eletroforese em gel de agarose

7/18/2019 eletroforese em gel de agarose

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USP - Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

Departamento de Física e QuímicaProf.ª Dr.ª Eliane Candiani Arantes Braga

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

Noturno

Nomes:

Rodrigo Ferreira Scandiuzzi

Ricardo Rezende

Luis Claudio Ferreira

Arthur Steckelberg

Ribeirão Preto2011



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1. Objetivo

Verificar o comportamento eletroforético de proteínas com diferentes PIs, em

eletroforese para proteínas básicas.

2. Introdução

2.1 Eletroforese em gel

É uma técnica de separação de moléculas onde as partículas que são carregadasnegativamente por um composto denominado SDS (detergente dodecil sulfato de sódio),com exceção do DNA que já possui um caráter de cátion, migram em um determinado geldurante a aplicação de uma diferença de potencial em direção a um eletrodo positivo, sendoque este é criado por uma corrente elétrica, e posteriormente são aplicadas sobre o gel.

Para a separação das moléculas nesta técnica, temos que levar em consideração otamanho da molécula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que asde maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. Em alguns casos o formato damolécula também influencia, pois dependendo do formato as mesmas terão mais facilidadede migrar pelo gel. É importante ressaltar que a eletroforese é utilizada normalmente para aseparação de proteínas e moléculas de DNA e RNA.

2.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida

A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. Parapreparar este gel, basta adicionar os dois polímeros nas concentrações desejadas em umsuporte de vidro e na presença de um catalisador.

Esta técnica é utilizada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separarfragmentos muito pequenos de DNA e proteínas que apresentam uma mínima diferença demassa, além disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra.

Apesar das vantagens, o gel de agarose é mais utilizado pois a poliacrilamida émuito tóxica e difícil de ser preparada. Neste tipo de gel a corrida é feita em cubas verticais,e o carante utilizado é o mesmo da eletroforese em gel de agarose.

O tamanho do poro do gel pode ser controlado pela concentração total deacrilamida (T), e pelo grau de bis-acrilamida (C).

a=massa de acrilamida, b=massa de bis-acrilamida e V=volume

ba

bC e

V

baT

100100



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Existem dois tipos de gel de poliacrilamida:

Desnaturante: separa e purifica fitas simples de DNA, e convenciona desnaturante

pois é polimerizado pela uréia.

Não desnaturante: separa e purifica fitas duplas de DNA.

2.3 Aplicações de técnicas Eletroforéticas

Análise da pureza de proteínas

Determinação do peso molecular

Verificação da concentração de proteínas

Detecção de proteólise

Identificação de proteínas imunoprecipitadas

Primeiro estágio de imunoblotting

Separação e concentração de antígenos de proteínas para produção de anticorpos

Separação de proteínas radioativamente marcadas

2.4 Fatores que afetam a eletroforese:

Campo Elétrico: Voltagem, resistência e corrente;

Amostra: Carga, tamanho e forma;

O tampão: Composição, concentração e Ph;

O meio de suporte: Absorção, eletroendosmose e peneira molecular.

2.5 Classificação das eletroforeses :

2.5.1 Eletroforese em solução livre:

Eletroforese de fronteira móvel

Eletroforese de fluxo livre

Eletroforese capilar

Cromatografia eletrocinética capilar (misto)



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2.5.2 Eletroforese em meio de suporte:

Eletroforese em papel

Eletroforese em camada delgada (sílica ou alumina)

Eletroforese em membrana de acetato de celulose

Eletroforese em gel: agarose, poliacrilamida ou amido

3 Materiais e métodos

3.1 Gel a 9 % em acrilamida, para eletroforese sem SDS:

O espaço retangular formado entre duas placas de vidro, distanciadas entre si porespaçadores de 0,7 mm, é preenchido com a solução que dará origem ao gel. Terminada a polimerização, retira-se a borracha da parte inferior da placa e monta-seo sistema na cuba de eletroforese. Realizar uma pré-corrida de 30 minutos, a 100V, antes da aplicação das amostras.

Soluções utilizadas para a montagem do gel de poliacrilamida:

3.2 Amostras:

1. Nenhuma amostra2. Tripsina3. Soroalbumina4. Soro de cavalo5. Veneno de T.serrulatus6. Fração XIII7. Veneno de C. durissus terrificus8. Crotoxina9. Crotamina10. Fucsina



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3.3 Procedimento para montagem da placa

- Limpar com etanol 70% ou acetona as placas de vidro, espaçadores e pentes

- Preparar as soluções, de resolução e de concentração, sem adicionar o TEMED, deacordo com as quantidades indicadas. Adicionar à solução do gel de resolução oagente polimerizante TEMED. Agitar vigorosamente e colocar imediatamente asolução, com o auxílio de uma micropipeta, entre as placas de vidro, com o cuidadode evitar a formação de bolhas de ar. A solução é colocada até à marca traçadapreviamente.

- Adicionar TEMED à solução do gel concentrador e colocar o pente logo em seguida,antes do gel começar a polimerizar. Encaixe o pente com o tamanho de poçodesejado entre as placas. Deixar em repouso até o gel concentrador polimerizar(aproximadamente 30 minutos). Após o gel ter polimerizado retirar o penteposicionando de forma que não danifique os poços do gel concentrador. Com oauxílio de uma micropipeta, lavar os poços com tampão de eletroforese e tentararrumar os poços que tenham ficado deformados durante a remoção do pente.

- Coloque as amostras e os padrões moleculares nos poços do gel de concentração, asolução tampão e encaixe a tampa. Remover com o auxílio de uma seringa as

bolhas de ar que se formaram entre as placas de vidro, no limite inferior do gel. (Porconvenção, o preto é o pólo negativo e o vermelho é o pólo positivo - as proteínasvão migrar para o pólo positivo).

4 Discussão e Resultados

Na eletroforese em gel de poliacrilamida as proteínas migram através dos poros dogel. O tamanho desses poros diminuem para concentrações crescentes de acrilamida.

A migração através do gel se dá por causa do tamanho dos poros do gel e do pesomolecular das proteínas. Considerando um determinado tamanho de poro, tem-se quequanto menor for o peso molecular da proteína mais facilmente ela migrará em relação àsproteínas de alto peso molecular.

A direção da eletroforese é de cima para baixo. As proteínas pequenas movem-serapidamente no gel, enquanto as grandes ficam em cima, perto do ponto de aplicação damistura.

Através da visualização dos resultados é possível analisar também se as proteínastem caráter básico ou ácido em relação as outras. Como no processo realizado em aulatinha a pretensão de detectar proteínas básicas, as que se possuíssem um menordeslocamento ao longo do gel tinha essas características.



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Pode visualizar as proteínas no gel corando-as com um corante (Coomassie Blue).

4.1 Prováveis causas de erros:

Formação de bolhas no gel e nas soluções;

Preparo de soluções;

Montagem da placa;

Manuseio do gel;

Tempo de corrida;

Preparo do Tampão e deixa-lo extravasar na placa.

5 Conclusão

A eletroforese em gel de poliacrilamida é usada em menor escala. A técnica é

simples, rápida e capaz de separar misturas de fragmentos de DNA que não podem serseparados por outros métodos, tais como centrifugação com densidade de gradiente ou porvelocidade de sedimentação. A localização do DNA no gel pode ser determinada

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diretamente. As bandas do gel são coloridas por corante, que colore por intercalar-se nadupla fita de DNA.

A partir dos resultados obtidos, pudemos observar que as proteínas comportam-sealeatoriamente nos diferentes PIs , devido às distintas concentrações das substâncias emquestão.

Presença de bolhas, não preparação adequada do gel bem como os erros relacionadosanteriormente, pode causar flutuação nos resultados levando a um experimento inadequado.

Referencias Bibliográficas:

SILVA JÚNIOR, J. G. Eletroforese de proteínas: guia teórico e prático. Rio de Janeiro:Interciência, 2001.

STRYER, Lubert. Bioquimica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1988.

www.w3.ufsm.br/piquini/biomol09/eletroforese.doc

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