UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANCENTRO DE ENGENHARIA E CINCIAS EXATASENGENHARIA QUMICA

ESTERILIZAO DO AR EM BIOPROCESSOS

Toledo - Paran2015ADAIR GALLO JUNIORJSSICA CAROLINE ZANETTEJULCIMARI CAROLINE SCHOSSLER DEAK

ESTERILIZAO DO AR EM BIOPROCESSOS

Trabalho sobre os tipos de esterilizao de ar, apresentado Universidade Estadual do Oeste do Paran, como requisito para a avaliao parcial da disciplina de Engenharia Bioqumica.Professor: Dr. Srgio Luiz de Lucena

Toledo Paran2015FAZER SUMRIO

1. INTRODUO

Os bioprocessos so etapas de transformao que ocorrem por meio de agentes biolgicos como clulas e enzimas. So conhecidos e utilizados pelo homem h milhares de anos, porm nas ltimas dcadas vm ganhando destaque como alternativas sustentveis e solues inovadoras para a indstria.Esse tipo de processo apresenta uma srie de caractersticas prprias, pois frequentemente trata-se de fazer crescer um microrganismo ou uma dada clula, seja microbiana, animal ou vegetal, exigindo a presena, desde o projeto da planta at sua operao em regime, de uma mentalidade prpria e particular em relao existente na indstria qumica no biolgica. Nos bioprocessos faz-se uso principalmente da biotecnologia, que a aplicao de conhecimentos qumicos e biolgicos e de novas tecnologias nas reas da sade, de alimentos, qumica e ambiental.A biotecnologia apontada como uma das reas de conhecimento que mais podem trazer benefcios humanidade e tambm como uma das reas profissionais com maior potencial de crescimento. As aplicaes da biotecnologia na forma de produtos, processos e servios esto presentes principalmente nas seguintes reas: Sade: produo de vacinas, antibiticos, probiticos, anticorpos monoclonais, kits para diagnstico; desenvolvimento e pesquisa de novos medicamentos e novas molculas bioativas. Alimentos e bebidas: alimentos e bebidas fermentados como queijo, po, vinagre, vinho, cerveja, aguardente, leite fermentado, iogurte; alimentos funcionais; aromas e corantes naturais; enzimas para diversas aplicaes. Agricultura: plantas transgnicas, bioinseticidas e bionematicidas, biofertilizantes, hormnios. Energia: biocombustveis como etanol, biodiesel, biogs e bio-hidrognio; culturas energticas melhoradas geneticamente. Meio-ambiente: tratamento de efluentes e biorremediao.Na maioria dos bioprocessos o acmulo do produto desejado depende da ao isolada do microrganismo responsvel pela sua sntese, logo, para obter resultados bons necessriaa utilizao de equipamentos e meios esterilizados, que possam permitir a conduo de processos em larga escala em condies de assepsia, em especial, a possibilidade de utilizao de grandes volumes de ar esterilizado, componente indispensvel aos processos biolgicos aerbios.O objetivo deste trabalho descrever as particularidades sobre os aerossis microbianos, indicar formas para se estimar a concentrao de microrganismos suspensos no ar e apresentar as principais formas disponveis para executar a esterilizao do ar para bioprocessos.

2. AEROSSIS MICROBIANOS

Aerossis microbianos so aqueles em que as partculas em suspenso no ar so microrganismos vivos. Provm, geralmente, dum aerossol lquido que apresentam um ncleo infeccioso, constitudo pelo microrganismo.As espcies microbianas suspensas no ar atmosfrico, assim como sua concentrao, podem ser extremamente variveis, dependendo de uma srie de fatores. Podem-se encontrar microrganismos de maiores dimenses, como bolores (fragmentos de hifas) e leveduras, assim como espcies de menores dimenses como bactrias ou seus esporos. Esses microrganismos so provenientes do solo, ou de plantas, ou ainda de cursos de gua, sendo postos em suspenso pelamovimentao do ar ambiente, sendo os de menores dimenses frequentemente associados a partculas de poeira. Dependendo do clima de uma dada localidade, ou mesmo de um dia para outro em uma mesma localidade, podem-se encontrar diferentes concentraes de microrganismos suspensos no ar, assim como distintas espcies de microrganismos suspensos. Ao se efetuar a contagem de microrganismos no ar em um ambiente livre de radiaes solares e com umidade relativa elevada, muito provavelmente obtm-se concentraes elevadas de clulas vegetativas. Ao contrrio, uma determinao feita aps longa exposio luz solar forneceria uma contagem preferencial de espcies mais resistentes, como os esporos de bactrias. Analogamente, a concentrao de microrganismos suspensos no ar drasticamente reduzida aps um perodo de chuvas e extremamente elevada aps um perodo de ventos fortes. Apesar das possveis variaes em uma mesma localidade, ao se efetuar determinaes de concentrao de microrganismos por longos perodos, obtm-se valores mdios relativamente prximos, como encontrados em alguns estudos j realizados.Essas informaes permitem refletir sobre o local de onde se deve proceder captao de ar para um processo. Esse local de captao no deve ser aleatrio, pois se pode acabar captando ar de locais muito contaminados, como seria o caso de se localizar a entrada de ar do sistema de compresso muito prxima do solo ou ainda voltada para locais particulares e sujeitos a um maior nvel de contaminao.Quanto s dimenses dos microrganismos suspensos no ar, podem-se considerar como representativos valores da ordem de 0,5 a 1,0 m, ou seja, dimenses de bactrias ou seus esporos. Por outro lado, as partculas de poeira, que frequentemente transportam os microrganismos, apresentam dimetros frequentemente superiores a 4m, sendo que os esporos normalmente no esto associados a estas partculas de poeira.

3. AMOSTRADORES

A determinao da concentrao de microrganismos suspensos no ar atmosfrico realizada atravs do uso de dispositivos designados genericamente por amostradores. Esses instrumentos no so apenas importantes por realizarem essatarefa, mas tambm porque so empregados para a verificao da efetiva esterilizao do ar destinado ao processo, ou na quantificao de eventuais contaminantes em reas ditas estreis. De uma forma geral, todos os amostradores operam de maneira semelhante, pois o princpio bsico deles consiste em reter, de alguma forma, os microrganismos suspensos em um determinado volume de ar, dando-se, a seguir, condies para que estas clulas proliferem, de maneira a tornar possvel a contagem de colnias, para a quantificao dos contaminantes no volume de ar amostrado. Tendo em vista essa descrio geral, pode-se concluir que: a) Dependendo da forma empregada para reter os microrganismos, no se pode assegurar que esta reteno seja total, podendo-se inclusive imaginar que haja distintas eficincias de coleta para diferentes amostradores; b) Dependendo da forma de retenodos microrganismos, pode-se tambm imaginar a possibilidade da ocorrncia de destruio de certas espcies; c) As clulas microbianas suspensas no ar podem estar associadas a partculas de poeira, podendo ocorrer a existncia de mais que uma clula por partcula. Por mais que se busque desagregar estes conjuntos, sempre difcil afirmar que uma colnia tenha tido, obrigatoriamente, origem em uma nica clula. Essa , inclusive, a razo pela qual os resultados so frequentemente expressos em nmero de partculas, ou de nmero de colnias por unidade de volume de ar amostrado; d) A etapa final da determinao consiste em contar colnias que se desenvolveram em um dado meio de cultura e, tendo em vista a grande variedade de microrganismos suspensos no ar, torna-se difcil eleger um meio no qual se possa afirmar que todas as espcies se desenvolvam em um dado intervalo de tempo.Uma primeira consequncia dos fatos acima apontados reside na dificuldade em comparar resultados obtidos pelo uso de diferentes amostradores, ou com um mesmo amostrador, porm operado de formas distintas. Outra consequncia clara a impossibilidade de se obter a concentrao total ou absoluta de microrganismos suspensos no ar atmosfrico. Uma forma de minorar esses problemas, especialmente quando se deseja efetuar testes de efetividade de esterilizao de um dado sistema, consiste em preparar uma suspenso de um dado microrganismo em ar, previamente submetido esterilizao. Esse ar, artificialmente contaminado com o microrganismo usado como marcador, passado atravs do filtro determinando-se a concentrao (ou o nmero) de microrganismos no ar antes e aps o elemento filtrante, desde que tambm se conhea o volume de ar amostrado, medindo-se a vazo de ar e o tempo do ensaio. Pode-se assim quantificar a eficincia de reteno () do filtro em teste:

Onde: N1: concentrao de microrganismos no ar antes da passagem pelo filtro (partculas ou colnias por unidade de volume);N2: concentrao de microrganismos no ar aps a passagem pelo filtro (partculas ou colnias por unidade de volume).O fato de se conhecer o microrganismo empregado para esse tipo de determinao significa que se conhece perfeitamente o aspecto das colnias que se quer contar (formato, aparncia e cor), alm de se conhecer o meio de cultura e as condies mais adequadas para a sua proliferao.A seguir sero apresentadas algumas caractersticas de alguns amostradores mais frequentemente empregados.

3.1. IMPINGER

O impinger um dos amostradores mais conhecidos e sobre o qual h muitas referncias. Existem inmeras verses desse amostrador, sendo um exemplo tpico o indicado na Figura 1,conhecido como "all-glassimpinger" (AGI).

FONTE: Biotecnologia Industrial Vol. 2 (pgina 67)Figura 1. All-glassimpinger (AGI) - (I) Entrada do ar; (2) Sada do ar (bomba de vcuo).Esse amostrador consta de um recipiente de vidro que contm 10 mLdo lquido coletor, que pode ser gua destilada, ou determinadas solues como a soluo gelatina-fosfato, constituda de gelatina (2 g.L-1) e Na2HPQ4 (4 g.L-1), qual se adiciona 0,01 mL de leo de oliva esterilizado, a fim de evitar a formao de espuma. Antes do incio da amostragem, todo o conjunto deve ser esterilizado. Ao se iniciar a amostragem do ar, liga-se a abertura 2, indicada na Figura 1, a uma bomba de vcuo, de forma a reduzir a presso no interior do recipiente. Dessa maneira, o ar entrar no amostrador atravs da abertura 1, borbulhando no lquido coletor atravs do tubo de vidro, o qual capilar em sua parte final para gerar bolhas de pequeno dimetro. Espera-se, portanto, que os microrganismos existentes no ar fiquem retidos no lquido. Terminada a tomada de amostra, o frasco agitado, a fim de promover a desagregao dos eventuais aglomerados de clulas, determinando-se, ento, a concentrao de microrganismos no lquido coletor, atravs dos mtodos usuais de diluies e contagem de colnias em placas. Conhecendo-se a vazo de ar e o tempo de amostragem, conhece-se o volume de ar amostrado, tendo-se, portanto, todos os dados necessrios para o clculo da concentrao de microrganismos neste ar.Uma das vantagens desse amostrador consiste no fato de no ser necessrio o uso de medidor de vazo de ar, uma vez executada a calibrao do aparelho, pois o tubo capilar funciona como um "orifcio crtico". Essa expresso significa uma condio de trabalho na qual a relao entre as presses reinantes nas extremidades do tubo capilar suficiente para produzir velocidade do ar igual do som. Essa velocidade no mais ultrapassada, mesmo que a presso do lado do vcuo diminua ou oscile abaixo desse valor crtico. Para o ar, a relao de presses de 0,53, significando que se a amostragem for efetuada de um ambiente presso de 1atm, a presso do lado do vcuo dever ser inferior a 0,53 atm, podendo inclusive oscilar entre valores abaixo deste e, mesmo assim, a vazo permanecer constante. Assim, uma vez construdo o instrumento, ele deve ser submetido a uma calibrao, para se conhecer a vazo de ar que ele permite, com a devida preciso.No caso do AGI, pode ocorrer a reteno no tubo de admisso do ar, para demonstrar isso, empregaram aerossol contendo cristal violeta, sendo que aps certo tempo de amostragem efetuavam uma lavagem no tubo de admisso, determinando a concentrao daquele corante atravs de um colorimetro. Demonstraram que no apenas ocorre essa reteno, como tambm que ela depende do tamanho da partcula, observando que para partculas de 20 um ocorre praticamente reteno total. Tambm ocorre a destruio de clulas vegetativas durante a amostragem.Uma vez constatados esses problemas com o AGI, desenvolveram um outro tipo de amostrador, que recebeu a designao de amostrador Shipe, indicado na Figura 2.

FONTE: Biotecnologia Industrial Vol. 2 (pgina 69)Figura 2 - Amostrador Shipe, (I) Orifcio crtico (entrada do ar); (2) sada do ar (bomba de vcuo)

Esse outro tipo de instrumento consiste ern um erlenmeyer de 125 mL, sendo a entrada de ar feita atravs de um "orifcio critico". Ele opera de forma similar ao AGI, colocando-se no erlenmeyer 25 mL do liquido coletor e ligando-se a sada de ar a uma bomba de vcuo. Devido a entrada do 'ar ern alta velocidade ser efetuada na superfcie do liquido, isto provoca um movimento circular do liquido coletor, sendo importante a localizao do orifcio de entrada, a fim de evitar uma excessiva umidificao das paredes do frasco. Como se pode observar,o amostrador Shipe no conta com o tubo de entrada, e ainda lana as partculas contra a superfcie do liquido coletor que esta em movimento. Isso evita a mencionada reteno e tambm reduz a possibilidade de destruio de clulas vegetativas.

3.2. AMOSTRAGEM POR FILTRAO

Existem vrios amostradores cujo principio bsico da amostragem a filtrao. Consistem em fazer passar o ar atravs de um elemento filtrante, o qual dever reter os microrganismos suspensos. Posteriormente, pode-se colocar esse material filtrante em suspenso em um volume conhecido de um liquido adequado, procedendo-se a uma agitao vigorosa, a fim de propiciar a passagem dos microrganismos retidos para o lquido. Finalmente, efetua-se a determinao da concentrao de microrganismos no liquido, pelas tcnicas usuais de diluies e contagem em placas. Conhecendo-se o volume de liquido sabe-se o nmero total de microrganismos retidos e, novamente, conhecendo-se a vazo do ar amostrado e o tempo de amostragem, tem-se todos os elementos para o clculo da concentrao de clulas no ar. Altenativamente, pode-se aps a passagem do ar atravs do elemento filtrante dar condies para que as clulas proliferem no pr6prio coletor, efetuando-se ento a contagem de colnias. Esse procedimento, quando possvel, evita o trabalho adicional de suspender as clulas em um liquido para posterior contagem. Um amostrador tpico dessa categoria o amostrador de algodo, esquematizado na Figura 3.

FONTE: Biotecnologia Industrial Vol. 2 (pgina 71)Figura 3 Amostrador de algodo, (I) Entrada do ar; (2) Sada do ar (bomba de vcuo). Aps a sua montagem ele deve ser submetido a esterilizao, preferencialmente por meio de calor seco (estufa), a fim de evitar o umedecimento das .fibras e a consequente perda de eficincia de reteno de microrganismos. A amostragem e realizada conectando-se a extremidade 2 a uma bomba de vcuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazo de ar. Aps o tempo de amostragem, o chumao de algodo retirado do amostrador e assepticamente transferido para um recipiente contendo um volume conhecido de gua esterilizada. Procede-se, ento, a uma vigorosa agitao, objetivando a passagem dos microrganismos retidos nas fibras para o lquido, efetuando-se a determinao da concentrao de microrganismos no liquido por contagem de colnias em placas. Esse amostrador apresenta uma serie de inconvenientes, como a dificuldade em suspender os microrganismos retidos, alem de provocar a destruio de clulas vegetativas. Altenativamente pode-se empregar l de vidro, mas de qualquer maneira a obteno de altas eficincias de coleta depende de se ter o material filtrante muito bem compactado, de forma a se observar uma perda de carga, no leito filtrante, relativamente elevada e da ordem de 0,5 kgf/cm.Uma forma mais conveniente de se efetuar amostragens por filtrao consiste no emprego de um amostrador que consiste em um suporte em ao inoxidvel, o qual abriga membranas Millipore 47 mm de dimetro e poros de 0,22 m ou 0,8 m, devendo ser previamente esterilizado. O sistema dispe de uma bomba de vcuo, que succiona o obrigando a passar atravs da membrana e tambm atravs de um orifcio critico, a fim de se ter uma vazo constante e conhecida. Terminada a amostragem, a membrana deve ser retirada assepticamente e colocada sobre a superfcie de um meio de cultura em pequenas placas de Petri. Aps tempo adequado de incubao, contam-se as colnias que aparecem sobre a membrana, obtendo-se, assim, a concentrao de microrganismos no ar amostrado. Ao que tudo indica, o desenvolvimento de amostradores que operam por filtrao atravs de membranas, teve seu inicio empregando um sistema cujo elemento filtrante consistia em papel filtro Whatman 40 e 42. Esse sistema original, esquematizado na Figura 4, era constitudo de um funil de alumnio, ao qual se adapta uma folha de papel-filtro apoiado em uma grade de ao inoxidvel. Entre a grade e a folha de papel coloca-se uma camada de algodo hidr6filo.

FONTE: Biotecnologia Industrial Vol. 2 (pgina 72)Figura 4 Amostrador de papel filtro.

Aps a esterilizao do sistema, ao se efetuar a passagem de ar atravs da folha de papel-filtro, o que poderia ser feito acoplando-se um segundo cone aps o elemento filtrante e este ligado a um orifcio critico e a uma bomba de vcuo, os microrganismos devem ficar retidos sobre esta folha. Terminada a amostragem, o sistema pode ser desmontado, adicionando-se a seguir um meio de cultura ao algodo hidrfilo, de forma a permitir, apos um certo perodo de incubao, a contagem de colnias surgidas na superfcie do papel-filtro.

3.3. AMOSTRADORES DE FENDA OU ORIFCIO

O principio bsico de funcionamento desses amostradores consiste em se fazer com que o ar amostrado incida, a uma dada velocidade, sobre a superfcie de um meio de cultura slido, havendo, em virtude de uma brusca mudana de direo do ar, o choque das partculas suspensas que nao acompanham as linhas de corrente, ocasionando a reteno destas partculas nesta superfcie. A Figura 5 mostra esquematicamente o amostrador de fenda.

FONTE: Biotecnologia Industrial Vol. 2 (pgina 73)Figura 5 Amostrador de fenda. (1) Placa de Petri; (2) Disco giratrio; (3) Tubo e fenda (entrada do ar); (4) Sada do ar para o medidor de vazo e bomba de vcuo; (5) Caixa metlica.Como se nota, consta de uma placa de Petri, contendo um meio de cultura slido preso a um disco horizontal giratrio, estando todo este conjunto no interior de uma caixa metlica, provida de uma janela que permite fechamento hermtico. O ar entra por um tuba vertical que possui, na extremidade inferior, uma fenda atravs da qual as partculas em suspenso no ar so lanadas contra a superfcie coletora. Uma vez esterilizado todo o conjunto, a sada de ar e conectada a uma bomba de vcuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazo de ar. Durante o perodo de amostragem, o disco gira com velocidade angular regulvel, em funo da contaminao do ar que se esta tomando como amostra, podendo-se imaginar valores desde 0,1 rpm ate cerca de 2 rpm. Aps a amostragem, a placa de Petri retirada do amostrador, fechada em condies de assepsia e incubada. Decorrido um intervalo de tempo adequado, conta-se o nmero de colnias que aparecem sobre o meio de cultura. Conhecendo-se a velocidade de rotao da placa, a vazo de ar e o nmero de colnias sobre o meio, ou parte de sua superfcie, tem-se todos os elementos para quantificar a contaminao do ar amostrado. No h como proceder a desagregao dos aglomerados de clulas, o que tambm ocorre com os sistemas, anteriormente descritos, nos quais se efetua a contagem diretamente sobre a superfcie coletora. Isso significa que cuidados devem ser tomados, especialmente quando se trabalha com aerossis de microrganismos definidos, a fim de evitar a presena de aglomerados, que podem ser aleatoriamente desfeitos sobre a superfcie coletora durante a amostragem, gerando contagens igualmente aleatrias. A eficincia de reteno de aerossis depende da vazo do ar, assim como da distncia da fenda ao meio de cultura. Determina-se um valor Maximo de 95% de reteno, quando empregavam vazes superiores a 28 L/min e 2 mm de distncia da fenda ao meio. Essa reteno diminui sensivelmente quando se reduz a vazo do ar, sendo que obtem-se retenes inferiores a 70%, operando com uma vazo da ordem de 56 L/min e uma distancia de 6 mm entre a fenda e o meio solido. Para amostragens muito prolongadas pode ocorrer ainda o inconveniente da perda de gua do meio de cultura slido, com a consequente abertura de fendas no meio, o que inutilizaria o ensaio efetuado. Apesar dos inconvenientes e cuidados apontados no que se refere a esse tipo de amostrador, ele apresenta certas vantagens sobre os demais. De fato, pode-se imaginar a realizao de teste de um determinado sistema para a esterilizao do ar, como por exemplo o teste de um determinado material filtrante, determinando de forma contnua a eficincia de esterilizao ao longo do tempo de operao do sistema. Pelo emprego de uma suspenso de um dado microrganismo conhecido, marca-se no meio de cultura a posio da fenda no instante inicial. Aps a incubao, pode-se proceder a contagem do nmero de colnias existentes em determinados setores da placa, os quais correspondero a certos intervalos de tempo conhecidos, desde que se conhea a velocidade de rotao da placa. Como se conhece a vazo, sabe-se o volume de ar amostrado ern cada setor da placa e, portanto, a correspondente concentrao de microrganismos no ar que passou pelo elemento filtrante ern teste. Pode-se, assim, determinar a variao da eficincia de reteno ern funo do tempo de amostragem, ou de operao do sistema de esterilizao. evidente que outros amostradores tambm permitem esse tipo de determinao, porm executada de forma intermitente, pois a cada amostragem h a necessidade de substituio do sistema de coleta do amostrador, para a realizao da contagem de partculas. No caso do amostrador em questo, isso no necessrio, bastando providenciar a substituio da placa, apos um giro completo, por outra esterilizada. Na verdade, esses testes de sistemas de esterilizao de ar, destinados a processos fermentativos, so de grande importncia, tendo ern vista a necessidade de alta confiabilidade.

4. MTODOS PARA ESTERILIZAO DO AR

A esterilizao do ar geralmente realizada atravs de meios filtrantes por questes de convenincia. Porm, pode ser feita tambm por outros mtodos como por radiaes ou aquecimento.4.1. ESTERILIZAO POR AQUECIMENTO

Microorganismos geralmente so mais resistentes ao calor seco do que ao calor umido. Por isso, quando se realiza esterilizaes por calor seco, as temperaturas devem ser mais elevadas e o tempo de permanncia tambm deve ser maior em relao ao calor mido. Alm disso, materiais particulados presentes no ar podem fornecer algum tipo de proteo trmica para o microorganismo, dificultando ainda mais a esterilizao.Em termos de esterilizao de ar para uso industrial, o mtodo por aquecimento leva grande desvantagem. A necessidade de grandes quantidades de ar faz com que o aquecimento seja muito dispendioso de energia, alm de se necessitar de tubulaes muito longas para se obter os tempos de residncia necessrios. Portanto, a esterilizao por aquecimento restringe-se a pequenas escalas, como laboratorail ou escala piloto, devido a tais problemas. Decker et al. determinaram a relao entre a temperatura e o tempo necessrios para eliminar 99,9999% dos esporos do Bacillus globigii usando um esterilizador por resistncia eltrica. Os resultados esto apresentados na figura X.

Percebe-se que o tempo necessrio para esterilizao cresce exponencialmente com o decrescimo da temperatura, mostrando o quo invivel este mtodo para escalas industriais. Um modelo de esterilizador por aquecimento de ar apresentado na figura X. Neste modelo o ar de entrada previamente aquecido em uma antecamara pelo ar de sada a fim de reaproveitar parte da energia.

Figura X Modelo de Esterilizador de ar por aquecimentoO ar necessrio para processos industrias, como fermentao por exemplo, deve ser introduzido no reator sob certa presso a fim de superar as resistncias impostas por filtros e a prpria coluna de lquido. Um compressor estacionrio do tipo helicoidal que opera numa vazo de 170 m3/min e descarga de 3kg/cm2 aumenta a temperatura do ar de 20 para 180. Este aumento no desprezvel e pode ser utilizado para eliminar clulas vegetativas do ar. A fim de se obter ar esterilizado e aumentar a eficincia do uso de energia, pode-se instalar um sistema de esterilizao por aquecimento na sada do crompressor. Assim, a energia necessria para elevar a temperatura mais alguns graus reduzida. importante mencionar que o ar deve ser resfriado antes de entrar nos reatores. O no resfriamento do ar implica em dificuldade no controle de temperatura no reator, alm de formao de gradientes de temperatura ao longo da coluna de lquido.

4.2. ESTERILIZAO POR RADIAES

Quando se considera o uso de radiaes para esterilizar o ar, deve-se levar em conta diversos fatores como o tipo de radiao, a eficincia na destruio de microorganismos, o custo da mesma, a periculosidade e os efeitos colaterais que pode causar. Portanto, a maioria das radiaes excluda automaticamente por serem muito perigosas ou custosas. As radiaes ultraviolentas (UV) so as nicas que apresentam aplicaes prticas para esterilizao do ar. Porm, por possuirem um baixo poder de penetrao, a esterilizao por este tipo de radiao necessita de tempos relativamente longos. Isso um problema para o uso industrial, pois h a necessidade de se esterilizar grandes volumes de ar. A principal aplicao prtica deste mtodo de esterilizao em salas asspticas para a esterilizao do ar contdo e de superfcies. O ar que fornecido a estas salas sofre um processo de esterilizao por filtrao prvia.

4.3. ESTERILIZAO POR FILTRAO

A esterilizao por filtao a tcnica mais empregada atualmente para esterilizao do ar, tanto em instalaes industriais como em pequena escala. uma tcnica que possui grande confiabilidade e tem a capacidade de fornecer grandes vazes de ar a um custo relativamente baixo.Os mais diversos tipos de materias j foram usados para filtrao, tais como carvo, algodo e papel. Posteriormente surgiram os filtros de materiais fibrosos como a l de vidro, materiais sinterizados como o vidro, metais, materiais cermicos, membranas, materiais polimricos, como o naylon, o teflon e os steres de celulose. Com o passar do tempo, as membranas polimricas porosas acabaram dominando a operao e substituram gradualmente os filtros de l de vidro.Em instalaes industriais, recomenda-se desenvolver um sistema de filtrao para cada etapa que necessite de ar esterilizado e no desenvolver um sistema central que fornea ar esterilizado para toda a instao. Os benefcios econmicos que um sistema central traz, no compensam os riscos de haver uma falha no sistema de filtrao e comprometer todas as operaes que so dependentes do ar esterilizado.

4.3.1. Filtros de materiais fibrosos

Estes filtros no tem mais tanta popularidade para uso industrial quanto antigamente. Porm, ainda so encontrados em algumas instaes. O principal material utilizado a l de vidro. Nesta operao o ar passa atravs do espao entre as fibras, e o material particulado, como microorganismos, fica retido ao longo das fibras. Um esquema de um filtro de l de vidro apresentado na figura X.

Figura X Esquema de um filtro de l de vidro industrialComo pode ser observado, um esquema bem simples. Possui altura de aproximadamente 2 a 3 metros, e dimetro de 1 a 1,5 metro. Na parte inferior a entrada de ar, que passa atravez da l de vidro e sai pela parte superior. A l de vidro sustentada por uma grande na parte inferior e superior do filtro. importante ressaltar que a instalao da l de vidro dentro do filtro deve ser feita de maneira cuidadosa a fim de garantir camadas bem compactas e homogneas. Isso ir impedir a formao de caminhos preferenciais de escoamento de ar, que causam a diminuio na eficincia do sistema. Quando a camada de l de vidro for muito espessa, pode-se instalar grades intermedirias para sustentao. Alm disso, para evitar o arraste das fibras, pode-se empregar mantas de l de vidro compactadas embebidas em resinas (cerca de 0,5 cm). Essas mantas tornam o leito filtrante menos espesso e mais regular.Na operao do filtro, deve-se procurar operar com temperaturas de ar superiores ambiente para evitar a formao de condensado no leito. Um leito umedecido perde muito a sua eficincia na reteno de aerosis. Geralmente aps a compresso do ar que aumenta sua temperatura, deixa-se esfriar at uma temperatura em torno de 50 a 60 para ento passar pelo filtro.Antes de se iniciar a operao ou aps a troca da l de vidro deve-se esterelizar completamente o filtro. Faz-se isso deixando-se passar ar quente de 180 a 200 por 2 horas ou, o que mais comum, faz-se a esterilizao por vapor saturado. Com presso de 1 kg/cm2 por 2 horas ou a 3 kg/cm2 por 1 hora. Como pode ser visto na figura X, abre-se a vlvula do vapor e deixa-se sair completamente o ar e o condensado pela sada na parte inferior. Aps a isso, fecha-se a vlvula e de maneira a aumentar a presso. Aps a esterilizao por vapor, importante abrir o equipamento e verificar se no ouve a compactao da l de vidro. Se ouve, preenche-se os espaos em que ouve compactao e repete-se o procedimento de esterilizao. Antes de iniciar a operao, importante passar ar quente at que o leito esteja completamente seco. Devido esterilizao por vapor, a l de vidro se degrada rapidamente, perdendo sua eficincia e aumentando a resistncia ao escoamento com o passar do tempo. Em geral, faz-se a esterilizao do filtro antes de cada fermentao na indstria, em mdia uma vez por semana. Com essa frequncia de esterilizao, o leito de l de vidro deve ser trocado em mdia a cada 4 meses. Por ser um material de dificil operao e que exige grande frequncia de trocas, este tipo de filtro perdeu muito espao para os filtros de membrana polimrica porosa. 4.3.2. Filtros de membranas

Os filtros de membranas geralmente so elaborados a partir de materiais polmericos, principalmente o politetrafluoretileno (PFFE ou Teflon). Possuem caractersticas hidrofbicas e apresentam poros na ordem de 0,2 a 0,45 m, menor que os microorganismos que so retirados. Por isso so tambm chamados de filtros absolutos.O uso de materiais hidrofbicos de grande importncia para tais filtros, pois eles permitem que ar em condies normais de temperatura seja filtrado, sem se preocupar com a umidade que ir se formar por condesao. Essa umidade no ficar aderida superfcie do filtro e escoar para o fundo, de modo a evitar o crescimento de microbiano. Alm de evitar o bloqueio dos poros e consequente aumento na perda de carga.Geralmente, para uso industrial, os filtros so apresentados na forma de cartuchos como pode ser visto na figura X.

Figura X Cartuchos para filtro polimricoEstes cartuchos so instalados no interior de um recipiente, geralmente de inox, que abriga vrios cartuchos. O ar entra pela parte externa do cartucho e passa atravs do meio filtrante, saindo pela parte interna do cilindro. Por se tratar de filtros absolutos, a filtrao independe da velocidade de entrada do ar, ao contrrio dos filtros de fibra. Porm, grandes velocidades de ar acarretam aumento exessivo na perda de carga, alm de gerar vibraes que podem comprometer o sistema de vedao dos cartuchos (anis de vedao que podem ser vistos na figura X). Para o dimensionamento deste sistema de filtrao, sabendo a vazo de ar requerida, basta escolher uma rea de filtrao adequada para que a velocidade superficial no seja to elevada, causando excessiva perda de carga. A equao que relaciona essa variveis a seguinte:

Onde, Q a vazo de ar, v a velocidade superficial e A a rea do filtro. As figuras X e X apresentam alguns dados da perda de carga em funo da vazo de ar empregada para dois tipos de cartuchos.

Figura X Perda de carga em funo da vazo de ar (N: condies normais) para o filtro cartucho de 10 polegadas da Millipore Co.

Figura X Perda de carga em funo da vazo de ar (N: condies normais) para o filtro cartucho de 40 polegadas da Millipore Co. Tais dados, geralmente so dados pelos fabricantes dos filtros, e podem ser utilizados para se determinar um ponto timo de operao, com o nmero certo de cartuchos a fim de se operar com uma vazo baixa por cartucho. interessante notar que o aumento no comprimento do cartucho, aumenta a rea e por consequncia diminui a perda de carga. Alm disso, a variao na perda de carta em funo da presso de entrada se d devido ao aumento da densidade do ar com a presso. Assim, uma maior quantidade de ar escoa e a perda de carga reduzida.Indica-se ainda a instalo de filtros mais simples previamente aos filtros de membrana para retirar o particulado mais grosso. Isso aumenta a vida til dos filtros de membrana.A operao de esterilizao do filtro semelhante dos filtros de fibras. Basicamente, introduz-se vapor, previamente filtrado, pela parte inferior do filtro, deixando a vlvula 1, apresentada na figura X, aberta para expulso do ar. Aps a expulso do ar, fecha-se a vlvula e deixa-se esterilizar pelo tempo necessrio. Este tempo em mdia de 30 minutos a 145. A vida til de um filtro de membrana pode variar de 1 a 3 anos, considerando-se uma esterilizao por semana.

Figura X Esquema de instalao de um filtro de membrana polimricaAps a instalao dos filtros, recomendada que sejam feitos testes de vedao, alm dos testes com o ar filtrado, utilizando amostradores, a fim de garantir a eficincia do filtro. Geralmente estes testes so realizados pela prpria empresa que fornece os filtros.

4.3.3. Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air)

So filtros feitos a partir de placas de acetato de celulose ou de fibra de vidro, portante no deixam de ser um tipo de filtro de fibras. Geralmente so instalados em salas asspticas, reas limpas ou capelas. A eficincia de remoo de partculas para os filtros feitos com acetato de celulose de 99,97% para partculas de dimetro mdio de 0,3 m, e para os de fibra de vidro supeior a 99,97% para partculas superiores a 0,5 m. As fibras de vidro apresentam dimetros entre 0,5 e 2 m e o espao entre as fibras muito maior que 0,3 m. Porm, ainda assim, tais filtros so eficientes para remover tais partculas. importante ressaltar que os filtros HEPA so projetados para reter com eficincia partculas muito finas, mas eles no filtram gases e molculas odorferas. Sendo necessrio um sistema com carvo ativado para tal finalidade.Os filtros HEPA apresentam uma baixa perda de carga devido grande rea superficial que possuem. Isso possibilita o uso de ventiladores ao invs de compressores para a sua operao. Os fatores mais importantes a considerar num filtro HEPA so o dimetro das fibras, a espessura do filtro e a velocidade das partculas.As partculas so retidas no filtro por uma combinao de 3 mecanismos: Impacto: Onde as partculas de grandes dimenses no so capazes de evitar as fibras enquanto seguem um fluxo de ar e so levadas a um impacto direto com uma delas. Este efeito aumenta com a diminuio da separao entre as fibras e com o aumento da velocidade do fluxo de ar. (predomina em partculas de mais de 0,4 m). Interceptao: Onde as partculas que seguem um fluxo de ar entram em contato com uma fibra e aderem a ela. Difuso: Um mecanismo adicional, que resultado da coliso de molculas de gs com as partculas menores, especialmente aquelas com menos de 0,1 m, o que impede e retarda sua passagem atravs do filtro. Este comportamento semelhante ao movimento browniano e aumenta a probabilidade de que uma partcula seja detida por um dos dois mecanismos anteriores. o mecanismo dominante quando o fluxo de ar lento. (predomina em partculas inferiores a 0,1 m)A difuso predomina em partculas inferiores a 0,1 m, enquanto que a interceptao e o impacto predominam em partculas de mais de 0,4 m. Quando a partcula tem dimetro prximo ao tamanho de partcula mais penetrante (Most Penetrating Particle Size ou MPPS), 0,3 m, a difuso e a interceptao so comparativamente ineficientes. Como este o ponto mais fraco do desempenho do filtro, as especificaes HEPA utilizam a reteno destas partculas para classificar o filtro. Um esquema de um filtro HEPA pode ser visto na figura Y.

Figura Y Esquema de um filtro HEPA A figura X apresenta um esquema de capela que opera com fluxo laminar de ar em que um filtro HEPA est instalado.

Figura X Modelo de capela com fluxo de ar laminar e filtro HEPAO ar desce atravs da capela em fluxo laminar com velocidade em torno de 50 cm/s. importante notar que para garantir a esterilizao da capela, geralmente deixa-se uma luz UV ligada por um tempo antes de iniciar os trabalhos. O mesmo esquema pode ser usado em uma sala assptica em uma indstria ou hospital.

5. CONCLUSO

A esterilizao do ar para processos fermentativos exige uma rigorosa conduo em condies de assepsia e o mtodo mais adequado o dos filtros de membranas polimricas hidrofbicas. No entanto, esses filtros devem ser adequadamente projetados, evitando-se o emprego de velocidades excessivas de ar atravs da membrana esterilizante, a fim de se contar com baixas perdas de presso.Igualmente, deve-se haver todo o cuidado com a instalao, buscando uma efetiva vedao do sistema, para que no ocorra contato entre o ar esterilizado e o ar atmosfrico. Uma soluo o emprego de pr-filtros, os quais podem ser substitudos com uma maior frequncia, a fim de ampliar o tempo de operao da membrana esterilizante. Tanto os pr-filtros como os filtros devem ser substitudos, portanto necessrio um fcil acesso ao sistema, a fim de que esta operao possa ser rpida e efetuada com segurana. No caso dos processos fermentativos contnuos, nos quais se espera uma operao ininterrupta por vrias semanas, interessante a instalao de dois filtros em paralelo para cada reator. Dessa forma, pode-se providenciar a esterilizao de um filtro aps certo tempo de operao sem interromper o processo.

6. REFERNCIAS

BORZANI, W.; AQUARONE, E.; LIMA, U. A.; SCHMIDELL, W.;Biotecnologia Industrial. Volume 2, Editora Edgard Blcher LTDA.MELLO, M. T.; Aerossis Microbianos Proteo contra Aerossis Infectantes em Tcnicas Bacteriolgicas. Seo de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil.http://www.eolss.net/sample-chapters/c17/e6-58-04-02.pdf