EGFR, HPV E LESÕES DISPLÁSICAS DO COLO DO ÚTERO · este mestrado que contribuiu para o meu crescimento pessoal e curricular. Ao Dr. Horácio Scigliano, por toda a ... 3.1. HPV

Alice Manuela Santos Alves

EGFR, HPV E LESÕES DISPLÁSICAS DO COLO DO ÚTERO

Dissertação de Candidatura ao grau de

Mestre em Oncologia, submetida ao Instituto

de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da

Universidade do Porto.

Orientador – Prof. Doutor Rui Manuel de

Medeiros Melo Silva

Categoria – Prof. Associado convidado

Afiliação – Instituto de Ciências Biomédicas

Abel Salazar da Universidade do Porto.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que directa ou indirectamente contribuíram para a realização

deste trabalho, indispensável para o crescimento do meu conhecimento científico. Ao

Prof. Doutor Rui Medeiros, meu orientador neste trabalho, pela oportunidade, orientação,

conhecimentos transmitidos e disponibilidade demonstrada em todo o desenvolvimento

desta tese.

Quero também agradecer ao Laboratório de Anatomia Patológica Dr.Albino Oliveira,

e ao meu chefe, Dr. Albino Oliveira pela disponibilidade dos meios necessários no serviço

para a realização deste trabalho. Quero agradecer também a oportunidade de frequentar

este mestrado que contribuiu para o meu crescimento pessoal e curricular. Ao Dr.

Horácio Scigliano, por toda a disponibilidade, ajuda, pelas indispensáveis sugestões que

contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho de investigação.

A toda a comissão coordenadora do Curso de Mestrado em Oncologia, assim como

a todos os docentes deste mestrado, pelo empenho demonstrado e excelente modo de

transmissão dos conhecimentos científicos. Às minhas amigas e companheiras de

laboratório, agradeço a ajuda, a força, a paciência, a simpatia, o respeito e o bom

ambiente de trabalho. Em especial, à Sandra e à Joana pela disponibilidade e ajuda no

laboratório de imunohistoquímica. E à Margarida pela falta de atenção que lhe “roubei”. À

Estela, Paula, Ana, Sofia e Marta obrigada pelo incentivo, coragem, carinho e amizade

que desde sempre demonstraram. Obrigada “meninas do LAO”!

À Jani Silva e à Joana Mendes obrigada pela atenção, tempo e valiosas

observações neste estudo, à Judite pelo companheirismo, pelas ajudas espontâneas,

pela presença e coragem que transmite. À Liliana, à Rita, à Estela Teixeira, à Cristina e à

Elsa pelo companheirismo, pelo carinho e amizade que se reforçou nestes períodos. À

Sara Ricardo, à Soledad Almeida ao Ricardo Correia, e ao Sr. Fernando pelo contributo

indispensável de sugestões e material laboratorial.

Ao Joaquim pela incansável partilha e ajuda nesta tese, sem a tua disponibilidade

teria sido muito mais difícil, um obrigada muito sincero e especial.

Finalmente, uma palavra aos meus pais, à minha irmã e ao João por se esforçarem

inesgotavelmente para me proporcionar uma vida melhor…Obrigada pelo amor, valores,

educação, apoio, coragem, paciência…enfim…Não posso deixar de referir o vosso

exemplo, que mesmo nos piores dias, que tudo parece escuro, com uma força de

vontade extraordinária e trabalho honesto, tudo se consegue… Não há dias maus, há

dias menos bons!

Obrigada!

RESUMO

O Cancro do Colo do Útero (CCU) é uma das neoplasias mais frequente a nível

mundial. A presença da infecção pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) de alto risco é o

principal factor de risco para o seu desenvolvimento.

Nesta patologia, o diagnóstico precoce das lesões pré-neoplásicas, é essencial

para um melhor prognóstico. Neste sentido, as técnicas de imunohistoquímica são cada

vez mais utilizadas como método auxiliar de diagnóstico no CCU. Ao disponibilizar

marcadores biológicos de detecção, esta técnica contribui para o aumento da

sensibilidade do rastreio cervico-vaginal, definindo critérios mais precisos que os

actualmente utilizados.

Assim, sabendo que o HPV provoca alterações ao nível do ciclo celular por

interacção com o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), pretende-se

analisar a adequação da técnica de quantificação da expressão de EGFR em citologia

como método de rastreio de lesões displásicas do colo do útero.

Com o intuito de melhorar a precisão do diagnóstico citológico diminuindo a

subjectividade de interpretação por parte do profissional citopatologista, o principal

objectivo deste estudo consistiu em determinar se o marcador EGFR poderia ser

indicativo do tipo de lesão displásica diagnosticada pelo exame de Papanicolaou.

Avaliou-se em que medida (i) o método por marcação com EGFR seria fiável para a

identificação de células displásicas, (ii) a quantidade de células displásicas seria

indicativa do tipo de lesão e/ou HPV e (iii) o método em estudo seria equiparável a outros

métodos actualmente reconhecidos.

Os resultados obtidos sugerem que o marcador EGFR poderá ser um potencial

classificador na identificação de células displásicas, apresentando uma sensibilidade de

78,5 % acompanhada de uma especificidade de 92,3%.

A quantificação da expressão do marcador EGFR apresentou-se estatisticamente

homogénea quando comparada entre os diferentes diagnósticos citológicos para um nível

de confiança de 95% ( (2) = 1,759, p = 0.415). O mesmo resultado foi obtido face ao

tipo/risco de genótipo de HPV ( (3) = 3,963, p = 0.265) e ao diagnóstico histológico (

) = 5,084, p = 0.079). No entanto, neste último caso, a quantificação da expressão

do EGFR é sugestivamente maior nos casos de CINIII.

Em conclusão, o EGFR representa um classificador aceitável para a identificação

de células displásicas e, após quantificação da expressão de EGFR, que este poderá ser

um potencial método de screening para detecção de lesões de CIN III.

ABSTRACT

Cervical Cancer is one of the most common malignancies worldwide. The presence

of high risk human papillomavirus infections is the main risk factor for its development.

Within this pathology, early diagnosis of precancerous lesions is essential for better

prognosis. In this regard, immunohistochemical techniques are increasingly used as

auxiliary diagnostic methods for the cervical cancer. By providing biomarkers detections,

this technique contributes to an increase of the sensitivity of the cervix screening, defining

a more precise criteria than those currently used.

Knowing that HPV changes the cell cycle by interacting with the epidermal growth

factor receptor (EGFR), it is intended to assess the suitability of the technique to quantify

the expression of EGFR in cytology as a method of screening for dysplastic lesions of the

cervix.

In order to improve the accuracy of cytological diagnosis by reducing the subjectivity

introduced by the interpretation of the cytopathologist professional, the main objective of

this study was to determine whether the EGFR marker may be suggestive of the type of

dysplastic lesions diagnosed by Pap smear. For this purpose it was evaluated the extent

to which (i) the EGFR marking would be reliable for identifying dysplastic cells, (ii) the

quantity of dysplastic cells would be suggestive of the type of lesion and / or HPV and (iii)

the studied method would be comparable to other methods currently recognized.

The results revealed that the EGFR marker would be a potential classifier for

dysplastic cells, showing a sensitivity of 78.5% alongside with a specificity of 92.3%.

In turn, the quantification of the expression of EGFR marker had a statistically

homogeneous distribution, when compared between the different cytological diagnoses,

for a confidence level of 95% ( (2) = 1,759, p = 0.415, N = 98). The same result was

obtained regarding the type / risk HPV genotype ( (3) = 3,963, p = 0.265, N = 72) and

the histological diagnosis ( ) = 5,084, p = 0.079, N = 98). In the last case however,

the quantification of the EGFR expression is suggestively higher for CINIII.

Thus, it was concluded that EGFR represents an acceptable classifier to identify

dysplastic cells and after quantifying the expression of EGFR marker, this would be a

potential screening method for detection of CIN III lesions.

i

ÍNDICE

1. Introdução ..................................................................................................... 1

2. EnquadramentoTeórico ................................................................................ 3

2.1. Cancro do Colo do Útero .......................................................................... 3

2.2. Aspectos Epidemiológicos ....................................................................... 3

2.3. Etiopatogenia ........................................................................................... 4

2.4. Histopatologia .......................................................................................... 6

2.4.1. Morfologia ............................................................................................ 7

2.5. Citopatologia ............................................................................................ 8

3. Papiloma Vírus Humano ..............................................................................11

3.1. HPV - Definição ......................................................................................11

3.2. A Organização Genómica do HPV ..........................................................12

3.3. Carcinogénese Induzida pela Infecção por HPV .....................................13

4. Biopatologia do Cancro ...............................................................................16

4.1. O Ciclo Celular ........................................................................................17

4.2. Inibidores das Cinases Dependentes das Ciclinas ..................................18

4.2.1. Proteína p16 no ciclo celular ...............................................................18

4.3. Proliferação celular .................................................................................19

4.3.1. EGFR no ciclo celular ..........................................................................19

5. Objectivos .....................................................................................................21

6. Material e Métodos .......................................................................................22

6.1. População em Estudo .............................................................................23

6.2. Procedimento Laboratorial ......................................................................24

6.2.1. Detecção e genotipagem do HPV .......................................................24

6.2.2. Imunohistoquímica ..............................................................................28

6.2.3. Avaliação dos imunomarcadores .........................................................29

6.2.4. Análise Estatística ...............................................................................32

ii

7. Resultados ....................................................................................................33

7.1. Análise de Dados ....................................................................................33

7.1.1. Descrição da base de dados ...............................................................33

7.1.2. Caracterização dos casos clínicos analisados .....................................34

7.1.3. Validação estatística dos objectivos do estudo ....................................37

8. Discussão de Resultados ............................................................................46

9. Conclusão e Perspectivas futuras ..............................................................49

Referências Bibliográficas ...................................................................................51

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ASCUS – Células escamosas atípicas de significado indeterminado

CCU – Cancro do Colo do Útero

CIN - Neoplasia Intraepitelial Cervical

CCV – Citologia Cervico-vaginal

CDKs - Ciclina / cinases dependentes de ciclinas

DNA –Ácido desoxirribonucleico

DST – Doença Sexualmente Transmissível

DO - Densidade Óptica

E2F – Factor de Transcrição

H0 – Hipótese nula

HE - Hematoxilina-Eosina

HIV –Vírus da Imunodeficiência Humana

HPV – Papilomavírus Humano

HSV – Herpes vírus Simples

HSIL – Lesão pavimentosa intra-epitelial de alto Grau

IARC – Internacional Agency for Research on Cancer

MHC-I - Complexo de Histocompatibilidade I

LCR – Região Regulatória

LSIL – Lesão pavimentosa intra-epitelial de baixo grau

OMS – Organização Mundial de Saúde

ORF – Regiões de leitura aberta

PBS – Tampão fosfato

pb – Pares de base

PCR – Polymerase Chain Reaction

p 16 – Proteína p16

pRB – Proteína do retinoblastoma

p53 - Proteína supressora tumoral

RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA - Ácido Ribonucleico SIL - Lesão intra-epitelial escamosa

TGF-α - Factor de crescimento transformante alfa

VEGF - Factor de crescimento vascular endotelial


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1. INTRODUÇÃO

A elevada incidência do CCU, com mais de 530.000 novos casos em todo mundo,

constitui um grave problema de Saúde Publica Mundial (International Agency for

Research on Cancer 2008).

Apesar dos avanços científicos no diagnóstico e tratamento de várias neoplasias

malignas, as doentes com CCU continuam a ocupar o segundo lugar das neoplasias mais

frequente no sexo feminino em todo mundo (International Agency for Research on Cancer

2008).

Nesta patologia, o diagnóstico precoce das lesões pré-neoplásicas, é essencial

para um melhor prognóstico e consequentemente útil para a diminuição da mortalidade

por esta causa. Com a introdução de programas de rastreio pelo exame de Papanicolaou

a incidência de CCU tem diminuído. No entanto, apesar do êxito destes programas, o

screening ginecológico tem limitações significativas no que diz respeito à sensibilidade e

especificidade de detecção das lesões pré-neoplásicas, em parte devido à subjectividade

dos critérios morfológicos utilizados (Denton, Bergeron et al. 2010).

Com o avanço existente no estudo dos mecanismos de carcinogénese

nomeadamente na regulação do ciclo celular, as técnicas de imunohistoquímica são cada

vez mais utilizadas como método auxiliar de diagnóstico em patologias do colo do útero

(Shen, Shui et al. 2008). Ao disponibilizar de marcadores biológicos de detecção, esta

técnica contribui para o aumento da sensibilidade do rastreio cervico-vaginal, definindo

critérios mais precisos que os actualmente utilizados para a identificação de lesões pré-

neoplásicas e neoplásicas do colo do útero. Assim, usando as metodologias indicadas,

este estudo propôs-se investigar características morfológicas, moleculares e

imunocitoquímicas das lesões displásicas do colo do útero com o objectivo de contribuir

para novas estratégias de diagnóstico citológico.

Neste sentido, sabendo que o HPV provoca alteração ao nível do ciclo celular por

interacção com o EGFR, pretende-se analisar a adequação da técnica de

imunomarcação por EGFR em citologia como método de rastreio de lesões displásicas

do colo do útero. Esta análise é realizada comparando a técnica de EGFR com as actuais

metodologias utilizadas no rastreio cervico-vaginal, nomeadamente o screening pelo

exame de Papanicolaou, associado ou não aos testes de detecção de HPV e com o

recente teste de detecção da p16 para identificação de lesões de alto grau.

Assim, tem-se como principal objectivo deste estudo, determinar se o marcador

EGFR pode ser indicativo do tipo de lesão displásica diagnosticada pelo exame de

Papanicolaou.


2/53

Para tal, o documento apresentado foi estruturado da seguinte forma: a Introdução

ao tema com uma breve apresentação do status of the art, seguindo do Enquadramento

Teórico que faz uma abordagem geral dos aspectos teóricos necessários para a

concretização dos objectivos de estudo. No capítulo dos Objectivos apresenta-se o

objectivo geral e os objectivos específicos, a partir dos quais foram formuladas as

hipóteses do estudo.

O capítulo do Material e Métodos apresenta todos os procedimentos metodológicos

laboratoriais. Aqui é feita uma breve descrição da base de dados assim como, a

caracterização dos casos clínicos analisados. A validação estatística dos objectivos do

estudo foi apresentada sobre a forma de gráficos e tabelas de apoio no capítulo dos

Resultados.

A Discussão dos Resultados foi feita segundo os resultados estatísticos

apresentados. Por fim, o último capítulo é dedicado à Conclusão.


3/53

2. ENQUADRAMENTOTEÓRICO

2.1. CANCRO DO COLO DO ÚTERO

O CCU continua a ser uma das principais causas de morte por cancro no sexo

feminino, especialmente em países subdesenvolvidos (Policht and Song 2010).

Contrariamente a outros tipos de cancro, o CCU, é prevenível, já que se trata de

uma patologia com um longo período de lesões precursoras que antecedem a neoplasia

invasora (Bibbo and Wilbur 2008; Kumar, Abbas et al. 2010). Neste sentido, surgem os

programas de rastreio para detecção das suas lesões precursoras, que actualmente se

baseiam na avaliação subjectiva pelo exame de Papanicolaou associado ou não, aos

testes de HPV (Salcedo M, Silveira et al. 2008).

Nenhuma outra neoplasia documenta melhor os notáveis efeitos da prevenção, do

diagnóstico precoce e do tratamento curativo sobre a taxa de mortalidade do que o CCU

e, daí, a importância na continuidade da investigação na área do diagnóstico precoce

(Kumar, Abbas et al. 2010).

2.2. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS

O CCU é o segundo cancro mais frequente no sexo feminino e representa cerca de

13% de todos os cancros na mulher. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS),

em 2008, foram diagnosticados 530.000 novos casos, dos quais 85% foram

diagnosticados em países subdesenvolvidos onde não se aplicam programas de rastreio,

representando um grave problema de saúde pública mundial (International Agency for

Research on Cancer 2008).


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Figura 1-Taxa de incidência mundial do Cancro do Colo do Útero, por 100.000 habitantes, em 2008 (adaptado de International Agency for Research on Cancer 2008).

Esta neoplasia apresenta uma distribuição geográfica variável (Figura 1).

Aproximadamente 88% das mortes ocorrem em países em vias de desenvolvimento

(América Latina, África, China e Índia), onde a incidência da doença é maior, enquanto

que em países desenvolvidos (Europa Ocidental e América do Norte), os programas de

rastreio já permitem a sua detecção precoce e como tal a incidência da doença é menor

(Clifford, Smith et al. 2003; International Agency for Research on Cancer 2008).

Em Portugal, em 2008, foram diagnosticados 949 novos casos e 346 mortes por

esta doença, o que corresponde a uma taxa de incidência de 12,2/100.000 e a uma taxa

de mortalidade de 3,6/100.000, representando o valor mais elevado da Europa Ocidental

(Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2008; International Agency for Research on

Cancer 2008).

Os dados disponíveis apontam para que os dois grandes picos de incidência no

nosso país ocorram em mulheres entre os 40-45 anos e entre os 55-65 anos (Ramada

and Medeiros 2007).

2.3. ETIOPATOGENIA

A patogénese do CCU tem sido delineada por uma série de factores

epidemiológicos, clínico-patológicos, e estudos de genética molecular. Vários estudos

têm demonstrado que o HPV é um factor etiológico necessário para o desenvolvimento

desta neoplasia, embora não seja suficiente (Sociedade Portuguesa de Papillomavírus

2004; Ramada and Medeiros 2007).


5/53

Esta ligação (HPV e cancro) foi pela primeira vez demonstrada, no início dos anos

80, por Harald zur Hausen, um virologista alemão, cuja descoberta lhe valeu a atribuição

do prémio Nobel da Medicina em 2008 (Zur Hausen 2002).

A maior parte das mulheres com CCU estão infectadas por estirpes de HPV de alto

risco e a sua prevalência é distinta em diferentes populações. Segundo Medeiros et al, o

HPV de alto risco com maior incidência em Portugal é o 16 (Medeiros et al 2005).

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que o efeito carcinogénico do HPV de

alto risco está relacionado com as oncoproteinas virais E6 e E7 que interagem, inactivam

e degradam proteínas de genes oncosupressores celulares como a proteína supressora

tumoral (p53) e a proteína do retinoblastoma (pRb) permitindo a proliferação celular

descontrolada (Zur Hausen 2002; Longworth and Laimins 2004).

Em 1996, a OMS reconheceu o HPV como uma causa importante para o

desenvolvimento de CCU o que teve implicações importantes, não só relativamente à

etiologia da doença, mas, também, na implementação de testes de detecção e tipagem

do HPV, como adjuvantes no rastreio deste tipo de cancro (Burd 2003).

Segundo a Sociedade Portuguesa de Papillomavírus, em 2004, a infecção por HPV,

por si só, não leva ao desenvolvimento de cancro. No entanto, 99,7% das mulheres com

CCU estão infectadas por estirpes de HPV de alto risco (Sociedade Portuguesa de

Ginécologia 2007). E a infecção com múltiplos tipos de HPV tende a aumentar a

gravidade da doença (Zur Hausen 2002).

A infecção por HPV é muito comum em mulheres jovens sexualmente activas,

apresentando uma prevalência de 20-46% (Zur Hausen 2002). A transmissão sexual

contribui para este facto, ocorrendo por contacto cutâneo, embora a transmissão não

sexual via fómites também possa ocorrer (Burd 2003). Estão estabelecidos alguns

factores de risco que favorecem esta infecção, nomeadamente factores relacionados com

a actividade sexual, designadamente a idade precoce da primeira relação sexual. O risco

de infecção é maior quando a mulher, ou o parceiro, tem ou teve, parceiros sexuais

múltiplos. Além disso, o uso de hormonas esteróides e a paridade também influenciam o

desenvolvimento deste tipo de neoplasia, bem como o consumo de tabaco, por diminuir a

resposta imunitária e por apresentar actividade mutagénica (Kirwan and Herrington 2001;

Burd 2003; Trottier and Franco 2006).

A imunossupressão está associada à persistência do ácido desoxirribonucleico

(DNA) viral e à progressão das lesões. A maioria das infecções são subclínicas, podendo,

inicialmente, resultar em lesões de baixo grau. Os mecanismos pelos quais o sistema

imunitário elimina a infecção por HPV ainda não estão completamente esclarecidos.

Sabe-se, no entanto, que há infecções que não são totalmente eliminadas pelo sistema


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imunitário, podendo persistir por longos períodos e causar doença clínica (Longworth and

Laimins 2004; Trottier and Franco 2006).

Para além das imunodeficiências, também a presença de outros agentes

infecciosos responsáveis por doenças sexualmente transmissíveis (DST), como por

exemplo o Herpesvirus Simples II (HSV-II), Chlamydia Trachomatis e o Citomegalovírus,

podem actuar como co-factores no desenvolvimento de CCU. (Camara, Cruz et al.;

Sociedade Portuguesa de Papillomavírus 2004; Sociedade Portuguesa de Ginécologia

2007).

Por fim, factores genéticos como haplótipos HLA (antigénios leucocitários humanos)

específicos,polimorfismos em alguns genes envolvidos na regulação do ciclo celular e

reparação do DNA têm sido também associados ao desenvolvimento desta neoplasia

(Jee, Won et al. 2004). A Figura 2 representa o modelo etiológico da infecção por HPV e

CCU, evidenciando o papel das infecções persistentes e dos co-factores na mediação da

progressão das lesões.

Figura 2- Modelo etiológico da infecção por HPV e Cancro do Colo do Útero, ilustrando o papel das infecções persistentes e dos co-factores na mediação da progressão das lesões. (adaptado de

Franco et al. 2001).

2.4. HISTOPATOLOGIA

A classificação das lesões pré-neoplásicas do colo do útero tem evoluído ao longo

do tempo e já foram classificadas de diversas formas. A classificação mais antiga

consiste no sistema displasia/ carcinoma in situ, no qual a displasia leve está situada

numa das extremidades e a displasia grave/ carcinoma in situ encontra-se na outra


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extremidade. Este sistema de classificação foi seguido pelo sistema de classificação de

neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) na qual a displasia leve foi denominada NIC de

grau I, displasia moderada NIC de grau II e displasia grave denominado NIC de grau III

(Stevens, Lowe et al. 2003; Coleman and Tsongalis 2009; Kumar, Abbas et al. 2010).

Actualmente o sistema de classificação deve ser expresso, preferencialmente,

segundo a classificação de Richart, em 1968, para neoplasia intraepitelial. A maioria dos

médicos estão familiarizados com este sistema classificativo, que parece traduzir melhor

o comportamento biológico das lesões (Tabela 1) (Stevens, Lowe et al. 2003; Coleman

and Tsongalis 2009; Kumar, Abbas et al. 2010).

Tabela 1 - Classificação de Richart

Neoplasia Intraepitelial Cervical

Classificação

CIN I Grau I

CIN II Grau II

CIN III / CIS Grau III

2.4.1. MORFOLOGIA

O diagnóstico de lesão intra-epitelial escamosa (SIL) é baseado na identificação de

atipia nuclear caracterizada pelo aumento nuclear, hipercromasia, presença de grânulos

de cromatina grosseira, e variação de tamanho e forma nuclear. As alterações nucleares

podem ser acompanhadas por halos citoplasmáticos, indicando o rompimento do

citoesqueleto antes da libertação do vírus no meio ambiente. Estas alterações nucleares

e halos perinucleares são chamados de atipia coilocítica (Stevens, Lowe et al. 2003;

Kumar, Abbas et al. 2010).

A alteração seguinte do espectro consiste no aparecimento de células atípicas nas

camadas mais baixas do epitélio escamoso, porém acompanhado de uma diferenciação

persistente em direcção às camadas de células escamosas. As células atípicas mostram

alterações na relação núcleo/citoplasma, variações no tamanho do núcleo, perda de

polaridade, aumento do número de figuras mitóticas e hipercromasia. Resumindo as

células atípicas adquirem características de células malignas e expandem-se para os

dois terços da espessura epitelial. Estas lesões situam-se dentro do intervalo de variação

da CIN II e são classificadas citológicamente como lesão intraepitelial de alto grau (HSIL).

As características descritas anteriormente foram associadas a populações de

células aneuplóides e correlacionam-se fortemente com os tipos de HPV de alto risco

(Bibbo and Wilbur 2008). Estas células provavelmente reflectem as alterações precoces

que ocorrem na população celular em replicação (basais e parabasais) e que estão


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associadas aos efeitos dos oncogenes E6/E7 sobre o ciclo celular. Tais alterações

precoces englobam a desregulação do ciclo celular e o aumento do número de

receptores da proteína p16 INK4. O aumento da expressão da p16 é provavelmente uma

das respostas compensatória aos distúrbios celulares provocados pelos oncogenes

virais. À medida que a lesão evolui, ocorre uma perda progressiva da diferenciação até

que os tecidos sejam completamente substituídos por células atípicas imaturas, que não

exibem diferenciação na superfície CIN III (Figura 3).

Figura 3 - Representação da infecção pelo HPV e o espectro de lesões provocadas nos tecidos do colo do útero (adaptado de Woodman et al. 2007).

As alterações celulares que correspondem a esse espectro histológico e que são

observadas nos esfregaços de Papanicolaou, serão mencionadas na secção seguinte.

2.5. CITOPATOLOGIA

Actualmente e desde 1988 (ano da sua criação), o Sistema de Bethesda é a

classificação mais utilizada para a avaliação da citologia cervico - vaginal (Bibbo and

Wilbur 2008). Este Sistema de classificação impôs-se à já existente classificação de

Papanicolaou, pelas suas vantagens; nomeadamente na clareza da terminologia

utilizada, na uniformidade e razoável reprodutibilidade entre diferentes citotécnicos,

patologistas e laboratórios; reflectindo também a compreensão mais actual da neoplasia

cervical (Solomon and Nayar 2004). A sua última actualização aconteceu em 2001 e

encontra-se esquematizada na secção Anexo I.

Os critérios adoptados para esta classificação segundo Bethesda 2001 foram

(Solomon and Nayar 2004; Bibbo and Wilbur 2008):


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Células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US):

Existência de núcleos com aproximadamente 1/2 a 3 vezes o tamanho da área do

núcleo de uma célula pavimentosa normal intermediária. A relação núcleo-

citoplasma (N/C) está ligeiramente aumentada; com hipercromasia nuclear

mínima e irregularidade na distribuição da cromatina ou da forma nuclear. Pode

ocorrer, ainda, anormalidade nuclear associada a citoplasma denso e orangófilo

(paraqueratose atípica).

Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau (LSIL): O aumento nuclear é, pelo

menos, 3 vezes a área do núcleo de uma célula intermediária normal, resultando

em aumento da N/C com maturação bem definida do citoplasma. Os graus

variáveis de hipercromasia nuclear são acompanhados por variações no tamanho

nuclear, número e forma. A binucleação ou multinucleação estão geralmente

presentes; a cromatina apresenta-se, em geral, uniformemente distribuída, mas

grosseiramente granular; no entanto, pode apresentar-se baça ou degenerada. O

contorno da membrana nuclear é normalmente ligeiramente irregular, mas pode

ser liso. Frequentemente surgem coilócitos, células com cavidades perinucleares

de contornos irregulares e atipia nuclear; no entanto, são importantes para a

classificação como LSIL.

Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL): As células apresentam

menos maturação que na LSIL. O tamanho da célula é variável, afectando

principalmente células do tipo basal. A hipercromasia nuclear é acompanhada por

variações no tamanho e forma nuclear; o grau de aumento nuclear é mais variável

do que observado na LSIL. Algumas células com HSIL apresentam o mesmo grau

de aumento nuclear como na LSIL, mas a área do citoplasma está diminuída,

levando ao aumento mais acentuado da N/C. Outras células apresentam uma N/C

muito elevada, mas o tamanho real dos núcleos pode ser consideravelmente

menor do que na LSIL. A cromatina pode ser fina ou grosseiramente granular e

com distribuição uniforme. O contorno da membrana nuclear é bastante irregular e

frequentemente demonstra fendas proeminentes e estrias.

Carcinoma epidermóide: as células apresentam-se maioritariamente isoladas, de

marcada variação no tamanho e forma, com células caudadas e fusiformes, que

frequentemente têm citoplasma denso e orangófilo. Também o núcleo tem

variação marcada de tamanho, membrana irregular e opacidade nuclear. A


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cromatina apresenta-se grosseiramente granular e irregularmente distribuída.

Alterações queratóticas associadas podem estar presentes, mas não são

suficientes para interpretação de carcinoma na ausência de anomalias nucleares.

A diátese tumoral está muitas vezes presente.


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3. PAPILOMA VÍRUS HUMANO

3.1. HPV - DEFINIÇÃO

O vírus HPV é facilmente transmissível e a sua infecção pode ser totalmente

silenciosa.

O HPV constitui um grupo heterogéneo. São pequenos vírus, de aproximadamente

55nm de diâmetro, cujo material genético é uma molécula de DNA circular de cadeia

dupla. Apresentam replicação nuclear e são revestidos por uma cápside proteica, de

simetria icosaédrica, sem invólucro lipídico (Figura 4) (Kirwan and Herrington 2001; Burd

2003; Longworth and Laimins 2004).

Figura 4-Imagem tridimensional do HPV (adaptado de http://www.prn.org /html/authorized/3dvirusmodels/hpvlow.php, Julho 2011).

Este vírus pertence à família dos Papillomaviridae e estão já identificados cerca de

140 genótipos de HPVs diferentes, dos quais cerca de 40 infectam preferencialmente os

genitais: vulva, vagina, colo do útero, pénis e áreas perianais (Sociedade Portuguesa de

Papillomavírus 2004; Doorbar 2006; Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2007).

Apesar da elevada taxa de infecção, na maioria dos casos esta é transitória e auto-

limitada, tendo resolução espontânea em 75 a 80% dos casos, ao fim de 1-2 anos

(Sociedade Portuguesa de Ginécologia 2007).

A infecção torna-se persistente nos restantes 25%, condição predisponente a uma

evolução desfavorável. Mas, mesmo assim, muitos destes casos não evoluem para

neoplasia. Estima-se que apenas 10 a 11% dos casos de infecção evoluam para

neoplasia intraepitelial, dos quais 10% para neoplasia intraepitelial cervical (CIN) II-III

(verdadeira lesão pré-neoplásica) e 1% para cancro invasivo, com um tempo de

progressão variável, em geral, à volta dos 15 anos (Figura 5) (F. and MD 2004).


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Figura 5 - Representação esquemática do modelo de infecção com HPV de alto risco e número de anos que leva ao desenvolvimento do Cancro do Colo do Útero (Adaptado de mtm laboratories

2011).

3.2. A ORGANIZAÇÃO GENÓMICA DO HPV

O vírus do HPV é um vírus de DNA circular de cadeia dupla, com cerca de 8.000

pares de bases (pb) e é constituído por 8 regiões de leitura aberta (open reading frame-

ORF) que correspondem às sequências delimitadas entre um codão de “iniciação” e um

codão “stop” (Figura 6) (Munger, Baldwin et al. 2004; Doorbar 2006).

A sua expressão está intimamente dependente do programa de diferenciação da

célula hospedeira, de modo que, a nível funcional, o genoma divide-se numa região

precoce e numa região tardia, de acordo com o momento em que os respectivos genes

são transcritos, durante o ciclo viral (Fehrmann, Klumpp et al. 2003; Silva 2008).

Figura 6 - Representação esquemática do Genoma do HPV, com os genes precoces (E1, E2, E4, E5, E6 e E7), os genes tardios (L1 e L2) e a região reguladora (URR) (adaptado de Doorbar 2006).

Os genes precoces (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) são expressos nas células das

camadas inferiores do epitélio do colo do útero e codificam as proteínas necessárias para

a replicação e transcrição do genoma viral. Os genes tardios (L1 e L2) codificam

proteínas estruturais, com capacidade para se auto-agregarem, de modo a formar a


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cápside do vírus, constituída maioritariamente pela proteína viral L1, que contribui com

cerca de 80-90% do conteúdo proteico, e, em menor proporção, pela L2 (Fehrmann,

Klumpp et al. 2003; Doorbar 2006; Silva 2008).

A montante das ORF, existe uma região reguladora (URR) não codificante (Figura

6), de aproximadamente 1.000 pb. Esta região contém as sequências que regulam a

expressão dos genes virais, nomeadamente o promotor, contendo locais de ligação para

as polimerases do DNA e do ácido ribonucleico (RNA), e outros factores que potenciam

ou reprimem a expressão dos genes virais (Doorbar 2006; Silva 2008).

A sequência de aminoácidos da proteína L1 é altamente conservada entre todos os

tipos de HPV. A cápside é constituída por 72 capsómeros, cada um composto por 5

subunidades da proteína L1. Supõe-se que a L2 tem a função de atrair o DNA viral para o

interior da cápside (encapsulamento do genoma), durante a formação de novas partículas

virais. As proteínas da cápside dão origem a determinantes antigénicos específicos para

cada tipo de vírus, que dependem da conformação tridimensional das proteínas na

cápside, e não apenas de cada uma das proteínas isoladamente (Kirwan and Herrington

2001; zur Hausen 2002; Burd 2003).

3.3. CARCINOGÉNESE INDUZIDA PELA INFECÇÃO POR HPV

A forte associação entre a infecção precoce por HPV e o desenvolvimento de

lesões pré-neoplásicas ou carcinoma é evidente e amplamente aceite (Bollmann, Mehes

et al. 2003; Bibbo and Wilbur 2008; Singh, Mehrotra et al. 2008).

Um dos principais eventos da carcinogénese induzida pelo HPV é a integração do

genoma do HPV no cromossoma do hospedeiro (Bibbo and Wilbur 2008). A

carcinogénese deste tipo de tumor desenvolve-se com a integração do DNA do HPV no

genoma do hospedeiro, envolvendo a linearização do genoma do vírus entre os genes E1

e L1, e a inactivação do gene E2 por corte ou delecção aquando da sua integração (Silva

2008). A perda da expressão do receptor transcripcional da proteína E2 é importante pois

pode resultar numa expressão descontrolada das proteínas E6 e E7 produzindo

alterações fenotípicas na célula hospedeira (Munger, Baldwin et al. 2004; Sociedade

Portuguesa de Papillomavírus 2004).

Os genes virais E6 e E7 dos HPVs de alto risco codificam proteínas responsáveis

pelo potencial oncogénico do vírus, pela sua capacidade de induzir a transformação

maligna das células infectadas. Os genes E6 e E7 codificam oncoproteínas que têm

como alvo a pRb e a p53 respectivamente, que são proteínas codificadas por genes

supressores tumorais (Melsheimer, Vinokurova et al. 2004; Kumar, Abbas et al. 2010).

A proteína E6 dos HPVs de alto risco liga-se à p53, e leva à sua rápida degradação

pela via ubiquitina proteossoma (Kumar, Abbas et al. 2010).


14/53

Como resultado desta degradação, as actividades normais da p53 como a indução

de paragem do ciclo celular em G1, apoptose e reparação do DNA, não são realizadas.

Deste modo, e uma vez que a p53 regula os chekpoints G1/S e G2/M do ciclo celular, a

sua rápida degradação resulta na perda destes pontos de controlo, podendo levar à

ocorrência de duplicações cromossómicas e anomalias centroméricas (DeFilippis,

Goodwin et al. 2003; Bibbo and Wilbur 2008).

A proteína E7 forma um complexo com a forma hipofosforilada (activa) da pRb, que

leva à proteólise da pRb pelo proteossoma, e como a pRb hipofosforilada normalmente

inibe a entrada na fase S ligando-se ao factor de transcrição E2F, os dois oncogenes do

vírus operam conjuntamente para promover a síntese de DNA quando bloqueia a

paragem do crescimento mediada pela p53 e a apoptose das células geneticamente

alteradas (Figura 7) (DeFilippis, Goodwin et al. 2003; Doorbar 2006; Bibbo and Wilbur

2008; Kumar, Abbas et al. 2010; Laurson, Khan et al. 2010).

Figura 7 - Representação esquemática da acção das oncoproteínas E6 e E7 e a sua relação com o ciclo celular. As E6 e E7 ligam-se às proteínas celulares p53 e pRb respectivamente, alterando as

suas funções e vias de regulação do ciclo celular (adaptado de Burd 2003).

Além dos oncogenes virais referidos anteriormente, uma outra proteína viral, a E5,

parece ter influência no ciclo de vida viral. A função desta proteína não está ainda bem

caracterizada, e existem controvérsias sobre o seu real papel no ciclo viral.

Segundo Camara et al. a proteína E5, por meio de um sinal da via de transdução

dos receptores de factor de crescimento, parece actuar, sinergicamente, com o EGFR

(Camara, Cruz et al.2003).

A proteína E5 do HPV tipo 16 activa o EGFR através da ligação a uma subunidade

da ATPase levando a uma reduzida degradação dos receptores de EGF, a um aumento


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da reciclagem do EGFR, e consequentemente resultando numa expressão acentuada do

mesmo (Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011). Como consequência, este aumento de

EGFR promove a inibição da expressão do complexo de histocompatibilidade (MHC-I) e

MHCII na membrana plasmática (Gao and Zheng 2010).

A E5 parece ser importante na fase inicial da infecção, estimulando a proliferação

celular, resultando na entrada e progressão do ciclo celular através da regulação da p27

(Kip 1), afectando várias vias celulares envolvidas na adesão, motilidade celular e

sinalização mitogénica. Estas alterações podem levar à inibição da apoptose e facilitar a

persistência da infecção no epitélio uterino (Kivi, Greco et al. 2008; JM, Kim et al. 2010;

Muto, Stellacci et al. 2011).

Assim, a proteína E5 parece ter fracas propriedades oncogénicas que ocorrem por

inibição da apoptose após lesão do DNA. No entanto, à medida que as lesões associadas

a infecção por HPV progridem até cancro, o DNA viral integra-se no DNA da célula

hospedeira, e uma parte substancial do genoma viral sofre delecção, incluindo a

sequência codificadora da E5. Logo, a E5 não será necessária para os eventos tardios da

carcinogénese mediada por HPV (Hausen 2002; Gao and Zheng 2010).

No conjunto, os oncogenes virais E5, E6 e E7 desempenham assim um papel

fundamental na transformação celular por diversos mecanismos que afectam o normal

funcionamento celular (M and F 2005; Vermeulen, Jordanova et al. 2007; Kumar, Abbas

et al. 2010; Pedroza-Saavedra, Lam et al. 2010).


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4. BIOPATOLOGIA DO CANCRO

A carcinogénese baseia-se na acumulação de alterações genéticas sucessivas ao

longo do tempo que acabam por transformar uma célula normal numa célula maligna.

Determinados grupos de genes são particularmente afectados, resultando na aquisição

de novas capacidades que são importantes para a progressão tumoral neste processo de

“multistep” até ao desenvolvimento de neoplasia, Essas novas características são

seguidamente listadas e representadas na Figura 8 (Kumar, Abbas et al. 2010):

Crescimento e proliferação celular autónoma – capacidade de proliferação

independente dos estímulos mitogénicos;

Insensibilidade aos factores inibidores de crescimento – as células tumorais

poderão não responder aos factores inibitórios extra e intra-celulares, continuando

assim a sua proliferação;

Fuga à apoptose- resistência à morte celular geneticamente programada por

alteração de genes que controlam a apoptose, permitindo a sobrevivência das

células com erros graves no DNA;

Imortalidade celular- manutenção da actividade dos telómeros essencialmente por

reactivação da telomerase;

Angiogénese- as células tumorais adquirem capacidade de produzir factores de

crescimento que estimulam a formação de novos vasos que nutrem o tumor

permitindo a sua progressão;

Capacidade de invasão tecidular e metastização - aquisição de capacidades de

mobilização, penetração e migração das células tumorais.

Figura 8 - Alterações necessárias adquiridas pelas células malignas (adaptado de Hanahan e Weinberg 2000).


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Esta acumulação sucessiva de alterações genéticas, citogenéticas e epigenéticas,

está paralela e fenotipicamente relacionada com várias alterações histológicas e

citologicas detectáveis, como hiperplasias e displasias culminando com a evolução para

carcinomas in situ e invasores.

O ciclo celular é o ponto-chave para a compreensão da biopatologia do cancro.

Muitos dos erros moleculares que causam o comportamento anormal das células

neoplásicas assentam em alterações do ciclo celular (Massague 2004).

4.1. O CICLO CELULAR

A maioria das nossas células é substituída nos tecidos através de um processo que

envolve a replicação de DNA e a divisão do núcleo e citoplasma originando duas células-

filhas. Esta rotina sequencial, designada por ciclo celular, é constituída por duas partes

básicas: a mitose, onde ocorre a divisão celular com divisão nuclear e citocinese e a

interfase, período entre as mitoses onde há síntese e replicação de DNA (Cooper 2001).

Pode dividir-se o ciclo celular em quatro fases: fase de pré-sintese (fase G1) onde

ocorre a produção de RNA e proteínas necessárias para a etapa seguinte fase de síntese

de DNA (fase S), onde existe replicação gradual do DNA nuclear a fase pós-síntese (fase

G2) com produção de proteínas necessárias para a fase seguinte, e a fase de mitose

(fase M). Na fase de mitose ocorre separação dos cromátideos duplicados e tem lugar

tanto a divisão nuclear (mitose) como a divisão do citoplasma (citocinese). Corresponde à

fase mais curta do ciclo. É de referir que a maior parte das células não se encontram em

fase activa de produção de DNA ou de mitose, podendo estar em fase de repouso G0 ou

de pré-síntese (G1), a fase mais longa do ciclo celular (Cooper 2001).

A progressão do ciclo celular é altamente regulada por um conjunto de sinais e

mecanismos extra-celulares e intracelulares que coordenam os vários processos que

ocorrem durante as fases do ciclo, resultando na sua activação ou inibição. Esta rede

complexa mas coordenada de proteínas actuam maioritariamente em determinados

pontos-chave do ciclo denominados de pontos de controlo. Um dos mais importantes

ocorre na passagem da fase G1 para a fase S denominado por ponto de restrição ou

ponto de controloG1/S, dependente da acção dos factores de crescimento para a

passagem para a fase S. O ponto de controlo G1 permite a detecção de erros no DNA

antes da sua replicação. Quando é detectado um erro no DNA o ciclo celular é

interrompido permitindo a reparação dos genes afectados. O ponto de controlo de G2

previne a iniciação da mitose sem a completa replicação do DNA, embora também

permita a detecção dos erros de DNA. Outro ponto de controlo ocorre na mitose onde um

conjunto de proteínas, (ex. Bub e Mad), controlam o alinhamento dos cromossomas


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assegurando a correcta distribuição dos cromátideos para as células-filhas (Cooper 2001;

Pinto, Soares et al. 2007).

4.2. INIBIDORES DAS CINASES DEPENDENTES DAS CICLINAS

O controlo do ciclo celular é não só regulado pelos complexos ciclina / cinases

dependentes de ciclinas (CDKs) mas também pelos inibidores das CDK (CDKIs). Estas

proteínas intervêm a vários níveis do ciclo celular inibindo a sua progressão. Pertencem

as duas classes distintas: a família Cip/Kip das quais fazem parte a p21 WAF1, p27 Kip1 e

p57 kip2com domínios amino-terminal homólogos que contêm regiões de ligação às CDK e

ciclinas e a família INK4/ARF das quais fazem parte as P16INK4B, p15INK4C e p19INK4D com

repetições tandem de sequência tipo anquirina (Sherr and Roberts 1995).

Os membros da família Cip/Kip regulam várias fases do ciclo celular

nomeadamente G1 e S inibindo os complexos das CDK 2, 4 e 6 com as ciclinas A, E e D.

Por sua vez, os membros da família INK4, como a p16INK4A, apenas actuam no ponto de

restrição do ciclo celular, no final da fase G1, inibindo o complexo das CDK4/6 - ciclina D

(Cooper 2001).

4.2.1. PROTEÍNA P16 NO CICLO CELULAR

A proteína p16 funciona como um regulador negativo da proliferação celular que

inibe especificamente os complexos CDK4/6-ciclina D evitando a fosforilação da pRb

(Serrano, Hannon et al. 1993).

O aumento da P16 na presença da pRb normal mostrou levar à restrição do ciclo

celular (Serrano, Lee et al. 1996). A sua expressão pode ser encontrada em células

epiteliais, fibroblastos, células musculares lisas e melanócitos mas de uma forma muito

baixa durante quase todo o ciclo celular aumentando ligeiramente na fase G1 (Tam et al,

1994). Valores de expressão muito elevados ou completamente ausentes poderão

corresponder a alterações na dinâmica desta proteína.

Valores elevados de expressão proteica da p16 foram detectados em lesões pré-

neoplásicas e neoplásicas cervicais associadas à infecção por HPV (Galgano, Castle et

al. 2010). Estudos no âmbito das lesões displásicas do colo do útero e expressão de

marcadores tumorais, têm revelado que a expressão da p16 é marcadamente

influenciada pelo status de expressão da pRb. Segundo a literatura a sobreexpressão da

p16 em células cervicais pode ser interpretada como um dos indicadores da integração

do genótipo do HPV de alto risco na célula hospedeira, devido à inactivação funcional da

pRb pela proteína E7 (Sano, Oyama et al. 1998).

Têm sido publicados diversos estudos em que se tem observado uma

sobreexpressão imunohistoquimica da proteína p16 num elevado número de casos de


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displasia de alto grau (80-100% de lesões de CINII e praticamente todas as lesões de

CINIII) e carcinoma invasor (Missaoui, Hmissa et al. 2010). Estudos mostram uma

tendência linear da expressão da p16 com o aumento da gravidade da lesão (Salcedo

Mde, Silveira et al. 2008). Para além disso, a imunocitoquímica com marcação por p16,

tem o potencial para fornecer uma elevada sensibilidade na presença de lesões de alto

grau, com uma especificidade significativamente mais elevada que o teste de HPV

(Denton, Bergeron et al. 2010).

4.3. PROLIFERAÇÃO CELULAR

A proliferação celular pode ser definida como aumento do número de células

resultante da conclusão do ciclo celular. Depende da proporção de células que proliferam

(fracção proliferativa), da duração do ciclo celular e da fracção de células que se vão

perdendo por morte ou diferenciação celular.

A hiperproliferação celular é um indicador de uma desordem no crescimento celular

que muito frequentemente resulta em cancro. Por outro lado, quanto maior for a fracção

de proliferação maior será o crescimento do tumor.

Estes factos suscitaram o interesse do estudo da proliferação em Oncologia,

desenvolvendo-se várias metodologias para tal. Estes métodos incluem a determinação

do índice de figuras mitóticas, índice marcado por timidina tritiada, demonstração por

métodos argênticos de regiões organizadoras nucleares (AgNORs), proliferação por

citometria de fluxo e avaliação da proliferação através da avaliação de proteínas

relacionadas com o ciclo celular por imunohistoquímica. Esta última corresponde a um

dos métodos mais utilizados actualmente e baseia - se na detecção de determinadas

proteínas que são expressas durante as distintas fases do ciclo celular (Hall and Woods

1990).

4.3.1. EGFR NO CICLO CELULAR

O EGFR é uma glicoproteína transmembranar com 170 kDa constituída por um

domínio extracelular transmembranar para o ligando, por uma região transmembranar

hidrofóbica e por um domínio interno com actividade tirosina cinase intrínseca. Este

receptor é codificado pelo protooncogene C-erb B localizado no cromossoma 7 (7p12) e

faz parte da família ErbB de receptores tirosina cinase do tipo I, constituída por quatro

receptores homólogos: ErbB1 (EGFR/HER-1) ErbB2 (HER-2) ErbB3 (HER-3) e ErbB4

(HER-4) (Venook 2005).

O EFGR é um receptor expresso em várias células normais não hematopoiéticas

tais como células epiteliais, células do tecido conjuntivo, células da glia, células

musculares e células das glândulas salivares. É um importante receptor mediador de


20/53

acções como crescimento, desenvolvimento, diferenciação e sobrevivência celular

(Venook 2005).

Este receptor pode ser activado por vários ligandos como o factor de crescimento

epidérmico (EGF), factor de crescimento transformante alfa (TGF-α), entre outros

(Charoenrat, Rhys-Evans et al. 2002).

A ligação do factor de crescimento (por exemplo o EGF) estimula a formação de um

complexo dimérico com dois membros da família ErbB promovendo a autofosforilação

dos resíduos de tirosina específios da região citoplasmática. Poderão formar-se

diferentes formas de complexos homo e heterodiméricos. O receptor de tirosina

autofosforilado fica desta forma activo e recruta proteínas adaptadoras e efectoras com a

subsequente activação das vias sinalização intracelular. Outros segundos mensageiros

podem ser mobilizados e activam consequentemente factores transcricionais nucleares

determinando respostas celulares como por exemplo a proliferação celular, inibição da

apoptose, estimulação da invasão e disseminação.

A expressão ou sobrexpressão do EGFR tem sido descrita em vários tipos de

neoplasias, nomeadamente em carcinomas da cabeça e pescoço (80-100%), cancro do

pulmão (40-93%), cancro da mama (14-91%) e na neoplasia cervical a expressão do

EGFR varia entre 70-90% dependendo da metodologia utilizada (Khalil, Grandis et al.

2003; Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011).

Na neoplasia cervical a expressão do EFGR está relacionada com infecção pelo

HPV, e sabe-se que a desregulação do EGFR causa oncogenicidade, mas os

mecanismos biológicos que promovem o crescimento das células não estão

completamente esclarecidos (Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011).

O EGFR está envolvido na proliferação e crescimento celular de células tumorais

assim como no aumento da sua vida celular por resistência à apoptose (Venook 2005).

Pode ter efeitos em importantes fases da invasão e disseminação tumoral,

nomeadamente por promoção da motilidade celular, alteração e redução de moléculas de

adesão e pela estimulação de enzimas proteolíticas de degradação da matriz extracelular

(Ch'ng, Low et al. 2008).

A participação do EGFR na angiogénse, provavelmente pela regulação do factor de

crescimento vascular endotelial (VEGF), parece ser igualmente relevante (Charoenrat,

Rhys-Evans et al. 2002).

A determinação da expressão do EGFR pode ser de igual forma útil na planificação

do tratamento com radioterapia ou quimioterapia, uma vez que tumores com aumento

deste receptor foram associados a maior radiorresistência (Milas, Fan et al. 2004).

A expressão aumentada do EGFR nestas neoplasias faz desta molécula um alvo

atractivo para utilização terapêutica de agentes inibidores deste receptor.


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5. OBJECTIVOS

Com a finalidade de melhorar a precisão do diagnóstico citológico pela diminuição

da subjectividade de interpretação por parte do profissional citopatologista, o principal

objectivo deste estudo consiste em determinar se o marcador EGFR poderá ser indicativo

do tipo de lesão displásica diagnosticada pelo exame de Papanicolaou.

Para tal pretende-se avaliar em que medida o método por marcação com EGFR é

fiável para a identificação de células displásicas:

I. Sensibilidade e especificidade do marcador EGFR para detecção de células

displásicas;

Seguidamente, pretende-se averiguar em que medida a quantidade de células

displásicas será indicativo do tipo de lesão e/ou HPV:

II. Relação entre a expressão do marcador EGFR e o diagnóstico citológico;

III. Relação entre a expressão do marcador EGFR e o tipo/risco de HPV;

IV. Relação entre a expressão do marcador EGFR e o diagnóstico histológico;

Por fim, pretende-se também comparar o método em estudo com outros métodos

actualmente reconhecidos:

V. Relação entre a expressão do marcador p16 e o tipo/risco de HPV.


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6. MATERIAL E MÉTODOS

Depois de ter sido efectuada uma análise dos registos clínicos foi realizada uma

triagem dos casos, sendo rejeitados os casos em que não foram detectadas quaisquer

lesões displásicas. Os casos com displasia foram sujeitos a uma análise citológica,

histológica e molecular.

Na análise citológica, após revisão dos resultados previamente obtidos pelo exame

de Papanicolaou, procedeu-se à análise imunocitoquímica, recorrendo aos marcadores

EGFR e p16.

A análise histológica consistiu na revisão dos casos arquivados e reclassificação

dos mesmos, se aplicável.

Do ponto vista da análise molecular foram efectuadas metodologias de detecção de

HPV e subsequente genotipagem.

A figura seguinte representa o delineamento geral da pesquisa que permitiu a

orientação do estudo.

Figura 9 – Fluxograma de representativo do delineamento geral da pesquisa.


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6.1. POPULAÇÃO EM ESTUDO

Este estudo, do tipo retrospectivo, realizou-se com amostras residuais obtidas a

partir de citologias armazenadas em meio líquido PreservCyt (Cytyc Corporation,

Boxborough, MA, USA), provenientes do programa de rastreio do colo do útero, de um

Laboratório de Anatomia Patológica da zona Norte, e a partir de tecidos fixados em

formol tamponado a 10%, incluídos em parafina e diagnosticados e arquivados no

mesmo laboratório. Através do estudo com técnicas convencionais de hematoxilina-

eosina (HE), em lâminas arquivadas, realizou-se a reclassificação histológica dos casos e

apenas uma amostra foi reclassificada de CIN II para CIN I.

Os critérios de inclusão foram os seguidamente listados:

Sabendo que a expressão do EGFR está alterada em células displásicas e

partindo do pressuposto teórico de que os casos saudáveis não apresentam

displasia, o estudo centrou-se exclusivamente na utilização de amostras de ASC-

US, LSIL e HSIL. Segundo o sistema de Bethesda (Bibbo and Wilbur 2008)

representam: células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US),

lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), lesões intraepiteliais

escamosas de alto grau (HSIL);

Amostras com confirmação histológica, correspondentes aos casos de citologia

meio líquido, classificadas em CIN I- displasia leve; CIN II- displasia moderada;

CIN III- displasia grave/carcinoma in situ. As amostras histológicas compreendem

biópsias cervicais e conizações.

Para os critérios de inclusão previamente listados, foram identificados as seguintes

limitações com possibilidade de condicionar a qualidade dos casos estudados e

consequentemente a qualidade dos dados estatisticamente analisados:

A consecutiva reutilização da amostra em estudo perde representatividade celular

à medida que novas lâminas são laboratorialmente processadas a partir mesma

amostra; assim, a contagem de células nos resultados obtidos de lâmina para

lâmina apresentam uma ordem de grandeza distinta e imprevisível,

impossibilitando uma correspondência directa entre os valores capturados entre

amostras;

O facto de serem considerados casos histológicos até 6 meses depois da colheita

de citologia meio líquido, podem prejudicar a qualidade da relação entre

diagnóstico citológico e diagnóstico histológico. Esta relação pode ser

prejudicada, uma vez que neste intervalo temporal a patologia pode evoluir,


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ignorando possíveis melhorias (por intervenção terapêutica ou regressão

espontânea) ou agravamentos (por evolução natural da patologia, sem qualquer

tratamento).

Foram excluídos exames cujos resultados apresentam lesões displásicas de (i)

ASC-H, não se pode excluir lesão de alto grau, (ii) anomalia das células glandulares e (iii)

„Outras‟ neoplasias.

O conjunto de dados final resultou em 49 casos respeitando os critérios

anteriormente descritos.

6.2. PROCEDIMENTO LABORATORIAL

6.2.1. DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO HPV

Processamento das amostras

Das citologias de colo uterino, previamente colhidas e armazenadas em meio

líquido PreservCyt, foram centrifugadas cerca de 2ml de cada amostra a 4500 rpm

durante 15 minutos.De seguida rejeitou-se o sobrenadante e suspendeu-se em 2mL de

tampão fosfato (PBS). Uma alíquota de 1ml foi concentrada em 200μL de PBS para

posterior extracção de ácidos nucleícos.

Isolamento de ácidos nucleicos

Procedeu-se à extracção de DNA das amostras de citologia de colo uterino com o

kit comercial QiAamp DNA Blood mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) e de acordo com as

normas do fabricante (QIAGEN, 2010).

Quantificação de DNA

A presença de DNA, após a extracção, foi avaliada através da quantificação da

Densidade Óptica (DO) utilizando um espectofotómetro UV/visível, Nanodrop (ND-1000,

Nanodrop Technologies), a partir de 2μL de amostra. A avaliação da quantidade e da

qualidade deve ser executada a vários comprimentos de onda: 260nm (para avaliar

especificamente para ácidos nucleicos) e 280nm (para avaliar presença de proteínas). A

sua pureza foi avaliada através do rácio dos valores de absorvância a 260/280nm. Uma

razão maior que 1,8 é geralmente considerada um indicador de qualidade aceitável do

DNA, sendo-o também aplicado neste trabalho experimental.


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Polymerase Chain Reaction (PCR)

Nas reacções de PCR foram incluídos controlos negativos e positivos: para o

controlo negativo, substitui-se o DNA da amostra por água bidestilada estéril (ddH2O); o

controlo positivo para o HPV consistiu numa amostra de citologia do colo do útero com

HPV de alto risco detectado por diagnóstico com o kit hc2 High-Risk HPV DNA test

(Qiagen, Hilden, Alemanha).

As reacções de amplificação foram efectuadas no termociclador programável

BioRad MyCyclerTM (Bio-Rad, Hercules, Canadá) num volume total de 50μL.

Controlo do método de extracção de DNA

Para testar a eficácia do método de extracção de DNA, foi pesquisada a presença

do gene de referência, beta globina, pela técnica da PCR, de modo a obter um fragmento

de 175 pb, com os primers PCO3 e BGII (Tabela 2). A reacção de amplificação continha

10 ng de DNA, 1U Taq DNA Polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e o respectivo

tampão de reacção 1X, 4 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0.2 mM de dinucleosídeos

trifosfatados (dNTPs) (MBI Fermentas, #R0192) e 0.3 μM de cada primer. As condições

de amplificação encontram-se descritas na Tabela 3.

Detecção de DNA do HPV

A presença de DNA viral foi avaliada com recurso à técnica da PCR, utilizando os

primers GP5+/6+ e os primers degenerados MY09/11 (Tabela 2), que amplificam uma

região relativamente estável do gene L1 do HPV com 150 e 450 pb, respectivamente.

A reacção com os primers MY09/11 continha 10 ng de DNA, 1U Taq DNA

Polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e o respectivo tampão de reacção 1X, 4 mM de

MgCl2 (MBI Fermentas), 0.2 mM de dNTPs (MBI Fermentas, #R0192) e 0.4 μM de cada

primer. As condições de amplificação encontram-se descritas na Tabela 3.

A reacção com os primers GP5+/6+ (Tabela 2) continha 10 ng de DNA, 1U Taq

DNA Polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e o respectivo tampão de reacção 1X, 3 mM

de MgCl2 (MBI Fermentas), 0.2 mM de dNTPs (MBI Fermentas, #R0192) e 0.4 μM de

cada primer. As condições de amplificação encontram-se descritas na Tabela 3.


26/53

Tabela 2- Sequência dos primers utilizados (A =Adenina, T= Timina, G= Guanina e C= Citosina. Os primers MY09/11 são degenerados e usam

nucleótidos modificados, em que M=A ou C, R=A ou G, W=A ou T e Y=C ou T).

Sequência dos Primers

Beta globina PCO3 5´-ACA CAA CTG TGT TCA TAG C-3´

BGII 5´-GTC TCC TTA AAC CTG TCT TG-3´

HPV MY 09 5´-CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3´

MY11 5´-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3´

GP5+ 5´-TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC-3´

GP6+ 5´-GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C-´

Tabela 3- Condições de amplificação de DNA.

Primers Condições de amplificação

Beta-globina PCO3/BGII Pré-desnaturação: 3min-95ºC

35 ciclos: 1min-94ºC, 1min-55ºC e 1min-72ºC

Extensão final: 10min-72ºC

HPV MY09/11 Pré-desnaturação: 3min-95ºC

40 ciclos: 45s-94ºC, 45s-55ºC e 1min-72ºC


GP5+/6+ Pré-desnaturação: 4min-95ºC

40 ciclos: 30s-94ºC, 1min-44ºC e 1.30min-72ºC


Electroforese em gel de agarose dos fragmentos amplificados

De modo a verificar a amplificação dos fragmentos de DNA, 15 μl dos produtos

obtidos na PCR foram analisados por electroforese em géis de agarose a 1,5% (p/v),

corados com brometo de etídeo. Em seguida os géis foram visualizados, utilizando um

transiluminador (Quantity one, Bio-Rad) de luz UV e com o suporte do programa

informático.


27/53

A figura 10 mostra a banda característica da amplificação do gene L1 do HPV com

peso molecular 450 pb.

Figura 10 – Representação do gel de agarose identificativo da presença de HPV.

Genotipagem do HPV por RFLP

As amostras positivas por PCR com os primers MY09/11 foram genotipadas pelo

método Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), conforme o descrito por

Nobre et al. (2008). Este método permite a diferenciação dos vários genótipos do HPV,

pela análise de clivagem do DNA.

Os genótipos do HPV foram divididos em quatro grupos baseados na sua

actividade oncogénica (Munoz, Castellsague et al. 2006; Nobre, de Almeida et al. 2008):

HPV de alto risco 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59;

HPV de provável alto risco 26, 53, 66, 68, 73 e 82;

HPV de baixo risco 6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 61, 70, 72, 81 e 89;

HPV de risco indeterminado 30, 32, 34 e 64, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85,

86, 87, 90, 91, 97, 102 e 106.

Cerca de 5 μL dos produtos de PCR foram submetidos a digestão em quatro

reacções independentes, num volume total de 20 μL, que continha, 2μL de 10X de

tampão de cada enzima e 10U das seguintes enzimas de restrição: PstI (New England

BioLabs, R0140S), HaeIII (MBI Fermentas, #ER0151), DdeI (New England BioLabs,

R0175L) e RsaI (New England BioLabs, R0167S). As digestões ocorreram durante 1hora

a 37ºC.

Electroforese em gel de agarose dos fragmentos obtidos por RFLP

Os fragmentos obtidos por RFLP foram analisados por electroforese em géis de

agarose a 3% (p/v), corados com brometo de etídeo e visualizados sob luz UV. A

identificação dos tipos de HPV foi realizada seguindo o algoritmo proposto por Nobre et

al. (2008) e foi representada na Figura 11.


28/53

Figura 11 – Representação de um gel de agarose exemplificativo da digestão por RFLP. Fragmentos obtidos pelas enzimas PstI, HaeIII,DdeI e RsaI. As referências M1 e M2 representam os

marcadores de peso molecular de 25 e 100 pb respectivamentes.

6.2.2. IMUNOHISTOQUÍMICA

Para as técnicas de imunohistoquímica utilizou-se o sistema manual de detecção.

O material residual presente nas amostras de citologia em meio líquido foi

processado pelo Thinprep® T2000 (Hologic), colocou-se em solução fixadora (álcool a

95% durante 30 minutos) e foi posteriormente hidratado.

As amostras foram seguidamente submetidas a distintos processos de recuperação

antigénica de acordo com o anticorpo primário utilizado, como indicado na Tabela 4.

Depois de colocar as lâminas nos receptores especiais do sistema de

imunomarcação manual, a técnica de imunocitoquímica foi realizada de acordo com os

seguintes passos:

Bloqueio da peroxidase endógena, com o reagente indicado nos respectivos Kit´s

de detecção, durante 5 (+ -) minutos;

Incubação com o anticorpo primário (Tabela 4) durante 30 minutos;

Lavagem com tampão e incubação com solução de DAB para visualização da

imunomarcação;

Contraste com hematoxilina de Gill III (leica microsystem) durante 2 minutos,

diferenciação em água corrente, desidratação e montagem.

Foram incluídos controlos negativos e positivos para assegurar a especificidade da

imunomarcação.


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Tabela 4- Painel de anticorpos utilizados (ERS: Epitope Retrieval Solution, MW: microondas)

Anticorpo Clone Diluição Pré-tratamento Casa comerical

Anti-EGFR EGFR pharmDx IHC kit

Code K1492

2-18C9 Pré-diluido 2 minutos em proteinase K

DacoCytomation Glostrup, Denmark

Anti-P16 CINtec ® Cytology kit,

REF 9521 E6H4 Pré-diluido

10 minutos em ERS-MW

(5`+ 5`) MTM, Heidelberg, Germany

6.2.3. AVALIAÇÃO DOS IMUNOMARCADORES

A quantificação da expressão da imunomarcação foi realizada por 2 observadores

independentes, dois citotécnicos (1 e 2) que avaliaram a expressão dos marcadores

citológicos. Nesta análise utilizou-se o microscópio óptico DM1000 Leica (Leica

Microsystems).

EFRG em Citologia

Na análise citológica a quantificação da expressão imunocitoquimica do marcador

EGFR foi efectuada em 2 pontos” hot” seleccionados aleatoriamente com a objectiva de

4X. No campo seleccionado e devidamente marcado, efectuou-se a contagem das

células displásias marcadas; displásicas não marcadas; não displásicas marcadas e não

displásicas não marcadas, numa ampliação de 40 X.

A contagem de células foi realizada segundo os seguintes critérios: citoplasma

marcado e/ou membrana citoplasmática a partir de 50%. Em casos de agrupamentos

celulares só foram consideradas células com limites celulares bem definidos,

inequivocamente marcadas. A Figura 12 mostra a presença/ ausência de marcação

citoplasmática para os diferentes tipos de lesão.


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A - Marcação citoplasmática positiva para EGFR numa lesão de HSIL, ampliação 20X.

B - Marcação citoplasmática positiva para EGFR numa lesão de HSIL, ampliação 40X.

C - Marcação citoplasmática positiva para EGFR numa lesão de LSIL, ampliação 40X.

D - Ausência de marcação para EGFR numa lesão de LSIL, ampliação 20X.

E - Ausência de marcação para EGFR numa lesão de LSIL, ampliação 20X

Figura 12 – Presença/ausência demarcação citoplasmática para EGFR.

p16 em Citologia

A avaliação da expressão da p16 foi efectuada de acordo com a indicação do

fabricante (CINtec, cytology Kit). Se as células apresentam uma marcação castanha

(citoplasmática/nuclear) positiva e são morfologicamente anormais, o resultado é

considerado Positivo. Se as células mostrarem uma coloração castanha e não

apresentam anormalidades morfológicas (ex: células metaplásicas), o resultado é


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Negativo. As imagens que se seguem mostram exemplos de marcação e ausência de

marcação para as lesões de HSIL, LSIL e ASC-US.

A - Marcação nuclear e citoplasmática positiva para p16 numa lesão de HSIL, ampliação 40X.

B - Marcação nuclear e citoplasmática positiva para p16 numa lesão HSIL, ampliação 40X.

C - Marcação nuclear e citoplasmática positiva para p16 numa lesão de LSIL, ampliação 40X.

D - Marcação nuclear e citoplasmática positiva para p16 numa lesão de ASC-US, ampliação 10X.

E - Ausência de marcação numa lesão de LSIL, ampliação 10X.

F - Ausência de marcação numa lesão de ASC-US, ampliação 10X.

Figura 13 – Marcação/ausência de marcação nuclear e/ou citoplasmática para p16.

A classificação da expressão com EGFR foi capturada de forma distinta da

expressão da p16. O oposto não seria viável, isto é, classificar a expressão de EGFR de

acordo com a mesma classificação utilizada pelo p16, visto que todos os casos em


32/53

estudo apresentam células displasicas. Dessa forma todos os casos seriam classificados

de forma semelhante.

Por outro lado, não existe o interesse de classificar a expressão de p16 por

contagem de células, dado que para este anticorpo, um determinado caso é considerado

positivo bastando que para tal haja pelo menos uma célula displásica marcada.

6.2.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistical Package for Social

Sciences (SPSS) versão para Windows 17.0.

Foram analisadas possíveis associações entre as variáveis usando testes não

paramétricos: teste Kruskal-Wallis e teste do Qui-quadrado (X2). O valor de p <0,05 foi

considerado para indicar significado estatístico.

A hipótese nula, H0, é a notação usada para representar a hipótese que vai ser

testada.


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7. RESULTADOS

7.1. ANÁLISE DE DADOS

7.1.1. DESCRIÇÃO DA BASE DE DADOS

O conjunto de dados obtido é constituído por 98 registos que correspondem a 49

casos clínicos com diferentes graus de displasia. Foram considerados apenas casos de

displasia por se tratar da avaliação de um imunomarcador que quando alterado no ciclo

de vida da célula, mostra uma expressão aumentada.

Dado o desconhecimento de literatura existente acerca do marcador EGFR em

citologia, optou-se por introduzir mais que um observador para aumentar o contributo na

validação desta técnica (secção: Avaliação dos Imunomarcadores, capítulo 5). Assim,

cada caso clínico foi avaliado por dois observadores independentes (1 e 2) sendo

contabilizados 2 registos para cada caso clínico.

A informação capturada para cada caso clínico incluiu: número da amostra, idade,

número de registo citológico e histológico, diagnóstico citológico e histológico, registo dos

controlos para a realização da técnica de genotipagem do HPV, bem como os respectivos

resultados, a classificação do genótipo de acordo com o risco associado, o registo da

expressão do marcador EGFR para células displásicas e não displásicas, e por fim o

registo da expressão da p16 para citologia. A tabela seguinte apresenta uma breve

descrição de cada um dos atributos capturados para cada registo.


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Tabela 5-Descrição dos atributos do conjunto de dados analisados.

N Nome Descrição 1 Nr_amostra Número da amostra

3 Idade Idade da paciente

4 Nr_Cito Número de registo citológico

5 Nr_Hist Número de registo histológico

6 Diag_Cito Diagnostico citológico

7 Diag_Hist Diagnóstico histológico

8 Ctrl_BG Controle beta globina

9 Ctrl_HPV_GP Controle HPV genótipo

10 Ctrl_HPV_MY Controle HPV enzima my

11 Genótipo_HPV Genótipo do HPV

12 Classif_genótipo_HPV Classificação do genótipo

13 Reg_Cit_EGFR_DM Registo citológico do EGFR de células displásicas marcadas

14 Reg_cit_EGFR_DNM Registo citológico do EGFR de células displásicas não marcadas

15 Reg_cit_egfr_ndm Registo citológico do EGFR de células não displásicas marcadas

16 Reg_cit_egfr_ndnm Registo citológico do EGFR de células não displásicas não marcadas

17 Reg_cit_P16 Registo citológico do P16

7.1.2. CARACTERIZAÇÃO DOS CASOS CLÍNICOS ANALISADOS

Idade

A idade da paciente variou entre os 19 e os 56 anos tendo uma média de 32,55

anos e um desvio padrão de 8,94 anos. Nesta amostra 34.7% das mulheres tinham mais

de 35 anos (Figura 14).

Figura 14 – Representação gráfica com a distribuição da 'Idade' das mulheres contida não conjunto de dados.

A Figura 14 apresenta a distribuição do atributo ´Idade` onde se observa que existe

uma maior representação de idades inferior a 35 anos.


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Diagnósticos Citológico

Os registos citológicos analisados apresentam vários graus de lesões displásicas

do colo uterino: 28 registos citológicos relativos a ASC-US, 54 a LSIL e 16 a HSIL.

Figura 15 – Representação gráfica da distribuição de 'Diagnóstico Citológico'.

O gráfico da Figura 15 representa claramente uma maior prevalência de LSIL,

representando mais de metade das lesões no conjunto de dados.

Genótipo de HPV

Na tipificação do HPV verificámos a presença de 17 tipos diferentes. O HPV 16 e

31 foram os mais prevalentes, sendo detectado em 13,9% das amostras, seguido do HPV

58 (8,3%).


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Diagnóstico Citológico vs Genótipo de HPV

A Tabela 6 representa a distribuição por diagnóstico citológico dos diferentes tipos de HPV detectados na população em estudo,

verificou-se que em amostras de ASC-US o HPV mais prevalente foi tipo 31, sendo detectado em 30% das amostras. Para casos de LSIL o

HPV mais prevalente foi HPV 31, 54, 66, 70 e 84 sendo cada um deles detectado em 10,5% das amostras. Os HPV´s 16 e 33 foram os

mais prevalentes em casos de HSIL sendo cada um deles detectado em 28,6% dos casos.

Tabela 6-Distribuição por diagnóstico citológico dos diferentes tipos de HPV detectados na população em estudo.

Genótipo HPV

6 16 18 30 31 33 34 45 53 54 56 58 61 66 70 81 84 Total

Diagnóstico Citológico

ASC-US N 4 4 0 0 6 0 0 0 0 0 2 2 2 0 0 0 0 20

% 20,0 20,0 ,0 ,0 30,0 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 10,0 10,0 10,0 ,0 ,0 ,0 ,0 100,0%

LSIL N 0 2 2 2 4 0 2 2 2 4 2 2 0 4 4 2 4 38

% ,0 5,3 5,3 5,3 10,5 ,0 5,3 5,3 5,3 10,5 5,3 5,3 ,0 10,5 10,5 5,3 10,5 100,0%

HSIL N 0 4 2 2 0 4 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 14

% ,0 28,6 14,3 14,3 ,0 28,6 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 14,3 ,0 ,0 ,0 ,0 ,0 100,0%

Total N 4 10 4 4 10 4 2 2 2 4 4 6 2 4 4 2 4 72

% 5,6% 13,9 5,6 5,6 13,9 5,6 2,8 2,8 2,8 5,6 5,6 8,3 2,8 5,6 5,6 2,8 5,6 100,0%


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7.1.3. VALIDAÇÃO ESTATÍSTICA DOS OBJECTIVOS DO ESTUDO

Objectivo 1 – Sensibilidade e especificidade do marcador EGFR

Assumindo a displasia da célula como indicador de lesão celular provocada pelo

vírus do HPV, por desregulação do normal funcionamento do ciclo celular, teve-se como

objectivo avaliar em que medida o marcador EGFR poderia contribuir para a detecção

das lesões displásicas do colo uterino. Assim, propôs-se avaliar a sensibilidade e

especificidade do marcador EGFR para detecção de células displásicas.

Tabela 7 – Distribuição do número de células marcadas por EGFR.

EGFR Positivo EGFR Negativo

Células Displasicas

2118 579

Células Normais

4112 49002

A Tabela 7 representa uma tabela de verdade com o marcador EGFR para o

número de células displásicas marcadas e não marcadas, e para o número de células

não displásicas marcadas e não marcadas.

Desta forma, foram calculadas a sensibilidade e a especificidade da metodologia de

marcação por EGFR em citologia ao que correspondeu a 78,5% e 92,3%,

respectivamente.

Objectivo 2 - Relação entre a expressão do marcador EGFR e o diagnóstico

citológico.

O exame de Papanicolaou detecta alterações morfológicas que resultaram de

modificações moleculares de proteínas reguladoras que alteram o normal funcionamento

do ciclo celular. Estas modificações celulares são provocadas aquando da infecção pelo

HPV. Algumas proteínas reguladoras do ciclo celular têm sido estudadas para

compreender a sua influência na oncongenicidade.

Neste sentido, questionou-se a hipótese de uma relação entre a expressão do

marcador EGFR e as alterações morfológicas celulares atribuídas em diagnóstico

citológico, tomando esta a seguinte forma: H0a, a mediana de células displásicas

marcadas pelo EGFR é igual para os diferentes diagnósticos citológicos.

Para testar H0a, recorreu-se ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, usando-se

uma probabilidade de erro tipo (α) de 0.05 pois o número de células marcadas não segue

uma distribuição normal (Shapiro – Wilk: 0,909, df: 98, p-value: 0).


38/53

A Figura 16 ilustra a distribuição do número de células EGFR positivas por

diagnóstico citológico.

Figura 16 – Representação gráfica da distribuição do número de Células EGFR Positivas, por Diagnóstico Citológico, p=0.415.

Pela análise do gráfico representado na Figura 16 e pela análise das estatísticas da

Tabela 8, verificou-se uma distribuição homogénea de células displásicas marcadas, em

relação aos diferentes diagnósticos citológicos.

A aceitação de H0a significa que o número de células marcadas por EGFR se

apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado de entre os diferentes

diagnósticos citológicos.

De acordo com o teste de Kruskal-Wallis ( (2) = 1,759, p = 0.415, N = 98), sob

os parâmetros anteriormente especificados, H0a não é rejeitada e como tal, pode afirmar-

se, com uma confiança de 95% (p=0.415 > α = 0.05) que o número de células marcadas

por EGFR se apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado de entre os

diferentes diagnósticos citológicos.

Objectivo 3 - Relação entre a expressão do marcador EGFR e o tipo/risco do

genótipo de HPV

Na neoplasia cervical a expressão do EFGR está relacionada com infecção pelo

HPV, e sabe-se que a desregulação do EGFR causa oncogenicidade, mas os


39/53

mecanismos biológicos que promovem o crescimento das células não estão

completamente esclarecidos (Soonthornthum, Arias-Pulido et al. 2011).

Neste sentido, considerou-se importante estabelecer a possível relação entre a

expressão do marcador EGFR e o tipo/risco de HPV. Como tal, levantou-se a hipótese de

uma relação entre a expressão do marcador e o tipo/risco de genótipo de HPV.

Assim, definiu-se H0b: A mediana para o número de células marcadas com

displasia é igual para os diferentes riscos de HPV.

Para testar H0b recorreu-se ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, usando-se



Os gráficos que se seguem auxiliam na resposta à questão formulada

anteriormente.

Figura 17 – Representação gráfica da distribuição do número de registos por risco do genótipo do HPV.

O gráfico da Figura 17 representa a distribuição do número de registos pelo risco do

genótipo do HPV: alto risco, provável alto risco, baixo risco e risco indeterminado. Assim,

o conjunto de dados apresenta 40 registos para infecção por HPV de alto risco, seguido

de 16 casos de infecção por HPV de baixo risco, 10 casos por infecção por HPV de risco

indeterminado e 6 casos de infecção por HPV de provável alto risco.

Os quatro registos em que o risco do HPV foi classificado como „indeterminado‟

foram excluídos do teste estatístico.


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Figura 18 – Representação gráfica da distribuição do número de células EGFR positivas por risco do genótipo do HPV, p=0.265.

A Figura 18 representa a distribuição do número de células EGFR positivas por

risco do genótipo do HPV. O gráfico da Figura 18 e as estatísticas apresentadas na

Tabela 8, mostram que a mediana de células marcadas pelo EGFR é aproximada quando

distribuída pelo risco do genótipo do HPV, observando-se apenas uma distinção para o

HPV de risco indeterminado.

A aceitação de H0b significa que o número de células marcadas por EGFR se

apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado de entre os diferentes riscos

de HPV.

De acordo com o teste de Kruskal-Wallis ( (3) = 3,963, p = 0.265, N = 72), sob

os parâmetros anteriormente especificados, H0b não é rejeitada e como tal, pode afirmar-

se, com uma confiança de 95% (p=0.265 > α = 0.05) que o número de células marcadas

por EGFR se apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado entre os

diferentes genótipos de HPV.

Objectivo 4 - Relação entre a expressão do marcador EGFR e o diagnóstico

histológico

O diagnóstico das lesões de displasia do colo do útero pode ser realizado pelo

exame de Papanicolaou, que embora não detecte o vírus, permite reconhecer as


41/53

alterações que este causa nas células. Por sua vez, a biopsia histológica é utilizada para

a observação e caracterização destas alterações celulares.

Assim, utilizando a metodologia de marcação imunocitoquimica com EGFR em

citologia, questionou-se se a expressão do marcador EGFR poderia estar associada a

algum tipo de lesão diagnosticada em histologia.

A H0c foi colocada no sentido de dar resposta à questão anterior, tomando esta a

seguinte forma: A mediana para o número de células marcadas com displasia é igual

para os diferentes diagnósticos histológicos obtidos.

Para testar H0c recorreu-se ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, usando-se



Figura 19 – Representação gráfica da distribuição do número de registos por diagnóstico histológico.

O gráfico da Figura 19 representa a distribuição do número de registos pelo

diagnóstico histológico obtido: CIN I, CIN II e CIN III. Assim, o conjunto de dados

apresenta 80 registos para lesão CIN I, seguido de 12 casos com lesão CIN II, e 6 casos

de CIN III.


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Figura 20 – Representação gráfica da distribuição do número de células EGFR positivas, pelo tipo de lesão histológica, p= 0.079.

Pela análise do gráfico obtido na Figura 20 e pelas estatísticas apresentadas na

Tabela 8 verifica-se que a mediana do número de células marcadas com EGFR para as

lesões de CIN I e CIN II é relativamente aproximada com 20 e 21,5 células marcadas

respectivamente e para lesões de CIN III a mediana é relativamente superior (47,5).

A aceitação de H0c significa que o número de células marcadas por EGFR se

apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado entre os diferentes

diagnósticos histológicos obtidos.

De acordo com o teste de Kruskal-Wallis ( ) = 5,084, p = 0.079, N = 98), sob

os parâmetros anteriormente especificados, H0c não é rejeitada e como tal, pode afirmar-

se, com um grau de confiança de 95% (p=0.079 > α = 0.05) que o número de células

marcadas por EGFR se apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado de

entre os diferentes diagnósticos histológicos obtidos.


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Tabela 8 – Distribuição do número de células displásicas marcadas com EGFR por diagnósticos e risco do genótipo.

Média Mediana Desvio Padrão KW p-value

Diagnóstico Citológico

ASC-US 23,1786 20 14,80003

0.415 LSIL 29,1667 23,5 18,25475

HSIL 29,5625 19,5 29,62424

Diagnóstico Histológico

CIN I 25,45 20 17,44133

0.079 CIN II 30 21,5 22,35255

CIN III 50,1667 47,5 29,86246

Risco Génotipo

Alto Risco 28,15 20 19,42976

0.265 P Alto Risco 24,3333 21 11,36075

Baixo Risco 32,0625 22 22,53728

Objectivo 5 - Relação entre a expressão do marcador p16 e o tipo/risco de

génotipo do HPV

Estudos no âmbito das lesões displásicas do colo do útero e expressão de

marcadores tumorais têm revelado que a expressão da p16 é marcadamente influenciada

pelo status de expressão da pRb. Segundo a literatura, a sobreexpressão da p16 em

células cervicais pode ser interpretada como um dos indicadores da integração do

genótipo do HPV de alto risco na célula hospedeira, devido à inactivação funcional do Rb

pela proteína E7 (Sano, Oyama et al. 1998).

Assim, questionou-se a hipótese de uma possível relação entre a expressão

citológica de p16 e o tipo/risco de HPV.

A H0d foi colocada no sentido de dar resposta à questão anterior, tomando esta a

seguinte forma: O resultado do teste citológico p16 é independente do risco do HPV.

Para testar H0d utilizou-se o teste χ2 com a estatística de Pearson, através de uma

tabela de contingência cruzando o resultado Citológico p16 e Risco do Genótipo do HPV.


44/53

Figura 21 – Representação gráfica da distribuição da avaliação p16 por risco do genótipo de HPV.

O gráfico da Figura 21 mostra que para a infecção por HPV de alto risco registou-se

um maior número de casos positivos para p16 comparativamente com os restantes. Para

infecções por HPV de provável alto risco e risco indeterminado a expressão positiva para

a p16 mantêm-se, mas com valores inferiores relativamente ao alto risco. Em casos de

infecções por HPV de baixo risco nota-se uma inversão em relação ao número de casos

negativos e positivos para o p16, verificando-se aqui um número mais elevado de casos

negativos para este grupo.


45/53

Tabela 9 – Distribuição da avaliação da p16 e o risco do genótipo de HPV.

Resultado Citológico p16

negativo Positivo

Risco do Genótipo do

HPV

Alto risco 14 26

Provável alto risco 2 a) 4 b)

Baixo risco 10 6

Risco indeterminado 4 c) 6

De acordo com o teste de Pearson (χ2Pearson (3) = 3.771, p = 0.287), sob os

parâmetros anteriormente especificados, H0d não é rejeitada para nível de significância α

de 5% e como tal pode afirmar-se que o resultado do teste citológico p16 não é indicativo

do risco do HPV.

É importante referir que a execução deste teste estatístico pressupõe a verificação

de um conjunto de pré-condições, nomeadamente, a existência de um mínimo de 5

registos por cruzamento entre „Resultado Citológico p16‟ e „Risco do Genótipo do HPV‟.

Este pressuposto enfraquece o resultado do teste obtido, (Tabela 9) uma vez que em a),

b) e c) a pré-condição não se verifica.


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8. DISCUSSÃO DE RESULTADOS

Com este estudo pretendeu-se avaliar pela técnica de imunocitoquímica a

expressão de EGFR em diferentes lesões displásicas do colo uterino.

O trabalho incidiu em 49 casos clínicos que resultaram em 98 registos de citologias

com diferentes lesões de displasia. A representação média da idade encontrou-se nos

32,55 anos e cerca de 35 % das mulheres têm idade superior a 35 anos. Isto reflecte o

facto das infecções por HPV ocorrerem em idades jovens.

Em diferentes populações são encontradas prevalências distintas de diferentes

tipos de HPV, sendo o de alto risco mais frequentemente associado à neoplasia uterina,

especificamente o HPV 16 e 18 (Maufort, A et al. 2010).

Neste trabalho, após genotipagem de HPV, verificou-se que o HPV 16 e HPV 31

foram os mais prevalentes, estando presentes em 13,9% das amostras. Estes resultados

estão de acordo com a literatura (Maufort, A et al. 2010). Por outro lado, o HPV 16 e o 33

foram os mais prevalentes em amostras de HSIL, detectados em 28,6% dos casos com

este tipo de lesão.

Sensibilidade e especificidade do marcador EGFR

Assumindo a displasia da célula como indicador de lesão celular provocada pelo

HPV, sendo esta resultante da desregulação do normal funcionamento do ciclo celular,

avaliou-se em que medida o marcador EGFR pode contribuir para a detecção das lesões

displásicas do colo uterino. Como resultado o marcador EGFR obteve uma sensibilidade

de 78,5%, acompanhada de uma especificidade 92,3%, traduzindo-se assim num

classificador aceitável para a identificação de células displásicas.

Expressão do marcador EGFR e Diagnóstico Citológico

As alterações morfológicas celulares detectadas pelo exame de Papanicolaou são o

resultado de modificações moleculares de proteínas reguladoras, provocadas aquando

da infecção pelo HPV. Assim, algumas dessas proteínas do ciclo celular, nomeadamente

o EGFR, têm sido estudadas para compreender o seu papel na oncongenicidade. Neste

sentido, foi avaliada a relação entre a expressão do marcador EGFR em citologia e as

alterações morfológicas celulares atribuídas em diagnóstico citológico pelo exame de

Papanicolaou. Dos resultados obtidos, conclui-se que o número de células marcadas por

EGFR se apresenta estatisticamente homogéneo quando comparado de entre os

diferentes diagnósticos citológicos de ASC-US, LSIL e HSIL. Assim, o número de células


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displásicas marcadas com o marcador EGFR não é indicativo do tipo de lesão displásica

caracterizada pelo exame de Papanicolaou. Uma vez que não foi possível definir scores

que permitissem tal associação, tornou-se inviável não só comparar os classificadores

pelos métodos de EGFR e p16, como consequentemente verificar uma possível melhoria

na identificação de casos de ASC-US e LSIL com o classificador EGFR.

Expressão do marcador EGFR e o tipo/risco de genótipo de HPV

Dada a sensibilidade do EGFR à proteína E5 do HPV 16 e as propriedades

oncogénicas da mesma, procurou-se verificar uma possível relação entre a expressão do

marcador EGFR e o tipo/risco do genótipo de HPV.

O conjunto de dados estudado apresentou 40 casos de infecção por HPV de alto

risco, seguido de 16 casos de infecção por HPV de baixo risco, 10 casos por infecção por

HPV de risco indeterminado e 6 casos de infecção por HPV de provável alto risco.

Verifica-se assim que, apesar do número reduzido de casos, o grupo de HPV de alto

risco é o de maior representatividade.

Quando analisado o número de células displásicas marcadas com EGFR

relativamente ao risco do genótipo do HPV, verificou-se que este se distribui

maioritariamente de forma homogénea. Notou-se, no entanto, uma ligeira distinção no

caso do HPV de „Risco Indeterminado‟. Não obstante, de acordo os resultados obtidos,

não é possível identificar qualquer relação estatisticamente significativa entre o número

de células displásicas marcadas com EGFR e o risco do genótipo do HPV.

Expressão do marcador EGFR e Diagnóstico Histológico

O diagnóstico das lesões de displasia do colo do útero pode ser realizado pelo

exame de Papanicolaou, que embora não detecte o vírus, permite reconhecer as

alterações que este causa nas células. Por sua vez, a biopsia histológica é utilizada para

a observação e caracterização destas alterações celulares.

Neste sentido, realizou-se uma avaliação da distribuição do número de células

displásicas marcadas com EGFR, pelo tipo de lesão histológica e conclui-se que para

lesões de CIN I e CIN II esta distribuição é semelhante. Em lesões de CIN III este valor é

relativamente distinto, no entanto, sem significância estatística suficiente para o nível de

confiança utilizado.

Deste modo, e apenas acima de um nível de confiança superior a 92.1%, não é

possível identificar qualquer relação estatisticamente significativa entre o número de

células displásicas marcadas com EGFR e o Diagnóstico Histológico.


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Expressão do marcador p16 e o tipo/risco de genótipo do HPV

Os resultados obtidos na análise da expressão do p16 e tipo/ risco do genótipo do

HPV mostraram que para a infecção por HPV de „Alto Risco‟ há um número de casos

positivos para a p16 relativamente mais elevado face aos restantes genótipos. Segundo a

literatura, e de um ponto vista molecular, estes resultados traduzem uma integração do

genótipo do HPV de alto risco nas células hospedeiras (Sano, Oyama et al. 1998).

Nos resultados apresentados para infecções por HPV de „provável alto risco‟ e

„risco indeterminado‟ a expressão positiva para a p16 mantêm-se superior aos casos

negativos, mas com valores inferiores relativamente ao „alto risco‟. Estes resultados

podem ajudar a compreender o potencial oncogénico dos génotipos de HPV de provável

„alto risco‟ e „risco indeterminado‟. Isto devido à capacidade da proteína E7 deste grupo

de vírus vir a promover a inactivação funcional do Rb como acontece com a oncoproteína

E7 dos HPV´s de alto risco.

Em contrapartida, nos casos de infecções por HPV de baixo risco nota-se uma

inversão em relação ao número de casos negativos e positivos para a p16, verificando-se

aqui um número mais elevado de casos negativos para este grupo.

Não obstante dos resultados previamente descritos, verificou-se estatisticamente a

independência entre o número de células displásicas marcadas com p16 e o tipo/risco de

genótipo do HPV, ou seja, diagnóstico obtido pelo marcador p16 não é indicativo do

tipo/risco do genótipo do HPV.


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9. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS

Nos últimos anos, o método de detecção para o rastreio do CCU tem consistido na

avaliação subjectiva pelo exame de Papanicolaou. Apesar do seu êxito, este método

continua a apresentar limitações significativas no que diz respeito à sensibilidade e

especificidade na detecção de lesões pré-neoplásicas. Por outro lado, os testes

moleculares complementares ao exame de Papanicolaou, quando apresentam resultados

positivos para HPV de alto risco, não determinam necessariamente o desenvolvimento

para neoplasia.

Estes dados sugerem a continuidade de investigação em metodologias de

diagnóstico que contribuam com critérios mais precisos que os actualmente utilizados.

As técnicas de imunohistoquímica são cada vez mais utilizadas como método

auxiliar de diagnóstico em patologias do colo do útero com recurso a marcadores

biológicos de detecção que aumentam a sensibilidade do rastreio cervico-vaginal.

Assim, usando as metodologias indicadas, este estudo propôs-se a investigar

características morfológicas, moleculares e imunocitoquímicas das lesões displásicas do

colo do útero com o objectivo de contribuir para novas estratégias de diagnóstico

citológico.

Neste sentido e sabendo que o HPV provoca alteração ao nível do ciclo celular por

interacção com o EGFR, foi objectivo de estudo determinar a adequação da técnica de

imunomarcação por EGFR em citologia como método de rastreio de lesões displásicas

do colo do útero.

De acordo com o estudo realizado e posterior validação estatística dos objectivos

do estudo, pode concluir-se que:

A técnica de imunocitoquímica com EGFR representa um classificador

aceitável para a identificação de células displásicas, uma vez que apresenta

uma sensibilidade e especificidade relativamente próximas dos actuais

métodos utilizados no rastreio cervico-vaginal.

Da relação entre a expressão do marcador EGFR e diagnóstico citológico, o

número de células displásicas identificadas com o EGFR não é indicativo do

tipo de lesão displásica caracterizada pelo exame de Papanicolaou.

Uma vez não sendo possível definir scores que permitissem tal associação,

tornou-se inviável comparar os classificadores pelos métodos de EGFR e p16.

Quando avaliada a relação entre expressão do marcador EGFR e o tipo/risco

de genótipo de HPV verificou-se que não é possível identificar qualquer


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relação estatisticamente significativa entre o número de células displásicas

marcadas com EGFR e o risco do genótipo do HPV associado.

Da análise entre a expressão do marcador EGFR e diagnóstico histológico a

quantificação da expressão do EGFR, detectado por imunocitoquimica, é

sugestivamente maior nos casos de CINIII.

O diagnóstico obtido pelo marcador p16 não é indicativo do tipo/risco do

genótipo do HPV. No entanto, os resultados obtidos na análise da expressão

da p16 e tipo/ risco do genótipo do HPV mostraram que para a infecção por

HPV de alto risco há um número de casos positivos para a p16 relativamente

mais elevado face aos restantes genótipos.

Nos resultados apresentados para infecções por HPV de „provável alto risco‟ e

„risco indeterminado‟, a expressão positiva para a p16 mantêm-se superior aos

casos negativos, mas com valores inferiores relativamente ao „alto risco‟.

Estes resultados podem, em estudo futuros, ajudar na compreensão do

potencial oncogénico dos génotipos de HPV de provável „alto risco‟ e „risco

indeterminado`.

Em conclusão, podemos referir que o EGFR representa um classificador aceitável

para a identificação de células displásicas. Adicionalmente e após quantificação da

expressão de EGFR, pode também concluir-se que este será um potencial método de

screening para detecção de lesões de CIN III.

Neste sentido, seria pertinente dar continuidade ao estudo de forma a melhorar a

metodologia aplicada, definindo estratégias que permitam contornar as limitações

previamente identificadas. Seria também vantajoso aumentar o número de casos

analisados bem como, comparar a expressão imunocitoquimica do EGFR com outros

marcadores imunocitoquimicos.


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ANEXO I

BETHESDA 2001 – Versão Portuguesa

Tipo de amostra

___ Convencional

___ Meio líquido

Avaliação da Amostra

Satisfatória

Com representação da zona de transformação

___ Sem representação da zona de transformação

___

Parcialmente obscurecida por inflamação

Parcialmente obscurecida por sangue

Artefactos de fixação

Outros…………………………………….

Não satisfatória ___

Rejeitada/não processada por…………………………………………………………………..

___

Processada e examinada, mas não satisfatória por…………..………………………………

Categoria Global

___

Negativa para lesão intraepitelial ou malignidade (**)

___

Anomalias de células epiteliais, pavimentosas/glandulares (**)

outra neoplasia maligna (**)

ausência de lesão intraepitelial, mas com presença de células endometriais, a valorizar pela clínica (*)

(*) Comentário opcional: depois dos 40 anos pode estar associada a endométrio sem patologia, alterações hormonais ou

menos frequentemente a patologia endometrial/uterina.

(**)

Negativa para lesão intraepitelial ou malignidade (NILM)

Alterações celulares reactivas associadas a: o Inflamação, radiação, DIU, paraqueratose/hiperqueratose ou outras

Microorganismos o Trichomonas vaginalis o Fungos com morfologia compatível com spp Candida o Desvio da flora vaginal sugestivo de vaginose bacteriana o Bactérias com morfologia compatível com spp Actinomyces o Alterações celulares associadas com o vírus Herpes simplex

Atrofia

Células glandulares benignas pós-histerectomia Anomalias de células epiteliais pavimentosas

Células pavimentosas atípicas o de significado indeterminado – ASC-US o não se pode excluir lesão intraepitelial de alto grau – ASC-H o Lesão intraepitelial de baixo grau – LSIL o Lesão intraepitelial de alto grau – HSIL

Não se pode excluir invasão

Carcinoma epidermóide Anomalias de células glandulares

Células atípicas o Endocervicais o Endometriais o Sem outras especificações (SOE)

Células atípicas, sugestivas de neoplasia o Endocervicais o SOE

Provável adenocarcinoma in situ (AIS) do endocolo

Adenocarcinoma o SOE o Endocervical o Endometrial o Extrauterino

Outra neoplasia maligna: especificar

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