ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA DA SAÚDE DE LISBOA total v2.1.pdf · - Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa - Licenciatura em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica

- Instituto Politécnico de Lisboa -

- Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa -

Licenciatura em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica

Autor:

Amadeu Borges Ferro

Dezembro de 2010

Imunocitoquímica

ii

AAMMAADDEEUU BBOORRGGEESS FFEERRRROO

o Bacharel em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica pela Escola Superior de Tec-

nologia da Saúde de Lisboa.

o CESE em Metodologias do Ensino da Ciências pela Universidade Lusófona de Humanida-

des e Tecnologias.

o Mestre em Educação Médica pela Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.

o Professor Adjunto da Área Científica de Anatomia Patológica da Escola Superior de Tec-

nologia da Saúde de Lisboa.

o Coordenador da Licenciatura em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica da Esco-

la Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa.

o Responsável pela Unidade Curricular de Imunocitoquímica da Licenciatura em Anatomia

Patológica, Citológica e Tanatológica da Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lis-

boa.

iii

ÍNDICE GERAL

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................................................. v ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................................................. vii 1 IMUNOCITOQUÍMICA .......................................................................................................................... 1

1.1 Definição geral ....................................................................................................................... 1 1.2 Enquadramento histórico ...................................................................................................... 1 1.3 Principais aplicações .............................................................................................................. 3

2 ANTIGÉNIO E ANTICORPO ................................................................................................................... 5 2.1 Antigénio ................................................................................................................................ 5 2.2 Anticorpo ............................................................................................................................... 5 2.3 Imunoglobulinas .................................................................................................................... 6 2.4 Cadeias leves .......................................................................................................................... 9 2.5 Cadeias pesadas ................................................................................................................... 10

2.5.1 Cadeia pesada α - Alfa ..................................................................................................... 10 2.5.2 Cadeia pesada γ - Gama .................................................................................................. 10 2.5.3 Cadeia pesada δ - Delta ................................................................................................... 11 2.5.4 Cadeia pesada μ - Miu ..................................................................................................... 11 2.5.5 Cadeia pesada ε - Epsilon ................................................................................................ 12

2.6 Bases da especificidade: ...................................................................................................... 12 2.6.1 Forças de ligação entre Antigénio e Anticorpo ............................................................... 12

2.7 Características dos Anticorpos ............................................................................................. 13 2.7.1 Especificidade .................................................................................................................. 13 2.7.2 Afinidade .......................................................................................................................... 13

3 PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA ..................................................................................15 4 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS ................................................................................17

4.1 Imunogénios ........................................................................................................................ 17 4.2 Soros Policlonais .................................................................................................................. 17

4.2.1 Etapas da produção de Soros Policlonais ........................................................................ 18 4.2.2 Três tipos de soros policlonais ......................................................................................... 18

4.3 Soros Monoclonais ............................................................................................................... 19 4.3.1 Etapas da produção de Soros Monoclonais .................................................................... 20 4.3.2 Produção de Soros Monoclonais passo a passo .............................................................. 21

4.4 Soros Monoclonais versus Soros Policlonais ....................................................................... 23 4.4.1 Soros Monoclonais: ......................................................................................................... 23 4.4.2 Soros Policlonais: ............................................................................................................. 24

5 MANUSEAMENTO DE SOROS ............................................................................................................25 5.1 Recepção .............................................................................................................................. 25 5.2 Armazenamento .................................................................................................................. 25

5.2.1 Frascos contentores ........................................................................................................ 25 5.2.2 Temperatura .................................................................................................................... 25 5.2.3 Manipulação diária .......................................................................................................... 26

6 IMUNOFLUORESCÊNCIA ....................................................................................................................27 6.1 Métodos de Imunofluorescência ......................................................................................... 27

6.1.1 Fluorocromos ................................................................................................................... 28 6.1.2 União dos fluorocromos a anticorpos ............................................................................. 29 6.1.3 Microscópio de fluorescência .......................................................................................... 29 6.1.4 Microscopia de Imunofluorescência no diagnóstico ....................................................... 30

7 IMUNOENZIMOLOGIA .......................................................................................................................31 7.1 Enzimologia Básica ............................................................................................................... 31

7.1.1 Papel Catalisador ............................................................................................................. 32

iv

7.1.2 Características das Enzimas ............................................................................................. 33 7.1.3 Modelos De Interacção Enzima / Substrato .................................................................... 33 7.1.4 Factores que afectam a Actividade Enzimática ............................................................... 34 7.1.5 Classificação das Enzimas ................................................................................................ 35 7.1.6 Tipos de Inibição .............................................................................................................. 36

7.2 Imunoenzimologia ............................................................................................................... 37 7.2.1 Horseradish Peroxidase – HRP......................................................................................... 37 7.2.2 Calf intestine alkaline phosphatase ................................................................................. 40 7.2.3 Glucose Oxidase (Aspergillus niger)................................................................................ 43 7.2.4 Beta-Galactosidase (E. coli ) ............................................................................................ 44 7.2.5 Contraste ......................................................................................................................... 44

8 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS ....................................................................................................47 8.1 Método Directo .................................................................................................................... 49 8.2 Métodos indirectos .............................................................................................................. 49

8.2.1 Simples ............................................................................................................................. 49 8.2.2 Método PAP (Peroxidase Anti Peroxidase)...................................................................... 50 8.2.3 Método APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase) ................................ 51

8.3 Métodos de Avidina-Biotina ................................................................................................ 51 8.3.1 Enquadramento histórico ................................................................................................ 51 8.3.2 Principais características da avidina ................................................................................ 52 8.3.3 Principais características da Streptavidina ...................................................................... 53 8.3.4 Principais características da Biotina ................................................................................ 53 8.3.5 A ligação entre a avidina e a biotina ................................................................................ 53 8.3.6 Biotinilação ...................................................................................................................... 53 8.3.7 Marcação da avidina ........................................................................................................ 54 8.3.8 Métodos Imunocitoquímicos de avidina-biotina ............................................................ 54 8.3.9 Características das técnicas de avidina-biotina ............................................................... 55

8.4 Métodos de polímero .......................................................................................................... 57 8.4.1 Polímero de esqueleto interno ........................................................................................ 58 8.4.2 MicroPolímeros de enzimas ............................................................................................ 60

9 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS .............................................................................61 9.1 Higiene e segurança no Laboratório .................................................................................... 61 9.2 Cuidados com material e reagentes .................................................................................... 62 9.3 Diluição de soros de anticorpos ........................................................................................... 62 9.4 A diluição ideal ..................................................................................................................... 62 9.5 Teste de diluição de soros de Anticorpos ............................................................................ 63 9.6 Pipetagem ............................................................................................................................ 63 9.7 Cuidados gerais .................................................................................................................... 63

9.7.1 Preparação da Micropipeta ............................................................................................. 64 9.7.2 Como retirar uma amostra com uma micropipeta.......................................................... 65 9.7.3 Como expelir a amostra da micropipeta ......................................................................... 66

9.8 Tempo de duração da incubação ......................................................................................... 66 9.9 Temperatura de incubação .................................................................................................. 67 9.10 pH ......................................................................................................................................... 67

10 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS ............................................................................................................69 10.1 Fixação em Imunocitoquímica ............................................................................................. 69

10.1.1 Actuação do fixador .................................................................................................... 69 10.1.2 Fixação para cortes de crióstato ................................................................................. 69 10.1.3 Fixação em Imunocitoquímica de rotina ..................................................................... 70

10.2 Processamento histológico .................................................................................................. 71 10.3 Preparação de lâminas em IHQ ........................................................................................... 72

v

10.3.1 Cromo-alúmen gel ....................................................................................................... 72 10.3.2 Vectabond ................................................................................................................... 72 10.3.3 Lâminas com cargas electrostáticas ............................................................................ 72 10.3.4 3-Amino-Propil-Trietoxisilane (APES/TESPA/SILANE) ................................................. 72

10.4 Corte em Imunocitoquímica ................................................................................................ 72 11 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA .............................................................................................................75

11.1 Consequências da fixação .................................................................................................... 75 11.2 Digestão enzimática proteolítica ......................................................................................... 76 11.3 Recuperação antigénica de origem térmica ........................................................................ 76

12 INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS ............................................................................................79 12.1 Peroxidase Endógena ........................................................................................................... 79 12.2 Fosfatase Alcalina ................................................................................................................ 79 12.3 Glucose Oxidase ................................................................................................................... 79 12.4 Pontos susceptíveis de atrair proteínas ............................................................................... 79 12.5 Causas de marcação inespecífica ......................................................................................... 79

13 CONTROLO DE QUALIDADE ...............................................................................................................81 13.1 Avaliação da qualidade da Imunocitoquímica ..................................................................... 81

13.1.1 Preservação da morfologia do tecido ......................................................................... 81 13.1.2 Sensibilidade ............................................................................................................... 81 13.1.3 Especificidade .............................................................................................................. 82 13.1.4 Score final de qualidade da imunocitoquímica ........................................................... 83

14 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICAS ..............................................................................85 14.1 Principais antigénios detectados por imunocitoquímica ..................................................... 88

15 MARCAÇÃO MÚLTIPLA ......................................................................................................................93 15.1 Método simultâneo ............................................................................................................. 93 15.2 Método sequencial com desnaturação intercalar ............................................................... 93

16 CONCLUSÃO ......................................................................................................................................95 17 APÊNDICES ........................................................................................................................................97

17.1 Apêndice 1 - Adesivação de lâminas - APES......................................................................... 97 17.2 Apêndice 2 - Tampão EDTA 1 mM pH 8.0 ............................................................................ 97 17.3 Apêndice 3 - Tampão citrato, pH 6.0 ................................................................................... 97 17.4 Apêndice 4 - Tampão Tris/EDTA, pH9.0 ............................................................................... 98 17.5 Apêndice 5 - Solução de pepsina 0,4% pH 1/2 .................................................................... 98 17.6 Apêndice 6 - Solução de bloqueio da Peroxidase Endógena ............................................... 98 17.7 Apêndice 7 – Protocolo de Técnica Imunocitoquímica LSAB ............................................... 98 17.8 Apêndice 8 – Protocolo de Técnica Imunocitoquímica de Polímero Indirecto ................... 99

18 LISTA BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................................101

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 – Albert Coons. .......................................................................................................................... 1 Figura 2 – Anticorpo e Antigénio. ............................................................................................................ 6 Figura 3 – Aspecto esquemático de uma imunoglobulina. ..................................................................... 6 Figura 4 – Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima papaína. ...................................................... 7 Figura 5 – Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima pepsina. ...................................................... 7 Figura 6 – Zona de “hinge” do Anticorpo ................................................................................................ 8 Figura 7 – Localização das diferentes zonas estruturais do Anticorpo. .................................................. 9 Figura 8 – Estrutura esquemática da IgA. ............................................................................................. 10

vi

Figura 9 – Concentrações das diferentes Subclasses de IgG ao longo da vida. .................................... 11 Figura 10 – Representação esquemática da IgM. ................................................................................. 11 Figura 11 – Soro Policlonal .................................................................................................................... 17 Figura 12 – Soro Monoclonal ................................................................................................................ 19 Figura 13 - Kohler e Milstein ................................................................................................................. 20 Figura 14 – Produção de Soros Monoclonais. ....................................................................................... 21 Figura 15 – frascos contentores ............................................................................................................ 25 Figura 16 – Imunofluorescência. ........................................................................................................... 27 Figura 17 – Microscópio de Fluorescência. ........................................................................................... 29 Figura 18 - IMF positiva para IgG, em padrão linear. ............................................................................ 30 Figura 19 - IMF positiva para IgA em padrão granular ......................................................................... 30 Figura 20 – Microscópio óptico. ............................................................................................................ 31 Figura 21 – Enzimas e Co-factores. ....................................................................................................... 32 Figura 22 – Papel catalisador das enzimas numa reacção. ................................................................... 32 Figura 23 – Reacção de oxidação-redução ............................................................................................ 35 Figura 24 – Reacção de transferência ................................................................................................... 35 Figura 25 – Reacção de hidrólise ........................................................................................................... 35 Figura 26 – Reacção de liase ................................................................................................................. 36 Figura 27 – Reacção de isomerizacão.................................................................................................... 36 Figura 28 – Reacção de ligação ............................................................................................................. 36 Figura 29 – estrutura química da HRP. .................................................................................................. 38 Figura 30 – revelação por DAB. ............................................................................................................. 39 Figura 31 – revelação por AEC. .............................................................................................................. 40 Figura 32 – reacção de revelação da fosfatase alcalina por NBT-BCIP. ................................................ 41 Figura 33 – Revelação por NBT-BCIP. .................................................................................................... 41 Figura 34 – Revelação por New Fuchsin. ............................................................................................... 42 Figura 35 – Revelação por Fast Red TR. ................................................................................................ 42 Figura 36 – Hematoxilina de Harris. ...................................................................................................... 44 Figura 37 – Hematoxilina de Mayer. ..................................................................................................... 44 Figura 38 – Nuclear Fast Red. ................................................................................................................ 45 Figura 39 – Verde Metilo ....................................................................................................................... 45 Figura 40 – Método directo. .................................................................................................................. 49 Figura 41 – Método indirecto simples................................................................................................... 50 Figura 42 – Método PAP. ....................................................................................................................... 50 Figura 43 – Método APAAP. .................................................................................................................. 51 Figura 44 – Avidina e Biotina. ................................................................................................................ 52 Figura 45 – estrutura química da Biotina. ............................................................................................. 53 Figura 46 – Método LSAB/LAB .............................................................................................................. 55 Figura 47 – Método ABC/StrepABC ....................................................................................................... 55 Figura 48 – Bloqueio da biotina endógena. .......................................................................................... 57 Figura 49 – Polímero ............................................................................................................................. 58 Figura 50 – Estrutura química do dextrano. .......................................................................................... 58 Figura 51 – EPOS .................................................................................................................................... 59 Figura 52 – Polímero de esqueleto interno indirecto. .......................................................................... 60 Figura 53 – MicroPolímero de enzimas indirecto. ................................................................................ 60 Figura 53 – Soros pré-diluidos ............................................................................................................... 62 Figura 54 – Colocação de ponta na micropipeta. .................................................................................. 64 Figura 55 – Colocação da micropipeta. ................................................................................................. 64 Figura 56 – Utilização do polegar para pipetar. .................................................................................... 64 Figura 57 – Micropipeta e tubo ao nível dos olhos. .............................................................................. 65 Figura 58 – Pressão no êmbolo da micropipeta. ................................................................................... 65

vii

Figura 59 – Introdução da ponta no líquido. ......................................................................................... 65 Figura 60 – Libertar o êmbolo da micropipeta. ..................................................................................... 65 Figura 61 – Micropipeta e tubo ao nível dos olhos. .............................................................................. 66 Figura 62 – Ponta a tocar parede do tubo. ........................................................................................... 66 Figura 63 – Pressão no êmbolo da micropipeta. ................................................................................... 66 Figura 64 – Crióstato ............................................................................................................................. 70 Figura 65 – Cortes de parafina .............................................................................................................. 70 Figura 66 – Processador automático de tecidos ................................................................................... 71 Figura 67 - Algoritmo utilizado para tumores indiferenciados. ............................................................ 86 Figura 68 - Algoritmo utilizado para situações linfoproliferativas. ....................................................... 87 Figura 69 - Receptores de Estrogénio ................................................................................................... 88 Figura 70 - Receptores de progesterona ............................................................................................... 88 Figura 71 - Proteína p53 ........................................................................................................................ 88 Figura 72 - HER-2 ................................................................................................................................... 88 Figura 73 - Bcl-2 ..................................................................................................................................... 89 Figura 74 - CD3 ...................................................................................................................................... 89 Figura 75 - CD15 .................................................................................................................................... 89 Figura 76 - CD20 .................................................................................................................................... 89 Figura 77 - CD30 .................................................................................................................................... 90 Figura 78 - CD34 .................................................................................................................................... 90 Figura 79 - CD45 .................................................................................................................................... 90 Figura 80 - Ki67 ...................................................................................................................................... 90 Figura 81 - melanoma HMB45 ............................................................................................................... 91 Figura 82 - CL Kappa .............................................................................................................................. 91 Figura 83 - CL lambda ............................................................................................................................ 91 Figura 84 - vimentina ............................................................................................................................. 91 Figura 85 - CK 7 ...................................................................................................................................... 92 Figura 86 - PAN CK clones -AE1\AE3 ..................................................................................................... 92 Figura 87 - proteína S100 ...................................................................................................................... 92 Figura 88 - actina do músculo liso ......................................................................................................... 92 Figura 89 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gânglio linfático. ......................................................... 94 Figura 90 - Glicoforina A (castanho), CD20 (negro) e CD3 (vermelho) em baço. .................................. 94 Figura 91 - Insulina (castanho), Citoqueratina (negro) e CD34 (vermelho) em pâncreas. .................... 94 Figura 92 – CD20 (castanho), Citoqueratina (negro) e AML (vermelho) em ap. ileo-cecal. ................. 94

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1 – Marcadores em Imunocitoquímica ........................................................................................ 2 Tabela 2 – Pré-requisitos para Imunocitoquímica. ............................................................................... 16 Tabela 3 – Características dos Fluorocromos. ....................................................................................... 28 Tabela 4 – Grelha de avaliação de qualidade da imunocitoquímica ..................................................... 83 Tabela 5 – Factores de ponderação do Score Final da qualidade da imunocitoquímica. ..................... 84

IMUNOCITOQUÍMICA IMUNOCITOQUÍMICA

1

1 IMUNOCITOQUÍMICA

1.1 Definição geral

Nome dado ao conjunto de técnicas que utilizam anticorpos para identificar estruturas tecidulares

(que funcionam como antigénios) in situ.

O objectivo principal destas técnicas consiste em situar e identificar determinadas substâncias teci-

dulares. Assim, o princípio básico das referidas técnicas incide num conjunto de reacções específicas

(interacções anticorpo-antigénio), que conferem cor ou electrodensidade aos compostos que se pre-

tende estudar.

O valor prático desta área tecnológica específica da Anatomia Patológica, resulta da possibilidade de

conjugar um marcador com um anticorpo, outra proteína ou composto, sem provocar qualquer tipo

de dano à ligação específica estabelecida entre o anticorpo e o antigénio. Este facto propicia a obser-

vação microscópica dos locais onde se encontra o anticorpo e, consequentemente, o antigénio.

Podemos dizer que a Imunocitoquímica se apresenta como um poderoso meio de identificação de

várias estruturas celulares normais (através dos respectivos antigénios) e patogénicas (neoplásicas

ou não), bem como das consequências, a nível funcional e morfológico, da acção desses mesmos

elementos.

1.2 Enquadramento histórico

A 1ª técnica de Imunocitoquímica foi introduzida por Coons et al em 1941 (Figura 1), e consistiu na

conjugação de um Anticorpo com um corante fluorescente e sua utilização para identificação de

antigénios em cortes histológicos, o que significou a entrada numa nova dimensão no diagnóstico

Anatomopatológico.

Figura 1 – Albert Coons.

Fonte: http://www.nap.edu/readingroom.php?book=biomems&page=acoons.html


2

O 1º composto a ser conjugado com um Anticorpo foi o isocianato de fluoresceína e mais tarde sur-

giu o isotiocianato de fluoresceína (mais fácil de conjugar), gradualmente passaram a utilizar-se

novos compostos marcadores como outras moléculas fluorescentes: Isotiocianato de Rodamina

(vermelho); ou enzimas: Peroxidase (1966), Fosfatase alcalina (1978), Glucose oxidase (1979). O pro-

duto final destas reacções enzimáticas, pode ser tornado “electron-dense”, mas existem outros pro-

dutos que intrinsecamente já possuem esta capacidade, podendo ser utilizados em Imunocitoquími-

ca para microscopia electrónica: Ferritina (1961) e Ouro Coloidal (1971). Também se tornou possível

a marcação de Anticorpos com substâncias radioactivas, visualizando-se o resultado por Autoradio-

grafia (Tabela 1).

Grupo Nome Cor final obtida

Compostos fluorescentes

Isotiocianato de Fluoresceína Verde

Isotiocianato de Rodamina Vermelho

Enzimas

Peroxidase (HRP) Castanho

Fosfatase alcalina Vermelho

Glucose oxidase Azul

Metais pesados

Ferritina Negro

Ouro coloidal Negro

Compostos Radioactivos

14C -

35S -

3H -

Tabela 1 – Marcadores em Imunocitoquímica


3

Métodos por ordem cronológica de criação:

A. Método directo simples

B. Métodos indirectos:

a. Simples

b. Enzima anti-enzima:

i. PAP (peroxidase anti peroxidase)

ii. APAAP (fosfatase alcalina anti fosfatase alcalina)

c. Avidina – biotina

i. Streptavidina-biotina

ii. LSAB (Labelled streptavidin-biotin)

d. Polimero:

i. Polímero directo (EPOS®)

ii. Polímero indirecto (EnVision®, Picture®)

1.3 Principais aplicações

A Imunocitoquímica têm as suas principais aplicações ao nível de:

Estudo de neoplasias.

o Diagnóstico.

Diagnóstico de neoplasias de baixa diferenciação morfológica.

Caracterização da histogénese e patogénese.

Distinção do carácter maligno ou benigno de determinadas proliferações

celulares (ex. plasmócitos).

Caracterização da origem de metástases indiferenciadas.

o Prognóstico.

Identificação da presença de receptores hormonais (ex. ER e PgR).

Caracterização da expressão de proto-oncogenes (ex. Her2/neu).

Estudo de proteínas supressoras de tumor (ex. p53).

Caracterização da presença de indicadores de proliferação celular (ex. Ki67).

o Indicação terapêutica.

Quantificação da expressão de Her2/neu em neoplasia mamária (trastuzu-

mab).

Identificação da presença de CD117 em tumores do estroma gástrico (Gli-

vec).


4

Estudo de doenças infecciosas.

o Caracterização dos agentes etiológicos (bactérias, vírus, protozoários, etc.).

o Fenotipagem da reacção inflamatória envolvente.

Estudo de outras patologias.

o Caracterização de subtipos de amiloidose.

o Caracterização de produtos de secreção de células.

Hormonas.

Enzimas.

A Imunocitoquímica é uma disciplina em permanente evolução, devendo todos os investigadores que

se dedicam a esta actividade permanecer em constante procura, no sentido de estabelecer novos

protocolos, adaptando às suas necessidades toda a gama de reagentes disponível no mercado.

IMUNOCITOQUÍMICA ANTIGÉNIO E ANTICORPO

5

2 ANTIGÉNIO E ANTICORPO

2.1 Antigénio

Um antigénio é geralmente uma molécula de grandes dimensões, como por exemplo: uma molécula

proteica, lipídica, um hidrato de carbono ou um ácido nucleico, que uma vez introduzido no organis-

mo induz a uma resposta por parte do sistema imunitário, com produção de anticorpos específicos.

Tal deve-se ao facto de cada antigénio ser constituído por diversos radicais químicos, com capacida-

de de promover a produção de anticorpos ou imunoglobulinas.

Os antigénios são reconhecidos devido à sua estrutura tridimensional, resultante da sua nuvem de

electrões e não devido à sua estrutura química, sendo este facto consistente com a natureza das

afinidades antigénio-anticorpo. Cada uma destas moléculas apresenta na sua superfície, um ou mais

locais específicos de ligação ao anticorpo – determinante antigénico ou epítopo. Estas regiões de

ligação altamente específicas são constituídas por sequências (completas ou fragmentos) de proteí-

nas ou de polissacarídeos.

Tendo em conta que, segundo a sua constituição química os antigénios apresentam a capacidade de

estabelecer ligações com um dado anticorpo, todas as moléculas podem constituir potenciais antigé-

nios.

Releve-se que, quando essas moléculas evidenciam um peso molecular superior a 8000 Dalton, pos-

suem a capacidade de “actuar” por si só como antigénios. Por sua vez, substâncias de baixo peso

molecular podem ligar-se a moléculas com um peso molecular superior (os chamados haptenos), e

desempenhar as funções de antigénio.

2.2 Anticorpo

Nome dado às moléculas de natureza proteica que são produzidas maioritariamente pelos plasmóci-

tos em resposta à presença de material dentro do organismo que é por ele reconhecido como estra-

nho. A sua principal característica é combinar-se com o material indutor (antigénio) em condições

fisiológicas favoráveis à sua ligação (Figura 2). O local de ligação ao epítopo é chamado de paratopo.

Esta ligação constitui a base da Imunocitoquímica.


6

Figura 2 – Anticorpo e Antigénio.

Fonte: http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/antiBSpec.php

2.3 Imunoglobulinas

Classe de proteínas que possuem actividade de anticorpo. As imunoglobulinas podem ser visualiza-

das no microscópio electrónico e demonstram uma conformação em Y, que é tomada como exemplo

quando se quer representar um anticorpo (Figura 3).

Figura 3 – Aspecto esquemático de uma imunoglobulina.

Fonte: http://imgt.cines.fr/textes/IMGTeducation/QuestionsAnswers/_UK/PosterIGH/imagesIgH.html

2.3.1.1 Estrutura geral

Cada imunoglobulina possui uma estrutura básica constituída por 4 cadeias proteicas: 2 cadeias

pesadas idênticas e 2 cadeias leves idênticas, unidas por ligações dissulfídicas que mantêm a estabili-

dade do anticorpo.

A enzima papaína divide a molécula em (Figura 4):

- 2 Fragmentos com capacidade de ligação ao antigénio - Fab (fragment antigen binding)

- 1 Fragmento sem capacidade de ligação ao antigénio - Fc (fragment crystallisable)


7

Figura 4 – Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima papaína.

A molécula também pode ser quebrada pela enzima pepsina dando origem a um fragmento específi-

co: F(ab’)2, com capacidade de ligação ao antigénio e cristalização limitada (Figura 5). A maioria dos

anticorpos utilizados em imunocitoquímica são tratados desta forma, para evitar reactividade cruza-

da com a porção Fc que é reconhecida por alguns receptores de células humanas, podendo originar

falsos positivos e fundo (Key, 2006).

Figura 5 – Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima pepsina.

F(ab')

2

pFc'

Quebra pela pepsina

Fab

Fc

Quebra pela papaína


8

Por redução e acidificação pode-se dividir uma imunoglobulina nos seus constituintes básicos

(cadeias pesadas e leves).

Possuem uma zona móvel denominada Hinge (dobradiça), que permite ao Anticorpo uma mudança

de ângulo de orientação de modo a existir uma maior capacidade de ligação ao antigénio (Figura 6).

Figura 6 – Zona de “hinge” do Anticorpo

Fonte: http://www.odec.ca/projects/2003/lange3c/public_html/hinge.gif

Nas cadeias leves e pesadas existem 3 tipos de zonas (Figura 7):

- Zonas constantes

- Zonas variáveis

- Zonas hipervariáveis

Zona constante da cadeia pesada- CH: determina o tipo de cadeia pesada em questão e consequen-

temente o tipo de imunoglobulina.

Zona constante da cadeia leve – Cl: determina o tipo de cadeia leve em questão.

Zonas variáveis - zonas de ligação do Anticorpo.

Zonas hipervariáveis: dentro das zonas variáveis são responsáveis pela ligação altamente específica a

um antigénio.


9

Figura 7 – Localização das diferentes zonas estruturais do Anticorpo.

Fonte: http://www.cartage.org.lb/en/themes/sciences/lifescience/generalbiology/physiology/LymphaticSystem/Antibodymediated/Antibodymediated.htm

Distribuição das zonas hipervariáveis entre os aminoácidos:

Cadeia pesada Cadeia leve

31-37 23-34

86-91 50-56

101-110 89-97

Presença de ligações dissulfídicas entre os aminoácidos:

Cadeia pesada Cadeia leve

22-98 23-98

Isto vai permitir a organização espacial da molécula do Anticorpo de modo a formar áreas específicas

de ligação (zona hiperváriavel) expostas ao contacto com o Antigénio.

2.4 Cadeias leves

A distribuição de cadeias leves difere em todas as classes e subclasses de Imunoglobulina, bem como

entre diferentes espécies animais, no entanto cada Anticorpo possui duas cadeias leves de um só

destes tipos:

K - Kappa

λ - Lambda

No ser humano as cadeias leves K constituem cerca de 65% do total de cadeias leves.

Zona variável

Zona constante

Zona hiperva-riável


10

2.5 Cadeias pesadas

As cadeias pesadas de cada imunoglobulina diferem nas propriedades antigénicas e estruturais e

definem a classe e subclasse de cada molécula.

2.5.1 Cadeia pesada α - Alfa

Está presente na IgA. Esta existe nas secreções sero-mucosas – saliva, lágrimas, suor, corrimento

nasal, secreções gastrointestinais, etc., onde possui funções de defesa contra o ataque por microor-

ganismos. Existe nestes líquidos sob a forma de dímero estabilizado contra a proteólise por combi-

nação com outra proteína - o componente secretor- sintetizado por células epiteliais e que possui

uma cadeia peptídica simples. A dimerização é efectuada por conjugação com uma outra cadeia pro-

téica –cadeia J (Figura 8).

Figura 8 – Estrutura esquemática da IgA.

Fonte: http://www.drpeterjdadamo.com/wiki/wiki.pl?action=browse;oldid=IgA;id=Immunoglobulin_A

Tem como função principal ligar-se aos microorganismos, diminuindo a sua capacidade de aderência

às células epiteliais, impedindo assim a sua entrada.

Possui duas subclasses: IgA1, IgA2 (com diferentes ligações dissulfídicas).

2.5.2 Cadeia pesada γ - Gama

Está presente na IgG. Esta é a imunoglobulina que existe em maior quantidade e possui capacidade

de atravessar a barreira placentária: passa da mãe para o feto e defende-o nas primeiras semanas de

vida. É a imunoglobulina com maior capacidade de difusão, sendo a primeira responsável pela neu-

tralização imediata das toxinas bacterianas e pela promoção da fagocitose. Existem 4 subclasses –

IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 – possuindo, cada uma delas, cadeias pesadas ligeiramente diferentes, na cons-

tituição por aminoácidos e nas ligações dissulfídicas. Também possuem diferentes concentrações

serológicas ao longo da vida do ser humano (Figura 9).

Componente secretor


11

Figura 9 – Concentrações das diferentes Subclasses de IgG ao longo da vida.

2.5.3 Cadeia pesada δ - Delta

Está presente na IgD. Esta foi a última imunoglobulina a ser descoberta. Possui menor capacidade de

resistência à digestão proteolítica, ao contrário das outras imunoglobulinas, o que explica o seu curto

tempo de vida no plasma sanguíneo. Possui uma elevada percentagem de glúcidos. Encontra-se na

superfície de linfócitos sanguíneos com a função de activador/inibidor.

2.5.4 Cadeia pesada μ - Miu

Está presente na IgM. As moléculas de IgM são polímeros de 5 unidades de anticorpos, unidos por

uma cadeia J (Figura 10). Existe principalmente na corrente sanguínea e possui principal apetência

para antigénios com vários epítopos. Tem alta capacidade citolítica e resposta rápida, estando envol-

vida nos casos de resposta a bacterémia.

Figura 10 – Representação esquemática da IgM.

Fonte: http://bioweb.wku.edu/courses/Biol328/Ig_structure.html


12

2.5.5 Cadeia pesada ε - Epsilon

Está presente na IgE. Esta existe em baixa proporção no organismo humano. Forma uma segunda

barreira de defesa contra o ataque de microorganismos nas superfícies externas do organismo. Está

presente em afecções por parasitas. É responsável por alguns dos sintomas de alergia atópica (reac-

ção inflamatória).

2.6 Bases da especificidade:

Utilizando haptenos (moléculas que não estimulam a produção de Anticorpo específicos, mas que se

combinam com estes depois de formados) demonstrou-se que a configuração de um Antigénio, é

mais importante que a sua natureza química. Assim, este é reconhecido devido à sua estrutura tridi-

mensional, resultante da sua nuvem de electrões e não devido à sua estrutura química, sendo isto

consistente com a natureza das afinidades Antigénio-Anticorpo que não envolvem ligações covalen-

tes.

2.6.1 Forças de ligação entre Antigénio e Anticorpo

Todas as forças de atracção entre Antigénio e Anticorpo possuem em comum a necessidade de pro-

ximidade entre moléculas para se criarem.

2.6.1.1 Electrostáticas

Devem-se à atracção entre grupos iónicos carregados com cargas contrárias.

2.6.1.2 Pontes de Hidrogénio

São relativamente fracas e reversíveis e formam-se entre grupos hidrofílicos como OH e NH2 e COOH,

dependendo da proximidade das duas moléculas que transportam estes grupos. São fortemente

condicionadas pela electronegatividade dos elementos.

2.6.1.3 Hidrofóbicas

Da mesma forma que as gotas de óleo na água podem juntar-se todas numa só, grupos hidrofóbicos

não polares (ex. Imunoglobulinas) tendem a fazer o mesmo. Se dois grupos hidrofóbicos de 2 proteí-

nas se aproximarem o suficiente, de tal forma a excluírem todas as moléculas de água entre elas, a

superfície em contacto com a água é reduzida e as proteínas adquirem um estado de energia mais

baixo (menor entropia) do que aquele que existia enquanto estavam separadas, ou seja, surge uma

atracção entre elas.

As forças hidrofóbicas contribuem em mais de 50% da força total da ligação Antigénio-Anticorpo.


13

2.6.1.4 Van der Waals

Estão ligadas a perturbações temporárias da nuvem de electrões de uma molécula, que podem for-

mar um dipolo eléctrico que induz uma perturbação dipolar em outra molécula, tendo assim os dois

dipolos uma força de atracção entre eles.

2.7 Características dos Anticorpos

2.7.1 Especificidade

Característica de um Anticorpo que lhe permite reconhecer e estabelecer ligações com Antigénios

individualizados e específicos. Depende da proximidade entre Antigénio-Anticorpo e da complemen-

taridade entre Antigénio-Anticorpo (Modelo chave-fechadura). A alta complementaridade Anticorpo-

Antigénio vai estar relacionada com a proximidade entre grupos específicos no Antigénio e no Anti-

corpo que estabelecem ligações muito fortes entre si, por perfeita correspondência.

2.7.2 Afinidade

Característica que define a força de ligação entre Antigénio-Anticorpo.

Muitas complementaridades

Alta afinidade

Elevada força de ligação

Poucas complementaridades

Baixa afinidade

Baixa força de ligação


14

IMUNOCITOQUÍMICA PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA

15

3 PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA

Qualquer tipo de tecnologia aplicada necessita de respeitar determinados requisitos, de modo a que

possa ser realizada de uma forma correcta e eficaz. As técnicas de Imunocitoquímica não fogem a

esta regra, uma vez que, para serem aplicadas correctamente, devem também obedecer a algumas

regras básicas, essenciais para o seu sucesso.

A primeira condição a respeitar é que o antigénio deve permanecer insolúvel mas disponível no teci-

do, no decorrer da técnica. Note-se que essa insolubilidade implica a sua permanência no local origi-

nal. A par disso, deve também manter inalteradas as características que vão ser reconhecidas pelo

anticorpo. Daí que nalguns casos, seja necessário proceder à realização de métodos de recuperação

antigénica.

A segunda condição é a marcação específica pelo anticorpo primário, isto é, o anticorpo deverá ape-

nas ligar-se ao antigénio pretendido (marcação específica) e não a outros elementos estranhos em

simultâneo (marcação inespecífica). O que se pretende obter é uma marcação específica do antigé-

nio com ausência de marcação inespecífica de fundo. Todavia, para que tal seja possível, surge a ter-

ceira condição: é fundamental conhecer os atributos dos tipos de soros a aplicar. Note-se que, o

conhecimento das várias características do tipo de soro a utilizar tais como: clonalidade, classe ou

subclasse da imunoglobulina, especificidade, reactividade, condições de manuseamento, revelam-se

essenciais para a interpretação de resultados, bem como para a avaliação da qualidade da técnica.

Finalmente surge a quarta e última condição: para uma correcta e eficaz realização destas técnicas é

imprescindível o uso de uma marcação estável com uma intensidade suficiente, que não suscite

qualquer tipo de dúvidas relativamente à presença ou ausência do antigénio no tecido (Tabela 2).

IMUNOCITOQUÍMICA PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA

16

PRÉ-REQUISITO CARACTERÍSTICAS

Antigénio disponível (pre-

servado ou recuperado).

O antigénio deverá permanecer insolúvel mas disponível.

A sua insolubilidade implica a sua permanência no local original.

O antigénio deverá manter as suas características reconhecíveis pelo anti-

corpo (com ou sem métodos de recuperação)

Métodos de recuperação/digestão mais usuais:

Digestão enzimática.

Aquecimento a altas temperaturas em solução de recuperação.

Marcação específica. O anticorpo deverá ligar-se ao Antigénio pretendido.

Anticorpo bem caracteri-

zado.

Deverão ser conhecidos todos os elementos teciduais que despoletam

resposta por parte do anticorpo.

Deverá ser perfeitamente conhecida toda a sequência de ligação do Anti-

corpo ao Antigénio.

Deverá conhecer-se a espécie animal onde foi produzido o Anticorpo.

As características do Anticorpo deverão ser estabelecidas:

Classe.

Subclasse.

Modo de produção.

Qual o antigénio que o despoletou.

Produto final ou marca-

dor facilmente visualiza-

vel.

Fluoresceína ou rodamina.

Peroxidase (HRP).

Fosfatase alcalina.

Glucose oxidase.

Entre outros…

Tabela 2 – Pré-requisitos para Imunocitoquímica.

IMUNOCITOQUÍMICA SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS

17

4 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS

4.1 Imunogénios

Um imunogénio é um antigénio, sintético ou natural, utilizado para produzir anticorpos em massa. A

fonte e preparação de um imunogénio são muito importantes para se obter a melhor qualidade de

reagentes para técnicas Imunocitoquímicas. Existem dois grandes grupos de imunogénios: péptidos

sintéticos e proteínas purificadas. Os péptidos sintéticos têm a vantagem de possuir uma sequência

de aminoácidos conhecida, contudo, pode não ser possível alcançar laboratorialmente a conforma-

ção tridimensional da proteína nativa, o que pode originar falsos negativos se a aplicação do anticor-

po criado a partir deste imunogénio não for devidamente caracterizada. Pode ainda ser impossível

recriar determinado antigénio in vitro visto que as modificações pós-traducionais representam mui-

tas vezes um importante processo para a conformação final de um antigénio in vivo. O uso de anti-

génios purificados evita muitos destes problemas, mas origina outros. O processo de purificação é

muitas vezes difícil de optimizar, podendo o produto final conter demasiadas proteínas contaminan-

tes. Um outro problema ao utilizar antigénios purificados, prende-se com a presença de outros epí-

topos que não são específicos para a obtenção do anticorpo pretendido. Os anticorpos são produzi-

dos por imunização de um animal (coelho, ratinho, cabra, cavalo, etc.) com o antigénio pretendido. O

animal reage à imunização produzindo anticorpos para o antigénio pretendido (Ramos-Vara, 2005).

4.2 Soros Policlonais

Os Soros Policlonais possuem Anticorpos produzidos por várias células, reagindo assim com diversos

epítopos de um Antigénio (Figura 11). O animal mais utilizado para a produção de soros policlonais é

o coelho, mas podem ser utilizados outros: cabra, porco, ovelha, cavalo, etc.

Figura 11 – Soro Policlonal

Fonte: http://www.dako.com/dist/08002_ihc_staining_methods_5ed.pdf


18

4.2.1 Etapas da produção de Soros Policlonais

Quanto melhores forem as técnicas de purificação tanto melhor será a qualidade do soro policlonal.

O uso de animais de laboratório pouco expostos a ambientes adversos (altamente contaminados por

Antigénio) facilita a obtenção de soros com poucos Anticorpos previamente desenvolvidos contra

outros Antigénios.

Sequência habitual de produção:

1. Escolha do Antigénio.

2. Purificação do Antigénio:

a. Precipitação.

b. Centrifugação.

c. Diálise.

d. Cromatografia.

e. Electroforese.

3. O Antigénio é injectado no animal escolhido.

a. As injecções são repetidas a intervalos regulares de modo a manter a concentração

de Anticorpos específicos alta.

4. É colhido sangue do animal testado, normalmente sem o sacrificar.

5. O soro é separado dos elementos celulares do sangue por centrifugação ou outros métodos

adequados.

6. O soro pode ser purificado de modo a permanecerem somente os Anticorpos desejados.

a. Métodos de purificação:

i. Para separação das outras proteínas do sangue:

1. Precipitação salina.

2. Cromatografia por troca iónica.

ii. Para separação de outros anticorpos:

1. Cromatografia de afinidade.

2. Técnicas de absorção por fase sólida ou líquida.

4.2.2 Três tipos de soros policlonais

Existem três tipos de soros policlonais diferenciados pela etapa de selecção e purificação em que se

encontram.

4.2.2.1 Soro total/“whole serum”

Obtido após extracção dos elementos celulares:


19

o Soro que se obtém logo a seguir à centrifugação.

o Possui diversos Anticorpos e proteínas circulantes (albumina, Alfa, beta globulinas).

o Se não se conseguir um soro mais purificado este é utilizado, apesar de não ser o ideal.

4.2.2.2 Soro de fracção de imunoglobulinas/“Ig fraction”

Obtido após extracção das proteínas (excepto imunoglobulinas):

o Possui diversos Anticorpos específicos e não específicos

4.2.2.3 Soro de afinidade Isolada/“Affinity isolated antibodies”

Obtido após extracção das imunoglobulinas não específicas para o antigénio pretendido:

o Possui Anticorpos específicos e vestígios de contaminantes (proteínas e outras imunoglobuli-

nas).

o Nem sempre se consegue este tipo de soros.

o Como é muito mais puro que os outros soros, tem a possibilidade de oferecer uma melhor

marcação

4.3 Soros Monoclonais

Um soro monoclonal é um reagente que é o produto de um único clone de plasmócitos imortalizados

e que, como tal, é uniforme em estrutura, especificidade e afinidade, podendo ser produzido em

relativa grande quantidades.

Os Anticorpos de um determinado clone são imunoquimicamente idênticos e reagem com um

determinado epitopo de um Antigénio, contra o qual foram produzidos (Figura 12). O animal mais

utilizado para obter clones de Anticorpos monoclonais é o ratinho.

Figura 12 – Soro Monoclonal


Estes reagentes revolucionaram muitas áreas de trabalho experimental, industrial e clínico, tendo

proporcionado um Prémio Nobel da Medicina e Fisiologia aos seus maiores impulsionadores - Kohler

e Milstein - em 1984 (Figura 13).


20

Figura 13 - Kohler e Milstein

Fonte: http://sachemdisplacementchromatography.typepad.com/.a/6a012876728c57970c013482986309970c-pi

4.3.1 Etapas da produção de Soros Monoclonais

A técnica mais utilizada para a produção de soros monoclonais consiste, resumidamente, nos

seguintes passos (Figura 14):

A. Imunização de um animal de modo a serem produzidos Anticorpos para um determinado Anti-

génio que é introduzido por injecções repetidas.

B. Colheita de plasmócitos no baço desse animal.

C. Fusão desses plasmócitos (curto tempo de vida) com células de mieloma (longo tempo de

vida).

D. Colocação individual das células resultantes da fusão em cultura de modo a poder recolher-se

os Anticorpos por elas produzidos.

E. Testes para os Anticorpos em causa, no sentido de se saber quais as suas características.

F. Manutenção das culturas (clones) que demonstrem características úteis e destruição das res-

tantes.

G. Recolha sistemática dos Anticorpos produzidos pelo clone que passam a constituir o soro

monoclonal e que podem ser utilizados em IHQ.


21

Figura 14 – Produção de Soros Monoclonais.

Fonte: http://www.nature.com/nchembio/journal/v4/n6/images/nchembio0608-326-F1.jpg

4.3.2 Produção de Soros Monoclonais passo a passo

1 - Imunização

Nome dado ao processo pelo qual se obtém uma resposta imunológica, por parte de um ser vivo,

para um determinado antigénio.

1.1 Escolha do animal a ser imunizado.

Definida pelo tipo de células de mieloma a utilizar posteriormente, pois sabe-se que fusão de DNA

entre espécies iguais permite melhores resultados.

1.2 Escolha da porta de entrada para a imunização.

Definida pelas características do Antigénio (solúvel ou insolúvel). Caso o Antigénio seja solúvel pode

ser utilizada a injecção endovenosa, caso seja insolúvel deve ser utilizada a injecção intraperitoneal,

intradérmica ou intramuscular.

1.3 Determinação da capacidade do Antigénio para produzir uma resposta imunológica.

Esta característica pode ser manipulada nalguns casos de modo a obter o máximo de resposta com

um mínimo de Antigénio. Pode-se, por exemplo, adicionar ao Antigénio determinados reagentes,

como o hidróxido de alumínio, que permitem a formação de um "depósito" de Antigénio no animal

que lenta, mas consistentemente, vai provocar a resposta imunológica sem que seja necessário o uso

de injecções repetidas.

1.4 Determinação dos factores que afectam a classe e a afinidade dos Anticorpos produzi-

dos.


22

Existem alguns factores que não podem ser controlados:

A natureza do Antigénio - se possuir elevado teor em glúcidos tende a despoletar uma resposta sob a

forma de IgM.

As características individuais de cada animal, que vão estar envolvidos no tipo de imunoglobulina

produzido após a imunização.

Mas podem ser utilizadas algumas estratégias de modo a ser produzido o tipo de Imunoglobulina

pretendido:

Se for utilizada uma única injecção para produzir a resposta imunitária esta vai ser sob a for-

ma de IgM.

Se forem utilizadas várias injecções separadas por um espaço de tempo relativamente pro-

longado a resposta tende a ser sob a forma de IgG. Isto é muito útil pois estes soros são mais

procurados devido às menores dimensões desta molécula, que possibilitam uma maior capa-

cidade de difusão tecidual, e também devido à facilidade com que é digerida pela pepsina de

modo a ser eliminada a porção Fc que pode originar falsas marcações. Mas, por vezes, é útil

possuir um soro de IgM para um antigénio, que pode ser utilizado em técnicas de dupla mar-

cação simultaneamente com um soro de IgG para outro Antigénio.

Finalmente é importante ter em conta que os Anticorpos com maior afinidade para o Antigé-

nio são produzidos tardiamente e portanto deve-se esperar algum tempo entre a primeira

injecção e a colheita de plasmócitos.

2 - Escolha das células de mieloma a utilizar.

2.1 Tipos existentes.

Estão disponíveis comercialmente diversos tipos de linhas celulares de mieloma. Os mais utilizados

são o Ag8 para ratinho e o Y0 para ratazana, pois não produzem qualquer tipo de cadeia, permitindo

assim que todos os Anticorpos produzidos após a fusão sejam do tipo anteriormente produzido pelo

plasmócito imunizado.

3 - Métodos de fusão entre um grupo de células de mieloma e um grupo de plasmócitos.

O método mais utilizado é o que utiliza o polietileno glicol (PEG) como diminuidor da tensão superfi-

cial entre as membranas celulares das células do mieloma e as células do baço do animal utilizado,

que, entretanto foi sacrificado para permitir a sua retirada. Uma vez diminuída a tensão superficial as

células fundem as suas membranas celulares e numa posterior mitose fundem o seu DNA o que

resulta numa célula híbrida que mantém a imortalidade de uma célula-mãe e a capacidade de produ-

zir anticorpos específicos da outra célula-mãe. Esta célula híbrida prolifera e dá origem a um clone.

4 - Selecção HAT.


23

Após a junção, em meio de cultura, dos grupos de células de mieloma e dos plasmócitos são aplica-

das as técnicas de fusão anteriormente referidas e daí resultam três tipos de células:

a) Células híbridas - o objectivo desta técnica.

b) Plasmócitos não hibridados - Que morrem em pouco tempo.

c) Células de mieloma - Que são eliminadas pela adição ao meio de cultura de HAT (Hipoxanti-

na, Aminopterina e Timidina), pois não possuem enzimas para contornar o efeito destes

elementos tóxicos.

5 - Selecção de clones

As células híbridas são testadas por etapas até se individualizarem clones produtores de Anticorpos

para o Antigénio pretendido. Normalmente os testes são feitos por IHQ, aplicando os sobrenadantes

da cultura de tecidos onde repousam as células híbridas a testar como soros primários de uma técni-

ca de imunofluorescência indirecta. (As células libertam para o líquido sobrenadante da cultura os

Anticorpos que produzem).

6 - Produção alargada de soro monoclonal.

A partir do momento em que um sobrenadante de um clone é intensivamente testado e é compro-

vada a sua viabilidade, este pode ser utilizado para IHQ de rotina. A cultura pode então produzir soro

durante muito tempo, desde que mantida em boas condições. O sobrenadante é assim regularmente

recolhido e comercializado pelo seu produtor. Existe ainda a hipótese de inocular o clone de células

(ou parte) na cavidade abdominal de um ratinho e recolher regularmente o líquido ascítico que se

desenvolve e que é muito rico em Anticorpos específicos.

7 - Purificação, digestão e conjugação de Anticorpos.

Podem ser realizadas estes tipos de intervenções utilizando técnicas específicas para esse fim.

8 - Armazenamento de Anticorpos.

Os soros podem ser conservados durante longos períodos (anos) em câmaras frigoríficas a -70ºC,

mas uma vez descongelado poderá permanecer a 4ºC durante alguns meses ou, no caso de possuir

conservantes específicos (Ex. Sodium Azide), alguns anos.

4.4 Soros Monoclonais versus Soros Policlonais

4.4.1 Soros Monoclonais:

Vantagens:

Alta especificidade.

Alta afinidade.

Determinação de um só epítopo de um Antigénio.


24

Alta homogeneidade.

Ausência de Anticorpos não específicos.

Maior facilidade de caracterização.

Baixa variabilidade de lote para lote.

Desvantagens:

Alto custo relativo.

Identificação de só um epítopo de um Antigénio. Esse epítopo pode estar destruído (por ex.:

pela fixação) mesmo que exista a molécula total do Antigénio..

Se o soro não foi produzido contra um epítopo específico do Antigénio que se quer detectar

e se existirem outros Antigénio com esse epítopo, a grande vantagem da alta especificidade

será inútil.

Relativa dificuldade de obtenção em grandes quantidades.

4.4.2 Soros Policlonais:

Vantagens:

Baixo custo relativo.

Capacidade para detectar um Antigénio mesmo na ausência de vários dos seus epitopos .

Relativa facilidade de obtenção em grandes quantidades.

Desvantagens:

Relativa baixa especificidade.

Determinação de vários epitopos que podem pertencer a vários Antigénio..

Relativa baixa homogeneidade.

Possibilidade de presença de Anticorpos não específicos.

Maior dificuldade de caracterização.

Relativa alta variabilidade de lote para lote.

IMUNOCITOQUÍMICA MANUSEAMENTO DE SOROS

25

5 MANUSEAMENTO DE SOROS

Para se conseguir o máximo de qualidade nas marcações de Imunocitoquímica é importante que na

utilização de todos os soros se sigam as regras de manuseamento e armazenamento que são indica-

das pelo fabricante na "bula" que os acompanha.

5.1 Recepção

Assim que se recebe um soro no laboratório é muito importante que se proceda ao seu armazena-

mento, de acordo com as indicações do fabricante (Normalmente é indicado o seu armazenamento

no frigorífico a 4ºC.). Cada soro deverá ser registado numa folha do laboratório onde se indicam: o

lote, data de validade, data de recepção e número da nota de encomenda. Estes dados serão úteis

em caso de posterior reclamação.

5.2 Armazenamento

Os principais factores a ter em conta quando se fala em armazenamento de soros são: os frascos

contentores, a temperatura e a manipulação diária.

5.2.1 Frascos contentores

Deverão ser utilizados frascos de polipropileno, policarbonato ou de vidro borossilicado, pois pos-

suem uma baixa capacidade de absorção de proteínas. É também útil utilizar frascos transparentes

pois permitem uma rápida inspecção (Figura 15).

Figura 15 – frascos contentores

Fonte: http://www.favorgen.com/products_for_res_use.htm

5.2.2 Temperatura

Este factor é talvez o mais determinante quando se fala em conservação de anticorpos.

Todas as indicações dos fabricantes deverão ser seguidas criteriosamente em relação a esta condi-

cionante. Os frigoríficos e arcas congeladoras utilizados para armazenar anticorpos devem ter indica-

IMUNOCITOQUÍMICA MANUSEAMENTO DE SOROS

26

ção digital da temperatura que desenvolvem e ser monitorizados regularmente para prevenir even-

tuais flutuações. Deverá existir um sistema de "Back-up" para compensar eventuais falhas de ener-

gia. É também de evitar o "descongelar/congelar" diário dos soros que requerem congelação, man-

tendo-se uma pequena quantidade de soro a 4ºC para uso de curta duração.

5.2.3 Manipulação diária

O tratamento adequado dos soros durante a sua utilização previne a sua deterioração ou contamina-

ção.

Deve-se manter o reagente afastado do calor e da luz solar directa, para além de se proceder à sua

devolução atempada ao local de armazenamento após utilização. É também importante utilizarem-se

pontas descartáveis para recolha de soros.

IMUNOCITOQUÍMICA IMUNOFLUORESCÊNCIA

27

6 IMUNOFLUORESCÊNCIA

6.1 Métodos de Imunofluorescência

Nome dado aos métodos de ICQ que utilizam como substâncias propiciadoras da visualização do

antigénio moléculas fluorescentes (Figura 16). Estes métodos exigem a utilização de um microscópio

especial para a visualização das marcações, com uma lâmpada que emite radiação no campo dos

ultravioletas (480-590 nm).

Figura 16 – Imunofluorescência.

Fonte: http://www.microscopyu.com

As técnicas de imunofluorescência foram introduzidas por Albert Coons e pelos seus colaboradores

em 1941 e, desde então, são aplicáveis tanto para diagnóstico como para investigação. São de uso

limitado no diagnóstico de rotina, sendo por isso pouco utilizados, uma vez que as moléculas fluores-

centes perdem actividade com o passar do tempo, não permitindo a conservação das lâminas em

arquivo.

A imunofluorescência é uma forma de luminescência, entendo-se esta última como a emissão de luz

que se produz a partir de uma fonte de energia não térmica. A fluorescência primária ou autofluores-

cência é aquela que certos tecidos ou orgãos apresentam sem haver necessidade de serem modifica-

dos. Por exemplo, a lâmina elástica das artérias mostra autofluorescência em determinadas substân-

cias. Podemos induzir fluorescência em determinadas substâncias que não tenham esta capacidade

(fluorescência secundária) marcando anticorpos dirigidos contra antigénios tecidulares com fluoro-

cromos.


28

As técnicas de imunofluorescência realizam-se quase sempre com tecido congelado porque o proces-

so de fixação com formol e a inclusão em parafina alteram a estrutura dos tecidos, provocam um

aumento dos fenómenos de autofluorescência e o bloqueio de alguns determinantes antigénicos.

6.1.1 Fluorocromos

Fluorocromos são substâncias que têm a propriedade de absorver altas fontes de energia preceden-

tes da radiação UV e do espectro de luz visível. Assim, quando estas substâncias são iluminadas, há

uma libertação gradual de energia que se prolonga mesmo sem a fonte luminosa. Este fenómeno

denomina-se fosforescência.

Os fluorocromos mais utilizados nas técnicas de imunofluorescência são a fluoresceína e a rodamina.

A fluoresceína usa-se quase sempre sob a forma de isotiocianato (FITC), que absorve a luz azul e emi-

te fluorescência verde. A rodamina usa-se na forma de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC);

absorve luz verde e emite fluorescência vermelha (Tabela 3).

Tabela 3 – Características dos Fluorocromos.

Para ser utilizado em imunofluorescência, um fluorocromo deverá ter determinadas características:

a) Não deve interferir com a relação antigénio-anticorpo;

b) O seu armazenamento deverá ser estável;

c) Deverá encontrar-se disponível na sua forma purificada;

d) A sua emissão deverá ser máxima no espectro do visível;

e) O comprimento de onda da luz absorvida e da luz emitida devem ser muito diferentes para

que possam diferenciar-se facilmente.

Os fluorocromos podem ligar-se de forma covalente aos anticorpos (sem alterar as suas proprieda-

des) e estes últimos ligam-se depois aos antigénios. Assim, os fluorocromos ligados a anticorpos

específicos constituem um meio útil para visualizar zonas onde ocorra a reacção antigénio-anticorpo.

Também podem marcar-se o anticorpos específicos marcados com fluorocromos distintos (marcação

múltipla).


29

6.1.2 União dos fluorocromos a anticorpos

O tipo de ligação depende do tipo de fluorocromo. O FITC e o TRITC ligam-se ao anticorpo através de

ligações covalentes com os grupos amina e carboxilo dos anticorpos. Esta ligação deve ser feita em

pH alcalino e devem usar-se moléculas purificadas para que os fluorocromos não se liguem a outras

proteínas e originem falsa marcações.

6.1.3 Microscópio de fluorescência

Para a visualização das técnicas de imunofluorescência deve usar-se um microscópio de fluorescência

(Figura 17). Este tipo de microscópio tem incorporado:

1. Fonte de luz UV e visível;

2. Filtros primários que seleccionam o comprimento de onda que vai incidir sobre a amostra;

3. Filtro secundário que selecciona os comprimentos de onda emitidos dentro do espectro de

luz visível, deixando passar apenas a luz emitida por uma substância fluorescente.

Figura 17 – Microscópio de Fluorescência.

Fonte: http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy.html

A fonte de luz pode ser uma lâmpada de vapor de mercúrio a alta pressão ou uma lâmpada halogé-

nea de quartzo. A primeira produz mais energia e é preferível quando se pretende uma imunofluo-

rescência de baixa intensidade. No entanto, é dispendiosa, há risco de explosão e perde a intensida-

de com o tempo. Existem dois tipos de microscópios de imunofluorescência: o microscópio de

transmissão e o de luz de incidência.


30

6.1.4 Microscopia de Imunofluorescência no diagnóstico

A utilização da imunofluorescência para o diagnóstico das doenças glomerulares do rim é

importante, principalmente, porque algumas delas devem seu nome a particularidades dessa

técnica. As glomerulopatias podem apresentar-se com imunofluorescência negativa (doenças

glomerulares não imuno mediadas). Porém a maioria apresenta imunofluorescência positiva para

anticorpos anti- IgA, IgG, IgM ou complementos (C1, C3 ou C4) que pode ter padrão linear ou padrão

granular (cerca de 95%). Quando o padrão da imunofluorescência é fortemente linear é feito o

diagnóstico de Doença Glomerular por Anticorpos Anti Membrana Basal Glomerular, essa doença

quando associada ao componente pulmonar é chamada de Doença de Goodpasture (Figura 18).

Figura 18 - IMF positiva para IgG, em padrão linear.

Quando o padrão é granular evidencia-se outra patologia glomerular cujo diagnóstico exige a técnica

de imunofluorescência que é a Glomerulopatia de IgA, quando a imunoglobulina detectada pela

imunofluorescência é a IgA (Figura 19).

Figura 19 - IMF positiva para IgA em padrão granular

IMUNOCITOQUÍMICA IMUNOENZIMOLOGIA

31

7 IMUNOENZIMOLOGIA

Dá-se o nome de Imunoenzimologia aos métodos de Imunocitoquímica que utilizam, como substân-

cias propiciadoras da visualização do antigénio, enzimas. São os métodos mais utilizados actualmen-

te, pois permitem a visualização em microscópio óptico comum e a obtenção de preparações perma-

nentes (Figura 20). Possuem como principal vantagem a visualização da estrutura geral do tecido em

simultâneo com a marcação imunocitoquímica.

Figura 20 – Microscópio óptico.

Fonte: http://www.microscopyu.com/museum/e600pol.html

7.1 Enzimologia Básica

As enzimas são catalisadores biológicos muito potentes e eficazes, responsáveis pela maior parte das

reacções químicas que mantém a homeostase. Como possuem um papel muito importante ao nível

dos processos dos seres vivos, tornam-se chaves importantes no diagnóstico clínico e terapêutica.

As enzimas podem ser classificadas com base na sua composição:

Enzimas Simples: compostas apenas por proteínas

Enzimas Complexas: quando compostas por proteínas e uma pequena quantidade de molé-

culas orgânicas.

As enzimas complexas também são denominadas de holoenzimas, cujo componente proteico é

denominado de apoenzima e o componente não-protéico de coenzima ou de grupo prostético

(ex.protoporfirina de ferro da peroxidase). Quando a coenzima quando é um ião ou molécula inor-

gânica, denomina-se co-factor (Figura 21).


32

Figura 21 – Enzimas e Co-factores.

http://www.bio12.com/ch6/RemedialEnzymes.htm

As enzimas podem ser encontradas em todos os tecidos e fluidos do corpo, como por exemplo:

Enzimas intracelulares – catalisam as reacções da “cascata metabólica”.

Enzimas da membrana plasmática - regulam a catálise dentro das células em resposta a

sinais extracelulares.

Enzimas do Sistema Circulatório são responsáveis pela regulação da coagulação sanguínea.

7.1.1 Papel Catalisador

Um catalisador é uma substância que acelera uma reacção química, diminuindo a energia de activa-

ção. Como catalisadores as enzimas actuam em pequena quantidade, não levando a cabo reacções

que sejam energicamente desfavoráveis, não modificam o sentido dos equilíbrios químicos, mas sim

acelerando o seu processo (Figura 22).

Figura 22 – Papel catalisador das enzimas numa reacção.

Fonte: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/fe/Carbonic_anhydrase_reaction_in_tissue.svg

ENZIMAS COMPLEXAS EXEMPLO DE COFACTOR


33

7.1.2 Características das Enzimas

As enzimas possuem a capacidade de distinguir de forma específica o substrato sobre o qual agem

(Especificidade do Substrato) e cada reacção é catalisada por uma enzima específica (Especificidade

de Acção).

A reacção entre enzima e substrato descreve-se da seguinte forma:

ENZIMA (E)+ SUBSTRATO (S) COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO (CES)

CES E + PRODUTO FINAL (P)

A acção enzimática caracteriza-se pela formação de um complexo que representa o estado de transi-

ção, logo é necessário a formação do complexo enzima - substrato antes da obtenção do produto

final.

O substrato une-se ao centro activo da enzima através de numerosas interacções como, por exem-

plo: pontes de hidrogénio, ligações electrostáticas e ligações hidrofóbicas.

O centro activo é uma pequena porção da enzima, constituída por uma série de aminoácidos que

interactuam com o substrato.

7.1.3 Modelos De Interacção Enzima / Substrato

7.1.3.1 Modelo de Fisher – Chave/Fechadura

Elaborado por Fisher no início do século passado, é baseado no princípio de que as enzimas são mui-

to específicas, e só actuam sobre determinados substratos, catalisando reacções. Fisher sugeriu que

esta especificidade é devida ao facto dos substratos encaixarem perfeitamente no centro activo

das enzimas, provocando a abertura ou fecho desta. De acordo com este modelo o centro activo é

uma estrutura rígida, havendo assim um ajuste perfeito entre enzima e o substrato.

7.1.3.2 Modelo De Koschland - Encaixe Induzido

De acordo com este modelo, a enzima e o centro activo não são estruturas rígidas. O substrato que

tem afinidade para determinada enzima liga-se ao centro activo, modificando-o, de modo que haja

um encaixe perfeito do substrato à enzima. Exerce-se assim uma força sobre o substrato, quebrando

ligações da molécula ou estabelecendo outras (reacções de catálise ou de síntese). Assim se explica a

especificidade relativa das enzimas, isto é, uma enzima pode catalisar alguns substratos com dife-

renças estruturais pequenas.


34

7.1.4 Factores que afectam a Actividade Enzimática

Existem diversos factores que afectam a actividade enzimática. Em seguida são destacados os princi-

pais.

7.1.4.1 Concentração enzimática

A velocidade de transformação do substrato é proporcional à concentração da enzima.

7.1.4.2 Concentração do substrato

A actividade enzimática aumenta com o aumento da concentração do substrato até à saturação da

enzima.

7.1.4.3 pH

O pH pode afectar de diferentes maneiras:

O centro activo pode conter aminoácidos com grupos ionizados que podem variar com o pH

do meio.

A ionização dos aminoácidos que não estão no centro activo podem provocar modificações

na conformação das enzimas.

O substrato pode ser afectado por variações do pH.

Um pH extremo modifica irreversivelmente a estrutura da enzima, desnaturando a proteína e em

certos casos modifica a ligação entre a apoenzima e a coenzima.

Algumas enzimas apresentam variações peculiares, como por exemplo: a pepsina do estômago

apresenta um pH ideal = 2, enquanto que a fosfatase alcalina do intestino apresenta um pH ideal=12

7.1.4.4 Temperatura

A temperatura influencia fortemente a actividade enzimática. Uma determinada temperatura repre-

senta o máximo da actividade enzimática, mas quando se supera um valor considerável (normal-

mente acima dos 50ºC) a actividade enzimática cai bruscamente, pois a enzima sofre uma desnatu-

ração.

7.1.4.5 Concentração de sais e iões da solução envolvente

Algumas enzimas necessitam que estejam presentes iões metálicos – Mg++, Mn++, Zn++ - que fun-

cionam como agentes electrofílicos.


35

7.1.5 Classificação das Enzimas

7.1.5.1 Oxiredutases

Actuam em reacções de Oxidação – Redução. Nestas reacções há uma molécula se reduz e outra

que se oxida (Figura 23).

Figura 23 – Reacção de oxidação-redução

Fonte: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/enzimas.htm

7.1.5.2 Tranferases

Actuam pela Transferência de grupos funcionais que podem ser aldeídos, alquilos, glucosilos ou fos-

fatos (Figura 24). São denominadas Quinases.

Figura 24 – Reacção de transferência


7.1.5.3 Hidrolases

Actuam em reacções de Hidrólise (Figura 25). Transformam os polímeros em monómeros, actuando

sobre:

ligações éster

ligações glucosídicas

ligações peptidícas

ligações C-N

Figura 25 – Reacção de hidrólise


36


7.1.5.4 Liases

Produzem adição a duplas ligações entre C e C; entre C e O; entre C e N (Figura 26).

Figura 26 – Reacção de liase


7.1.5.5 Isomerases

Catalisam reacções de Isomerização (Figura 27).

Figura 27 – Reacção de isomerizacão


7.1.5.6 Ligases

Participam na formação de ligações com gasto de ATP entre C e O; C e S; C e N; C e C (Figura 28).

Figura 28 – Reacção de ligação


7.1.6 Tipos de Inibição

Podem existir dois tipos de inibição:

Inibição Competitiva – ocorre em enzimas que tem a capacidade de se ligar a mais do que um

substrato. Se o inibidor se liga à enzima ao nível do centro activo, diminui a sua afinidade

para o substrato.


37

Inibição Não-Competitiva – o inibidor liga-se à enzima no centro alostérico (zona específica

extra-centro activo), levando a uma alteração da configuração do centro activo, o que faz

com que a enzima tenha dificuldade a ligar-se ao centro activo do substrato.

7.2 Imunoenzimologia

Os métodos de marcação imunoenzimáticos utilizam reacções do tipo enzima-substrato para obte-

rem produtos finais coloridos a partir de cromogénios incolores.

As enzimas mais utilizadas são:

Peroxidase (Horseradish Peroxidase)

Fosfatase Alcalina ( Calf intestine Alkaline Phosphatase )

Glucose Oxidase

Beta–Galactosidase

São critérios para selecção de enzimas em Imunocitoquímica:

A enzima deve existir em grandes quantidades na natureza numa forma altamente pura e ser

pouco dispendiosa.

A Conjugação não deve anular a actividade enzimática.

A enzima conjugada deve ser estável em solução

A actividade da enzima endógena não deve interferir em grande escala com a técnica.

Os produtos da reacção enzimática devem ser facilmente detectados e permanecerem está-

veis durante longos períodos.

7.2.1 Horseradish Peroxidase – HRP

Características gerais:

Peso molecular: 40 Kdal

pH ideal: 6.0 – 6.5

pH estável : 4.0 – 10.0

Estabilidade Térmica: abaixo dos 60º C

Composição: glicoproteína com uma mole de protoheme IX

Açucares neutros e amino representam 18%

Ponto isoeléctrico:7.2

Especificidade: grande especificidade para o H2O2


38

Estabilidade: bastante estável. Como pó liofilozado, pode ser guardado durante muitos

anos no frigorífico. Em solução aquosa (1mg/ml) pode ser mantida mais do que um ano

a 5º C, sem diminuição da actividade.

Obtida da raiz do Rábano, contém um grupo de base férrica (hematina) no seu centro activo, pos-

suindo em solução uma cor castanha (Figura 29). A hematina da peroxidase forma um complexo

com o peróxido de hidrogénio provocando a sua decomposição em H2O e Oxigénio atómico.

A peroxidase também pode oxidar outras substâncias como os nitratos e os polifenois. Em ICQ a

peroxidase oxida indirectamente os cromogénios ao reagir com o peróxido de hidrogénio. Os cromo-

génios utilizados são substâncias que na sua forma oxidada são coloridas e estáveis, conferindo cor

ao local da reacção. Existe sob a forma de peroxidase endógena em várias estruturas humanas como

os glóbulos vermelhos.

Figura 29 – estrutura química da HRP.

Fonte: http://www.york.ac.uk/depts/chem/staff/jrls.html

Pode ser conjugada com outras proteínas de duas maneiras:

Ligação covalente:

o Pode ser realizada utilizando o glutaraldeído.

o Estão envolvidos os grupos E-amino da lisina e os grupos N-terminal de ambas as

proteínas.

Ligação não-covalente:

o ligação anticorpo / peroxidase através da porção Fab (Complexo PAP).

7.2.1.1 Substratos e Cromogéneos

A actividade da peroxidase em presença de um substrato resulta, numa primeira fase, na formação

de um complexo enzima-substrato:

PEROXIDASE + PERÓXIDO DE HIDROGÉNIO COMPLEXO ES


39

E, posteriormente, na oxidação de um dador de electrões que cede electrões e permite que a reac-

ção prossiga.

DADOR DE ELECTRÕES

COMPLEXO ES PEROXIDASE + H2O +O 2-

Existem alguns dadores de electrões que uma vez oxidados se tornam coloridos e portanto são

designados cromogénios. Este facto associado à capacidade de precipitarem no local da reacção após

a oxidação, torna-os muito úteis em Imunocitoquímica.

Os Cromogénios mais utilizados para a peroxidase são:

3,3 – Diaminobenzidina Tetrahydrochloride (DAB)

Gera um composto castanho, insolúvel em álcool e noutros solventes orgânicos (Figura 30).

Figura 30 – revelação por DAB.

A sua oxidação causa a polimerização, permitindo a reacção com o tetróxido de ósmio, aumentando

a intensidade da cor e permitindo o surgimento da densidade para os electrões (útil em ICQ de

microscopia electrónica).

O composto final pode mudar a sua cor para negro caso seja utilizado, em simultâneo com a oxida-

ção, o cloreto de níquel. Pode também intensificar-se a cor castanha caso seja utilizado, em simultâ-

neo com a oxidação, o sulfato de cobre.

3-Amino-9-Etilcarbazol (AEC)

Após oxidação forma um produto final vermelho-rosado, solúvel no álcool (Figura 31). Devem ser

utilizados um meio de montagem e um contraste aquosos.


40

Figura 31 – revelação por AEC.

4 – Cloro-1-Naftol (CN)

Forma um produto final azul. É solúvel em álcool e noutros solventes orgânicos. Tende a difundir-se

do local onde precipita.

p- fenilenodiamino Dihydrochloride/pirocatecol

Também chamado de Reagente de Hanker – Yates. Forma um produto final azul a negro, insolúvel no

álcool e em solventes orgânicos. Possui características semelhantes ás do DAB.

7.2.2 Calf intestine alkaline phosphatase


Peso Molecular: 100Kdal

pH ideal: 9.8

Ponto Isoeléctrico: 5.7

Activadores : Zn, Mg++, Ca++

Tem com função principal remover por hidrólise e transferir grupos fosfatos de ésteres orgânicos,

quebrando as ligações P-O. É formada uma ligação temporária entre a enzima e o substrato – PO4.

Estas reacções são activadas por diversos iões metálicos como: Mg++, Mn++ e Ca++.

Não era muito utilizada em ICQ até surgir o método APAAP, que tem como principal vantagem o

facto de evitar a actividade endógena da peroxidase. É recomendada a sua utilização em esfregaços e

tecidos com muito sangue. Para a inibição da fosfatase alcalina endógena do osso, rim, fígado e gló-

bulos brancos, recomenda-se a utilização de Levamisole, que é adicionado à solução de revelação.

7.2.2.1 Substratos e Cromogéneos

A enzima hidrolisa os ésteres de fosfato-naftol (substratos) em compostos fenólicos e fosfatos. Os

fenois reagem com os sais incolores de Diazonium (cromogénio) para produzir corantes azo.


41

Podem ser utilizadas diferentes combinações de substratos e cromogénios:

5-Bromo-4-Cloro-Indolil Fosfato ( BCIP ) - substrato

Nitro Blue Tetrazolium (NBT) - cromogénio

O BCIP é hidrolisado pela fosfatase alcalina levando à formação de um composto temporário que

posteriormente é dimerizado para produzir um corante de índigo. O NBT é reduzido a formazan pela

dimerização do composto anterior (Figura 32).

Figura 32 – reacção de revelação da fosfatase alcalina por NBT-BCIP.

Fonte: http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/References/the-handbook/Ultrasensitive-Detection-

Technology/Enzyme-Labeled-Fluorescence.Par.35337.Image.-1.0.1.gif

Esta combinação de reagentes forma um precipitado azul a negro virtualmente insolúvel em solven-

tes orgânicos (Figura 33).

Figura 33 – Revelação por NBT-BCIP.

Fonte: http://www.maxim.com.cn/show/product/showlist.asp?id=128&tid=&tid1=4

New Fucsin (cromogénio)

Produz um tom avermelhado, sendo insolúvel no álcool e nos solventes orgânicos (Figura 34). Possui

uma intensidade bastante forte.


42

Figura 34 – Revelação por New Fuchsin.

Fonte: http://www.maxim.com.cn/show/product/showlist.asp?id=128&tid=&tid1=4

Naftol As-Mx Fosfato + Fast Blue BB

Naftol As-Mx Fosfato + Fast Red Tr

O Naftol As-Mx Fosfato pode ser utilizado na sua forma ácida ou de sal sólido (substrato). Os cromo-

génios Fast-Red TR e Fast Blue BB produzem uma cor vermelha (Figura 35) e azul Brilhante respecti-

vamente, sendo solúveis em álcool e nos solventes orgânicos.

Figura 35 – Revelação por Fast Red TR.

Fonte: http://home.primus.com.au/royellis/hmb45.html

Outros Substratos:

o Naftol As-BI Fosfato

o Naftol AS-TR Fosfato

Outros Cromogénios:

o Fast Red LB

o Fast Garnet GBC


43

7.2.3 Glucose Oxidase (Aspergillus niger)


Peso molecular: 185 Kdal.

pH: 5.5.

Especificidade: altamente específica para Beta-D-glucose.

Inibidores: Ag, Hg, Cu.

Estabilidade: as preparações são estáveis durante anos se guardadas no frio, sendo as

soluções racionalmente estáveis sobre uma variedade de condições.

Considerada com uma flavoenzima, pois o seu grupo prostético é composto por flavina.

20% da sua constituição são carbohidratos.

No seu estado puro contém polissacáridos como a amilase, maltase e sucrase, que

podem contribuir para falsos resultados.

Sendo uma holoenzima, é constituída por duas subunidades idênticas, que estão ligadas entre si por

ligações não covalentes. Existem cerca de 120 pontos de contacto entre os dímeros centrados à volta

de 11 resíduos, formando cada um ligações de hidrogénio. Não existe nos mamíferos, o que significa

que não existe actividade enzimática endógena. Possui pouca sensibilidade quando comparada com

a fosfatase alcalina e com a peroxidase.

7.2.3.1 Cromogéneos

Existem muitos sais cujos produtos de reacção são apropriados para as técnicas de imunoenzimolo-

gia que utilizam a glucose oxidase.

INT – vermelho – solúvel no álcool. As lâminas devem ser montadas em meio de montagem

aquoso

NBT – azul a negro – virtualmente insolúvel no álcool. Produz bons resultados em métodos

de dupla marcação

Tetranitro Blue Tetrazolium – TNBT- Castanho - Insolúvel no álcool. É mais estável no que se

refere a preparações permanentes.


44

7.2.4 Beta-Galactosidase (E. coli )


Peso Molecular: 500 Kd.

pH: 6 –8.

Estabilidade: é estável 4-6 meses quando guardada a 5º C.

Quando se utiliza um pH 7 não é necessário particular cuidado com a Beta-Galactosidase endóge-

na. Recorrendo ao 5-Bromo-4-3-indoxil-D-Galactoside com substrato, pode ser obtido um precipita-

do de cor azulada. È pouco utilizada em ICQ

7.2.5 Contraste

As colorações de contraste são escolhidas tendo em conta a cor do produto final obtido na técnica de

ICQ.

As Colorações de contraste recomendadas para os cromogénios anteriormente referidos são:

Hematoxilina de Harris – cor azul (Figura 36).

Figura 36 – Hematoxilina de Harris.

Hematoxilina de Mayer – cor azul (Figura 37).

Figura 37 – Hematoxilina de Mayer.


45

Nuclear Fast Red ou Kernechtrot – cor vermelha.

Figura 38 – Nuclear Fast Red.

Fonte: http://www.vetmed.fu-berlin.de/einrichtungen/institute/we01/studium/histologie/uebungen_ss/index.html

Methyl Green ou verde de metilo – cor verde

Figura 39 – Verde Metilo

Fonte: http://www.pathology-skin-rjreed.com/html/amf__dendritic_cells_.htm


46

IMUNOCITOQUÍMICA MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS

47

8 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS

Uma vez que os anticorpos, como proteínas que são, não possuem cor própria nem outra forma de

serem visualizados nas preparações histológicas e citológicas, foi necessário encontrar forma de lhes

conferir uma maneira de serem observáveis quando se encontram ligados aos antigénios que se que-

rem detectar em Anatomia Patológica.

Existem actualmente diversos métodos aplicáveis a Imunocitoquímica. A sua invenção teve pratica-

mente sempre o mesmo denominador comum: a procura de uma ampliação de sinal mais potente.

Todos ambicionaram continuamente associar o máximo de moléculas visualizáveis a uma molécula

de Anticorpo-Antigénio.

Se no início, com Coons, a ampliação de sinal era medíocre, o que limitava a exequibilidade da Imu-

nocitoquímica a situações excepcionais e esporádicas, isso não toldou as potencialidades destas téc-

nicas, tendo desde sempre os investigadores procurado identificar quantidades cada vez mais ínfi-

mas de antigénio.

Ao longo dos anos têm sido desenvolvidas abundantes formas de aumentar o sinal (cor, fluorescên-

cia, etc.) que está associado ao antigénio tecidual. Algumas dessas metodologias não singraram e

nunca obtiveram uma expansão relevante, outras tiveram muita aplicabilidade no seu tempo mas

foram ultrapassadas e não são praticamente utilizadas nos dias de hoje. No entanto, todas possuem

as suas vantagens e desvantagens que devem ser conhecidas para uma compreensão mais profunda

da Imunocitoquímica.


48

Símbolos utilizados:

- Antigénio

- Anticorpo primário

- Anticorpo secundário

- Complexo PAP

- Complexo APAAP

- avidina / streptavidina

- Biotina

- Biotina com braço espaçador

- Marcador

- polímero


49

8.1 Método Directo

Neste método é utilizado somente um anticorpo primário, que possui o marcador. Isto significa que o

anticorpo que possui o marcador se liga directamente ao antigénio (Figura 40).

Figura 40 – Método directo.

Vantagens:

Simples

Rápido

Desvantagens:

Pouca ampliação de sinal, pois somente existe uma molécula de marcador por molécula de

antigénio.

Dispendioso, pois obriga à existência de Anticorpos primários com marcador.

8.2 Métodos indirectos

8.2.1 Simples

Neste método são utilizados dois tipos de anticorpos (Figura 41):

O primário, que é dirigido contra o antigénio que se quer detectar.

O secundário, que é dirigido contra as imunoglobulinas da espécie animal onde foi produzido

o Anticorpo primário. O Anticorpo secundário está marcado com a substância que permite a

visualização do complexo.

Exemplos de Anticorpos secundários:

RAM (CAR) – Rabbit anti mouse Igs – utilizado no caso do anticorpo primário ser produzido

em ratinho (geralmente monoclonal).

SAR (PAC) – Swine anti rabbit Igs – utilizado no caso do anticorpo primário ser produzido em

coelho (geralmente policlonal).


50

Figura 41 – Método indirecto simples.

Vantagens:

Mais sensível do que o método directo, pois há maior número de moléculas de marcador por

cada molécula de Antigénio.

Maior versatilidade do que o método directo, pois basta possuir um anticorpo secundário

marcado – não é necessário que os primários estejam marcados.

Mais económico.

Desvantagens:

Mais demorado e complexo do que o método directo.

8.2.2 Método PAP (Peroxidase Anti Peroxidase)

A sequência de actuação é a seguinte (Figura 42):

É aplicado o Anticorpo primário dirigido contra o antigénio a detectar.

É aplicado o Anticorpo secundário ou de ponte dirigido contra as imunoglobulinas da espécie

animal em que foi produzido o anticorpo anterior.

É aplicado o Complexo PAP (enzima-anti-enzima).

Figura 42 – Método PAP.


51

O complexo PAP deve ser produzido na mesma espécie animal do Anticorpo primário de modo a que

o Anticorpo secundário possa fazer a ponte entre os dois.

O Anticorpo secundário deve ser aplicado em excesso de modo a manter uma porção Fab ligada ao

Anticorpo primário e a outra porção Fab livre para se poder ligar ao complexo PAP.

Vantagens:

Possui maior sensibilidade do que os métodos anteriormente descritos.

Não utiliza Anticorpo marcados

Permite o aumento das diluições do Anticorpo 1º e consequentemente a diminuição da mar-

cação de “fundo”.

Desvantagens:

Mais demorado do que os métodos descritos anteriormente.

Mais complexo do que os métodos descritos anteriormente.

8.2.3 Método APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase)

Método semelhante ao PAP, mas que utiliza como marcador a fosfatase alcalina em vez da peroxida-

se deste último (Figura 43).

É bastante utilizado em situações que pela sua natureza impeçam ou dificultem a utilização dos

métodos de imunoperoxidase, como, por exemplo, lâminas de citologia com muitos eritrócitos.

Figura 43 – Método APAAP.

8.3 Métodos de Avidina-Biotina

8.3.1 Enquadramento histórico

Os métodos de Avidina-Biotina são utilizados desde a década de 40 em cromatografias bioquímicas

que se baseavam na grande afinidade entre a avidina e a biotina. Só em 1977 se dá a aplicação do

sistema avidina-biotina em Imunocitoquímica, por Heggeness e Ash em métodos de imunofluores-


52

cência. Em 1980 Hsu et al introduziram os métodos de Imunocitoquímica pelo Complexo Avidina-

biotina (ABC), que permitiram a grande popularização destas técnicas e ainda hoje são utilizados.

Posteriormente surgiram novas inovações como por exemplo:

Utilização da streptavidina.

Técnica da Labelled Avidin-biotin (LAB)

Técnica da Labelled Streptavidin-biotin (LSAB).

Todos os métodos de avidina-biotina se baseiam em 4 princípios gerais:

1. A extraordinária afinidade existente entre a avidina e a biotina que se ligam formando um

complexo praticamente indissociável.

2. A possibilidade existente de ligação entre a biotina e outras moléculas, como enzimas e anti-

corpos (anticorpos biotinilados).

3. Possibilidade de se marcar a avidina com uma variedade de substâncias como enzimas,

metais pesados ou fluorocromos.

4. Possibilidade de utilização da avidina como ponte entre duas moléculas biotiniladas.

a. Ex. um Anticorpo e uma enzimas (peroxidase)

8.3.2 Principais características da avidina

Trata-se de uma glicoproteína básica (p.m 67 Kd), presente na clara do ovo em grandes quantidades

e que, apesar de existir em alguns ovíparos, não tem expressão nos mamíferos. É constituída por

quatro subunidades, que por sua vez são constituídas cada uma, por uma cadeia polipeptídica sim-

ples de 128 aminoácidos.

A principal característica da estrutura terciária desta molécula é a formação de quatro “bolsas”, cada

uma correspondente a uma das referidas subunidades, e que têm a capacidade de se ligar a uma

molécula de biotina (Figura 44).

Figura 44 – Avidina e Biotina.

Apesar das suas úteis características, a avidina possui uma desvantagem que é a presença de resí-

duos oligossacáridos na sua estrutura. Estes elementos induzem a ligação da avidina a estruturas


53

tecidulares de carga eléctrica negativa, o que provoca o aparecimento de marcação inespecífica de

fundo. Para suplantar este problema implantou-se a utilização de streptavidina.

8.3.3 Principais características da Streptavidina

A streptavidina é uma proteína de p.m 60 Kd, extraída da cultura de Streptomyces avidinii, não pos-

suindo resíduos oligossacáridos. Esta molécula é igual à avidina em tudo o resto e pode ser utilizado

em ICQ.

8.3.4 Principais características da Biotina

Também conhecida por vitamina H, é uma proteína muito simples de apenas 244 d, existente em

grande quantidade na gema do ovo (Figura 45). A sua simplicidade permite a sua ligação em cada

uma das “bolsas”, que existem na molécula de avidina para a qual é específica.

Figura 45 – estrutura química da Biotina.

Fonte: http://www.csapt.it/b/bi/biotina.html

8.3.5 A ligação entre a avidina e a biotina

A ligação entre a avidina e a biotina é devida a ligações químicas não covalentes e é extremamente

rápida e forte, sendo uma das ligações mais duradouras das existentes na Natureza. Só pode ser

quebrada em situações extremas como a utilização de um meio de pH extremamente baixo (pH 1.5).

8.3.6 Biotinilação

Processo pelo qual a biotina é conjugada com uma variedade de moléculas por exemplo: enzimas,

ácidos nucleicos ou anticorpos. O pequeno tamanho da molécula da biotina, permite a ligação às

referidas estruturas sem que ocorram alterações ao nível das suas características imunológicas ou

físicas. Pode até ser efectuada a múltipla biotinilação do mesmo anticorpo sem que surjam altera-

ções imunológicas. Surge-nos assim a possibilidade de “revestir” um Anticorpo ou uma enzima com

um grande número de moléculas de biotina, que se comportam como locais de ligação para a avidi-


54

na. O número máximo de moléculas de biotina que se podem ligar a um Anticorpo foi estimado em

150.

O processo de biotinilação implica a passagem da biotina para a sua forma activada permitindo assim

a sua ligação através do grupo carboxílico as zonas NH2 da molécula a ser biotinilada. A biotinilação

não é somente aplicada a anticorpos, mas também a Ácidos nucleicos para utilização em ISH (in situ

hibridization).

8.3.7 Marcação da avidina

A Avidina pode ser marcada com diversas moléculas, como por exemplo:

fluorocromos: rodamina ou fluoresceína.

enzimas: peroxidase, fosfatase alcalina, beta- galactosidase;

ferritina ou ouro coloidal.

No caso dos fluorocromos, pode existir ligação via um derivado do isotiocianato. Para as enzimas e a

ferritina é utilizado um reagente de braço duplo como o gluteraldeído; finalmente o ouro coloidal

liga-se através de forças electrostáticas não covalentes. As técnicas que utilizam a avidina marcada

estão actualmente em expansão, sendo das mais utilizadas.

8.3.8 Métodos Imunocitoquímicos de avidina-biotina

Os métodos que utilizam a avidina e a biotina não diferem, no seu essencial, dos outros. Logo não é

necessária a utilização de processamento ou fixação especial, o que permite a aplicação desses

métodos na rotina hospitalar.

Métodos mais conhecidos:

LSAB – Labelled streptavidin-biotin

LAB - Labelled avidin-biotin

ABC- Avidin-biotin complex

8.3.8.1 Método LAB/LSAB

Descrição sumária (Figura 46):

1. Aplicação do Anticorpo primário contra o Antigénio pretendido.

2. Aplicação do Anticorpo secundário biotinilado dirigido contra o Anticorpo primário.

3. Aplicação da avidina ou streptavidina marcada com substância propiciadora da visualização

(normalmente peroxidase).

4. Revelação (quando necessário) e visualização.


55

Figura 46 – Método LSAB/LAB

8.3.8.2 Método ABC/StreptABC

Descrição sumária (Figura 47):

1. Aplicação do Anticorpo primário dirigido contra o Antigénio pretendido.

2. Aplicação do Anticorpo secundário biotinilado dirigido contra o Anticorpo primário.

3. Aplicação do complexo avidina-biotina (marcado com substância propiciadora da visualiza-

ção - normalmente peroxidase)

4. Revelação (quando necessário) e visualização.

Figura 47 – Método ABC/StrepABC

Preparação do complexo ABC:

É feita cerca de 1 a 4h antes da aplicação. Mistura-se avidina e biotina marcada com peroxidase de

modo a que haja ligação entre elas. As proporções adicionadas devem facultar a existência de uma

zona livre na avidina e 3 ocupadas com biotina marcada.

8.3.9 Características das técnicas de avidina-biotina

Vantagens:

Alta Sensibilidade


56

o A possibilidade de biotinilação de um Anticorpo secundário com cerca de 150 molé-

culas de biotina, permite uma ampliação de sinal, que as técnicas usadas anterior-

mente não atingem.

o No método ABC, a avidina e a biotina com o marcador, possuem uma alta capacida-

de de formar uma rede interligada que atinge grandes proporções e que permite a

existência de um grande número de moléculas de marcador por cada Anticorpo pri-

mário.

Alta versatilidade

o A alta polivalência do processo de biotinilação permite a utilização das técnicas de

avidina-biotina em diversas situações como a Imunocitoquímica, Hibridação in situ

ou a citoquímica de afinidade, quer em microscopia electrónica quer em microscopia

óptica.

Desvantagens:

Ligação da avidina a estruturas tecidulares carregadas negativamente.

o Esta desvantagem foi suplantada com a introdução da streptavidina

Ligação da avidina e streptavidina à biotina endógena.

o A biotina existe normalmente em alguns órgãos humanos como o rim, o fígado ou a

mama.

o Quando durante uma técnica de ICQ por avidina-biotina, se aplica a 3ª camada de

reagente, corre-se o risco deste se ligar à biotina previamente existente no tecido

(endógena), para além da biotina que se encontra acoplada ao Anticorpo secundário.

Se isso acontecer, surgirão zonas de falsa marcação que poderão ser prejudiciais ao

diagnóstico.

8.3.9.1 Bloqueio da biotina endógena

Para suplantar os problemas provocados pela biotina endógena pode ser feita uma técnica de blo-

queio da biotina endógena, que consiste na aplicação, no início da técnica de IHQ, de avidina livre

que se irá ligar à biotina endógena, bloqueando-a. Seguidamente é aplicada biotina livre para blo-

queio dos pontos activos livres da avidina previamente aplicada, que entretanto se ligou ao tecido via

biotina endógena. Logo, no local onde havia uma molécula de biotina passa a existir um complexo de

avidina-biotina completamente desactivado (Figura 48).


57

Figura 48 – Bloqueio da biotina endógena.

8.3.9.2 Aplicações práticas

Os métodos que utilizam a avidina-biotina, sendo altamente sensíveis, são extremamente úteis para

a detecção de pequenas quantidades de Antigénio. Estas pequenas quantidades podem existir nor-

malmente ou como consequência da fixação e processamento.

Também devido à alta sensibilidade, estes métodos permitem a diminuição do “fundo” por aumento

da diluição dos Anticorpos primários, o que também diminui os custos. Para além disso, estes méto-

dos facultam uma diminuição dos tempos de incubação, tornando a técnica mais rápida.

8.3.9.3 Conclusão

Os métodos de ICQ que utilizam avidina-biotina ou streptavidina-biotina são, actualmente, os mais

utilizados pois possuem grande versatilidade e grande sensibilidade, o que permite o aumento da

qualidade da marcação em casos de fixação prolongada ou processamento deficiente e a diminuição

do tempo de duração e dos custos da técnica. Também permitem a melhoria da qualidade da marca-

ção, com maiores intensidades e melhores aspectos visuais (melhor fotografia). Para além disso

facultam a diminuição do “fundo” e elevada especificidade. No entanto, a alta sensibilidade pode ter

consequências negativas como a ampliação do sinal de pequenas quantidades de biotina endógena

ou a ampliação de sinal de pequena quantidade de Anticorpo primário ligado inespecificamente.

8.4 Métodos de polímero

Posteriormente surgiram no mercado novos sistemas de amplificação que transmitem uma nova

abordagem dos conceitos anteriormente utilizados. Os métodos que maior sucesso obtiveram foram

os métodos de polímero, que podem ser de esqueleto interno ou de micropolimeros de enzimas.

1 - Biotina endógena

2 - Aplicação de avidina livre 3 - Biotina endógena bloqueada


58

8.4.1 Polímero de esqueleto interno

Como o próprio nome indica estas metodologias recorrem a uma macromolécula constituída por um

esqueleto central de grandes dimensões, ao qual estão acopladas grandes quantidades de anticorpos

e moléculas propiciadoras da visualização que podem ser enzimas (Figura 49).

Figura 49 – Polímero


A principal molécula utilizada como esqueleto interno é o dextrano, uma substância de elevado peso

molecular – aprox. 500 kd. Os dextranos são polissacarídeos de elevado peso molecular, que consis-

tem em unidades de α-D-glicose ligadas predominantemente por ligações glicosídicas 1-6 (Figura 50).

Figura 50 – Estrutura química do dextrano.

Fonte: http://pt.wikipedia.org/wiki/Dextrano

Os dextranos são formados a partir da sacarose durante o crescimento de bactérias pertencentes aos

géneros Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus, todas pertencentes à família Lactobacillacea. No

entanto, a maioria dos dextranos é sintetizada pela bactéria da espécie Leuconostoc mesenteroides.


59

8.4.1.1 Polímero de esqueleto interno directo (EPOS®)

Neste método utiliza-se somente um polímero que é constituído pelo esqueleto de dextrano ao qual

estão acoplados anticorpos “primários” e substâncias propiciadoras da visualização – normalmente

peroxidase (Figura 51).

Figura 51 – EPOS


Vantagens

Por possuir só um passo, trata-se de um método extremamente rápido e fácil, evidenciando uma

diminuição de factores de erro.

Desvantagens

Possui pouco poder de amplificação. Para além disso, é relativamente dispendioso e existem poucos

anticorpos primários comercializados desta forma.

8.4.1.2 Polímero de esqueleto interno indirecto

Neste método aplica-se um anticorpo primário dirigido contra o antigénio pretendido e posterior-

mente aplica-se um polímero ao qual estão acoplados anticorpos “secundários” e substâncias propi-

ciadoras da visualização – normalmente HRP (Figura 52).


60

Figura 52 – Polímero de esqueleto interno indirecto.


Vantagens

Por possuir só dois passos, trata-se de um método extremamente rápido e fácil, evidenciando uma

diminuição de factores de erro. Para além disso é um método muito ampliativo, deslocando bastan-

tes moléculas propiciadoras de visualização por molécula de antigénio.

Desvantagens

É relativamente dispendioso.

8.4.2 MicroPolímeros de enzimas

Estes métodos baseiam-se na polimerização de enzimas e sua associação a anticorpos, formando os

micropolímeros de enzima (Figura 53). Segundo os seus fabricantes esta abordagem evita os proble-

mas decorrentes do uso de dextran ou de outras macromoléculas como esqueleto. O micropolímero

com uma alta densidade de enzima muito activa acoplada a um anticorpo secundário gera um rea-

gente, que supera a interferência estérica, que advém do enorme volume ocupado pelo polímero de

esqueleto interno. Este método proporciona maior acessibilidade ao antigénio pois a pequena

dimensão dos seus reagentes permite uma melhor difusão aos pontos-alvo e uma redução da ligação

não específica.

Figura 53 – MicroPolímero de enzimas indirecto.

Fonte: http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?catID=436&locID=0

IMUNOCITOQUÍMICA EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS

61

9 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS

9.1 Higiene e segurança no Laboratório

Ao trabalhar dentro de qualquer laboratório, é importante ter presente regras de segurança indis-

pensáveis a uma boa prática. Cada indivíduo tem o dever de tomar os procedimentos adequados à

salvaguarda da sua saúde e segurança e daqueles que o rodeiam.

O uso de substâncias tóxicas, corrosivas, inflamáveis ou explosivas, de alta temperatura ou electrici-

dade potenciam os riscos. Por isso, devem cumprir-se as regras básicas de segurança:

Conservar as bancadas arrumadas e limpas,

Não correr ou fazer movimentos bruscos,

Lavar as mãos com frequência,

Não pipetar com a boca,

Fazer a correcta manipulação de reagentes,

Adicionar soluções concentradas sobre outras mais diluídas e não o inverso.

É também indispensável o uso de equipamentos de protecção individual, como bata, luvas, óculos,

máscara e outros, sempre que a situação o justifique. A protecção colectiva representa um importan-

te factor de segurança e é conseguida com adequados sistemas de ventilação e extracção de ar,

entre outros.

Em caso de acidente é importante saber como agir. Para tal, são necessárias noções básicas de pri-

meiros socorros, destacando-se os procedimentos PAS a cumprir em caso de acidente:

1. Prevenir – actuar no sentido de evitar a ocorrência de mais acidentes ou o agravamento dos

já ocorridos;

2. Alertar – informar as entidades competentes da ocorrência;

3. Socorrer – abordar os feridos e proceder de acordo com as situações encontradas.

Em caso de ingestão de produto tóxico ou nocivo não se deve provocar o vómito sem indicação

expressa de Profissional de Saúde competente ou dar de beber à vítima.

Quando um reagente perigoso contacta com os olhos, pele ou mucosas deve lavar-se de imediato e

abundantemente a zona afectada com água fria.

Ao assumir uma atitude cautelosa/ponderada e respeitando as regras de segurança laboratorial

estamos a contribuir drasticamente para a diminuição do número de acidentes.


62

9.2 Cuidados com material e reagentes

Existem diversos procedimentos a assegurar na execução de técnicas imunocitoquímicas, sendo que

um dos principais se prende com a correcta utilização do material e reagentes. Todo o material a

utilizar deve encontrar-se devidamente limpo, de forma a evitar contaminações ou danos na técnica,

e aquele que é descartável deve ser cuidadosamente separado após utilização.

Os reagentes habitualmente utilizados nas baterias de hidratação/desidratação, como álcool, xilol ou

água destilada devem ser mudados dos recipientes com relativa frequência, de forma a manter a

maior grau de genuinidade possível.

Ao utilizar pipetas de Pasteur, estas devem ser descartadas num recipiente apropriado após cada

utilização, bem como as pontas das micropipetas.

9.3 Diluição de soros de anticorpos

Existem no mercado diversos soros sob a forma pré-diluida que permitem aplicação imediata, mas a

margem de manobra que facultam é limitada (Figura 54). A maior parte dos Anticorpos são comer-

cializados sob a forma concentrada e é necessário dilui-los para posterior aplicação. A apresentação

concentrada dos Anticorpos é a ideal para a aplicação e adaptação personalizada de cada laboratório

com as suas características específicas, sendo assim possível contornar condições de fixação e de

processamento que, por vezes, se encontram longe das ideais.

Figura 54 – Soros pré-diluidos

Fonte: http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/cdg/products/autoimmune/product_detail/global/aibu_29403_pdp.jpg

9.4 A diluição ideal

É considerada diluição ideal de um soro a diluição que permite a maior intensidade de marcação com

o menor fundo possível.

A diluição representa-se por:

X/Y X= partes de soro concentrado Y= partes de solução final

Exemplo: 1/20; 1/1000; 1/5000.


63

É necessário efectuar alguns cálculos quando se pretende calcular as quantidades de soro a pipetar.

Existe ainda a possibilidade de conjugar a diluição do Anticorpo com outros factores que podem ser

manipulados de modo a melhorar e adaptar à técnica as condições de cada laboratório:

- Método utilizado

- Tempo de incubação

- Temperatura de incubação

9.5 Teste de diluição de soros de Anticorpos

Caso o fabricante forneça uma indicação de partida para a diluição ideal do Anticorpo, esta deverá

ser utilizada como ponto de partida para o teste. Se isso não acontecer, deverá ser utilizado o teste

padrão do laboratório para os Anticorpos, cuja diluição é desconhecida. Exemplo: 1/20; 1/50; 1/100;

1/200; 1/500.

A diluição correcta de um Anticorpo é o factor que mais contribui para a qualidade de uma lâmina de

Imunocitoquímica.

A maneira mais utilizada para o teste de Anticorpos é a utilização de um método sensível, um tempo

e uma temperatura de incubação constantes, e fazer variar as diluições de forma programada até se

identificar a diluição ideal.

9.6 Pipetagem

Para manusear pequenas quantidades de reagente de forma precisa, utilizam-se micropipetas, que

medem um volume exacto e facilmente aspiram e expelem líquidos. Ao utilizar a micropipeta, deve

escolher-se a ponta adequada, normalmente reconhecida pela cor presente no topo da micropipeta.

Por regra, utiliza-se o polegar para controlar cuidadosamente o êmbolo da micropipeta, pois este é,

para a maioria dos indivíduos, o dedo com melhor motricidade fina.

9.7 Cuidados gerais

1º - Seleccione o volume a pipetar dentro da amplitude da

micropipeta. Não tente seleccionar um volume que ultrapasse o

mínimo ou o máximo permitidos pela micropipeta.


64

2º - Quando utilizar a micropipeta colocar sempre primeiro a pon-

ta. Se não proceder desta forma poderá aspirar liquido para den-

tro da câmara e provocar danos graves (Figura 55).

Figura 55 – Colocação de

ponta na micropipeta.

3º - Mantenha sempre a micropipeta numa posição vertical quan-

do tem líquido na ponta. Não permita que o líquido possa escorrer

para o seu interior (Figura 56).

Figura 56 – Colocação da

micropipeta.

4º - Mude sempre de ponta a cada pipetagem.

5º - Utilize o seu polegar para controlar a velocidade a que aspira

ou dispensa o liquido. Se for demasiado brusco pode aspirar liqui-

do para dentro da câmara da micropipeta (Figura 57).

Figura 57 – Utilização do

polegar para pipetar.

9.7.1 Preparação da Micropipeta

1º - Verifique se possui a micropipeta correcta para pipetar a quantidade desejada. Possui três tama-

nhos no seu laboratório (1-10 µL; 10-100 µL; 100-1000 µL).

2º - Regule o volume desejado. Sabe interpretar a escala? Se não sabe, PERGUNTE!

3º - Pressione a extremidade da micropipeta na ponta adequada. As pontas amarelas são para 1-200

µL. As pontas azuis são para 100-1000 µL.


65

9.7.2 Como retirar uma amostra com uma micropipeta

1º - Antes de pegar na micropipeta destape o tubo ou frasco de onde vai retirar a amostra.

2º - Segure a micropipeta na posição vertical numa mão e o tubo na

outra mão. Ambos deverão estar ao nível dos olhos (Figura 58).

Figura 58 – Micropipeta e

tubo ao nível dos olhos.

3º - Antes de colocar a ponta dentro do líquido pressione o êmbolo

da micropipeta até sentir a primeira pressão e mantenha essa posi-

ção. Não ultrapasse a primeira pressão ou irá pipetar um volume

incorrecto (Figura 59).

Figura 59 – Pressão no

êmbolo da micropipeta.

4º Introduza a ponta no líquido a pipetar (Figura 60).

Figura 60 – Introdução da

ponta no líquido.

5º - Aspire o líquido libertando lentamente o êmbolo da micropipe-

ta. Em seguida tape o tubo ou frasco que contem o líquido a pipetar

(Figura 61).

Figura 61 – Libertar o êmbo-

lo da micropipeta.


66

9.7.3 Como expelir a amostra da micropipeta

1º - Com a mão livre destape o tubo ou frasco para onde pretender colocar o liquido pipetado.

2º - Segure a micropipeta numa posição vertical com uma mão e

segure o tubo ou frasco de destino com a outra. Ambos deverão

estar ao nível dos olhos (Figura 62).

Figura 62 – Micropipeta e

tubo ao nível dos olhos.

3º - Toque a parede interior do tubo ou frasco de destino com a

ponta. Isto cria uma pequena tensão superficial que auxilia à

expulsão do líquido da ponta da micropipeta (Figura 63).

Figura 63 – Ponta a tocar

parede do tubo.

4º - Lentamente pressione o êmbolo da micropipeta até à primei-

ra pressão. Depois continue até à segunda pressão e mantenha o

êmbolo nessa posição (Figura 64).

Figura 64 – Pressão no êmbolo

da micropipeta.

5º - Lentamente retire a micropipeta do tubo ou frasco, mantendo o êmbolo pressionado e evitando

aspirar líquido para dentro da ponta.

Fonte: Adaptado de http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/geneconn/smallvol/part1.html

9.8 Tempo de duração da incubação

Normalmente estabelece-se um tempo de incubação uniforme para todos os soros. Esse é o ponto

de partida e só é alterado caso prove ser inaplicável.

Tempos mais utilizados:

30 minutos (a mais utilizada).


67

60 minutos.

16 horas (incubação overnight).

De um modo geral, quanto maior o tempo de incubação, maior a intensidade de marcação e conse-

quentemente de fundo.

9.9 Temperatura de incubação

Estabelecida no início dos testes, e só é alterada caso se prove inaplicável (por maus resultados)

Temperaturas mais utilizadas:

4º C.

37º C.

temperatura ambiente (a mais utilizada).

De um modo geral, quanto maior a temperatura, maior a marcação e consequentemente maior a

marcação de fundo.

9.10 pH

Estabelecido no início dos testes e assim permanece até final com o auxílio da solução tampão. O

valor de pH mais utilizado é 7.4 a 7.6.


68

IMUNOCITOQUÍMICA PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

69

10 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

10.1 Fixação em Imunocitoquímica

É uma das mais importantes fases da técnica Imunocitoquímica. A sua função é preservar os tecidos,

mantendo-os o mais próximo possível das características “in vivo”. Isso consegue-se, de um modo

geral, mergulhando os tecidos a fixar numa solução fixadora

10.1.1 Actuação do fixador

O fixador previne a autólise por inibição das enzimas dos lisossomas. Inibe o crescimento dos fungos

e bactérias que podem promover reacções de putrefacção. Protege os tecidos e as células das agres-

sões do procedimento histológico e coloração.

Os fixadores desnaturam as proteínas por:

Coagulação

Formação de compostos adicionados

Uma mistura dos dois processos anteriores

Existe consequentemente uma alteração na conformação das proteínas que resulta na inactivação

das enzimas. Os compostos resultantes dos processos de fixação diferem dos compostos iniciais nos

aspectos químicos e antigénicos. Pode-se inferir que um composto alterado é um composto protegi-

do.

A fixação provoca ainda outras alterações nos aspectos físicos do tecido: destrói a capa impermeável

em torno das células tornando-as permeáveis a diversas macromoléculas que podem então entrar ou

sair. Diferentes fixadores promovem diferentes graus de porosidade, sabendo-se que o formol per-

mite um baixo grau de porosidade, ao contrário do B5, que permitem um alto grau de porosidade.

Um factor extremamente importante a reter é que a fixação é sempre um passo de compromisso, ou

seja, não existe fixação perfeita, com preservação morfológica e preservação antigénica perfeita.

10.1.2 Fixação para cortes de crióstato

Os cortes de crióstato (Figura 65), pelo menos teoricamente, permitem uma maior preservação dos

antigénios do que os de parafina, mas perdem no pormenor estrutural. As técnicas de Imunocito-

química podem ser realizadas sem qualquer fixação química ou, posteriormente, podem ser utiliza-

dos diversos fixadores para os cortes de crióstato, como álcool, acetona ou até formol.


70

Figura 65 – Crióstato

Fonte: http://education.vetmed.vt.edu/Curriculum/VM8054/Labs/Lab2/IMAGES/cryostat.jpg

Cada laboratório deve determinar o processo de fixação que considera melhor para si.

10.1.3 Fixação em Imunocitoquímica de rotina

A maior parte dos cortes de Imunocitoquímica são cortes de tecidos incluídos em parafina (Figura

66), tendo surgido várias técnicas para a fixação inicial.

Figura 66 – Cortes de parafina

10.1.3.1 Fixadores de formol

Quimicamente, o Formaldeído é o mais simples dos aldeídos e tem a denominação da International

Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) de metanal. Possui a fórmula química H2CO. Apresenta-

se em condições normais de pressão e temperatura como um gás incolor de cheiro característico e

penetrante. Ao nível celular o formaldeído parece possuir a capacidade de fomentar o estabeleci-

mento de pontes de metileno entre os aminoácidos de várias proteínas, alterando a sua forma e

contribuindo para a sua inactivação funcional. Nesta reacção parecem estar também implicados os

iões Ca2+. Na utilização laboratorial o formaldeído é empregado sob a forma de gás a 37%-39% em

solução aquosa, a que se dá o nome de formol.


71

O fixador mais utilizado é o formol a 10% (também pode ser tamponado para manter o pH). Tem boa

capacidade de penetração no tecido e é relativamente bem tolerado pelo tecido. Surgem assim bai-

xas permeabilidades para as macromoléculas não existindo grandes alterações das proteínas intraci-

toplasmáticas.

Apesar de ser um passo indispensável na técnica histológica, a fixação afecta directamente a aplica-

ção de imunocitoquímica, podendo “mascarar” alguns antigénios e impedir o seu reconhecimento

pelo anticorpo. Os efeitos negativos causados pelo formol podem ser minimizados com a aplicação

das condições ideais de fixação, pois a capacidade de afectar os antigénios não depende somente do

fixador utilizado mas também das condições da fixação, como o pH, temperatura, tempo de espera

entre colheita de material e fixação, tamanho dos fragmentos a fixar (o ideal seria 10*10*3 mm),

duração da fixação, entre outros.

O formol pode reagir com um epitopo antigénico mascarando-o directamente ou pode também rea-

gir com os aminoácidos envolventes do epitopo alterando a sua forma e mascarando-o indirecta-

mente (Bancroft, 2008). Quando surge este obstáculo torna-se então necessária a recuperação anti-

génica.

Apesar de causar efeitos adversos, o formol continua a ser o fixador mais utilizado em histopatologia

por fornecer uma boa preservação morfológica e ser menos dispendioso que outros fixadores alter-

nativos (Dabbs, 2006).

10.2 Processamento histológico

O processamento histológico (Figura 67) pode provocar alterações ao nível dos Antigénios, princi-

palmente devido ao aquecimento do tecido na impregnação e inclusão, quando as altas temperatu-

ras (600C) podem destruir irreversivelmente um epitopo.

Figura 67 – Processador automático de tecidos

Fonte: http://image.made-in-china.com/2f0j00QCRTtiHMFpoG/Vacuum-Tissue-Processor-VTP-3000-.jpg; http://www.microm-online.com/microm%20homepage/html/stp_120_e_l.html


72

10.3 Preparação de lâminas em IHQ

Quando sujeitas às lavagens da técnica de Imunocitoquímica e à recuperação antigénica, os cortes

podem descolar da lâmina, perdendo-se assim trabalho e tempo, por vezes essencial ao doente. Por

regra, as lâminas de Imunocitoquímica são sujeitas a um tratamento que permite um aumento da

força de ligação entre elas e os cortes, podendo utilizar-se diversas metodologias de adesivação das

lâminas. A carga química dos tecidos é maioritariamente negativa (DNA, grupos fosfato, iões mono-

valentes, etc.) e ao fornecer às lâminas uma carga oposta (positiva) através da adesivação, torna-se

mais fácil o estabelecimento de pontes entre o tecido e a sílica do vidro da lâmina.

10.3.1 Cromo-alúmen gel

Este método é fácil de aplicar e permite bons resultados. Tem a desvantagem de fazer “ponte” entre

o vidro e os corantes, levando a que as lâminas no final da técnica fiquem, em toda a sua extensão,

coradas da cor do corante de contraste. Uma vez que utiliza substâncias de origem orgânica, há ten-

dência para a formação de contaminantes (fungos e bactérias) nas lâminas preparadas e armazena-

das.

10.3.2 Vectabond

Este método permite bons resultados. Tem a desvantagem de utilizar reagentes tóxicos e corrosivos.

10.3.3 Lâminas com cargas electrostáticas

Estas lâminas são adquiridas já preparadas (ex. superfrost plus) e permitem excelentes resultados.

Apesar de serem relativamente dispendiosas são muito fáceis de utilizar pois são prontas a utilizar.

Trata-se de um método muito utilizado em laboratórios com um grande volume de trabalho e pou-

cos recursos humanos.

10.3.4 3-Amino-Propil-Trietoxisilane (APES/TESPA/SILANE)

Trata-se de um dos métodos mais utilizados, e apesar de utilizar reagentes tóxicos e corrosivos, per-

mite obter lâminas adesivadas de forma rápida, simples e pouco dispendiosa. A técnica para utiliza-

ção deste composto está em Apêndice 2.

10.4 Corte em Imunocitoquímica

Os cortes deverão ser o mais finos possível (2-4ųm) e não deverão possuir pregas ou estrias que faci-

litam o descolar nas lavagens e recuperação antigénica. É importante que estejam colocados numa


73

posição central da lâmina, que por sua vez deve ter esmerilados de boa qualidade para que não se

apaguem os números de registo.

Na lâmina a processar deverão estar inscritos:

N.º de exame

N.º de bloco

Soro a aplicar (antigénio a detectar)

Em imunocitoquímica, o corte não deve ser demasiado espesso, principalmente quando se utilizam

aparelhos de capilaridade, como o Sequenza®. Na altura do corte, se o bloco histológico a estudar já

se encontrar desbastado não se deve proceder a um novo desbaste, de forma a manter a mesma

superfície de corte obtida na HE (Hematoxilina-Eosina), de forma a estabelecer comparação entre os

casos.

Após o corte, as lâminas permanecem o tempo necessário na estufa para que o tecido adira à lâmina

(por exemplo: de 20min a 80ºC).


74

IMUNOCITOQUÍMICA RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA

75

11 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA

Há alguns anos atrás, o interesse crescente dos Profissionais de Anatomia Patológica em expandir a

aplicação de técnicas imunocitoquímicas em tecidos fixados em formol e impregnados em parafina

foi influenciado pelos maus resultados obtidos. Foram dirigidas diversas tentativas para encontrar

um substituto para o formol como fixador de rotina, mas falharam. Para ultrapassar a “máscara”

imposta pelo formol, efectuaram-se diversos estudos com o intuito de recuperar as características

originais dos antigénios afectados, surgindo assim o conceito de recuperação antigénica (Shi et al,

2001).

11.1 Consequências da fixação

Não está completamente estabelecido o mecanismo de actuação do formol mas parece estar rela-

cionado com:

Formação de pontes de metileno entre os pontos-chave de uma proteína ou de várias pro-

teínas.

Envolvimento de iões cálcio nesta reacção.

Assim, surgem alterações nas estruturas quaternárias e terciárias das proteínas que condicionam a

inibição de enzimas que poderiam autolisar o tecido. As estruturas primária e secundária são manti-

das.

As consequências da fixação dependem de:

Concentração de formol

pH

Temperatura ºC

Duração da fixação

As alterações decorrentes da fixação podem ser de tal maneira extensas que levam ao não reconhe-

cimento do antigénio fixado por parte do seu anticorpo específico.

No final da fixação e processamento histológico podem existir três tipos de situações:

Pode ser possível detectar diversos antigénios teciduais mesmo após fixação e consequente

alteração proteica, não sendo necessário recorrer a processos de recuperação antigénica.

Alguns antigénios têm o seu número diminuido nos tecidos após fixação, sendo de todo o

interesse recorrer a processos de recuperação antigénica, de forma a aumentar a sensibili-

dade da técnica (evitando eventuais falsos negativos):


76

Outros antigénios ficam completamente obstruídos pela fixação sendo imperioso recorrer a

processos de recuperação antigénica (evitando de certeza falsos negativos)

Os soros monoclonais em geral apresentam maiores problemas na detecção de antigénios fixados

em formol do que os soros policlonais, pois estão limitados à detecção de somente um epitopo.

11.2 Digestão enzimática proteolítica

Um dos estratagemas para "desmascarar" os antigénios obstruídos pela fixação é o tratamento dos

tecidos com enzimas proteolíticas como por exemplo:

pronase

tripsina

proteinase K

pepsina

Estas enzimas digerem ligações proteicas e levam à destruição indirecta das ligações induzidas pela

fixação (pontes de metileno), expondo assim antigénios que estavam obstruídos ou mascarados

pelas alterações estruturais decorrentes da fixação. No entanto, as ligações normais das proteínas

também são destruídas, podendo haver destruição parcial ou total do antigénio por digestão enzimá-

tica, devendo o processo de digestão enzimática ser controlado de forma extremamente rigorosa.

Para a digestão enzimática em banho-maria a temperatura ideal ronda os 37ºC, que é a temperatura

óptima de actuação da maior parte das enzimas utilizadas.

11.3 Recuperação antigénica de origem térmica

A recuperação antigénica mediada por calor é definida como o aquecimento a alta temperatura de

secções tecidulares de modo a recuperar a antigenicidade que foi obstruída pela fixação em formol

(Shi et al, 2001).

Na década de 40 Fraenkel-Conrat et al, realizaram diversos estudos bioquímicos sobre as interacções

entre o formaldeído e as proteínas, demonstrando que as ligações induzidas podiam ser destruídas

por aquecimento a altas temperaturas ou por tratamento em soluções alcalinas fortes. Em 1991 Shi

et al aplicaram estas técnicas a cortes de Histologia, procedendo ao aquecimento, em forno

microondas, das lâminas mergulhadas em soluções de sais metálicos aumentando a sensibilidade das

técnicas de Imunohistoquímica. O efeito de recuperação antigénica é atingido devido à transferência

de energia resultante do aquecimento, que para além de quebrar as ligações Proteína-Proteína, que-

bra também as ligações entre os iões cálcio e os aminoácidos (nesta ultima reacção podem também

estar envolvidos agentes quelantes existentes na solução de recuperação).

O método de aquecimento pode ser :


77

forno microondas

panela de pressão

aquecimento em chama

banho-maria termostatizado

outros

As lâminas são colocadas num recipiente com a respectiva solução de recuperação e colocadas den-

tro do aparelho pré-definido, como o forno de microondas, entre outros. Para a recuperação térmica

em forno microondas é utilizada frequentemente uma potência de 750W durante 15 ou 20 min.

A morfologia geral do tecido não é particularmente afectada. O pH da solução de recuperação e a

existência de agentes quelantes (promovem a extracção dos iões cálcio do tecido) também afecta de

algum modo a recuperação antigénica, surgindo antigénios com preferência por determinados pH

ou agentes quelantes (Ex. EDTA ou EGTA).

De um modo geral utilizam-se dois tipos de soluções:

tampão citrato pH 6

tampão EDTA 1mM pH 8

tampão ácido bórico a pH 7.0

Por vezes é necessário uma combinação de dois métodos de recuperação antigénica para se atingi-

rem os resultados pretendidos (digestão enzimática+tratamento térmico).

O sucesso da recuperação antigénica demonstrou que a modificação da estrutura proteica induzida

pelo formol é um processo reversível sobre certas condições e desde que as proteínas mantenham a

sua estrutura primária fornecida pelo conjunto de aminoácidos (Hayat, 2002).

A introdução de métodos de recuperação antigénica foi, sem dúvida, um dos principais avanços que

permitiram o desenvolvimento da Imunocitoquímica até ao modo que hoje conhecemos, pois até ao

seu aparecimento somente uma pequena percentagem de antigénios podia efectivamente ser detec-

tada. Com o aumento de substâncias detectáveis nos tecidos ou células aumentou a procura da ICQ

tanto ao nível do diagnóstico, como do prognóstico, como da indicação terapêutica.


78

IMUNOCITOQUÍMICA INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS

79

12 INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS

12.1 Peroxidase Endógena

Existe principalmente em tecidos com glóbulos vermelhos, mas também ao nível do Baço, Rins, Fíga-

do, Medula óssea e em áreas de necrose. É bloqueada por um excesso de substrato ( H2O2) que leva

à saturação da actividade enzimática. Para a inibição efectiva da peroxidase endógena pode ser utili-

zada uma solução de H2O2 a 1.5% - 3% em água destilada imediatamente após a desparafina-

ção/hidratação ou noutro momento considerado adequado.

12.2 Fosfatase Alcalina

Existe em pequena quantidade no rim, fígado e osso. O bloqueio é feito por adição de levamisole a

5mM à solução de revelação. As fosfatases alcalinas do intestino não podem ser inibidas desta for-

ma.

12.3 Glucose Oxidase

Não existe nos mamíferos.

12.4 Pontos susceptíveis de atrair proteínas

Podem ser pontos hidrofóbicos, electrostáticos ou outros. Estas estruturas teciduais podem existir

em qualquer órgão ou tecido e poderão provocar o aparecimento de coloração de “fundo” ou de

marcação inespecífica. Deverão ser anulados ou inibidos utilizando várias técnicas como por ex.:

Utilização de soro normal não imune de uma espécie animal diferente da utilizada para pro-

duzir o anticorpo primário, aplicado imediatamente antes do soro primário.

Utilização de PBS ou TBS de lavagem e de diluição de soros com um detergente (ex. triton

X100; tween 20).

Utilização de PBS ou TBS de diluição de soros com albumina sérica bovina (BSA) a 0.05%

12.5 Causas de marcação inespecífica

Interacções hidrofóbicas.

Interacções iónicas.

Actividade enzimática endógena.

Anticorpos naturais.

Anticorpos contaminantes.

IMUNOCITOQUÍMICA INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS

80

Difusão antigénica.

Reacções cruzadas.

Receptores Fc.

Outros:

o Tecidos necrosado

o Fixação deficiente

o Má desparafinação

IMUNOCITOQUÍMICA CONTROLO DE QUALIDADE

81

13 CONTROLO DE QUALIDADE

O controle de qualidade da técnica é da responsabilidade do Técnico de Anatomia Patológica e surge

como um dos passos mais importantes do desempenho deste profissional, pois implica conhecimen-

tos profundos e capacidade crítica rigorosa.

Todas as lâminas que saem do laboratório de Imunocitoquímica têm que ser avaliadas pelo Técnico

responsável e ponderada a sua qualidade, tirando daí as consequentes ilações, tendo como objectivo

máximo a melhoria permanente da qualidade do produto final do seu trabalho.

Tipos de controlo de qualidade:

Controlo de procedimentos

o Substituição de reagentes

o Controle tecidual

Positivo

Negativo

Interno

13.1 Avaliação da qualidade da Imunocitoquímica

De forma a permitir a interpretação e avaliação de lâminas de Imunocitoquímica, é importante pos-

suir uma escala de avaliação que quantifica os parâmetros preservação da morfologia do tecido, sen-

sibilidade e especificidade.

13.1.1 Preservação da morfologia do tecido

É fundamental que uma metodologia imunocitoquímica garanta a estabilidade do substrato onde é

aplicada, independentemente deste ser fresco ou de se apresentar fixado, ou então de se constituir

em base citológica ou base histológica. A operacionalização será directa criando-se uma escala ordi-

nal que corresponde a uma hierarquia iniciada na opção “ausência total de preservação morfológica

do tecido” que corresponde à pior situação possível, e terminando na opção “preservação perfeita

da morfologia do tecido” que corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4).

13.1.2 Sensibilidade

A sensibilidade é definida como a capacidade de reconhecer os verdadeiros positivos (Almeida,

1990). Partindo deste princípio poderemos operacionalizar este parâmetro analisando e classificando

a intensidade da marcação específica e a quantidade relativa de estruturas marcadas.


82

13.1.2.1 Intensidade de marcação

A intensidade de marcação permite-nos avaliar a disponibilidade do antigénio e a capacidade ampli-

ficativa dos métodos de detecção e revelação utilizados. Este item obterá expressão prática subme-

tendo-o a hierarquização numa escala ordinal que se inicia em “intensidade de marcação nula” que

corresponde à pior situação possível e terminando em “intensidade de marcação muito intensa” que

corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4).

13.1.2.2 Quantidade relativa de estruturas marcadas

A quantidade relativa de estruturas marcadas permite-nos quantificar o rácio existente entre estru-

turas marcáveis e estruturas marcadas. Este item obterá expressão prática submetendo-o a hierar-

quização numa escala ordinal que se inicia em “0% de estruturas marcadas” que corresponde à pior

situação possível e terminando em “100% de estruturas marcadas” que corresponde à melhor situa-

ção possível (ver Tabela 4).

13.1.3 Especificidade

Genericamente podemos afirmar que a especificidade é a capacidade de reconhecer os verdadeiros

negativos (Almeida, 1990). Em imunocitoquímica, a especificidade de um Anticorpo permite-lhe

reconhecer e estabelecer ligações com Antigénios individualizados e específicos. Aplicando estes

conceitos à marcação imunocitoquímica podemos caracterizar como inespecífica a presença de mar-

cação em células ou em estruturas extra-celulares que não deveriam estar marcadas, uma vez que o

anticorpo não é dirigido contra elas. Este item obterá expressão prática submetendo-o a hierarquiza-

ção numa escala ordinal que se inicia em “presença de marcação inespecífica que compromete a

avaliação da marcação específica” que corresponde à pior situação possível e terminando em “sem

marcação inespecífica” que corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4).

13.1.3.1 Marcação inespecífica e marcação de fundo

A marcação inespecífica pode surgir por diversos motivos, como por exemplo reacções cruzadas

entre anticorpos ou baixa afinidade entre Anticorpo e Antigénio. Comummente é feita a distinção

entre marcação inespecífica propriamente dita e marcação de fundo. A principal diferença entre

estas duas é dada pela forma de apresentação: enquanto a marcação inespecífica propriamente dita

é electiva para as estruturas intra ou extra-celulares marcando-as de forma semelhante à marcação

específica, a marcação de fundo não é electiva dispersando-se de forma irregular pelas estruturas

celulares. No entanto, para efeitos desta escala de avaliação não foi considerada relevante esta dis-

tinção pois uma marcação imunocitoquímica é de baixa qualidade quando apresenta marcação ines-

pecífica, independentemente do seu sub-tipo.


83

Sensibilidade Especificidade

Preservação da morfolo-

gia do tecido

Intensidade da marca-

ção específica

Quantidade relativa de

estruturas marcadas

Marcação inespecífi-

ca/fundo

0

Ausência de preservação

morfológica que invalida

a avaliação

Intensidade de marcação

nula

0% de estruturas marca-

das

Presença de marcação

inespecífica que invalida

a avaliação

1 - Intensidade de marcação

fraca

1 a 10% de estruturas

marcadas -

2

Ausência de preservação

morfológica que não

invalida a avaliação


moderada


marcadas

Presença de marcação

inespecífica que não

invalida a avaliação

3 - Intensidade de marcação

forte


marcadas -

4 Preservação perfeita da

morfologia


muito forte


marcadas

Ausência de marcação

inespecífica

Tabela 4 – Grelha de avaliação de qualidade da imunocitoquímica

13.1.4 Score final de qualidade da imunocitoquímica

Para permitir uma constatação mais imediata e perceptível da qualidade da imunocitoquímica, uma

comparabilidade entre estudos e um tratamento estatístico mais aprofundado, foi criado o Score

Final de qualidade da imunocitoquímica. Este dado quantitativo resulta da aplicação de um algoritmo

sobre os itens referidos anteriormente.

13.1.4.1 Factores de ponderação

Numa tentativa de valorizar os itens que mais contribuem para a qualidade final da marcação imuno-

citoquímica foram introduzidos factores de ponderação. O item considerado mais relevante foi

“intensidade da marcação” pelo que lhe foi atribuído o factor de ponderação 3. Em seguida foram

considerados os itens “quantidade relativa de estruturas marcadas” e “marcação inespecífica/fundo”

com o factor de ponderação 2. Finalmente foi atribuído o factor de ponderação 1 ao item “preserva-

ção da morfologia do tecido” (Tabela 5).


84

Sensibilidade Especificidade

Preservação da mor-

fologia do tecido

Intensidade da mar-

cação específica

Quantidade relativa

de estruturas marca-

das

Marcação inespecífi-

ca/fundo

Factor de

ponderação 1 3 2 2

Tabela 5 – Factores de ponderação do Score Final da qualidade da imunocitoquímica.

IMUNOCITOQUÍMICA APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA

85

14 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICAS

As técnicas de Imunocitoquímica são uma ferramenta poderosa ao dispor do diagnóstico anatomo-

patológico e da investigação. Não obstante, a imunocitoquímica é um meio de pensar o diagnóstico e

frequentemente serve de complemento a um raciocínio diagnóstico, não o substituindo. O prognós-

tico e a indicação terapêutica são muito condicionados pelo recurso a estas técnicas, demonstrando

aqui o Técnico de Anatomia Patológica toda a sua responsabilidade e relevância para a melhoria da

quantidade e qualidade de vida do doente.

De um modo geral, já são conhecidos e estudados os diferentes antigénios que podem ser expressa-

dos pelos diferentes tipos de patologias, sendo necessário, muitas vezes, detectar a sua existência

para confirmar a patologia correspondente. Noutras situações recorre-se a técnicas imunocitoquími-

cas não para confirmar uma suspeita proveniente do aspecto morfológico da patologia, mas sim

como ferramenta de primeira linha pois o aspecto morfologico não indica caminhos definitivos. Aqui

recorrem-se a algoritmos diagnósticos (Figura 68 e Figura 69), surgindo a imunocitoquímica como a

principal determinante da resposta final.


86

Figura 68 - Algoritmo utilizado para tumores indiferenciados.


87

Figura 69 - Algoritmo utilizado para situações linfoproliferativas.


88

14.1 Principais antigénios detectados por imunocitoquímica

Figura 70 - Receptores de Estrogénio

Figura 71 - Receptores de progesterona

Figura 72 - Proteína p53

Figura 73 - HER-2


89

Figura 74 - Bcl-2

Figura 75 - CD3

Figura 76 - CD15

Figura 77 - CD20


90

Figura 78 - CD30

Figura 79 - CD34

Figura 80 - CD45

Figura 81 - Ki67


91

Figura 82 - melanoma HMB45

Figura 83 - CL Kappa

Figura 84 - CL lambda

Figura 85 - vimentina


92

Figura 86 - CK 7

Figura 87 - PAN CK clones -AE1\AE3

Figura 88 - proteína S100

Figura 89 - actina do músculo liso

IMUNOCITOQUÍMICA MARCAÇÃO MÚLTIPLA

93

15 MARCAÇÃO MÚLTIPLA

A múltipla marcação consiste na aplicação de mais de um anticorpo primário num corte durante a

técnica imunocitoquímica e consequente identificação dos correspondentes antigénios. Cada ligação

anticorpo-antigAg irá apresentar uma diferente cor que pode ser separadamente identificada. Exis-

tem duas formas distintas de aplicar marcação múltipla: método simultâneo ou método sequencial

(Kropf, 2006).

15.1 Método simultâneo

Nesta metodologia de múltipla marcação os anticorpos primários são todos colocados em simultâ-

neo na lâmina, assim como os anticorpos secundários e assim sucessivamente. É necessário que seja

feita uma planificação adequada para que não surjam interacções indesejadas entre os reagentes

utilizados que podem comprometer a especificidade e sensibilidade da marcação imunocitoquímica.

Vantagens:

Rápida.

Desvantagens:

Planificação complicada.

Exigência de reagentes altamente específicos.

15.2 Método sequencial com desnaturação intercalar

Este método implica a realização de uma técnica Imunocitoquímica completa, incluindo revelação,

seguida de uma desnaturação e posteriormente de nova técnica imunocitoquímica, e assim sucessi-

vamente (Figura 90, Figura 91, Figura 92, Figura 93).

A desnaturação tem a função de eliminar todos os reagentes colocados no tecido pela técnica ante-

rior, de forma deixar o tecido limpo para os novos anticorpos. Pode ser realizada com soluções de

baixo pH ou por alta temperatura.

Vantagens:

Planificação mais simples.

Não exige reagentes altamente específicos.

Desvantagens:

Mais demorada e trabalhosa.

IMUNOCITOQUÍMICA MARCAÇÃO MÚLTIPLA

94

Figura 90 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gânglio linfático.

Figura 91 - Glicoforina A (castanho), CD20 (negro) e CD3 (vermelho) em baço.

Figura 92 - Insulina (castanho), Citoqueratina (negro) e CD34 (vermelho) em pâncreas.

Figura 93 – CD20 (castanho), Citoqueratina (negro) e AML (vermelho) em ap. ileo-cecal.

IMUNOCITOQUÍMICA CONCLUSÃO

95

16 CONCLUSÃO

Este Manual procura facultar aos Estudante e interessados em Imunocitoquímica uma

informação actual e aplicada em língua portuguesa. Na sua génese esteve principalmente a

experiência profissional do autor e uma revisão bibliográfica que se procurou que fosse ade-

quada. No entanto, muito ficou ainda por dizer e fundamentar, pelo que novas revisões sur-

girão, dando lugar a novos Manuais, que procurarão ser mais ajustados ao estado-da-arte

em vigor.

IMUNOCITOQUÍMICA CONCLUSÃO

96

IMUNOCITOQUÍMICA APÊNDICES

97

17 APÊNDICES

17.1 Apêndice 1 - Adesivação de lâminas - APES

1. Colocar as lâminas em acetona - 5 minutos.

2. Secar as lâminas ao ar.

3. Preparar solução APES 2% em acetona.

4. Colocar as lâminas em solução de APES 2% - 30 minutos.

5. Colocar as lâminas em água corrente – 10 minutos.

6. Passagem por água destilada.

7. Deixar secar “overnight”, à temperatura ambiente ou a 37ºC.

Notas:

a. APES - 3-AMINOPROPIL-TRIETOXISILANO (Sigma - 440140-500).

b. A solução de APES pode ser guardada no frigorífico para nova utilização.

c. Estas lâminas não possuem prazo de validade.

17.2 Apêndice 2 - Tampão EDTA 1 mM pH 8.0

Preparação da Solução Stock 100x concentrada.

1. Juntar 29,2 g de EDTA a 1000 cm3 de água Destilada.

2. Ajustar o pH com NaOH 0.1M para ajudar a dissolução.

Notas:

a. A solução stock deve se diluída a 1/100 antes da utilização e ajustar o pH com NaOH

0.1M.

b. Mergulhar as lâminas em 400 ml de solução tampão e colocar no forno microondas

durante 15 minutos à potência de 900 w (nunca deixar secar as lâminas).

c. Após recuperação, arrefecer gradualmente as lâminas em água corrente.

17.3 Apêndice 3 - Tampão citrato, pH 6.0

Para 5000 cm3 de solução:

1. Juntar 10.5g de Ácido Cítrico a 5000 cm3 de água destilada.

2. Acertar o pH a 6.0 com NaOH 2M (aproximadamente 60 cm3).

3. Adicionar 2,5 cm3 de tween 20 e homogeneizar.


98

17.4 Apêndice 4 - Tampão Tris/EDTA, pH9.0

Para 1000 cm3 de solução:

1. Juntar 1000 cm3 de água destilada a 1,21 g de Tris Base e a 0,37 g de EDTA.

2. Verificar o pH e se necessário corrigir para pH 9, com NaOH 2M.

3. Adicionar 0,5 cm3 de tween 20 e homogeneizar.

17.5 Apêndice 5 - Solução de pepsina 0,4% pH 1/2

1. Dissolver 0,4 g de pepsina em 100 cm3 de água destilada.

2. Adicionar 1 cm3 de Ácido Clorídrico

3. Acertar o pH entre 1 e 2 a 37ºC.

Notas:

a. a solução de pepsina é conservada no congelador e pode ser reutilizada até quatro

vezes.

b. Cada reutilização exige o acerto de pH.

c. Evitar diluir a solução em cada reutilização.

17.6 Apêndice 6 - Solução de bloqueio da Peroxidase Endógena

1. Medir 100 cm3 de água destilada.

2. Adicionar 3 cm3 de Peróxido de Hidrogénio 30% e homogeneizar.

17.7 Apêndice 7 – Protocolo de Técnica Imunocitoquímica LSAB

1. Desparafinar em xilol - 15 min.

2. Passagem em Álcool 100%.

3. Inibição da Peroxidase endógena em solução de bloqueio - 10 min.

4. Passagem por água corrente.

5. Recuperação antigénica.

6. Lavagem em PBS e colocação de meio hidrófobo em volta do corte.

7. Colocação em soro primário - 30 min.

8. Lavagem em PBS - 2 x 5 min.

9. Colocação em soro secundário biotinilado - 30 min.


11. Colocação em “soro terciário”- streptavidina conjugada com peroxidase - 30 min.


99


13. Revelação com solução de DAB - 5 min.

14. Lavagem em água corrente.

15. Contrastar com hematoxilina de Mayer.

16. Desidratar, clarificar e montar.

17.8 Apêndice 8 – Protocolo de Técnica Imunocitoquímica de Polímero Indi-

recto

1. Desparafinar em xilol - 15 min.

2. Passagem em Álcool 100%.

3. Inibição da Peroxidase endógena em solução de bloqueio - 10 min.

4. Passagem por água corrente.

5. Recuperação antigénica.

6. Lavagem em PBS e colocação de meio hidrófobo em volta do corte.

7. Colocação em soro primário - 30 min.


9. Colocação do Soro polímero indirecto - 30 min.


11. Revelação com solução de DAB - 5 min.

12. Lavagem em água corrente.

13. Contrastar com hematoxilina de Mayer.

14. Desidratar, clarificar e montar.


100

TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS LISTA BIBLIOGRÁFICA

101

18 LISTA BIBLIOGRÁFICA

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