da concentração. Verificou-se também que, em todas as
concentrações avaliadas, a modulação da QLlum promovida pela fração H foi ainda maior
que pela fração DCM. Entretanto, as frações aquosa e butanólica tiveram pouco efeito sobre a
produção de QLlum, mesmo nas maiores concentrações analisadas, não causando uma
resposta dose-dependente. Os valores de CI50 obtidos pelas frações DCM e H foram,
83
respectivamente, 60,32 ± 7,49 (�g/mL) e 34,82 ± 4,47 (�g/mL). Não foi possível calcular CI50
para as frações Aq e But devido à pequena inibição causada
0 50 100 150 200 2500
25
50
75
100AqButDCMH
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
Figura 19. Curvas de porcentagem de inibição de QLlum em função das concentrações das frações de tamarindo. A QLlum foi produzida por neutrófilos humanos estimulados por ZIops. Valores expressos como média ± EPM de 3 experimentos realizados em duplicata. Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; ZIops: zimosan opsonizado.
Tabela 4.3. Efeitos das frações de T. indica sobre a produção de QLlum por neutrófilos ativados por ZIops
Porcentagem de inibição (%)b Concentração
(µg/mL)a Aq But DCM H
5 5,80 ± 4,83 0,25 ± 0.25 4,64 ± 1,02 16,81 ± 5,14
10 5,75 ± 4,35 5,50 ± 5.50 24,19 ± 4,81 37,74 ± 9,30
50 5,41 ± 3,95 12,67 ± 1.15 52,13 ± 3,49 67,02 ± 7,81
100 9,57 ± 0,04 17,75 ± 5.02 63,03 ± 3,60 81,61 ± 3,15
200 26,17 ± 4,06 22,17 ± 10.61 73,33 ± 1,07 88,06 ± 2,92
CI50 60,32 ± 7,49 34,82 ± 4,47
n 3 3 3 3
a: concentração final diferentes frações do extrato hidroalcoólico de T. indica; b: porcentagem de inibição da QLlum produzida pelos neutrófilos estimulados por ZIops. Os valores são expressos com média ± EPM. Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; ZIops: Zimosan opsonizado.
84
4.5.2. PMA
Os efeitos das frações sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos ativados por PMA
também foram verificados, avaliando-as nas concentrações 5, 10, 50, 100 e 200µg/mL. As
frações aquosa e butanólica causaram pouca inibição da produção de QLlum pelos PMNs
ativados por PMA, diferentemente das frações hexano e diclorometano que provocaram uma
grande inibição da QLlum de forma dose-dependente. O CI50 obtido pela fração DCM foi
56,34 ± 1,20 (µg/mL) e pela fração H foi 13,61 ± 2,99 (µg/mL) (Figura 20 e Tabela 4.4).
Observando-se os valores de porcentagem de inibição obtidos por cada concentração avaliada,
bem como de CI50 (Tabela 4.4), verificou-se que a fração H promoveu uma maior inibição
desde as menores concentrações avaliadas e a fração DCM apresentou um aumento gradual de
seu efeito, à medida que aumentou-se a dose, e que somente nas concentrações maiores os
efeitos das duas frações se equipararam.
0 50 100 150 200 2500
25
50
75
100AqButDCMH
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
Figura 20. Curvas de porcentagem de inibição de QLlum em função das concentrações das frações de tamarindo. A QLlum foi produzida por neutrófilos humanos estimulados por PMA. Valores expressos como média ± EPM de n experimentos realizados em duplicata (n: dados encontrados na tabela 4.4). Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol.
85
Tabela 4.4. Efeitos das frações de T. indica sobre a produção de QLlum por neutrófilos ativados por PMA
Porcentagem de inibição (%) Concentração
(µg/mL)a Aq But DCM H
5 6,16 ± 2,46 12,59 ± 3.15 13,14 ± 1,72 42,74 ± 4,78
10 1,91 ± 0,89 11,73 ± 4.62 23,26 ± 6,04 49,93 ± 3,22
50 16,05 ± 4,17 25,57 ± 5.99 54,80 ± 5,04 63,74 ± 4,07
100 14,35 ± 6,02 21,45 ± 5.81 69,82 ± 2,43 73,18 ± 3,16
200 25,95 ± 5,16 43,10 ± 0.52 84,58 ± 1,50 86,67 ± 1,43
CI50 56,34 ± 1,20 13,61 ± 2,99
n 3 3 4 4
a: concentração final das diferentes frações do extrato hidroalcoólico de T. indica; b: porcentagem de inibição da QLlum produzida pelos neutrófilos estimulados por PMA. Os valores são expressos com média ± EPM. Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato.
4.5.3. fMLP
Para avaliar os efeitos das frações sobre a produção de QLlum induzida pelo fMLP,
foram utilizadas as mesmas concentrações anteriores (5, 10, 50, 100 e 200µg/mL) para as
frações Aq, But e DCM. Porém, a fração H foi analisada nas concentrações 1,25; 2,5; 5; 25 e
50µg/mL. Assim como ocorreu nos ensaios com os demais estímulos, as frações Aq e But
demonstraram pouco efeito sobre a produção de QLlum por neutrófilos ativados por fMLP,
enquanto que as frações H e DCM modularam a produção de QLlum, de uma maneira dose
dependente, com CI50 de 42,01 ± 2,70µg/mL (DCM) e 5,40 ± 0,97µg/mL (H) (Figura 21 e
Tabela 4.5). Como pode ser observado nos valores de CI50 e de porcentagem de inibição, a
modulação promovida pela fração H foi expressivamente maior que pela fração DCM.
86
0 50 100 150 200 2500
25
50
75
100AqButDCMH
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
Figura 21. Curvas de porcentagem de inibição de QLlum em função das concentrações das frações de tamarindo. A QLlum foi produzida por neutrófilos humanos estimulados por fMLP. Valores expressos como média ± EPM de n experimentos realizados em duplicata (n: estes dados se encontram na tabela 4.5). Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol.
Tabela 4.5. Efeitos das frações de T. indica sobre a produção de QLlum por neutrófilos ativados por fMLP
Porcentagem de inibição (%) Concentração
(µg/mL)a Aq But DCM H
1,25 25,27 ± 2,59
2,5 38,49 ± 4,28
5 0,59 ± 0,59 1,97 ± 1,97 7,99 ± 2,13 44,76 ± 4,52
10 0,69 ± 0,69 0,00 ± 0,00 18,69 ± 5,74
25 69,27 ± 3,83
50 6,81 ± 0,20 4,64 ± 2,68 57,44 ± 2,79 76,03 ± 3,17
100 11,91 ± 2,18 18,05 ± 7,66 80,68 ± 1,81
200 30,98 ± 6,83 35,70 ± 6.34 94,15 ± 0,87
CI50 42,01 ± 2,70 5,40 ± 0,97
N 3 3 4 5
a: concentração final das diferentes frações do extrato hidroalcoólico de T. indica; b: porcentagem de inibição da QLlum produzida pelos neutrófilos estimulados por fMLP. Os valores são expressos com média ± EPM. Abreviaturas: Aq: fração aquosa; But: fração butanólica; DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina.
87
Na figura 22, estão mostradas separadamente as curvas de porcentagem de inibição da
QLlum, obtidas pelas frações DCM (A) e H (B), para os diferentes estímulos utilizados.
Como pode ser observado, as frações inibiram mais fortemente a QLlum produzida por
neutrófilos estimulados por fMLP, sendo isto significativo (p<0,05) para a fração DCM.
0 50 100 150 200 2500
25
50
75
100fMLPPMAZIops
A
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
0 50 100 150 200 2500
25
50
75
100fMLPPMAZIops
B
concentração (µµµµg/mL)
porc
enta
gem
de
inib
ição
Figura 22. Curvas de porcentagem de inibição de QLlum em função das concentrações das frações DCM (A) e H (B) do extrato de tamarindo. A QLlum foi produzida por neutrófilos humanos estimulados por ZIops, PMA ou fMLP. Valores expressos como média ± EPM. Abreviaturas: DCM: fração diclorometano; H: fração hexano; EPM: erro padrão da média; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato; QLlum: quimioluminescência dependente de luminol; ZIops: zimosan opsonizado.
88
4.6. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a desgranulação de neutrófilos
estimulados por fMLP
O efeito do EB sobre a desgranulação foi verificado avaliando a liberação de elastase
por neutrófilos estimulados por fMLP, por meio da quantificação da degradação do substrato
SAAVNA. Na Figura 23 está demonstrada a inibição da liberação da enzima elastase, causada
pelo EB de T. indica. Este efeito foi dependente da dose e estatisticamente significativo em
concentrações acima de 200µg/mL (p<0.001).
Observou-se que o EB causou pouca ou nenhuma interferência na leitura a 405nm. Os
valores de Abs obtidos nestes controles foram subtraídos dos valores dos poços-teste para não
interferirem na visualização da atividade enzimática real (dados não mostrados).
(-) (+) DMSO 100 200 4000.0
0.5
1.0
1.5
**
controles EB T. inidica (µµµµg/mL)
∆∆ ∆∆ a
bs (2
0 m
in)
Figura 23. Efeito inibitório do extrato bruto de T. indica sobre a liberação da enzima elastase por neutrófilos ativados por fMLP. A liberação da enzima foi avaliada a 405nm pela formação do produto p-NA a partir do substrato SAAVNA. Os dados são expressos como média ± EPM de quatro experimentos realizados em triplicata (* p<0,001, em relação ao DMSO). Controles: (-): liberação espontânea de elastase por células não estimuladas; (+): células estimuladas na ausência do extrato; DMSO: células estimuladas na presença do solvente. Abreviaturas: � Abs: variação na absorvância; DMSO: dimetilsulfóxido; EB: extrato bruto; EPM: erro padrão da média; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; p-NA: P-nitroanilina; SAAVNA: succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida.
89
4.7. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a atividade catalítica da enzima elastase
Com o intuito de verificar se os resultados obtidos no item 4.6 se devem a uma ação
do extrato sobre o processo de desgranulação ou diretamente sobre a atividade catalítica da
enzima elastase, foi realizado um ensaio no qual utiliza-se apenas o sobrenadante rico em
enzima elastase liberada pelos neutrófilos. Neste ensaio, avaliou-se o efeito do EB sobre a
degradação do substrato SAAVNA pela enzima elastase previamente separada das células. O
EB de T. indica, nas concentrações 200 e 400µg/mL inibiu significativamente a atividade da
enzima elastase (Figura 24).
(-) (+) DMSO 100 200 4000.0
0.5
1.0
1.5
2.0
controles EB T. indica (µµµµg/mL)
***
∆∆ ∆∆ a
bs (4
05nm
)
Figura 24. Efeito inibitório do extrato bruto de T. indica sobre a atividade catalítica da enzima elastase. A atividade da enzima proveniente do sobrenadante de neutrófilos estimulados por fMLP foi avaliada a 405nm pela formação do produto p-NA a partir do substrato SAAVNA. Os dados são expressos como média ± EPM de três experimentos realizados em triplicata (* p< 0,05; ** p<0,001 em relação ao DMSO). Controle: (-): utilizou-se o sobrenadante de células não estimuladas; (+): sobrenadante de células estimuladas, na ausência do extrato; DMSO: sobrenadante de células estimuladas, na presença do solvente. Abreviaturas: � Abs: variação na absorvância; DMSO: dimetilsulfóxido; EB: extrato bruto; EPM: erro padrão da média; fMLP: N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; p-NA: P-nitroanilina; SAAVNA: succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida.
90
4.8. Avaliação da toxicidade do extrato bruto e das frações de T. indica sobre os
neutrófilos
A toxicidade das amostras foi verificada através dos ensaios de exclusão ao corante
Azul de Tripan e da determinação da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH).
O extrato bruto não apresentou atividade citotóxica sobre os neutrófilos nos dois
ensaios, como pode ser observado na Tabela 4.6. No ensaio de exclusão ao corante Azul de
Tripan as células, na presença do extrato, obtiveram viabilidades superiores a 94% e no ensaio
de determinação da atividade da enzima LDH a porcentagem de liberação da enzima em
relação ao controle positivo (Triton X-100) foi baixa, quando comparadas com os valores do
controle negativo.
Tabela 4.6. Análise da citotoxicidade do extrato bruto de T. indica sobre os neutrófilos
Amostra Células viáveis
(%) (c)
Atividade da LDH (d) LDH liberada
(% controle positivo) (e)
Controle positivo (a) --- 0,146 ± 0,009 100
Controle negativo (b) 97,33 ± 0,79 0,013 ± 0,002 9,05 ± 1,80
DMSO (0,25%) 96,19 ± 1,27 0,013 ± 0,003 9,86 ± 2,06
EB T. indica
(400�g/mL)
96,13 ± 0,84 0,009 ± 0,002 6,24 ± 1,54
EB T. indica
(800�g/mL)
94,19 ± 0,92 0,015 ± 0,002 10,39 ± 1,52
Os valores estão representados como média ± erro padrão. (a) 1 × 106 neutrófilos / mL lisados com Triton X-100 0,2%; (b) 1 × 106 neutrófilos / mL incubados com Hanks; (c) % de células viáveis, determinada por meio do ensaio de exclusão ao corante Azul de Tripan, baseado na contagem de 200 células; (d) Atividade da enzima LDH, avaliada utilizando-se o kit LDH Liquiform (Labest Diagnostica); (e) Valores de porcentagem de LDH liberada, calculadas em relação ao controle positivo. Abreviaturas: LDH: lactato desidrogenase; DMSO: dimetilsulfóxido; EB: extrato bruto.
91
Ao avaliar as frações aquosa, butanólica e dicloromentano na concentração 200�g/mL
(maior concentração empregada nos ensaios de QL), verificou-se que, nas condições
experimentais empregadas, elas também não causaram efeitos citotóxicos sobre os neutrófilos
(Tabela 4.7).
Tabela 4.7. Análise da citotoxicidade das frações do extrato de T. indica sobre os neutrófilos.
Amostra Células viáveis (%) (c)
Atividade da LDH (d) LDH liberada (% controle positivo) (e)
Controle positivo (a) --- 0,118 ± 0,004 100
Controle negativo (b) 97,33 ± 0,79 0,009 ± 0,003 6,77 ± 1,63
DMSO (0,25%) 97,25 ± 0,80 0,004 ± 0,001 4,47 ± 0,63
Aquosa 98,17 ± 0,32 0,008 ± 0,002 6,73 ± 2,34
Butanólica 97,33 ± 0,61 0,007 ± 0,002 5,53 ± 1,74
Diclorometano 96,33 ± 1,24 0,008 ± 0,001 6,81 ± 1,22
Os valores estão representados como média ± erro padrão. (a) 1 × 106 neutrófilos / mL lisados com Triton X-100 0,2%; (b) 1 × 106 neutrófilos / mL incubados com Hanks; (c) % de células viáveis, determinada por meio do ensaio de exclusão ao corante Azul de Tripan, baseado na contagem de 200 células; (d) Atividade da enzima LDH, avaliada utilizando-se o kit LDH Liquiform (Labest Diagnostica); (e) Valores de porcentagem de LDH liberada, calculadas em relação ao controle positivo. As frações foram testadas na concentração 200�g/mL. Abreviaturas: LDH: lactato desidrogenase; DMSO: dimetilsulfóxido.
92
Entretanto, como pode ser observado nos resultados apresentados na Tabela 4.8, a
fração hexano apresentou efeitos tóxicos para os neutrófilos tanto no ensaio de exclusão ao
corante Azul de Tripan, quanto de determinação da atividade da enzima LDH. Este efeito foi
significativo nas concentrações 100 e 200�g/mL (p<0,05) (Tabela 4.8).
Tabela 4.8. Análise da citotoxicidade da fração hexano do extrato de T. indica sobre os neutrófilos.
Amostra Células viáveis
(%) (c)
Atividade da LDH (d) LDH liberada
(% controle positivo) (e)
Controle positivo (a) ------- 0,195 ± 0,050 100
Controle negativo (b) 98,50 ± 1,00 0,009 ± 0,003 4,62 ± 1,52
DMSO (1%) 97,50 ± 1,50 0,006 ± 0,002 3,01 ± 0,82
Fração Hexano
5,0�g/mL
96,75 ± 0,75 0,009 ± 0,001 4,44 ± 0,66
10 �g/mL 99,25 ± 0,25 0,011 ± 0,002 5,45 ± 0,83
50 �g/mL 97,75 ± 0,75 0,021 ± 0,006 10,77 ± 3,21
100 �g/mL 83,50 ± 0,50 * 0,053 ± 0,006 26,86 ± 2,85 *
200 �g/mL 19,05 ± 2,45 * 0,102 ± 0,004 * 52,30 ± 2,21 *
Os valores estão representados como média ± erro padrão. (a) 1 × 106 neutrófilos / mL lisados com Triton X-100 0,2%; (b) 1 × 106 neutrófilos / mL incubados com Hanks; (c) % de células viáveis, determinada por meio do ensaio de exclusão ao corante Azul de Tripan, baseado na contagem de 200 células; (d) Atividade da enzima LDH, avaliada utilizando-se o kit LDH Liquiform (Labest Diagnostica); (e) Valores de porcentagem de LDH liberada, calculadas em relação ao controle positivo. Abreviaturas: LDH: lactato desidrogenase; DMSO: dimetilsulfóxido. *p< 0,001, em relação ao controle negativo
93
5. Discussão
94
5.1. Obtenção do extrato do fruto de Tamarindus indica L. e frações
Dentre os métodos utilizados para produzir extratos vegetais descritos na literatura,
optou-se pelo preparo do extrato hidroalcoólico por se tratar da forma mais próxima das
tinturas empregadas na medicina popular, além de ser uma forma de extrair um maior número
de compostos diferentes. Como a frutificação da espécie ocorre somente no período de
setembro a novembro, o extrato de tamarindo foi obtido a partir de lotes preparados
anualmente.
O fracionamento do extrato permitiu a separação de grupos de substâncias através de
suas polaridades e o estudo das atividades biológicas, promovidas pelas diferentes frações,
possibilitou um direcionamento para isolamento de substâncias em estudos posteriores.
Os lotes de extrato produzidos, bem como as frações provenientes deles, foram
avaliados quanto às suas composições de açúcares totais, polifenóis e flavonóides. Esses
dados auxiliaram na padronização do preparo anual de extratos, além de permitirem que os
resultados obtidos nos ensaios biológicos sejam posteriormente relacionados com os possíveis
componentes das amostras.
5.2. Avaliação dos perfis de quimioluminescência produzidos por neutrófilos na
presença dos diferentes estímulos
O “burst” respiratório é desencadeado pelo sistema NADPH oxidase, que é ativado
seguindo a uma perturbação da membrana plasmática, durante a fagocitose, ou à interação
entre a superfície celular e uma variedade de agentes (KITAGAWA et al., 2003).
Para que o complexo NADPH-oxidase seja ativado, deve haver a reunião de seus
componentes na membrana plasmática ou na membrana dos grânulos. A migração dos
componentes citosólicos para a membrana está diretamente relacionada com a ativação dos
mesmos, através da fosforilação de resíduos por proteínas quinases. O envolvimento da
95
família das proteínas quinase C (PKC) na ativação e regulação do complexo NADPH oxidase
é sugerido por diversos estudos, que demonstram que o componente citosólico p47phox é
substrato para esta proteína. Uma vez ativado este complexo, ocorre a formação do radical
ânion superóxido por meio da transferência de elétron do NADPH para o oxigênio molecular.
Conseqüentemente, outras espécies reativas de oxigênio são formadas na presença de outras
enzimas, as quais fazem parte dos mecanismos microbicidas dependentes de oxigênio dos
neutrófilos (SELVATICI et al., 2006).
A quimioluminescência é um importante método para estudar a produção de EROs,
em tempo real, por fagócitos ativados. Para amplificar a quimioluminescência produzida por
fagócitos durante o “burst” respiratório são utilizadas sondas quimioluminescentes, as quais
diferem com respeito a sua sensibilidade resultante de diferentes mecanismos moleculares que
levam à emissão de luz (KOPPRASCH et al., 2003).
Neste estudo, foram utilizadas as sondas quimioluminescentes luminol e lucigenina. O
luminol é capaz de reagir com uma variedade de agentes oxidantes, em uma reação onde ele é
oxidado a um íon aminoftalato eletronicamente excitado, que retorna a um estado basal
emitindo fóton (ALLEN; LOOSE, 1976). Devido ao seu tamanho reduzido (177,2 daltons) e à
sua estrutura química lipofílica, a molécula de luminol é capaz de difundir através de
membranas biológicas detectando EROs produzidas intra e extracelularmente (KOPPRASCH
et al., 2003; BRIHEIM et al., 1984). Ainda não existe um consenso a respeito de quais
espécies reativas de oxigênio reagem com o luminol, mas sabe-se que ele detecta diversos
tipos de EROs, embora haja uma maior sensibilidade para aquelas envolvidas no sistema
MPO-H2O2 (DAHLGREN; STENDAHL, 1983; ANIANSSON et al., 1984; CALDEFIE-
CHÉZET et al., 2002; O’DOWD et al., 2004). A dependência da mieloperoxidase (MPO)
para a produção de quimioluminescência dependente de luminol (QLlum) foi inicialmente
constatada por meio de experimentos utilizando neutrófilos deficientes nessa enzima, os quais
96
após serem ativados não produziam QLlum (DAHLGREN; STENDAHL; 1983;
ANIANSSON et al., 1984). Entretanto, nesses mesmos trabalhos, ensaios realizados com a
lucigenina demonstraram que a deficiência na enzima MPO não influenciava na produção de
QLluc. Estes e outros estudos de padronização da técnica de QL apontam a lucigenina como
um detector específico do radical ânion superóxido (O2•�). Antes de reagir com o O2
•�, a
lucigenina deve ser reduzida por um elétron para produzir o radical cátion lucigenina. O
sistema biológico que reduz a lucigenina pode ser o mesmo que produz o O2•�. O radical
cátion lucigenina então reage com o O2•� para produzir um intermediário instável, lucigenina
dioxietano. Este se decompõe para produzir duas moléculas de N-metilacridona, uma das
quais está em um estágio eletronicamente excitado, que retorna ao estagio basal emitindo
fóton (Figura 6) (LI et al., 1999). Por se tratar de uma molécula grande (510,5 daltons), a
lucigenina não é capaz de atravessar membranas e, portanto, detecta apenas ânion superóxido
produzido extracelularmente (ANIANSSON et al., 1948; CALDEFIE-CHÉZET et al., 2002;
DAHLGREN et al., 1985). Porém, este conceito pode ser contestável ao se utilizar estímulos
particulados como o zimosan. Estes são fagocitados pelas células e, neste processo, a
lucigenina pode ser englobada juntamente com o estímulo, passando a quantificar ânion
superóxido intracelularmente. Isso reflete nos perfis de QLlum e QLluc produzidos por
neutrófilos ativados por zimosan opsonizado, os quais, embora em diferente escalas, são
muito semelhantes.
Neste trabalho, os estímulos utilizados para ativar os neutrófilos foram o zimosan
opsonizado (ZIops), o N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) e o Forbol-12-miristato-
13-acetato (PMA). O “burst” respiratório produzido por estes estímulos difere em
características do tempo de curso, ou seja, sua cinética, que compreende o tempo levado para
iniciar a produção de EROs após a adição do estímulo, a intensidade máxima (pico) atingida e
a duração da produção de EROs (DECOURSEY; LIGETY, 2005). As respostas de
97
quimioluminescência das células variaram consideravelmente dependendo da sonda
quimioluminescente e dos estímulos empregados.
De maneira geral, observou-se que, independente do estímulo utilizado, a QLlum
produzida foi maior que a QLluc. Outros autores, tais como Pavelkova e Kubala (2004) e
Kopprasch e colaboradores (2003) obtiveram resultados semelhantes ao analisar as duas
sondas, e provavelmente esta diferença nas intensidades se devem ao fato de o luminol
quantificar uma maior diversidade de EROs.
O fMLP é um estímulo solúvel proveniente de parede bacteriana. A ativação celular
pelo fMLP gerou menor produção de QL (menores valores de área integrada), quando
comparada à ativação por PMA ou ZIops. O perfil de QLluc apresentou um pico em torno de
2 minutos, cessando completamente a produção de QL 5 minutos após a adição do estímulo às
células, quando comparado ao controle. Assim como foi descrito por Dahlgren e Stendahl
(1983), neste estudo também se verificou um perfil de QLlum, produzido por neutrófilos
ativados por fMLP, composto por dois picos, sendo que o primeiro se iniciou imediatamente
após a adição do estímulo, e teve seu ápice em torno de 2 minutos, com rápido declínio, e o
segundo, o qual foi um pouco mais duradouro, iniciou logo em seguida e teve seu ápice em
torno de 5 a 8 minutos, após a adição do estímulo. Estes picos correspondem,
respectivamente, à produção de EROs extra e intracelularmente.
O fMLP ativa a produção de EROs imediata ligando-se ao receptor de formilpeptídeo
(FPR), que é um receptor clássico acoplado a proteína G. Após a ligação do fMLP, o receptor
sofre mudança conformacional, que o possibilita a interagir com a proteína G, trocando GDP
por GTP no sítio de ligação da subunidade � e causando a dissociação das subunidades βγ. A
ativação da proteína G desencadeia diversos sistemas de sinalização nos neutrófilos,
envolvendo quinases e fosfolipases. Uma das vias deste processo inicia-se pela ativação de
fosfolipase C (PLC), resultando na hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2), gerando
98
de um lado diacilglicerol (DAG) que ativa PKC e de outro inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) que
promove a liberação de íons cálcio dos estoques intracelulares (Figura 2) (SELVATICI et al.,
2006).
O zimosan opsonizado é um estímulo particulado que induz a fagocitose e ativa o
“burst” oxidativo nos neutrófilos através de receptores de complemento (CR), de
imunoglobulina (FcγR) e de manose (lectinas) (PAVELKOVA; KUBALA 2004; KIM, et al.
2004). A estimulação pelo ZIops leva à ativação de fosfolipase A2 (PLA2), que produz ácidos
graxos insaturados como o ácido aracdônico (AA) e também de fosfolipase C (PLC), que leva
a ativação de PKC (MARIDONNEAU-PARINI et al., 1986; ROSSI, 1986; MUKHERJEE et
al., 1994). De acordo com Cabanis e colaboradores (1996), tanto a produção de AA, quanto a
ativação de PKC estão envolvidas na ativação de NADPH oxidase pelo ZIops, sendo que o
AA está relacionado com a reunião dos componentes do complexo e PKC com a fosforilação
dos mesmo. Alguns autores comprovaram a participação de fosfolipase D (PLD) na ativação
via ZIops. Uma vez ativada, PLD catalisa a hidrólise de fosfatidilcolina para produzir ácido
fosfatídico (PA). PA ativa proteínas quinase que também são capazes de fosforilar
componentes de NADPH oxidase. (Figura 2) (REGIER et al., 2000).
Ao estimular os neutrófilos com zimosan opsonizado, foram visualizados perfis de
quimioluminescência dependentes de luminol e lucigenina característicos, sendo que, para as
duas sonda utilizadas, a produção de QL iniciou-se de um a dois minutos após a adição do
estímulo e persistiu por mais de 30 minutos. Além de prolongada, esta produção de QL pelas
células ocorreu de forma intensa, atingindo os maiores picos observados, quando comparados
àqueles obtidos com os outros estímulos.
Pavelkova e Kubala (2004) observaram perfis de QL semelhantes, e de acordo com
estes autores, ZIops induz uma produção de EROs prolongada, pois ela é iniciada com a
ligação do zimosan aos receptores na membrana do fagócito e finalizada somente após a
99
formação do fagolisossomo. Kopprasch e colaboradores (2003) também verificaram uma
intensa produção de EROs por neutrófilos ativados por ZIops.
O PMA é um estímulo solúvel sintético, conhecido pela sua ação promotora de
tumores. Neutrófilos ativados por ele produziram perfis de quimioluminescência dependente
de luminol e lucigenina, que se iniciaram imediatamente após a adição do estímulo e se
mantiveram persistentes por mais de 20 minutos. A QL produzida por neutrófilos ativados por
PMA atingiu picos elevados, embora consideravelmente menores que aqueles obtidos quando
se utilizou o ZIops, principalmente nos ensaios com luminol. Em seus estudos, Pavelkova e
Kubala (2004), também constataram que o PMA induz uma resposta de QL imediata e
duradoura e que esta, quando amplificada pela lucigenina, não apresenta diferença nos valores
de área integrada de QLluc obtidos de neutrófilos ativados por PMA ou ZIops. Entretanto, nos
ensaios de QLlum, os valores de área integrada, produzidos pela células ativadas por ZIops,
foram aproximadamente 4,5 vezes maiores que aqueles obtidos ao utilizar o PMA como
estímulo.
O PMA ativa o “burst” respiratório nos neutrófilos sem se ligar a um receptor de
membrana, mimetizando o diacilglicerol (DAG), um ativador fisiológico de PKC
(PAVELKOVA; KUBALA, 2004; EDWARDS, 1996), e a ativação forte e contínua desta
molécula de sinalização pelo PMA, promove a intensa e prolongada produção de EROs
observada neste e em outros trabalhos (DE COURSEY; LIGETY, 2005).
Como demonstrado, a ativação do neutrófilo pelos três estímulos culmina na ativação
de PKC. Esta molécula tem participação importante no desencadeamento do “burst”
respiratório por fosforilar resíduos de serina de p47phox do complexo NADPH oxidase e
desencadear o deslocamento de seus componentes citosólicos para a membrana, o que
promove a ativação do mesmo (KIM et al., 2004).
100
5.3. Efeitos do extrato bruto (EB) hidroalcoólico da polpa do fruto de T. indica e de suas
frações sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos ativados
A produção de espécies reativas de oxigênio pelos neutrófilos é de grande importância
para a defesa imunológica do organismo. Em condições fisiológicas normais, diversos
antioxidantes naturais como glutationa peroxidase, catalase, SOD, ácido ascórbico e β-
caroteno controlam a atividade das EROs, impedindo que causem danos ao tecido próprio.
Porém, a intensa ativação neutrofílica promove a liberação de grandes quantidades de EROs,
causando um desequilíbrio entre a quantidade de compostos citotóxicos liberados e de seus
respectivos neutralizantes. O acúmulo de EROs no espaço extracelular pode causar sérios
danos ao tecido próprio e está envolvido na etiologia de diversas doenças humanas, como
esclerose múltipla, derrame cerebral, artrite reumatoide, doenças cardiovasculares e câncer
(FIALKOW et al., 2006). Diante disso, muitas pesquisas têm sido realizadas em busca de
moduladores do “burst” respiratório de neutrófilos ativados, como uma alternativa para
reduzir a inflamação causada por estas células.
Utilizando a técnica de quimioluminescência, é possível avaliar a atividade
antioxidante de compostos sobre neutrófilos ativados. No presente estudo foram empregados
os ensaios de quimioluminescência dependentes de luminol e lucigenina para avaliar a
atividade antioxidante do extrato de tamarindo e das frações provenientes dele. Os neutrófilos
tratados com as diferentes amostras foram submetidos à ativação pelos estímulos ZIops, PMA
ou fMLP e os perfis de QL foram acompanhados.
Como foi abordado anteriormente, por quantificar apenas a produção do radical ânion
superóxido, a lucigenina produz uma quantidade de quimioluminescência significativamente
menor que o luminol, e por outro lado, o fMLP induz uma produção de EROs relativamente
pequena. Portanto, ensaios de QLluc para verificar os efeitos do tamarindo sobre produção de
EROs, por neutrófilos ativados pelo fMLP, foram inviabilizados devido à pequena quantidade
101
de QL produzida, o que tornou o sistema pouco sensível. Desta forma, utilizou-se apenas o
luminol nos experimentos que empregaram como estímulo o fMLP. De acordo com
Kopprasch e colaboradores (2003), a lucigenina não é uma sonda eficiente na quantificação
de EROs produzidas por neutrófilos ativados por fMLP, pois amplifica fracamente este
processo. A avaliação do EB sobre neutrófilos ativados pelos demais estímulos foi realizada
utilizando as duas sondas e no estudo das frações deste extrato, utilizou-se apenas o luminol.
Os resultados dos ensaios de quimioluminescência dependente de luminol e lucigenina
mostraram que o EB de T. indica é hábil em modular, de uma maneira dose dependente, o
“burst” respiratório dos neutrófilos induzido pelos três estímulos avaliados.
Nos ensaios de QLlum, observou-se que o EB possui atividade modulatória da
produção de EROs por neutrófilos estimulados por fMLP, PMA e ZIops de forma dose
dependente. Porém, em baixas concentrações, ele foi mais efetivo na inibição do “burst”
respiratório induzido por PMA e somente em concentrações maiores (acima de 400µg/mL) é
observado um efeito inibitório semelhante para todos os estímulos. Os valores de CI50
comprovam esta diferença na intensidade de inibição promovida pelo extrato ao avaliar os três
estímulos (CI50 PMA< CI50 fMLP < CI50 ZIops) (p<0,05).
Ao avaliar a produção de EROs por neutrófilos na presença de EB utilizando como
sonda a lucigenina, verificou-se novamente um maior efeito modulador do extrato sobre
células ativadas por PMA, onde os valores de CI50 também foram significativamente menores.
Nuñes e colaboradores (2003), utilizando o ensaio de redução do citocromo c,
estudaram uma lactona sesquiterpênica isolada de wunderlichia crulsiana e verificaram efeito
inibitório sobre a produção de radical ânion superóxido por neutrófilos ativados por PMA, OZ
e fMLP. Semelhantemente ao constatado em nosso trabalho, estes autores também
observaram que, o composto foi mais eficaz quando se utilizava o PMA como estímulo. De
102
acordo os autores, o mecanismo de ação da substância para inibir a produção de O2•- por
neutrófilos ativados por PMA pode ser diferente do mecanismo utilizado quando as células
são ativadas via receptores de membrana.
Com o intuito de avaliar se o efeito modulador do extrato bruto de T. indica sobre os
neutrófilos está relacionado com a morte destas células, foram realizados dois ensaios de
citotoxicidade: exclusão ao corante azul de Tripan e de determinação da atividade da enzima
lactato desidrogenase. Nas condições experimentais empregadas, verificou-se que o extrato
bruto, nas maiores concentrações utilizadas nos ensaios de QL, não possui efeito tóxico sobre
os neutrófilos, quando comparado com os controles.
Após verificar o potencial antioxidante do extrato bruto de tamarindo, as frações
aquosa, butanólica, hexano e diclorometano também foram analisadas quanto aos seus efeitos
sobre a produção de QLlum por neutrófilos ativados por ZIops, PMA e fMLP. Para todos os
estímulos utilizados, as frações Aq e But apresentaram pouca inibição da produção de EROs,
sem promover efeito dose-resposta. Não foi possível calcular os valores de CI50 para estas
amostras, devido à pequena inibição. Por outro lado, as frações DCM e H modularam a
produção de QLlum induzida pelos três estímulos e os efeitos foram dependentes da dose.
Diante dos valores de CI50 e de porcentagem de inibição, verificou-se que o maior efeito
modulador é atribuído à fração H.
Ao avaliar a citotoxicidade das frações sobre os neutrófilos, observou-se que as
frações aquosa, butanólica e diclorometano não foram citotóxicas, nas maiores concentrações
empregadas nos ensaios de QL. Analisando a fração hexano, verificou-se que , nas
concentrações 100 e 200�g/mL, esta foi significativamente tóxica para os neutrófilos, em
comparação ao controle negativo (p<0,05). Entretanto, quando empregada em concentrações
inferiores a 50�g/mL, H não causou a morte celular. Como foi demonstrado, os valores de
CI50 obtidos por esta fração nos ensaios de QL foram, em �g/mL, 34,82 ± 4,47 (ZIops), 13,61
103
± 2,99 (PMA) e 5,40 ± 0,97 (fMLP). Estas concentrações são bem inferiores àquelas que
demonstraram citotoxicidade, o que sugere que a fração hexano, em baixas concentrações, é
efetiva para modular a QL produzida por neutrófilos ativados, por algum mecanismo que não
envolva a morte celular.
Os resultados dos ensaios de QL, obtidos neste trabalho, complementam o estudo
realizado por Martinello (2006) que, em ensaios não celulares, verificou que o EB
hidroalcoólico do fruto de T. indica, bem como suas frações, apresentaram capacidade
“scavenger” de radical ânion superóxido e radical hidroxil e atividade antioxidante na inibição
da lipoperoxidação, sendo que nesta última atividade, a fração com maior efeito foi a
butanólica. Além da polpa do fruto, outras partes da planta como semente (TSUDA et al.,
1994), folhas (JOYEUX et al., 1995), flores (AL-FATIMI et al., 2007) e casca do caule
(RAMOS et al., 2003), também tiveram atividade antioxidante comprovada.
Como os três estímulos usados ativam a produção de EROs via diferentes mecanismos
de transdução de sinal, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que o extrato e as frações
de T. indica podem modular pontos nas diferentes vias de sinalização ou inibir um alvo
bioquímico comum como o complexo NADPH oxidase. Outras formas de ação do extrato
podem ser: como bloqueadores de receptores ou como “scavenger” de espécies reativas de
oxigênio. Porém, como as amostras não se tratam de substâncias isoladas e sim de misturas
complexas de diferentes compostos, pode haver várias substâncias atuando de diferentes
formas sobre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos. Embora a atividade “scavenger” do
extrato já tenha sido comprovada, é provável que este também possua ação sobre a produção
de EROs pelo neutrófilo, visto que houve diferenças entre os valores de CI50 e de
porcentagem de inibição obtidos ao utilizar os diferentes estímulos.
O extrato bruto e as frações avaliadas neste estudo possuem em sua composição
concentrações variáveis de flavonóides e outros polifenóis. Estes metabólitos secundários,
104
presentes em uma grande variedade de espécies vegetais, são conhecidos por possuírem, entre
outros efeitos biológicos, atividade antioxidante (PRIOR, 2003; KANASHIRO et al., 2004).
Entretanto, até o momento, não foi possível correlacionar os resultados deste trabalho com a
composição química do extrato, avaliada nos ensaios colorimétricos realizados. A fração But,
que apresentou a maior concentração de flavonóides dentre as analisadas, demonstrou baixo
efeito inibitório sobre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos, com atividade semelhante ao
promovido pela fração Aq, que possui a menor quantidade de flavonóides. As atividades
observadas podem estar relacionadas com outros compostos fenólicos, que estão presentes em
altas concentrações nas frações DCM e H ou ainda com outros tipos de substâncias.
5.4. Efeito do extrato bruto de T. indica sobre a desgranulação
Além da produção de espécies reativas de oxigênio, os neutrófilos utilizam um arsenal
de mecanismos microbicidas não oxidativos para a eliminação de patógenos invasores. Um
desses mecanismos consiste na produção de serino-proteases como a elastase, que são
liberadas no fagossomo e são responsáveis pela degradação do microrganismo englobado
(MAYER-SCHOLL et al., 2004; PHAM, 2006). A elastase, principal protease presente nos
grânulos azurófilos, pode alcançar o espaço extracelular, onde sua atividade é controlada por
inibidores endógenos como α-1-antitripsina, inibidor de leucoprotease secretória (SLPI) e
“elafin” (JOHANSON et al. 2002; FITCH et al., 2006). A ação desses inibidores é
fundamental, pois a elastase não é específica para moléculas dos patógenos, podendo degradar
macromoléculas do tecido hospedeiro como elastina, fibronectina, proteoglicanas e proteínas
do plasma. Entretanto, o aumento da liberação de elastase resulta em um desequilíbrio entre a
quantidade de enzima ativa no espaço extracelular e seus inibidores endógenos. O acúmulo
anormal de elastase causa um número de doenças inflamatórias agudas e crônicas como artrite
reumatóide, enfisema pulmonar e fibrose cística. Portanto, existe um grande número de
105
estudos em busca de inibidores de proteases, para controlar a ação destas enzimas (FOOK et
al., 2005; LEE; DOWNEY, 2001).
Estímulos solúveis como citocinas, endotoxinas, fator de agregação plaquetária (PAF)
e fMLP também induzem a liberação da elastase pelos neutrófilos e são utilizados por
diversos autores em estudos de caracterização desta enzima, bem como de busca por novos
inibidores (SCHORR et al., 2005).
Com o intuito de verificar o efeito do extrato bruto de T. indica sobre uma função
efetora do neutrófilo independente de oxigênio, foi avaliada sua ação sobre a desgranulação
de neutrófilos ativados, utilizando como parâmetro a liberação da enzima elastase. Neste
estudo, utilizou-se o substrato succinil-Ala-Ala-Val-p-nitroanilida (SAAVNA), o qual na
presença da enzima elastase, é degradado formando o produto P-nitroanilina (p-NA), que
pode ser quantificado espectrofotometricamente.
Os neutrófilos foram previamente tratados com citocalasina B (CB), uma substância
que age sobre o citoesqueleto, fazendo com que a célula deixe de ser fagocítica e se torne
secretora na presença de um estímulo (FOOK et al., 2005). O estímulo utilizado para induzir a
desgranulação foi o fMLP. Fosfolipase C e fosfolipase D são ativadas durante a
desgranulação induzida por fMLP (KÁLDI et al., 2002). De acordo com Cabanis e
colaboradores (1996), a indução de liberação de elastase dos grânulos azurófilos pelo fMLP
está relacionada principalmente com a mobilização de Ca2+ intracelular , além de possuir uma
relação com a ativação de PKC .
No presente estudo foi observado que, na presença do extrato bruto de T. indica, a
desgranulação dos neutrófilos ativados por fMLP foi inibida de forma dose dependente, sendo
este efeito significativo em concentrações superiores a 200�g/mL.
Após a verificação deste efeito do extrato, foi realizado um ensaio para avaliar sua
atividade diretamente sobre a enzima elastase, com o intuito de esclarecer o mecanismo de
106
ação do mesmo, isto é, se o extrato age sobre o neutrófilo ou sobre a atividade catalítica da
enzima elastase liberada.
Inibidores de proteases são amplamente distribuídos entre bactérias, animais e plantas,
sendo que, na maioria das famílias de plantas estão presentes em seus órgãos reprodutivos e
de reserva (RYAN, 1990). Muitos inibidores de proteases já foram isolados de sementes de
leguminosas, como por exemplo, das espécies Glycine max, Phaseolus limensis, Phaseolus
vulgaris, Phaseolus angularis e Lens sculenta (HOJIMA et al., 1983).
Para avaliar o efeito do extrato de tamarindo sobre a atividade da elastase, foi utilizado
o sobrenadante dos neutrófilos rico nesta enzima, previamente separado das células
estimuladas. Observou-se que o extrato inibiu a atividade catalítica da enzima, reduzindo
significativamente a formação de p-NA em concentrações superiores a 200�g/mL.
Com esses resultados, é sugerido que o extrato de T. indica influencie no processo de
desgranulação, e que este efeito é parcialmente devido a sua ação sobre a atividade catalítica
da enzima elastase. Fook e colaboradores (2005) isolaram um inibidor de protease da semente
de T. indica que inibiu a liberação de elastase por neutrófilos estimulados por PAF e fMLP,
sendo mais efetivo quando utilizava o estímulo PAF, além de promover forte inibição sobre a
atividade da enzima.
5.5. O fruto de Tamarindus indica L. como fonte natural com atividade antioxidante
O presente trabalho demonstrou que o extrato do fruto de T. indica possui efeito
modulador sobre funções efetoras dependentes e independentes de oxigênio dos neutrófilos. A
comprovação destas propriedades corrobora com outros trabalhos realizados com a mesma
espécie (FOOK et al., 2005; TSUDA et al., 1994; JOYEUX et al., 1995; MARTINELLO,
2006), que comprovaram suas atividades antioxidante e sobre a desgranulação.
107
Como este estudo é realizado com extrato bruto e frações, sem análises de substâncias
isoladas, não é sabido quais metabólitos presentes na polpa do fruto de T. indica são
responsáveis pelos efeitos observados. Para melhor entendimento dos mecanismos de ação,
são necessários estudos com compostos ativos isolados, sendo que a purificação dos mesmos
já está em andamento. Todavia, estudos com extratos brutos são importantes, pois em muitos
casos as atividades biológicas de um produto natural não se devem à ação de um único
componente e sim devido ao efeito sinérgico gerado entre diferentes substâncias
(VERPOORT et al., 2005), além de comprovar que o fruto de tamarindo pode ser utilizado
como uma fonte natural com atividades antioxidante e antiinflamatória.
108
6. Conclusões
109
Diante dos dados apresentados, podemos concluir:
• As condições para o estudo dos efeitos do extrato de T. indica sobre o metabolismo
oxidativo de neutrófilos ativados por fMLP e PMA foram otimizadas e as
concentrações destes estímulos suficientes para estimular 1 x 106 neutrófilos foram,
respectivamente, 10-6M e 10-7M.
• O metabolismo oxidativo produzido pelos diferentes estímulos mostrou perfis de
quimioluminescência (QL) com características cinéticas próprias como: tempo para
iniciar a produção de EROs após a adição do estímulo, a intensidade máxima (pico)
atingida e a duração da produção destas espécies reativas.
• O extrato bruto hidroalcoólico da polpa do fruto de Tamarindus indica L. possui
atividade inibitória sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados por
ZIops, PMA e fMLP de maneira dose dependente, e este efeito é mais pronunciado
quando utiliza-se o PMA como estímulo.
• As frações hexano e diclorometano do extrato de T. indica são capazes de modular
negativamente o metabolismo oxidativo de neutrófilos ativados por ZIops, PMA e
fMLP, de maneira dose dependente. No entanto, as frações aquosa e butanólica
apresentaram um efeito inibitório, deste processo celular, pouco significativo e sem
relação com a dose.
110
• O extrato bruto de T. indica demonstrou efeito inibitório sobre a liberação da enzima
elastase por neutrófilos ativados por fMLP, e este efeito parece ser, parcialmente,
devido à ação do extrato na atividade catalítica da mesma.
• O extrato bruto e as frações aquosa, butanólica e diclorometano não demonstraram
efeitos citotóxicos sobre neutrófilos, avaliados através de experimentos de exclusão ao
corante Azul de Tripan e determinação da enzima LDH.
• A fração hexano apresentou efeitos tóxicos sobre os neutrófilos apenas nas
concentrações 100 e 200µg/mL. Em concentrações inferiores, incluindo aquelas
referentes aos valores de CI50 obtidos, não causou a morte celular.
• Os resultados obtidos neste trabalho dão suporte para que sejam realizados estudos de
purificação do principio ou dos princípios ativos presentes na polpa do fruto de T.
indica, bem como para o planejamento de ensaios que verifiquem seus efeitos in vivo.
Contudo, estes dados já são suficientes para apontar o fruto do tamarindo como fonte
natural com atividades antioxidante e antiinflamatória.
111
7. Referências Bibliográficas
112
ALLEN, R.C.; STJERNHOLM, R.L.; STEELE, R.H.; Evidence for the generation of an electronic state(s) in human polymorphonuclear leukocytes and its participation in bactericidal activity. Biochemical and Biophysical Research communication, New York, v.47, n.4, p.679-684, 1972. AL-FATIMI, M.; WURSTER, M.; SCHRODER, G.; LINDEQUIST, U. Antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of selected medicinal plants from Yemen. Journal of Ethnopharmacology, Lausanne, in press, 2007. ALLEN, R.C.; LOOSE, L.D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochemical and Biophysical Research Communications, New York, v.69, n.1, p.245-252, 1976. ALZUGARAY, D.; ALZUGARAY, C. Flora brasileira. São Paulo: Três Livros e Fascículos, 1984. 205p. ANDERSSON, T.; DAHLGREN, C.; LEW, P.D.; STENDAHI, O. Cell surface expression of fMet-Leu-Phe receptors on human neutrophils. Correlation to changes in the cytosolic free Ca2+ level and action of Phorbol Myristate Acetate. The Journal of Clinical Investigation, New Haven, v.79, n.4, p.1226-1233, 1987. ANIANSSON, H.; STENDAHL, O.; DAHLGREN, C. Comparison between luminol- and lucigenindependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes. Acta Pathologic Microbiologica et Immunolgica Scandinavica., Copenhagen, v.92, p.357-961, 1984. BABIOR, B.M.; KIPNES, R.S.; CURNUTTE, J.T. Biological defense mechanism. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent. The Journal of Clinical Investigation, New Haven, v.52, n.3, p.741-744, 1973. BABIOR, B.M. Oxidants from phagocytes: agents of defence and destruction. Blood, New York, v.64, n.5, p.959-966, 1984. BABIOR, B.M. NADPH oxidase: an update. Blood, New York, v.93, n.5, p.1464-1476, 1999. BABIOR, B.M. Phagocytes and oxidative stress. The American Journal of Medicine, Marion, v.109, n.1, p.33- 44, 2000. BELAAOUAJ, A.A.; McCARTHY, R.; BAUMANN, M.; GAO, Z.; LEY, T.J.; ABRAHAM, S.N.; SHAPIRO, S.D. Mice lacking neutrophil elastase reveal impaired host defense against gram negative bacterial sepsis. Nature Medicine, New York, v.4, n.5, p.615-618, 1998. BERGENDI, L.; BENES, L.; DURACKOVA, Z.; FERENCIK, M. Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sciences, Berlin, v.65, n.18, p.1865-1874, 1999. BORREGAARD, N; COWLAND, J.B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocytes. Blood, New York, v.89, n.10, p.3503-3521, 1997.
113
BRIHEIM, G.; STENDAHL, O.; DAHLGREN, C. Intra- and extracellular events in luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes. Infection and Immunity, Washington, v.45, n.1, p.1-5, 1984. BRINKMANN, V.; REICHARD, U.; GOOSMANN, C.; FAULER, B.; UHLEMANN, Y.; WEISS, D.S.; WEINRAUCH, Y.; ZYCHLINSKY, A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science, Washington, v.303, n.5663, p.1532-1535, 2004. BROWN, E.J. Phagocytosis. BioEssays, Cambridge, v.17, n.2, p.109-117, 1995. BULLEN, J.J., ARMSTRONG, J.A.. The role of lactoferrin in the bactericidal function of polymorphonuclear leucocytes. Immunology, Oxford, v.36, n.4, p.781-791, 1979. BURG, N.D.; PILLINGER, M.H. The neutrophil: Function and regulation in innate and humoral immunity. Clinical Immunology, Oxford, v.99, n.1, p.7-17, 2001. CABANIS, A.; GRESSIER, B.; BRUNET, C.; DINE, T.; LUYCKX, M.; CAZIN, M.CAZIN, J.C. Effect of the protein kinase C inhibitor GF 109 203X on elastase release and respiratory burst of human neutrophils. General Pharmacology, Bristol, v.27, n.8, p.1409-1414, 1996. CALDEFIE-CHÉZET, F.; GUERRY, M.; CHALCHAT, J.C.; FUSILLIER, C.; VASSON, M.P.; GUILLOT, J. Anti-inflammatory effects of Melaleuca alternifolia essential oil on human polymorphonuclear neutrophils and monocytes. Free Radical Research Communication, London, v.38, n.8 pp.805-811, 2004. CALIXTO, J.B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytotherapeutic agents). Brasilian Journal of Medical and Biological Re search, Ribeirão Preto, v.33, n.2, p.179-189, 2000. CATHCART, M.K. Regulation of superoxide anion production by NADPH oxidase in monocytes/macrophages: contributions to atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, New York, v.24, p.23-28, 2003. CHANG, Y.H.; ABDALLA, D.S.P.; SEVANIAN, A. Characterization of cholesterol oxidation products formed by oxidative modification of low density lipoprotein. Free Radical Biology and Medicine, New York, v.23, n.2, p.202-214, 1997. CHEUNG, K.; ARCHIBALD, A.C.; ROBINSON, M.F. The origin of chemiluminescence produced by neutrophils stimulated by opsonized zymosan. The Journal of Immunology, Baltimore, v.130, n.1, p.2324-2339, 1983. CHUA, F.; LAURENT, G.J. Neutrophil elastase mediator of extracellular matrix destruction and accumulation. Proceedings of the American Thoracic Society, New York, v.3, n.5, p.424-427, 2006. CLARK, R.A. The human neutrophil respiratory burst oxidase. Jounal of Infection Disease, Chicago, v.161, n.6, p.1140-1147, 1990. CONDLIFFE, A.M.; WEBB, L.M.C.; FERGUSON, FERGUSON, G.J.; DAVIDSON, K.; TURNER, M.; VIGORITO, E.; MANIFAVA, M.; CHILVERS, E.R.; STEPHENS, L.R.;
114
HAWKINS, P.T. RhoG Regulates the Neutrophil NADPH Oxidase. The Journal of Immunology, Baltimore, v.176, n.1, p. 5314–5320, 2006. DAHLGREN, C.; ANIANSSON, H.; MAGNUSSON, K.E. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infection and Immunity, Washington, v.47, n.1, p.326-328, 1985. DAHLGREN, C.; STENDAHL, O. Role of Myeloperoxidase in Luminol-dependent chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes. Infection and Immunity, Washington, v.39, n.2, p.736-741, 1983. DALLEGRI, F.; OTTONELLO, L. Tissue injury in neutrophilic inflammation. Inflammation research, Basel, v.46, n.10, p.382-391, 1997. DE COURSEY, T.E.; LIGETI, E. Regulation and termination of NADPH oxidase activity. Cellular and Molecular Life Sciences, Basel, v.62, n.19, p.2173-2193, 2005. DE SMET, P.A.G.M. The role of plant-derived drugs and herbal medicines in healthcare. Drugs, New York, v.54, n.6, p.801-840, 1997. DOWD, L.E. Spectrophotometric determination of quercetin. Analytical Chemistry, Washington, v.31, n.7, p.1184-1187, 1959. DUBOIS, M.; GILLES, K.A.; HAMILTON, J.K.; REBBERS, P.A.; SMITH, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, Washington, v.28, n.3, p.350-356, 1956. EDWARDS, S.W. The O2� generating NADPH oxidase of phagocytes: structure and methods of detection. Methods: A companion to methods in enzymology, New York, v.9, n.3 p.563-577, 1996. EI TAHIR, A.; IBRAHIM, A.M.; SATTI, G.M.H.; THEARTNDER, T.G.; KHARAZNI, A.; KHALID, S.A. The potential antileishmanial activity of some sudanese medicinal plants. Phytotherapy Research, London, v.12, n.8, p.576-579, 1998. ELGHETANY, M.T. Surface antigen changes during normal neutrophilic development: a critical review. Blood Cells, Molecules and Diseases, Orlando, v.28, n.2, p.260-274, 2002. FAURSCHOU, M.; BORREGAARD, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes and Infection, Paris, v.5, n.14, p.1317-1327, 2003. FIALKOW, L.; WANG, Y.; DOWNEY, G.P. Reactive oxygen and nitrogen species as signaling molecules regulating neutrophil function. Free Radical Biology and Medicine, New York, v.42, n.2, p.153-164, 2006. FITCH, P.M.; ROGHANIAN, A.; HOWIE, S.E.M.; SALLENAVE, J.M. Human neutrophil elastase inhibitors in innate and adaptive immunity. Biochemical Society Transactions, London, v.34, p.279-282, 2006.
115
FOOK, J.M.S.L.L.; MACEDO, L.L.P.; MOURA, G.E.D.D.; TEIXEIRA, F.M.; OLIVEIRA, A.S.; QUEIROZ, A.F.S.; SALES, M.P. A serine proteinase inhibitor isolated from Tamarindus indica seeds and its effects on the release of human neutrophil elastase. Life Sciences, Berlin, v.76, n.25, p.2881-2891, 2005. FOSSATI, G.; BUCKNALL, R.C.; EDWARDS, S.W. Insoluble and soluble immune complexes activate neutrophils by distinct activation mechanisms: changes in functional responses induced by priming with cytokines. Annals of the Rheumatic Diseases, London, v.61, n.1, p.13-19, 2007. FRANCIS, C.L.; TYAN, T.A.; JONES, B.D.; SMITH, S.J.; FALKOW, S. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature, London, v.364, n.6439, p.639-642, 1993. FUJIE, K.; SHINGUH, Y.; INAMURA, N.; YASUMITSU, R.; OKAMOTO, M.; OKUHARA, M. Release of neutrophil elastase and its role in tissue injury in acute inflammation: effect of the elastase inhibitor, FR134043. European Journal of Pharmacology, Amsterdam, v.374, n.1, p.117-125, 1999. GALÁN, J.E.; PACE, J.; HAYNAN, M.J. Involvement of the epidermal growth factor receptor in the invasion of cultured mammalian cells by Salmonella typhimurium. Nature, Nature, v.357, n.6379, p.588-589, 1992. GANZ, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nature Reviews. Immunology, London, v.3, n.9, p.710-720, 2003. GARWICZ, D.; LENNARTSSON, A.; JACOBSEN, S.E.W.; GULLBERG, U.; LINDMARK, A. Biosynthetic profiles of neutrophil serine proteases in a human bone marrow-derived cellular myeloid differentiation model. Haematologica, Pavia, v.90, n.1, p.38-44, 2005. GESSNER, J.E.; HEIKEN, H.; HAMM, A.; SCHMIDT, R.E. The IgG Fc receptor family. Annals of Hematology, Berlin, v.76, n.6, p.231-248, 1998. GRAPH Pad Prism version 3.00 for Windows. San Diego: Graphpad Software, 1999. (www.graphpad.com). GRÜNWALD, J. The european phytomedicines market: figures, trends, analysis. Herbal Gram, New York, v.34, p.60-65, 1995 HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M. Oxigen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Archives of Biochemistry and Biophysics, New York, v.246, n.2, p.501-514, 1986. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C.; CROSS, C.E. Free radicals, antioxidants, and human disease: Where are we now? Journal of Laboratorial Clinical Medicine, London, v.119, n.6, p.598-620, 1992. HALLIWELL, B. Free radicals, antioxidants and human disease: curiosity, cause or consequence? Lancet, London, v.344, n.8924, p.721-724, 1994.
116
HAVSTEEN, B.H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. Pharmacology and Therapeutics, New York, v.96, n.2, p67-202, 2002. HENSON, P.M. The immunology release of constituents from neutrophils leukocytes. The Journal of Immunology, Baltimore, v.107, n.6, p.1535, 1971. HIBBS, M.S.; BAINTON, D.F. Human neutrophil gelatinase is a component of specific granules. The Journal of Clinical investigation, New Haven, v. 84, n.5, p.1395-1402, 1989. HIRVONEN, T.; VIRTAMO, J.; KORHONEN, P.; ALBANES, D.; PIETINEN, P. Intake of flavonoids, carotenoids, vitamins C and E, and risk of stroke in male smokers. Stroke, New York, v.31, n.10, p.2301-2306, 2000. HOJIMA, Y.; PISANO, J.J.; COCHRANE, C.G. Survey of plant inhibitors of polymorphonuclear leukocyte elastase, pancreatic elastase, cathepsin G, cathepsin B, Hageman factor fragments, and other serine proteinases. Biochemical Pharmacology, Oxford, v.32, n.6, p.985-990, 1983. HOLMES, B.; PAGE, A.R.; GOOD, R.A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. The Journal of Clinical Investigation, New Haven, v.46, n.9, p.1422-1432, 1967. HUNDT, M.; SCHMIDT, R.E. The glycosylphosphatidylinositol-linked Fc gamma receptor III represents the dominant receptor structure for immune complex activation of neutrophils. European Journal of Immunology, Weinheim, v.22, n.3, p.811-816, 1992. INDIK, Z.K.; PARK, J.G.; HUNTER, S.; SCHEREIBER, A.D. The molecular dissection of Fc gamma receptor mediated phagocytosis. Blood, New York, v.86, n.12, p.4389-4399, 1995. JOHANSSON, S.; GORANSSON, U.; LUIJENDIJK, T.; BACKLUND, A.; CLAESON, P.; BOHLIN, L. A neutrophil multitarget functional bioassay to detect anti-inflammatory natural products. Journal of Natural Products, Cincinnati, v.65, n.1, p.32-41, 2002. JOYEUX, M.; MORTIER, F.; FLEURECETIN, J. Screening of antiradical, antilipoperoxidant and hepatoprotective effects of nine plant extracts used in Caribbean folk medicine. Phytotherapy Research, London, v.9, p.228-230, 1995. KABEYA, L.M. Estudo do efeito de cumarinas simples no metabolismo oxidativo de neutrófilos de coelho: aspectos metodológicos, avaliação da atividade e da sua relação com a toxicidade e com propriedades físico-químicas dos compostos. 2002. 140f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Área de concentração: Fármacos e Medicamentos). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2002. KÁLDI, K.; SZEBERÉNYI, J.; RADA, B.K.; KOVÁCS, P.; GEISTZT, M. MÓCSAI, A.; LIGETI, E. Contribution of phopholipase D and a brefeldin A-sensitive ARF to chemoattractant-induced superoxide production and secretion of human neutrophils. Journal of Leukocyte Biology, Washington, v.71, p.695-700, 2002.
117
KANASHIRO, A.; KABEYA, L.M.; POLIZELLO, A.C.; LOPES, N.P.; LOPES, J.L.; LUCISANO-VALIM, Y.M. Inhibitory activity of flavonoids from Lychnophora sp. On generation of reactive oxygen species by neutrophils upon stimulation by immune complexes. Phytotherapy research, London, v.81, n.1, p.61-65, 2004. KANASHIRO, A.; SOUZA, J.G.; KABEYA, L.M.; AZZOLINI, A.E.C.S.; LUCISANO-VALIM, Y.M. Elastase release by stimulated neutrophils inhibited by flavonoids: importance of thecatechol group. Zeitschrift für Naturforschung, Tuebingen, in press, 2007. KANOFSKY, J.R.; WRIGHT, J.; MILES-RICHARDSON, G.E.; TAUBER, A.I. Biochemical requeriments for singlet oxygen production by purified human myeloperoxidase. The Journal of Clinical Investigation, New Haven, v.74, n.4, p.1489-1495, 1984. KIM, J.S.; DIEBOLD, B.A.; KIM, J.I.; KIM, J.; LEE, J.Y.; PARK, J.B. Rho is involved in superoxide formation during phagocytosis of opsonized zymosans. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v. 279, n.20, p.21589-21597, 2004. KITAGAWA, R.R.; RADDI, M.S.G.; KHALIL, N.M.; VILEGAS, W.; FONSECA, L.M. Effect of the isocoumarin paepalantine on the luminol and lucigenin amplified chemiluminescence of rat neutrophils. Biological and Pharmaceutical Bulletin, Tokyo, v.26, n.6, p.905-908, 2003. KLEBANOFF, S.J. Myeloperoxidase: friend and foe. Journal of Leukocyte Biology, New York, v.77, n.5, p.598-625, 2005. KLEIN, J. Defense reactions mediated by phagocytes. In: ____. Immunology. Boston: Blackwell Scientific Publications, 1990. cap.13, p.311-334. KOBAYASHI, S.D.; VOYICH, J.M.; DELEO, F.R. Regulation of the neutrophil-mediated inflammatory response to infection. Microbes and Infection, Paris, v.5, n.14, p.1337-1344, 2003. KOMUTARIN, T.; AZADI, L.; BUTTERWORTH, L.; KEIL, D.; CHITSOMBOON, B.; SUTTAJIT, M.; MEADE, B.J. Extract of the seed coat of Tamarindus indica inhibits nitric oxide production by murine macrophages in vitro and in vivo. Food and Chemical Toxicology, Oxford, v.42, n.4, p.649-658, 2004. KOPPRASCH, S.; PIETZCH, J.; GRAESSLER, J. Validation of different chemilumigenic substrates for detecting extracellular generation of reactive oxygen species by phagocytes and endothelial cells. Luminescence, Chichester, v.18, n.5, p.268-273, 2003. KORN, E.D.; WEISMAN, R.A. Phagocytosis of latex beads by acanthamoeba. II. Electron microscope study of the initial events. The Journal of Cell Biology, New York, v.34, n.1, p.219-227, 1967. KUDOH, S.; KATSUHIKO, S.; YAMADA, M.; LIU, Q.; NAKAJI, S.; SUGAWARA, K. Contribution of nitric oxide syntase to human neutrophil chemiluminescence. Luminescence, Chichester, v.14, n.6, p.335-339, 1999. LANHERS, M.C.; FLEURENTIN, J.; GUILLEMI, F. Tamarindus indica L. Ethnopharmacologia, Paris, v.18, p.42-57, 1996.
118
LEE, W.L.; DOWNEY, G.P. Leukocyte elastase physiological functions and role in acute lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, New York, v.164, n.5, p.896-904, 2001. LEE, W.L.; HARRISON, R.E.; GRINSTEIN, S. Phagocytosis by neutrophils. Microbes and Infection, Paris, v.5, n.14, p.1299-1306, 2003. LEY, K. Integration of inflammatory signals by rolling neutrophils. Immunological Reviews, Copenhagen v.186, p.8-18, 2002. LI, Y.; ZHU, H.; TRUSH, M.A. Detection of mitochondria-derived reactive oxygen species production by the chemilumigenic probes lucigenin and luminol. Biochimica et Biophysica Acta, Amsterdan, v.1428, p.1-12, 1999. LIBRANDI, A.P.L. Investigação da atividade do extrato da polpa de tamarindo (Tamarindus indica L.) sobre o Sistema Complemento: estudos in vitro e em um modelo experimental de hiperlipidemia em hamsters. 2006. 124f. Tese (Doutorado em ciências farmacêuticas, Área de concentração: Produtos Naturais e Sintéticos). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. LIU, Y.; SHAW, S.K; MA, S.; YAHG, L.; LUSCINSKAS, F.W.; PARKOS, C.A. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. The Journal of Immunology, Baltimore, v.172, n.1, p.7-13, 2004. LOCKETT, C.T.; CALVERT, C.C.; GRIVETTI, L.E. Energy and micronutrient composition of dietary and medicinal wild plants consumed during drought: study of Fulani, Northeastern Nigeria. International Journal of Food Sciences and Nutrition, London, v.51, p.195-208, 2000. LOFGREN, R.; SERRANDER, L.; FORSBERG, M.; WILSON, A.; WASTESON, A.; STENDAHL, O. CR3, FcγRIIa and FcγRIIIa induce activation of the respiratory burst in human neutrophils: the role of intracellular Ca2+, phospholipase D and tyrosine phosphorylation. Biochimica et Biophysica Acta, Amsterdam, v.1452, n.1, p.46-59, 1999. LUCISANO, Y.M.; MANTOVANI,B. Lysosomal enzime release from polymorphonuclear leukocytes induced by immune complexes of IgM and IgG. The Journal of Immunology, Baltimore, v.132, n.4, p.2015-2020, 1984. MAITI, R.; DAS, U.K.; GHOSH, D. Attenuation of hyperglycemia and hyperlipidemia in Streptozotocin-induced diabetic rats by aqueous extract of seed of Tamarindus indica. Biological and Pharmaceutical Bulletin, Tokyo, v. 28, n.7, p.1172-1176, 2005. MALECH, H.L.; GALLIN, J.L. Current concepts: Immunology. Neutrophils in human diseases. The New England Journal of Medicine, London, v.317, n.11, p.687-694, 1987. MANTLEY, J.A.; BUSLIG, B.S., Eds. Flavonoids in the Living System. Advances in Experimental Medicine and Biology, New York, Vol. 439, p.278, 1998. MARASCO, W.A.; PHAN, S.H.; KRUTZSCH, H.; SHOWELL, H.J.; FELTNER, D.E.; NAIM, R.; BECKER, E.L.; WARD, P.A. Purification and identification of formyl-methionyl-
119
leucyl-phenylalanine as the major peptide neutrophil chemotactic factor produced by Escherichia coli. The Journal of Biological Chemical, Baltimore, v.259, n.9, p.5430-5439, 1984. MARIDONNEAU-PARINI, I.; TRIGALE, S.M.; TAUBER, A.I.. Identification of distinct activation pathways of the human neutrophil NADPH-oxidase. The Journal of Immunology, Baltimore, v.137, n.9, p.2925-2929, 1986. MARTINELLO, F.; SOARES, S.M.; FRANCO, J.J.; SANTOS, A.C.; SUGOHARA, A.; GARCIA, S.B.; CURTI, C.; UYEMURA, S.A. Hypolipemic and antioxidant activities from Tamarindus indica L. pulp fruit extract in hypercholesterolemic hamsters. Food and Chemical Toxicology, Oxford, v.44, n.6, p810-818, 2005. MARTINELLO, F. Avaliação da atividade biológica do extrato hidroalcoólico de Tamarindus indica L. sobre o metabolismo lipídico e na carcinogênese coloretal em hamster. 2006. 153f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas, Área de concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. MAYER-SCHOLL, A.; AVERHOFF, P.; ZYCHLINSKY, A. How do neutrophils and pathoens interact? Current Opinion in Microbiology, London, v.7, n.1, p.62-66, 2004. MEYDANI, M.; MARTIN, A.; RIBAYA-MERCADO, J.; GONG, J.; BLUMBERG, J.B.; RUSSEL, R.M. β-carotene supplementation increases antioxidant capacity of plasma in older women. Journal of Nutrition, Philadelphia, v.124, n.12, p.2397-2403, 1994. MIDDLETON Jr., E.; KANDASWAMI, T.; Theoharides. The effects of plants flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease and cancer. Pharmacology Reviews, Baltimore, v.52, n.4, p.673- 751, 2000. MOLLINEDO, F.; BORREGAARD, N.; BOXER, L.A. Novel trends in neutrophil structure, function and development. Immunology Today, Amsterdam, v.20, n12, p.535-537, 1999. MUKHERJEE, A. B.; MIELE, L.; PATTABIRAMAN, N. Phospholipase A2 enzymes: regulation and physiological role. Biochemical Pharmacology, Oxford, v. 48, n.1, p.1-10, 1994. MUTHU, S.E.; NANDAKUMAR, S.; RAO, U.A. The effect of methanolic extract of Tamarindus indica Linn. on the growth of clinical isolates of Burkholderia pseudomallei. The Indian Journal of Medical Research, New Delhi, v.122, n.6, p. 525-528, 2005. NUÑEZ, C.V.; ZACHEUC, F.M.; PINTO, E.; ROQUE, N.F.; COLEPICOLOA, P.; BRIGADÃO, M.R.P.L. Sesquiterpene lactone from Wunderlichia crulsiana inhibits the respiratory burst of leukocytes triggered by distinct biochemical pathways. Life Sciences, Berlin, v.73, n.17, p.2161-2169, 2003. O’DOWD, Y.; DRISSB, F.; DANGA, P.M.C.; ELBIMA, C.; GOUGEROT-POCIDALOA, M.A.; PASQUIERA, C.; EL-BENNAA, J. Antioxidant effect of hydroxytyrosol, a polyphenol from olive oil: scavenging of hydrogen peroxide but not superoxide anion produced by human neutrophils. Biochemical Pharmacology, Oxford, v.68, n.10, p.2003-2008, 2004.
120
PAUL, J. Media for culturing cells and tissues II – defined media. In: Cell and tissue culture. 4.ed. Edinburg and London, Livingstone, 1970. p.91E. PAULA, F.S. Efeitos do extrato da polpa do fruto de Tamarindus indica L. sobre funções efetoras de neutrófilos humanos ativados. 2007. 108p. Dissertação (Mestrado em Imunologia básica e aplicada). Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007. PAVELKOVA, M; KUBALA, L. Luminol-, isoluminol- and lucigenin- enhanced chemiluminescence of rat blood phagocytes stimulated with different activators. Luminescence, Chichester, v.19, n.1, p.37-42, 2004. PAYÁ, M.; FERRANDIZ, M.L.; MIRALLEZ, F.; MONTESINOS, C.; UBEDA, A.; ALCARAZ, M.J. Effects of coumarin derivatives on superoxide anion generation. Arzneimittelforschung, Aulendorf, v.43, n.6, p.655-658, 1993. PHAM, C.T.N. Neutrophil serine proteases: specific regulator of inflammation. Nature reviews. Immunology, London, v.6, n.7, p.541-550, 2006. PRIOR, R.L. Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage. The American Journal of Clinical Nutrition, Bethesda, v.78 (supl), p.570-578, 2003. RAMOS, A.; VISOZO, A.; PILOTO, J.; GARCÍA, A.; RODRÍGUEZ, C.A.; RIVERO, R. Screening of antimutagenicity via antioxidant activity in Cuban medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, Lausanne, v.87, p.241-246, 2003. RAVETCH, J.V.; CLYNES, T.A. Divergent roles for Fc receptors and complement in vivo. Annual Review of Immunology, Palo Alto, v.16, p.421-432, 1998. REGIER, D.S.; GREENE, D.G.; SERGEANT, S.; JESAITIS, A.J.; MCPHAIL, L.C. Phosphorylation of p22phox is mediated by phospholipase D-dependent and -independent mechanisms. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, v.275, n.37, p.28406-28412, 2000. ROSS, D.; BRUGGEN, R.V.; MEISCHL, C. Oxidative killing of microbes by neutrophils. Microbes and Infection, Paris, v.5, p.1307-1315, 2003. ROSS, J.A; KASUM, C.M. Dietary flavonoids: bioavailability metabolic effects and safety. Annual Review of Nutrition, Palo Alto, v.22, p.19-34, 2002. RYAN, C.A. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses agaist insects and pathogens. Annual Ver. Phytopathology, New York, v.28, p.425-449, 1990. SCHORR, K.; ROTT, A.; DA COSTA, F.B.; MERFORT, I. Optimisation of a human neutrophil elastase assay and investigation of the effect of sesquiterpene lactones. Biologicals, London, v.33, n.3, p.175-184, 2005. SEGAL, A.W.; JONES, O.T. The subcellular distribution and some properties of the cytochrome b component of the microbicidal oxidase system of human neutrophils. The Biochemical Journal, London, v. 182, n.1, p.181-188, 1979.
121
SEGAL, A.W. How neutrophils kill microbes. Annual review of immunology, Palo Alto, v.23, p.197- 223, 2005. SELVATICI, R.; FALZARANO, S.; MOLLICA, A.; SPISANI, S. Signal transduction pathways triggered by selective formylpeptide analogues in human neutrophils. European Journal of Pharmacology, Amsterdam, v.534, n.1, p.1-11, 2006. SENGELOV, H.; KJELDESEN, L.; KROEZE, W.; BERGER, M.; BORREGAARD, N. Secretory vesicles are the intracellular reservoir of complement receptor 1 in human neutrophils. The Journal of Immunology, Baltimore, v. 153, n.2, p.804-810, 1994. SENGELOV, H. Complement Receptors in neutrophils. Critical Reviews in Immunology, Boca Raton, v.15, n.2, p.107-131, 1995. SINGLENTON, V.L.; ROSSI, J. Colorimetry of total phenolic with phosphomolybdic-phosphotungstic acid agents. American Journal of Enology and Vitic, Corning, v.16, p.144-158, 1965. SPLETTSTOESSER, W.D.; SCHUFF-WERNER, P. Oxidative Stress in Phagocytes - “The Enemy Within”. Microscopy Research and Technique, New York, v.57, n.6, p.441-455, 2002. SREELEKHA, T.T.; VIJAYAKUMAR, T.; ANKANTHIL, R.; VIJAYAN, K.K.; NAIR, M.K. Immunomodulatory effects of a polysaccharide from Tamarindus indica. Anticancer Drugs, Oxford, v.4, n.2, p.209-212, 1993. STAHL, P.D.; EZEKOUITZ, R.A. The manose receptor is a pattern recognition receptor involved in host defense. Current opinion in Immunology, Philadelphia, v.10, n.1, p.50-55, 1998. STEINMETZ, K.A.; POTTER, J.D. Vegetables, fruit and cancer prevention: a review. Journal of the American Dietetic Association, Chicago, v.96, n.10, p.1027-1039, 1996. SWANSON, J.A.; BAER, S.C. Phagocytosis by zippers and triggers. Trends in Cell Biology, Cambridge, v.5, n.3, p.89-92, 1995. THELEN, M.; DEWALD, B.; BAGGIOLINI, M. Neutrophil signal transduction and activation of the respiratory burst. Physiological Reviews, Washington, v.73, n.4, p.797-821, 1993. TKALCEVIC, J.; NOVELLI, M.; PHYLACTIDES, M.; IREDALE, J.P.; SEGAL, A.W.; ROES, J. Impaired immunity and enhanced resistance to endotoxin in the absence of neutrophil elastase and cathepsin G. Immunity, Cambridge, v.12, n.2, p.201-210, 2000. TSUDA, T.; WATANABLE, M.; OHSHIMA, K.; YAMAMOTO, A.; KAWAKISHI, S.; OSAWA, T. Antioxidative components isolated from the seed of tamarind (Tamarindus indica L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, v.42, n.12, p.2671-2674, 1994.
122
UNKELESS, J.C.; SHEN, Z.; LIN, C.W.; DEBEUS, E. Function of human Fc gamma RII and Fc gama RIIIB. Seminars in Immunology, Philadelphia, v.7, n.1, p.37-44, 1995. VERPOORT, R.; CHOI, Y.H.; KIM, H.K. Ethnopharmacology and systems biology: A perfect holistic match. Journal of Ethnopharmacology, Lausanne, v.100, n.1, p.53-56, 2005. WEINRAUCH, Y.; FOREMAN, A.; SHU, C.; ZAREMBER, K.; LEVY, O.; ELSBACH, P.; WEISS, J. Extracellular accumulation of potentially microbicidal/permeability-increasing protein and p 15s in an envolving sterile rabbit peritoneal inflammatory exudates. The Journal of Clinical Investigation, New Haven, v.95, n.4, p.1916-1924, 1995. WEINRAUCH, Y.; DRUJAN, D.; SHAPIRO, S.D.; WEISS, J.; ZYCHLINSKY, A. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature, Michigan, v.417, n.6884, p.91-94, 2002. WEISS, J.; FRANSON, R.C.; BECKERDITE, S.; SCHMEIDLER, K., ELSBACH, P. Partial characterization and purification of a rabbit granulocyte factor that increases permeability of Escherichia coli. The Journal of Clinical Investigation, New Haven, v.55, n.1, p.33-42, 1975. WIEDOW, O.; MEYER-HOFFERT, U. Neutrophil serine proteases: potential key regulators of cell signaling during inflammation. Journal of Internal Medicine, Oxford, v.257, n.4, p.319-328, 2005. ZAGO, M.A.; FALCÃO, R.P.; PASQUINI, R. Hematologia: Fundamentos e prática. 1ª ed. São Paulo: Atheneu, 2001. p.9-43. ZYCHLINSKY, A.; WEINRAUCH, Y.; WEISS, J. Forum in immunology. Introduction: Forum in immunology on neutrophils. Microbes and infection, Paris, v.5, n.14, p.1289-1291, 2003.
123
8. Anexos
124
ANEXO A – Metodologias Utilizadas para determinar as quantidades de açúcares totais, compostos fenólicos e flavonóides no extrato bruto de tamarindo e nas frações. Ensaios realizados por Martinello (2006).
1. Determinação de açúcares totais
Utilizou-se a reação do fenol-sulfúrico, descrita por Dubois e colaboradores (1956),
para fazer as dosagens de açúcares totais do extrato bruto e das frações. Nesta reação,
açúcares simples, polissacarídeos e seus derivados são hidrolisados pelo ácido sulfúrico e os
produtos formados sofrem complexação com o fenol, mudando a cor da solução.
Resumidamente, em um tubo de reação contendo 500�L de amostra, branco ou padrão de
glicose, adicionou-se solução de fenol 0,71% (p/v) e ácido sulfúrico fumegante 71% (v/v).
Fez-se a determinação das hexoses em espectrofotômetro Beckaman DU-70 em comprimento
de onda de 490nm.
2. Dosagem dos compostos fenólicos totais
Para quantificar os compostos fenólicos totais presentes nas amostras, utilizou-se o
método descrito por Folin-Ciocalteau (SINGLENTON; ROSSI, 1965). Utilizou-se o reagente
de Folin, que sofre redução na presença de compostos fenólicos, formando um composto com
absorção máxima em 725nm. Em um tubo de reação contendo 50�L de amostra, branco ou
padrão de ácido gálico, adicionou-se ácido acético 0,35% (v/v), reagente de Folin-Ciocalteau
5% (v/v), carbonato de sódio saturado 1,75% (v/v) e água destilada q.s.p.. Incubou-se por 90
minutos na ausência de luz e, em seguida, fez-se a determinação da absorvância em
espectrofotômetro Beckaman DU-70 em comprimento de onda de 725nm.
125
3. Determinação dos flavonóides totais
As determinações de flavonóides totais das amostras foram realizadas de acordo com o
método descrito por Dowd (1959), que tem como princípio a formação de complexos estáveis
entre cátions alumínio e os flavonóides. Ao meio de reação contendo 200�L de amostra,
branco ou padrão de quercetina (flavonóide), adicionou-se 60�L de ácido acético glacial, 1mL
de solução de piridina:H2O:AlCl3 12% (17:80:3) e 1,24mL de DMSO:H2O (1:1). O produto
da reação foi determinado em espectrofotômetro Beckaman DU-70 em comprimento de onda
de 420nm.
126
ANEXO B – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
127
ANEXO C – Termo de consentimento livre e esclarecido assinado pelos doadores de sangue voluntários.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu________________________________________________________________, abaixo assinado, tenho sido devidamente esclarecido sobre todas as condições que constam do documento “ESCLARECIMENTOS AO SUJEITO DA PESQUISA”, de que trata o projeto de pesquisa intitulado “ ESTUDO DO EFEITO DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE Tamarindus indica L. SOBRE O METABOLISMO OXIDATIVO DE NEUTRÓFILOS ESTIMULADOS” que tem como pesquisadores responsáveis Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim e Fabiana da Silva Paula especialmente no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, aos riscos e aos benefícios, bem como forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram assegurados, a seguir relacionados:
1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos benefícios e de outras situações relacionadas com a pesquisa. As dúvidas poderão ser esclarecidas com os responsáveis pela pesquisa no Laboratório de Bioquímica do Departamento de Física e Química da FCFRP – USP (Av. Café, S/N) ou pelos telefones: 3602-4212 / 3602-4434.
2. A liberdade de retirar o meu consentimento e deixar de participar do estudo, a qualquer momento, sem que isso me traga prejuízo.
3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada a minha privacidade.
4. O ressarcimento de eventuais despesas decorrentes da minha participação no projeto.
Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade em participar do referido projeto.
Ribeirão Preto,_______de________________ de _______.
______________________________ Assinatura do voluntário
128
ESCLARECIMENTO AO SUJEITO DA PESQUISA
Título do Projeto: ESTUDO DO EFEITO DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE Tamarindus indica L. SOBRE O METABOLISMO OXIDATIVO DE NEUTRÓFILOS ESTIMULADOS
Pesquisadores responsáveis: Profa. Dra. Yara Maria Lucisano Valim Fabiana da Silva Paula Ao voluntário:
Nosso grupo de trabalho está realizando um estudo sobre a atividade antioxidante do tamarindo. O neutrófilo é uma célula do sistema imune responsável pelo início da inflamação e libera radicais livres para combater os microrganismos patogênicos, os quais quando produzidos de forma desordenada são prejudiciais à nossa saúde. Nosso estudo analisará se o tamarindo é capaz de reduzir a liberação desses radicais livres. Isso é de grande importância, pois, se comprovada a eficácia do tamarindo como antioxidante, futuramente, este poderá ser empregado em tratamentos de doenças inflamatórias. Assim, solicitamos a sua permissão para colher sangue para estudar melhor o neutrófilo. O desconforto que o paciente poderá apresentar está relacionado apenas com a picada da agulha durante a coleta do sangue. As dúvidas poderão ser esclarecidas com os responsáveis pela pesquisa no Laboratório de Bioquímica do Departamento de Física e Química da FCFRP – USP (Av. Café, S/N) ou pelos telefones: 3602-4212 / 3602-4434.
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo
