EMULSÕES CONTENDO GELANA ACILADA: EFEITO DO …repositorio.unicamp.br/bitstream/REPOSIP/325506/1/Vilela... · derivados do ovo ou do leite comumente usados como emulsificantes. Outra

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

JOICE ALINE PIRES VILELA

EMULSÕES CONTENDO GELANA ACILADA: EFEITO DO

PROCESSAMENTO E DA ADIÇÃO DE SAIS NOS MECANISMOS DE

ESTABILIZAÇÃO

CAMPINAS

2016

JOICE ALINE PIRES VILELA

EMULSÕES CONTENDO GELANA ACILADA: EFEITO DO

PROCESSAMENTO E DA ADIÇÃO DE SAIS NOS MECANISMOS DE

ESTABILIZAÇÃO

Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da

Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos

para a obtenção do Título de Doutora em Engenharia de Alimentos.

Profª Dra. Rosiane Lopes da Cunha

Orientadora

Este exemplar corresponde à versão

final da tese defendida pela aluna

Joice Aline Pires Vilela e orientada

pela Profª Dra. Rosiane Lopes da Cunha

CAMPINAS

2016

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________ Profa. Dra. Rosiane Lopes da Cunha (Orientadora)

Faculdade de Engenharia de Alimentos – Universidade Estadual de Campinas

_______________________________________ Prof. Dr. Edvaldo Sabadini (Membro)

Instituto de Química – Universidade Estadual de Campinas

_______________________________________ Prof. Dr. Paulo José do Amaral Sobral (Membro)

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – Universidade de São Paulo

_______________________________________ Prof. Dr. Pedro Esteves Duarte Augusto (Membro)

Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"- Universidade de São Paulo

_______________________________________ Profa. Dra. Samantha Cristina de Pinho (Membro)


_______________________________________ Prof. Dr. Guilherme Máximo (Suplente)


_______________________________________ Profa. Dra. Miriam Dupas Hubinger (Suplente)


_______________________________________ Profa. Dra. Izabel Cristina Freitas Moraes (Suplente)


Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Aos meus pais Geraldo e Solange

Agradecimentos

Agradeço, antes de tudo, à energia que existe, agradeço a essa rede, essa malha fina que

conecta todas as coisas que vibram. Ao que alguns chamam de energia divina. Para outros se trata do

consciente coletivo, a força do cosmo, a possibilidade de organização em meio ao caos. Agradeço a

esse ser que não é senão sendo. A esse olho que tudo vê e acompanha. A esse que para alguns é

criador, para outros, criatura. Agradeço àquele que para muitos é a força motriz desse intrincado

carrossel de planetas, estrelas e galáxias. A esse que é eterno, que tudo permeia, que tudo contém e

em tudo está contido. Agradeço a esse mistério, que não pode ser designado, nem explicado, muito

menos compreendido, mas que se faz presente, sem sombra de dúvidas, a cada sopro de vida e no

pulsar de tudo que há na natureza.

Agradeço à Professora Rosiane Lopes da Cunha pela orientação durante todo esse período e à

Faculdade de Engenharia de Alimentos, professores e funcionários, e às agências de fomento, CNPq,

Capes e, principalmente, à Fapesp, todos imprescindíveis para a realização desse trabalho. Também

gostaria de agradecer a todos do Laboratório de Engenharia de Processos (às técnicas Vanessa,

Zildene e Patrícia, às professoras Ana Carla, Carolina e Fabiana e aos alunos Luiz Henrique,

Fernanda, Raphaela, Raquel, Guilherme, David, Ana Letícia, Cristiane, Andresa, Mariano, Paula,

Thaís, Kátia e Rejane).

Meus agradecimentos à banca examinadora, pelas valiosas correções e sugestões que

contribuíram para a melhoria desse trabalho. Também ao Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia

de Fotônica Aplicada a Biologia Celular (INFABIC), por disponibilizar o microscópio confocal. Ao

Laboratório de Extração, Termodinâmica Aplicada e Equilíbrio/FEA, pelo auxílio e uso de

equipamentos. Também ao professor Marcelo Menossi/IB por disponibilizar equipamentos para uso.

Igualmente, gostaria de agradecer a CP Kelco Brasil e a Companhia Cacique de Café solúvel

por terem disponibilizado as matérias-primas utilizadas nesse trabalho. Ao Cléo T. G. V. M. T. Pires

pelas análises de espectroscopia de infravermelho e microscopia eletrônica de varredura das amostras

de borra de café.

Agradeço imensamente aos meus pais Geraldo e Solange, e aos meus irmãos, Luana e

Giovanni, bem como a todos os meus familiares e agregados queridos, a todas as tias (em especial às

tias Iza, Betânia, Irene, Conceição, Vilda e Silca), aos tios, primos, primas e ao Vô Victor e Vô

Salatiel, todos são muito importantes na minha vida.

Por fim, agradeço a todos os amigos que estiveram junto comigo durante essa caminhada

(Cléo, André, Tida, Robson, Ediane, Mariana, Amanda, Glaudson, Walquíria, Henrique, Felipe,

Flávio, Pedro Paulo, Pedro C., Luzinha, Christian, Samuel, Paulinha, Chun, Petty, Fernando, Gui,

Julião, Vanessa, Bruno, Érika).

RESUMO

Emulsões estabilizadas por partículas sólidas, denominadas emulsões Pickering, apresentam-

se como uma alternativa frente às emulsões clássicas estabilizadas por surfactantes. Estas emulsões

são caracterizadas por uma elevada estabilidade à coalescência e menor sensibilidade às alterações

do meio. As gelanas acilada (HA) e desacilada (LA) foram os materiais estudados como potenciais

estabilizantes de emulsões de óleo de girassol disperso em água. Diferenças importantes foram

observadas nas propriedades das gelanas HA e LA, principalmente no comportamento reológico e

nos valores de potencial zeta, que auxiliaram a entender o mecanismo de atuação desses

polissacarídeos em emulsões óleo-água. Em dispersões contendo baixas concentrações de

polissacarídeo, foi observado que a capacidade espessante da gelana HA é muito superior e que esta

apresentou valores de potencial zeta duas vezes maior que o encontrado para a gelana LA. Além

disso, a gelana LA não mostrou capacidade emulsificante nas condições estudadas. Já em relação às

emulsões contendo gelana HA, baixas concentrações de polissacarídeo (a partir de 0,05% m/m)

foram capazes de estabilizar emulsões contendo 30% (m/m) de óleo de girassol. O efeito da força

iônica nas emulsões contendo gelana HA também foi determinado. As propriedades das emulsões

mostraram-se bastante dependentes da razão polissacarídeo/sal e também do tipo de sal utilizado. O

aumento da viscosidade da fase contínua, a repulsão eletrostática entre as gotas e a deposição de

partículas sólidas na interface (Pickering) foram os mecanismos que provavelmente contribuíram

para a estabilização, sendo o predomínio de um mecanismo sobre o outro dependente da composição

e condições utilizadas na preparação das emulsões. Independente do mecanismo de estabilização

atuando, é importante ressaltar as baixas concentrações de polissacarídeo utilizadas, mostrando que a

gelana HA tem potencial para ser utilizada como um ingrediente estabilizante/emulsificante. Esse

carboidrato é de uso “Generally Recognized as Safe” (GRAS) e, portanto, constitui-se como uma

interessante opção na estabilização de emulsões alimentícias, especialmente considerando o atual

interesse em reduzir a utilização de ingredientes sintéticos ou derivados de origem animal, como os

derivados do ovo ou do leite comumente usados como emulsificantes. Outra parte desse trabalho

(ANEXO I) envolveu o estudo das partículas de borra de café, um subproduto da indústria de

alimentos rico em carboidratos, cujas partículas podem ter aplicação em diversos segmentos. Na

caracterização da borra de café foi observado que se trata de um material constituído de partículas

com diâmetro médio variando numa faixa bastante abrangente (37 m a 10 mm), com morfologia

heterogênea e potencial zeta negativo no pH natural (5,0). Não foram observadas diferenças

significativas de composição entre as frações separadas por tamanho através de peneiras. Métodos

químicos e físicos foram utilizados para alcançar reduções no tamanho das partículas de borra de

café e concluiu-se que a utilização de rotor-estator seguida de separação através de filtragem pode

ser utilizada para a obtenção de micro/nanopartículas. Devido ao baixo rendimento na obtenção

dessas partículas, sua aplicação na estabilização de emulsões não foi realizada nesse trabalho.

ABSTRACT

Emulsions stabilized by solid particles, called Pickering emulsions, could be used as an

alternative emulsion type in comparison to classic emulsions stabilized by surfactants. These

emulsions are characterized by a high stability to coalescence and reduced sensitivity to

environmental changes. Acylated (HA) and deacylated (LA) gellan were the materials studied in this

work for stabilization of emulsions containing sunflower oil dispersed in water. Significant

differences were observed between the properties of HA and LA gellans, mainly on rheological

behavior and zeta potential, which allowed understanding the emulsion stabilization mechanism

performed by these polysaccharides. Dispersions containing low polysaccharide concentrations

showed that the thickening capacity and the zeta potential values of HA gellan was much higher than

LA gellan. Moreover, the LA gellan did not show emulsifying capacity in the studied conditions.

Regarding emulsions containing HA gellan, low concentrations of polysaccharide (from 0.05% w/w)

were able to stabilize emulsions containing 30% (w/w) of sunflower oil. The effect of ionic strength

in the emulsions containing gellan HA was also determined. Emulsions properties were quite

dependent of the polysaccharide/salt ratio and also of the type of salt used. The increased viscosity of

the continuous phase, the electrostatic repulsion between the charged droplets and deposition of solid

particles onto the interface (Pickering) were the suggested stabilization mechanisms, and the

predominance of each mechanism was dependent on the composition and conditions used to prepare

the emulsions. Regardless of the stabilization mechanism, it is important to highlight the low

polysaccharide concentrations used, showing that HA gellan can be potentially used as a

stabilizer/emulsifier ingredient. This carbohydrate is GRAS and therefore it is an interesting option

in the stabilization of food emulsions, especially considering the current interest in reducing the use

of synthetic ingredients or animal derivatives, as egg or milk derivatives commonly used as

emulsifiers. Another part of this work (Annex I) involved the study of coffee grounds particles, a

byproduct of the food industry rich in carbohydrates, which particles can be applied in several areas.

It was observed that the coffee grounds is a material consisting of particles with average size in a

wide range (37 m to 10 mm), with heterogeneous morphology, and negative zeta potential at the

natural pH (5.0). No significant differences in composition were observed among the fractions

separated by size using sieves. Chemical and physical methods have been used to achieve size

reduction of the coffee grounds particles. The use of rotor-stator followed by separation by filtration

allowed obtaining micro/nanoparticles. Because of the low yield in obtaining these particles, their

application in the stabilization of emulsions was not performed in this work.

Índice de Figuras

FIGURA 1. MECANISMOS DE DESESTABILIZAÇÃO DE EMULSÕES (MCCLEMENTS, 2007). .................................................. 29

FIGURA 2. (A) PARTÍCULA ESFÉRICA NA INTERFACE ÓLEO-ÁGUA COM ÂNGULO DE CONTATO NA JUNÇÃO DAS TRÊS FASES:

PARTÍCULA (P), ÓLEO (O) E ÁGUA (A). QUANTIDADES PO, PA E OA SÃO AS TENSÕES NAS INTERFACES. (B)

MONOCAMADA DE PARTÍCULAS NA SUPERFÍCIE DE UMA GOTA DE ÓLEO DISPERSA EM ÁGUA (FONTE: DICKINSON, 2012).

.................................................................................................................................................................. 31

FIGURA 3. UNIDADE REPETIDA DO TETRASSACARÍDEO QUE COMPÕEM A GOMA GELANA ACILADA (A) E DESACILADA (B). ........ 39

FIGURA 4. ILUSTRAÇÃO ESQUEMÁTICA DAS ETAPAS UTILIZADAS NO PREPARO DAS EMULSÕES 1, 2, 3 E 4. TODAS AS EMULSÕES

FINAIS APRESENTAM A MESMA CONCENTRAÇÃO DE GELANA HA E ÓLEO, 0,1% M/M E 30% M/M, RESPECTIVAMENTE. .. 45

FIGURA 5. CURVAS DE ESCOAMENTO A 25ºC DAS DISPERSÕES CONTENDO A) 0,07, B) 0,10, C) 0,14 OU D) 0,21% (M/M) DE

GELANA HA PREPARADAS ATRAVÉS DE AGITAÇÃO MAGNÉTICA EM TEMPERATURA AMBIENTE. “SUB1” = PRIMEIRA CURVA

DE SUBIDA; “DESC” = CURVA DE DESCIDA E “SUB2” = SEGUNDA CURVA DE SUBIDA. .................................................. 55

FIGURA 6. AJUSTE EXPONENCIAL E LINEAR DAS CURVAS REPRESENTANDO O COMPORTAMENTO DE K (A), N (B) E VISCOSIDADE

APARENTE A 100 S-1

(C) FRENTE AO AUMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE GELANA. ...................................................... 56

FIGURA 7. VARREDURA DE FREQUÊNCIA DAS DISPERSÕES CONTENDO A) 0,07, B) 0,10, C) 0,14 OU D) 0,21% (M/M) DE HAG

A 25ºC. MÓDULO ELÁSTICO (G’) REPRESENTADO PELOS SÍMBOLOS CHEIOS E MÓDULO VISCOSO (G”) REPRESENTADO

PELOS SÍMBOLOS VAZIOS. ................................................................................................................................ 57

FIGURA 8. (A) CURVAS DE ESCOAMENTO A 25º C DAS SUSPENSÕES AQUOSAS DE GELANA HA E LA NA MESMA CONCENTRAÇÃO

PREPARADAS ATRAVÉS DE DIFERENTES CONDIÇÕES. AM: DISPERSÕES PREPARADAS ATRAVÉS DA AGITAÇÃO MAGNÉTICA.

RE: DISPERSÕES SUBMETIDAS A UMA PASSAGEM EM ROTOR-ESTATOR (14.000 RPM/ 4 MIN). UT: DISPERSÕES QUE

PASSARAM POR TRATAMENTO EM SONDA DE ULTRASSOM. (B) VISCOSIDADE APARENTE A 100 S-1

DAS SUSPENSÕES

AQUOSAS DE GELANA HA E LA NA MESMA CONCENTRAÇÃO PREPARADAS ATRAVÉS DE DIFERENTES CONDIÇÕES. LETRAS

DIFERENTES REPRESENTAM DIFERENÇA SIGNIFICATIVA (P < 0,05) ENTRE VALORES DA MESMA COLUNA. ....................... 58

FIGURA 9. EFEITO DO TRATAMENTO TÉRMICO (TT) NAS CURVAS DE ESCOAMENTO (A) E NOS VALORES DE VISCOSIDADE APARENTE

E POTENCIAL ZETA (B) DAS DISPERSÕES DE GELANA HA E LA. ................................................................................ 61

FIGURA 10. A) DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS E POTENCIAL ZETA DAS DISPERSÕES DE GELANA HA ANTES DO

TRATAMENTO EM ULTRASSOM. B) DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS E POTENCIAL ZETA DAS DISPERSÕES DE

GELANA HA APÓS O TRATAMENTO EM ULTRASSOM. O POTENCIAL ZETA FOI MEDIDO EM DILUIÇÕES CONTENDO 0,014%

(M/M) DE GELANA. ........................................................................................................................................ 63

FIGURA 11. CURVAS DE ESCOAMENTO DAS SUSPENSÕES CONTENDO GELANA ACILADA E KCL. A) 0,035% E B) 0,14% (M/M) DE

GELANA HA. ................................................................................................................................................. 64

FIGURA 12. A) DENSIDADE E B) TENSÃO INTERFACIAL DAS DISPERSÕES AQUOSAS DE GELANA HA (0,025% M/M) EM FUNÇÃO

DA QUANTIDADE DE KCL ADICIONADA. .............................................................................................................. 66

FIGURA 13. PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES DAS EMULSÕES CONTENDO GELANA DESACILADA (LA). .................................... 68

FIGURA 14. PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES DAS EMULSÕES CONTENDO GELANA HA PREPARADAS UTILIZANDO (A) ROTOR-

ESTATOR OU (B) ROTOR-ESTATOR SEGUIDO DE HOMOGENEIZAÇÃO A 300 BAR. ....................................................... 69

FIGURA 15. ESTABILIDADE POR TEMPO PROLONGADO DAS EMULSÕES COM GELANA HA PREPARADAS EM ROTOR-ESTATOR. A)

PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES E B) VALORES DE D43 APÓS 1, 30 OU 60 DIAS DE ARMAZENAMENTO A TEMPERATURA

AMBIENTE. LETRAS DIFERENTES SIGNIFICAM DIFERENÇA SIGNIFICATIVA ENTRE VALORES DA MESMA COLUNA (P < 0,05). 70

FIGURA 16. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS EMULSÕES PREPARADAS USANDO ROTOR-ESTATOR

CONTENDO: A) 0,05%, B) 0,075%, C) 0,10%, D) 0,125%, E) 0,15% OU F) 0,20% (M/M) DE GELANA HA (BARRA:

200 M). .................................................................................................................................................... 72

FIGURA 17. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS, DIÂMETRO MÉDIO (D43, D32 E D50%) E SPAN DAS EMULSÕES

PREPARADAS USANDO ROTOR-ESTATOR CONTENDO: 0,05%, 0,075%, 0,10%, 0,125%, 0,15% OU 0,20% (M/M) DE

GELANA HA. LETRAS DIFERENTES SIGNIFICAM DIFERENÇA SIGNIFICATIVA ENTRE VALORES DA MESMA COLUNA (P < 0,05).

.................................................................................................................................................................. 73

FIGURA 18. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS EMULSÕES PREPARADAS USANDO ROTOR-ESTATOR SEGUIDO

DE HOMOGENEIZAÇÃO A 300 BAR CONTENDO: A) 0,05%, B) 0,075%, C) 0,10%, D) 0,125%, E) 0,15% OU F) 0,20%

(M/M) DE GELANA HA (BARRA: 200 M). ........................................................................................................ 74

FIGURA 19. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS, DIÂMETRO MÉDIO (D43, D32 E D50%) E SPAN DAS EMULSÕES

PREPARADAS USANDO ROTOR-ESTATOR SEGUIDO DE HOMOGENEIZAÇÃO A 300 BAR CONTENDO: 0,05%, 0,075%,

0,10%, 0,125%, 0,15% OU 0,20% (M/M) DE GELANA HA. LETRAS DIFERENTES SIGNIFICAM DIFERENÇA SIGNIFICATIVA

ENTRE VALORES DA MESMA COLUNA (P < 0,05). ................................................................................................ 75

FIGURA 20. A) CURVAS DE ESCOAMENTO DAS EMULSÕES PREPARADAS SOMENTE COM ROTOR-ESTATOR. B) CURVAS DE

ESCOAMENTO DAS EMULSÕES PREPARADAS COM ROTOR-ESTATOR SEGUIDO DE HOMOGENEIZAÇÃO A 300 BAR. O

COMPORTAMENTO REOLÓGICO DAS AMOSTRAS FOI INDICADO POR “PP” PARA COMPORTAMENTO DE FLUIDO

PSEUDOPLÁSTICO OU “HB” PARA COMPORTAMENTO DO TIPO HERSCHEL-BULKLEY. ................................................. 77

FIGURA 21. PROPRIEDADES REOLÓGICAS DAS EMULSÕES PREPARADAS SOMENTE COM ROTOR-ESTATOR OU ROTOR-ESTATOR

SEGUIDO DE HOMOGENEIZAÇÃO A 300 BAR (HOMOG). A) ÍNDICE DE COMPORTAMENTO. B) ÍNDICE DE CONSISTÊNCIA. C)

VISCOSIDADE A 100 S-1. D) VISCOSIDADE A 3 S

-1. ............................................................................................... 78

FIGURA 22. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS EMULSÕES CONTENDO 0,1% (M/M) DE GELANA HA E 30%

(M/M) DE ÓLEO DE GIRASSOL PREPARADAS COMO DESCRITO ANTERIORMENTE (SEÇÃO 4.4.3): (A) EMULSÃO 1 (E1), (B)

EMULSÃO 2 (E2), (C) EMULSÃO 3 (E3), (D) FASE CREME INFERIOR DA EMULSÃO 4 (E4) E (E) FASE CREME SUPERIOR DA

EMULSÃO 4 (BARRA = 200 M). (F) PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES. .................................................................. 80

FIGURA 23. A) CURVAS DE ESCOAMENTO, B) DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS GOTAS E C) SPAN E DIÂMETROS MÉDIOS DAS

EMULSÕES CONTENDO 0,1% (M/M) DE GELANA HA E 30% (M/M) DE ÓLEO DE GIRASSOL PREPARADAS COMO DESCRITO

ANTERIORMENTE (SEÇÃO 4.4.3): E1, E2, E3 E E4. ............................................................................................. 81

FIGURA 24. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS EMULSÕES CONTENDO 1) 0,025% OU 2) 0,1% (M/M) DE

GELANA HA COM ADIÇÃO DE KCL NAS FORÇAS IÔNICAS DE A) 0,03, B) 0,3, C) 3 E D) 30 MM. BARRA: 200 M. ........ 86


GELANA HA COM ADIÇÃO DE CACL2 NAS FORÇAS IÔNICAS DE A) 0,03, B) 0,3, C) 3 E D) 30 MM. BARRA: 200 M. ..... 87


GELANA HA COM ADIÇÃO DE FECL3 NAS FORÇAS IÔNICAS DE A) 0,03, B) 0,3, C) 3 E D) 30 MM. BARRA: 200 M. ..... 88

FIGURA 27. PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES DAS EMULSÕES CONTENDO GELANA HA (0,025 OU 0,1% M/M) E SAIS (KCL, CACL2

OU FECL3). PORÇÃO DE COR BRANCA DAS BARRAS REPRESENTA FASE SORO. PORÇÃO CINZA REPRESENTA A FASE CREME OU

A PRÓPRIA EMULSÃO (QUANDO NÃO HOUVE SEPARAÇÃO DE FASES). ...................................................................... 90

FIGURA 28. PROPRIEDADES REOLÓGICAS (ÍNDICE DE CONSISTÊNCIA, ÍNDICE DE COMPORTAMENTO E VISCOSIDADE APARENTE A

100 S-1) DAS EMULSÕES CONTENDO GELANA HA (0,025 OU 0,1% M/M) E SAIS (KCL, CACL2 OU FECL3). ................... 92

FIGURA 29. D43 E SPAN DAS EMULSÕES CONTENDO GELANA HA (0,025 OU 0,1% M/M) E SAIS (KCL, CACL2 OU FECL3). ....... 93

FIGURA 30. REGISTRO FOTOGRÁFICO DAS EMULSÕES CORADAS COM VERMELHO DO NILO (MARCADOR DO ÓLEO) E FITC

(MARCADOR DA GELANA HA) UTILIZADAS NA MICROSCOPIA CONFOCAL. A) EMULSÕES SEM ADIÇÃO DE SAIS COM 0,025,

0,075, 0,10, 0,125 OU 0,15% (M/M) DE GELANA HA. B) EMULSÕES CONTENDO 0,025% (M/M) DE GELANA HA SEM

ADIÇÃO DE SAL OU COM ADIÇÃO DE KCL, CACL2 OU FECL3 (FI=0,3 MM). C) EMULSÕES CONTENDO 0,10% (M/M) DE

GELANA HA SEM ADIÇÃO DE SAL OU COM ADIÇÃO DE KCL, CACL2 OU FECL3 (FI=0,3 MM). ...................................... 94

FIGURA 31. MICROSCOPIA CONFOCAL DAS EMULSÕES ESTABILIZADAS POR A) 0,025% (FASE SUPERIOR), B) 0,10% OU C)

0,15% (M/M) DE GELANA HA. O CANAL 1 APRESENTA A GELANA HA MARCADA COM FITC EM VERDE, O CANAL 2

APRESENTA A MICROSCOPIA ÓPTICA DO SISTEMA E O CANAL 3 APRESENTA O ÓLEO MARCADO COM VERMELHO DO NILO EM

VERMELHO. AS BARRAS REPRESENTAM 50 M. .................................................................................................. 95

FIGURA 32. COLOCALIZAÇÃO DOS COMPONENTES MARCADOS (GELANA HA E ÓLEO) NAS EMULSÕES CONTENDO A) 0,025%

(M/M) DE GELANA HA (FASE SUPERIOR), B) 0,15% (M/M) DE GELANA HA E C) 0,10% DE GELANA HA COM KCL (FI=0,3

MM). .......................................................................................................................................................... 96

FIGURA 33. DUAS DIFERENTES PERSPECTIVAS DAS MONTAGENS EM 3D ATRAVÉS DA VARREDURA EM PROFUNDIDADE DAS

EMULSÕES CONTENDO GELANA HA (0,10% M/M) SEM ADIÇÃO E COM ADIÇÃO DE KCL OU FECL3 (FI = 0,3 MM). ........ 97

FIGURA 34. EMULSÃO COM 0,025% (M/M) DE GELANA HA. A) PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES E DIÂMETRO MÉDIO D43. B)

PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES E VISCOSIDADE APARENTE A 100 S-1. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MICROSCOPIA ÓPTICA

DAS EMULSÕES: C) SEM ADIÇÃO DE SAL, D) COM 62,6 MG DE KCL/G DE GELANA, E) 626 MG DE KCL/G DE GELANA E F)

15633 MG DE KCL/G DE GELANA. MICROSCOPIA FLUORESCENTE DAS EMULSÕES CONTENDO ÓLEO MARCADO COM

VERMELHO DO NILO: G) 1563 MG DE KCL/G DE GELANA (7,5 MM) OU H) 15633 MG DE KCL/G DE GELANA (75 MM).

BARRA = 200 M. ...................................................................................................................................... 100

FIGURA 35. EMULSÃO COM 0,10 % (M/M) DE GELANA HA. A) PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES E DIÂMETRO MÉDIO D43. B)

PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES E VISCOSIDADE APARENTE A 100 S-1. MICROGRAFIAS OBTIDAS POR MICROSCOPIA ÓPTICA

DAS EMULSÕES: C) SEM ADIÇÃO DE SAL, D) COM 62,6 MG DE KCL/G DE GELANA, E) 1563 MG DE KCL/G DE GELANA E F)

6260 MG DE KCL/G DE GELANA. G) IMAGEM AMPLIFICADA DA EMULSÃO CONTENDO 1563 MG DE KCL/G DE GELANA (30

MM). BARRA = 200 M. ............................................................................................................................. 102

FIGURA 36. PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES DAS EMULSÕES CONTENDO 0,025% (M/M) DE GELANA HA COM ADIÇÃO DE: A) 0

MM, B) 0,75 MM, C) 3 MM OU D) 7,5 MM DE KCL. ...................................................................................... 104

FIGURA 37. PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES DAS EMULSÕES CONTENDO 0,10% (M/M) DE GELANA HA COM ADIÇÃO DE: A) 0

MM, B) 3 MM, C) 12 MM OU D) 30 MM DE KCL. .......................................................................................... 105

FIGURA 38. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE GOTAS DAS EMULSÕES CONTENDO: A) 0,025% M/M OU B) 0,1% M/M DE GELANA

HA ANALISADAS 24H APÓS O PREPARO. .......................................................................................................... 108

FIGURA 39. CURVAS DE ESCOAMENTO DAS EMULSÕES ESTABILIZADAS POR GELANA HA (0,1% M/M) COM DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE KCL. ............................................................................................................................. 109

FIGURA 40. VARREDURA DE FREQUÊNCIA A 25ºC DAS EMULSÕES ESTABILIZADAS POR GELANA HA (0,1% M/M) COM DIFERENTES

CONCENTRAÇÕES DE KCL: A) 0, 0,3 E 3 MM; B) 0, 12 E 30 MM. ...................................................................... 110

FIGURA 41. A) DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS DA BORRA DE CAFÉ. B) FRAÇÕES SEPARADAS POR TAMANHO

ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DE PENEIRAS COM MESH 3,5, 14, 30, 70, 100, 120 E 200. C) DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS

PARTÍCULAS DAS FRAÇÕES RETIRADAS DAS PENEIRAS COM MESH 400 E 100. ......................................................... 123

FIGURA 42. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DAS FRAÇÕES 100 (DMÉDIO =179,5 M) E 400 (DMÉDIO = 49,5 M).

MAGNITUDE DE 100X. AS BARRAS REPRESENTAM 100 M. ............................................................................... 124

FIGURA 43. VARIAÇÃO DO POTENCIAL ZETA EM FUNÇÃO DO PH DA FRAÇÃO 400 (DMÉDIO = 49,5 M ) DA BORRA DE CAFÉ. ... 125

FIGURA 44. COMPOSIÇÃO ELEMENTAR CHN DAS FRAÇÕES DA BORRA DE CAFÉ. ............................................................. 126

FIGURA 45. A) ESPECTRO DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO DA FRAÇÃO 400 COM AS PRINCIPAIS BANDAS

INTERPRETADAS ATRAVÉS DA COMPARAÇÃO COM TRABALHOS SIMILARES. B) ESPECTROS DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO

INFRAVERMELHO DAS FRAÇÕES DE BORRA DE CAFÉ 70 (DMÉDIO = 385 M), 120 (DMÉDIO = 137 M), 230 (DMÉDIO = 68,5

M) E 400 (DMÉDIO = 49,5 M). .................................................................................................................... 128

FIGURA 46. EFEITO DA A) CONCENTRAÇÃO DE HCL, B) TEMPO, C) TEMPERATURA E D) UTILIZAÇÃO DE ULTRASSOM DURANTE A

HIDRÓLISE NA DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS DA BORRA DE CAFÉ. ..................................................... 129

FIGURA 47. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS DA FRAÇÃO 100 (DMÉDIO =179,5 M) EM FUNÇÃO DO NÚMERO DE

PASSAGENS EM HOMOGENEIZADOR A ALTA PRESSÃO. ........................................................................................ 131

FIGURA 48. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS DA FRAÇÃO 100 (DMÉDIO =179,5 M) EM FUNÇÃO DA PRESSÃO DE

HOMOGENEIZAÇÃO. ..................................................................................................................................... 131

FIGURA 49. DIÂMETRO MÉDIO (D43) E POLIDISPERSÃO DAS PARTÍCULAS EM FUNÇÃO DO NÚMERO DE PASSOS EM ROTOR-

ESTATOR DA FRAÇÃO 100 (DMÉDIO =179,5 M). ............................................................................................... 132

FIGURA 50. EFEITO DE 3 PASSAGENS EM ROTOR-ESTATOR NAS FRAÇÕES DE BORRA DE CAFÉ: F14 (3535 M), F30 (985 M),

F70 (385 M) E F100 (179 M). ................................................................................................................ 133

FIGURA 51. DIÂMETRO MÉDIO DAS PARTÍCULAS APÓS A PASSAGEM DA FRAÇÃO 100 (DMÉDIO =179,5 M) EM ROTOR-ESTATOR

UTILIZANDO DIFERENTES TEMPERATURAS DURANTE O PROCESSO (5, 25, 50 OU 70ºC). .......................................... 133

FIGURA 52. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS (QUINTUPLICATAS) DOS FILTRADOS OBTIDOS APÓS A) 2, B) 4, C) 7 E

D) 8 PASSAGENS EM ROTOR-ESTATOR. E) POTENCIAL ZETA DOS FILTRADOS EM FUNÇÃO DAS PASSAGENS NO ROTOR-

ESTATOR. F) MICROGRAFIA OBTIDA EM MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA DO FILTRADO OBTIDO APÓS 8

PASSAGENS EM ROTOR-ESTATOR COM MAGNITUDE DE 1000X. BARRA REPRESENTA 10 M. A FRAÇÃO 100 FOI A

AMOSTRA UTILIZADA PARA OBTENÇÃO DAS DISPERSÕES. .................................................................................... 135

Índice de Tabelas

TABELA 1. EXEMPLOS DE PARTÍCULAS BIOCOMPATÍVEIS UTILIZADAS NA ESTABILIZAÇÃO DE EMULSÕES O/A DO TIPO PICKERING.33

TABELA 2. RAZÕES MÁSSICAS DE KCL, CACL2 E FECL3 UTILIZADAS E SUAS CORRESPONDENTES FORÇAS IÔNICAS. .................... 46

TABELA 3. CONCENTRAÇÃO DE KCL UTILIZADA NAS EMULSÕES COM GELANA HA. ............................................................. 47

TABELA 4. PROPRIEDADES FÍSICAS E FÍSICO-QUÍMICAS DAS GELANAS LA E HA A 25ºC. ...................................................... 53

TABELA 5. PROPRIEDADES REOLÓGICAS DAS DISPERSÕES CONTENDO 0,07, 0,10, 0,14 OU 0,21% (M/M) DE GELANA HA A

25ºC. .......................................................................................................................................................... 56

TABELA 6. POTENCIAL ZETA DAS DISPERSÕES DE GELANA HA E LA ANTES E APÓS O TRATAMENTO EM SONDA DE ULTRASSOM (UT)

A 25ºC. ....................................................................................................................................................... 60

TABELA 7. PARÂMETROS REOLÓGICOS DAS SUSPENSÕES COM GELANA ACILADA E KCL. ...................................................... 64

TABELA 8. TENSÃO INTERFACIAL (FASE AQUOSA-ÓLEO DE GIRASSOL) A 25ºC. .................................................................. 65

TABELA 9. POTENCIAL ZETA DAS EMULSÕES PREPARADAS COM HOMOGENEIZAÇÃO (300 BAR). .......................................... 71

TABELA 10. AMOSTRAS SELECIONADAS COM A CORRESPONDÊNCIA ENTRE RAZÃO MÁSSICA E FORÇA IÔNICA........................ 103

TABELA 11. D43 (M) APÓS 1, 30 OU 60 DIAS DE ARMAZENAMENTO A TEMPERATURA AMBIENTE. ................................... 106

TABELA 12. POTENCIAL ZETA DAS EMULSÕES CONTENDO GELANA HA E KCL A 25ºC. ...................................................... 107

TABELA 13. PROPRIEDADES REOLÓGICAS DAS EMULSÕES CONTENDO 0,10% (M/M) DE GELANA HA A 25ºC. ..................... 109

TABELA 14. COMPOSIÇÃO APROXIMADA DA BORRA DE CAFÉ (BASE SECA). ..................................................................... 118

TABELA 15. CONDIÇÕES UTILIZADAS NOS EXPERIMENTOS DE HIDRÓLISE ÁCIDA DA BORRA DE CAFÉ. .................................... 119

TABELA 16. RENDIMENTO MÁSSICO DAS FRAÇÕES DE BORRA DE CAFÉ. .......................................................................... 124

TABELA 17. DIÂMETRO MÉDIO E SPAN DAS PARTÍCULAS OBTIDAS APÓS AS DIFERENTES CONDIÇÕES DE HIDRÓLISE. ............... 130

TABELA 18. DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS PRESENTES NAS FRAÇÕES 400 E 100 DA BORRA DE CAFÉ ANTES E APÓS

TRATAMENTO EM HOMOGENEIZADOR A ALTA PRESSÃO OU EM ROTOR-ESTATOR. ................................................... 134

Nomenclatura, abreviações e símbolos

HA Gelana acilada

LA Gelana desacilada

GRAS “Generally Recognized as Safe”

O/A Emulsão óleo em água

A/O Emulsão água em óleo

Ângulo de contato

Tensão na interface

ΔGd Energia livre de dessorção espontânea

r Raio da partícula

T Temperatura

H Hidrólise

E Emulsão

FI Força iônica

D32 “Sauter mean diameter”

D43 “De Brouckere mean diameter”

Tensão (Pa)

�̇� Taxa de deformação (s-1

)

F Força (N)

Viscosidade (Pa.s)

ap Viscosidade aparente (Pa.s)

k Índice de consistência (Pa.sn)

n Índice de comportamento

o Tensão residual (Pa)

G’ Módulo elástico ou de armazenamento (Pa)

G” Módulo viscoso ou de dissipação de energia (Pa)

C*

Concentração crítica de sobreposição

C**

Concentração crítica de agregação

UT Tratamento em sonda de ultrassom

TT Tratamento térmico

KCl Cloreto de potássio

CaCl2 Cloreto de cálcio

FeCl3 Cloreto férrico

FITC Isotiocianato de fluoresceína

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO 23

2. OBJETIVOS 26

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 28

3.1. EMULSÕES 28

3.1.1. EMULSÕES DO TIPO PICKERING 30

3.1.2 EMULSÕES ESTABILIZADAS POR POLISSACARÍDEOS 35

3.2 GELANA 38

4. MATERIAL E MÉTODOS 42

4.1 MATERIAL 42

4.2. CARACTERIZAÇÃO DAS GELANAS 42

4.2.1 EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE GELANA HA NAS PROPRIEDADES REOLÓGICAS DAS DISPERSÕES 42

4.2.2 EFEITO DO PROCESSO DE HOMOGENEIZAÇÃO NAS DISPERSÕES DE GELANA 42

4.2.3 EFEITO DO TRATAMENTO TÉRMICO NAS SUSPENSÕES DE GELANA 43

4.2.4 EFEITO DA FORÇA IÔNICA NAS SUSPENSÕES DE GELANA 43

4.2.5 DETERMINAÇÃO DA TENSÃO INTERFACIAL DAS SUSPENSÕES DE GELANA 43

4.3 EMULSÕES 44

4.3.1 PREPARAÇÃO DE EMULSÕES COM GELANA HA E LA EM ROTOR-ESTATOR 44

4.3.2 PREPARO DE EMULSÕES COM GELANA HA EM HOMOGENEIZADOR A ALTA PRESSÃO 44

4.3.3 EFEITO DO TRATAMENTO ULTRASSÔNICO NAS EMULSÕES DE GELANA HA 45

4.3.4 EFEITO DA ADIÇÃO DE KCL, CACL2 OU FECL3 NAS EMULSÕES COM GELANA HA 46

4.3.5 EFEITO DA ADIÇÃO DE KCL NAS EMULSÕES DE GELANA HA 46

4.4 METODOLOGIAS DE ANÁLISE 48

4.4.1. DETERMINAÇÃO DE POTENCIAL ZETA 48

4.4.2 DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS – DIFRAÇÃO A LASER 48

4.4.3. MEDIDAS REOLÓGICAS 49

4.4.4. PERFIL DE SEPARAÇÃO DE FASES 50

4.4.5. MICROSCOPIA ÓPTICA 50

4.4.6 TENSÃO INTERFACIAL 50

4.4.7 DENSIDADE 50

4.4.8 MICROSCOPIA CONFOCAL DE VARREDURA A LASER 50

4.4.9 TEOR DE CARBONO, HIDROGÊNIO E NITROGÊNIO (CHN) 51

4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 51

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 53

5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS GELANAS 53

5.1.1 PROPRIEDADES DAS GELANAS – CARACTERIZAÇÃO REOLÓGICA DA GELANA HA 54

5.1.2 PROPRIEDADES DAS GELANAS - EFEITO DO PROCESSO DE HOMOGENEIZAÇÃO 57

5.1.3 PROPRIEDADES DAS GELANAS - EFEITO DO TRATAMENTO TÉRMICO 61

5.1.4 PROPRIEDADES DAS GELANAS - EFEITO DA FORÇA IÔNICA 62

5.1.5 PROPRIEDADES DAS GELANAS – TENSÃO INTERFACIAL 64

5.2 EMULSÕES CONTENDO GELANA 68

5.2.1 EMULSÕES COM GELANA DESACILADA (LA) 68

5.2.2 EMULSÕES COM GELANA ACILADA (HA) – ROTOR-ESTATOR OU HOMOGENEIZAÇÃO 69

5.3. EFEITO DA FORÇA IÔNICA EM EMULSÕES COM GELANA HA 85

5.3.1 EFEITO DA ADIÇÃO DE KCL, CACL2 OU FECL3 NAS EMULSÕES COM GELANA HA 85

5.3.2 EFEITO DA ADIÇÃO DE KCL NAS EMULSÕES COM GELANA HA 98

6. CONCLUSÕES 114

7. ANEXO I - ESTUDO DAS PARTÍCULAS DA BORRA DE CAFÉ 117

7.1 INTRODUÇÃO 117

7.2 MATERIAL E MÉTODOS 118

7.2.1 MATERIAL 118

7.2.2. CARACTERIZAÇÃO DA BORRA DE CAFÉ 118

7.2.3 REDUÇÃO DE TAMANHO DA BORRA DE CAFÉ 119

7.2.4 METODOLOGIAS DE ANÁLISE 120

7.2.4.1 DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS – PENEIRAGEM 120

7.2.4.2 TEOR DE CARBONO, HIDROGÊNIO E NITROGÊNIO (CHN) 120

7.2.4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA 120

7.2.4.4 DETERMINAÇÃO DE POTENCIAL ZETA 120

7.2.4.5 ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO 121

7.2.4.6 DISTRIBUIÇÃO DE TAMANHO DE PARTÍCULAS – DIFRAÇÃO A LASER 121

7.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 122

7.3.1 CARACTERIZAÇÃO DA BORRA DE CAFÉ 122

7.3.2 REDUÇÃO DE TAMANHO DAS PARTÍCULAS DA BORRA DE CAFÉ 129

7.3.2.4 CARACTERIZAÇÃO DOS FILTRADOS 134

7.4 CONCLUSÃO 136

8. REFERÊNCIAS 138

22

CAPÍTULO 1. INTRODUÇÃO

23

1. INTRODUÇÃO

As emulsões, sistemas constituídos pela mistura de dois líquidos imiscíveis, encontram-se

presentes em uma ampla quantidade de produtos alimentícios, farmacêuticos e cosméticos. O

principal desafio encontrado na obtenção de produtos emulsionados está em alcançar a estabilidade

cinética do sistema com o uso de compostos que não ofereçam riscos à saúde do consumidor

(McCLEMENTS, 2005). Nesse sentido, as emulsões do tipo Pickering aparecem como uma

alternativa às emulsões estabilizadas por surfactantes sintéticos.

As emulsões denominadas Pickering são aquelas cuja estabilização é realizada através da

simples deposição de partículas sólidas de dimensões coloidais na interface óleo/água ou ar/água,

formando uma barreira estérica à coalescência das gotas ou bolhas. A deposição de partículas que

são parcialmente molháveis tanto pela fase polar quanto pela fase apolar na interface é um processo

praticamente irreversível (DICKINSON, 2012). Assim, essas emulsões possuem elevada estabilidade

à coalescência, mesmo quando gotas de tamanho milimétrico estão presentes. Além disso, as

emulsões formadas são menos sensíveis às alterações nas propriedades do meio, como pH,

temperatura e força iônica, e em muitos casos, as gotas envoltas pela camada de partículas sólidas

podem ser separadas da emulsão e redispersas novamente (CHEN et al., 2011). Assim, as emulsões

Pickering também podem ser utilizadas como uma via para a produção de cápsulas com tamanho e

permeabilidade controlados (DINSMORE et al., 2002).

Apesar do mecanismo de estabilização por partículas sólidas ter sido descrito pela primeira

vez na literatura há mais de 100 anos (PICKERING, 1907), a maioria dos estudos relacionados com

tal tipo de sistema foi realizada na última década. Nestes estudos o uso de materiais inorgânicos,

como partículas de sílica, de carbono e argilas, é predominante. Assim, pesquisas visando à obtenção

de partículas biocompatíveis para uso na estabilização de emulsões são de grande importância

(DICKINSON, 2012). Nesse sentido, os polissacarídeos são materiais de elevado potencial para este

tipo de aplicação, já que são provenientes de fontes naturais e seguros para o consumo humano. Em

geral, os polissacarídeos, devido ao seu caráter predominantemente hidrofílico, não são considerados

como bons emulsificantes, mas sim agentes estabilizantes que impedem a coalescência das gotas das

emulsões através do aumento da viscosidade da fase contínua (DICKINSON & STAINSBY, 1988;

DICKINSON, 2003; OZTURK & McCLEMENTS, 2016). Porém, estudos tem demonstrado que há

diversas maneiras de atuação dos polissacarídeos em uma emulsão, incluindo-se sua adsorção na

interface das gotas mesmo sem conter resíduos de proteína na cadeia (GARTI & LESSER, 2001).

Existem vários exemplos de polissacarídeos capazes de se depositar na interface óleo-água,

estabilizando as emulsões através do mecanismo Pickering (ZOPPE et al., 2012; TZOUMAKI et al.,

24

2011; RAYNER et al., 2012; JIA et al., 2015). A gelana, polissacarídeo aniônico produzido através

de fermentação, possui amplo uso na indústria de alimentos, principalmente na formação de sistemas

gelificados (SANDERSON, 1990). Porém, suas características como estabilizante/emulsificante

ainda foram pouco exploradas.

Outra estratégia para a produção de nanopartículas biocompatíveis para uso como

estabilizante em emulsões seria através do uso de subprodutos da indústria de alimentos. A borra de

café, resíduo insolúvel altamente disponível, rico em fibras e proteínas (SILVA et al., 1998;

MUSSATTO et al., 2011), constitui-se como uma boa alternativa.

25

CAPÍTULO 2. OBJETIVOS

26

2. OBJETIVOS

O objetivo principal deste trabalho foi estudar a capacidade de materiais ricos em

polissacarídeos (borra de café, gelana acilada e desacilada) de estabilizar emulsões e os mecanismos

associados a esta estabilização usando diferentes condições de processo de formação de emulsões e

força iônica.

Os objetivos específicos podem ser enumerados, como:

- Caracterização da borra de café e determinação de um método adequado para a obtenção de

partículas de tamanho nanométrico para posterior emprego na estabilização de emulsões.

- Estudo das diferentes propriedades (como comportamento reológico, potencial zeta e tensão

interfacial) da gelana em sua forma acilada (HA) e desacilada (LA).

- Estudo das propriedades e mecanismos de estabilização das emulsões utilizando a gelana

como emulsificante/estabilizante.

- Estudo da influência da força iônica e aplicação de ultrassom nas propriedades das emulsões

contendo gelana como emulsificante/estabilizante.

27

CAPÍTULO 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

28

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Emulsões

É de amplo conhecimento que óleo e água não se misturam a não ser que se aplique força

mecânica e que agentes emulsificantes sejam adicionados ao sistema. Assim, as emulsões, sistemas

formados por dois líquidos imiscíveis, são termodinamicamente instáveis devido à energia livre

positiva necessária para aumentar a área entre as fases aquosa e oleosa, bem como pela diferença de

densidade entre as fases. Emulsões simples são sistemas presentes em muitos produtos alimentícios,

cosméticos e fármacos, podendo ser do tipo óleo em água (O/A), quando consistem de gotas de óleo

dispersas em uma fase contínua aquosa, ou água em óleo (A/O), quando a fase contínua é oleosa

(McCLEMENTS, 2005).

A emulsificação pode ser considerada, antes de qualquer outra definição, como um processo

natural, existente em vários sistemas biológicos. Um exemplo pode ser encontrado na digestão de

lipídeos. As lipases podem atuar somente na superfície das gotas de óleo, portanto se faz necessário

aumentar a área superficial dos lipídeos para torná-los mais acessíveis às enzimas do trato digestivo

humano, acelerando e melhorando a eficiência da digestão. Dessa forma, faz-se uso do processo de

emulsificação, que irá quebrar a fase oleosa em gotas menores. Os sais biliares (bile) produzidos pelo

fígado são compostos emulsificantes que, aliados à temperatura corporal e aos movimentos

peristálticos, viabilizam o processo de emulsificação e, consequentemente, da própria digestão dos

lipídeos (MALDONADO-VALDERRAMA et al., 2011).

Outra ocorrência natural de sistemas emulsionados é o leite, um alimento que existe

naturalmente como uma emulsão. Em seu estado natural, o leite é uma emulsão do tipo óleo-em-água

que contém glóbulos de gordura (fase dispersa que geralmente representa cerca de 4% (m/m) da

composição) suspensos em um meio contínuo aquoso que contém uma mistura complexa de

proteínas, açúcares e sais. A interface dos glóbulos de gordura encontra-se estabilizada

principalmente por proteínas e fosfolipídios do leite e esses glóbulos de gordura servem como

solvente para as vitaminas lipossolúveis naturalmente presentes, como as vitaminas A, D e E

(McCLEMENTS, 2005; WALSTRA et al., 1999).

Uma vez realizada a emulsificação, sabe-se que as emulsões tendem a se desestabilizar com o

tempo, resultando em duas fases líquidas macroscopicamente separadas, processo indesejado em

alimentos, bebidas, fármacos e cosméticos emulsionados. Particularmente para emulsões O/A

existem diversos mecanismos de desestabilização, sendo os principais a cremeação, sedimentação,

floculação e coalescência das gotas (Figura 1). A floculação é um processo no qual as gotas

29

emulsificadas se associam em flocos sem a destruição das gotas individuais. Quando a interface das

gotas é destruída e existe a formação de gotas maiores, trata-se do processo conhecido como

coalescência. A cremeação ocorre quando a fase dispersa é menos densa do que a fase contínua,

porém não existe coalescência. Já na sedimentação, as gotas são mais densas do que o meio contínuo

(McCLEMENTS, 2007; HILL, 1996).

Figura 1. Mecanismos de desestabilização de emulsões (McCLEMENTS, 2007).

Como todas as emulsões são termodinamicamente instáveis e, portanto, informações sobre a

estabilidade cinética são importantes para o desenvolvimento de produtos que apresentem

propriedades desejáveis por um período de tempo suficientemente longo. Emulsões cineticamente

estáveis podem ser alcançadas por diversas maneiras, porém a maioria das emulsões alimentícias

envolve a aplicação de força mecânica aliada à adição de emulsificantes e estabilizantes.

Emulsificantes são compostos anfifílicos de baixa massa molecular (surfactantes, como polissorbatos

e lecitina) ou de alta massa molecular (como proteínas do leite, proteínas de soja e do ovo) que

atuam reduzindo a tensão interfacial das gotas. Já os estabilizantes atuam aumentando a viscosidade

da fase contínua (ou até mesmo provocando a gelificação da fase contínua, com formação dos

sistemas denominados como “emulsion-filled gel”), prevenindo, assim, a agregação das gotas

(McCLEMENTS, 2005). Vários polissacarídeos podem ser utilizados como estabilizantes, como as

gomas xantana, carragena e outras (DICKINSON, 2003).

Os atributos sensoriais e físico-químicos de produtos alimentícios emulsionados são

fortemente influenciados pelas características das gotas presentes em sua composição. Essas

características incluem desde a concentração, tamanho e carga das gotas, até as possíveis interações

entre elas (FRIBERG et al., 2004; McCLEMENTS, 2005). A concentração das gotas pode

influenciar na textura, estabilidade, aparência, atributos sensoriais e qualidade nutricional de uma

30

emulsão. Essa concentração pode ser expressa através da fração mássica ou volumétrica da fase

dispersa (McCLEMENTS, 2005).

O tamanho da gota, por sua vez, pode ter efeito na estabilidade, propriedades ópticas (ex.:

opaca, translúcida), no comportamento reológico e nos atributos sensoriais. Na prática, as emulsões

alimentícias possuem gotas de tamanho variando dentro de uma faixa específica, representada

através das curvas de distribuição de tamanhos. Várias informações podem ser obtidas através dessas

curvas, incluindo o Índice de Polidispersão (PDI) das gotas ou polidispersidade. O PDI relaciona a

largura da curva de distribuição com o tamanho médio das gotas. Para uma amostra perfeitamente

uniforme, situação teórica, o PDI teria valor zero, indicando que todas as gotas tem exatamente o

mesmo tamanho. Na prática, valores menores que 0,05 são raramente encontrados. Amostras com

valores de PDI entre 0-0,1 indicam uma distribuição de tamanhos do tipo monodispersa estreita.

Enquanto que valores entre 0,1-0,4 indicam amostra polidispersa moderada e acima de 0,4 amostra

amplamente polidispersa (McCLEMENTS, 2005; ISO, 2008).

As gotas, em boa parte das emulsões em alimentos, possuem carga elétrica devido à adsorção

de espécies ionizadas ou ionizáveis (ex.: proteínas, alguns polissacarídeos, surfactantes iônicos,

fosfolipídios e íons) em sua superfície. As características elétricas da superfície das gotas dependem

do tipo e concentração das espécies ionizadas presentes, bem como da composição iônica e

propriedades físicas do meio líquido circundante. A carga das gotas em uma emulsão é importante,

pois determina a natureza das interações com outras espécies carregadas e o comportamento na

presença de campos elétricos. Gotas em vários alimentos emulsionados são estáveis à agregação

devido ao uso de emulsificantes iônicos que adsorvem na superfície e impedem que as gotas se

aproximem o suficiente devido à repulsão eletrostática (FRIBERG et al., 2004; McCLEMENTS,

2005; DICKINSON, 1992).

Já as interações coloidais determinam quando as gotas se agregam ou permanecem separadas,

bem como as características dos agregados formados, como seu tamanho, formato, porosidade e

deformabilidade. A estabilidade à cremeação e a reologia de muitas emulsões em alimentos

dependem da quantidade de gotas agregadas e da natureza desses agregados (FRIBERG et al., 2004;

McCLEMENTS, 2005).

3.1.1. Emulsões do tipo Pickering

O conceito de estabilização de emulsão do tipo Pickering, descrita pela primeira vez em 1907

pelo pesquisador homônimo (PICKERING, 1907), está relacionado à barreira mecânica formada na

interface através da deposição de partículas sólidas de dimensões coloidais, que podem evitar a

31

floculação e coalescência das gotas. Curiosamente, este conceito de estabilização através da

deposição de partículas na interface tem sido aplicado há séculos em alimentos, sem ser

cientificamente estudado. Por exemplo, no molho de mostarda (uma emulsão concentrada de óleo-

em-água que tem sido utilizada há muito tempo) as partículas finas de mostarda contribuem para a

estabilidade física e coloidal da emulsão, evitando a coalescência das gotas de óleo (BINKS, 2007).

A eficiência da proteção da barreira mecânica formada depende da dificuldade de remoção

das partículas adsorvidas na interface. A barreira estérica é mais efetiva no caso de partículas

adsorvidas que são preferencialmente molháveis pela fase contínua, as quais, consequentemente,

tendem a se posicionar predominantemente na superfície externa das gotas. Além disso, para uma

estabilização Pickering efetiva, o tamanho médio das partículas deve ser no mínimo uma ordem de

magnitude menor que o tamanho das gotas da emulsão. Assim, nanopartículas são necessárias para a

estabilização de gotas submicrométricas (DICKINSON, 2012; CHEVALIER & BOLZINGER,

2013).

A localização de uma partícula individual em relação à interface óleo/água é definida pelo

ângulo de contato (), como representado na Figura 2 para o caso idealizado da partícula esférica

hidratada preferencialmente pela água ( < 90°).

Figura 2. (A) Partícula esférica na interface óleo-água com ângulo de contato na junção das três fases:

partícula (p), óleo (o) e água (a). Quantidades po, pa e oa são as tensões nas interfaces. (B) Monocamada

de partículas na superfície de uma gota de óleo dispersa em água (Fonte: DICKINSON, 2012).

Na Figura 2 está apresentada a situação em que a estabilização de gotas de óleo em água é

favorecida. Em termos termodinâmicos, o ângulo de contato trifásico (partícula, óleo e água) está

relacionado ao balanço das energias livres nas interfaces partícula-água, partícula-óleo e óleo-água.

Em termos mecânicos, a resolução para as três forças paralelas à superfície do sólido na junção das

três fases é expressa pela clássica equação de Young (1):

32

cos = (po – pa) /oa (1)

em que po, pa e oa são as tensões interfaciais partícula-óleo, partícula-água e óleo-água,

respectivamente. Para as partículas igualmente molháveis por óleo e água, o ângulo será exatamente

= 90°, enquanto que para partículas mais hidrofílicas 0 ≤ < 90° e mais hidrofóbicas 90° < ≤

180° (BINKS, 2002; DICKINSON, 2012; CHEVALIER & BOLZINGER, 2013).

A grande estabilidade alcançada através do mecanismo Pickering, que torna estas emulsões

tão diferentes das estabilizadas por surfactantes, reside no fato de que para uma partícula de raio r a

adsorção na interface óleo-água pode ser vista como um processo irreversível quando não é muito

próximo de 0° ou 180°. A razão para esta irreversibilidade está na energia livre de dessorção

espontânea (ΔGd), que é extremamente alta quando comparada com a energia térmica:

ΔGd = r² oa (1 – cos)² (2)

Na equação 2 estão apresentados os fatores mais importantes relacionados à energia de

interação da partícula com a interface são o ângulo de contato e o tamanho da partícula. Assim,

partículas que possuem condições favoráveis de molhabilidade ( não próximo de 0° ou 180°) e

tamanhos acima de 10 nm, aproximadamente, irão adsorver irreversivelmente na interface, já que seu

ΔGd será muito maior que kT (nas condições próximas da ambiente), em que k é a constante de

Boltzmann (k = 1,38 . 10-23

J/K) e T é a temperatura absoluta. Em contraste a essa adsorção

irreversível está o comportamento das moléculas de surfactante, as quais permanecem em equilíbrio

dinâmico, adsorvendo e dessorvendo da interface em uma rápida escala de tempo. A alta força de

adsorção explica a elevada estabilidade encontrada nas emulsões Pickering, mesmo quando gotas de

tamanho elevado (da ordem de milímetros) estão presentes, o que não é observado em emulsões

estabilizadas por surfactantes (DICKINSON, 2012; RAYNER et al., 2012; BINKS, 2002;

CHEVALIER & BOLZINGER, 2013).

Ainda que muitos pesquisadores na última década venham se dedicando ao entendimento e

desenvolvimento de emulsões estabilizadas por partículas sólidas (EEPS ou emulsões Pickering), a

maioria dos trabalhos envolve sistemas coloidais-modelo contendo partículas inorgânicas, como

óxido de ferro, argilas, partículas de carbono e de sílica (BINKS & LUMSDON, 1999; HUNTER et

al., 2008;. STOCCO et al., 2011; YI et al., 2011). Porém, há alguns estudos realizados com partículas

que podem ter aplicação em alimentos e fármacos sem riscos à saúde do consumidor (DICKINSON,

33

2012; CHEVALIER & BOLZINGER, 2013). A Tabela 1 apresenta alguns trabalhos conduzidos com

partículas biocompatíveis em emulsões O/A.

Tabela 1. Exemplos de partículas biocompatíveis utilizadas na estabilização de emulsões O/A do tipo

Pickering.

Tipo de partícula Tamanho Referência

Nanocristais de quitina 240 nm x 20 nm TZOUMAKI et al., 2011.

Flavonoides ~ 100 nm LUO et al., 2011.

Nanocristais de celulose 50-250 nm x 3-15 nm ZOPPE et al., 2012.

Grânulos de amido de quinoa 1-3 m RAYNER et al., 2012.

Grânulos de amido de arroz,

milho, trigo e batata

5,2 a 52 m LI et al., 2013.

Agregados de nanopartículas de

proteína de soja

~ 100 nm LIU & TANG, 2013.

Microgéis de isolado proteico de

soro do leite

235 nm DESTRIBATS et al., 2014

Celulose amorfa Não especificado JIA et al., 2015.

A maioria dos materiais apresentados na Tabela 1 são altamente polidispersos e com ângulo

de contato favorecendo a adsorção na interface óleo-água, e muitos existem na forma de agregados.

Na maioria dos casos foram utilizadas partículas de proteína e polissacarídeos, os mesmos

ingredientes que já vêm sendo utilizados para estabilizar emulsões clássicas. Assim, o limiar entre

estabilização clássica e Pickering é bastante estreito em alguns casos, principalmente no caso das

proteínas, que geralmente possuem propriedades tensoativas.

Na prática, a maioria dos ingredientes ricos em proteína usados como agentes emulsificantes

na indústria de alimentos (leite em pó, concentrado proteico de soro de leite, proteínas do ovo, etc.)

contém vários tipos de agregados de proteína e partículas coloidais de proteínas que podem se

acumular na interface óleo-água durante a homogeneização. Mesmo diante desse fato, deposição de

34

partículas de proteína na interface, as referidas emulsões não são chamadas de emulsões tipo

Pickering por duas razões principais (DICKINSON, 2012). Primeiramente, muitas das partículas

dispersas nesses coloides alimentícios coexistem na fase aquosa com moléculas solúveis de proteína,

e essas pequenas espécies moleculares são predominantemente responsáveis pela rápida redução da

tensão interfacial durante a homogeneização. Segundo, uma vez que os agregados auto-organizados

de proteínas se tornam realmente adsorvidos na superfície das gotas, eles começam a se romper em

fragmentos menores, que gradualmente se redistribuem na interface para formar uma camada final

do tipo gel de proteína adsorvida. Então, para ser considerado um emulsificante/estabilizante do tipo

Pickering, as partículas dispersas devem permanecer insolúveis e intactas durante o tempo útil da

emulsão em questão (DICKINSON, 2001, 2012).

DESTRIBATS e colaboradores (2014) conseguiram contornar os problemas envolvidos na

fragmentação dos agregados de proteínas. É de amplo conhecimento que as proteínas globulares do

soro do leite são capazes de se auto-organizar em diferentes tipos de agregados dependendo das

condições existentes (de temperatura, pressão, força iônica e pH). No estudo conduzido por

DESTRIBATS e colaboradores (2014), os agregados de proteína do soro do leite foram

covalentemente reticulados e então denominados de microgéis, os quais foram utilizados com

sucesso na estabilização do tipo Pickering de emulsões óleo-em-água.

Na opinião dos autores dessa tese, algumas restrições quanto à classificação do tipo de

estabilização presente em uma emulsão podem levar a alguns enganos. Na maioria dos casos há mais

de um mecanismo de estabilização ocorrendo simultaneamente (aumento da viscosidade da fase

contínua, redução da tensão interfacial, impedimento estérico, repulsão eletrostática, etc.). O

exemplo dos ingredientes ricos em proteína mostra que em algum momento há agregados de proteína

na interface atuando como estabilizante do tipo Pickering. Mesmo que os agregados se rompam e

formem a camada gelificada de proteína na interface, não se pode ignorar que o mecanismo

Pickering ocorreu em algum momento da formação da emulsão. Assim, no presente trabalho haverá

sempre a tentativa de entender e identificar qualquer tipo de mecanismo que esteja contribuindo para

a estabilização das emulsões sem se restringir a uma única classificação.

Já o caso dos polissacarídeos em emulsões Pickering é menos controverso, pois a maioria dos

polissacarídeos não possui atividade interfacial ou propriedades tensoativas. Mesmo assim, afirmar

que uma emulsão é do tipo Pickering não é tarefa fácil. Em alguns trabalhos as maiores evidências

encontradas são microscopias que mostram as partículas na interface, mas isso nem sempre é

possível, pois a microscopia óptica não é suficiente quando se trata de tamanhos na escala

nanométrica, e outras técnicas de microscopia exigem preparos na amostra, como secagem da

35

emulsão e coloração/marcação de ingredientes, que podem modificar suas propriedades ou mesmo

inviabilizar a análise.

Mesmo diante dessas dificuldades considera-se importante estudar o mecanismo de

estabilização Pickering considerando os resultados promissores obtidos, como alta estabilidade à

coalescência, liberação mais controlada e prolongada de alguns fármacos ou ingredientes lipofílicos

encapsulados (FRELICHOWSKA et al., 2009), maior estabilidade em relação à oxidação lipídica

(KARGAR et al., 2011), e até mesmo redução na velocidade da digestão dos lipídeos (TZOUMAKI

et al., 2013), quando comparada com emulsões convencionais contendo surfactantes. Assim, este

tipo de emulsão pode se constituir como um potencial sistema de encapsulação e entrega controlada,

podendo ser utilizado para o desenvolvimento de novos alimentos funcionais (LIU & TANG, 2013;

CHEVALIER & BOLZINGER, 2013).

3.1.2 Emulsões estabilizadas por polissacarídeos

Um dos aspectos mais críticos na formação de produtos emulsionados bem sucedidos é a

seleção de um emulsificante adequado. Em geral, há inúmeros tipos de emulsificantes sintéticos e

naturais que podem ser utilizados na indústria de alimentos, incluindo proteínas, polissacarídeos,

fosfolipídios e tensoativos. No entanto, os consumidores estão cada vez mais exigentes e há uma

crescente demanda na indústria de alimentos por ingredientes naturais para fabricar os denominados

“produtos com rótulo limpo" (OZTURK & McCLEMENTS, 2016; TAVERNIER et al., 2016).

Nesse sentido, os polissacarídeos constituem-se como interessante alternativa, já que a maioria

desses compostos é proveniente de fontes naturais e são seguros para uso em alimentos (“generally

recognized as safe” - GRAS) (STEPHEN & CHURMS, 2006).

A maioria dos polissacarídeos são moléculas altamente hidrofílicas que não apresentam

atividade superficial significativa e, por conseguinte, não são bons emulsificantes (DICKINSON &

STAINSBY, 1988; DICKINSON, 2003; OZTURK & McCLEMENTS, 2016). Em vez disso, os

polissacarídeos podem ser considerados como bons agentes estabilizantes devido ao seu caráter

hidrofílico, sua alta massa molecular e capacidade gelificante, que leva à formação de barreiras

macromoleculares no meio aquoso entre as gotas dispersas, ou seja, eles tendem a estabilizar as

emulsões através do aumento da viscosidade da fase aquosa contínua, inibindo o movimento das

gotas (DICKINSON & STAINSBY, 1988).

Com frequência, os polissacarídeos são modificados para se transformarem em compostos

com atividade superficial (GAONKAR, 1991; DICKINSON, 2003). Em geral, são realizadas

modificações químicas ou enzimáticas, em que grupos hidrofóbicos ou resíduos de proteínas são

http://www.crcnetbase.com/author/Stephen%2C+Alistair

http://www.crcnetbase.com/author/Churms%2C+Shirley

36

anexados às cadeias hidrofílicas, porém, o emulsificante obtido já não pode mais ser considerado

como um emulsificante natural. Os principais exemplos são os amidos e celuloses modificadas. Os

complexos formados através da reação de Maillard entre proteínas e polissacarídeos também são vias

interessantes para produção de emulsificantes à base de polissacarídeos, já que, em geral, os

complexos formados não necessitam de permissão de uso por parte das autoridades da área da saúde

(GAONKAR, 1991; GARTI, 1999; DICKINSON, 2003).

Alguns polissacarídeos naturais têm boas propriedades emulsificantes porque eles já têm

grupos não-polares ou proteínas ligados às suas cadeias. Os exemplos mais comuns são goma

arábica, pectina e galactomananas (DICKINSON, 2003; OZTURK & McCLEMENTS, 2016).

Atualmente, a goma arábica é o emulsificante à base de polissacarídeo natural mais amplamente

utilizado na indústria de alimentos (NAKAUMA et al., 2008; DICKINSON, 1993; GARTI, 1999).

No entanto, a grande desvantagem do uso da goma arábica é a proporção relativamente elevada de

emulsificante-óleo (1:1) necessária para formar emulsões estáveis (DICKINSON, 1993; GARTI,

1999). Estudos recentes têm mostrado que as pectinas cítricas também podem ser usadas como

emulsificantes (SCHMIDT et al., 2015). Outros estudos têm mostrado que polissacarídeos isolados a

partir de sementes de manjericão mostraram-se como bons emulsificantes, com atividade superficial

atribuída à presença de porções de proteína e grupos não-polares na cadeia do carboidrato

(HOSSEINI-PARVAR et al., 2016). A goma de fibra de milho também tem mostrado boas

propriedades emulsificantes, as quais também foram atribuídas à presença de porções proteicas

(YADAV et al., 2012).

No entanto, existem algumas indicações recentes de que certos hidrocolóides, principalmente

aqueles que pertencem à família das galactomananas, são capazes de se adsorver em interfaces óleo-

água e estabilizar emulsões através do mecanismo de estabilização estérica mesmo sem conter

resíduos de proteína em sua cadeia (OZTURK & McCLEMENTS, 2016). Gomas guar e de feno-

grego foram isoladas e purificadas até que a maior parte da matéria proteica fosse removida e, ainda

assim, apresentaram adsorção na interface. As emulsões preparadas com gomas guar e de feno-grego

purificadas foram altamente estáveis mesmo em condições diluídas e forte birrefringência foi

detectada na interface óleo-água indicando a presença de uma camada espessa e orientada de

polissacarídeos (GARTI, 1999; GARTI & LESSER, 2001).

O aumento da viscosidade da fase contínua e a estabilização estérica não são os únicos

mecanismos de estabilização desempenhados por polissacarídeos. Assim como citado anteriormente,

há também muitos estudos mostrando a capacidade de alguns polissacarídeos de estabilizar emulsões

37

através do mecanismo de deposição de partículas na interface, denominada estabilização do tipo

Pickering (ZOPPE et al., 2012; TZOUMAKI et al., 2011; RAYNER et al., 2012; JIA et al., 2015).

Um exemplo que pode ser citado é a estabilização de emulsões através da utilização de

grânulos de amido nativo (LI et al., 2013, RAYNER et al., 2012). Em estudo conduzido por LI e

colaboradores (2013), sobre a capacidade de grânulos de amido, provenientes de diferentes fontes

naturais, de estabilizar emulsões através do mecanismo Pickering, foi observado que quanto menor o

tamanho do grânulo maior era a capacidade de estabilizar emulsões. O grânulo de amido de menor

tamanho estudado, proveniente de arroz, mostrou bom desempenho emulsificante, evitando a

coalescência das gotas de emulsões armazenadas por vários meses. Com o aumento da concentração

dos grânulos de amido de arroz houve aumento da densidade de empacotamento dos grânulos na

interface e redução do tamanho das gotas. Os grânulos de amido de arroz apresentaram tamanho

médio (D43) de, aproximadamente, 5 m e foram capazes de formar emulsões em concentrações a

partir de 3% (m/m). Quando a concentração de grânulos passou de 3 para 45% (m/m) foi observada

uma redução no tamanho médio das gotas da emulsão de 802 m para 43 m, ou seja, o tamanho das

gotas das emulsões foi intensamente dependente da concentração de grânulos presente. Alterações no

pH e adição de sal não apresentaram efeito significativo sobre os sistemas.

Outro exemplo interessante de estabilização de emulsões através do uso de polissacarídeos

está descrita no trabalho de HOSSEINI-PARVAR e colaboradores (2016). Os autores exploraram a

capacidade emulsificante do polissacarídeo extraído da semente de manjericão. Mesmo em baixas

concentrações (0,3% m/m) esse polissacarídeo se mostrou capaz de estabilizar emulsões contendo

30% (m/m) de fase oleosa, prevenindo a coalescência das gotas por até 1 mês de armazenamento. A

goma de semente de manjericão apresentou adsorção na interface das gotas devido à presença de

segmentos hidrofóbicos em sua cadeia e conferiu altos valores de potencial zeta (cerca de -58 mV) às

gotas das emulsões em seu pH natural (~ 7,0). As propriedades das emulsões formadas foram

altamente dependentes do valor de pH e de força iônica. Os mecanismos de estabilização principais

apontados foram o impedimento estérico e a repulsão eletrostática, sendo que dependendo do pH e

da concentração de sal adicionado houve predominância de um mecanismo sobre o outro. Além

disso, uma microscopia existente na literatura mostrou que as dispersões da goma de semente de

manjericão apresentam uma estrutura fibrilar com presença de partículas globulares de,

aproximadamente, 1,5 m, mostrando que as dispersões desse polissacarídeo podem conter

microgéis (RAFE et al., 2013). A presença desses microgéis juntamente com outras evidências

apresentadas no trabalho, permitiu que os autores apontassem que a estabilização do tipo Pickering

também pudesse estar ocorrendo.

38

Já NAN e colaboradores (2014) descreveram uma estratégia diferente para formular emulsões

do tipo Pickering utilizando apenas polissacarídeos. Na primeira etapa do trabalho foram produzidas

partículas de gel de alginato (de tamanho nanométrico) recobertas com quitosana. A adsorção de

quitosana à superfície das partículas permitiu a obtenção de partículas com caráter menos hidrofílico

e, portanto, mais adequadas para a estabilização das emulsões. Na segunda etapa, essas partículas de

alginato recobertas com quitosana foram utilizadas para estabilizar emulsões. Quanto menor o

tamanho das partículas, menor foi a concentração necessária para alcançar emulsões estáveis à

coalescência. De modo geral, as emulsões obtidas se mostraram sensíveis às alterações de pH e de

força iônica. Por conter apenas ingredientes biocompatíveis, as emulsões Pickering obtidas no

trabalho foram citadas pelos autores como promissoras na encapsulação e veiculação de fármacos.

Assim, é possível que no futuro, muitos outros polissacarídeos sejam extraídos com o

propósito de serem utilizados como emulsificantes e não só como estabilizantes. Para tanto, há

necessidade de mais pesquisas para identificar, isolar e caracterizar as propriedades de emulsificantes

à base de polissacarídeos a partir de fontes naturais (GARTI, 1999; GARTI & LESSER, 2001;

OZTURK & MCCLEMENTS, 2016).

3.2 Gelana

A gelana é um polissacarídeo aniônico produzido por fermentação pela bactéria

Sphingomonas elodea que consiste de repetidas unidades de um tetrassacarídeo (-D-glicose, - D-

ácido glicurônico, -D-glicose e -L-ramnose) contendo dois substituintes: glicerato e acetato.

Ambos substituintes estão localizados no mesmo resíduo de glicose, e em média há um glicerato por

unidade repetida e um acetato a cada duas unidades (Figura 3A). Essa é sua forma altamente acilada

(gelana HA) ou natural. O tratamento com álcali é capaz de remover os grupos substituintes

resultando na gelana desacilada (gelana LA). A gelana em sua forma desacilada é composta pelo

mesmo tetrassacarídeo e cada unidade tetramérica repetida, assim como na gelana HA, possui um

grupo carboxílico lateral (Figura 3B) (O’NEIL et al., 1983; JANSSON et al., 1983; SANDERSON,

1990).

39

Figura 3. Unidade repetida do tetrassacarídeo que compõem a goma gelana acilada (A) e desacilada (B)

(SANDERSON, 1990).

A descoberta da goma gelana foi resultado de um esforço que existiu nos anos 70 para

produzir polissacarídeos microbianos com massa molecular e pureza controladas, eliminando, dessa

forma, as variações climáticas e geográficas que podem afetar as propriedades físicas e a

disponibilidade dos biopolímeros provenientes de fontes vegetais (WHITTAKER et al., 1997).

A gelana HA possui massa molar em torno de 1-2 x 106 Daltons. Já a massa molar da gelana

LA é menor, cerca de 2-3 x 105 Daltons. Geralmente, é necessário o aquecimento da água para a

hidratação completa desse polissacarídeo. A temperatura de hidratação da gelana LA é bastante

dependente das condições iônicas do meio aquoso e particularmente sensível à presença de íons

divalentes. Para uma completa hidratação, a gelana LA requer uma temperatura de aproximadamente

75 ºC caso não haja sequestrantes na água. Porém, a completa hidratação em temperatura ambiente é

possível através do uso de 0,3% de citrato de sódio como agente sequestrante (KANG et al., 1982;

O’NEIL et al., 1983; JANSSON et al., 1983).

A gelana HA irá intumescer quando dispersa em água deionizada resultando em solução com

consistência semelhante a soluções de amido. O uso de pequenas concentrações de cátions

monovalentes inibe esse intumescimento. Assim, a adição de íons como sódio e potássio pode ser

uma estratégia para melhorar a dispersão da goma e para reduzir a viscosidade da solução. O

aquecimento é indispensável para a completa hidratação da gelana HA. Enquanto a presença de íons

afeta a dispersão e intumescimento desse polissacarídeo, a temperatura de hidratação é praticamente

insensível à presença deles, e está em torno de 70 a 80 ºC. A hidratação de ambas gelanas, LA e HA,

40

pode ser inibida pela presença de sólidos solúveis ou por baixos valores de pH (KANG et al., 1982;

O’NEIL et al., 1983; JANSSON et al., 1983).

A principal aplicação da gelana tem sido na formação de géis. O mecanismo de gelificação da

gelana é considerado como um processo em duas etapas: primeiro há a formação de duplas-hélices

ordenadas (transição conformacional) durante o aquecimento, seguida pela interação entre as hélices

(transição sol – gel) durante o resfriamento. A temperatura em que se dá a formação do gel depende

do tipo de gelana, da concentração e do tipo de cátion presente na solução e da presença de outros

sólidos dissolvidos. Na ausência de cátions a gelana LA forma gel em torno de 25 ºC, enquanto que

na gelana HA a formação de gel se dá quando a temperatura no resfriamento alcança os 65 ºC. A

adição de cátions, como sódio e cálcio, causa um aumento nessa temperatura. Nos dois tipos de

gelana o gel é formado quase que instantaneamente, uma vez que a temperatura é atingida

(GRASDALEN & SMIDSROD, 1987; KANG et al., 1982; O’NEIL et al., 1983; JANSSON et al.,

1983).

A gelana HA forma gel através do simples resfriamento. Já a formação de gel com gelana LA

requer adição de cátions, ácidos, sólidos solúveis ou uma combinação destes aditivos. Cátions

divalentes são mais efetivos na formação de gel que os cátions monovalentes, sendo necessária maior

concentração de cátions monovalentes para formar géis com força semelhante aos géis com cátions

divalentes (NICKERSON et al., 2003; TANG et al., 1996; VILELA et al., 2011). A gelana HA

produz géis fracos e elásticos devido à presença dos grupos glicerato que ficam localizados dentro

das duplas-hélice, forçando uma rotação do grupo carboxílico e causando impedimento estérico no

momento da agregação das hélices para formar a rede tridimensional. Os géis de gelana HA vão

perdendo sua firmeza com o aumento da temperatura e podem ser desfeitos com o aquecimento

prolongado. Já a gelana LA produz géis firmes, não elásticos e estáveis frente ao aquecimento

(TANG et al., 1996; GRASDALEN & SMIDSROD, 1987; KANG et al., 1982; O’NEIL et al., 1983;

JANSSON et al., 1983).

Em relação às emulsões, nenhum trabalho foi conduzido visando estudar a possibilidade de

utilização da gelana como partícula coloidal na estabilização do tipo Pickering. Há poucos trabalhos

sobre a utilização da gelana em emulsões (LORENZO et al., 2013; HUANG et al., 2001) e a

referência existente, até essa data, sobre a utilização da gelana HA como único componente

estabilizante/emulsificante do sistema é o trabalho que foi gerado a partir dessa tese (VILELA &

CUNHA, 2016).

41

CAPÍTULO 4. MATERIAL E MÉTODOS

42

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material

Os materiais utilizados foram as gomas gelanas acilada (HA) e desacilada (LA) (Kelco, San

Diego, EUA) e óleo de girassol (Liza, Cargill, EUA). Os demais reagentes utilizados foram de grau

analítico. O teor de nitrogênio das gelanas HA e LA em pó foi de 1,75 ± 0,14 e 0,32 ± 0,02% (m/m),

respectivamente (base úmida), o qual foi determinado por um analisador elementar Flash 2000

CHNS/O (Thermo Scientific, Waltham, USA). O conteúdo de íons das gomas gelana foi

determinado por Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Acoplado Indutivamente. A gelana

HA apresentou a seguinte composição (% m/m): cálcio (0,23 ± 0,04), magnésio (0,097 ± 0,01),

potássio (2,0 ± 0,20) e sódio (1,5 ± 0,2). Já o teor de íons da gelana LA foi (% m/m): cálcio (0,25 ±

0,03), magnésio (0,074 ± 0,01), potássio (3,60 ± 0,05) e sódio (0,9 ± 0,2).

4.2. Caracterização das gelanas

A maioria das caracterizações foi feita com a gelana HA, polissacarídeo que apresentou a

capacidade de estabilizar as emulsões nas condições estudadas. Porém, algumas determinações

também foram conduzidas utilizando-se a gelana LA para efeito de comparação. Primeiramente, as

gelanas HA e LA foram caracterizadas quanto a sua viscosidade aparente a 100 s-1

(seção 4.4.3),

potencial zeta (seção 4.4.1) e teor de nitrogênio (seção 4.4.9). A viscosidade foi determinada

utilizando dispersões contendo 0,1% de polissacarídeo preparadas através de agitação magnética a

temperatura ambiente. Para as medidas no potencial zeta, essas dispersões foram diluídas em água

Milli-Q (1:10) e analisadas em seu pH natural.

4.2.1 Efeito da concentração de gelana HA nas propriedades reológicas das dispersões

Dispersões de gelana HA nas concentrações de 0,07, 0,10, 0,14 ou 0,21% m/m foram

preparadas através da adição do polissacarídeo em água Milli-Q e posterior homogeneização em

agitador magnético. Essas dispersões tiveram suas propriedades reológicas determinadas conforme

descrito na seção 4.4.3. Curvas de escoamento e ensaios oscilatórios foram realizados.

4.2.2 Efeito do processo de homogeneização nas dispersões de gelana

O efeito do processo usado para preparar as emulsões (passagem em rotor-estator e

tratamento em sonda de ultrassom) sobre as propriedades das dispersões de gelana foi determinado.

Gelana HA ou LA (0,14% m/m) foram dispersas em água Milli-Q através de agitação magnética.

Uma parte das dispersões foi submetida a uma passagem em rotor-estator (14.000 rpm/4 min) e foi

43

posteriormente caracterizada quanto às suas propriedades reológicas (seção 4.4.3). A outra parte das

dispersões foi submetida a um tratamento em sonda de ultrassom, e teve suas propriedades avaliadas

antes e após esse tratamento. O tratamento ultrassônico foi realizado em processador ultrassônico

modelo QR750 (Ultronique, Campinas, Brazil) operando a 20 kHz de frequência com potência

nominal de 750 W com sonda de área superficial de 1,32 x 10-4

m². O tratamento ultrassônico foi

feito com o auxílio de béquer encamisado conectado a um banho térmico com temperatura fixa de

24ºC, e 100 g de cada dispersão foi processada por 15 min. O pH e potencial zeta (seção 4.4.1) e as

propriedades reológicas (seção 4.4.3) das dispersões foram determinados antes e após o tratamento

ultrassônico.

4.2.3 Efeito do tratamento térmico nas suspensões de gelana

A influência do tratamento térmico nas propriedades das suspensões de gelana acilada (HA)

ou desacilada (LA) em meio aquoso foi determinada. Para tal, suspensões contendo 0,1% (m/m) de

gelana HA ou LA foram analisadas antes e após o tratamento térmico de 90ºC/30 min. Todas as

análises foram realizadas a 25ºC após 24 h do preparo das suspensões. As propriedades avaliadas

foram o comportamento reológico (seção 4.4.3) e o potencial zeta (seção 4.4.1).

4.2.4 Efeito da força iônica nas suspensões de gelana

A influência da força iônica nas propriedades das suspensões de gelana acilada em meio

aquoso foi determinada. Para tal suspensões de gelana em soluções salinas de KCl foram preparadas.

As concentrações de polissacarídeo foram as mesmas utilizadas para preparar a fase aquosa das

emulsões. Assim, duas concentrações de gelana foram avaliadas: 0,035% m/m (que corresponde à

emulsão com 0,025% de gelana HA em relação ao total) e 0,14% m/m (correspondente à emulsão

com 0,1% de gelana HA). A adição de KCl foi analisada em diferentes valores de força iônica (0, 3,

12, 30 ou 300 mM). Todas as dispersões foram preparadas através da agitação magnética, porém a

influência do tratamento ultrassônico nessas dispersões também foi avaliada. O tratamento

ultrassônico foi realizado conforme descrito anteriormente (seção 4.2.2). As propriedades avaliadas

foram: distribuição de tamanho de partículas (seção 4.4.2), propriedades reológicas (seção 4.4.3) e

potencial zeta (seção 4.4.1).

4.2.5 Determinação da tensão interfacial das suspensões de gelana

Dispersões contendo gelana LA ou gelana HA (0,025% m/m) foram preparadas através da

adição do polissacarídeo em água Milli-Q e posterior homogeneização em agitador magnético para

44

determinação da tensão interfacial entre essas dispersões e óleo de girassol (seção 4.4.6). O efeito da

adição de KCl na densidade (seção 4.4.7) e na tensão interfacial das dispersões de gelana HA

também foi avaliado. Concentrações de KCl de 0,03 mM e 0,75 mM (ou 6,3 e 156,3 mg de KCl/g de

gelana) foram utilizadas.

4.3 Emulsões

4.3.1 Preparação de emulsões com gelana HA e LA em rotor-estator

Emulsões contendo gelana acilada ou desacilada foram preparadas através da mistura da fase

aquosa com a fase oleosa em um rotor-estator Ultra Turrax modelo T18 (IKA, Alemanha) a 14.000

rpm por 4 min. A fase aquosa (70% m/m) foi constituída pelas dispersões contendo goma gelana

(HA ou LA) e a fase oleosa utilizada foi o óleo de girassol, na proporção de 30% (m/m) do total da

emulsão. As concentrações de gelana nas emulsões finais foram de 0,01, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1,

0,125, 0,15 ou 0,2% (m/m). As amostras foram caracterizadas após 24h quanto à reologia (seção

4.4.3), morfologia por microscopia óptica (seção 4.4.5), distribuição de tamanho das gotas (seção

4.4.2) e perfil de separação de fases (seção 4.4.4). A distribuição de tamanho das gotas foi

determinada após 24h e também após 7 dias para verificar a estabilidade das gotas à coalescência.

Em algumas amostras selecionadas também foi determinada a distribuição de tamanho das gotas

após armazenamento (em provetas seladas armazenadas em temperatura ambiente) por períodos

prolongados (30 e 60 dias).

4.3.2 Preparo de emulsões com gelana HA em homogeneizador a alta pressão

As emulsões contendo gelana HA preparadas conforme descrito anteriormente (seção 4.4.1)

foram processadas em homogeneizador a alta pressão após a passagem em rotor-estator (14.000

rpm/4 min). Foi utilizado um homogeneizador de dois estágios Panda 2K NS1001L (Niro Soavi,

Itália) a uma pressão de 300 bar no primeiro estágio e de 50 bar no segundo estágio. As amostras

foram caracterizadas após 24h quanto à reologia (seção 4.4.3), morfologia por microscopia óptica

(seção 4.4.5), distribuição de tamanho das gotas (seção 4.4.2), perfil de separação de fases (seção

4.4.4) e potencial zeta (seção 4.4.1). A distribuição de tamanho das gotas foi determinada após 24h e

também após 7 dias para verificar a estabilidade das gotas à coalescência.

45

4.3.3 Efeito do tratamento ultrassônico nas emulsões de gelana HA

Foram preparadas quatro emulsões com a mesma composição, mas diferentes combinações

de etapas de preparo, de modo a determinar o efeito do tratamento ultrassônico nas dispersões de

gelana HA nas emulsões formadas. A Figura 4 apresenta de forma esquemática as etapas utilizadas

para o preparo de cada emulsão. Uma dispersão aquosa de gelana HA preparada através de agitação

magnética (concentração fixa de 0,14% m/m) foi utilizada no preparo de emulsões contendo 0,1%

(m/m) de polissacarídeo e 30% (m/m) de óleo de girassol. A ‘Emulsão 1’ (controle) foi preparada

através da mistura da dispersão aquosa de gelana HA e do óleo utilizando apenas um passo em rotor-

estator Ultra Turrax modelo T18 (IKA, Alemanha) a 14.000 rpm por 4 min. A ‘Emulsão 2’ foi

preparada da mesma forma, porém a dispersão de gelana foi submetida a um passo adicional em

rotor-estator antes do preparo da emulsão. Na ‘Emulsão 3’ a dispersão de gelana foi submetida ao

tratamento ultrassônico (condições de processo descritas anteriormente na seção 4.2.2) antes da

mistura com óleo no rotor-estator. Já a ‘Emulsão 4’ foi preparada utilizando o tratamento

ultrassônico após uma pré-mistura em rotor-estator. A mesma quantidade de amostra foi processada

em cada etapa para manter constante a energia aplicada/massa. As emulsões foram caracterizadas

após 24h quanto à reologia (seção 4.4.3), morfologia por microscopia óptica (seção 4.4.5),

distribuição de tamanho das gotas (seção 4.4.2) e perfil de separação de fases (seção 4.4.4).

Figura 4. Ilustração esquemática das etapas utilizadas no preparo das Emulsões 1, 2, 3 e 4. Todas as emulsões

finais apresentam a mesma concentração de gelana HA e óleo, 0,1% m/m e 30% m/m, respectivamente.

46

4.3.4 Efeito da adição de KCl, CaCl2 ou FeCl3 nas emulsões com gelana HA

Foi determinado o efeito da adição de diferentes sais sob mesma força iônica nas emulsões

com gelana HA. Para tal, suspensões de gelana HA em soluções salinas (KCl, CaCl2 ou FeCl3) foram

utilizadas como fase aquosa para o preparo de emulsões óleo/água contendo 30% m/m de óleo de

girassol. A concentração de gelana nas emulsões foi de 0,025% ou 0,1% m/m. Quatro diferentes

forças iônicas foram avaliadas: 0,03, 0,3, 3 e 30 mM. As razões entre massa de sal e gelana

correspondente a cada força iônica estão apresentadas na Tabela 2. As emulsões foram preparadas

por mistura da fase aquosa com a fase oleosa em um rotor-estator Ultra Turrax modelo T18 (IKA,

Alemanha) a 14.000 rpm por 4 min. As amostras foram caracterizadas após 24h quanto à reologia

(seção 4.4.3), morfologia por microscopia óptica (seção 4.4.5) e por microscopia confocal (seção

4.4.8), distribuição de tamanho das gotas (seção 4.4.2) e perfil de separação de fases (seção 4.4.4). A

distribuição de tamanho das gotas foi determinada após 24h e também após 7 dias para verificar a

estabilidade das gotas à coalescência.

Tabela 2. Razões mássicas de KCl, CaCl2 e FeCl3 utilizadas e suas correspondentes forças iônicas.

KCl CaCl2 FeCl3

Força iônica Gelana mg de sal/ Força iônica Gelana mg de sal/ Força iônica Gelana mg de sal/

(mM) (% m/m) g gelana (mM) (% m/m) g gelana (mM) (% m/m) g gelana

0,03 0,025 6,3 0,03 0,025 3,1 0,03 0,025 2,3

0,3 0,025 62,6 0,3 0,025 31,1 0,3 0,025 22,7

3 0,025 626,0 3 0,025 310,6 3 0,025 227,0

30 0,025 6260,1 30 0,025 3106,3 30 0,025 2270,0

0,03 0,1 1,6 0,03 0,1 0,8 0,03 0,1 0,6

0,3 0,1 15,6 0,3 0,1 7,8 0,3 0,1 5,7

3 0,1 156,3 3 0,1 77,6 3 0,1 56,7

30 0,1 1563,3 30 0,1 775,8 30 0,1 566,9

4.3.5 Efeito da adição de KCl nas emulsões de gelana HA

O efeito da adição de KCl nas emulsões com gelana HA foi estudado de forma mais

detalhada, ampliando a faixa de concentrações de KCl estudada. A concentração de gelana nas

emulsões foi de 0,025% ou 0,1% m/m. Foram adicionadas quantidades de KCl variando entre 1,6 a

47

15633 mg de KCl/g de gelana. A força iônica (FI) das soluções utilizadas considerando a razão entre

a concentração de sal e gelana estão apresentadas na Tabela 3. As emulsões foram preparadas através

da mistura da fase aquosa (água, gelana e KCl) com a fase oleosa (30% m/m de óleo de girassol) em

um rotor-estator Ultra Turrax modelo T18 (IKA, Alemanha) a 14.000 rpm por 4 min. As amostras

foram caracterizadas após 24 h quanto à reologia (seção 4.4.3), morfologia por microscopia óptica

(seção 4.4.5), distribuição de tamanho das gotas (seção 4.4.2) e perfil de separação de fases (seção

4.4.4). A distribuição de tamanho das gotas foi determinada após 24h e também após 7 dias para

verificar a estabilidade das gotas à coalescência. Em algumas amostras selecionadas também foi

determinada a distribuição de tamanho das gotas após armazenamento por períodos mais

prolongados (30 e 60 dias).

Tabela 3. Concentração de KCl utilizada nas emulsões com gelana HA.

0,025 % m/m de gelana 0,1 % m/m de gelana

Amostra FI (mM) mg de KCl/g de gelana Amostra FI (mM) mg de KCl/g de gelana

0 sem KCl 0,0 0 sem KCl 0,0

1 0,007 1,6 1 0,03 1,6

2 0,03 6,3 2 0,12 6,3

3 0,07 15,6 3 0,30 15,6

4 0,30 62,6 4 1,20 62,6

5 0,75 156,3 5 3,00 156,3

6 3,00 626,0 6 12,01 626,0

7 7,49 1563,3 7 30,00 1563,3

8 30,00 6260,1 8 120,13 6260,1

9 74,92 15633,4 9 300,00 15633,4

48

4.4 Metodologias de análise

4.4.1. Determinação de Potencial Zeta

O potencial- foi determinado no equipamento Nanoseries ZS Instrument (Zetasizer Nano-

ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, UK), a 25° C com análise em triplicata. A mobilidade

eletroforética, ou seja, a velocidade das partículas sob efeito de um campo elétrico, foi obtida através

da técnica de “Laser Doppler Velocimetry” (LDV), que faz uso da relação existente entre a

velocidade e o espalhamento de luz produzido pelas partículas dispersas no meio. A mobilidade

eletroforética foi automaticamente convertida em valores de potencial- pelo software do

equipamento utilizando a equação de Henry (3):

UE = 2ɛz f(ka)/ 3

em que UE é a mobilidade eletroforética, ɛ é a constante dielétrica, z é o potencial-, é a

viscosidade do meio e f (ka) é a função de Henry. A função de Henry pode assumir diferentes valores

conforme a aproximação utilizada. Na aproximação de Smoluchowski, adequada para medidas feitas

em meio aquoso com moderada concentração de eletrólitos, o valor de f (ka) é 1,5 (HUNTER, 1988).

O potencial- de algumas amostras também foi medido em dispersões que apresentavam diferentes

valores de pH, fazendo assim uma varredura da relação entre o potencial- e o pH da amostra, numa

titulação em que o ponto de potencial- de valor zero pode ser identificado. O potencial zeta das

emulsões foi medido após diluição das mesmas (1:10) em dispersante adequado (água Milli-Q ou

solução salina, conforme a fase aquosa utilizada para preparar a emulsão).

4.4.2 Distribuição de tamanho de partículas – Espalhamento de luz laser

A distribuição de tamanho de partículas (volumétrica e numérica) foi determinada através da

técnica de espalhamento de luz laser utilizando-se o equipamento Laser Scattering Spectrometer

Mastersizer 2000 (Malvern Instruments LTD., U.K). Utilizou-se água destilada como meio

dispersante e agitação de 1750 rpm. O tamanho médio das partículas foi determinado utilizando o

Sauter Mean Diameter (D32), que é definido como o diâmetro da esfera que possui a mesma relação

volume/área superficial que a partícula de interesse (Equação 4) e também pelo De Brouckere Mean

Diameter (D43), definido pela Equação 5.

2

3

32

ii

ii

dn

dnD (4)

3

4

43

ii

ii

dn

dnD (5)

49

onde ni é o número de partículas com diâmetro di. O “span”, parâmetro associado à polidispersão das

partículas, também foi determinado através da curva de distribuição de tamanhos e foi calculado de

acordo com a Equação 6.

)5,0(

)1,0()9,0(

d

ddSpan

(6)

em que d(0,1), d(0,5) e d(0,9) representam diâmetros de partículas tal que 10, 50 ou 90%,

respectivamente, da amostra analisada é constituída de partículas de tamanho menor que esse valor.

4.4.3. Medidas reológicas

Para a determinação das propriedades reológicas das dispersões aquosas de gelana e das

emulsões foi utilizado um reômetro rotacional Physica MCR 300 rheometer (Physica Messtechnik

GmbH, Stuttgart, Alemanha). As medidas foram feitas em triplicata em uma temperatura de 25°C.

Foi usada geometria de cone-placa com 50 mm de diâmetro, ângulo de 2º e truncamento de 208

m. Curvas de escoamento foram obtidas com um programa de passos múltiplos usando um

intervalo de taxa de deformação entre 0 - 300 s-1

. Os modelos para fluidos Newtoniano (7),

pseudoplástico (8) e de Herschel-Bulkley (9) foram utilizados para ajustar as curvas de

escoamento:

. (7)

nk ).( (8)

nk ).(0 (9)

onde é a taxa de deformação (s-1

), é a viscosidade (Pa.s), n é o índice de comportamento, 0

é a tensão residual (Pa), e k é o índice de consistência (Pa.sn).

Para a determinação das propriedades viscoelásticas, ensaios oscilatórios com varredura de

frequência entre 0,1 e 10 Hz (em deformação constante de 1%) foram realizados e os módulos

viscoso (G”) e elástico (G’) foram determinados. As medidas foram feitas em triplicata a 25ºC

utilizando geometria de placas paralelas rugosa com 50 mm de diâmetro e “gap” (distância entre as

placas) de 500 m.

50

4.4.4. Perfil de separação de fases

Imediatamente após o preparo das emulsões, alíquotas de 100 mL de amostra foram

transferidas para tubos cilíndricos graduados (provetas de 100 ml, com 2,5 cm de diâmetro interno e

25 cm de altura), os quais foram selados e armazenados por 7 dias à temperatura ambiente. O volume

da fase creme, da fase soro e do óleo livre foram quantificados diariamente e os volumes finais das

fases após 7 dias foram apresentados. Para as amostras que foram armazenadas por tempo

prolongado (até 60 dias) foi utilizada solução de formol na borda das provetas para evitar o

crescimento de fungos.

4.4.5. Microscopia óptica

As análises de microscopia óptica foram realizadas em microscópio Scope A1 (Carl Zeiss,

Alemanha) com um aumento de até 100 x. As amostras foram colocadas em lâminas de vidro e

cobertas com lamínulas. Foram obtidas cerca de 10 imagens de cada amostra, de modo a varrer a

lâmina inteira.

4.4.6 Tensão interfacial

As medidas de tensão interfacial foram feitas através do método da gota pendente utilizando

um tensiômetro Tracker-S Tensiometer 180 (Teclis, Longessaigne, France). As medidas foram

realizadas a 25ºC ± 0,5º C através da formação da gota de óleo de girassol (20 L) na fase aquosa.

As fases aquosas analisadas foram água pura, dispersão aquosa de gelana LA, dispersão aquosa de

gelana HA ou dispersão aquosa de gelana HA com adição de KCl. Os valores de tensão interfacial no

equilíbrio foram obtidos após 40 min de análise, dado que após esse intervalo de tempo as curvas não

apresentavam alterações significativas dessa propriedade.

4.4.7 Densidade

A densidade das dispersões aquosas de gelana com ou sem adição de KCl foram

determinadas utilizando um densímetro Density Meter modelo DMA 4500 (Anton Paar, Austria). As

medidas foram realizadas em triplicata a 25º C.

4.4.8 Microscopia confocal de varredura a laser

O isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi usado para marcar a gelana através de ligação

covalente seguindo a metodologia descrita por HEILIG, GÖGGERLE, & HINRICHS (2009). Um

volume de 20 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) e 80 L de piridina foram misturadas com 1 g de

51

gelana em agitação magnética a temperatura ambiente por 30 min. Após a adição de 0,1 g de FITC e

40 L de dibutil dilaurato de estanho, a mistura foi incubada a 95ºC em banho térmico de água e

após 3h foi resfriada até temperatura ambiente. O gel resultante foi macerado e lavado com etanol

99,6% e foi desidratado em estufa a 65ºC. O óleo foi corado com vermelho do Nilo através da adição

do corante ao óleo e posterior agitação em temperatura ambiente. O pó de gelana marcado

covalentemente e o óleo corado foram então utilizados para o preparo das emulsões utilizando a

metodologia descrita anteriormente. As amostras foram visualizadas em microscópio confocal Zeiss

LSM 780-NLO e Axio Observer Z.1 (CarlZeiss AG, Germany) com objetivas de 10x.

4.4.9 Teor de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN)

A quantificação de nitrogênio presente nas gelanas foi realizada em um analisador elementar

Analyzer 2400, Série II (Perkin Elmer, USA). As determinações foram feitas em triplicata.

4.5 Análise estatística

A comparação entre as amostras em relação às diferentes propriedades determinadas foi feita

por análise de variância-ANOVA, em que diferenças estatísticas (p <0,05) foram determinadas pelo

teste de Tukey utilizando-se o software STATISTICA 7 (Statisoft Inc., Tulsa USA, 2000).

52

CAPÍTULO 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Caracterização das gelanas

53

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Caracterização das gelanas

A proposta inicial do projeto contemplava a preparação de nanocristais de gelana para a

obtenção de partículas sólidas insolúveis em água (com caráter hidrofílico reduzido). Porém, ao

iniciar o estudo foi verificado que a gelana pode permanecer parcialmente insolúvel em água caso

não seja dado o tratamento térmico necessário para a completa hidratação desse polissacarídeo. A

maioria dos trabalhos envolvendo o uso de gelana acilada e desacilada trabalham com dispersões do

polissacarídeo após o tratamento térmico, processo que promove uma transição conformacional das

cadeias de gelana. Com relação às propriedades emulsificantes desse polissacarídeo, um número

reduzido de pesquisas é encontrado na literatura (HUANG et al., 2001; LORENZO et al., 2013),

sendo que em todos os trabalhos a gelana é usada após tratamento térmico. Portanto, decidiu-se que

as dispersões de gelana sem hidratação completa (ou seja, sem tratamento térmico) seriam estudadas

quanto às suas propriedades emulsificantes e estabilizantes.

A Tabela 4 apresenta algumas propriedades dos dois tipos de gelana, HA e LA, para efeitos

de comparação.

Tabela 4. Propriedades físicas e físico-químicas das gelanas LA e HA a 25ºC.

Massa

molecular*

(kDa)

Potencial

Zeta**

(mV)

Viscosidade**

a

100 s-1

(mPa.s)

Nitrogênio

(% m/m)

Quantidade

de

proteína***

(% m/m)

Gelana HA 1 - 2x103 -62,15 ± 1,3 42,5 ± 0,7 1,75 ± 0,14 10,93 ± 0,86

Gelana LA 2 - 3x102 -31,19 ± 3,5 3,1 ± 0,1 0,32 ± 0,02 1,99 ± 0,14

*Fornecida pelo fabricante Kelco.

** Utilizando dispersões aquosas contendo 0,1% de polissacarídeo.

*** Utilizando fator de conversão 6,25.

A gelana HA tem massa molecular uma ordem de grandeza maior que a gelana LA, muito

provavelmente devido à presença dos grupos substituintes glicerato e acetato. Quando foi mensurado

o valor de potencial zeta das dispersões em água Milli-Q no pH natural, a dispersão aquosa de gelana

HA apresentou o dobro do valor encontrado para a gelana desacilada. A viscosidade aparente da

dispersão aquosa de gelana HA também foi bastante superior à encontrada na dispersão aquosa de

gelana LA mantendo a mesma concentração. O teor de nitrogênio da gelana em sua forma natural

54

(HA) é bastante superior ao encontrado para a gelana LA, dando indícios de que resíduos de proteína

estão presentes na gelana natural, e que estes resíduos são degradados/removidos durante o processo

de desacilação da gelana (TAYLOR et al., 2012). Esse resultado é importante, pois resíduos de

proteína podem conferir capacidade emulsificante, ou seja, ação interfacial ao polissacarídeo. Assim,

é possível concluir que as dispersões de gelana LA e HA apresentam propriedades bastante distintas,

que irão refletir nas emulsões formadas por cada uma delas.

5.1.1 Propriedades das gelanas – caracterização reológica da gelana HA

Na Figura 5 estão apresentadas as curvas de escoamento das dispersões de gelana HA (0,07 a

0,21% m/m) preparadas através de agitação magnética. As dispersões apresentaram comportamento

pseudoplástico, com redução da viscosidade com o aumento da taxa de cisalhamento. As dispersões

mais concentradas, com 0,14 ou 0,21% m/m de gelana HA, mostraram comportamento mais

complexo com tensão residual. Na Figura 5 foram apresentadas as rampas de subida (1), descida e

subida (2) de taxa de deformação para evidenciar a tixotropia das dispersões (comportamento

dependente do tempo de cisalhamento). O comportamento tixotrópico se tornou mais intenso

conforme houve aumento da concentração de HA. Já a Tabela 5 apresenta os parâmetros obtidos

através do ajuste das curvas de escoamento em estado estacionário (subida 2, após a retirada do

comportamento tixotrópico). Foi possível observar que houve redução no índice de comportamento

(n) e aumento no índice de consistência (k) e viscosidade aparente (ap) com o aumento da

concentração desse polissacarídeo.

55

Figura 5. Curvas de escoamento a 25ºC das dispersões contendo A) 0,07, B) 0,10, C) 0,14 ou D) 0,21% (m/m)

de gelana HA preparadas através de agitação magnética em temperatura ambiente. “Sub1” = primeira curva de

subida; “desc” = curva de descida e “sub2” = segunda curva de subida.

Na Figura 6A é possível verificar como ocorreu o aumento de k frente ao aumento da

concentração de polissacarídeo. O melhor ajuste obtido para k (com maior valor de R²) foi o ajuste

exponencial. Quanto à redução nos valores de n não foi possível determinar se este ocorreu de modo

linear ou exponencial, dado que os valores de R² obtidos foram semelhantes (Figura 6B). Já em

relação à viscosidade aparente em taxa de cisalhamento de 100 s-1

, o aumento observado ocorreu de

forma linear (Figura 6C).

56

Tabela 5. Propriedades reológicas das dispersões contendo 0,07, 0,10, 0,14 ou 0,21% (m/m) de gelana HA a

25ºC.

HA (% m/m) Comportamento

reológico o (Pa) k (mPa.s

n) n R²

Viscosidade aparente

a 100 s-1

(mPa.s)

0,07 Pseudoplástico ---- 0,44 ± 0,05 0,45 ± 0,01 0,996 34,2 ± 2,20

0,1 Pseudoplástico ---- 0,99 ± 0,04 0,39 ±0,01 0,995 58,2 ± 1,06

0,14 Herschel-Bulkley 1,35 ± 0,13 1,47 ± 0,12 0,38 ± 0,01 0,996 100,4 ± 6,64

0,21 Herschel-Bulkley 2,66 ± 0,06 4,33 ± 0,05 0,29 ± 0,01 0,990 190,0 ± 1,00

Figura 6. Ajuste exponencial e linear das curvas representando o comportamento de k (A), n (B) e viscosidade

aparente a 100 s-1

(C) frente ao aumento da concentração de gelana.

Na Figura 7 estão apresentados os ensaios oscilatórios das dispersões de gelana HA. Na

menor concentração de polissacarídeo (0,07% m/m) os valores dos módulos elástico (G’) e viscoso

57

(G”) forma semelhantes. Acima dessa concentração, em geral, o módulo elástico (G’) foi maior que

o módulo viscoso (G”) ao longo da varredura de frequência. Conforme aumentou a concentração de

gelana HA houve maior diferença entre os valores de G’ e G”, e o módulo elástico se tornou menos

dependente da frequência. Esse resultado indica um comportamento de fluido estruturado com

caráter de gel das dispersões de gelana acilada.

Figura 7. Varredura de frequência das dispersões contendo A) 0,07, B) 0,10, C) 0,14 ou D) 0,21% (m/m) de

HAG a 25ºC. Módulo elástico (G’) representado pelos símbolos cheios e módulo viscoso (G”) representado

pelos símbolos vazios.

5.1.2 Propriedades das gelanas - efeito do processo de homogeneização

O efeito do processo usado para preparar as emulsões (passagem em rotor-estator e

tratamento em sonda de ultrassom) sobre as propriedades reológicas das dispersões aquosas de

gelana foi determinado (Figura 8). Diferenças entre as propriedades reológicas das gelanas LA e HA

na mesma concentração também foram apresentadas. A gelana HA apresentou um comportamento

pseudoplástico, enquanto a gelana LA comportou-se como um fluido Newtoniano. Além disso, os

valores de viscosidade aparente em 100 s-1

da gelana HA foram consideravelmente maiores do que

os valores mostrados pela gelana LA sob as mesmas condições (Figura 8B). Esta diferença é

principalmente atribuída a maior massa molar da gelana HA, ocupando maior volume que a gelana

58

LA. Outra característica responsável pela maior viscosidade da gelana HA é a maior repulsão

eletrostática existente entre suas cadeias, propriedade confirmada pelos maiores valores absolutos de

potencial zeta obtidos na análise desse polissacarídeo.

Figura 8. (A) Curvas de escoamento a 25º C das suspensões aquosas de gelana HA e LA na mesma

concentração preparadas através de diferentes condições. AM: dispersões preparadas através da agitação

magnética. RE: dispersões submetidas a uma passagem em rotor-estator (14.000 rpm/ 4 min). UT: dispersões

que passaram por tratamento em sonda de ultrassom. (B) Viscosidade aparente a 100 s-1

das suspensões

aquosas de gelana HA e LA na mesma concentração preparadas através de diferentes condições. Letras

diferentes representam diferença significativa (p < 0,05) entre valores da mesma coluna.

O cisalhamento promovido pelo rotor-estator não causou alterações significativas no

comportamento reológico das suspensões quando comparado com o processo de preparação mais

simples, utilizando somente a agitação magnética. O tratamento ultrassônico provocou alterações

consideráveis no comportamento das dispersões de gelana HA, a qual apresentou comportamento

pseudoplástico antes do ultrassom e comportamento de fluido Newtoniano após esse processo. A

viscosidade aparente da dispersão de gelana LA também diminuiu após o processo de ultrassom, mas

o efeito deste processo na dispersão foi menos intensa do que o observado para a gelana HA, em

concordância com os resultados apresentados por TAYLOR e colaboradores (2012).

Após o tratamento em ultrassom, a curva de escoamento da dispersão de gelana HA tornou-se

muito semelhante à curva de escoamento da dispersão de gelana LA na mesma concentração.

TAYLOR e colaboradores sugerem que a diminuição da viscosidade da gelana LA após o tratamento

ultrassônico pode ser relacionada com uma degradação parcial das cadeias em oligômeros. Por outro

lado, os resultados destes autores mostraram a ausência de degradação significativa das cadeias do

polímero em oligômeros no caso da gelana HA. A gelana HA apresentou picos nos

59

electroferogramas que foram atribuídos a presença de agregados/microgéis de gelana HA (não

mostrados pela gelana LA) que desapareceram após a sonicação. Isto significa que a redução mais

intensa da viscosidade para a gelana HA após o tratamento ultrassônico não é causada por uma

diminuição da massa molecular das cadeias de goma gelana, mas sim por um decréscimo da massa

molecular aparente ou dissolução dos agregados/microgéis de gelana HA (TAYLOR et al. , 2012).

De acordo com o fabricante (Kelco Biopolymers, San Diego, CA), a massa molecular da

gelana HA (1000-2000 kDa) é uma ordem de grandeza maior que a massa da gelana LA (200-300

kDa), como um resultado do processo de desacilação, que implica em diferentes valores de

concentração crítica (C*). Uma solução polimérica pode se encontrar em três diferentes regimes de

concentração: diluído, semi-diluído e concentrado. A diferença entre os regimes está relacionada às

interações das macromoléculas em solução. Polissacarídeos em solução tendem a adotar uma

conformação espiral aleatória que oscila continuamente devido ao movimento browniano. Em baixas

concentrações, numa solução diluída, as cadeias dos biopolímeros encontram-se separadas umas das

outras e se movem independentemente. Com o aumento da concentração, a solução pode entrar no

regime semi-diluído, sendo essa transição marcada pela concentração crítica de sobreposição (C*).

Acima de C*, no regime semi-diluído, as moléculas estão em contato e se interpenetram e começam a

ocorrer interações físicas entre elas. O aumento de concentração associado ao regime semi-diluído

resulta em contração das moléculas em solução. A transição do regime semi-diluído para o regime

concentrado ocorre na concentração crítica de agregação (C**

), em que as moléculas não podem mais

contrair e aumentos na concentração podem levar a formação de agregados (YING & CHU, 1987).

De acordo com JAMPEN e colaboradores (2000), a C* para gelana LA foi 0,064% m/v (a

25ºC), enquanto a gelana HA mostrou C* na faixa de 0,0219-0,0230%, em temperaturas variando

entre 5 a 30°C (HUANG et al., 2008). As concentrações utilizadas nas dispersões de gelana HA e

também nas emulsões estão acima da C* para todas as condições estudadas nesse trabalho.

Não temos os dados referentes aos valores de concentrações críticas de agregação (C**

) para

os diferentes tipos de gelana, porém, a nossa hipótese é a de que os emaranhamentos existentes no

regime concentrado foram os responsáveis pela formação dos agregados/microgéis observados por

TAYLOR et al. (2012). O tratamento em ultrassom pode causar o desenlace destas estruturas e

assim, diminuir a viscosidade das dispersões. Ou seja, mesmo em concentrações acima de C*, é

possível evitar a presença dos agregados através da aplicação do ultrassom. Porém, como não foi

feito um estudo ao longo do tempo, não se sabe se as moléculas podem voltar a se entrelaçar algum

tempo após a quebra promovida pelo ultrassom. Nos resultados que seguem nesse trabalho, a

60

presença destes microgéis/agregados de gelana HA mostrou-se importante para a obtenção de

emulsões estáveis cineticamente.

A influência da quebra de agregados, promovida através de tratamento em sonda de

ultrassom, também foi determinada no potencial zeta. A Tabela 6 apresenta o potencial zeta de

dispersões aquosas contendo gelana HA ou LA, bem como os respectivos valores de pH de cada

dispersão, antes do tratamento em ultrassom (agitação magnética) ou após o tratamento em

ultrassom. A gelana HA quando dispersa em água resulta em dispersões com valores de pH menores

do que os valores encontrados após a dispersão da gelana LA. Os valores absolutos de potencial zeta

das dispersões de gelana HA também são maiores que os apresentados pelas dispersões de LA em

todas as condições estudadas.

Tabela 6. Potencial zeta das dispersões de gelana HA e LA antes e após o tratamento em sonda de ultrassom

(UT) a 25ºC.

Concentração Processo pHHA pHLA Potencial zetaHA Potencial zetaLA FI*HA FI*LA

(% m/m) (mV) (mV) (mM) (mM)

0,014 antes UT 5,54 ± 0,04 5,80 ± 0,05 -61,68 ± 5,30A -41,61 ± 5,49A 0,24 0,26

0,014 após UT 5,64 ± 0,03 5,63 ± 0,09 -55,03 ± 0,89AD -40,48 ± 5,26AB

0,028 antes UT 5,44 ± 0,02 5,72 ± 0,01 -77,27 ± 2,65B -39,03 ± 5,39AB 0,49 0,52

0,028 após UT 5,44 ± 0,04 5,55 ± 0,06 -52,65 ± 0,81DE -41,78 ± 3,5AB

0,07 antes UT 5,21 ± 0,04 5,58 ± 0,02 -85,35 ± 9,18C -35,56 ± 4,42B 1,22 1,30

0,07 após UT 5,35 ± 0,04 5,54 ± 0,02 -46,02 ± 1,37E -41,27 ± 1,67 AB

Letras diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05) entre os valores da mesma coluna. * FI: força iônica,

calculada como a metade da soma da concentração de cada íon multiplicada pelo quadrado da carga. A concentração de

íons foi obtida usando a quantidade de íons presente nas gelanas em pó (seção 4.1) e a concentração de gelana usada para

preparar a dispersão.

Os valores de potencial zeta das dispersões de gelana HA se mostraram dependentes da

concentração de polissacarídeo e da aplicação de tratamento ultrassônico. Houve aumento dos

valores absolutos de potencial zeta com o aumento da concentração de gelana HA. A concentração

de polissacarídeo pode ser considerada como um fator importante nas medidas de potencial zeta, e

são comumente associadas à ocorrência de agregação das cadeias, alterando a disposição das cargas

superficiais (CARNEIRO-DA-CUNHA et. al., 2011). Após o tratamento ultrassônico foi observada a

61

redução dos valores absolutos de potencial zeta, e estes apresentaram ligeira diminuição com o

aumento da concentração. Este resultado também pode ser associado às alterações na disposição dos

resíduos aniônicos dos agregados de gelana HA após a quebra promovida pelo ultrassom. Por outro

lado, as dispersões de gelana LA apresentaram valores de potencial zeta muito similares,

independente da concentração de polissacarídeo ou aplicação de tratamento ultrassônico. É provável

que nas concentrações estudadas a gelana LA ainda esteja abaixo da concentração em que há

possibilidade de agregação desse polissacarídeo.

5.1.3 Propriedades das gelanas - efeito do tratamento térmico

A Figura 9 apresenta o efeito do tratamento térmico no perfil de escoamento das dispersões

de gelana LA e HA. O tratamento térmico não apresentou efeito significativo nas curvas de

escoamento de ambas gelanas.

Figura 9. Efeito do tratamento térmico (TT) nas curvas de escoamento (A) e nos valores de viscosidade

aparente e potencial zeta (B) das dispersões de gelana HA e LA.

A Figura 9B apresenta também o efeito do tratamento térmico nos valores de potencial zeta

das dispersões. Também não houve diferença significativa nos valores de potencial zeta antes e após

o TT. Foi possível observar que a gelana HA apresenta valor absoluto de potencial zeta superior ao

da gelana LA como mencionado anteriormente. Assim, a alta viscosidade apresentada pela gelana

acilada em comparação à gelana desacilada pode ser atribuída a sua maior massa molecular e

também à maior repulsão eletrostática existente entre as suas cadeias.

62

5.1.4 Propriedades das gelanas - efeito da força iônica

A Figura 10 apresenta o efeito da adição de diferentes concentrações de KCl na distribuição

de tamanho de partículas e no potencial zeta dos agregados de gelana HA presentes nas dispersões

aquosas (0,14% m/m de gelana HA). O efeito do tratamento ultrassônico nessas dispersões também

foi determinado. As concentrações de KCl avaliadas (0, 3, 12, 30 e 300 mM) foram escolhidas

através da análise de resultados anteriores, e representam concentrações em que foram observadas

alterações significativas nas propriedades das emulsões.

Nas dispersões sem tratamento ultrassônico, o deslocamento da curva de distribuição de

tamanho de partículas mostrou que os agregados possuem a tendência a aumentar de tamanho

conforme se aumenta a concentração de KCl na dispersão, confirmando que a adição de KCl

promove agregação. A partir da concentração de 30 mM aumentos mais significativos foram

observados. Quanto ao potencial zeta, foi possível observar a redução do valor absoluto do potencial

zeta através da adição de KCl, porém não houve diferença significativa no potencial zeta das

dispersões contendo 3, 12 ou 30 mM de KCl. Não foi possível mensurar o potencial zeta das

dispersões contendo 300 mM de KCl (com ou sem tratamento ultrassônico) devido a limitações do

equipamento utilizado em relação a força iônica das soluções. Antes do tratamento ultrassônico, as

soluções contendo 12, 30 e 300 mM de KCl apresentaram precipitação.

Já as dispersões que passaram pelo tratamento ultrassônico se apresentaram homogêneas, sem

precipitação, com exceção da dispersão contendo 300 mM. Também foi possível observar que estas

apresentaram curvas de distribuição de tamanho de partícula muito similares, independente da

concentração de KCl presente, mostrando que a quebra de agregados promovida por esse tratamento

é mais intensa que a agregação promovida pela adição de KCl. Na Figura 10B é possível observar

que após o tratamento em ultrassom as curvas de distribuição de tamanhos mostraram

comportamento multimodal (bimodal na maioria das amostras). A exceção foi a dispersão que

continha 300 mM de KCl, que continuou apresentando comportamento monomodal e a presença de

grandes agregados mesmo após a passagem em ultrassom. Quanto ao potencial zeta, foi possível

observar a redução gradual do valor absoluto conforme aumentava a concentração de KCl presente,

mostrando o efeito da homogeneização prévia em ultrassom e do tamanho dos agregados na carga

superficial.

63

Figura 10. A) Distribuição de tamanho de partículas e potencial zeta das dispersões de gelana HA antes do

tratamento em ultrassom. B) Distribuição de tamanho de partículas e potencial zeta das dispersões de gelana

HA após o tratamento em ultrassom. O potencial zeta foi medido em diluições contendo 0,014% (m/m) de

gelana.

A Figura 11 e Tabela 7 representam a influência da adição de KCl no comportamento

reológico das suspensões de gelana HA preparadas sob agitação magnética. Na suspensão com

menor concentração de gelana (0,035% m/m) a adição de KCl na força iônica de 3 mM não alterou

significativamente a curva de escoamento e os parâmetros reológicos da suspensão. Por outro lado, a

adição de 30 mM causou grande alteração do comportamento reológico, pois a suspensão passou do

comportamento pseudoplástico para Newtoniano e houve uma queda brusca na viscosidade aparente.

Na suspensão com maior quantidade de gelana (0,14% m/m) a adição de KCl mesmo na menor força

iônica (3 mM) já foi capaz de alterar o comportamento reológico, reduzindo o índice de consistência

(k) e a viscosidade aparente e aumentando o índice de comportamento. Com o aumento da força

iônica essas alterações se tornaram mais acentuadas e o fluido deixou de possuir tensão residual

(passando do comportamento HB para comportamento pseudoplástico).

64

Figura 11. Curvas de escoamento das suspensões contendo gelana acilada e KCl. A) 0,035% e B) 0,14%

(m/m) de gelana HA.

Tabela 7. Parâmetros reológicos das suspensões com gelana acilada e KCl.

Gelana (% m/m) Força iônica (mM) Comportamento o (Pa)

k (Pa.sn) ou

(Pa.s) n R²

Viscosidade a 100 s-1

(mPa.s)

0,035 0 Pseudoplástico --- 0,053 0,57 0,999 7,28

0,035 3 Pseudoplástico --- 0,045 0,60 0,999 7,17

0,035 30 Newtoniano --- 0,002 1,0 0,994 1,78

0,14 0 Herschel-Bulkley 0,82 1,753 0,28 0,999 72,47

0,14 3 Herschel-Bulkley 0,71 0,802 0,37 0,997 50,65

0,14 30 Pseudoplástico --- 0,061 0,60 0,999 9,54

Assim, é possível concluir que até a força iônica de 3 mM as alterações são pequenas nas

suspensões de gelana HA, e consequentemente na fase aquosa que foi utilizada para preparar as

emulsões. A adição de sal com força iônica 10 vezes maior provocou grandes alterações, com o

aumento dos agregados e redução da viscosidade. A adição de cátions como sódio e potássio reduz o

intumescimento da gelana HA (KANG et al., 1982; O’NEIL et al., 1983; JANSSON et al., 1983),

provocando encolhimento nas cadeias, o que poderia explicar a queda de viscosidade observada.

Além disso, esses cátions podem promover certa neutralização das cargas negativas favorecendo a

formação de agregados e reduzindo a interação com a água e formação de rede. A existência de

maiores agregados também favorece a redução da viscosidade.

5.1.5 Propriedades das gelanas – tensão interfacial

A Tabela 8 mostra a tensão interfacial entre as dispersões aquosas de gelana e óleo de

girassol. O teor de nitrogênio apresentada pelo gelana HA (1,75 ± 0,14% m/m) é consideravelmente

65

maior que o teor de nitrogênio apresentado pela gelana LA (0,32 ± 0,02% m/m). Esse valor

corresponde a, aproximadamente, 11% (m/m) de proteína da massa seca de gelana HA, ou um

conteúdo máximo de 0,022% (m/m) de proteína nas emulsões preparadas nesse trabalho. No entanto,

os resultados de tensão interfacial indicaram que a adição de gelana HA, bem como de gelana LA,

não causam redução significativa na tensão entre água-óleo, dado que os valores de tensão

apresentados na Tabela 8 não apresentaram diferença significativa entre si.

Tabela 8. Tensão interfacial (fase aquosa-óleo de girassol) a 25ºC.

Polissacarídeo Concentração (% m/m) Tensão interfacial (mN/m)

---- (controle) 0 20,3 ± 1,0A

Gelana HA 0,025 22,5 ± 0,6A

Gelana LA 0,025 21,1 ± 1,0A

Letras diferentes indicam diferença significativa (p < 0,05) entre os valores da mesma coluna.

O efeito da adição de cloreto de potássio na tensão interfacial das dispersões aquosas de

gelana HA também foi determinado. Na Figura 12A encontra-se o efeito do sal na densidade das

dispersões, pois conhecer os valores de densidade das dispersões é necessário para a determinação da

tensão interfacial. Foi possível verificar ligeiro aumento nos valores de densidade conforme se

aumentou a concentração de sal adicionada e também que a dependência da densidade em relação ao

conteúdo salino se dá de forma linear. Já na Figura 12B estão apresentados os valores de tensão

interfacial das dispersões. Foi possível determinar a tensão somente em dispersões contendo baixa

concentração de KCl, pois efeitos de turbidez e precipitação inviabilizaram a medida. Assim, foi

possível verificar que baixas concentrações de KCl não alteram significativamente os valores de

tensão interfacial.

66

Figura 12. A) Densidade e B) Tensão interfacial das dispersões aquosas de gelana HA (0,025% m/m) em

função da quantidade de KCl adicionada.

Assim, é possível concluir que, mesmo contendo resíduos de proteína, a gelana HA não

causou redução da tensão interfacial das gotas de óleo das emulsões. Os resultados sugerem que a

gelana é um polissacarídeo com ausência de atividade superficial, excluindo a possibilidade de esse

polissacarídeo estar atuando através da redução da tensão interfacial das gotas nas emulsões

estudadas.

67


5.2 Emulsões contendo gelana

68

5.2 Emulsões contendo gelana

5.2.1 Emulsões com gelana desacilada (LA)

A Figura 13 apresenta o perfil de separação de fases após 7 dias das emulsões contendo

gelana LA. A separação de fases foi visualizada em todas as concentrações avaliadas, e foi muito

similar em todas as amostras. Como a emulsão continha inicialmente 30% (m/m) de óleo, é possível

verificar uma separação de fases quase total. Assim, esse polissacarídeo pode ser considerado pouco

eficiente na estabilização de emulsões, dado o alto índice de cremeação alcançado e a posterior

separação de uma fase superior de óleo após períodos mais longos. Assim, dada a ineficiência desse

polissacarídeo na estabilização das emulsões, optou-se por não realizar estudos mais aprofundados

desse estabilizante. Como se observará na próxima seção (5.3.2), os resultados dos sistemas

contendo a gelana HA foram mais promissores, portanto, foram investigados com maior

profundidade.

Figura 13. Perfil de separação de fases das emulsões contendo gelana desacilada (LA).

Nos resultados anteriores foi observado que a gelana LA apresentava viscosidade muito

reduzida em comparação à gelana HA nas baixas concentrações utilizadas. O potencial zeta

apresentado pela gelana LA também foi menor que o potencial zeta obtido para a gelana HA. Outra

diferença importante foi a ausência de agregados/microgéis nas dispersões de gelana LA, como

demostrou TAYLOR e colaboradores (2012). Todas as características citadas podem estar

relacionadas à ineficiência desse polissacarídeo na estabilização das emulsões nas condições

estudadas.

0

20

40

60

80

100

0,025 0,050 0,075 0,100 0,125 0,150 0,200

Vo

lum

e (

ml)

Gelana LA (% m/m)

Óleo livre Fase creme ou emulsão Fase soro

69

5.2.2 Emulsões com gelana acilada (HA) – Rotor-estator ou Homogeneização

As propriedades das emulsões contendo gelana HA (0,025 a 0,2% m/m) e óleo de girassol

(30% m/m) sem adição de sais preparadas utilizando somente rotor-estator ou rotor-estator seguido

de homogeneização a 300 bar foram comparadas. A Figura 14 apresenta o volume das fases

separadas das emulsões, que permite verificar que, independente da utilização da homogeneização a

alta pressão, as emulsões com concentração de gelana a partir de 0,05% (m/m) foram estáveis à

separação macroscópica de fases. A separação de óleo livre só ocorreu quando foram utilizadas as

menores concentrações de gelana (0,01% e 0,025% m/m) em amostras preparadas apenas com rotor-

estator.

Figura 14. Perfil de separação de fases após 7 dias das emulsões contendo gelana HA preparadas utilizando

(A) Rotor-estator ou (B) Rotor-estator seguido de homogeneização a 300 bar.

HUANG e colaboradores (2001) estudaram a estabilidade de emulsões preparadas utilizando

apenas polissacarídeos como estabilizantes. Entre os hidrocolóides estudados (goma feno-grego,

alginato, metilcelulose, xantana, goma de aveia, guar, goma arábica, pectina, goma de linhaça e

jataí), apenas a goma feno-grego e a xantana não mostraram qualquer separação de fases após 1 dia

de armazenamento em sistemas contendo 40% (m/m) de óleo de canola e 0,5% (m/m) de

polissacarídeo. As emulsões contendo 0,025% ou 0,1% (m/m) de gelana HA preparadas utilizando

apenas um passo em rotor-estator também foram avaliadas durante 60 dias de armazenamento a

temperatura ambiente (Figura 15). A emulsão com 0,025% de gelana HA não foi estável à separação

de fases e mostrou coalescência das gotas após 30 dias de armazenamento. Consequentemente, foi

observada uma maior quantidade de óleo livre após dois meses de armazenamento. Por outro lado, a

emulsão que continha 0,1% de gelana HA permaneceu estável à separação de fases após dois meses

de armazenamento. Embora os valores de D43 tenham aumentado ligeiramente, não houve diferença

70

estatisticamente significativa entre os valores observados, mostrando que a coalescência das gotas

durante esse período também não foi significativa para a amostra contendo 0,1% (m/m) de gelana.

Figura 15. Estabilidade por tempo prolongado das emulsões com gelana HA preparadas em rotor-estator. A)

Perfil de separação de fases e B) Valores de D43 após 1, 30 ou 60 dias de armazenamento a temperatura

ambiente. Letras diferentes significam diferença significativa entre valores da mesma coluna (p < 0,05).

Os valores de potencial zeta das emulsões preparadas utilizando rotor-estator seguido de

homogeneização a alta pressão (300 bar) estão apresentados na Tabela 9. As emulsões apresentaram

valores de potencial zeta variando entre -50 até -59 mV. Estes valores de potencial zeta podem estar

contribuindo para a estabilidade das emulsões, uma vez que elevados valores de potencial zeta

evitam a agregação das gotas presentes na emulsão e aumentam a estabilidade por meio da repulsão

eletrostática. A agregação das gotas é, na maior parte dos casos, indesejável em emulsões

alimentícias, porque pode levar a um aumento da viscosidade da emulsão e uma diminuição na

estabilidade à cremeação (MCCLEMENTS & WEISS, 2004).

71

Tabela 9. Potencial zeta das emulsões preparadas com homogeneização (300 bar).

Gelana (% m/m) Potencial zeta (mV)*

0,05 -50,9 ± 1,27A

0,075 -59,8 ± 0,49B

0,1 -59,0 ± 3,08B

0,125 -55,8 ± 2,28B

0,15 -58,5 ± 0,94B

0,2 -58,6 ± 0,66B

*Letras diferentes significam diferença significativa entre valores da mesma coluna (p < 0,05).

As Figuras 16 e 18 mostram a microestrutura das emulsões preparadas com rotor-estator ou

com rotor-estator seguido por homogeneização a alta pressão, respectivamente. Já as Figuras 17 e 19

apresentam a distribuição do tamanho de partículas, os tamanhos médios e span das mesmas. A

Figura 16A mostra uma emulsão em processo de coalescência, mas não foram observadas diferenças

significativas entre as distribuições de tamanho das gotas obtidas em 1 ou 7 dias após o preparo da

emulsão (com concentração de gelana HA de 0,05% m/m). Portanto, o comportamento observado na

Figura 16A pode ter sido induzido pela perturbação causada na emulsão durante o recobrimento da

amostra com lamínulas de vidro, procedimento necessário para a realização da microscopia. Este

comportamento foi observado apenas nesta emulsão devido à combinação do pequeno teor de

estabilizante e condições brandas no processamento (somente passagem no rotor-estator) resultando

em uma emulsão mais susceptível a processos de desestabilização.

72

Figura 16. Micrografias obtidas por microscopia óptica das emulsões preparadas usando rotor-estator

contendo: A) 0,05%, B) 0,075%, C) 0,10%, D) 0,125%, E) 0,15% ou F) 0,20% (m/m) de gelana HA (Barra:

200 m).

Em geral, nas emulsões preparadas com rotor-estator, foi possível observar as partículas

recobrindo as gotas de óleo de forma parcial até a concentração de 0,1% (m/m) de gelana HA

(principalmente nas Figuras 16B e 16C). Acima dessa concentração, o aspecto da superfície das

gotas de óleo se altera, e não é mais possível visualizar as partículas, talvez por haver um

recobrimento completo e denso, tornando as gotas totalmente opacas à passagem de luz. A redução e

73

homogeneização dos sistemas provocados pelo uso do homogeneizador a altas pressões podem ser

vistas nas microscopias da Figura 18A-F.

Figura 17. Distribuição de tamanho de partículas, diâmetro médio (D43, D32 e D50%) e span das emulsões

preparadas usando rotor-estator contendo: 0,05%, 0,075%, 0,10%, 0,125%, 0,15% ou 0,20% (m/m) de gelana

HA. Letras diferentes significam diferença significativa entre valores da mesma coluna (p < 0,05).

Todas as curvas de distribuição de tamanho de partículas das emulsões mostraram mais de

um pico (Figura 17 e Figura 19). Após a homogeneização a alta pressão as emulsões mostraram

comportamento bimodal mais evidente. De fato, na microestrutura desses sistemas é possível

identificar duas classes de tamanho de gotas nas emulsões. HUANG e colaboradores (2001)

estudaram emulsões estabilizadas exclusivamente por polissacarídeos (tais como goma de feno-

grego, metilcelulose, goma de linhaça, goma guar, xantana e outros) e eles também observaram

distribuições bimodais para todas as emulsões estudadas. Apesar das diferenças na concentração e na

preparação, as emulsões com gelana HA mostraram distribuições de tamanho semelhante às obtidas

com metilcelulose e goma xantana, com 10-20% de partículas na faixa de diâmetro de 0-3,5 m e

80-90% de partículas na faixa de diâmetro de 3,5- 80 m, dependendo da concentração de gelana

utilizada. Em relação à largura das distribuições, representada pelos valores de span, foi possível

74

observar que, nas emulsões preparadas apenas com rotor-estator, houve a diminuição nos valores de

span conforme a concentração de gelana HA aumentou até 0,125% (m/m). Nas emulsões preparadas

com homogeneizador, os valores de span foram similares independentemente da quantidade de

gelana no sistema.

Figura 18. Micrografias obtidas por microscopia óptica das emulsões preparadas usando rotor-estator seguido

de homogeneização a 300 bar contendo: A) 0,05%, B) 0,075%, C) 0,10%, D) 0,125%, E) 0,15% ou F) 0,20%

(m/m) de gelana HA (Barra: 200 m).

75

De forma geral, o uso da homogeneização a alta pressão reduziu o diâmetro médio das gotas

das emulsões pela metade. Emulsões preparadas apenas com rotor-estator apresentaram tamanhos

médios (D43 e D50%) entre 40 a 50 m, enquanto que as emulsões submetidas à homogeneização a

alta pressão mostraram tamanhos médios entre 17 e 27 m.

Figura 19. Distribuição de tamanho de partículas, diâmetro médio (D43, D32 e D50%) e span das emulsões

preparadas usando rotor-estator seguido de homogeneização a 300 bar contendo: 0,05%, 0,075%, 0,10%,

0,125%, 0,15% ou 0,20% (m/m) de gelana HA. Letras diferentes significam diferença significativa entre

valores da mesma coluna (p < 0,05).

Foi possível observar uma ligeira tendência de deslocamento da curva de distribuição de

tamanho em direção a menores tamanhos de gotas com o aumento da concentração de gelana até

0,1% (m/m), independentemente do processo utilizado na preparação das emulsões. Emulsões com

teor de gelana superior a 0,1% (m/m) mostraram distribuição de tamanho de partículas e

microestrutura semelhantes. Isso indica que esta concentração (0,1% m/m) foi suficiente para

estabilizar essas emulsões contendo 30% (m/m) de fase oleosa e a adição de maiores teores de

polissacarídeo não causaram quaisquer alterações na distribuição de tamanhos obtida. Este

comportamento pode ser observado mais claramente nas emulsões submetidas à homogeneização a

alta pressão. Portanto, o tamanho das gotas foi dependente da quantidade de gelana (até 0,1% m/m) e

76

também foi determinado pela quantidade de energia envolvida no processo utilizado para a

preparação das emulsões.

As Figuras 20 e 21 apresentam o comportamento reológico das emulsões que se mantiveram

estáveis. Todas as emulsões apresentaram comportamento pseudoplástico, exceto as emulsões com

maior quantidade de gelana (0,2% m/m), que mostraram um comportamento de fluido Herschel-

Bulkley (comportamento pseudoplástico com tensão residual). O comportamento de fluido

pseudoplástico, caracterizado pela redução da viscosidade aparente com o aumento da taxa de

deformação aplicada, é o comportamento mais comum para a maioria das emulsões alimentícias.

Neste caso, a pseudoplasticidade pode ocorrer por uma variedade de razões como, por exemplo, a

alteração da distribuição espacial devido à aplicação de cisalhamento, alinhamento de gotas não

esféricas, remoção de moléculas de solventes ligados às gotas, ou deformação e rompimento de

flocos (HUNTER, 1993).

77

Figura 20. A) Curvas de escoamento das emulsões preparadas somente com rotor-estator. B) Curvas de

escoamento das emulsões preparadas com rotor-estator seguido de homogeneização a 300 bar. O

comportamento reológico das amostras foi indicado por “PP” para comportamento de fluido pseudoplástico

ou “HB” para comportamento do tipo Herschel-Bulkley.

Na Figura 21 é possível observar que o aumento do teor de gelana levou a um aumento no

índice de consistência e viscosidade aparente das emulsões, mas uma diminuição do índice de

comportamento ou aumento da pseudoplasticidade. Também na Figura 21 é possível observar os

valores de viscosidade aparente em duas diferentes taxas de cisalhamento (3 ou 100 s-1

). A

78

viscosidade aumenta de forma quase linear com o aumento da concentração de gelana HA na

emulsão.

Figura 21. Propriedades reológicas das emulsões preparadas somente com rotor-estator ou rotor-estator

seguido de homogeneização a 300 bar (Homog). A) Índice de comportamento. B) Índice de consistência. C)

Viscosidade a 100 s-1

. D) Viscosidade a 3 s-1

.

Quanto ao processo utilizado, a mesma tendência pode ser observada em ambas as taxas de

deformação, com menores valores de viscosidade após a passagem no homogeneizador. A passagem

no homogeneizador causou uma redução no tamanho médio das gotas, assim considerando que o

volume das gotas foi mantido, a homogeneização resultou em emulsão com maior número de gotas

de tamanho menor. Uma quantidade maior de gotas menores na emulsão tende a aumentar a

viscosidade da mesma, pois há aumento na interação entre as gotas. Porém, foi possível observar que

a polidispersão das gotas se tornou muito maior após a passagem no homogeneizador, explicando a

redução de viscosidade observada. Quando a polidispersão é maior, as gotas se encaixam melhor, e

esse empacotamento gera espaço livre e facilita o escoamento, reduzindo a viscosidade (BARNES,

1994).

79

Os resultados relacionados ao tamanho de gotas mostraram que, acima de 0,1% (m/m) de

gelana, a maioria das emulsões estudadas apresentaram curvas de distribuição de tamanho similares.

Contudo, os dados reológicos mostraram que o índice de consistência e a viscosidade aparente

aumentam conforme aumenta a concentração de gelana presente. Assim, as propriedades reológicas

das emulsões foram mais dependentes do teor de gelana na fase contínua do que do tamanho de

gotas. A viscosidade da fase contínua pode ser apontada como um dos mecanismos de estabilização

que atuam sobre as emulsões com gelana HA. Algumas experiências foram feitas usando as

dispersões de gelana HA após o tratamento ultrassônico, que reduziu intensamente a viscosidade da

dispersão (tal como demonstrado na seção 5.2.2), com o intuito de explicitar o papel da viscosidade

da fase contínua nas emulsões, bem como determinar o efeito do tratamento ultrassônico nas

mesmas. Nesse experimento quatro emulsões com a mesma composição, mas preparadas por

diferentes vias foram avaliadas.

As Figuras 22 e 23 mostram algumas características dessas emulsões. A Emulsão 1 (ou

controle), 2 e 3 foram preparadas através da mistura das dispersões de gelana HA com óleo usando

rotor-estator, porém as dispersões de polissacarídeo foram preparadas da seguinte forma: somente

agitação magnética (Emulsão 1); agitação magnética seguida de um passo em rotor-estator (Emulsão

2) e agitação magnética seguida de tratamento ultrassônico (Emulsão 3).

80

Figura 22. Micrografias obtidas por microscopia óptica das emulsões contendo 0,1% (m/m) de gelana HA e

30% (m/m) de óleo de girassol preparadas como descrito anteriormente (seção 4.4.3): (A) Emulsão 1 (E1), (B)

Emulsão 2 (E2), (C) Emulsão 3 (E3), (D) Fase creme inferior da Emulsão 4 (E4) e (E) Fase creme superior da

Emulsão 4 (barra = 200 m). (F) Perfil de separação de fases.

81

Figura 23. A) Curvas de escoamento, B) Distribuição de tamanho das gotas e C) span e diâmetros médios das

emulsões contendo 0,1% (m/m) de gelana HA e 30% (m/m) de óleo de girassol preparadas como descrito

anteriormente (seção 4.4.3): E1, E2, E3 e E4.

Foi possível observar que as Emulsões 1 e 2 apresentaram propriedades muito similares

(Figuras 22 e 23), sendo possível concluir que o tratamento adicional em rotor-estator não causou

alterações significativas nas emulsões. Por outro lado, a Emulsão 3, que foi preparada com a

dispersão de gelana HA de baixa viscosidade (pós tratamento ultrassônico) mostrou um

82

comportamento bastante diferente. Essa emulsão apresentou separação de fases com presença de

óleo livre, e sua fase creme era composta por grandes gotas de óleo. Esse resultado mostrou que a

alta viscosidade da dispersão de gelana HA é um fator crítico na obtenção de emulsões estáveis.

A Emulsão 4, que foi preparada através de uma pré-mistura em rotor-estator seguida por

tratamento ultrassônico, apresentou duas fases esbranquiçadas, uma fase creme superior e uma fase

creme inferior. A fase creme superior mostrou a presença de grandes gotas de óleo e seu

comportamento reológico foi similar ao da fase creme da Emulsão 3. Já a fase creme inferior era

composta por gotas de óleo menores e sua curva de escoamento apresentou comportamento

Newtoniano. Ou seja, continha pequenas gotas de óleo estabilizadas e suspensas em um meio

contínuo de baixa viscosidade. Assim, é possível supor que a alta viscosidade e comportamento

elástico do meio contínuo não são os únicos mecanismos de estabilização presente nessas emulsões.

A Tabela 8 da seção 5.1.5 apresentou a tensão interfacial entre a fase oleosa e as dispersões

aquosas de gelana. O teor de nitrogênio da gelana HA (1,75 ± 0,14% m/m) é consideravelmente

maior que o teor de nitrogênio presente na gelana LA (0,32 ± 0,02% m/m). Devido a isso, esperava-

se que a gelana HA poderia ter alguma atividade na interface. Seu teor de nitrogênio corresponde a

11% (m/m) de proteína no polissacarídeo em pó, aproximadamente, ou a um conteúdo de proteína

máximo de 0,022% (m/m) nas emulsões preparadas. No entanto, os resultados de tensão interfacial

indicaram que a gelana HA não alterou significativamente a tensão entre óleo-água, o que sugere que

uma redução da tensão interfacial não teve lugar durante a formação das emulsões de gelana HA.

Assim, o mecanismo de estabilização relacionado à redução da tensão interfacial entre óleo e água

não será considerado dentro dos mecanismos de estabilização que provavelmente estão atuando nas

emulsões estabilizadas por gelana HA.

A estabilização do tipo Pickering, no qual a deposição de partículas na interface óleo-água

forma uma barreira física contra a coalescência das gotas, ocorre com partículas que podem ser

parcialmente molháveis tanto pela fase polar quanto pela fase apolar (BINKS, 2002; DICKINSON,

2012; CHEVALIER & BOLZINGER, 2013). A gelana é reconhecida como um polissacarídeo

predominantemente hidrofílico, mas a gelana HA apresenta certa insolubilidade em água. Assim, é

possível supor que, além da viscosidade do meio contínuo, o mecanismo de estabilização do tipo

Pickering também pode estar ocorrendo nas emulsões apresentadas. Outros estudos têm demonstrado

a capacidade de alguns biopolímeros de estabilizar emulsões através de uma combinação de

diferentes mecanismos, exemplos que podem ser citados são emulsões estabilizadas por celulose e

quitina, em que a estabilização Pickering e a presença de uma rede na fase contínua foram os

83

mecanismos apontados como responsáveis pela estabilização dessas emulsões (TZOUMAKI et al.,

2011;. JIA et al., 2015).

Resumindo, a gelana HA parece se auto-organizar em microgéis/agregados nas dispersões

aquosas. A presença de microgéis/agregados de gelana HA exerce um intenso efeito sobre o

comportamento reológico da dispersão desse polissacarídeo. A quebra desses agregados através do

tratamento ultrassônico pode diminuir a viscosidade da dispersão e, consequentemente, alterar as

propriedades da emulsão preparada com esta fase aquosa. Por conseguinte, a alta viscosidade do

meio contínuo parece ser um fator importante na estabilização de emulsões realizada pela gelana

HA. As dispersões de gelana HA também mostraram G' > G", mesmo a baixas concentrações de

polissacarídeo, indicando a presença de uma rede de gel na fase contínua das emulsões, que pode

auxiliar na estabilidade dos sistemas. A alta repulsão eletrostática exibida pelas gotas (confirmada

através dos resultados de potencial zeta) também pode estar contribuindo para a estabilidade das

emulsões de gelana HA. No entanto, pode ser visto que a gelana HA também foi capaz de estabilizar

pequenas gotas de óleo em um meio de baixa viscosidade. Uma vez que este polissacarídeo não

apresentou propriedades tensoativas, pode-se supor que a deposição de microgéis/agregados de

gelana na interface óleo-água pode estar ocorrendo, ou seja, é possível que o mecanismo de

estabilização do tipo Pickering também tenha contribuído para a estabilização dos sistemas

avaliados.

Independente do processo utilizado e do mecanismo responsável pela estabilização das

emulsões, é importante ressaltar as baixas concentrações de polissacarídeo utilizadas e seu potencial

uso como estabilizante/emulsificante. A gelana HA é de uso GRAS para alimentos e, portanto,

constitui-se como uma interessante opção na estabilização de emulsões, especialmente considerando

o atual interesse em alguns segmentos em reduzir a utilização de derivados de origem animal em

produtos alimentícios.

84


5.3 Efeito da força iônica em emulsões com gelana HA

85

5.3. Efeito da força iônica em emulsões com gelana HA

5.3.1 Efeito da adição de KCl, CaCl2 ou FeCl3 nas emulsões com gelana HA

O efeito da adição de diferentes sais (KCl, CaCl2 e FeCl3) nas emulsões contendo gelana HA

também foi determinado. Como as cadeias de gelana possuem carga negativa, considerou-se

importante avaliar a influência da valência do cátion presente no sal mantendo-se o valor de força

iônica do sistema. Duas diferentes concentrações de gelana foram escolhidas para este estudo, uma

concentração que originalmente apresentava separação de fases (0,025% m/m – HA0,025%) e outra

concentração que gerava emulsão estável à separação de fases (0,1% m/m – HA0,1%). A morfologia

das emulsões pode ser vista nas Figuras 24-26. As microscopias foram realizadas nas emulsões ou na

fase creme nos casos em que houve separação de fases.

Nas emulsões com adição de KCl (Figura 24) foi possível observar que somente na amostra

com menor concentração de gelana (0,025% m/m) e maior força iônica (30 mM) não houve

formação de emulsão. Nas amostras com concentração de gelana de 0,1% m/m foi possível observar

que a adição de KCl até a força iônica de 3 mM quase não altera a morfologia das emulsões. Porém

na maior força iônica (30 mM – Figura 24.2D) ocorre um aumento considerável no tamanho das

gotas e a superfície destas apresenta um aspecto bastante distinto com partículas visíveis na interface.

Nas análises posteriores será visto que a viscosidade dessa emulsão é bastante reduzida, o que dá

indícios de que a viscosidade não possui papel relevante na estabilização da emulsão em questão.

Assim, há uma possibilidade de que o mecanismo de estabilização por partículas sólidas (emulsão

Pickering) esteja predominando nessas condições.

Já nas emulsões com adição de CaCl2 (Figura 25) também foi possível observar que na

amostra com menor concentração de gelana (0,025% m/m) e maior força iônica (30 mM) não houve

formação de emulsão. Em geral, as morfologias foram bem parecidas às observadas nas emulsões

com KCl, porém na emulsão com 0,1% m/m de gelana e 30 mM de CaCl2 (Figura 25.2D) a emulsão

formada é bastante instável e em 3 mM já se observa um aumento no tamanho de gota quando

comparada a valores inferiores de força iônica.

Em relação às emulsões com adição de cloreto de ferro (Figura 26) foi possível observar que

na concentração de gelana de 0,025% m/m (Figura 26.1) emulsões bastante instáveis foram formadas

e foi considerado que não houve formação de emulsão nas amostras com força iônica de 3 e 30 mM.

Nas amostras com 0,1% m/m de gelana somente na maior força iônica não houve formação de

emulsão, e nesse caso foi possível observar a presença de estruturas rígidas com aspecto

cristalizado/gelificado.

86

Figura 24. Micrografias obtidas por microscopia óptica das emulsões contendo 1) 0,025% ou 2) 0,1% (m/m)

de gelana HA com adição de KCl nas forças iônicas de A) 0,03, B) 0,3, C) 3 e D) 30 mM. Barra: 200 m.

87


de gelana HA com adição de CaCl2 nas forças iônicas de A) 0,03, B) 0,3, C) 3 e D) 30 mM. Barra: 200 m.

88


de gelana HA com adição de FeCl3 nas forças iônicas de A) 0,03, B) 0,3, C) 3 e D) 30 mM. Barra: 200 m.

89

A Figura 27 apresenta os resultados de separação de fases das emulsões com adição de sal,

avaliadas 7 dias após o preparo. Foi possível observar que, sob a mesma força iônica, diferentes

resultados de separação de fases foram obtidos dependendo do sal utilizado. É possível observar, de

forma geral, um aumento na quantidade de soro separado conforme se aumenta a valência do cátion

presente no sal. As emulsões contendo cátion trivalente (FeCl3) foram as que apresentaram maiores

índices de separação de fases. Na menor concentração de gelana (0,025% m/m) a adição do cloreto

de ferro levou à formação de emulsões muito instáveis, sendo que em alguns casos (na força iônica

de 3 ou 30 mM) considerou-se que não houve formação de emulsão.

A adição de determinadas concentrações de KCl e CaCl2 à emulsão com menor concentração

de gelana (HA0,025%) possibilitou a redução da quantidade de soro separado em comparação com a

emulsão sem adição de sal. Importante notar que o KCl na força iônica de 3 mM resultou em uma

emulsão estável à separação de fases. A emulsão com maior concentração de gelana (HA0,1%) sem

adição de sais foi estável à separação de fases. Essa emulsão continuou estável frente à adição de

KCl ou CaCl2 até a concentração correspondente à força iônica de 3 mM. Em relação à adição de

FeCl3, as emulsões permaneceram estáveis somente até a força iônica de 0,3 mM.

É possível supor que a desestabilização causada pelos sais, quando estes estão presentes

acima de determinadas concentrações, está relacionada ao processo de neutralização das cargas do

polissacarídeo, que pode ter duas principais consequências. A primeira seria a formação de

agregados maiores que poderiam precipitar causando a desestabilização das emulsões. No entanto,

visualmente, não foram detectados sinais de precipitação nas amostras. A outra consequência da

neutralização seria na redução da viscosidade da fase contínua e redução da repulsão eletrostática

existente entre as gotas de óleo, caso a gelana esteja posicionada na interface.

Quanto maior a valência do cátion maior é sua capacidade de neutralizar as cargas do

polissacarídeo aniônico. É por isso que o cátion de ferro causou a desestabilização das emulsões

mesmo quando presente em concentrações menores em relação ao K+ e Ca

++.

90

0,025% (m/m) 0,1% (m/m)

KC

l

CaC

l 2

FeC

l 3

Figura 27. Perfil de separação de fases das emulsões contendo gelana HA (0,025 ou 0,1% m/m) e sais (KCl,

CaCl2 ou FeCl3). Porção de cor branca das barras representa fase soro. Porção cinza representa a fase creme

ou a própria emulsão (quando não houve separação de fases).

O comportamento reológico das emulsões com adição de sal pode ser visto na Figura 28. Os

resultados apresentados são referentes à emulsão ou a fase creme nos casos em que houve a

separação de fases. O índice de consistência (k) mostrou-se bastante dependente da concentração de

gelana presente na emulsão, apresentando valores maiores nas emulsões contendo 0,1% (m/m) de

gelana HA. Em relação aos sais é difícil verificar uma tendência clara, pois há influência da

quantidade de soro que foi separada de cada emulsão (alterando a concentração de gelana da fase

creme).

0

20

40

60

80

100

0 0,03 0,3 3 30

Vo

lum

e (

ml)

Força Iônica (mM)

0

20

40

60

80

100

0 0,03 0,3 3 30

Vo

lum

e (m

l)

Força Iônica (mM)

0

20

40

60

80

100

0 0,03 0,3 3 30

Vo

lum

e (

ml)

Força Iônica (mM)

0

20

40

60

80

100

0 0,03 0,3 3 30V

olu

me

(m

l)

Força Iônica (mM)

0

20

40

60

80

100

0 0,03 0,3 3 30

Vo

lum

e (

ml)

Força Iônica (mM)

0

20

40

60

80

100

0 0,03 0,3 3 30

Vo

lum

e (

ml)

Força Iônica (mM)

91

Em relação ao índice de comportamento foi possível observar que a adição de sal teve

influência reduzida no valor desse índice, que permaneceu praticamente inalterado com exceção das

amostras com valor de força iônica elevado. Esse índice nos mostra que, em geral, as emulsões

apresentaram comportamento pseudoplástico (n<1), e que este comportamento se acentua com o

aumento da concentração de gelana presente no sistema. Nas emulsões com alta força iônica (30

mM) houve separação de fases em todos os casos. A separação total de fases foi observada nas

amostras com adição de FeCl3 (sendo assim, essas amostras não foram caracterizadas). Já nas

amostras com menor concentração de gelana (0,025% m/m) com adição de KCl e CaCl2, o índice de

comportamento da fase creme aproximou-se bastante da unidade (comportamento newtoniano),

devido à instabilidade desta emulsão e a predominante presença de óleo livre.

Os resultados referentes à viscosidade também estão diretamente relacionados à quantidade

de soro separada e consequente compactação e aumento de concentração de sólidos na fase creme.

Nas amostras com maior concentração de gelana (0,10% m/m) a viscosidade das emulsões mostrou

alterações significativas somente a partir da força iônica de 3 mM, com grande redução da

viscosidade das emulsões com adição de FeCl3.

92

0,025% (m/m) 0,1% (m/m)

Índ

ice

de

con

sist

ênci

a

Índ

ice

de

com

port

am

ento

Vis

cosi

dad

e

Figura 28. Propriedades reológicas (índice de consistência, índice de comportamento e viscosidade aparente a

100 s-1

) das emulsões contendo gelana HA (0,025 ou 0,1% m/m) e sais (KCl, CaCl2 ou FeCl3).

A Figura 29 apresenta os resultados obtidos através das curvas de distribuição de tamanhos de

gotas das emulsões. Quanto ao diâmetro médio é possível observar que quase não houve alterações

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,03 0,3 3 30

k (P

a.sn

)

Força iônica (mM)

KCl CaCl2 FeCl3

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 0,03 0,3 3 30

k (P

a.sn

)

Força iônica (mM)

KCl CaCl2 FeCl3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,03 0,3 3 30

n

Força iônica (mM)

KCl CaCl2 FeCl3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,03 0,3 3 30

n

Força iônica (mM)

KCl CaCl2 FeCl3

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 0,03 0,3 3 30

Vis

cosi

dad

e a

10

0 s

-1 (

Pa.

s)

Força iônica (mM)

KCl CaCl2 FeCl3

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 0,03 0,3 3 30

Vis

cosi

dad

e a

10

0 s

-1 (

Pa.

s)

Força iônica (mM)

KCl CaCl2 FeCl3

93

significativas a não ser no maior valor de força iônica (30 mM), em que um aumento considerável do

tamanho das gotas pode ser visto. Já os valores de span não apresentaram uma tendência clara.

0,025% (m/m) 0,1% (m/m)

Diâ

met

ro m

édio

(D

43)

Span

Figura 29. D43 e span das emulsões contendo gelana HA (0,025 ou 0,1% m/m) e sais (KCl, CaCl2 ou FeCl3).

Para compreender melhor o papel de cada tipo de sal nas emulsões, foram realizadas análises

de microscopia confocal. A microscopia confocal foi utilizada para identificar a localização de cada

componente da emulsão. Para tal, se fez necessária a utilização de marcadores e nesse caso

específico foram utilizados os corantes vermelho do Nilo e o isotiocianato de fluoresceína (FITC)

para marcar, respectivamente, o óleo de girassol e a gelana HA. Foi observado que a utilização dos

marcadores alterou as propriedades (perfil de separação de fases e tamanho das gotas) das emulsões

em relação às emulsões sem adição de marcadores, porém os resultados serão aqui apresentados para

análise qualitativa e comparação entre as amostras estudadas.

A Figura 30 apresenta o registro fotográfico das amostras coradas. A Figura 30A apresenta as

emulsões sem adição de sais com diferentes concentrações de polissacarídeo (0,025, 0,075, 0,1, 0125

e 0,15% m/m). Somente a emulsão com 0,025% m/m de gelana HA apresentou separação de fases e,

94

portanto, teve sua fase superior avaliada durante as análises microscópicas. A Figura 30B e C

apresentam as emulsões com 0,025% ou 0,10% m/m de gelana, respectivamente, com adição de KCl

(cátion monovalente), CaCl2 (cátion divalente) ou FeCl3 (cátion trivalente). Os sais foram

adicionados em concentrações que resultaram em força iônica de 0,3 mM.

Figura 30. Registro fotográfico das emulsões coradas com vermelho do Nilo (marcador do óleo) e FITC

(marcador da gelana HA) utilizadas na microscopia confocal. A) Emulsões sem adição de sais com 0,025,

0,075, 0,10, 0,125 ou 0,15% (m/m) de gelana HA. B) Emulsões contendo 0,025% (m/m) de gelana HA sem

adição de sal ou com adição de KCl, CaCl2 ou FeCl3 (FI=0,3 mM). C) Emulsões contendo 0,10% (m/m) de

gelana HA sem adição de sal ou com adição de KCl, CaCl2 ou FeCl3 (FI=0,3 mM).

A Figura 31 apresenta as microscopias confocais das emulsões sem adição de sal. Foi

possível observar que a gelana HA (em verde) pode ser encontrada dispersa por toda a fase contínua

das emulsões e regiões mais destacadas (de brilho intenso) podem ser indícios da presença de

aglomerados desse polissacarídeo. Ao visualizar a fase oleosa dispersa (em vermelho), foi possível

observar pequenos pontos escuros na superfície das gotas que podem estar relacionados ao

posicionamento da gelana HA na interface.

95

Figura 31. Microscopia confocal das emulsões estabilizadas por A) 0,025% (fase superior), B) 0,10% ou C)

0,15% (m/m) de gelana HA. O canal 1 apresenta a gelana HA marcada com FITC em verde, o canal 2

apresenta a microscopia óptica do sistema e o canal 3 apresenta o óleo marcado com vermelho do Nilo em

vermelho. As barras representam 50 m.

A Figura 32 mostra o resultado da análise de co-localização em duas amostras sem adição de

sal (com 0,025% ou 0,15% m/m de gelana HA) e em uma amostra contendo KCl. A microscopia de

co-localização mostra a região da amostra em que houve sobreposição espacial e temporal dos

compostos marcados. Foi possível observar a co-localização do óleo e da gelana HA nas regiões do

entorno da gota, mais um indício de que pode haver gelana HA depositada na interface das gotas, o

que caracterizaria esta emulsão como uma emulsão do tipo Pickering. Porém, não foi possível

96

afirmar com certeza que houve a deposição do polissacarídeo na interface, pois pode ser que este

esteja somente muito próximo a ela (no entorno das gotas).

Figura 32. Colocalização dos componentes marcados (gelana HA e óleo) nas emulsões contendo A) 0,025%

(m/m) de gelana HA (fase superior), B) 0,15% (m/m) de gelana HA e C) 0,10% de gelana HA com KCl

(FI=0,3 mM).

Já a Figura 33 apresenta as imagens em 3D (resultado da varredura em profundidade feita nas

amostras) das emulsões com concentração fixa de gelana HA (0,10% m/m) sem adição de sal ou com

adição de KCl ou FeCl3. Foi possível observar que mesmo utilizando baixas concentrações de sal

(FI= 0,3 mM), alterações puderam ser verificadas na fase contínua das emulsões. Com a adição de

KCl foi observada maior heterogeneidade na distribuição da cor verde, com regiões mais

transparentes (menos gelana dispersa) e grande número de regiões de brilho intenso (aglomerados do

polissacarídeo). Essa característica do sal em promover aglomeração da gelana e reduzir a

homogeneidade da fase contínua foi mais intensa com a adição de FeCl3, que parece ter induzido à

formação de grandes aglomerados e heterogeneidade no perfil de espalhamento do polissacarídeo na

fase contínua. Como a gelana é um polissacarídeo de estrutura aniônica, é de se esperar que esta

interaja com íons positivos adicionados ao sistema, bem como, que cátions de maior carga tenham

efeitos mais pronunciados sobre esse polissacarídeo.

97

Figura 33. Duas diferentes perspectivas das montagens em 3D através da varredura em profundidade das

emulsões contendo gelana HA (0,10% m/m) sem adição e com adição de KCl ou FeCl3 (FI = 0,3 mM).

De modo geral é possível concluir que a adição de sais tem influência considerável nas

emulsões avaliadas. A razão polissacarídeo/sal presente pode induzir à separação de fases ou

melhorar a estabilidade da emulsão. Em geral, a viscosidade da fase contínua possui influência na

estabilização das emulsões, mas casos específicos foram observados em que o mecanismo de

estabilização predominante se assemelha ao mecanismo Pickering.

A adição de KCl ou CaCl2 resultaram em efeito muito semelhante sobre as emulsões,

diferente da adição de FeCl3, que teve efeito mais intenso sobre as propriedades dos sistemas

avaliados. A força iônica é calculada levando-se em consideração a concentração do sal e a carga de

seus íons. Assim, a quantidade de FeCl3 adicionada às emulsões, de modo a manter o mesmo valor

de força iônica nos sistemas, representa aproximadamente 1/3 da massa de KCl adicionada. Mesmo

em quantidades menores, a adição de FeCl3 resultou em uma fase creme muito semelhante à obtida

em concentrações elevadas de KCl, em que a desestabilização total da emulsão é evidente. Assim, a

valência do cátion teve grande influência na emulsão formada, e foi possível observar que a

98

quantidade de soro liberada aumenta com a valência do cátion presente no sal e que quanto maior a

valência do cátion, menor é a quantidade de sal capaz de induzir à quebra das emulsões. Esse

resultado está de acordo com a regra de Schulze-Hardy. A regra de Schulze-Hardy afirma que a

concentração de eletrólito necessária para induzir a coagulação em um sistema estabilizado de

partículas carregadas é inversamente proporcional à valência do contra-íon (HUNTER, 1993). Isso

explica o intenso efeito desestabilizante dos íons de ferro, que são capazes de induzir a coagulação

mesmo quando adicionados em pequenas quantidades.

5.3.2 Efeito da adição de KCl nas emulsões com gelana HA

Duas diferentes concentrações de gelana foram escolhidas para este estudo, uma concentração

que originalmente apresentava separação de fases (0,025% m/m) e outra concentração que produzia

emulsão estável à separação de fases (0,1% m/m). A Figura 34 apresenta o perfil de separação de

fases juntamente com os valores de D43 (Figura 34A) e de viscosidade aparente (Figura 34B) das

emulsões com menor concentração de gelana (0,025% m/m). Os valores de D43 e de viscosidade

aparente foram obtidos utilizando a fase creme ou a própria emulsão nos casos em que a separação

de fases não foi observada. A fim de simplificar a observação dos resultados, os gráficos foram

separados em quatro regiões principais.

A emulsão contendo 0,025% m/m de gelana HA sem adição de sal mostrou separação de

fases. Na ‘região 1' a adição de sal não causou diferenças significativas nas propriedades das

emulsões, uma vez que a quantidade de soro liberada permaneceu quase constante com o aumento do

teor de KCl até 15,6 mg de sal/g de gelana (ou 0,07 mM de KCl), e o tamanho médio mostrou uma

ligeira diminuição. Acima deste conteúdo de KCl, na ‘região 2', os valores de viscosidade aparente e

a quantidade de soro liberado pelas emulsões começou a diminuir. Na ‘região 3' não se observou

qualquer separação de fases e os baixos valores de viscosidade aparente foram mantidos. À medida

que o conteúdo de KCl continua a aumentar, maiores quantidades de soro, quase toda a quantidade

de água utilizada para preparar a emulsão, foram liberados, indicativo do colapso da emulsão,

impedindo a medição do tamanho médio das gotas apresentadas nesses sistemas (região 4 ). A Figura

34C-F apresenta a morfologia representativa das emulsões em cada região. Na micrografia da ‘região

4' (Figura 34F), foi possível observar que não há presença de gotas grandes. Esta fase creme mostrou

alto teor de óleo e os pontos que podem ser vistos na microestrutura podem estar relacionados à

presença de agregados de gelana ou água retida. A Figura 34G-H, com óleo de girassol marcado com

vermelho do Nilo e visualização através de microscopia fluorescente, confirmou a desestruturação da

emulsão, com grandes diferenças nos aspectos das fases creme visualizadas.

99

As emulsões contendo 0,025% (m/m) de gelana HA (Figura 34B) apresentaram valores de

viscosidade aparente relacionados à separação de fases. Foi possível observar que os maiores valores

de viscosidade foram obtidos em emulsões com fase creme mais concentrada e que os valores de

viscosidade foram reduzidos conforme a quantidade de soro separado diminuiu. Os valores de

viscosidade aparente dos sistemas com elevado teor de sal (6260 e 15633 mg de KCl/g de gel)

aproximaram-se da viscosidade do óleo de girassol puro. O mesmo foi observado nas emulsões

contendo 0,1% (m/m) de gelana HA com alto teor de KCl.

Portanto, diferentes alterações foram causadas pelo KCl dependendo da quantidade

adicionada às emulsões contendo 0,025% m/m de gelana. Baixas quantidades de KCl não causaram

alterações significativas nas propriedades das emulsões. Valores intermediários podem melhorar a

estabilidade à separação de fases, impedindo a liberação de soro. Grandes quantidades causaram a

quebra das emulsões.

100

Figura 34. Emulsão com 0,025% (m/m) de gelana HA. A) Perfil de separação de fases e diâmetro médio D43.

B) Perfil de separação de fases e viscosidade aparente a 100 s-1

. Micrografias obtidas por microscopia óptica

das emulsões: C) sem adição de sal, D) com 62,6 mg de KCl/g de gelana, E) 626 mg de KCl/g de gelana e F)

15633 mg de KCl/g de gelana. Microscopia fluorescente das emulsões contendo óleo marcado com vermelho

do Nilo: G) 1563 mg de KCl/g de gelana (7,5 mM) ou H) 15633 mg de KCl/g de gelana (75 mM). Barra =

200 m.

101

Em relação à emulsão contendo 0,1% (m/m) de gelana HA (Figura 35) foi possível observar

que não houve separação de fases sem adição de sal e que as propriedades das emulsões foram muito

semelhantes até o teor de 62,6 mg de sal/g de gelana (ou 1,2 mM de KCl). Acima dessa concentração

de KCl, na ‘região 3', os valores de D43 mostraram aumento enquanto que os valores de viscosidade

aparente foram reduzidos, estas mudanças ocorreram gradualmente com o aumento da quantidade de

sal adicionado. Na emulsão com 1563 mg de KCl/g de gelana (ou 30 mM de KCl), a separação de

fases pôde ser observada, e a fase creme continha gotas de maiores tamanhos e baixos valores de

viscosidade aparente foram observados (Figura 35E). A viscosidade mais baixa da emulsão pode

estar relacionada com o maior tamanho das gotas, uma vez que o aumento da gota conduz à

diminuição na razão de área/volume, reduzindo o atrito durante o fluxo, e consequentemente, a

viscosidade (BARNES, 1994). O encolhimento das cadeias de gelana devido à adição de KCl, que

tende a prevenir seu intumescimento, também pode ter sido responsável pela redução de viscosidade

nesse sistema. Novamente, na ‘região 4', o elevado teor de KCl induziu à separação de grandes

quantidades de soro e, consequentemente, o colapso das emulsões.

A emulsão mostrada na Figura 35E (0,1% de goma gelana e 30 mM de KCl) foi amplificada

na Figura 35G. Nesse razão específica de polissacarídeo-sal a presença de agregados/microgéis de

gelana recobrindo a interface das gotas da emulsão pode ser vista claramente nessa microscopia. É

possível que uma estabilização do tipo Pickering esteja predominando nestas condições, pois além da

evidente deposição de partículas na interface revelada pela microscopia, a viscosidade desse sistema

não é alta o suficiente para estar contribuindo com a estabilidade.

102

Figura 35. Emulsão com 0,10 % (m/m) de gelana HA. A) Perfil de separação de fases e diâmetro médio D43.

B) Perfil de separação de fases e viscosidade aparente a 100 s-1

. Micrografias obtidas por microscopia óptica

das emulsões: C) sem adição de sal, D) com 62,6 mg de KCl/g de gelana, E) 1563 mg de KCl/g de gelana e F)

6260 mg de KCl/g de gelana. G) Imagem amplificada da emulsão contendo 1563 mg de KCl/g de gelana (30

mM). Barra = 200 m.

De forma geral, foi possível concluir que nas emulsões contendo 0,10% (m/m) de gelana HA

a adição de baixas concentrações de KCl não acarretaram em alterações significativas nas

103

propriedades das emulsões. Já concentrações médias de KCl possuem a tendência de elevar o

tamanho médio das gotas e de reduzir a viscosidade. Altas concentrações de KCl, por sua vez,

podem causar a desestabilização total da emulsão. Quanto ao mecanismo responsável pela

estabilização das emulsões, pode-se concluir que dependendo das condições de força iônica um

mecanismo pode predominar sobre o outro. Em determinados sistemas há evidências suficientes para

afirmar que o mecanismo de estabilização Pickering está atuando.

Uma discussão mais detalhada sobre os mecanismos de estabilização realizados pela gelana

HA será apresentada mais adiante. Antes, algumas propriedades das emulsões com adição de KCl

serão tratadas com maiores detalhes. Para tal, um menor número de amostras foi selecionado. As

concentrações de KCl foram selecionadas através da análise dos resultados anteriores, e representam

concentrações em que foram observadas alterações significativas nas propriedades das emulsões

(Tabela 10). Novamente foram avaliadas emulsões com duas concentrações diferentes de

polissacarídeo (0,025 e 0,10% m/m), e embora as concentrações de KCl (ou força iônica) sejam

diferentes para cada concentração de gelana, a razão entre a massa de sal e de polissacarídeo foi

mantida. Dessa vez, foi utilizada a força iônica para a apresentação dos resultados para facilitar sua

visualização. A Tabela 10 apresenta novamente a correspondência entre força iônica e razão mássica

para facilitar a visualização e comparação dos resultados.

Tabela 10. Amostras selecionadas com a correspondência entre razão mássica e força iônica.

Gelana (% m/m) KCl (mM) mg KCl/ g gelana

0,025 0 ---

0,025 0,75 156

0,025 3 626

0,025 7,5 1563

0,1 0 ---

0,1 3 156

0,1 12 626

0,1 30 1563

As Figuras 36 e 37 apresentam os resultados referentes à análise de estabilidade por período

prolongado, em que foi determinado o volume das fases separadas após 1, 30 ou 60 dias de

104

armazenamento das emulsões. Na Figura 36 (0,025% de gelana HA) é possível observar que a

emulsão sem adição de KCl apresentou a menor estabilidade prolongada à separação de fases, pois

foi a emulsão que apresentou maior conteúdo de óleo livre após os 2 meses de armazenamento. As

emulsões com quantidade intermediária de KCl (0,75 e 3 mM) não apresentaram alterações na

separação de fases após um mês e somente uma pequena quantidade de soro separada pode ser vista

após 2 meses. Já a emulsão com quantidade elevada de KCl (7,5 mM) apresentou aumento gradual

da quantidade de soro liberado com o tempo de armazenamento. A Tabela 11A mostra os valores de

D43 ao longo do tempo de armazenamento das emulsões com menor teor de gelana HA. Somente as

emulsões sem adição de sal ou com maior teor de KCl (7,5 mM) apresentaram coalescência após os

60 dias de armazenamento, com aumento dos valores de D43. Apesar da emulsão com maior

quantidade de KCl ter apresentado aumento dos valores de D43, não houve diferença significativa

entre os valores de diâmetro médio após 1 ou 60 dias, devido ao grande desvio apresentado na

análise dessa amostra após 60 dias, provocado pela sua alta instabilidade.

Figura 36. Perfil de separação de fases das emulsões contendo 0,025% (m/m) de gelana HA com adição de:

A) 0 mM, B) 0,75 mM, C) 3 mM ou D) 7,5 mM de KCl.

105

Já a Figura 37 apresenta o perfil de separação de fases da emulsão com 0,10% (m/m) de

gelana HA em sua composição. Todas as emulsões mostraram-se estáveis à separação de fases

mesmo após 60 dias de armazenamento. Somente a emulsão com maior teor de KCl (30mM)

apresentou aumento na quantidade de soro liberada, porém não apresentou coalescência, já que não

houve aumento significativo dos valores de D43 ao longo do armazenamento (Tabela 11B). Os

valores de D43 mostraram que todas as emulsões com 0,10% (m/m) de gelana HA avaliadas não

apresentam coalescência significativa após 60 dias de armazenamento.

Figura 37. Perfil de separação de fases das emulsões contendo 0,10% (m/m) de gelana HA com adição de: A)

0 mM, B) 3 mM, C) 12 mM ou D) 30 mM de KCl.

106

Tabela 11. D43 (m) após 1, 30 ou 60 dias de armazenamento a temperatura ambiente.

A) 0,025% de Gelana HA

Armazenamento (dias) 0 mM de KCl 0,75 mM de KCl 3 mM de KCl 7,5 mM de KCl

1 73,1 ± 2,59A 56,1± 0,14

A 48,2 ± 0,14

A 62,4 ± 0,29

A

30 73,1 ± 1,12A 55,5 ± 0,11

A 48,5 ± 0,10

A 63,6 ± 0,12

A

60 123,8 ± 5,47B 55,3 ± 0,35

A 48,2 ± 0,34

A 80,1 ± 16,7

A

B) 0,100% de Gelana HA

Armazenamento (dias) 0 mM de KCl 3 mM de KCl 12 mM de KCl 30 mM de KCl

1 39,9 ± 8,64A 51,1 ± 0,92

A 73,3 ± 2,67

A 145,5 ± 5,61

A

30 43,3 ± 0,10A 52,8 ± 0,80

A 76,2 ± 1,20

A 141,2 ± 3,55

A

60 45,1 ± 0,18A 53,9 ± 0,91

A 73,4 ± 0,93

A 145,8 ± 4,03

A

* Letras diferentes significam diferença significativa entre valores da mesma coluna (p < 0,05).

A Tabela 12 apresenta o potencial zeta das emulsões contendo gelana HA e KCl. Os

resultados de potencial zeta das emulsões contendo 0,025% m/m de gelana HA não mostraram uma

tendência clara, e os valores obtidos foram muito similares independente da concentração de KCl

presente, e são muito próximos ao potencial zeta medido em dispersões de gelana HA pura. Já nas

emulsões com 0,10% m/m de gelana HA foram observadas ligeiras reduções da magnitude do

potencial zeta com o aumento do teor de KCl. Vale ressaltar que nas dispersões o potencial zeta se

mostrou sensível a alterações tanto na quantidade de polissacarídeo quanto na concentração de KCl.

107

Tabela 12. Potencial zeta das emulsões contendo gelana HA e KCl a 25ºC.

Gelana (% m/m) KCl (mM) Potencial zeta (mV)

0,025 0 -43,7 ± 3,4

0,025 0,75 -58,6 ± 1,0

0,025 3 -52,0 ± 1,5

0,025 7,5 -49,5 ± 3,9

Gelana (% m/m) KCl (mM) Potencial zeta (mV)

0,1 0 -55,6 ± 2,6

0,1 3 -55,0 ± 1,0

0,1 12 -51,6 ± 2,0

0,1 30 -46,1 ± 4,0

Já a Figura 38 apresenta as curvas de distribuição de tamanho de gotas referentes às emulsões

apresentadas anteriormente. Foi possível observar que na emulsão com menor concentração de

gelana (0,025% m/m) não há uma tendência clara, somente houve pequena redução de tamanho após

a adição de KCl. Já nas emulsões com concentração de gelana de 0,1% (m/m) foi observado um

aumento gradual do tamanho das gotas com o aumento na concentração de KCl. Todas as emulsões

apresentaram curvas de distribuição de tamanho de gotas multimodais, com presença de dois ou mais

picos.

108

Figura 38. Distribuição de tamanho de gotas das emulsões contendo: A) 0,025% m/m ou B) 0,1% m/m de

gelana HA analisadas 24h após o preparo.

A Figura 39 e Tabela 13 apresentam de forma mais detalhada o efeito da adição de diferentes

concentrações de KCl no comportamento reológico das emulsões com concentração fixa de gelana

HA de 0,10% m/m. É possível observar que a adição de KCl na concentração de 0,3 mM não alterou

significativamente as propriedades da emulsão formada, dado que curvas de escoamento semelhantes

e parâmetros reológicos estatisticamente iguais foram obtidos sem adição de sal ou com adição de

0,3 mM de KCl. Acima dessa concentração, a adição de KCl provocou alterações no comportamento

reológico e reduções no índice de consistência e viscosidade das emulsões foram observadas

conforme houve aumento na quantidade de sal adicionada. Todas as concentrações de sal analisadas

resultaram em emulsões com comportamento pseudoplástico, com redução da viscosidade frente ao

aumento da taxa de cisalhamento. Quanto maior a quantidade de sal presente na emulsão, maior foi o

valor do índice de comportamento (n), ou seja, menos pseudoplástico o comportamento da emulsão.

109

É importante ressaltar que a separação de fases só ocorreu na emulsão contendo 30 mM de KCl

(resultados já apresentados anteriormente) e portanto, a curva de escoamento apresentada foi obtida

através da caracterização da fase creme dessa emulsão.

Figura 39. Curvas de escoamento das emulsões estabilizadas por gelana HA (0,1% m/m) com diferentes

concentrações de KCl.

Tabela 13. Propriedades reológicas das emulsões contendo 0,10% (m/m) de gelana HA a 25ºC.

KCl Comportamento o (Pa) k (Pa.s

n) n R²

Viscosidade aparente

(mM) a 100 s-1

(mPa.s)

0 Herschel-Bulkley 1,81 ± 0,17A 2,89 ± 0,14A 0,32 ± 0,01A 0,992 139,9 ± 5,41A

0,3 Herschel-Bulkley 1,87 ± 0,01A 3,05 ± 0,17A 0,31 ±0,01A 0,991 140,1 ± 2,69A

3 Herschel-Bulkley 1,28 ± 0,01B 1,73 ± 0,10B 0,37 ± 0,01B 0,998 108,4 ± 1,63B

12 Pseudoplástico --- 0,74 ± 0,03c 0,48 ± 0,01C 0,998 65,4 ± 1,30C

30 Pseudoplástico --- 0,21 ± 0,03D 0,58 ± 0,02D 0,999 29,8 ± 2,05D

Já a Figura 40 apresenta os resultados dos ensaios oscilatórios das emulsões com

concentração fixa de gelana HA (0,1% m/m) com adição de KCl. Foi possível observar que os

valores de G’ e G” foram ligeiramente dependentes da frequência e que os valores de G’ são maiores

que os valores de G” em todo o intervalo de frequência para todas as emulsões analisadas

(comportamento característico de gel). A Figura 40A mostra o efeito da adição de 0,3 e 3 mM de

110

KCl e foi possível concluir que essas concentrações de KCl não foram capazes de causar alterações

significativas no comportamento viscoelástico das emulsões. Já a Figura 40B apresenta a

comparação da emulsão sem adição de KCl com emulsões contendo 12 ou 30 mM desse sal. A

adição dessas quantidades maiores de cloreto de potássio causaram redução nos valores de G’ e G” e

a emulsão com 30 mM apresentou os módulos elástico e viscoso com maior grau de dependência da

frequência ou seja, com comportamento de gel mais fraco. Esse resultado está de acordo com o

obtido através das curvas de escoamento, em que grande redução da consistência e viscosidade havia

sido observada para emulsões com maiores concentrações de sal em sua composição.

Figura 40. Varredura de frequência a 25ºC das emulsões estabilizadas por gelana HA (0,1% m/m) com

diferentes concentrações de KCl: A) 0, 0,3 e 3 mM; B) 0, 12 e 30 mM.

111

De acordo com os resultados apresentados nesse capítulo, algumas considerações podem ser

feitas sobre os tipos de mecanismos de estabilização realizados pela gelana HA e sobre a influência

da adição do cloreto de potássio nas emulsões. A gelana HA é usualmente reconhecida como um

agente espessante. Há poucos trabalhos que estudaram a capacidade da gelana HA de estabilizar

emulsões (LORENZO et al., 2013). Em geral, a estabilização de emulsões feita por polissacarídeos é

atribuída ao aumento de viscosidade da fase contínua (DICKINSON, 2003), reduzindo a velocidade

de movimento das gotas de óleo, evitando a coalescência. Nesse trabalho foi observada a capacidade

da gelana HA de estabilizar emulsões mesmo em sistemas que apresentaram baixa viscosidade

devido ao uso de tratamento ultrassônico ou devido à adição de sais. Um exemplo disto é a emulsão

contendo 0,1% de gelana HA e 1563 mg de KCl/g gelana (Figura 35E), que apresentou gotas de

tamanho elevado dispersas em um meio com viscosidade reduzida cuja análise miscroscópica

revelou de forma evidente o posicionamento dos agregados de gelana na interface óleo-água. Assim,

é possível concluir que a gelana possui a capacidade de estabilizar as emulsões por diferentes vias.

Na maioria das condições estudadas o aumento da viscosidade da fase contínua e a repulsão

eletrostática entre as gotas carregadas parecem ser os mecanismos mais prováveis. Porém, em certas

condições (por exemplo, na emulsão com 0,1% de gelana HA e 1563 mg de KCl/g gelana) a

estabilização Pickering, com deposição de partículas na interface, parece ser o principal mecanismo

atuando na estabilização da emulsão.

Por se tratar de um polissacarídeo carregado negativamente, a gelana pode ter suas cargas

neutralizadas através da adição de íons positivos, como o cátion K+. Assim, como visto

anteriormente na seção sobre o efeito do KCl na suspensão de gelana HA (seção 5.2.4), a adição de

determinadas concentrações de KCl pode reduzir a viscosidade da dispersão. Também foi visto que

determinados teores de gelana podem permanecer homogeneamente dispersos em água sem adição

de sais, porque a grande repulsão eletrostática entre as cadeias de gelana permite que a dispersão se

mantenha como uma fase estável. No entanto, a gelana tem tendência a precipitar quando o KCl é

adicionado acima de uma certa quantidade. A neutralização das cargas é responsável por maior

ocorrência de interações soluto-soluto, e como consequência, agregação e precipitação. Então, de

certa forma é possível dizer que a adição de KCl pode alterar a “solubilidade” dos agregados de

gelana HA.

A gelana é um biopolímero capaz de formar ligações de hidrogênio com as moléculas de água

apresentadas na fase contínua, dissolvendo-se na água. No entanto, com o aumento do teor de sal, as

moléculas de água são atraídas pelos íons de sal, o que reduz o número de moléculas de água

disponíveis para interagir com o polissacarídeo. Como resultado, as interações polissacarídeo-

112

polissacarídeo se tornam mais fortes do que as interações solvente-soluto. Este processo é conhecido

como salting-out. GARTI & LESER (2001) demonstraram que certos polissacarídeos hidrofílicos

(aniônicos ou não-iônicos), purificados até não conter mais traços de proteína em sua estrutura,

podem, ainda assim, exibir propriedades emulsificantes e de superfície apesar de seu caráter rígido e

hidrofílico. Eles concluíram que a adsorção ativa de polissacarídeos na interface pode ser induzida

por um efeito salting-out, resultando em camadas semi-sólidas em torno das gotas. A formação de

barreiras mecânicas espessas do tipo gel através da deposição de hidrocolóides na interface óleo-

água foi relatada. Em um capítulo anterior do presente trabalho (seção 5.2.5) foi mostrado que a

gelana HA é um polissacarídeo que não é capaz de alterar a tensão interfacial entre óleo e água,

porém, em razões específicas de polissacarídeo-KCl, pode ser observada a formação de uma barreira

mecânica em torno das gotas da emulsão, provavelmente devido ao efeito salting-out.

Portanto, é possível concluir que a gelana HA, reconhecida como um polissacarídeo

predominantemente hidrofílico que apresenta valores elevados de potencial zeta e possui alta

capacidade espessante, pode atuar de diferentes formas na estabilização de emulsões. Os principais

mecanismos de atuação que podem ser citados são: aumento da viscosidade da fase contínua, elevada

repulsão eletrostática entre as gotas e formação de barreira mecânica através da deposição do

polissacarídeo na interface. Dependendo das condições de preparo e da razão gelana/sal, a

predominância de alguns mecanismos de estabilização foi observada.

113

6. CONCLUSÕES

114

6. CONCLUSÕES

No estudo das gelanas foi observado que a maior massa molar e a presença dos grupos acetil

e glicerato nas cadeias de gelana HA conferem a esse polissacarídeo poder espessante elevado

quando comparado a gelana LA nas mesmas condições. Outra diferença importante entre as duas

formas da gelana é a presença de microgéis/agregados nas dispersões de gelana HA. Foi observado

que o rompimento desses agregados promovido por tratamento ultrassônico resulta em dispersões

com baixa viscosidade, perda do comportamento pseudoplástico e afeta a capacidade estabilizante

desse polissacarídeo. Também foi observado que, apesar de a gelana HA ter apresentado teor de

nitrogênio maior que o encontrado na gelana LA, ambos os polissacarídeos não possuem capacidade

de reduzir a tensão na interface água-óleo.

Quanto às emulsões contendo gelana, foi possível concluir que a gelana LA não possui

capacidade emulsificante nas condições estudadas. Em relação às emulsões contendo gelana HA, foi

observado que emulsões estáveis à separação de fases podem ser obtidas mesmo utilizando baixas

concentrações desse polissacarídeo. Algumas emulsões contendo gelana HA foram estáveis à

separação de fases e coalescência das gotas durante 2 meses de armazenamento. Quanto ao preparo,

foi observado que a passagem no homogeneizador reduziu a viscosidade das emulsões e reduziu o

tamanho médio das gotas em comparação com as emulsões preparadas somente em rotor-estator. A

alta viscosidade do meio contínuo e a presença de uma rede de gel foram consideradas como fatores

importantes na estabilização de emulsões realizada pela gelana HA. A alta repulsão eletrostática

exibida pelas gotas (confirmada através dos resultados de potencial zeta) também foi apontada como

um dos principais mecanismos de estabilização atuando nessas emulsões.

Em relação ao efeito da adição de diferentes sais, foi possível concluir que, em concentrações

específicas, a adição de sais pode evitar a separação de fases, aumentando a estabilidade do sistema,

ou induzir a completa desestabilização da emulsão. Propriedades similares foram observadas em

emulsões com adição de KCl ou CaCl2. Já o efeito do FeCl3 foi mais intenso, e esse sal se mostrou

capaz de desestabilizar completamente as emulsões mesmo quando adicionado em baixas

concentrações em relação aos sistemas com KCl ou CaCl2.

Para o caso específico da adição de KCl, foi observado que a adição de baixas concentrações

de KCl não acarretaram em alterações significativas nas propriedades das emulsões. Concentrações

médias de KCl possuem a tendência de elevar o tamanho médio das gotas e de reduzir a viscosidade.

Já as altas concentrações de KCl podem causar a desestabilização total da emulsão. Em determinados

sistemas foi possível sugerir que o mecanismo de estabilização predominante é o do tipo Pickering,

115

com agregados de gelana HA depositados na superfície de gotas grandes dispersas em meio contínuo

com baixa viscosidade.

De modo geral, foi possível concluir que emulsões com diferentes propriedades podem ser

obtidas dependendo da razão polissacarídeo/sal e que esta razão pode interferir nos mecanismos de

estabilização atuando nas emulsões. Mesmo sendo um polissacarídeo predominantemente

hidrofílico, foi observado que a gelana HA pode se posicionar na interface das gotas, formando uma

barreira mecânica que impede a coalescência das gotas, em razões polissacarídeo/sal específicas.

Porém, independente do mecanismo de estabilização atuando, é importante ressaltar as baixas

concentrações de polissacarídeo utilizadas, mostrando que a gelana HA tem potencial para ser

utilizada como um ingrediente estabilizante/emulsificante. Esse carboidrato é de uso GRAS para

alimentos e, portanto, constitui-se como uma interessante opção na estabilização de emulsões

alimentícias, especialmente considerando o atual interesse em reduzir a utilização de derivados de

origem animal, permitindo a obtenção de emulsões sem uso de derivados do ovo ou do leite.

116

7. ANEXO I

Estudo das partículas da borra de café

117

7. ANEXO I - Estudo das partículas da borra de café

7.1 Introdução

O Brasil é o maior produtor e exportador de café do mundo, sendo que sua safra de 2015

alcançou 43 milhões de sacas de 60 kg de café beneficiado (ICO, 2015). A partir do café bruto vários

produtos podem ser obtidos, como o café torrado e moído, o extrato de café, o óleo de café e o café

solúvel. Aproximadamente 50% da produção mundial de café é destinada à fabricação de café

solúvel e, em média, 0,91 kg de borra de café são gerados para cada 1 kg de café solúvel produzido.

Assim, a quantidade gerada anualmente desse resíduo é bastante elevada, sendo estimada em cerca

de 6 milhões de toneladas/ano (SILVA et al., 1998; MUSSATTO et al., 2011).

A borra de café é um resíduo poluente devido a sua alta quantidade de matéria orgânica,

fazendo com que seu aproveitamento seja de fundamental importância para evitar impactos

ambientais. Assim, várias pesquisas relativas ao aproveitamento e agregação de valor a esse resíduo

tem sido conduzidas. Atualmente seu destino principal dentro da indústria é o uso como combustível,

através de queima em caldeiras devido ao seu alto poder calorífico de, aproximadamente, 5.000

kcal/kg (SILVA et al., 1998). No entanto, investigações já foram feitas considerando a utilização da

borra em enriquecimento de solos (CRUZ et al., 2012), remoção de corantes (FRANCA et al., 2009;

SAFARIK et al., 2012), adsorção de metais (AZOUAOU et al., 2010), na extração de compostos

fenólicos (ZUORRO & LAVECCHIA, 2012) entre outros.

A Tabela 14 apresenta a composição média da borra de café. Essa composição pode variar

bastante conforme a origem e processamentos prévios, mas, em geral, esse resíduo é rico em

polissacarídeos, lignina, proteínas e minerais. Os polissacarídeos são os componentes mais

abundantes na borra de café, sendo que os açúcares são polimerizados em estruturas de celulose e

hemicelulose, que quando somados correspondem à 40-50% em média de sua composição em massa

seca (MUSSATTO ET AL., 2011; BALLESTEROS et al., 2014).

A lignina também é uma fração presente em quantidade significativa nos resíduos de café. A

lignina é uma macromolécula constituída por uma grande variedade de grupos funcionais, como

hidroxila fenólica, hidroxila alifática, metoxil, carbonila e sulfonatos, sendo que sua estrutura e

composição podem variar de acordo com a matéria-prima de origem. Os ácidos clorogênico, caféico

e cumárico são os componentes mais relevantes da lignina do café e desempenham um papel

importante na saúde devido às suas propriedades antioxidantes (MAYDATA, 2002; STEWART

2008; MUSSATTO et al., 2011b; BALLESTEROS et al., 2014). Em um estudo recente, extratos

118

produzidos a partir de borra de café exibiram atividade anti-tumoral e anti-alérgica que foram

relacionadas com a presença de compostos fenólicos, tal como o ácido clorogênico, em sua

composição. De fato, tem sido relatado que o ácido clorogênico, o qual é um dos compostos

fenólicos mais abundantes na borra, possui inúmeras propriedades benéficas à saúde relacionadas

com a sua atividade antioxidante (MUSSATO et al., 2011b).

Em relação aos minerais, uma ampla variedade pode ser encontrada na borra de café, sendo o

potássio, magnésio e fósforo, micronutrientes essenciais à saúde humana, os minerais presentes em

maiores quantidades (BALLESTEROS et al., 2014).

Tabela 14. Composição aproximada da borra de café (base seca).

Componentes % (m/m)

Proteínas 10-15

Fibras 37-47

Óleo 10-15

Cinzas 0,27-1,14

Fonte: SILVA et al., 1998.

Atualmente, há uma grande pressão política e social para reduzir a poluição proveniente das

atividades industriais. Por essa razão, é necessário caracterizar e estudar formas de utilização

rentável da borra de café, agregando valor a esse material e diminuindo o seu impacto no meio

ambiente (BALLESTEROS et al., 2014).

7.2 Material e Métodos

7.2.1 Material

O material utilizado foi a borra de café coletada na Companhia Cacique de Café Solúvel,

Barueri, SP. Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico.

7.2.2. Caracterização da borra de café

A borra de café foi seca em estufa a 60ºC por 48h. A distribuição de tamanho da borra de café

seca foi determinada através de método de peneiragem (seção 4.5.1). Após a peneiragem, as frações

de cada peneira foram separadas e caracterizadas quanto ao teor de nitrogênio, carbono e hidrogênio

(seção 4.5.2), microscopia eletrônica de varredura (seção 4.5.3), efeito do pH no potencial zeta

(seção 4.5.4) e através de espectroscopia de absorção na região do infravermelho (seção 4.5.5).

119

7.2.3 Redução de tamanho da borra de café

A redução de tamanho das partículas da borra de café foi realizada por três diferentes

processos. Como a borra de café é um material muito heterogêneo e de alta polidispersidade, optou-

se por partir de uma das frações obtida durante a peneiragem com peneira de mesh 100 (Fração 100,

com diâmetro médio de 179,5 m). No primeiro processo foi utilizado rotor-estator Ultra Turrax

modelo T18 (IKA, Alemanha), em que uma dispersão aquosa contendo 2% (m/m) de borra de café

foi submetida a sucessivos passos de 4 min. Duas diferentes velocidades de rotação (14.000 e 18.000

rpm) foram avaliadas. No segundo processo foi utilizado o homogeneizador a alta pressão Panda 2K

NS1001L (Niro Soavi, Itália), em que dispersões de borra de café em água (0,5% m/m) foram

homogeneizadas nas pressões de 200, 600 ou 1000 bar no primeiro estágio e 50 bar no segundo

estágio. O efeito de sucessivas passagens (3 no total) mantendo fixa a pressão (600 bar no primeiro

estágio e 50 bar no segundo estágio) também foi determinado. No terceiro processo, as dispersões de

borra de café (0,5% m/m) foram submetidas à hidrólise ácida utilizando HCl. Neste processo foram

determinados os efeitos do tempo de hidrólise (1,5 ou 3h), da temperatura (60, 80 ou 95ºC), da

concentração de HCl (3 ou 6M) e do uso de ultrassom durante a hidrólise (Tabela 15). A razão entre

a quantidade de solução ácida e quantidade de borra foi mantida fixa em 200:1 (m/m). As dispersões

contendo as partículas produzidas em ambos os processos foram caracterizadas quanto à distribuição

de tamanho (seção 4.5.6).

Tabela 15. Condições utilizadas nos experimentos de hidrólise ácida da borra de café.

Hidrólises T (ºC) Tempo (h) HCl (M) Ultrassom

Controle --- --- --- ---

H1 80 1,5 3 não

H2 80 1,5 6 não

H3 95 1,5 3 não

H4 95 1,5 6 não

H5 80 3 3 não

H6 80 3 6 não

H7 60 1,5 3 sim

H8 60 1,5 3 não

120

Após os processos mecânicos (rotor-estator e homogeneizador), a dispersão de borra

resultante foi filtrada (papel de filtro Whatman número 1 de 110 mm de diâmetro) com o objetivo de

isolar as partículas nanométricas. As nanopartículas obtidas após filtragem foram caracterizadas

quanto ao tamanho através de microscopia eletrônica de varredura (seção 4.5.3) e tiveram sua carga

superficial determinada através do potencial zeta (seção 4.5.4).

7.2.4 Metodologias de análise

7.2.4.1 Distribuição de tamanho de partículas – Peneiragem

O conjunto para peneiragem foi constituído por 9 peneiras com diferentes diâmetros de

abertura (mesh ABNT variando de 3,5 a 400). A peneiragem ocorreu em sistema vibratório (modelo

Magnet 100, fabricante Bertel Indústria Metalúrgica Ltda, Caieiras - SP) com frequência de 60 Hz

em duas bateladas, com tempo de 15 min para cada batelada. Para compor a distribuição de tamanho

foi considerada a fração mássica de borra de café retida em cada peneira.

7.2.4.2 Teor de carbono, hidrogênio e nitrogênio (CHN)

A quantificação da matéria orgânica em termos de carbono, hidrogênio e nitrogênio presente

na borra de café foi realizada em um analisador elementar Analyzer 2400, Série II (Perkin Elmer,

USA). As determinações foram feitas em triplicata.

7.2.4.3 Microscopia eletrônica de varredura

As amostras secas de borra de café foram montadas em “stubs” de alumínio, cobertas com

ouro em um Sputter Coater SCD 050-Balzers (Alzenau, Alemanha) e observadas em um microscópio

eletrônico de varredura Jeol JSM-6340F (Tóquio, Japão) (Instituto de Química da Unicamp) operado

a 10 kV. Foram feitas imagens em aumentos de magnitude 100 e 1000x.

7.2.4.4 Determinação de Potencial Zeta

O potencial- foi determinado no equipamento Nanoseries ZS Instrument (Zetasizer Nano-

ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, UK), a 25° C com análise em triplicata. A mobilidade

eletroforética, ou seja, a velocidade das partículas sob efeito de um campo elétrico, foi obtida através

da técnica de “Laser Doppler Velocimetry” (LDV), que faz uso da relação existente entre a

velocidade e o espalhamento de luz produzido pelas partículas dispersas no meio. A mobilidade

121

eletroforética foi automaticamente convertida em valores de potencial- pelo software do

equipamento utilizando a equação de Henry (3):

UE = 2ɛz f(ka)/ 3

em que UE é a mobilidade eletroforética, ɛ é a constante dielétrica, z é o potencial-, é a

viscosidade do meio e f (ka) é a função de Henry. A função de Henry pode assumir diferentes valores

conforme a aproximação utilizada. Na aproximação de Smoluchowski, adequada para medidas feitas

em meio aquoso com moderada concentração de eletrólitos, o valor de f (ka) é 1,5 (HUNTER, 1988).

O potencial- foi medido em dispersões que apresentavam diferentes valores de pH, fazendo assim

uma varredura da relação entre o potencial- e o pH da amostra, numa titulação em que o ponto de

potencial- de valor zero pode ser identificado.

7.2.4.5 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho

A técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi

aplicada para estudo da estrutura das amostras de borra de café. A análise de FTIR foi realizada em

um espectrofotômetro Perkin Elmer modelo Spectrum One (Waltham, Estados Unidos) com

transformada de Fourier. As amostras secas foram analisadas nas seguintes condições: região

espectral de número de onda de 4000 a 650 cm-1

, resolução de 4 cm-1

, com 16 varreduras.

7.2.4.6 Distribuição de tamanho de partículas – Difração a laser

A distribuição de tamanho de partículas (volumétrica e numérica) foi determinada através da

técnica de difração a laser utilizando-se um equipamento Laser Scattering Spectrometer Mastersizer

2000 (Malvern Instruments LTD., U.K). Utilizou-se água destilada como meio dispersante e agitação

de 1750 rpm. O tamanho médio das partículas foi determinado utilizando o Sauter Mean Diameter

(D32), que é definido como o diâmetro da esfera que possui a mesma relação volume/área superficial

que a partícula de interesse (Equação 4) e também pelo De Brouckere Mean Diameter (D43), definido

pela Equação 5.

2

3

32

ii

ii

dn

dnD (4)

3

4

43

ii

ii

dn

dnD (5)

onde ni é o número de partículas com diâmetro di. O “span”, parâmetro associado à polidispersão das

partículas, também foi determinado através da curva de distribuição de tamanhos e foi calculado de

acordo com a Equação 6.

122

)5,0(

)1,0()9,0(

d

ddSpan

(6)

em que d(0,1), d(0,5) e d(0,9) representam diâmetros de partículas tal que 10, 50 ou 90%,

respectivamente, da amostra analisada é constituída de partículas de tamanho menor que esse valor.

7.3 Resultados e discussão

7.3.1 Caracterização da borra de café

A borra de café proveniente de uma empresa produtora de café solúvel passou por processo

de secagem e foi caracterizada quanto a distribuição de tamanhos das partículas, potencial zeta das

partículas, morfologia das partículas, composição (carbono, nitrogênio e hidrogênio) e espectro na

região do infravermelho. A distribuição de tamanhos das partículas que compõem a borra de café

está apresentada na Figura 41A. É possível verificar que o resíduo da indústria de café solúvel

apresenta alta polidispersidade, com tamanhos variando entre 37 m até aproximadamente 10 mm. O

diâmetro médio obtido foi de 2,09 ± 0,33 mm. A distribuição de tamanho apresentada na Figura 41A

foi obtida através do método de separação em peneiras. Cada fração retida nas peneiras utilizadas foi

separada para posterior utilização (Figura 41B). Na Figura 41C está apresentada a distribuição de

tamanho de duas frações que foram separadas. A cada fração foi dado um nome conforme o mesh da

peneira correspondente. Essa distribuição de tamanhos da Figura 41C foi obtida por difração a laser e

esta técnica não pode ser utilizada em algumas frações devido ao limite máximo de tamanho

mensurável pelo equipamento. Ambas as distribuições mostradas na Figura 41C apresentaram mais

de um pico, que pode estar relacionado à aglomeração das partículas quando dispersas em água ou ao

inchamento das mesmas (a dispersão em água destilada é realizada durante as determinações feitas

no equipamento de difração a laser).

123

Figura 41. A) Distribuição de tamanho das partículas da borra de café. B) Frações separadas por tamanho

através da utilização de peneiras com mesh 3,5, 14, 30, 70, 100, 120 e 200. C) Distribuição de tamanho das

partículas das frações retiradas das peneiras com mesh 400 e 100.

Já a Tabela 16 apresenta o rendimento mássico de cada fração retida nas peneiras. O maior

rendimento foi da fração com tamanho médio de 3535 m (Mesh 14), seguida das frações obtidas

nas peneiras com mesh 30 (Dmédio = 985 m) e 70 (Dmédio = 385 m). Isso mostra que partículas de

tamanho micrométrico estão presentes na borra de café em quantidades consideráveis e podem ser

utilizadas após um processo simples de separação. A fração de menor tamanho foi obtida em peneira

de mesh 400, com diâmetro médio de 49,5 m. Essa fração apresentou o menor rendimento mássico

(0,03% m/m).

124

Tabela 16. Rendimento mássico das frações de borra de café.

Peneira Poro D médio Fração

(mesh) (m) (m) mássica (%)

400 37 49,5 0,03 ± 0,07

230 62 68,5 0,86 ± 0,20

200 75 100 0,78 ± 0,34

120 125 137 0,87 ± 0,30

100 149 179,5 2,32 ± 1,01

70 210 385 14,5 ± 3,51

30 560 985 34,72 ± 2,73

14 1410 3535 38,22 ± 5,53

3,5 5660 7000 7,69 ± 2,58

As frações de mesh 100 (Dmédio =179,5 m) e 400 (Dmédio = 49,5 m) foram caracterizadas

por microscopia eletrônica de varredura, como pode ser observado na Figura 42. Uma composição

heterogênea pode ser observada, destacando-se a presença de estruturas alongadas que é

característica de materiais fibrosos.

Figura 42. Microscopia eletrônica de varredura das frações 100 (Dmédio =179,5 m) e 400 (Dmédio = 49,5 m).

Magnitude de 100x. As barras representam 100 m.

125

Na Figura 43 está apresentada a variação do potencial zeta em função do pH da borra de café.

A variação da carga superficial das partículas frente ao pH pode influenciar na sua capacidade

emulsificante. Porém, o equipamento utilizado permite avaliar o potencial zeta em partículas de até

100 m. Assim, o potencial zeta foi avaliado apenas na fração com menor tamanho médio (fração

400, com diâmetro médio de 49,5 m). Foi possível verificar que a dispersão da borra em água tinha

um pH natural em torno de 5,0. Nessas condições, a borra apresenta potencial zeta negativo, próximo

de -25 mV. O ponto de carga zero corresponde aproximadamente ao pH de 3,3. Abaixo desse valor

de pH o potencial zeta é positivo.

Figura 43. Variação do potencial zeta em função do pH da fração 400 (Dmédio = 49,5 m ) da borra de café.

A borra de café apresenta composição similar ao grão de café, contendo majoritariamente

carboidratos, sendo hemicelulose o polissacarídeo encontrado em maior quantidade, seguido de

celulose. Também apresenta uma porção considerável de compostos nitrogenados, que podem incluir

proteínas, cafeína, trigonelina, aminas e aminoácidos livres (MUSSATTO et al., 2011).

Considerando a complexidade de sua composição, as frações de borra resultantes dos processos de

moagem e extração do café podem apresentar uma composição diferente para cada fração. Assim,

dependendo da fração escolhida, propriedades diferentes poderiam ser encontradas, e, portanto,

partículas com diferentes capacidades emulsificantes poderiam ser obtidas.

Sendo assim, o teor de hidrogênio, nitrogênio e carbono de cada fração foram determinados e

estão apresentados na Figura 44. É possível verificar que houve pequenas diferenças nos teores de

carbono, hidrogênio e nitrogênio conforme o tamanho da fração analisada. Além disso, ao se analisar

as razões de N/C e H/C de cada fração, resultados bastante semelhantes foram observados, indicando

que não há diferença significativa na composição das diferentes frações.

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

5

10

2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5

Po

ten

cial

Zet

a (m

V)

pH

126

Figura 44. Composição elementar CHN das frações da borra de café.

Também foram analisados os espectros de absorção na região do infravermelho para algumas

frações (Figura 45). A espectroscopia no infravermelho se baseia no fato de que as ligações químicas

das substâncias possuem frequências de vibrações específicas, as quais correspondem aos níveis de

energia da molécula (chamados nesse caso de níveis vibracionais). Se a molécula receber radiação

eletromagnética com 'exatamente' a mesma energia de uma dessas vibrações, então a luz será

absorvida, desde que sejam atendidas determinadas condições (STUART, 2004). Nesse tipo de

espectroscopia um feixe de radiação infravermelha passa pela amostra e a quantidade de energia

transmitida é registrada e utilizada para a construção de um gráfico em função número de onda

utilizado (normalmente uma faixa entre 4000-400 cm-1

).

Na Figura 45A foram apontadas as principais informações que o espectro obtido possui. A

banda mais larga em aproximadamente 3400 cm-1

inclui diversos modos vibracionais atribuídos

principalmente aos grupos –OH e, com menor contribuição, aos grupos funcionais contendo -NH. A

presença dos grupos metil e metileno foi confirmada pelos dois picos agudos que aparecem em 2925

cm-1

e 2855 cm-1

, atribuídos ao estiramento assimétrico e simétrico de ligações C-H em cadeias

http://pt.wikipedia.org/wiki/Liga%C3%A7%C3%A3o_qu%C3%ADmica

http://pt.wikipedia.org/wiki/Subst%C3%A2ncia

http://pt.wikipedia.org/wiki/Freq%C3%BC%C3%AAncia

http://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%ADvel_de_energia

http://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%ADvel_de_energia

127

alifáticas. Estes picos foram previamente relacionados à presença de cafeína em café torrado

(CRAIG et al., 2012). Os mesmos picos também foram relacionados à presença de lipídeos em milho

e farinha de milho (CREMER & KALETUNC, 2003). Como a cafeína é altamente solúvel em água

quente, é mais provável que estes picos estejam relacionados à presença de lipídeos nas borras de

café avaliadas (PUJOL et al., 2013).

A banda que aparece em 1742 cm-1

está associada com a vibração de grupos carbonila (C=O)

em ésteres alifáticos ou em triglicerídeos. Portanto, esta banda também pode ser atribuída à presença

de lipídeos. As bandas de baixa intensidade entre 1665 a 1000 cm-1

indicam presença de ligações

C=C e C-H, e foram atribuídas por alguns autores à presença de lipídeos, carboidratos, como lignina,

e de ácidos clorogênicos (WANG & LIM, 2012; CLIFFORD et al., 2008). Ácidos clorogênicos são

compostos fenólicos que contribuem para o sabor do café e são de importância bio-farmacológica

potencial para os seres humanos (FARAH et al., 2006). No entanto, a espectroscopia de

infravermelho não é capaz de distinguir as bandas correspondentes aos ácidos clorogênicos e aos

polissacarídeos, e uma análise cromatográfica seria necessária para confirmar a presença de ácidos

clorogênicos na amostra (PUJOL et al., 2013).

Já a Figura 45B apresenta os perfis de absorção de diferentes frações de borra de café. Os

perfis das amostras analisadas foram semelhantes, mostrando que não há diferença significativa de

composição entre as diferentes frações da borra, confirmando o resultado obtido na análise de

composição CHN.

128

Figura 45. A) Espectro de absorção na região do infravermelho da fração 400 com as principais bandas

interpretadas através da comparação com trabalhos similares. B) Espectros de absorção na região do

infravermelho das frações de borra de café 70 (Dmédio = 385 m), 120 (Dmédio = 137 m), 230 (Dmédio = 68,5

m) e 400 (Dmédio = 49,5 m).

No geral foi possível verificar que a borra de café é um material constituído de partículas com

tamanho médio variando numa faixa bastante abrangente (37 m a 10 mm), que a morfologia dessas

partículas é bastante heterogênea, predominando o formato característico de material fibroso.

Quando dispersas em água, as partículas apresentam um potencial zeta negativo (-25 mV) no pH

natural (5,0). Essa carga pode contribuir para manter o equilíbrio das partículas em uma dispersão,

aumentando o tempo até que a sedimentação aconteça. Também se concluiu que não há diferenças

significativas de composição entre as diferentes frações.

129

7.3.2 Redução de tamanho das partículas da borra de café

Com o intuito de tornar as partículas mais adequadas para uso como emulsificantes em

emulsões é preciso reduzir o tamanho das mesmas. Assim alguns métodos foram utilizados e os

resultados encontram-se a seguir. A maioria dos ensaios foi feita utilizando como amostra a fração

100 (179,5 m).

7.3.2.1 Método químico: hidrólise ácida

Foram feitos 8 ensaios de hidrólise ácida em diferentes condições (descritas na Tabela 15 da

seção 7.2.3) partindo-se da fração de mesh 100 de borra de café (Figura 46). Os resultados de

diâmetro médio e span estão apresentados na Tabela 17. Todas as hidrólises efetuadas resultaram em

redução do tamanho das partículas, em que o diâmetro médio superficial (D32) original de

aproximadamente 180 m foi reduzido para a faixa de 47 a 84 m, dependendo das condições do

ensaio. A polidispersidade (span) aumentou após todas as hidrólises realizadas, o que pode ser

devido às partículas de menor tamanho que foram geradas. Dentre os fatores avaliados foi possível

verificar que a temperatura de hidrólise teve maior influência que os demais fatores (tempo de

hidrólise, concentração de HCl e uso de ultrassom). O aumento da concentração de HCl causou

redução de tamanho somente utilizando a temperatura de 80ºC.

Figura 46. Efeito da A) concentração de HCl, B) tempo, C) temperatura e D) utilização de ultrassom durante a

hidrólise na distribuição de tamanho de partículas da borra de café.

130

Tabela 17. Diâmetro médio e span das partículas obtidas após as diferentes condições de hidrólise.

Hidrólises D32 (m) D43 (m) Span

Controle 178,4 ± 23,2 268,2 ± 19,5 1,32 ± 0,08

H1 69,9 ± 4,6 178,6 ± 7,1 2,19 ± 0,03

H2 58,6 ± 3,4 155,8 ± 7,8 2,37 ± 0,10

H3 47,1 ± 2,3 133,0 ± 7,2 2,66 ± 0,05

H4 55,1 ± 2,3 143,2 ± 6,9 2,57 ± 0,04

H5 57,4 ± 1,9 155,7 ± 5,0 2,45 ± 0,04

H6 54,3 ± 2,6 157,8 ± 12,0 2,74 ± 0,07

H7 78,3 ± 3,4 213,0 ± 5,7 1,93 ± 0,02

H8 83,7 ± 14,7 211,6 ± 18,4 2,05 ± 0,11

Apesar da considerável redução de tamanho alcançada, esta ainda está aquém do objetivo

inicial do projeto, que visava a produção de partículas na escala nanométrica. Alternativas para

tornar a hidrólise ácida mais efetiva seriam o aumento de temperatura (acima da temperatura de

ebulição da água) ou o uso de ácido mais forte, como o ácido sulfúrico. Porém, essas alternativas

podem ter como consequência a síntese de compostos indesejáveis durante o processo de hidrólise, o

que não é interessante para materiais cuja aplicação principal seria em produtos alimentícios.

7.3.2.2 Método físico: Homogeneizador a altas pressões

Primeiramente foi determinado o efeito de sucessivas passagens no homogeneizador

utilizando uma pressão de 600 bar (Figura 47). A primeira passagem levou a uma redução

substancial do tamanho médio das partículas, porém as passagens adicionais causaram redução de

tamanho pouco significativa. Isso significa que todos os processos de ruptura e desagregação

possíveis para a quantidade de energia aplicada ocorreram de forma eficiente na primeira passagem.

131

Figura 47. Distribuição de tamanho das partículas da Fração 100 (Dmédio =179,5 m) em função do número de

passagens em homogeneizador a alta pressão.

Também foi determinado o efeito de diferentes pressões de homogeneização na distribuição

de tamanho e polidispersão das partículas (Figura 48). Maiores pressões permitiram a obtenção de

partículas com menor tamanho médio e polidispersão, porém a redução de tamanho frente ao

aumento de pressão utilizado (de 200 a 1000 bar) pode ser considerada modesta.

Figura 48. Distribuição de tamanho das partículas da Fração 100 (Dmédio =179,5 m) em função da pressão de

homogeneização.

7.3.2.3 Método físico: Rotor-estator

O efeito de sucessivos passos em rotor-estator sobre a distribuição de tamanho da fração de

mesh 100 (Dmédio =179,5 m) encontra-se na Figura 49. Duas diferentes velocidades foram usadas

132

(14000 e 18000 rpm). Observou-se que esse aumento na velocidade do rotor não causou alterações

significativas nos resultados obtidos. Pode-se considerar que a redução de tamanho ocorreu até o

sétimo passo, pois após esse ponto o tamanho permaneceu praticamente constante. Porém, as

maiores reduções ocorreram até 3 passagens no rotor-estator. Já a polidispersidade aumentou com a

aplicação de alto cisalhamento até a quarta passagem, sendo que após isso uma pequena redução foi

verificada. No entanto, o valor final da polidispersidade foi ainda maior que o valor inicial da fração

100.

Figura 49. Diâmetro médio (D43) e polidispersão das partículas em função do número de passos em rotor-

estator da Fração 100 (Dmédio =179,5 m).

Também foi determinado o efeito do rotor-estator em outras frações de borra de café além da

fração 100. A Figura 50 mostra as reduções de tamanho alcançadas nas frações 14, 30, 70 e 100. É

possível observar que o perfil de redução foi semelhante para todas as frações. Através dos

resultados de D43 apresentados na Figura 50 é possível observar que menores partículas são

alcançadas partindo-se de frações menores. No entanto os valores de D32 (resultados não

apresentados) mostram que após 3 passagens todas as amostras chegam a um tamanho parecido, com

valores de D32 na faixa de 26 a 37 m aproximadamente. Esse resultado nos mostra que parece haver

um limite para a redução de tamanho que pode ser alcançada através desse método. É possível que as

frações de tamanhos maiores só contenham aglomerados maiores e que a redução de tamanho feita

pelo rotor-estator pode estar associada à quebra desses aglomerados, resultando em tamanhos muito

parecidos mesmo partindo de frações diferentes. Esse resultado também pode estar associado ao

limite de rompimento de acordo com a força aplicada, e à medida que o diâmetro da partícula

decresce, a força necessária para a quebra dessa partícula se torna muito maior.

133

Figura 50. Efeito de 3 passagens em rotor-estator nas frações de borra de café: F14 (3535 m), F30 (985 m),

F70 (385 m) e F100 (179 m).

O efeito da temperatura da dispersão durante a aplicação do rotor-estator também foi

determinado. Os resultados da Figura 51 mostram que a temperatura não influenciou

significativamente a redução de tamanho, ou seja, que as propriedades mecânicas das partículas não

mostraram grandes alterações dentro da faixa de temperatura estudada.

Figura 51. Diâmetro médio das partículas após a passagem da Fração 100 (Dmédio =179,5 m) em rotor-estator

utilizando diferentes temperaturas durante o processo (5, 25, 50 ou 70ºC).

Assim, quanto aos processos físicos utilizados (homogeneizador e rotor-estator) foi possível

observar que o uso da pressão mais alta (1000 bar) no homogeneizador resultou em partículas com

distribuição de tamanho bastante similar à obtida após 7 etapas no rotor-estator. Já o uso da menor

pressão (200 bar) resultou em partículas com tamanho similar ao obtido após 4 passos no rotor-

estator. É importante ressaltar que o uso do homogeneizador tem certas limitações, pois a dispersão

134

submetida a esse processo deve ser diluída e não pode conter partículas muito grandes, dada a

possibilidade de entupimento e queda de eficiência do equipamento. Assim, para as próximas etapas

optou-se pelo uso do rotor-estator, um equipamento mais simples de operar que o homogeneizador e

que permitiu a obtenção de resultados equivalentes.

Além disso, observando-se as curvas de distribuição de tamanho, tanto após o rotor-estator

quanto após o homogeneizador, foi possível verificar a presença de partículas com tamanhos

menores que 1 m (Tabela 18). Assim, o isolamento dessas partículas também foi avaliado para a

obtenção das nanopartículas de borra de café. De fato, verificou-se que uma filtragem simples em

papel de filtro permitia a obtenção de dispersões contendo partículas de tamanho nanométrico. Os

resultados a seguir mostram as características das dispersões após a filtragem (denominadas como

filtrados).

Tabela 18. Distribuição de tamanho das partículas presentes nas frações 400 e 100 da borra de café antes e

após tratamento em homogeneizador a alta pressão ou em rotor-estator.

7.3.2.4 Caracterização dos filtrados

Na Figura 52 estão apresentadas as distribuições de tamanho, potencial zeta, e morfologia das

dispersões de borra de café filtradas após múltiplas passagens em rotor-estator. As curvas de

distribuição de tamanho mostraram sempre um pico ao redor do valor de 100 nm, independente do

número de passagens em rotor-estator. Quanto ao potencial zeta, foi possível verificar que as

partículas do filtrado apresentaram maiores valores absolutos de potencial zeta que o apresentado

135

pela fração 400 (seção 7.3.1, Figura 43). A microscopia mostra a presença das partículas de tamanho

reduzido (micrométricas) e também a presença de alguns grandes aglomerados.

Figura 52. Distribuição de tamanho das partículas (quintuplicatas) dos filtrados obtidos após A) 2, B) 4, C) 7 e

D) 8 passagens em rotor-estator. E) Potencial zeta dos filtrados em função das passagens no rotor-estator. F)

Micrografia obtida em microscópio eletrônico de varredura do filtrado obtido após 8 passagens em rotor-

estator com magnitude de 1000x. Barra representa 10 m. A fração 100 foi a amostra utilizada para obtenção

das dispersões.

As dispersões obtidas tiveram sua concentração de partículas determinada através do método

de secagem e avaliação da massa seca. Um valor de 0,02% m/m de partículas em solução foi obtido.

Para viabilizar o uso dessas dispersões na formação de emulsões é preciso concentrar essas

136

dispersões de modo a atingir concentrações de no mínimo 1% m/m de partículas. Porém, não foi

possível realizar esta etapa durante este trabalho, ficando como sugestão para possíveis trabalhos

futuros.

Assim, nesse capítulo foram apresentadas algumas propriedades da borra de café bem como

os resultados referentes à sua redução de tamanho, realizada por métodos físicos ou por hidrólise

ácida. Esse trabalho continha em seu início duas principais propostas de estudos, as emulsões

estabilizadas por borra de café ou por gelana acilada. Devido aos resultados interessantes obtidos no

estudo da gelana como agente emulsificante, optou-se por fazer deste o foco do trabalho. Assim, o

estudo envolvendo a borra de café não teve prosseguimento neste projeto.

7.4 Conclusão

Na caracterização da borra de café foi observado que se trata de um material constituído de

partículas com diâmetro médio variando numa faixa bastante abrangente (37 m a 10 mm), com

morfologia heterogênea e potencial zeta negativo no pH natural (5,0). Não foram observadas

diferenças significativas de composição entre as frações separadas por tamanho através de peneiras.

Os resultados envolvendo a redução de tamanho das partículas de borra de café mostraram

que os métodos físicos utilizados foram mais eficientes na redução de tamanho das partículas que o

método químico, além de se constituírem como métodos mais seguros, em que não há a formação de

compostos com potencial toxicidade durante o processo. A redução de tamanho utilizando o método

simples de cisalhamento em rotor-estator seguida de separação das partículas através de filtragem foi

a melhor estratégia encontrada para obter nanopartículas de borra de café. Também foi observado

que a viabilidade do processo de redução de tamanho através de rotor-estator pode ser melhorada

através do uso de frações com maiores tamanhos médios. Apesar de uma metodologia para a

obtenção de nanopartículas de café ter sido determinada, a aplicação dessas partículas em emulsões

não foi realizada nesse trabalho, pois o rendimento do processo era muito reduzido.

137

8. REFERÊNCIAS

138

8. REFERÊNCIAS

AZOUAOU, N.; SADAOUI, Z.; DJAAFRI, A.; MOKADDEM, H. Adsorption of cadmium from

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