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ELAINE UCHIMA UEHARA
ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DO ÓXIDO NÍTRICO NA
RESPOSTA IN VITRO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE
RECÉM-NATOS E ADULTOS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do título de mestre em
Ciências.
São Paulo 2017
ELAINE UCHIMA UEHARA
ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DO ÓXIDO NÍTRICO NA
RESPOSTA IN VITRO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE
RECÉM-NATOS E ADULTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do título de mestre em Ciências.
Área de concentração: Imunologia
Orientadora: Profª. Drª. Alessandra Pontillo
Coorientador: Prof. Dr. Cyro Alves de Brito
Versão corrigida. A versão original eletrônica, encontra-se disponível tanto na Biblioteca do ICB quanto na Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP (BDTD).
São Paulo
2017
CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e informação Biomédica
do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo
Ficha Catalográfica elaborada pelo(a) autor(a)
UEHARA, ELAINE UHIMA ATIVIDADE IMUNOMODULADORA DO ÓXIDO NÍTRICO NARESPOSTA IN VITRO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE RECÉM-NATOS E ADULTOS / ELAINE UHIMA UEHARA; orientadoraALESSANDRA PONTILLO; coorientador CYRO ALVES DEBRITO. -- São Paulo, 2017. 98 p.
Dissertação (Mestrado) ) -- Universidade de SãoPaulo, Instituto de Ciências Biomédicas.
1. Óxido Nítrico. 2. Neonato. 3. Nitrosilação. 4.Imunidade Neonatal. 5. iNOS. I. PONTILLO,ALESSANDRA, orientador. II. ALVES DE BRITO, CYRO,coorientador. III. Título.
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
Candidata: Elaine Uchima Uehara
Título da Dissertação: Atividade imunomoduladora do óxido nítrico na resposta in vitro de células mononucleares de recém-natos e adultos
Orientadora: Prof.ª Drª Alessandra Pontillo
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a ........./......../.........., considerou a candidata:
( ) Aprovada ( ) Reprovada
Examinador(a): Assinatura: .........................................................................
Nome: .................................................................................
Instituição: ..........................................................................
Examinador(a): Assinatura: .........................................................................
Nome: .................................................................................
Instituição: ..........................................................................
Examinador(a): Assinatura: .........................................................................
Nome: .................................................................................
Instituição: ..........................................................................
Presidente: Assinatura: .........................................................................
Nome: .................................................................................
Instituição: ..........................................................................
Trabalho realizado no Laboratório de Imunogenética do Departamento de
Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas – Universidade de São
Paulo – USP, e no Laboratório de Imunologia Celular do Centro de
Imunologia do Instituto Adolfo Lutz – IAL – SP, com apoio financeiro da
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e do
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Para o meu maior tesouro, minha família: minha mãe Elza, meu pai Douglas,
meu irmão Vinícius e minha avó Teresa, por todo amor e apoio. Amo vocês!
E àqueles que infelizmente se foram no meio dessa caminhada, mas que estiveram
e estarão comigo para sempre: minha amiga Póket (Carla), meu avô Paulo, meu
primo Reinaldo e meu tio Issamu.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por sempre guiar o meu caminho, e por ter me ajudado a chegar até
aqui. Por ter colocado tantas pessoas maravilhosas em minha vida que foram
essenciais para que eu concluísse mais essa etapa.
À minha base, minha família: mãe, pai, Vi e vó, por serem a razão para quem eu
busco sempre ser melhor a cada dia. Obrigada por todo amor, apoio e força em
cada decisão, em cada dificuldade, e a cada vitória.
A todos os meus tios e primos, por nossa união e amor tão importantes em minha
vida.
Aos meus orientadores, Alessandra e Cyro, por terem aceitado essa missão de
ficar comigo indo e vindo entre ICB e IAL (além do LIM-56, é claro!). Cada um,
a seu modo, foi essencial para o meu crescimento acadêmico, científico e pessoal.
Assim, obrigada à Ale, por ter aceitado essa orientação compartilhada, pelos
puxões de orelha quando precisei, por todos os ensinamentos, discussões, por
estar sempre disponível, e acima de tudo, por esse carinho quase maternal que
trata não só a mim, mas a todos seus alunos. Ao Cyro por todas as discussões
científicas, de carreira, por ter aguentado todos os meus choros e momentos de
desespero. Por nunca ter desistido, e sempre ter acreditado no projeto.
Aos meus queridos irmãos do Laboratório de Imunogenética: Dhêmerson,
Edione, Fernanda, Jaíne e Vinícius (e Pamela!) por essa nossa relação quase que
familiar. Obrigada por terem me acolhido com tanto carinho, mesmo eu sendo a
irmã adotada!
Aos amigos do centro de Imunologia do IAL: Camila, Kelly, Alan, Karolzinha,
Fernanda, Adriana, e em especial à Carol, por ser minha companheira dos
nossos inacabáveis CBAs! Obrigada a todos os pesquisadores, funcionários e
alunos do Centro de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz.
Meu especial agradecimento à Dra. Maria N. Sato e a todo o grupo da
“Experimental” e seus agregados (Anninha, Aline, Amandinha, Fabinho, Fran,
Gabriel, Kelly, Luanda, Marília, Marina, Nat e Nilson). Obrigada por todos os
reagentes emprestados, pela convivência sempre agradável, e por tantas vezes
terem me ajudado e aconselhado em tantos experimentos. Em especial, obrigada
à Anna Júlia e à Luana por nossas noites no laboratório, seja fazendo
experimento, seja discutindo resultados, estatística, a vida acadêmica, ou mesmo
sobre os filmes do Oscar!
Aos professores da banca de qualificação, Prof. Niels O. S. Câmara, Prof.ª Telma
M. Oshiro e Prof.ª Suzana V. Mello pelas sugestões e questionamentos que
enriqueceram esse trabalho.
Ao Prof. Anderson de Sá Nunes, e a todos os amigos que fiz organizando os
cursos de férias (Aline, Bruna, Caio, Cainho, Felipe, Ildefonso, Isa Suzuki, Nath,
Rafa, Raíssa, Theresa e Thi). Obrigada pelos nossos churrascos, happy hours,
mas também pelas semanas de muito trabalho e noites sem dormir durante os
cursos. Foi um aprendizado muito grande!
Não posso esquecer aqueles que foram responsáveis pelo início de tudo isso, ao
Prof. João Pessoa Araújo Junior, e à Dra. Sueli Akemi Taniwaki (Chefinha!) que
lá atrás me orientaram na iniciação científica, e me deram a minha primeira
oportunidade de fazer ciência.
Aos meus amigos de Botucatu, que provaram que “o que Botucatu constrói
ninguém destrói”. Obrigada Dyaxu (Evandra), Takííí (Manuela), Uai (Marlous),
Napalm (Natanael) e Trident (Renata) por serem tão presentes ainda hoje, mesmo
que a distância ou a vida corrida pesem. Obrigada por cada almoço correndo,
esbarrão na Dr. Arnaldo, ou saídas de final de semana. Vocês me lembram o
quanto valeu à pena ter ido para a terra dos bons ares! E um agradecimento
especial à Dupexe (Cecília), que do outro lado do Atlântico continua a me
inspirar cientificamente, e ser meu exemplo de dedicação e cientista!
À toda equipe (médicos, enfermeiras, residentes e internos) do Centro Obstétrico
do HU, mas principalmente à todas as mães que me permitiram participar de um
momento tão especial como o nascimento de um filho, para que essa pesquisa
conseguisse ser feita.
Por último, e não menos importante, gostaria de agradecer a pessoas que não
estão mais aqui fisicamente, mas que tiveram uma participação enorme em tudo
isso.
À minha querida Póket (Carla), como você e sua alegria fazem falta aqui amiga!
Espero que daí de cima esteja se orgulhando, como eu me orgulhava de você!
Que em cada vitória estejamos festejando, e rindo como fazíamos sempre juntas.
Ao meu avô, Paulo e ao Tio Issamu, que sempre me incentivaram
profissionalmente.
Ao meu primo Reinaldo, por ser o primo engenheiro mecatrônico que entendia de
química! Re, pelo nosso último dia juntos, quando você me arguiu sobre esse
trabalho como se fosse um dos membros da banca, esse trabalho é pra você, e
espero que esteja à altura do seu perfeccionismo.
Às agências de fomento, CNPq e FAPESP, pelo auxílio financeiro.
E a todos aqueles que participaram direta ou indiretamente dessa etapa. Perdão
por não ter te mencionado aqui, mas meus sinceros agradecimentos!
“Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu
É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu
É sobre ser abrigo e também ter morada em outros corações
E assim ter amigos contigo em todas as situações”
(Trem Bala - Ana Vilela)
RESUMO
UEHARA, E. U. Atividade imunomoduladora do óxido nítrico na resposta in vitro de células mononucleares de recém-natos e adultos. Dissertação (Mestrado em Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.
O período neonatal é marcado por uma maior susceptibilidade a diversas infecções, devido a uma dificuldade do seu sistema imune de gerar respostas pró-inflamatórias e de perfil Th1. As atividades microbicidas do óxido nítrico já são muito bem descritas, entretanto, seu potencial como molécula imunorreguladora vem chamando a atenção, e o número de publicações relatando essas atividades vem crescendo. Assim, a proposta deste trabalho foi avaliar as potenciais atividades imunomoduladoras deste composto, e sua capacidade em reverter esse perfil anti-inflamatório e Th2 tão característico do período neonatal. Para tanto, células mononucleares de adultos e neonatos foram isoladas a partir de sangue periférico e de cordão umbilical, respectivamente. Estas células foram estimuladas com agonistas de TLR ou PHA, na presença do inibidor de óxido nítrico sintase, NOS (L-NAME), ou do doador de NO, NOC-18. Os resultados mostraram uma menor secreção de citocinas pró (IL-1β, TNF-α, IL-6) e anti-inflamatórias (IL-10) nas células de adultos tratadas com L-NAME e estimuladas com CL097 e LPS. O mesmo foi observado para as células de neonatos quanto à secreção de TNF-α, IL-6 e IL-10. O estímulo com o agonista de TLR3, Poly I:C, em contrapartida, parece não ser modulado pela inibição das NOS, já que não houve mudança na secreção de citocinas quando apenas o estímulo inato foi utilizado, para os dois grupos. A adição do doador de NO, entretanto, parece não ter modulado a secreção destas 4 citocinas em neonatos, e em adultos. De forma geral, o estímulo policlonal de PHA, em conjunto com NOC-18 não alterou proliferação, ativação e apoptose de linfócitos de adultos, entretanto, causou uma alteração do perfil de citocinas secretadas (aumento de IL-4, IL-2, IL-10 e TNF-α). Nos neonatos, em contrapartida, não houve alteração no perfil de citocinas secretadas, mas foi possível observar um aumento da população de linfócitos T CD4+ ativados, além da maior expressão de CD69 nestes. Em conjunto, os dados indicam que o NO pode gerar alterações diferentes nas células mononucleares de adultos e neonatos, corroborando com as divergências já descritas entre os dois sistemas imunes, e ressaltando outros pontos nos quais as células tem susceptibilidades distintas. Já se sabe que os neonatos possuem menores quantidades de enzimas antioxidantes, possibilitando um acúmulo de espécies reativas, que tem potencial para reagir com o NO e causar modificações proteicas como a S-nitrosilação. O crescente número de publicações sobre as modificações que o NO é capaz de causar em proteínas, e como eles podem regular diversos processos celulares nos leva a acreditar que, nos neonatos, o NO é capaz de nitrosilar enzimas e/ou fatores de transcrição que estejam envolvidos nos processos celulares alterados que foram observados.
Palavras-chave: Óxido nítrico. Neonato. Nitrosilação. Imunidade neonatal. iNOS.
ABSTRACT
UEHARA, E. U. Nitric oxide immunomodulatory activity in newborn and adult mononuclear cell responses in vitro. Masters Thesis (Immunology). Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2017.
Early life is characterized by an increased susceptibility to a variety of infections because the difficult that newborn immune system has to develop proinflammatory and Th1 responses. Nitric oxide’s microbicidal activities are well described, however, its immunomodulatory potential have been drawing attention, and the number of publications describing these activities is booming. Then, the proposal of this work was to evaluate NO-immunomodulatory properties, and whether NO is able to exchange anti-inflammatory and Th2 responses, which is the main characteristic of newborn immune system. For this purpose, adult and newborn’s mononuclear cells were isolated from peripheral and cord blood, respectively. Cells were stimulated with TLR agonists and PHA, in the presence of nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME, or an NO-donor, NOC-18. There were less pro (IL-1β, TNF-α and IL-6) and anti-inflammatory (IL-10) cytokine release in L-NAME-treated cells stimulated with CL097 and LPS. The same was observed in newborn mononuclear cells to TNF-α, IL-6 and IL-10 release. TLR3 stimulus (Poly I:C), however, apparently were not modulated by NOS inhibition once there were no cytokine release changes in comparison to the situation with TLR stimulus alone, in both groups. NO-donor addition, however, did not modulate these inflammatory cytokine release, in adults and neonates. In a general way, polyclonal stimulus, PHA, together with NOC-18 did not change proliferation, activation and apoptosis rates in adult lymphocytes, nevertheless, changed the cytokine profile release (increasing IL-4, IL-2, IL-10 and TNF-α secretion). In spite of, in neonates, there were no modulation of cytokine release, but we were able to see an increase number of activated T CD4+ cells, and a higher CD69 expression on it. In resume, results indicates NO is able to have different effects in newborn and adult mononuclear cells, corroborating with the differences that have already been described between both immune systems, and highlighting point in which they have different susceptibilities. Is it already known that neonates have lower amounts of antioxidant enzymes, allowing an accumulation of reactive species, which has the potential to react with NO and to cause protein modifications such as S-nitrosylation. The increasing number of publication on the modification that NO is able to cause in proteins, and how they can regulate several cellular processes lead us to believe that, in neonates, NO is able to nitrosylates enzymes and/or transcription factors that are involved in the altered cellular processes that we observed.
Keywords: Nitric oxide. Newborn. Nitrosylation. Neonate immunity. iNOS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fatores imunes presentes na pele, mucosas e no sangue durante a vida
fetal, em neonatos pré-termo e termo, durante a infância e na vida adulta. ................... 26
Figura 2 - Perfil de polarização de respostas de linfócitos em diferentes períodos da
vida. ............................................................................................................................................ 28
Figura 3 - Metabolismo da L-arginina pelas enzimas iNOS e arginase-1. ..................... 30
Figura 4 - Vias de ativação de iNOS por TLR e citocinas. ................................................ 31
Figura 5 - Representação esquemática do trabalho. ......................................................... 39
Figura 6 - Estratégia de análise dos dados de citometria de fluxo para a avaliação de
proliferação e ativação de linfócitos. ..................................................................................... 45
Figura 7 - Estratégia de análise dos dados de citometria de fluxo para avaliação da
apoptose de linfócitos. ............................................................................................................. 47
Figura 8 - Expressão ex vivo de ARG1 e NOS2 em células mononucleares de
neonatos e adultos. .................................................................................................................. 52
Figura 9 - Modulação da expressão de NOS2 e ARG1 em células mononucleares de
adultos e neonatos após o estímulo com agonistas de TLR. ............................................ 53
Figura 10 - Aumento de secreção de TFN-α e IL-10 por células mononucleares de
adultos quando estimulados com agonistas de TLR7/8 (CL097) e TLR4 (LPS),
respectivamente, em comparação aos neonatos................................................................ 55
Figura 11 - Heatmap representativo da produção de citocinas inflamatórias por células
mononucleares de adultos e neonatos, tratadas com inibidor de NOS, L-NAME, e
posterior estímulo com agonistas de TLR. ........................................................................... 56
Figura 12 - Heatmap representativo da produção de citocinas inflamatórias por células
mononucleares de adultos e neonatos, estimuladas com agonistas de TLR, e o doador
de NO, NOC-18. ....................................................................................................................... 59
Figura 13 - Modulação da expressão de NOS2 e ARG1 em células mononucleares
estimuladas com PHA e o doador de NO, NOC-18. ........................................................... 61
Figura 14 - Percentual e grau de ativação de linfócitos de neonatos e adultos após
estímulo com PHA e com o doador de NO (NOC-18). ....................................................... 63
Figura 15 - Taxa de proliferação de linfócitos de neonatos e adultos estimulados com
PHA (A) e PHA mais o doador de NO, NOC-18 (B, C e D). .............................................. 65
Figura 16 - Correlação entre ativação e proliferação de linfócitos T CD8+ e B de
neonatos estimulados com o mitógeno PHA. ...................................................................... 66
Figura 17 - Apoptose (células AnexinaV+) de linfócitos de adultos e neonatos
estimulados com PHA e NOC-18. ......................................................................................... 67
Figura 18 - Correlação entre ativação (expressão de CD69) e apoptose (expressão de
fosfatidilserina) em linfócitos T CD4+ (A, B, E e F) e T CD8+ (C, D, G e H) de adultos e
neonatos estimulados somente com PHA (A, B, C e D) ou com PHA em conjunto com
200 µM de NOC-18 (E, F, G e H). ......................................................................................... 69
Figura 19 - Correlação entre ativação (expressão de CD69) e apoptose (expressão de
fosfatidilserina) em linfócitos B de adultos e neonatos estimulados somente com PHA
(A e B) ou com PHA em conjunto com 200 µM de NOC-18 (C e D)................................ 70
Figura 20 - Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 por células mononucleares
de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o doador de NO, NOC-18, por 48
horas. .......................................................................................................................................... 72
Figura 21 - Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 por células mononucleares
de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o doador de NO, NOC-18, por 120
horas. .......................................................................................................................................... 74
Figura 22 - Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 por células mononucleares
de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o inibidor de NOS, L-NAME, por 48
horas. .......................................................................................................................................... 76
Figura 23 - Modulação da expressão de GATA3 e RORC2 em células mononucleares
estimuladas com PHA e o doador de NO, NOC-18. ........................................................... 78
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Dados demográficos e clínicos dos recém-natos estudados ......................... 40
Tabela 2 - Dados demográficos dos adultos estudados .................................................... 41
Tabela 3 - Marcadores utilizados para avaliação do perfil de ativação e proliferação de
linfócitos ..................................................................................................................................... 44
Tabela 4 - Marcadores utilizados para avaliação de morte celular .................................. 46
Tabela 5 - Sequências de oligonucleotídeos (primers) utilizados para amplificação dos
genes NOS2, ARG1, RORC2, GATA3 e do gene housekeeping, GAPDH .................... 49
Tabela 6 - Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e
neonatos, tratadas com inibidor de NOS, L-NAME, e posterior estímulo com agonistas
de TLR........................................................................................................................................ 58
Tabela 7 - Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e
neonatos, estimuladas com agonistas de TLR, e o doador de NO, NOC-18. ................ 60
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitro
µM micromolar
AID Activation-induced deaminase citidine
AIM2 Absent in melanoma 2
AMPc Cyclic adenosine monofosfate
APC Antigen-presenting cell
CAT Catalase
CBA Cytometric Bead Array
CBP BREB-binding protein
CD Cluster differentiation
cDNA DNA complementar
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl ester
CL097 Imidazoquinoline
CNS-1 Conserved non-coding sequence 1
CO2 Gás Carbônico
ct cycle threshold
CVID Commom variable immunodeficiency
DAMP Danger-associated molecular pattern
DC Dendritic cell
eNOS Endothelial nitric oxide-synthase
FoxP3 Forkhead box P3
GATA3 GATA-binding protein 3
GMPc Monofosfato cíclico de guanosina
GPX Glutationa peroxidase
HDAC Histona deacetilase
HUAEC Human umbilical artery endotelial cells
IFN-α Interferon alfa
IFN-β Interferon beta
IFN-γ Interferon gama
IL Interleucina
ILC Innate lymphoid cell
iNOS Inducible nitric oxide-synthase
IRF Interferon regulator factor
ISG Interferon-stimulated genes
L-NAME Nω-nitro-L-arginina-metil-éster
LPS Lipopolissacarídeo
M1 Macrófago do tipo M1
M2 Macrófago do tipo M2
MAPK Mitogen Activated Protein Kinase
MDSC Myeloid-derived suppressor cell
MHC Complexo Principal de Histocompatibilidade
mL Mililitro
mM Milimolar
MyD88 Myeloid differentiation primary response 88
N2O3 Trióxido de dinitrogênio
NF-κB Nuclear factor kappa B
NLR NOD-like receptor
NLRC4 NLR Family CARD domain containing 4
NLRP3 NLR Family Pyrin domain containing 3
nNOS óxiNeuronal nitric oxide-synthase
NO Óxido Nítrico
NO+ Íon nitrosium
NO2 Dióxido de nitrogênio
NOC-18 1-[N-(2-Aminoethyl)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolate
NOD Nucleo-binding Oligomerization Domain
NOS Óxido nítrico sintase
O2º- Radical superóxido
ONOO- Radical peróxinitrito
PAMP Pathogen-associated molecular pattern
PARP1 Poly(ADP-ribose) polymerase-1
PCR Polymerase-chain reaction
PHA Fitohemaglutinina
Poly I:C Polyinosinic Polycytidylic Acid
RNA Ácido ribonucleico
PBS Phosphate Buffered Saline
RORγt RAR-Related Orphan Receptor Gamma
SOCS Suppressor of cytokine signaling
SOD Superóxido dismutase
STAT Signal Transducer and Activator of Transcription
T reg Célula T reguladora
Tbet t-box transcription factor
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGF-β Transforming Growth Factor Beta
Th T helper lymphocyte
Tip-DC TNF/iNOS-producing dendritic cell
TLR Toll-like receptor
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TRIF TIR-domain-containing adapter-inducing interferon β
αCD3 Anticorpo anti-CD3
SUMÁRIO
1 Introdução ........................................................................................................ 22
1.1 Imunidade inata neonatal .............................................................................................. 22
1.2 Imunidade adaptativa neonatal .................................................................................... 27
1.3 NO e a resposta imune ................................................................................................. 29
1.4 NO como modulador da resposta imune .................................................................... 32
1.5 Justificativa ...................................................................................................................... 34
2 Objetivos .......................................................................................................... 37
2.1 Objetivos específicos ..................................................................................................... 37
3 Material e Métodos .......................................................................................... 39
3.1 Desenho Experimental .................................................................................................. 39
3.2 Casuística ........................................................................................................................ 39
3.3 Coleta de material biológico ......................................................................................... 41
3.4 Obtenção e cultura de células mononucleares ......................................................... 41
3.4.1 Avaliação da influência do óxido nítrico na resposta imune inata .......................... 42
3.4.2 Avaliação da influência do óxido nítrico na resposta imune adaptativa ................ 43
3.5 Ensaio de proliferação e caracterização das subpopulações de linfócitos .......... 43
3.6 Avaliação de apoptose em subpopulações de linfócitos ......................................... 45
3.7 Quantificação de citocinas ............................................................................................ 47
3.8 Avaliação da produção de NO ..................................................................................... 48
3.9 Isolamento de RNA e avaliação da expressão gênica relativa ............................... 48
3.10 Análise estatística .......................................................................................................... 50
4 Resultados ....................................................................................................... 52
4.1 Expressão gênica de NOS2 e ARG1 em células mononucleares de adultos e
neonatos .................................................................................................................................... 52
4.2 Modulação da expressão gênica de NOS2 e ARG1 em células mononucleares
de adultos e neonatos após estímulo com agonistas de TLR ........................................... 53
4.3 Produção de NO e citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos
e neonatos após estímulo com agonistas de TLR .............................................................. 54
4.4 Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e
neonatos tratadas com inibidor de NOS e estimuladas com agonistas de TLR ............ 55
4.5 Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e
neonatos após estímulo com agonistas de TLR na presença do NO exógeno ............. 58
4.6 Modulação da expressão gênica de NOS2, ARG1 em células mononucleares de
adultos e neonatos estimuladas com PHA ........................................................................... 61
4.7 Avaliação fenotípica dos linfócitos de adultos e neonatos após estímulo com o
mitógeno PHA, e o doador de NO, NOC-18 ........................................................................ 62
4.8 Avaliação da proliferação dos linfócitos de neonatos e adultos após estímulo com
o mitógeno PHA, e o doador de NO, NOC-18 ..................................................................... 64
4.9 Avaliação da apoptose de linfócitos de neonatos e adultos após estímulo com o
mitógeno PHA e o doador de NO, NOC-18 ......................................................................... 66
4.10 Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 em células mononucleares
estimuladas com o mitógeno PHA e o doador de NO, NOC-18 ....................................... 70
4.11 Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 em células mononucleares
estimuladas com o mitógeno PHA e o inibidor de NOS, L-NAME ................................... 75
4.12 Modulação da expressão gênica de GATA3 e RORC2 em células
mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o doador de NO,
NOC-18 ...................................................................................................................................... 77
5 Discussão......................................................................................................... 80
6 Conclusões ...................................................................................................... 88
Referências* .............................................................................................................. 89
INTRODUÇÃO
22
1 Introdução
Mesmo com o avanço da ciência e da medicina, a primeira infância
ainda é um período crítico onde aproximadamente 40% dos óbitos de crianças
até 5 anos de idade ocorre enquanto elas ainda são recém-nascidas. Ao
menos 60% destes óbitos são decorrentes de prematuridade e/ou infecções
(BHUTTA; BLACK, 2013; LIU et al., 2012). Por isso, em função desta elevada
taxa de letalidade, e à maior susceptibilidade a diversas infecções, o período
neonatal recebe especial atenção.
Durante muito tempo atribuiu-se essa susceptibilidade nos recém-natos
a um sistema imune deficiente e menos desenvolvido, denominações
consideradas mal-empregadas atualmente. Nos dias atuais, os pesquisadores
preferem atribuir essas diferenças na responsividade do sistema imune do
neonato à fase de transição pelo qual ele passa, de um ambiente “estéril”,
dentro da placenta, e sob a influência de diversos sinais anti-inflamatórios
necessários para a manutenção da gestação, para um mundo externo repleto
de antígenos e patógenos (ADKINS et al., 2014; KOLLMANN et al., 2017;
ZHANG et al., 2017). Soma-se a essa mudança de microambiente, a
colonização bacteriana em diversas superfícies do corpo, como pele e trato
gastrointestinal (GENSOLLEN et al., 2016). Sendo assim, é necessário que o
sistema imune do recém-nascido seja capaz de combater infecções, mas ao
mesmo tempo, que não reaja de maneira exacerbada a alguns estímulos
microbianos, a fim de evitar processos inflamatórios intensos.
Alguns pontos nos quais os sistemas imunes de neonatos e adultos
divergem já foram descritos, e estes contemplam desde a resposta imune inata
até a adaptativa.
1.1 Imunidade inata neonatal
A imunidade inata dos neonatos é foco de muitos estudos, dada sua
importância como primeira linha de defesa do organismo, e sua capacidade de
direcionar a resposta imune adaptativa (GOENKA; KOLLMANN, 2015;
KOLLMANN et al., 2012).
23
Logo ao nascer, o recém-nato, nascido a termo, é recoberto pela
chamada vernix caseosa, secreção branca de glândulas sebáceas fetais que
recobre o neonato nos primeiros dias de vida. Essa secreção contém uma série
de peptídeos antimicrobianos como lisozima e β-defesinas que vão atuar como
primeira barreira física na defesa contra microorganismos (TOLLIN et al., 2005)
(Figura 1).
Ao contrário do que se pode pensar, a quantidade de células (como
monócitos, células dendríticas e neutrófilos) nesse período é bastante
semelhante ao que é encontrado em indivíduos adultos (GOENKA;
KOLLMANN, 2015; GUILMOT et al., 2011; KOLLMANN et al., 2009; LEVY et
al., 1999), entretanto, funcionalmente, o que se observa é uma reduzida
capacidade dessas células de induzir respostas pró-inflamatórias.
Os neutrófilos neonatais possuem atividade fagocítica diminuída
(SILVEIRA-LESSA et al., 2016), além de quantidades de duas a quatro vezes
menores de peptídeos antimicrobianos pré-formados (LEVY et al., 1999), o que
dificulta a eliminação de bactérias Gram negativas, e pode aumentar a
susceptibilidade dos neonatos frente à sepse, por exemplo.
As células NK, por sua vez, encontram-se em número bastante
aumentado no sangue periférico dos recém-natos quando comparadas com
adultos. Após o nascimento, a quantidade dessas células cai
progressivamente, atingindo números semelhantes aos de um adulto até os 5
anos de idade. Apesar desse número aumentado de células, há uma grande
deficiência nas respostas antivirais e antitumorais devido a dificuldades que
essas células NK têm para secretar IFN-γ (GUILMOT et al., 2011).
As células inatas neonatais têm maior dificuldade de expressar
moléculas coestimuladoras e secretar citocinas importantes não só para uma
correta ativação, mas também para um direcionamento adequado da resposta
imune celular. Monócitos e células dendríticas (convencionais e
plasmocitóides) de neonatos secretam quantidades menores de TNF-α, IL-
12p70 e IFN-γ, e expressam menos CD80, CD86 e moléculas de MHC de
classe II após ativação via receptores do tipo Toll (TLR). O número de DCs
polifuncionais para essas citocinas também se encontra diminuído
(KOLLMANN et al., 2009).
24
A expressão de receptores de imunidade inata como os TLR e os NOD-
like receptors (NLR) também se encontra conservada e estável nos recém-
natos, entretanto, funcionalmente, percebe-se algumas diferenças que tornam
esse tipo de imunidade nesse período da vida um pouco menos eficiente
(DOWLING; LEVY, 2014).
Fatores solúveis como as proteínas do sistema complemento
encontram-se não só diminuídas no início da vida (cerca de dois terços da
quantidade encontrada em adultos), como possuem menores capacidades
opsonizantes e líticas (MCGREAL et al., 2012) (Figura 1).
As concentrações de adenosina, purina endógena, ao contrário dos
demais fatores solúveis, encontram-se mais elevadas no plasma de neonatos
(cerca de quatro vezes mais) e pode exercer funções supressoras nas células
imunes (Figura 1). Esta pode se ligar em seus receptores de membrana,
aumentando a concentração intracelular do segundo mensageiro, o
monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). Já há relatos mostrando que, em
células mononucleares neonatais, as concentrações de AMPc são até 20 vezes
maiores do que nas de adultos, e que isso impacta diretamente na inibição da
transcrição de uma série de citocinas responsáveis pela polarização de perfil
Th1, e aumenta a secreção de citocinas que direcionam para um perfil
regulador (IL-10) e Th17 (IL-6 e IL-23) (HASKÓ et al., 2000; KOLLMANN et al.,
2012; LEVY et al., 2006). Os maiores níveis desse segundo mensageiro
interferem, por exemplo, na sinalização pelo TLR2, através da inibição da
fosforilação da MAPK, interferindo diretamente na secreção de citocinas pró-
inflamatórias (KOLLMANN et al., 2012).
A dificuldade das pDCS de transcrever e secretar IFN do tipo I ocorre
devido a um problema na translocação do IRF7 para o núcleo, e
consequentemente problemas na transcrição dos genes de IFN-α e IFN-β
(DANIS et al., 2008). A ligação de IRF3 ao coativador CBP é menor nos
neonatos, e isso interfere diretamente na secreção das mesmas citocinas pós
estímulo via TLR3 e TLR4 TRIF-dependente e na transcrição de genes
induzidos por IFN (Interferon-stimulated genes - ISGs) (AKSOY et al., 2007).
A exposição das células NK ao TGF-β (secretado provavelmente por
células T reguladoras) inibe uma correta maturação destas, além de afetar
diretamente a secreção de IFN-γ e a desgranulação dessas células em
25
humanos e camundongos. Essa citocina reguladora suprime o aumento de
expressão de fatores de transcrição, como t-bet e GATA3, necessários nos
últimos estágios de maturação e desenvolvimento das NK (IVARSSON et al.,
2013; MARCOE et al., 2012).
Recentemente houve a descrição das células eritróides CD71+, que
também parecem contribuir para o microambiente anti-inflamatório dos
neonatos (Figura 1). Estas foram descritas como células eritróides, nucleadas,
que expressam grandes quantidades de arginase-2 e parecem ser importantes
para controlar a inflamação local gerada no trato gastrointestinal após
colonização bacteriana (ELAHI et al., 2013).
Outro tipo celular, que parece estar aumentado na primeira infância, e
que colabora com a supressão das respostas imunes são as MDSCs (Myeloid-
derived supressor cell ou células mielóide supressoras) (Figura 1). Estas
células de origem mielóide são caracterizadas por induzirem a supressão in
vitro de linfócitos e células NK através de diversos mecanismos, dentre eles a
expressão de iNOS e arginase-1, e a produção de espécies reativas de
oxigênio (GANTT et al., 2014; GERVASSI et al., 2014).
Muitos destes fatores, característicos da resposta imune inata neonatal,
exercem importante impacto no desenvolvimento de respostas adaptativas. A
dificuldade das DCs em secretarem IL-12p70 e IFN-γ e aumentar a expressão
de moléculas coestimuladoras, como CD80 e CD86, favorece a diferenciação
dos linfócitos TCD4+ em Th2, Th17 e até mesmo em T reguladoras (Treg).
Esse perfil de resposta imune, com menor secreção de citocinas pró-
inflamatórias e de padrão Th1, favorece a maior susceptibilidade a uma série
de infecções por patógenos intracelulares.
26
Figura 1 - Fatores imunes presentes na pele, mucosas e no sangue durante a vida fetal, em neonatos pré-termo e termo, durante a infância e na vida adulta. Durante a vida fetal, e logo após o nascimento, durante o período neonatal, o recém-nato apresenta uma série de fatores que contribuem para a supressão do seu sistema imune (adenosina plasmática, células T reguladoras, células eritróides). Todos esses fatores visam, principalmente, evitar uma resposta imune exacerbada frente à colonização microbiana que estão sofrendo. Apesar destes, os neonatos contam com alguns fatores protetivos como os peptídeos antimicrobianos da vernix caseosa e os anticorpos maternos (adquiridos por passagem transplacentária, ou pela amamentação). Com o amadurecimento do sistema imune, há uma diminuição desses fatores supressores/reguladores, e um aumento de outros elementos que irão colaborar para uma resposta eficiente contra diversos tipos de patógenos (ILCs, proteínas e peptídeos antimicrobianos, componentes do sistema complemento, e uma maior e melhor polarização dos linfócitos para o perfil Th1) (KOLLMANN et al., 2017).
27
1.2 Imunidade adaptativa neonatal
A limitada exposição a antígenos intraútero faz com que os neonatos
tenham um repertório limitado não só de linfócitos T e B de memória, mas
também de células efetoras. Além disso, a resposta imune inata, pouco eficaz
no combate a potenciais patógenos, interfere na resposta dos neonatos a
muitos patógenos, e ao desenvolvimento de uma reposta protetora pós-
vacinação (ADKINS, 2007; DOWLING; LEVY, 2014; THOME et al., 2016).
As maiores concentrações de IL-10 parecem agir de forma autócrina nas
DCs de cordão, limitando a sua maturação, e somada à ausência de IL-12 e
IFN-γ, favorecem a polarização dos linfócitos T CD4+ neonatais em Th2
(LANGRISH et al., 2002) (Figura 2). Além dos fatores imunes, fatores
epigenéticos colaboram para essa maior polarização Th2 no período neonatal.
Os loci das citocinas características do perfil Th2 (IL-4, IL-5 e IL-13) encontram-
se mais disponíveis pela menor metilação do CNS-1, um enhancer e co-
regulador da expressão destas citocinas. Assim, linfócitos de neonatos quando
estimulados (mesmo em condições não polarizantes) respondem rapidamente
com maiores secreções de IL-4, enquanto que linfócitos adultos (que possuem
o CNS-1 hipermetilado) não só demoram mais tempo, mas também necessitam
de citocinas que direcionem sua resposta para um perfil Th2 (ZAGHOUANI et
al., 2009).
Por sua vez, a maior secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-1β,
IL-6 e IL-23 pelas células mononucleares neonatais favoreceriam a
diferenciação dos mesmos linfócitos em Th17 (KOLLMANN et al., 2009)
(Figura 2), entretanto, o que se observa, é uma maior dificuldade na
diferenciação desses linfócitos, ocasionado por uma menor expressão do RNA
mensageiro de seu fator de transcrição, RORγt (DE ROOCK et al., 2013).
A maior proporção de células T reguladoras (30 a 40% do total de
células T CD4+) tanto na periferia quanto em órgãos linfoides de neonatos,
quando comparado com adultos, corrobora para essa dificuldade de
desenvolver respostas de perfil Th1 (THOME et al., 2016) (Figura 2).
Funcionalmente, in vitro, a depleção dessas células reguladoras neonatais
aumenta a proliferação de linfócitos, a secreção de citocinas, e melhora a
28
resposta contra patógenos de forma epítopo-específica (BRUSTOSKI et al.,
2006; FERNANDEZ et al., 2008; LEGRAND et al., 2006; THOME et al., 2016).
Figura 2 - Perfil de polarização de respostas de linfócitos em diferentes períodos da vida. O período neonatal é marcado por uma maior resposta anti-inflamatória, e uma polarização de perfil Th2 e regulador. Após este período, os indivíduos tornam-se mais capazes de desenvolver respostas pró-inflamatórias, antivirais e polarizar sua resposta para um perfil Th1 (KOLLMANN et al., 2012).
Tal dificuldade em desenvolver uma resposta eficiente de linfócitos T vai
afetar também o desenvolvimento de centros germinativos, e
consequentemente de linfócitos B. Apesar de tardia, e em menores
quantidades, camundongos imunizados no nascimento são capazes de gerar
centros germinativos, expressar enzimas importantes para a troca de classe de
imunoglobulinas como a AID (Activation-induced Citidine Deaminase – Citidina
Deaminase induzida por ativação), e secretar anticorpos quando comparados
com animais adultos (MUNGUÍA-FUENTES et al., 2017). Entretanto, nesse
período, os linfócitos B expressam menores quantidades de moléculas como o
CD73 (PETTENGILL; LEVY, 2016). A expressão reduzida dessa
ectonucleotidase impacta diretamente na maturação e troca de isotipo de
anticorpo em linfócitos B, como já foi demonstrado em camundongos adultos e
em indivíduos adultos com imunodeficiência comum variável (CVID – Common
Variable Immunodeficiency) (SCHENA et al., 2013). Parece haver, também,
uma menor migração de plasmócitos para a medula óssea, colaborando para
29
que essa resposta mediada por anticorpos não se sustente por muito tempo
(PIHLGREN et al., 2001).
Com essa resposta imune de caráter mais anti-inflamatório, e com uma
polarização de resposta que não favorece a defesa contra patógenos
intracelulares, a susceptibilidade na infecção por estes agentes encontra-se
aumentada no período neonatal (Figura 2).
1.3 NO e a resposta imune
O óxido nítrico (NO) é um pequeno e inorgânico radical, instável,
produzido a partir da oxidação do aminoácido L-arginina através da ação da
enzima óxido nítrico sintase (NOS) (DAVIS et al., 2001).
O NO entrou no cenário da imunologia no final da década de 80, tendo
sido descrito como molécula microbicida, produzida por fagócitos, através da
ação da óxido nítrico sintase induzida (iNOS). Entretanto, atualmente, sabe-se
que não só outras células do sistema imune são capazes de produzir NO,
como também pode haver a expressão das demais isoformas de NOS (eNOS –
óxido nítrico sintase endotelial, e nNOS - óxido nítrico sintase neuronal)
(BOGDAN, 2001; 2015).
As NOS são todas homodímeros que catalisam a oxirredução da L-
arginina (Figura 3). As duas isoformas constitutivas (eNOS e nNOS) produzem
baixas concentrações de NO e agem de forma dependente de Ca2+, ao passo
que a induzida (iNOS) produz altas quantidades de NO, de forma independente
de Ca2+ mas dependente de estímulos imunes (DAVIS et al., 2001).
A L-arginina também é substrato para outra enzima, a arginase, que
compete com as NOS por esse aminoácido. A arginase metaboliza a L-arginina
em L-ornitina e ureia, tendo um importante papel em processos
antiinflamatórios e de remodelamento tecidual (Figura 3).
30
Figura 3 - Metabolismo da L-arginina pelas enzimas iNOS e arginase-1. As enzimas iNOS e arginase competem pelo mesmo substrato, o aminoácido L-arginina. A iNOS metaboliza esse aminoácido em citrulina e NO, enquanto a arginase em ornitina e ureia (adaptado de BOGDAN, 2011).
Estímulos via receptores de reconhecimento de padrões, tais como
TLRs e NLRs, ou de citocinas, como TNFR, IL1R e IFNGR, levam à ativação
de vias de sinalização intracelulares que culminam na transcrição (mediada por
NF-κB e/ou AP-1) de NOS2, entre outros genes pró-inflamatórios, e na
consequente expressão de iNOS (Figura 4). Em contrapartida, citocinas de
perfil Th2, assim como citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-β inibem
essa expressão e estimulam a transcrição do gene ARG1 da arginase através
da ativação do fator de transcrição C/EBPβ (KLEINERT et al., 2004) (Figura 4).
Tais características tão opostas têm servido de base para diferenciar
populações de macrófagos, por exemplo. Macrófagos do tipo M1,
caracterizados por um perfil mais pró-inflamatório expressam mais iNOS,
enquanto que macrófagos do tipo M2, que possuem atividade mais reguladora
e resolutiva, expressam mais arginase (MURRAY; WYNN, 2011).
Apesar de grande parte dos estudos sobre NO no sistema imune terem
sido feitos em macrófagos, como dito anteriormente, outras células do sistema
imune são capazes de produzir essa molécula e de usá-la, também, como
molécula microbicida. Tal fato levou a certas denominações para estados
transitórios de células, como é o caso das tip-DCs. Células dendríticas que
expressam altas quantidades de NOS2 (gene responsável por transcrever
31
iNOS) e secretam altas concentrações de TNF-α foram assim denominadas em
estudos que demonstraram seu papel microbicida em infecções virais e
bacterianas (SERBINA et al., 2003; ALDRIDGE et al., 2009). Apesar desse tipo
de denominação, é importante ressaltar que tais nomenclaturas fazem
referência a estados transitórios das células, não havendo nenhuma
modificação definitiva capaz de torna-la um tipo celular diferente.
Figura 4 - Vias de ativação de iNOS por TLR e citocinas. Expressão de iNOS pode ser induzida e/ou potencializada por PAMPs, DAMPs e citocinas. A sinalização através de TLR, IL-1R e TNFR induz ativação de AP-1 e NFκB, os principais fatores de transcrição envolvidos na transcrição de iNOS (UEHARA et al., 2015).
O NO produzido pode exercer seus mecanismos microbicidas
diretamente sobre os patógenos ao interagir com componentes importantes
destes como ácidos nucleicos, moléculas responsáveis por infectividade ou
virulência inativando-os ou modificando-os estrutural e funcionalmente.
Indiretamente, o NO pode interagir com moléculas de tal forma a modificar o
metabolismo microbiano, inibir a formação/maturação do fagolisossomo, a
secreção de toxinas e sistemas de secreção (BOGDAN, 2015). Tais efeitos
microbicidas também não se restringem à célula que produziu o NO. Por ser
um gás, o NO é capaz de facilmente se difundir pelas células, podendo
alcançar células que não expressam iNOS, mas que estejam infectadas por
32
algum patógeno intracelular e ali exercer suas funções antimicrobianas
(OLEKHNOVITCH et al., 2014).
Outro importante mecanismo que o NO utiliza para limitar as infecções é
induzir a morte das células infectadas. Macrófagos previamente ativados por
IFN-β ou IFN-γ, quando infectados podem induzir um aumento de expressão de
iNOS e secreção de NO, que pode resultar na ativação de caspases e morte
das células infectadas, tanto por apoptose, como por necrose (independente da
ativação de caspase). A morte dessas células resulta na inibição da expansão
e replicação destes patógenos (HERBST et al., 2011; ZWAFERINK et al.,
2008).
Além das atividades microbicidas já bem estabelecidas, o NO dentro do
sistema imune também participa da maturação de células dendríticas. Em
modelos experimentais, patógenos e citocinas induzem a produção de NO via
iNOS, que pode inibir a ação das caspases (inflamatórias e apoptóticas). Com
sua atividade inibida, as caspases não serão capazes de clivar a cadeia
invariante ligada ao MHC de classe II, possibilitando que as moléculas de MHC
consigam ser corretamente enoveladas, e a DC que está sendo maturada,
aumente a expressão dessas moléculas em sua superfície, além de outras
moléculas coestimuladoras como CD80 e CD86 (HUANG et al., 2008). Em
humanos, entretanto, apesar de resultados bastante controversos, há
evidências de que há um aumento de expressão de outra isoforma, nNOS, que
também é importante para um aumento de expressão de moléculas co-
estimuladoras como CD80 e CD83, e secreção de citocinas como IL-12p40,
IFN-γ, IL-4 e IL-13 (ADLER et al., 2010).
Assim sendo, muitos dos estudos realizados relatam este papel do NO
como uma molécula de importante atividade microbicida, mas com outras
atividades que colaboram na indução de processos inflamatórios.
1.4 NO como modulador da resposta imune
Além da sua clássica atividade microbicida, recentemente, alguns
trabalhos vêm demonstrando que outras células (linfócitos T e B, células
dendríticas), além de macrófagos e monócitos, são capazes de produzir NO, e
que esta molécula pode ter um papel imunomodulador dependendo da sua
33
origem e da concentração em que ele se encontra (BAUER et al., 1997;
JIANJUN YANG et al., 2013; NIEDBALA et al., 2007; NIEDBALA et al., 2013;
NIEDBALA et al., 2014; WINK et al., 2011).
Por ser uma molécula instável, o NO pode reagir com alguns resíduos
de proteínas que contenham enxofre como cisteína, podendo causar mudanças
pós traducionais de tal modo a modificar sua estrutura e/ou função
(HERNANSANZ-AGUSTÍN et al., 2013).
As principais reações pelas quais o NO pode causar modificações em
proteínas são a nitração e a S-nitrosilação. A nitração é um processo que
ocorre principalmente em situações de estresse oxidativo, e depende da
reação do NO com o radical superóxido (O2°-). Estes dois radicais livres podem
dar origem ao peroxinitrito (ONOO-), composto altamente oxidante e
potencialmente lesivo às células (DAVIS et al., 2001; PACHER et al., 2007). A
S-nitrosilação (ou S-nitrosação) ocorre através da oxidação do NO em N2O3, e
posterior dissociação deste radical em nitrosium (NO+) e NO2. O radical NO+
gerado torna-se então disponível para reagir com o grupamento tiol do resíduo
de cisteína, formando um S-nitrosotiol (STAMLER et al., 1992).
Tais modificações podem ser causadas pelo próprio NO endógeno tanto
em componentes da resposta imune inata quando da adaptativa. Alguns
trabalhos já relataram modificações em receptores de reconhecimento de
padrão, como os inflamassomas. O NO é capaz de nitrosilar o NLRP3 (em
maior quantidade e proporção) além de outros receptores como o NLRC4 e
AIM2, contribuindo, por exemplo, como a progressão e gravidade de algumas
infecções como a tuberculose e o choque séptico (MAO et al., 2013; MISHRA
et al., 2013; PARK et al., 2013)
Altas concentrações de NO aumentam a sinalização via p53, o que
suprime as funções de células T e a secreção de citocinas como IL-2, IL-4, IL-
15, IL-10 e IFN-γ (BAUER et al., 1997), enquanto que concentrações mínimas
de NO induzem o aumento de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc) que,
por sua vez, favorece a expressão da cadeia β2 do receptor de IL-12 (IL-12Rβ2)
e a diferenciação de linfócitos Th1 (NIEDBALA et al., 1999). Fisiologicamente,
a colocalização de tipDCs, cDCs e linfócitos T CD4+ em baços de
camundongos infectados por L. monocytogenes evidencia a importância do NO
34
para potencializar uma polarização Th1, além de inibir a indução de outros
fatores de transcrição como FoxP3 (induzido por TGF-β) (LEE et al., 2011).
Também já foi mostrado, em modelos animais e em humanos, que
linfócitos T CD4+ ativados produzem NO, e este vai mediar a nitração de
resíduos tirosínicos do fator de transcrição RORγt (característico de linfócitos
Th17), inativando-o. Assim, a deficiência de iNOS favorece a diferenciação dos
linfócitos T CD4+ em Th17, sem afetar as populações de Th1 e Th2, enquanto
que sua presença diminui a secreção de IL-17 pelos linfócitos TCD4+ ativados
(JIANJUN YANG et al., 2013; NIEDBALA et al., 2011; NIEDBALA et al., 2013).
Em modelo de adição exógena de NO, foi observado que ele favorece a
geração de células Treg, chamadas de NO-Tregs, que não expressam o fator
de transcrição FoxP3. Essas células são geradas a partir de linfócitos TCD4+
CD25- na presença de NO, αCD3 e APC, e têm capacidade supressora in vitro
e in vivo, principalmente sobre células Th17. Essas células reguladoras podem
atuar diminuindo a inflamação em modelos de doenças inflamatórias como
colite e artrite (NIEDBALA et al., 2007).
Além de todas essas atividades sob os linfócitos T, o NO também pode
regular a sobrevida de plasmócitos. Tais células secretoras de anticorpo,
quando nocauteadas para o gene da iNOS, tem um maior estresse de retículo
endoplasmático e uma maior atividade de caspases iniciadoras (caspase-9 e
caspase-12) e efetoras (caspase-3 e caspase-6) da apoptose (SAINI et al.,
2014).
1.5 Justificativa
Como descrito acima, os neonatos são mais susceptíveis a infecções
devido às características da sua resposta imune, voltada para evitar repostas
pró-inflamatórias intensas. Isso infelizmente corrobora com uma maior
mortalidade nesse período, especialmente em países menos desenvolvidos.
As pesquisas com NO nos últimos anos vem mudando de foco, deixando
de caracterizá-lo apenas como molécula microbicida, e destacando seu papel
como molécula mensageira e moduladora. Graças à suas características de
radical livre, o NO pode reagir com uma série de proteínas, especialmente
aquelas com algum resíduo de cisteína, de tal forma a modificá-las tanto
35
estrutural como funcionalmente. Isso faz com que o NO, seja ele produzido
pelas células, ou adicionado exogenamente, consiga modificar o perfil de
resposta de linfócitos TCD4+, principalmente.
Apesar do papel imunomodulador do NO ter sido bastante estudado nos
últimos anos, pouco se sabe sobre sua ação no sistema imune neonatal.
Assim, compreender a ação desse radical sobre as células do sistema imune
de neonatos e adultos corrobora não só com a compreensão da resposta
imune nesses períodos, mas também como esse radical poderia ser utilizado
como alvo em terapias ou formulações vacinais.
OBJETIVOS
37
2 Objetivos
Avaliar o potencial imunomodulador do óxido nítrico nas respostas inatas
(produção de citocinas) e adaptativas (produção de citocinas, proliferação
celular e ativação) de neonatos e adultos saudáveis.
2.1 Objetivos específicos
Verificar os níveis de produção de NO, e expressão de NOS2 e ARG1
em células mononucleares de cordão umbilical e de sangue periférico de
adultos após estímulo in vitro com agonistas de TLR;
Avaliar como a inibição de NOS ou a adição de NO exógeno pode
modular a secreção de citocinas inflamatórias por estas células após o
estímulo com agonistas de TLR;
Avaliar o potencial imunomodulador do NO exógeno na resposta imune
adaptativa de neonatos e adultos in vitro.
MATERIAL E MÉTODOS
39
3 Material e Métodos
3.1 Desenho Experimental
Figura 5 - Representação esquemática do trabalho. Células mononucleares de adultos e neonatos foram cultivadas/ativadas de 2 formas diferentes: com agonistas de TLR, na presença de inibidor de NOS, ou doador de NO por 24 horas e com PHA, na presença de doador de NO por 48 e 120 horas. Análises específicas para cada etapa foram realizados a fim de avaliar secreção de citocinas e de NO, expressão gênica e caraterísticas de linfócitos, basicamente.
3.2 Casuística
Foi coletado sangue de cordão umbilical de 18 recém-natos (7 meninas,
e 11 meninos), filhos de mães com sorologia negativa para sífilis, hepatite B e
C e toxoplasmose, ou quaisquer outras intercorrências clínicas ou obstétricas
que pudessem estar associadas a complicações pós-operatórias (diabetes,
40
hipertensão arterial, deslocamento prematuro da placenta, placenta prévia,
doenças do colágeno, etc.), pré-eclâmpsia, e/ou pacientes que apresentavam
quaisquer sinais ou sintomas compatíveis com quadro infeccioso de qualquer
etiologia, foram selecionados para o estudo no Centro Obstétrico do Hospital
Universitário da USP. Após assinatura do TCLE (CAAE
42925515.4.0000.5467), foi realizada a coleta do sangue de cordão umbilical
no próprio centro obstétrico. Outras condições que pudessem alterar o sistema
imunológico (ex.: uso de corticoides, medicamentos imunossupressores,
desnutrição etc.) também foram consideradas como fator de exclusão. Os
dados clínicos dos recém-natos encontram-se na Tabela 1.
Também foram selecionados 22 adultos saudáveis (9 mulheres e 13
homens), com sorologia negativa para sífilis, hepatite B e C, e quaisquer outras
doenças e/ou uso de medicamentos que pudessem alterar o sistema imune do
indivíduo. Após assinatura do TCLE, o sangue periférico destes foi coletado
através de punção venosa. As características dos indivíduos adultos, encontra-
se na Tabela 2.
Tabela 1 - Dados demográficos e clínicos dos recém-natos estudados
ID Sexo Idade
Gestacional Peso (g) Capurro APGAR Tamanho
1 M 39 2/7 3660 40 8/9/10 AIG
3 F 39 5/7 3420 38 4/7 9/10/10 AIG
6 F 39 1/7 2780 39 2/7 8/9/10 AIG
16 M 38 4/7 3540 39 5/7 8/10/10 AIG
17 M 39 2/7 3715 39 4/7 9/10/10 AIG
19 M 39 2/7 3460
20 F 40 4/7 3280 40 9/10/10 AIG
26 F 40 3/7 3905 41 6/7 8/9/9 AIG
27 M 38 4/7 3285 40 9/10/10 AIG
28 F 39 1/7 3095 39 8/10/10 AIG
30 F 40 3225 41 6/7 8/9/10 AIG
31 M 39 3155 40 2/7 8/10/10 AIG
32 M
3150 37 2/7 7/8/9/ AIG
33 M 40 2/7 3290 40 3/7 8/9/10 PIG
34 M 38 5/7 3045 38 1/7 7/9/9 AIG
35 M 39 4/7 3540 41 6/7 8/9/10 AIG
36 F
3345 39 2/7 8/9/9 AIG
37 M
3075 38 4/7 10/10/10 AIG
41
Tabela 2 - Dados demográficos dos adultos estudados
ID Sexo Idade
4 M 34
6 F 27
8 F 24
9 F 33
10 M 36
13 F 31
15 M 49
16 F 29
17 M 26
18 F 36
20 F 35
19 M 30
21 M 23
22 M 28
23 M 31
24 F 33
25 M 52
26 M 40
27 M 37
28 M 43
29 F 19
30 M 33
3.3 Coleta de material biológico
Sangue de cordão umbilical: após dequitação da placenta,
aproximadamente 50 mL de sangue foram coletados do cordão umbilical em
tubos heparinizados com auxílio de agulha e seringa descartáveis. As amostras
foram transportadas para o laboratório, onde foram processadas.
Sangue periférico: através de punção venosa, aproximadamente 15 mL
de sangue periférico foram coletados também em tubos heparinizados.
3.4 Obtenção e cultura de células mononucleares
No laboratório, as amostras de sangue de cordão foram diluídas em
meio de cultura RPMI1640 (Gibco, Thermofisher Scientific) numa proporção 1:3
(10 mL de sangue em 30 mL de meio), enquanto que as de sangue periférico
foram diluídas na proporção 1:1 (20 mL de sangue em 20 mL de meio).
42
As células mononucleares dos adultos foram separadas pelo gradiente
de densidade Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare) através de uma única
centrifugação por 30 minutos a 1400 g. As células dos neonatos, em
contrapartida, necessitaram de duas centrifugações para melhor eliminação
das hemácias. Nestas, a nuvem de células mononucleares da primeira
centrifugação foi adicionada a um novo gradiente de densidade, e novamente
centrifugados por 30 minutos a 1400 g.
As células obtidas foram então quantificadas através de contagem em
Câmara de Neubauer. 15 x 106 células foram separadas para marcação com
CFSE para os ensaios de proliferação (item 3.5), e as demais foram
plaqueadas na concentração de 1 x 106 células/poço em 250 µL de RPMI
contendo 5 % de soro humano AB (Sigma Aldrich) em placas de 48 poços
(Corning-Costar). Estas placas foram incubadas a 37 ºC e 5% de CO2 e, no dia
posterior à separação, os estímulos foram adicionados.
3.4.1 Avaliação da influência do óxido nítrico na resposta imune inata
A fim de avaliar a influência do óxido nítrico na resposta imune inata de
adultos e neonatos, as células mononucleares de ambos os grupos foram
estimuladas por 24 horas com os agonistas de TLR3 (Poly I:C – 1 µg/mL),
TLR4 (LPS – 2,5 µg/mL) e TRL7/8 (CL097 – 2,5 µg/mL) (InvivoGen) na
presença do inibidor de NOS, ou do doador de NO.
Para avaliar o efeito da inibição da produção de NO, as células
mononucleares foram previamente tratadas com o inibidor da óxido nítrico
sintase, Nω-nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME) (Sigma Aldrich), nas
concentrações de 10 mM e 1 mM, 1 hora antes da adição dos agonistas de
TLR. De forma semelhante, para avaliar a resposta frente a concentrações
conhecidas de NO, foi adicionado concomitantemente os agonistas de TLR e o
doador de NO, NOC-18 (DETA NONOnate - C4H13N5O2) (Santa Cruz
Biotechnology), nas concentrações de 200 µM e 50 µM. Tanto o inibidor,
quanto o doador foram mantidos na cultura durante todo o ensaio, e o efeito do
NO na resposta inata dessas células foi avaliada pela modulação da expressão
gênica (item 3.9), e pela produção de citocinas (item 3.7) após o estímulo.
43
Os sobrenadantes de cultura foram coletados após o período de
estímulo e guardados a -80 ºC para posterior dosagem de citocinas e nitrito. As
células foram estocadas para isolamento de RNA, em 30 µL de PBS e 120 µL
de RNA Later (Sigma Aldrich).
3.4.2 Avaliação da influência do óxido nítrico na resposta imune adaptativa
A fim de avaliar a influência do óxido nítrico na resposta imune
adaptativa de adultos e neonatos, as células mononucleares de ambos os
grupos foram estimuladas por 48 e 120 horas com o mitógeno fitohemaglutinina
(PHA) (Sigma Aldrich) a 2 µg/mL na presença ou ausência do doador de óxido
nítrico NOC-18 nas concentrações de 200 e 50 µM. De forma semelhante à
avaliação da resposta imune inata, a PHA foi adicionada concomitantemente
com ao NOC-18 na cultura das células mononucleares.
Os sobrenadantes de cultura foram coletados após o período de
estímulo e guardados a -80 ºC para posterior dosagem de citocinas e nitrito. As
células foram estocadas para isolamento de RNA, em 30 µL de PBS e 120 µL
de RNA Later (Sigma Aldrich), ou caracterizadas, por citometria de fluxo, para
seu fenótipo, perfil de ativação, proliferação (item 3.5) e apoptose (item 3.6).
3.5 Ensaio de proliferação e caracterização das subpopulações de linfócitos
Após a separação, células mononucleares de adultos e neonatos foram
marcadas com CFSE (Life Technologies). Resumidamente, 15 x 106 células
foram marcadas com 2,5 µM de CFSE em 1 mL de RPMI, e mantidas sob
agitação a 37 ºC por 5 minutos. Após esse período, foi adicionado 5x o volume
de RPMI contendo 10% de soro AB, para inativação do CFSE. As células foram
então centrifugadas por 10 minutos a 450 g, e posteriormente lavadas com
RPMI para descartar o excesso do marcador. As células foram plaqueadas
conforme descrito no item 3.4. e, no dia seguinte à separação, foram
estimuladas conforme descrito no item anterior (3.4.2).
Após 5 dias de estímulo, as células mononucleares foram
imunofenotipadas, a fim de determinar a proliferação das subpopulações de
44
linfócitos T (CD3, CD4 e CD8) e B (CD19), bem como sua ativação (CD69), e
viabilidade utilizando o painel abaixo:
Tabela 3 - Marcadores utilizados para avaliação do perfil de ativação e proliferação de linfócitos
Marcador Fluorocromo Marca Clone Concentração
de uso
Live/Dead Texas Red Invitrogen - 1:32
CD3 PE-Cy5 BD Bioscience UCHT1 1:16
CD4 Horizon V500 BD Bioscience RPA-T4 1:16
CD8 PE-Cy7 Southern Biotech RFT8 1:32
CD19 APC ExBio AG7 1:16
CD69 APC-Cy7 BD Bioscience FN50 1:16
Foram coletadas 5 x 105 células, que, após lavagem, foram
ressuspendidas em 1 mL de PBS com o marcador de viabilidade celular
LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit (Invitrogen), e incubadas por 30
minutos a 4 ºC ao abrigo da luz. Em seguida, as células foram lavadas e
ressuspendidas em 50 µL de PBS contendo os anticorpos do painel 1, e
incubadas por 20 minutos a 4 ºC ao abrigo da luz. Após esse período, as
células foram lavadas e ressuspendidas em solução isotônica Facs Flow (BD
Bioscience). Foram adquiridos 10000 eventos no citômetro de fluxo LSR
Fortessa (BD Biosciences) utilizando o software FACSDiva (BD Biosciences). A
análise dos dados foi feita no software FlowJo versão 7 (Tree Star, Inc), através
da estratégia de análise descrita na Figura 6.
45
Figura 6 - Estratégia de análise dos dados de citometria de fluxo para a avaliação de proliferação e ativação de linfócitos. Esquema de análise dos marcadores de superfície dos linfócitos ativados (no exemplo, linfócitos T CD4+ estimulados com PHA e 50 µM de NOC-18). Foi feito primeiro gate para selecionar as células que passaram uma a uma no citômetro, posteriormente um gate no tamanho e granulosidade característicos da célula a ser analisada. Após foram selecionadas as células viáveis, diferenciaram-se as populações de linfócitos T (CD3+) e B (CD19+), e dentro dessas as subpopulações (CD4+ e CD8+ para linfócitos T), aqueles que estavam ativados (CD69+), ou aqueles que proliferaram (CFSE low).
3.6 Avaliação de apoptose em subpopulações de linfócitos
A taxa de apoptose foi avaliada em subpopulações de linfócitos através
do FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmigen), de acordo com
as instruções do fabricante. De forma sucinta, 5 x 105 células foram lavadas e
ressuspendidas em 50 µL de PBS contendo os anticorpos do painel 2. Estas
células foram incubadas por 20 minutos, a 4 ºC ao abrigo da luz. Após a
46
marcação dos antígenos de superfície, as células foram lavadas duas vezes
com 400 µL de PBS gelado, e em seguida ressuspendidas em 1mL do tampão
do kit. Foram transferidos 200 µL para um novo tubo, e marcados com 5 µL da
anexina V e 5 µL de PI (BD Bioscience).
Tabela 4 - Marcadores utilizados para avaliação de morte celular
Marcador Fluorocromo Marca Clone Concentração
de uso
CD3 PE-Cy5 BD Bioscience UCHT1 1:16
CD4 Horizon V500 BD Bioscience RPA-T4 1:16
CD8 PE-Cy7 Southern Biotech RFT8 1:32
CD19 APC ExBio AG7 1:16
CD69 APC-Cy7 BD Bioscience FN50 1:16
Após 15 minutos de incubação, as células foram ressuspendidas em 400
µL do tampão do kit, e a aquisição de dados foi feita em citômetro de fluxo em
até 1 hora. Foram adquiridos 10000 eventos no citômetro de fluxo LSR
Fortessa (BD Biosciences) utilizando o software FACSDiva (BD Biosciences). A
análise dos dados foi feita no software FlowJo versão 7 (Tree Star, Inc), através
da estratégia de análise descrita na Figura 7.
47
Figura 7 - Estratégia de análise dos dados de citometria de fluxo para avaliação da apoptose de linfócitos. Esquema de análise dos linfócitos marcados com AnexinaV (no exemplo, linfócitos T CD4+ estimulados com 200 µM de NOC-18). Foi feito primeiro gate para selecionar as células que passaram uma a uma no citômetro, posteriormente um gate no tamanho e granulosidade característicos da célula a ser analisada. Diferenciou-se as populações de linfócitos T (CD3+) e B (CD19+), e dentro dessas as subpopulações (CD4+ e CD8+ para linfócitos T), aqueles que estavam expressavam fosfatidilserina em sua superfície (AnexinaV).
.
3.7 Quantificação de citocinas
Citocinas características da resposta imune inata (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-
12p70 e TNF-α) ou adquirida (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF-α) foram
quantificadas no sobrenadante de cultura dos ensaios descritos em 3.4.1 e
3.4.2, através dos kits BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammatory
Cytokines Kit (BD PharMingen), e BD Cytometric Bead Array Human
Th1/Th2/Th17Cytokine Kit (BD PharMingen), respectivamente.
Em ambos, a curva padrão e as amostras foram diluídas e incubadas
com esferas de captura e anticorpo de detecção marcado com ficoeritrina (PE)
por duas horas à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Posteriormente, as
amostras foram lavadas por centrifugação a 500 g por 5 minutos. O
sobrenadante foi removido e o pellet formado foi ressuspendido em tampão de
lavagem para a análise no citômetro BD Fortessa (BD Biosciences).
48
3.8 Avaliação da produção de NO
A concentração de NO produzido pelas células mononucleares
estimuladas com agonistas dos TLR (item 3.4.1) foi determinada indiretamente
através da quantificação de nitrito nos sobrenadantes de culturas através de
uma reação colorimétrica utilizando o reagente de Griess (Sigma Aldrich) de
acordo com as instruções do fabricante. O reagente de Griess foi adicionado
numa proporção de 1:1 para cada amostra de sobrenadante (40 µL). Após 15
minutos de incubação, à temperatura ambiente, a reação colorimétrica foi lida
em espectofotômetro num λ = 550 nm. A quantificação de nitrito das amostras
foi comparada a uma curva de nitrito de sódio (NaNO2) partindo de 200 µM e
caindo numa diluição 1:2 até 1,5 µM. O meio de cultura utilizado para essa
dosagem estava sem corante vermelho (phenol red) para não interferir na
reação colorimétrica.
3.9 Isolamento de RNA e avaliação da expressão gênica relativa
O RNA total das células mononucleares previamente cultivados como
descrito nos itens 3.4.1 e 3.4.2 foi extraído utilizando-se colunas de sílica do
RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) seguindo as orientações do fabricante. A pureza
e a quantidade do RNA foram avaliadas por meio de leitura por
espectofotometria no equipamento Nanodrop (Thermo Scientific).
O RNA foi retrotranscrito utilizando-se o iScript cDNA Synthesis Kit
(Biorad), conforme recomendações do fabricante.
A amplificação dos genes alvo (NOS2, ARG1, ROR2C e GATA3) foi
realizada por qPCR utilizando os primers da tabela 5 e o SYBR® Green PCR
Master Mix (Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific). O gene gliceraldeíro
3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como gene housekeeping para
normalização dos dados.
Para cada reação foram utilizados 5 µg/mL de cDNA, 1 mM de cada
primer e 9 µL de SYBR® Green PCR Master Mix em um volume total de 14 µL.
A amplificação foi realizada no equipamento de PCR em tempo real Applied
Biosystems® 7500 Real-Time PCR Sytem (Applied Biosystems, ThermoFisher
49
Scientific) de acordo com o programa padrão (95 ºC por 2 minutos, seguidos de
40 ciclos de 95 ºC por 30 segundos, e 60 ºC por 1 minuto).
Para verificar a especificidade da amplificação de cada gene, após a
PCR, foi executada uma reação de desnaturação do DNA amplificado. A curva
de dissociação do DNA (“melting curve”) permite detectar e discriminar as
moléculas de DNA dupla fita resultantes da reação de PCR (“amplicons”). Os
primers reportados na Tabela 5 obtiveram boas curvas de dissociação.
O Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR software foi utilizado para
obter os dados de Cycle Threshold (Ct) para cada reação de PCR. Os dados
de Ct foram utilizados para análise comparativa da expressão gênica, que por
sua vez foi calculada através do método comparativo de Ct (SCHMITTGEN;
LIVAK, 2008). Os Ct dos genes alvos foram normalizados pelo Ct do GAPDH
(ΔCt). Os ∆Ct foram utilizados tanto para representar a expressão basal dos
genes alvos (como 2-∆Ct), quanto para calcular a modulação da expressão
genica frente a estimulo (como “Fold Change”/FC=2-∆∆Ct; dados pareados) ou
entre 2 grupos (como FC=2-∆Ct/2-Δct, dados não pareados).
Tabela 5 - Sequências de oligonucleotídeos (primers) utilizados para amplificação dos genes NOS2, ARG1, RORC2, GATA3 e do gene housekeeping, GAPDH
Gene (ID) Sequência oligonucleotídeos (Primers)
NOS2 Foward: CCTCGGCTCCAGCATGTACCCTCGG
Reverse: CGGAAGGCGTCCTCCTGCCCACTGA
ARG1 Foward: GTTTCTCAAGCAGACCAGCC
Reverse: GCTCAAGTGCAGCAAAGAGA
RORC2 Foward : TGGAAGTGGTGCTGGTTAGGA
Reverse: AAGGCTCGGAACAGCTCCAT
GATA3 Foward: AGATGGCACGGGACACTACCT
Reverse: TAATTCGGGTTCGCTTCCG
GAPDH Foward: GAAGGTGAAGGTCGGAGT
Reverse: GAAGATGGTGATGGGATTTC
50
3.10 Análise estatística
Os dados foram analisados no software GraphPadPrism (versão 6.0). A
análise estatística entre os grupos e intragrupos foi realizada utilizando os
testes não paramétricos de Mann-Whitney e Wilcoxon, respectivamente.
Quando havia mais de um parâmetro a ser analisados nos testes intragrupo, o
teste não paramétrico de Friedman foi utilizado. Para as análises de correlação,
foi usado o teste de Spearman.
Todas as comparações que resultaram em p≤0,05 foram consideradas
significantes.
RESULTADOS
52
4 Resultados
4.1 Expressão gênica de NOS2 e ARG1 em células mononucleares de adultos e neonatos
A fim de avaliar a capacidade das células mononucleares dos recém-
natos de produzir NO e metabolizar a L-arginina, primeiramente, foi avaliada a
expressão gênica basal dos genes da iNOS (NOS2) e arginase-1 (ARG1) nas
células mononucleares de adultos e neonatos.
Foi possível observar que a expressão basal de ARG1 é
significativamente maior nas células mononucleares dos recém-natos (ARG1RN
= 473,4 x 10-4 ± 0,01) quando comparado às células de adultos (ARG1Ad = 8,2
x 10-4 ± 0,0006) (Figura 8). Já para NOS2, além de não haver diferença em
sua expressão entre os grupos (NOS2Ad = 4,9 x 10-4 ± 0,0003 versus NOS2RN =
9,4 x 10-4 ± 0,001), houve uma menor expressão desse gene quando
comparado com a expressão da ARG1 (Figura 8).
Figura 8 - Expressão ex vivo de ARG1 e NOS2 em células mononucleares de neonatos e adultos. A expressão relativa de ARG1 e NOS2 em células mononucleares isoladas de sangue de cordão umbilical de neonatos e sangue periférico de adultos foi calculada em comparação à amplificação do gene constitutivo, GAPDH. Os círculos fazem referência à expressão em células de adultos (n=4) e os triângulos, a de neonatos (n=6). A análise estatística foi realizada no software GraphPrism mediante teste de Mann Whitney. Foram considerados estatísticos valores de p<0,01 (**).
0 .0 0 0
0 .0 0 1
0 .0 0 2
0 .0 0 3
0 .0 2
0 .0 4
0 .0 6
0 .0 8
Ex
pre
ss
ão
re
lati
va
(2
-c
t )
A du ltos
N e o n a tos
A R G 1 N O S 2
**
53
4.2 Modulação da expressão gênica de NOS2 e ARG1 em células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com agonistas de TLR
Uma vez que foi observada uma diferença na expressão constitutiva de
ARG1 entre adultos e neonatos (Figura 8), verificou-se se, em resposta a
estímulos que simulam PAMPs, haveria modulação dos genes de ARG1 e
NOS2 nas células mononucleares de ambos os grupos. Para tanto, avaliou-se
se o estímulo com agonistas de TLR era capaz de modular a expressão gênica
de NOS2 e ARG1 nas células mononucleares de adultos e recém-natos.
0
2
4
6
A R G 1F
old
Ch
an
ge
(2
-
ct ) A du ltos
N e o n a tos
N .A . = N ã o h o u v e
a m p lif ic a ç ã o
C L 0 9 7 L P S P o ly I:C
0
5
1 0
1 5
2 0
N O S 2
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ha
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ct )
C L 0 9 7 L P S P o ly I:C
N .A . N .A . N .A .
A B
Figura 9 - Modulação da expressão de NOS2 e ARG1 em células mononucleares de adultos e neonatos após o estímulo com agonistas de TLR. A modulação da expressão dos genes NOS2 (A) e ARG1 (B) foi calculada através comparação do fold change de amostras pareadas (2-ΔΔct), nos quais foram comparadas a expressão das células estimuladas com a expressão das células que não receberam estímulo. A expressão dos genes foi normalizada pela amplificação do gene constitutivo, GAPDH (Δct). Os círculos fazem referência à expressão em células de adultos (n=4) e os triângulos, a de neonatos (n=4).
Houve uma baixa ou nenhuma amplificação do gene de NOS2 nas
células mononucleares de neonatos estimuladas dos agonistas de TLR, o que
impossibilitou o cálculo da expressão relativa destes. Para os adultos, em
contrapartida, e apesar de não estatisticamente significante, parece haver um
aumento de expressão de NOS2 quando os agonistas de TLR, CL097 (NOS2Ad
= 5,2 ± 6,4) e LPS (NOS2Ad = 3,6 ± 3,4), foram adicionados (Figura 9A). Já
para ARG1, aparentemente os 3 agonistas de TLR, tanto em adultos (CL097 –
ARG1Ad = 1,58 ± 0,71, LPS - ARG1Ad =1,33 ± 0,57 e Poly I:C - ARG1Ad = 2,33 ±
1,8) como em neonatos (CL097 – ARG1RN = 1,54 ± 0,47, LPS - ARG1RN = 1,19
54
± 0,59 e Poly I:C - ARG1RN = 2,2 ± 1,2), foram capazes de aumentar a sua
expressão de forma bastante semelhante (Figura 9B).
4.3 Produção de NO e citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com agonistas de TLR
Além da expressão de NOS2 e ARG1, avaliou-se a ativação das células
mononucleares com os agonistas de TLR através da quantificação de citocinas
inflamatórias (IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12p70 e TNF-α), bem como a produção de
NO através da medida indireta da quantificação de nitrito.
Não foi possível quantificar nitrito nos sobrenadantes de cultura das
células tanto de adultos, como de neonatos, indicando que, apesar de ter se
observado uma indução de expressão de NOS2 (em células de adultos), a
produção de NO é muito pequena (ou abaixo do limite de detecção da técnica),
ou que sua produção ocorre muito antes do período analisado (24 horas).
Para as citocinas, como se pode observar na Figura 10, os estímulos
foram capazes de induzir um aumento da secreção de citocinas quando
comparados à situação sem estímulo, em ambos os grupos. Entretanto, após o
estímulo com os agonistas de TLR por 24 horas, não foi possível quantificar IL-
12p70 devido às suas baixíssimas concentrações no sobrenadante de cultura.
As células de adultos, quando estimuladas com CL097, secretaram
maiores quantidades de TNF-α (TNF-α Ad = 7232 ± 3445) do que as de
neonatos (TNF-α RN = 997,2 ± 712,2) (Figura 10B). De forma semelhante, a
secreção de IL-10, após estímulo com LPS, foi maior nas células de adultos
(IL-10Ad = 113,6 ± 94,4), do que de neonatos (IL-10RN = 5,138 ± 6) (Figura
10C).
Para as demais citocinas (IL-1β e IL-6), apesar de não ter sido
observada diferença entre os grupos, parece haver uma menor secreção
destas pelas células de neonatos, principalmente após o estímulo com os
agonistas de TLR (Figuras 10A e 10D).
55
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
T N F
pg
/mL
B a s a l C L 0 9 7 L P S P o ly I:C
*
p = 0 ,0 5 7 1
A d u ltos
N eo n a tos
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
IL -1 0
pg
/mL
B a s a l C L 0 9 7 L P S P o ly I:C
*
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
IL -6
pg
/mL
B a s a l C L 0 9 7 L P S P o ly I:C
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
1 0 0 0 0
IL -1 p
g/m
L
B a s a l C L 0 9 7 L P S P o ly I:C
A B
C D
Figura 10 - Aumento de secreção de TFN-α e IL-10 por células mononucleares de adultos quando estimulados com agonistas de TLR7/8 (CL097) e TLR4 (LPS), respectivamente, em comparação aos neonatos. As células mononucleares de adultos e neonatos foram estimuladas por 24 horas com os agonistas de TLR3 (Poly I:C), TLR4 (LPS) e TLR7/8 (CL097). As citocinas IL-1β (A), TNF-α (B), IL-10 (C), e IL-6 (D) foram dosadas no sobrenadante de cultura, através da técnica de CBA. As formas pretas representam a secreção das citocinas por células de adultos (n=4) e as azuis, por células de neonatos (n=4). A análise estatística foi feita no software GraphPad Prism, mediante teste de Mann Whitney. Foram considerados estatísticos valores de p<0,05 (*).
4.4 Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos tratadas com inibidor de NOS e estimuladas com agonistas de TLR
Apesar de não ter sido possível quantificar nitrito no sobrenadante das
culturas, decidiu-se avaliar a contribuição das NOS na produção de citocinas
inflamatórias pelas células estimuladas com agonistas de TLR. Como já
descrito anteriormente, iNOS é a principal isoforma induzida por estímulos
imunes e a que mais produz NO. Entretanto, não se pode descartar a possível
influência que as demais isoformas também poderiam exercer sobre essa
56
secreção. Estas, ao contrário da iNOS, não produzindo grandes quantidades
de NO, de tal maneira, que sua secreção também não seria detectada pela
reação de Griess, como já havia sido observado no trabalho. Para tanto, as
células foram tratadas com o inibidor de NOS Nω-nitro-L-arginina-metil-éster,
L-NAME, e posteriormente estimuladas com os mesmos agonistas de TLR.
O L-NAME é um inibidor não específico das NOS, sendo capaz de inibir
as 3 isoformas. Ele é um composto químico estruturalmente semelhante à L-
arginina, e por isso, capaz de se ligar às NOS, impedindo que seu análogo se
ligue, e então inibindo a produção de NO.
Apesar de nenhum dado nesta etapa do trabalho ter sido
estatisticamente significante, talvez devido ao pequeno número de amostras,
houve algumas tendências que serão relatadas a seguir. Os dados são
demonstrados no formato de Heatmap (Figura 11), e os dados brutos
encontram-se na Tabela 4.
Adultos Neonatos
- + LNAME 1mM + LNAME 10mM - + LNAME 1mM + LNAME 10mM
IL-1
β
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
TNF-
α BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
IL-6
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
IL-1
0
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
Figura 11 - Heatmap representativo da produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos, tratadas com inibidor de NOS, L-NAME, e posterior estímulo com agonistas de TLR. As citocinas foram dosadas no sobrenadante de cultura de células de adultos (n=3) e neonatos (n=3) após estímulo com os agonistas de TLR3 (Poly I:C), TLR4 (LPS) e TLR7/8 (CL097) por 24 horas. Os
Valor mais baixo Valor mais alto
57
dados são representados em média e de acordo com uma escala colorimétrica, para cada citocina, onde o maior valor é representado em verde, e o menor, em vermelho.
Quando as células mononucleares foram tratadas com o inibidor de
NOS, aparentemente houve uma diminuição da secreção de IL-1β, TNF-α e IL-
10 pelas células de adultos estimulados com os agonistas de TLR4 (LPS), mas
principalmente com aquelas que foram estimuladas o agonista de TLR 7/8,
CL097. IL-6 parece ter sofrido menores influências da inibição das NOS, uma
vez que houve diminuição da sua secreção quando as células foram
estimuladas com CL097 e LPS, mas bem menos pronunciada que as demais
citocinas (Figura 11).
Para os neonatos, o inibidor parece ter pouca ou nenhuma influência
sobre a secreção de IL-1β quando os agonistas CL097, LPS e Poly I:C foram
utilizados. TNF-α, IL-10 e IL-6, parecem ser inibidas de maneira dose-
dependente quando as células neonatais foram estimuladas com CL097 e LPS
(Figura 11). Chama a atenção a secreção de IL-6 quando as células de adultos
e neonatos foram estimuladas com o agonista de TLR3, Poly I:C. Assim como
a secreção de IL-1β pelos neonatos, a secreção de IL-6 parece não ser afetada
pela inibição das NOS (Figura 11).
58
Tabela 6 - Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos, tratadas com inibidor de NOS, L-NAME, e posterior estímulo com agonistas de TLR. Os dados são representados em média ± desvio padrão.
Adulto Neonato
- + LNAME
1mM + LNAME
10mM -
+ LNAME 1mM
+ LNAME 10mM
IL-1
β (
pg/
mL)
BASAL 3,20 ± 5,55 6,02 ± 5,23 10,23 ± 4.45 65,12 ± 56,48 58,03 35,94 62,78 59,34
CL097 4546 ± 3773 3021 ± 4668 3440 ± 4624 212,1 ± 197,1 307,7 ± 369 198,8 ± 262,7
LPS 56,61 ± 18,26 64,81 ± 49,79 36,24 ± 17,07 77,55 ± 63,94 114,7 ± 110,8 72,12 ± 54,98
POLY I:C 3,17 ± 5,02 8,96 ± 4,01 10,85 ± 3,23 58,64 ± 43,41 41,11 ± 35,82 56,91 ± 57,14
TNF-
α (
pg/
mL)
BASAL 55,61 ± 95,14 62,91 ± 107,8 17,27 ± 27,67 2,04 ± 1,01 2,66 ± 0,49 1,80 ± 0,38
CL097 8669 ± 2322 6815 ± 4204 4852 ±6522 750,2 ± 628,2 856,6 ± 713,8 275,2 ± 288,9
LPS 619,7 ± 432,1 1054 ± 1027 593,7 ± 713,4 91,35 ±74,91 113,6 ± 78,54 23,33 ± 13,26
POLY I:C 47,65 ± 74,3 66,86 ± 111,1 10,9 ± 18,88 65,28 ± 111,2 1,22 ± 2,11 0,93 ± 1,62
IL-6
(p
g/m
L) BASAL 85,65 ± 65,56 114 ± 98,3 105,5 ± 30,93 1596 ± 2278 1537 ± 1987 1560 ± 2455
CL097 9865 ± 1403 9154 ± 2635 7715 ± 2841 4881 ± 4528 4967 ± 4447 3952 ±5454
LPS 4379 ± 740,6 4943 ± 1701 3442 ± 1869 3613 ± 2749 4250 ± 3020 3240 ± 3472
POLY I:C 100,7 ± 98,36 183,9 ± 142,5 194,7 ± 130,4 1952 ± 1970 1252 ± 1677 1640 ± 2584
IL-1
0 (
pg/
mL)
BASAL 6,25 ± 10,83 2,89 ± 5,01 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
CL097 923,4 ± 618,3 867,4 ± 843 635,3 ± 860 43,51 ± 75,36 34,88 ± 60,42 23,78 ± 41,18
LPS 140,3 ± 95,32 169,7 ± 86,33 82,24 ± 43,57 3,05 ± 5,29 4,3 ± 7,44 2,76 ± 4,79
POLY I:C 2,31 ± 4,01 1,83 ± 3,18 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
4.5 Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com agonistas de TLR na presença do NO exógeno
Apesar de não ter sido encontrada produção detectável de NO nos
ensaios, e a já relatada baixa produção de NO em indivíduos saudáveis, há
relatos na literatura que demonstram que em infecções e, em determinadas
patologias, pode haver um aumento da produção de NO (detectado pelo
aumento do nitrito – produto da degradação do NO, no soro dos pacientes)
(ALDRIDGE et al., 2009; DE SOUZA et al., 2013; JIN et al., 2017; TORRE et
al., 1996; TORRE et al., 2002). Sendo assim, com o intuito de verificar se a
adição do NO exógeno (em concentrações conhecidas) era capaz de modular
a produção de citocinas inflamatórias, células mononucleares de ambos os
59
grupos foram cultivadas e estimuladas com agonistas de TLR, na presença do
composto “doador” de NO, NOC-18.
O NOC-18 é um composto químico que se dissocia espontaneamente
em cultura (pH 7,4 e 37 ºC), liberando NO paulatinamente. Foram utilizadas
duas concentrações de NOC-18, 50 e 200 µM, que resultam numa liberação
aproximada de 50 e 200 nM de NO, respectivamente (KRAUSE et al., 2016;
WAHEED et al., 2010). Novamente os dados são representados no formato de
heatmap (Figura 12) e os dados brutos, na Tabela 5, e nenhum dado desta
etapa foi significativo.
Nas culturas de células de adultos, a adição do NOC-18 em sua maior
concentração parece inibir a secreção de IL-1β por células estimuladas com os
3 agonistas de TLR (Figura 12). Entretanto, nas culturas de células de
neonatos, a secreção de IL-1β parece ter aumentado quando a maior
concentração do doador de NO foi adicionada, e as células foram estimuladas
com CL097 e LPS (Figura 12 e Tabela 5).
Adultos Neonatos
Basal + NOC18 50uM + NOC18 200uM Basal + NOC18 50uM + NOC18 200uM
IL-1β
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
TNF-α
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
IL-6
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
IL-10
BASAL
CL097
LPS
POLY I:C
Figura 12 - Heatmap representativo da produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos, estimuladas com agonistas de TLR, e o doador de NO, NOC-18. As citocinas foram dosadas no sobrenadante de cultura de células de adultos (n=3) e neonatos (n=3) após estímulo com os agonistas de TLR3 (Poly I:C),
Valor mais baixo Valor mais alto
60
TLR4 (LPS) e TLR7/8 (CL097) por 24 horas. Os dados são representados em média e de acordo com uma escala colorimétrica, para cada citocina, onde o maior valor é representado em verde, e o menor, em vermelho.
Para as demais citocinas (IL-6, TNF-α e IL-10) a adição do NOC-18
parece não interferir em suas produções tanto pelas células de neonatos como
pelas de adultos. As concentrações de cada uma delas após o estímulo
somente com o agonista de TLR não foi muito diferente daquelas que
receberam o estímulo de TLR e o doador de NO (Figura 12).
Tabela 7 - Produção de citocinas inflamatórias por células mononucleares de adultos e neonatos, estimuladas com agonistas de TLR, e o doador de NO, NOC-18. Os dados são representados em média ± desvio padrão.
Adulto Neonato
- + NOC18
50uM + NOC18 200uM
- + NOC18
50uM + NOC18 200uM
IL-1
β (
pg/
mL)
BASAL 3,20 ± 5,55 14,03 ± 15,17 5,10 ± 4,50 65,12 ± 56,48 43,56 ± 33,55 64,37 ± 52,25
CL097 4546 ± 3773 3016 ± 4624 3320 ± 4698 212,1 ± 197,1 223,8 ± 233,8 250,9 ± 206,8
LPS 56,61 ± 18,26 297,9 ± 392,8 109,5 ± 15,82 77,55 ± 63,94 70,09 ± 62,46 134,4 ± 148,3
POLY I:C 3,17 ± 5,02 13,07 ± 11,07 6,50 ± 6,55 58,64 ± 43,41 53,22 ± 47,87 56,85 ± 45,29
TNF-
α (
pg/
mL)
BASAL 55,61 ± 95,14 29,91 ± 50,63 58,99 ± 101,1 2,04 ± 1,01 2,03 ± 0,68 3,88 ± 2,31
CL097 8669 ± 2322 5624 ± 5104 7408 ± 3694 750,2 ± 628,2 584,6 ± 482,6 627,6 ± 478,2
LPS 619,7 ± 432,1 531,3 ± 336,3 678,6 ± 261,2 91,35 ±74,91 72,25 ± 56,58 73,48 ± 50,96
POLY I:C 47,65 ± 74,3 23,86 ± 3593 62,26 ± 102 65,28 ± 111,2 1,82 ± 3,15 4,21 ± 4,57
IL-6
(p
g/m
L) BASAL 85,65 ± 65,56 455,6 ± 631,7 99,7 ± 71,71 1596 ± 2278 1373 ± 1774 2349 ± 2458
CL097 9865 ± 1403 8888 ± 2428 9805 ± 1307 4881 ± 4528 5072 ± 4068 5956 ± 3962
LPS 4379 ± 740,6 6436 ± 3534 7669 ± 1772 3613 ± 2749 3519 ± 2575 4182 ± 3121
POLY I:C 100,7 ± 98,36 220,4 ± 118,1 152,8 ± 8701 1952 ± 1970 1703 ± 2321 2167 ± 1979
IL-1
0 (
pg/
mL)
BASAL 6,25 ± 10,83 1,97 ± 3,41 3,12 ±5,41 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
CL097 923,4 ± 618,3 640,2 ± 566,8 411,8 ± 270,3 43,51 ± 75,36 37,28 ± 60,92 35,23 ± 56,53
LPS 140,3 ± 95,32 169,8 ± 98,34 222,9 ± 121,8 3,05 ± 5,29 2,84 ± 4,93 3,97 ± 6,88
POLY I:C 2,31 ± 4,01 0 ± 0 1,99 ± 3,45 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0
61
4.6 Modulação da expressão gênica de NOS2, ARG1 em células mononucleares de adultos e neonatos estimuladas com PHA
Como foram observadas diferenças na expressão constitutiva de ARG1
em células mononucleares de adultos e neonatos (Figura 8), e o estímulo com
agonistas de TLR gerou uma diferente indução na expressão de NOS2 (Figura
9), avaliou-se como um estímulo policlonal poderia modular a expressão gênica
dos mesmos genes em ambos os grupos.
Para tanto, as células foram estimuladas com PHA e o doador de NO,
NOC-18, em duas concentrações.
Novamente, houve dificuldades para detectar a expressão do gene de
NOS2, especialmente nos neonatos, não sendo possível em muitos casos
calcular o valor de fold change (Figura 13A). Para ARG1, em contrapartida,
houve o contrário. O estímulo com PHA e NOC-18 parece ter inibido a
expressão desse gene nos adultos, uma vez que nas situações estimuladas
com PHA, quase não houve amplificação deste (Figura 13B). Nos neonatos,
entretanto, a maior presença deste gene já observada em situações sem
estímulo (Figura 8) se manteve elevada nos neonatos, havendo, inclusive, um
aparente aumento da sua expressão quando as células foram estimuladas com
PHA e 50 µM do doador de NO (Figura 13B).
N O S 2
0
1
2
3
4
+ 2 0 0 M N O C -1 8+ 5 0 M N O C -1 8
Fo
ld C
ha
ng
e (
2-
c
t)
A R G 1
0
5
1 0
1 5
2 0
Fo
ld C
ha
ng
e (
2-
c
t)
N e o n a tos
A du ltos
+ 2 0 0 M N O C -1 8+ 5 0 M N O C -1 8
A B
Figura 13 - Modulação da expressão de NOS2 e ARG1 em células mononucleares estimuladas com PHA e o doador de NO, NOC-18. A expressão relativa dos genes foi calculada em comparação à amplificação do gene constitutivo, GAPDH, e em comparação à situação estimulada com PHA por 48 horas. Os círculos fazem referência à expressão em células de adultos (n=4) e os triângulos, a de neonatos (n=4).
62
4.7 Avaliação fenotípica dos linfócitos de adultos e neonatos após estímulo com o mitógeno PHA, e o doador de NO, NOC-18
Como, aparentemente, a adição do NO exógeno parece modular de
forma distinta a expressão de NOS2 e ARG1 em células de neonatos e adultos
(Figura 13), e considerando que já existiam relatos sobre das atividades
imunomoduladoras do NO na resposta de linfócitos de camundongos adultos
(JIANJUN YANG et al., 2013; LEE et al., 2011; NIEDBALA et al., 1999;
NIEDBALA et al., 2007; NIEDBALA et al., 2013; NIEDBALA et al., 2014;
OBERMAJER et al., 2013), decidiu-se avaliar se duas concentrações (uma alta
– 200 µM e uma baixa – 50 µM) de NOC-18 em conjunto com o mitógeno PHA,
in vitro, poderiam modificar a frequência das populações de linfócitos T CD4+
(CD3+ CD4+), linfócitos T CD8+ (CD3+ CD8+) e linfócitos B (CD19+), e
modificar seu perfil de ativação (avaliado pelo marcador CD69) nas duas
populações estudadas.
O estímulo com fitohemaglutinina foi capaz de induzir um aumento das
populações de células ativadas tanto em adultos como em neonatos (Figura
14). Quando este estímulo policlonal foi associado ao doador de NO não houve
alteração na frequência de linfócitos de T CD4+ ativados em adultos.
Entretanto, o doador, na maior concentração, foi capaz de induzir um aumento
da população de linfócitos T CD4+ ativados e na expressão de CD69 na
superfície desses linfócitos de neonatos, em relação às demais situações (PHA
e PHA + 50 µM) (Figura 14A). De forma semelhante, houve um aumento da
população ativada de linfócitos B de neonatos quando receberam o estímulo de
PHA juntamente com o NOC-18 na sua maior concentração. Entretanto, isso
não se refletia diretamente na maior expressão de CD69 nos linfócitos, de tal
maneira que a maior expressão e CD69 foi observada quando os linfócitos B
foram estimulados com PHA e 50 µM de NOC-18 (Figura 14C).
63
0
2 0
4 0
6 0
8 0
Cé
ls C
D3
+ C
D4
+ C
D6
9+ (
%)
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lts N e o n a te s
2 0 0 M5 0 M
# #
0
2 0
4 0
6 0
8 0
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lts N e o n a te s
Cé
ls C
D3
+ C
D8
+ C
D6
9+ (
%)
0
5 0
1 0 0
Cé
ls C
D1
9+ C
D6
9+
(%)
# # # #
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
5 0 M 2 0 0 M
A
B
C
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
MF
I C
D6
9
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lts N e o n a te s
2 0 0 M5 0 M
# #
*
B a sa l
P H A
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
MF
I C
D6
9
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
MF
I C
D6
9 # # #
* *
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
5 0 M 2 0 0 M
Figura 14 - Percentual e grau de ativação de linfócitos de neonatos e adultos após estímulo com PHA e com o doador de NO (NOC-18). As formas fechadas representam as situações sem estímulo com PHA, e as vazias, aqueles que receberam o mitógeno. Os dados são representativos de experimentos realizados com células de adultos (n=11) e de neonatos (n=9). A análise estatística foi feita no software GraphPad Prism, mediante teste Friedman (intragrupo - #) e Mann Whitney (entre grupos - *). Foram considerados estatísticos valores de p<0,05.
64
4.8 Avaliação da proliferação dos linfócitos de neonatos e adultos após estímulo com o mitógeno PHA, e o doador de NO, NOC-18
Uma vez que se encontraram diferenças na ativação de linfócitos T
CD4+ e B após a adição do NOC-18, e entre os grupos, foi avaliada a
influência do NO na proliferação dos linfócitos T CD4+, T CD8+ e B. Para tanto,
avaliou-se, por citometria de fluxo, a perda de fluorescência das células
marcadas com CFSE e estimuladas como no tópico anterior.
Não houve diferenças entre as taxas de proliferação de linfócitos T
CD4+, T CD8+ e B de neonatos e adultos somente com o estímulo de PHA
(Figura 15A).
Consideramos a proliferação com PHA como ponto de referência para
avaliar o efeito da adição do NOC-18 na proliferação destes mesmos linfócitos.
Não houve diferença na proliferação dos linfócitos T CD4+ e T CD8+ de
neonatos e adultos após a adição de NOC-18 (Figuras 15B e 15C). Entretanto,
este doador, em sua maior concentração (200 µM), parece ter aumentado a
proliferação dos linfócitos B dos adultos, em comparação aos neonatos (Figura
15D).
A fim de verificar se as taxas de proliferação dos linfócitos estavam
diretamente relacionadas à sua ativação, foram realizadas análises de
correlação.
A única população no qual foi possível estabelecer uma correlação
foram os linfócitos T CD8+ de neonatos. A relação inversamente proporcional
nas células estimuladas apenas com PHA e 50 µM de NOC-18 indica que
quanto mais esses linfócitos proliferavam, eles encontravam-se num estágio de
menor ativação, e as que proliferavam menos, possuíam uma maior expressão
de CD69 em sua superfície (Figura 16A). Para os linfócitos B desse mesmo
grupo, estimulados apenas com PHA, há uma tendência de uma correlação
positiva, onde os linfócitos que mais proliferavam, encontravam-se mais
ativados, e vice-versa (Figura 16B).
65
Pro
life
ra
çã
o (
CF
SE
low
)
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
A du ltos
N e o n a tos
T C D 4 + T C D 8 + B
L in fó c ito s T C D 4 +
8 0
9 0
1 0 0
1 1 0
1 2 0
1 3 0
1 4 0
1 5 0
1 6 0
1 7 0
1 8 0
N O C -1 8 : 2 0 0 M50 M
Pro
life
ra
çã
o (
%)
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
L in fó c ito s T C D 8 +
Pro
life
ra
çã
o (
%)
N O C -1 8 : 2 0 0 M50 M
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
L in fó c ito s B
N O C -1 8 : 2 0 0 M50 M
p = 0 ,0 5 9 2
Pro
life
ra
çã
o (
%)
A
B C
D
Figura 15 - Taxa de proliferação de linfócitos de neonatos e adultos estimulados com PHA (A) e PHA mais o doador de NO, NOC-18 (B, C e D). A taxa de proliferação de cada subpopulação foi mensurada a partir da perda da fluorescência do CFSE na situação estimulada com PHA, em comparação à situação basal, sem estímulo. Os círculos fazem referência às células de adultos (n=13), ao passo que triângulos às de neonatos (n=10). (A) As formas pretas representam a taxa de proliferação dos linfócitos T CD4+, as azuis dos linfócitos T CD8+, e as vermelhas dos linfócitos B. (B, C e D) A taxa de proliferação foi
66
calculada em relação à proliferação somente com PHA. A análise estatística foi feita no software GraphPad Prism, mediante teste de Wilcoxon (intragrupos) e Mann Whitney (entre grupos). Foram considerados estatísticos valores de p<0,05.
0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0
0
1 0
2 0
3 0
P r o l i f e r a ç ã o (% C D 3+
C D 8+
C F S El o w
)
Ativ
aç
ão
(%
CD
3+
CD
8+
CD
69
+)
r = -0 ,7 8 3 3
p = 0 ,0 1 7 2
P H A + 50 M N O C -1 8
A B
0 2 0 4 0 6 0 8 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
P r o l i f e r a ç ã o (% C D 1 9+
C F S El o w
)
Ativ
aç
ão
(%
CD
19
+C
D6
9+
)
r = 0 ,6 6 7
p = 0 ,0 5 8 3 7
P H A
Figura 16 - Correlação entre ativação e proliferação de linfócitos T CD8+ e B de neonatos estimulados com o mitógeno PHA. Em (A) a correlação entre ativação e proliferação de linfócitos T CD8+ de neonatos (n=9) estimulados com PHA e 50µM de NOC-18. (B) representa a correlação para os linfócitos B neonatais (n=9) estimulados apenas com a PHA. A análise estatística foi feita no software GraphPrism mediante teste de correlação de Pearson, e foram considerados estatísticos valores de p<0,05.
4.9 Avaliação da apoptose de linfócitos de neonatos e adultos após estímulo com o mitógeno PHA e o doador de NO, NOC-18
Como foi observado, na Figura 14, houve um aumento na ativação de
linfócitos T CD4+ de neonatos quando estimulados com PHA e a maior
concentração de NOC-18 (200 µM), mas esta não foi acompanhada de um
aumento de proliferação dos mesmos (Figura 15). Por esse motivo, optou-se
por avaliar a apoptose desses linfócitos, através da marcação destes com
AnexinaV (que se liga à fosfatidilserina) após os mesmos estímulos (PHA e
NOC-18), a fim de avaliar se essa maior ativação não gerava um aumento da
taxa de apoptose das células.
Como pode-se observar na Figura 17A, apesar de não ser
estatisticamente significante, há um aumento das células marcadas com
AnexinaV quando as células são estimuladas com PHA. Para ambos os
grupos, esse percentual de células parece aumentar de acordo com a
quantidade crescente de NO na cultura. De forma bastante semelhante,
67
observa-se um aparente aumento das células T CD8+ que estão entrando em
apoptose quando o estímulo com o mitógeno é adicionado (Figura 17B).
0
2 0
4 0
6 0
L in fó c ito s T C D 4 +
CD
3+
CD
4+
An
ex
ina
V+
(%
)
- -5 0 M 5 0 M2 0 0 M 2 0 0 MN O C -1 8
A d u lto s N e o n a to s
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
L in fó c ito s T C D 8 +
CD
3+
CD
8+
An
ex
ina
V+
(%
)
- -5 0 M 5 0 M2 0 0 M 2 0 0 MN O C -1 8
A d u lto s N e o n a to s
B a sa l
P H A
0
5 0
1 0 0
L in fó c ito s B
CD
19
+ A
ne
xin
aV
+(%
)
*
*
- -5 0 M 5 0 M2 0 0 M 2 0 0 MN O C -1 8
A d u lto s N e o n a to s
A B
C
Figura 17 - Apoptose (células AnexinaV+) de linfócitos de adultos e neonatos estimulados com PHA e NOC-18. O percentual de apoptose foi mensurado através da marcação dos linfócitos T CD4+, T CD8+ e B com AnexinaV. As formas fechadas representam as situações sem estímulo com PHA, e as vazias, aqueles que receberam o mitógeno. Os dados são representativos de experimentos realizados com células de adultos (n=4) e de neonatos (n=5). A análise estatística foi feita no software GraphPad Prism, mediante teste Mann Whitney (entre grupos). Foram considerados estatísticos valores de p<0,05 (*).
Esse aparente aumento nas taxas de apoptose de linfócitos T CD4+ e T
CD8+ além de não serem estatisticamente significantes, não se correlacionam
com o grau de ativação dos linfócitos. Para os linfócitos T CD4+ e T CD8+ de
adultos estimulados somente com a PHA (Figuras 18A e 18C) parece haver
uma correlação positiva entre apoptose e ativação, entretanto, esta não é
68
estatisticamente significativa. Já para os linfócitos T CD8+ de neonatos
estimulados com PHA em conjunto com a maior concentração de NOC-18,
apesar de também não ser significante, parece haver uma relação
inversamente proporcional entre estes parâmetros (Figura 18H). Os linfócitos T
CD4+ de neonatos, estimulados somente com a PHA ou em conjunto com a
maior concentração de NOC-18 não apresentaram nenhuma possível
correlação entre suas taxas de apoptose e ativação (Figuras 18B e 18D).
Para os linfócitos B é possível observar que a taxa de apoptose destes
quando estimulados com PHA, ou com PHA + 200µM de NOC-18, é maior do
que os neonatos (Figura 17C). E apesar de não ser estatisticamente
significante, parece haver uma correlação inversamente proporcional entre a
taxa de apoptose e ativação nestes indivíduos adultos sob os mesmos
estímulos (Figura 19A e 19C), entretanto, para os neonatos, o mesmo não é
observado.
69
2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 4+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
4+
An
ex
ina
+)
r = 1 ,0 0 0
p = 0 ,3 3 3
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 4+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
4+
An
ex
ina
+)
r = - 0 ,5
p = 1 ,0 0
2 2 2 4 2 6 2 8 3 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 4+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
4+
An
ex
ina
+)
r = 0 ,4
p = 0 ,7 5 0
2 5 3 0 3 5 4 0 4 5
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 4+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
4+
An
ex
ina
+)
r = 0 ,0
p = 1 ,0 8 3
A d u lto s N e o n a to s
A B
C D
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 8+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
8+
An
ex
ina
+)
r = 1 ,0 0 0
p = 0 ,3 3 3
0 5 1 0 1 5
0
2 0
4 0
6 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 8+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
8+
An
ex
ina
+)
r = 0 ,4
p = 0 ,7 5
E F
0 1 0 2 0 3 0
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 8+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
8+
An
ex
ina
+)
r = 1 ,0 0 0
p = 0 ,3 3 3
2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A tiv a ç ã o (C D 3+
C D 8+
C D 6 9+
)
Ap
op
tos
e (
CD
3+
CD
8+
An
ex
ina
+)
r = -1 ,0 0 0
p = 0 ,0 8 3 3
G H
Figura 18 - Correlação entre ativação (expressão de CD69) e apoptose (expressão de fosfatidilserina) em linfócitos T CD4+ (A, B, E e F) e T CD8+ (C, D, G e H) de adultos e neonatos estimulados somente com PHA (A, B, C e D) ou com PHA em conjunto com 200 µM de NOC-18 (E, F, G e H). A análise estatística foi feita no software GraphPrism mediante teste de correlação de Spearman.
70
6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
8 0
8 5
9 0
9 5
1 0 0
A tiv a ç ã o (C D 1 9+ C D 6 9
+)
Ap
op
tos
e (
CD
19
+ A
ne
xin
a+)
r = -1 ,0 0 0
p = 0 ,3 3
0 2 0 4 0 6 0 8 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
A tiv a ç ã o (C D 1 9+ C D 6 9
+)
Ap
op
tos
e (
CD
19
+ A
ne
xin
a+)
r = - 0 ,4
p = 0 ,7 5
0 5 0 1 0 0 1 5 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A tiv a ç ã o (C D 1 9+C D 6 9
+)
Ap
op
tos
e (
CD
19
+A
ne
xin
a+)
r = -0 ,4
p = 0 ,7 5
6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0
7 0
8 0
9 0
1 0 0
1 1 0
A tiv a ç ã o (C D 1 9+ C D 6 9
+)
Ap
op
tos
e (
CD
19
+ A
ne
xin
a+)
r = -1 ,0 0 0
p = 0 ,3 3
A d u ltos N e o n a to s
A B
C D
Figura 19 - Correlação entre ativação (expressão de CD69) e apoptose (expressão de fosfatidilserina) em linfócitos B de adultos e neonatos estimulados somente com PHA (A e B) ou com PHA em conjunto com 200 µM de NOC-18 (C e D). A análise estatística foi feita no software GraphPrism mediante teste de correlação de Spearman.
4.10 Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 em células mononucleares estimuladas com o mitógeno PHA e o doador de NO, NOC-18
Como foram observadas algumas diferenças no perfil de ativação, mas
não no de proliferação e morte dos linfócitos, especialmente de neonatos, foi
avaliada a secreção de citocinas no sobrenadante de cultura, a fim de verificar
se havia alguma mudança no perfil de polarização de resposta, principalmente
dos linfócitos T auxiliares (IFN-γ – perfil Th1, IL-4 – perfil Th2, IL-17 – perfil
Th17, IL-10 – perfil T regulador), além de IL-2 e TNF-α. A quantificação de
citocinas foi avaliada em dois períodos, após 48 e 120 horas da adição dos
estímulos.
Após 48 horas de estímulo com PHA somente, houve um aumento
significativo na secreção das citocinas IL-17A (Figura 20A), IFN-γ (Figura
20B), IL-10 (Figura 20C), TNF-α (Figura 20D) pelas células mononucleares de
71
adultos. Efeito semelhante, nas células de neonatos, foi observado apenas
para IL-10 (Figura 20C).
O NOC-18 sozinho não exerceu modulação nenhuma sobre a secreção
de citocinas tanto de neonatos como de adultos, entretanto, quando adicionado
conjuntamente à PHA, na sua maior concentração (200 µM), causou um
aumento da secreção de IL-10 (Figura 20C), TNF-α (Figura 20D), IL-4 (Figura
20E) e IL-2 (Figura 20F) nas células mononucleares de adultos quando
comparado às demais situações (PHA e PHA + 50 µM). A menor concentração
do doador (50 µM), não foi capaz de reproduzir estes mesmos efeitos. Nos
neonatos, a adição dos dois estímulos em conjunto não foi capaz de modular a
secreção da maioria das citocinas que já era observada apenas com a PHA.
Apenas para IL-2, a maior concentração do NOC-18 em conjunto com a PHA,
foi capaz de aumentar a secreção desta citocina, quando comparada com o
mitógeno sozinho (Figura 20F).
Entre os grupos, foi possível observar que para todas as variantes do
estímulo, a secreção de IL-17A e IFN-γ foi maior nos adultos que nos neonatos
(Figuras 20A e 20B). Quando o doador de NO foi adicionado, em qualquer
concentração, a secreção de TNF-α aumentou nos adultos (Figura 20D),
tornando-se maior do que a dos neonatos. Já para IL-4 e IL-10, somente o
NOC-18 em sua maior concentração, e em conjunto com a PHA, foi capaz de
tornar a secreção destas citocinas maior pelas células de adulto, quando em
comparação à dos recém natos (Figuras 20C e 20E).
72
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
IL -1 7 A
B a sa l
P H A
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
pg
/mL
****
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
IF N -
pg
/mL
*
*
*
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
IL -1 0
**
pg
/mL
#
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
T N F -
pg
/mL
**
# #
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
5
1 0
1 5
IL -4
pg
/mL
# #
**
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
IL -2
pg
/mL
# #
#
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
A B
C D
E F
Figura 20 - Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 por células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o doador de NO, NOC-18, por 48 horas. As citocinas foram dosadas no sobrenadante de cultura após estímulo com PHA e NOC-18 por 48 horas. As formas fechadas representam as situações sem estímulo de PHA, e as vazias, aquelas que receberam o mitógeno. Os dados são
73
relativos a dosagens no sobrenadante de cultura de células de adultos (n=15) e neonatos (n=12). A análise estatística foi feita no software GraphPad Prism, mediante teste de Friedman (intragrupo - #) e Mann Whitney (entre grupos - *). Foram considerados estatísticos valores de p<0,05.
Após 120 horas, houve uma diminuição da secreção de IL-17A pelas
células de adultos estimuladas com PHA e que recebiam também o NOC-18
(Figura 21A). A quantidade de IFN-γ no sobrenadante de cultura das células
de adultos, em contrapartida, se manteve elevada e maior que a dos neonatos,
sob o estímulo com a PHA. E a adição do NOC-18 aumentou significativamente
sua secreção pelas células de adultos de maneira dose-dependente (Figura
21B). No mesmo período, houve uma queda nas concentrações de IL-10 nos
sobrenadantes de cultura, principalmente de adultos, estimulados com PHA
somado à 200 µM de NOC-18 (Figura 21C). Houve uma menor secreção de
TNF-α pelas células mononucleares de adultos, e esta manteve-se,
aparentemente, mais elevada que a dos neonatos (Figura 21D). A produção de
IL-4 e IL-2, para os dois grupos, também parece ter diminuído
substancialmente (Figuras 21E e 21F).
74
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
7 0 0
IL -1 7 A
B a sa l
P H A
pg
/mL
****
#
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
1 0 0
2 0 0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
IF N -
pg
/mL
*
*
#
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
IL -1 0
pg
/mL
#
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
5 0 0
1 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
6 0 0 0
T N F -
pg
/mL
*
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
IL -4
pg
/mL
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
0
5
1 0
1 5
IL -2
pg
/mL
N O C -1 8 : 2 0 0 M5 0 M- -
A d u lto s N e o n a to s
2 0 0 M5 0 M
A
C
E
B
D
F
Figura 21 - Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 por células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o doador de NO, NOC-18, por 120 horas. As citocinas foram dosadas no sobrenadante de cultura após estímulo com PHA e NOC-18 por 120 horas. As formas fechadas representam as situações sem estímulo de PHA, e as vazias, aquelas que receberam o mitógeno. Os dados são relativos a dosagens no sobrenadante de cultura de células de adultos (n=15) e neonatos (n=12). A análise estatística foi feita no software GraphPad Prism, mediante teste de Friedman (intragrupo - #) e Mann Whitney (entre grupos - *). Foram considerados estatísticos valores de p<0,05.
75
4.11 Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 em células mononucleares estimuladas com o mitógeno PHA e o inibidor de NOS, L-NAME
De forma semelhante ao que foi avaliado para as citocinas inflamatórias
(Figura 11), avaliou-se se a inibição das NOS de forma geral (através do
tratamento com o inibidor de NOS, L-NAME) modificava a secreção de
citocinas quando as células foram estimuladas com o estímulo policlonal, PHA.
De forma semelhante à primeira situação (com os agonistas de TLR), nenhum
dado encontrado foi estatisticamente significante, provavelmente decorrente do
reduzido número amostral.
De forma contrária ao observado para o doador de NO, o tratamento
com o inibidor de NOS causou uma queda de maneira geral na secreção de
algumas citocinas de forma dose-dependente (IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-2) pelas
células de adultos (maiores concentrações de L-NAME, menores
concentrações de citocina secretada) (Figura 22). Entretanto, para IL-17A, foi
observado o contrário. Apesar das baixas concentrações no sobrenadante de
cultura das células de adultos, o tratamento com L-NAME parece ter
aumentado a produção desta (Figura 22A). Houve pouco, ou nenhum efeito
aparente na secreção das mesmas citocinas pelas células de neonatos. Parece
ter havido um leve aumento na secreção de IL-10 quando o L-NAME foi
adicionado na sua menor concentração (1mM) (Figura 22C). Para as demais
citocinas, não foi possível quantificá-las.
76
0
5
1 0
1 5
IL -1 7 A
B a sa l
P H A
L -N A M E : 1 0 m M1 m M- -
A d u lto s N e o n a to s
10m M1 m M
pg
/mL
0
2 0
4 0
6 0
8 0
IF N -
pg
/mL
L -N A M E : 1 0 m M1 m M- -
A d u lto s N e o n a to s
10m M1 m M
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
IL -1 0
pg
/mL
L -N A M E : 1 0 m M1 m M- -
A d u lto s N e o n a to s
10m M1 m M
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
T N F -
pg
/mL
L -N A M E : 1 0 m M1 m M- -
A d u lto s N e o n a to s
10m M1 m M
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
IL -4
pg
/mL
L -N A M E : 1 0 m M1 m M- -
A d u lto s N e o n a to s
10m M1 m M
0
1 0
2 0
3 0
IL -2
pg
/mL
L -N A M E : 1 0 m M1 m M- -
A d u lto s N e o n a to s
10m M1 m M
A
C
E
B
D
F
Figura 22 - Produção de citocinas de perfil Th1/Th2/Th17 por células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o inibidor de NOS, L-NAME, por 48 horas. As citocinas foram dosadas no sobrenadante de cultura após estímulo com PHA e L-NAME por48 horas. As formas fechadas representam situações sem estímulo de PHA, e as vazias, aquelas que receberam o mitógeno. Os dados são relativos a dosagens no sobrenadante de cultura de células de adultos (n=3) e neonatos (n=4).
77
4.12 Modulação da expressão gênica de GATA3 e RORC2 em células mononucleares de adultos e neonatos após estímulo com PHA e o doador de NO, NOC-18
Como foi observado aumento na secreção de algumas citocinas após o
estímulo de PHA em conjunto com o NOC-18, e como já foi descrito na
literatura que a adição de NOC-18, em conjunto com estímulos policlonais de
linfócitos (como anticorpos anti-CD3 e anti-CD28), pode induzir a polarização
de diferentes tipos celulares através da modulação de alguns fatores de
transcrição (JIANJUN YANG et al., 2013; NIEDBALA et al., 2007; NIEDBALA et
al., 2013), decidiu-se avaliar a expressão gênica de alguns genes relacionados
ao perfil de resposta Th2 e Th17 (GATA3 e RORC2), nas células
mononucleares estimuladas com o mitógeno PHA, na presença do NOC-18 por
48 horas.
Para os genes relacionados ao perfil Th2 e Th17, que já haviam sido
descritos por sofrer a ação moduladora do NOC-18, não houve diferença entre
os grupos, mas foi possível observar um aparente aumento de expressão de
GATA3 (Figura 23A) em ambos, com as duas concentrações de NOC-18
(GATA3Ad 50 µM = 1,89 ± 2,04; GATA3Ad 200 µM = 1,55 ± 1,03; GATA3RN 50
µM = 2,04 ± 1,91; GATA3RN 200 µM = 1,28 ± 0,94). Este aparente aumento da
expressão de GATA3 se reflete no aumento de secreção de IL-4, pelas células
de adultos (Figura 20E). Para RORC2, a menor concentração de NOC-18
parece ter aumentado a sua expressão nos adultos (RORC2Ad 50 µM = 3,85 ±
3,5), enquanto que nas demais situações para adultos (RORC2Ad 200 µM =
0,74 ± 0,29) e neonatos (RORC2RN 50 µM = 1,25 ± 0,34; RORC2RN 200 µM
=0,80 ± 0,48), parece ter havido uma regulação negativa deste gene (Figura
23B). Este aparente aumento de expressão de RORC2, entretanto, não foi
acompanhada de um aumento na secreção de IL-17 pelas células de adultos.
O que foi possível perceber é que não há mudança na secreção de IL-17 em
48 horas (Figura 20A), e que em 120 horas, na realidade, há uma diminuição
na secreção desta citocina quando as células de adultos são estimuladas com
o mitógeno, em conjunto com 50 µM de NOC-18 (Figura 21A).
78
R O R C 2
0
2
4
6
8
1 0
+ 2 0 0 M N O C -1 8+ 5 0 M N O C -1 8
Fo
ld C
ha
ng
e (
2-
c
t)
A du ltos
N e o n a tos
G A T A 3
0
1
2
3
4
5
+ 2 0 0 M N O C -1 8+ 5 0 M N O C -1 8
Fo
ld C
ha
ng
e (
2-
c
t)
A B
Figura 23 - Modulação da expressão de GATA3 e RORC2 em células mononucleares estimuladas com PHA e o doador de NO, NOC-18. A expressão relativa dos genes foi calculada em comparação à amplificação do gene constitutivo, GAPDH, e em comparação à situação estimulada com PHA por 48 horas. Os círculos fazem referência à expressão em células de adultos (n=4) e os triângulos, a de neonatos (n=4).
DISCUSSÃO
80
5 Discussão
Apesar dos avanços no conhecimento sobre as características do
sistema imune nas diferentes fases da vida, ainda há pontos inexplorados. O
entendimento de mecanismos reguladores do sistema imune no início da vida
torna-se essencial não só para o tratamento e prevenção de doenças neste
período, mas também para o desenvolvimento de vacinas e adjuvantes.
Os recentes relatos de como o NO pode atuar como imunomodulador,
principalmente atuando sob a resposta adaptativa, demonstram seu potencial
como alvo para uso clínico. Com isso, decidiu-se avaliar os possíveis efeitos
que esse radical livre poderia provocar nas células mononucleares de neonatos
e de adultos, e se ele era capaz de modificar o padrão de resposta anti-
inflamatória e de perfil Th2 tão bem estabelecido e descrito em neonatos.
Nossos resultados mostraram que células mononucleares neonatais
possuem uma dificuldade de expressar NOS2 e secretar NO, o que pode estar
relacionado à maior expressão constitutiva a nível transcricional (Figura 8) e
traducional da enzima arginase-1 (YU et al., 2011). Esta maior expressão de
arginase-1, aliada à presença das células eritróides CD71+ (características do
período neonatal e caracterizadas pela expressão da arginase-2) (ELAHI et al.,
2013) podem gerar uma menor biodisponibilidade ou até mesmo a depleção da
L-arginina, aminoácido que serve de substrato para ambas (arginase e iNOS),
dificultando ainda mais a produção de NO.
Nem mesmo o estímulo com os agonistas de TLR, considerados
indutores do aumento da expressão de NOS2 (KLEINERT et al., 2004) foram
capazes de causar uma regulação positiva para esse gene nas células dos
neonatos (Figura 9A). Apesar disso, não se pode deixar de considerar que
vários estudos e revisões já relataram problemas na sinalização por esses
receptores da imunidade inata no início da vida. Apesar desses receptores de
membrana e das moléculas de transdução de sinal estarem igualmente
expressos em adultos e recém-natos (KOLLMANN et al., 2012), estes últimos
apresentam outros problemas como a maior concentração de AMPc
intracelular, dificuldade de IRFs translocarem para o núcleo, entre outros que
vão interferir e limitar uma resposta pró-inflamatória (AKSOY et al., 2007;
81
KOLLMANN et al., 2012; LEVY et al., 2006) . Tais problemas são confirmados
e ficam mais evidentes pela menor secreção de citocinas inflamatórias após o
estímulo com estes agonistas pelas células mononucleares neonatais (Figura
10).
Apesar de termos focado nossas análises na expressão de NOS2,
atualmente já se sabe que células do sistema imune também são capazes de
expressar as outras isoformas de NOS, e que essas podem contribuir com
mecanismos de regulação deste sistema. Por essa razão, nos chamou a
atenção o fato que a inibição das NOS (através do uso da L-NAME) parece ter
diminuído a secreção de IL-1β, TNF-α e IL-10 quando as células de adultos
foram estimuladas com CL097 e LPS (Figura 11), enquanto que o mesmo não
foi observado para as células estimuladas com Poly I:C (Figura 11). Tais
achados indicam que o NO e as NOS podem interferir de forma distinta nas
diferentes vias de sinalização de TLR (MyD88 ou TRIF), ou mesmo nas vias
finais de sinalização, com ativação dos fatores de transcrição NF-κB ou IRF3.
Neste sentido, SOCS-1, molécula supressora, capaz de degradar p65 do fator
de transcrição NF-κB (YOSHIMURA et al., 2007), pode ser nitrosilada e
degradada pela ação do NO produzido pela nNOS em modelos de sepse
murina induzida por LPS (BAIG et al., 2015). Desse modo, o tratamento com L-
NAME nas células estimuladas com CL097 e LPS, poderia inibir essa
nitrosilação de SOCS-1, causando seu acúmulo e menor ativação de NF-κB,
enquanto que as estimuladas por Poly I:C, por este agonista induzir a ativação
do fator de transcrição IRF3, não sofreriam tanto estes efeitos supressores.
Nos neonatos, a secreção de citocinas parece não ter sido influenciada
pela inibição das NOS (Figura 11), indicando que nessa fase da vida, a
influência do NO seja menor, e que não haja a participação de SOCS-1 nesse
contexto. Contradizendo diversos estudos sobre a imunologia neonatal, e
apesar de analisar uma espécie diferente, um grupo francês demonstrou que
células mononucleares de cordeiros recém-natos são capazes de secretar altas
concentrações de IL-12. Neste estudo, as células mononucleares quando
estimuladas com agonistas de TLR7/8 expressam mais SOCS-1, mas não
sofrem ação deste, uma vez que conseguem facilmente polarizar a resposta
para um perfil mais Th1 (FERRET-BERNARD et al., 2010). O estímulo com
agonistas de TLR, e o consequente aumento de expressão de SOCS-1 não
82
interferiu na secreção de citocinas pró-inflamatórias dos cordeiros neonatos,
sugerindo que mecanismo semelhante possa existir para os recém-natos
humanos.
Espécies reativas de oxigênio são capazes de ativar o complexo
inflamassoma, e consequentemente promover a secreção de citocinas como
IL-1β e IL-18 (GROß et al., 2016; HOYT et al., 2017; MILLS et al., 2017),
entretanto, o NO já foi descrito por nitrosilar o NLRP3 de tal modo a não haver
mais a oligomerização do complexo. Com isso, há uma limitada resposta
inflamatória, o que favorece infecções como a tuberculose, ou o choque séptico
(MISHRA et al., 2013; PARK et al., 2013). Isso pode explicar a menor secreção
de IL-1β por células mononucleares de adultos quando o NOC-18 foi
adicionado (Figura 12), por exemplo. Em contrapartida, já foram descritos
mecanismos no qual o inflamassoma, na verdade, participa e regula a
expressão de iNOS e consequente produção de NO. Em modelos
experimentais, a ativação do NLRC4 pela flagelina citosólica, ativa a caspase-
1, que é capaz de clivar o PARP1, promovendo uma menor condensação da
cromatina, e tornando a região de transcrição de NOS2 mais acessível (BUZZO
et al., 2017).
O uso de moléculas doadoras de NO poderiam simular o efeito que o
NO produzido em resposta a algum processo inflamatório causaria nas células
do sistema imune. Seu uso trouxe muitas informações acerca da sua
capacidade moduladora, e de moléculas ou vias que poderiam ser estudadas
(BOGDAN, 2001; ILLI et al., 2009; JIANJUN YANG et al., 2013; NIEDBALA et
al., 2014). A nitrosilação é um tipo de alteração proteica que vem ganhando
atenção, principalmente por acontecer em condições fisiológicas, e devido à
grande quantidade de processos celulares regulados por essa modificação
(HESS et al., 2005).
Além de processos citoplasmáticos modulados por essas modificações,
já há relatos demonstrando que a nitrosilação pode ocorrer no núcleo,
regulando a transcrição de alguns genes, através de algumas modificações
epigenéticas. Estudo recente demonstrou que a expressão de NOS, e o uso de
doadores de NO, como o NOC-18, são importantes para a nitrosilação da
histona deacetilase (HDAC2), aumentando a acessibilidade ao promotor de
ARG2 em linhagens de células endoteliais de artéria umbilical (Human
83
umbilical artery endotelial cells – HUAEC) (KRAUSE et al., 2016). Apesar de
um gene diferente, tal trabalho corrobora com os nossos achados nos quais
houve um aparente aumento de expressão somente de ARG1 quando as
células mononucleares foram estimuladas com PHA, em conjunto com o NOC-
18 (Figura 13A). Em modelos murinos, a nitrosilação de dois resíduos de
cisteína em arginase-1 colabora com a maior estabilidade e atividade dessa
enzima. Com isso, há uma menor disponibilidade de NO (produzido pela
eNOS), uma menor regulação da vasodilatação das células endoteliais, e isso
pode acarretar em disfunções vasculares em camundongos mais velhos
(SANTHANAM et al., 2007). Assim, a adição do doador de NO pode tanto estar
relacionada à maior disponibilidade do locus da ARG1, como servindo de um
feedback positivo para uma maior expressão e estabilidade desta enzima.
Modelos experimentais com camundongos adultos demonstraram que a
adição de diferentes concentrações de NOC-18 faz com que os linfócitos
TCD4+ se diferenciem de maneiras diferentes. Em modelos experimentais, o
NO pode S-nitrosilar o fator de transcrição RORγt, diminuindo a diferenciação
dos linfócitos TCD4+ em Th17 (JIANJUN YANG et al., 2013; NIEDBALA et al.,
2011). Os dados obtidos mostram que o NO exógeno parece ser capaz de
inibir a expressão de RORC2 (Figura 23) em ambos os grupos, entretanto a
secreção de IL-17A após 48 horas pelos adultos manteve-se constante e maior
do que a dos neonatos conforme as concentrações do doador aumentavam no
meio. Após 120 horas, entretanto, houve uma queda nas concentrações desta
citocina no sobrenadante de cultura quando o NOC-18 era adicionado (Figura
21A). O uso do inibidor de NOS, aparentemente aumentou a secreção de IL-
17A (Figura 22A) pelos adultos. Assim, pode-se concluir que a exposição ao
NO por períodos prolongados pode inibir a diferenciação de novos linfócitos em
Th17 em adultos humanos, diminuindo a secreção de IL-17A. Entretanto, em
períodos mais curtos, e com estímulos policlonais, o NO não interfere nos
linfócitos já polarizados para um perfil Th17.
O mesmo grupo que relata a inibição da diferenciação de Th17, também
já descreveu a geração das chamadas NO-Tregs em camundongos. Essas são
células T CD4+ de perfil regulador, mas que não apresentam o fator de
transcrição FoxP3. Sua diferenciação é dependente de p53, IL-2, e OX40, e
leva à expansão e diferenciação de células TCD4+ CD25- em NO-Tregs,
84
células TCD4+CD25+ tbetlow GATA3hi que secretam IL-10 e IL-4 (NIEDBALA et
al., 2007). O aumento de expressão de GATA3 (Figura 23A) nas células
mononucleares de adultos estimuladas com PHA + NOC-18, somado a uma
maior secreção de IL-4, IL-10 e IL-2 após 48 horas (Figura 20), nos sugere que
o mesmo linfócito regulador possa estar sendo gerado na cultura de células de
adultos, entretanto, melhores caracterizações fenotípicas e funcionais
precisariam ser feitas.
Todas essas modificações causadas pela adição de NOC-18 em
conjunto com PHA na expressão e secreção de citocinas nas células de
adultos não foram acompanhadas por alterações em proliferação (Figura 15),
ativação (Figura 14) e apoptose (Figura 17) de linfócitos T CD4+ e linfócitos B.
Há diversos estudos evidenciando que a adição do NO exógeno
promove um aumento nas taxas de proliferação celular (NAPOLI et al., 2013;
THOMAS et al., 2008) , entretanto grande parte destes estudos foram
realizados em células transformadas, sejam elas linhagens ou em células
derivadas de algum tumor. A adição de NO exógeno também já foi relatada por
inibir a proliferação de diversas células, principalmente em células endoteliais
vasculares. Muitos destes relatos, tanto de inibição como indução de
proliferação descrevem que o NO pode induzir proteínas que regulam/inibem a
divisão celular (principalmente as que regulam a progressão do ciclo celular de
G1 para S), ou mesmo nitrosilar proteínas que participem deste processo
(ISHIDA et al., 1997; VILLALOBO, 2006). Em linfócitos T CD4+,
particularmente, já foi demonstrado que a adição de NO exógeno foi capaz de
inibir sua proliferação, mas sem afetar a produção de citocinas de perfil Th1 e
Th2 (VAN DER VEEN et al., 1999). Entretanto, nestes estudos, os autores
relataram essa menor proliferação em decorrência da menor secreção de IL-2
(TAYLOR-ROBINSON, 1997), fato contrário aos nossos achados (Figura 20F).
Enquanto que para adultos o estímulo com PHA e NOC-18 resultou,
principalmente, numa mudança no perfil de citocinas, para os neonatos o NOC-
18, especialmente na concentração de 200 µM, aumentou significativamente a
taxa de linfócitos T CD4+ ativados (Figura 14), mas não alterou as taxas de
proliferação (Figura 15B) e apoptose (Figura 17A) destes. Essa maior
porcentagem de linfócitos T CD4+ ativados foi, inclusive, maior do que o dos
linfócitos de adultos. Para os linfócitos B, o mesmo estímulo (PHA + 200 µM de
85
NOC-18) também foi capaz de induzir um aumento significativo do número de
linfócitos ativados nos neonatos, entretanto neste caso, essa quantidade era
menor do que a dos adultos (Figura 14C).
Infelizmente, a ausência de mudanças no perfil de citocinas secretadas
pelas células de neonatos não nos permite esclarecer se esse aumento da
população de linfócitos T CD4+ CD69+ se refletia em uma mudança de
polarização de linfócitos. A única citocina que teve sua secreção aumentada
pelas células mononucleares de neonatos quando estimulados com PHA e o
doador de NO, foi IL-2 (Figura 20F) em 48 horas. Em comparação com os
adultos, houve uma menor secreção, inclusive, de citocinas que se esperava
encontrar em maiores quantidades no sobrenadante de cultura dos recém-
natos como IL-10 e IL-4 (Figuras 20C e 20E) (ADKINS, 2007; KOLLMANN et
al., 2012).
Tais modificações em aumento de células ativadas, mas sem
modificação da secreção de citocinas podem ser decorrentes de modificações
em enzimas que regulam a condensação de certas regiões da cromatina, como
é o caso das HDACs. Vários estudos já evidenciaram que o NO (principalmente
exógeno) pode gerar modificações nessa família de enzimas (inclusive em
células neonatais), e consequentemente, deixar algumas regiões mais
disponíveis para transcrição (ILLI et al., 2008; KRAUSE et al., 2016; RIOS et
al., 2016).
Todas essas divergências na resposta imune de neonatos e adultos
tiveram quando o doador de NO foi adicionado ou as NOS foram inibidas,
reforça as diferenças no perfil de resposta nesses períodos da vida, e sugerem
que o metabolismo, e a susceptibilidade dessas células ao NO é diferente.
Já é sabido que as células neonatais carecem de sistemas
antioxidantes, possuindo menores quantidades de enzimas como a superóxido
dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPX) (NASSI et al.,
2009; PERRONE et al., 2016). A SOD é responsável por neutralizar o radical
superóxido, gerado, por exemplo, durante a respiração mitocondrial. A menor
disponibilidade de superóxido evita que este reaja com o NO, e produza
peroxinitrito, que é muito mais reativo, e possui uma atividade oxidante muito
mais pronunciada que o NO sozinho. Assim, a maior geração de peroxinitrito
nos neonatos, ou a maior difusão do NO pela célula, seriam capazes de gerar
86
modificações e alcançar regiões, como o núcleo, de forma diferente do que os
mesmos em células de adultos.
Compreender melhor tais mecanismos, e se as células imunes humanas
são “susceptíveis” às atividades imunomoduladoras do NO, assim como já é
descrito para modelos murinos, faz-se necessário. Além disso, compreender
bem a regulação das NOS, e averiguar as possíveis situações fisiológicas, ou
patológicas (especialmente durante a gestação) nas quais a produção de NO
está exacerbada torna-se de grande valia para compreender se esse radical
poderia modular a resposta imune do recém-nato.
Conclusão
88
6 Conclusões
No presente estudo avaliamos o potencial imunomodulador in vitro do
NO nas respostas imunes inata e adquirida de células mononucleares de
adultos e neonatos, e os nossos dados apontam que:
O NO (seja ele endógeno ou exógeno) é capaz de modular as respostas
imunes de neonatos e adultos, porém de formas distintas;
Durante respostas imunes inatas (ex.: via ativação por TLR) o NO
produzido pelas NOS parece ser importante, visto que o uso de L-NAME
modulou a secreção de citocinas inflamatórias;
Entretanto, a adição do NO exógeno parece modular a resposta apenas
relacionada à ativação dos NLR, e não dos TLR;
Na resposta imune adaptativa de adultos, o NO exógeno modula a
secreção de citocinas, sem alterar ativação, proliferação e apoptose;
Na resposta imune adaptativa de neonatos, o NO exógeno modula o
perfil de ativação dos linfócitos, mas sem alterar os demais parâmetros
analisados.
Assim, estudos mais aprofundados sobre as vias de sinalização
que o NO estaria modulando/modificando se fazem necessários, a fim
de avaliar o potencial dessa molécula como alvo em terapias, ou para
um futuro uso em formulações vacinais.
89
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