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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
ARIANE NORONHA NASSAU CRUZ
ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA NEUROMUSCULAR POR
MICROCORRENTE, NA CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA
PÓS-OPERATÓRIA. ANÁLISE DO COLÁGENO EM
RATOS
Mogi das Cruzes, SP 2007
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
ARIANE NORONHA NASSAU CRUZ
ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA NEUROMUSCULAR POR
MICROCORRENTE, NA CICATRIZAÇÃO CUTÂNEA
PÓS-OPERATÓRIA. ANÁLISE DO COLÁGENO EM
RATOS
Dissertação apresentada à Comissão da
Pós-Graduação da Universidade de Mogi
das Cruzes como parte dos requisitos para
a obtenção do Título de Mestre em
Engenharia Biomédica.
Orientador: Profº. Drº. Jean Jacques Bonvent
Mogi das Cruzes, SP
2007
2
Financiamento: CAPES – Bolsa da aluna; FAEP/UMC – Bolsa de pesquisa do orientador
Dedicatória
Dedico esse trabalho aos meus futuros alunos, para que possam refletir sobre a
necessidade de uma busca constante por novos conhecimentos. Para que sirva de
estímulo a novas pesquisas e ao desejo de contribuir com publicações científicas; como
um caminho honesto de participação intelectual, crescimento e realização pessoal. Que
a humildade seja uma companheira amiga nas tentativas vãns, pelo absoluto.
Dedico também a minha família, no qual se justifica a minha vontade de ser cada vez
melhor e a todos aqueles que acreditaram em mim.
Dedico ao meu filho, que representa a força propulsora do meu desejo de aprender.
AGRADECIMENTOS
A Fundação de amparo ao ensino e pesquisa (FAEP) da UMC.
A coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES), pelo apoio
financeiro.
Ao núcleo de pesquisa e tecnologia (NPT) da UMC, e ao laboratório de estimulação de
tecidos, (LeMovTec) por me apresentar um novo mundo em recursos e principalmente
ao orientador Profº Drº Jean-Jaques Bonvent, que significou mais que um mestre, um
verdadeiro mentor.
A coordenadora do programa de mestrado Profª Drª Annie France por seu apoio.
Agradeço principalmente Àquele em que tudo posso, em que tudo é possível, Deus meu
Senhor e a minha grande família, pais, sogros, irmã e primas e a pequena família, meu
marido Wilson Júnior e o meu filho Wilson Neto.
Aos amigos cativados nessa jornada, sem os quais a jornada não seria tão significativa
para o meu amadurecimento. A todos que deixaram um pouco de si e levaram um pouco
de mim, àqueles que aprenderam que nos tornamos eternamente responsáveis por
aqueles que cativamos. Citarei alguns dos quais dividi essa fase da minha vida, pessoas
como a Ingrid, Talie, Rafa, Tânia, Ana Maria, Ricardo, Ivan, Jacque, Jaqueline, Mônica,
Fred, João, Lyvyam e William, entre outros que passaram construindo sonhos e
expectativas, diferentes mas com algo em comum, a vontade de fazer a diferença.
Agradeço o auxílio da equipe do Biotério, Profº Maurício, Douglas, aos estagiários e ao
Paulo.
E a você que hoje lê este trabalho, pois sempre foi a minha maior preocupação, poder
contribuir para uma sociedade melhor.
São tantos nomes, a quem gostaria de agradecer, que sei que um muito obrigada sincero
atinge a todos aqueles que fazem parte da minha história.
OBRIGADA.
“O fracasso jamais o surpreenderá se sua vontade de vencer for suficientemente forte.”
Og Mandino
RESUMO
Após uma intervenção cirúrgica, o corpo tende a manter a homeostasia, o equilíbrio das funções normais de todo o organismo e do tecido lesado. Vários procedimentos e técnicas podem ser empregados para acelerar a cicatrização e melhorar a qualidade do tecido cicatricial. Dentre essas técnicas a eletro-estimulação tem mostrado resultados promissores. Existe um interesse crescente em relação ao uso de correntes de baixa intensidade (microcorrentes), cujos efeitos são em nível celular (bio-eletricidade) e sub-sensoriais. Entretanto, há controvérsias sobre a eficácia da aplicação dessas correntes na faixa de micro-ampères no reparo tecidual. O objetivo deste trabalho foi analisar a influência da MENS (Microcurrent Eletric Neuromuscular Stimulation) sobre a densidade de colágeno tipo I e III, nas fases inflamatória, proliferativa e de maturação, da cicatrização de ferida pós-operatória suturada. Para realização do trabalho, foram utilizados 30 ratos Wistar, que foram submetidos a dois cortes cirúrgicos, sendo um controle e outro para aplicação da MENS na intensidade de 300 µA. Os ratos foram divididos em 3 grupos de 10 animais. O grupo 1 (G1) foi submetido à microcorrente do primeiro dia até o terceiro dia; o grupo 2 (G2) foi submetido a microcorrente do primeiro dia ao sétimo dia e o grupo 3 (G3) foi submetido a microcorrente do primeiro dia ao décimo quarto dia. Amostras de tecidos de pele, da região da lesão, foram analisadas a partir de lâminas histológicas, cujas imagens foram capturadas por uma câmera digital acoplada a um microscópio óptico, entre polarizadores cruzados. A quantificação do colágeno tipo I e III foi feita mediante um software de imagem especialmente desenvolvido para esta finalidade. Os resultados obtidos mostram que, através de testes estatísticos de t-student e Anova one-way (Tukey), nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os tipos de colágeno (I e III); entretanto, houve diferença significativa do colágeno total no 14º dia, na região da derme reticular, entre o grupo tratado e o controle. Pode-se concluir que a aplicação da MENS permite um aumento de fibras colágenas tanto do tipo I quanto do tipo III, no início da fase de maturação na derme.
Palavras chaves: cicatrização, estimulação elétrica, microcorrente, colágeno tipo I e III
6
ABSTRACT
After a surgical intervention, the body tends to keep the homeostasy, the balance of the normal functions of all organism and wound tissue. Many procedures and techniques can be employed to promote healing and to improve the quality of the scar tissue. Among these techniques the electro-stimulation has shown promising results. Indeed, there is a great interest related to the use of low intensity currents (microcurrents), which effects are at a cellular level (bio-electricity) and sub-sensorial. However, there are controversies about the efficiency of applying such micro-amperes level currents in repairing wound tissues. The objective of this work is to analyze the influence of MENS (Microcurrent electric Neuromuscular Stimulation) on the density of collagen type I and III, in the different phases of the healing of the pos-chirurgical wound, i.e., inflammatory, proliferative and maturation. In order to perform this work, 30 Wistar rats were submitted to two surgical cuts, one being used as the control wound and the other submitted to MENS (300 µA of the intensity). The rats were divided into 3 groups of 10 animals: Group 1 (G1) was submitted to MENS from the first day to the third day; Group 2 (G2) was submitted to MENS from the first to the seventh day and group 3 (G3) was submitted to MENS from the first to the fourteenth day. Samples of skin tissue, from the wounded area, were analyzed to histological sections, whose images were captured by a digital camera coupled to an optical microscope, between crossed-polarizers. The quantification of collagen type I and III was performed using image analysis software, specially developed for this purpose. The results show that, by means of statistical tests t-student and Anova one-way (Tukey), no significant difference was found between the collagen types (I and III); however, there was significant difference of total collagen in the fourth day, in the area of the reticular dermis, between the treated group and the control one. We conclude that MENS allows an increase of collagen fibers either from type I as well as type III, in the beginning of the maturation phase in the dermis. Keywords: Healing, electrical stimulation, microcurrent, collagen type I and III.
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparações entre os parâmetros de microcorrentes utilizados na literatura...........17
Tabela 2: Principais tipos de colágeno, com a localização e a função. ............................ ........26
Tabela 3: Descrição das etapas para confecção do bloco para as lâminas histológicas ............ 45
Tabela 4: Colágeno total, ColTot(%), na região superficial (R1) ............................................ 56
Tabela 5: Colágeno total, ColTot(%), região central (R2)...................................................... 56
Tabela 6:Colágeno total, ColTot(%), região profunda (R3) ................................................... 56
Tabela 7: Razão de colágeno, RR_G, região superficial (R1)................................................... 56
Tabela 8: Razão de colágeno, RR_G, região central (R2) ......................................................... 57
Tabela 9: Razão de colágeno, RR_G, região profunda (R3)...................................................... 57
Tabela 10: média e desvio padrão dos colágenos totais, ColTot(%), das regiões, R1,R2 e R3,
no 3º, 7º e 14º dias. ................................................................................................................. 57
Tabela 11: Média e desvio padrão das razões, RR_G, entre os colágenos tipo I e III, das regiões,
R1, R2 e R3, no 3º, 7º e 14º dias ............................................................................................. 58
Tabela 12: Valor p da comparação entre os grupos tratados e controles, referentes ao colágeno
total, nas três regiões da lesão. ................................................................................................ 61
Tabela 13: Valor p da comparação entre os grupos tratados e controles, referentes à razão, nas
três regiões da lesão................................................................................................................ 61
Tabela 14: Valor p da comparação da densidade de colágeno total entre o 3º, 7º e 14º dias,
para cada região...................................................................................................................... 62
Tabela 15: Valor p da comparação da razão de colágeno tipos I / III, entre o 3º, 7º e 14º dias,
para cada região...................................................................................................................... 62
Tabela 16: Valor p da comparação da densidade de colágeno total entre o 3º e 7º e entre o 7º e
o 14º dias, para cada região..................................................................................................... 62
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: A pele e suas divisões anatômicas: epiderme, derme e hipoderme........................... 18
Figura 2: Epiderme e as suas divisões, (a) Representação esquemática; (b) Imagem obtida
num microscópio óptico, com aumento de 50x, de uma lamina histológica, corada com
Tricrômio de Mallory. ............................................................................................................ 19
Figura 3: Ilustração da migração de uma célula de fibroblasto, mostrando a direção do
movimento, os prolongamentos celulares formando a margem de ataque, a profilina e a zona
de polimerização de actina...................................................................................................... 23
Figura 4: Estrutura em tripla hélice, mostrando a conformação das cadeias do colágeno, com a
repetição periódica de prolina, responsável pelo enrolamento das cadeias. .............................. 25
Figura 5: Imagens, obtidas num microscópio óptico com polarizadores cruzados, do colágeno
da derme corado com picrosirius red. a) as fibras vermelhas correspondem ao colágeno de tipo
I; b) as pequenas fibras verdes são as fibras de colágeno tipo III. Aumento de 500x................ 26
Figura 6: Fases da cicatrização em relação ao tempo.( Robbinson;Collins, ) ......................... 28
Figura 7: Imagem obtida num microscópio óptico (com aumento de 50x), de uma lâmina
histológica mostrando a divisão entre a derme sem lesão (lado esquerdo) e com lesão (lado
diretio), corada pela técnica de tricrômio de mallory............................................................... 30
Figura 8: Formato de ondas a) contínua; b)alternada; c) pulsada ............................................ 32
Figura 9: Formato de onda da microcorrente gerada pelo aparelho da IBRAMED . ............... 35
Figura 10: Tricotomia com lâmina no 40 sem lesionar a pele do animal. ................................ 41
9
Figura 11 Imagens mostrando as regiões dos corte cirúrgicos; (a) demarcação da região para a
realização da lesão, com auxílio de um ‘punch’; (b) as duas lesões, antes da satura................. 41
Figura 12: a) Imagem das lesões, após a sutura; b) Detalhes das duas lesões, sendo uma para
aplicação da Mens e outra para controle.................................................................................. 42
Figura 13: Imagem (a) do eletroestimulador utilizado e (b) da visualização do sinal elétrica na
tela do osciloscópio ................................................................................................................ 43
Figura 14: (a) Disposição das duas canetas utilizadas para aplicação de microcorrente na lesão
com o rato na caixa de contenção, (b) posicionamento das canetas na lesão. ........................... 44
Figura 15:. Imagem da caixa de fixação da máquina fotográfica, contendo a caixa de
contenção. .............................................................................................................................. 44
Figura 16: Rato A com corte tratado e corte controle no dorso, separados 2 cm, com o corte
superior tratado e o inferior controle. ...................................................................................... 45
Figura 17: (a) Bloco de parafina contendo o região da lesão (em amarelo) (b) Esquema
representando os possíveis cortes transversais no fragmento de tecido com a região da lesão.. 46
Figura 18: Lâmina histológica com dois cortes histológicos contendo a lesão e um esquema
ilustrando os dois cortes (a) região periférica e (b) região central ............................................ 45
Figura 19: Esquema de sistema de captura de imagens para análise das lâminas histológicas 467
Figura 20: Ilustração da divisão da lâmina vista em aumento de 50X em três Regiões R1, R2,
R3, padronizadas no microscópio por uma rotação correspondendo a 5 mm...........................
488
Figura 21: Regiões analisadas em aumento de 200x, visualizadas entre os polarizadores
cruzados referentes à região (a) Superficial, R1; (b) central, R2 e (c) profunda, R3................. 49
Figura 22: Interface do programa de análise de imagem, com a imagem em aumento de 20x
entre polarizadores cruzados, a sobreposição da imagem para controle dos parâmetros
10
determinados para reconhecimento dos tons de vermelho e verde na imagem em
pixel...........499
Figura 23: Arquivo de texto programado para reconhecer os grupos G1, G2, G3, o nº da
lâmina processada de 1 a 20, a classificação entre tratada (t) e controle (c) e as regiões às quais
pertenciam , sendo mais superficial (1R), central (2R), ou profunda (3R ), com os valores
correspondentes a área em pixel.......................................................................................... 5050
Figura 24: a) cicatrizes das lesões superior e inferior após 7 dias, b) ampliação da região da
lesão (superior) tratada (c) ampliação da região da lesão (inferior) controle ........................... 51
Figura 25: a) cicatrizes no 7o dia, após remoção dos pontos de sutura; b) ampliação da região
da lesão tratada; (c) ampliação da região da lesão controle...................................................... 52
Figura 26: Imagens obtidas com aumento 100x, no microscópio óptico (polarizadores
paralelos) das laminas confeccionadas com Azan-Mallory. (a) na região da lesão tratada com
MENS; (b) na região da lesão controle no 7º dia. .................................................................. 52
Figura 27: Imagens obtidas com aumento 100x, no microscópio óptico (polarizadores
paralelos) das laminas confeccionadas com Azan-Mollary. (a) na região da lesão tratada com
MENS; (b) na região da lesão controle no 7º dia ................................................................... 53
Figura 28: Imagens obtidas com aumento 100x, no microscópio óptico, das laminas
confeccionadas com Picro-Sírius Red. a) entre polarizadores paralelos; e b) com polarizadores
cruzados. ................................................................................................................................ 53
Figura 29: Imagens obtidas no microscópio óptico, com aumento de 20X, mostrando a área
com lesão, na região central do corte. ..................................................................................... 54
Figura 30: Percentual do colágeno total, dos grupos tratado e controle, em relação às àreas: (a)
superficial; (b) central e (c) profunda ...................................................................................... 55
Figura 31: Razão entre o colágeno do tipo I e tipo III, dos grupos tratado e controle, em
relação às àreas: (a) superficial; (b) central e (c) profunda ...................................................... 59
11
12
Lista de abreviaturas e siglas
MENS: estimulação elétrica neuromuscular por microcorrente µA : micro-ampère mA: miliampère µm micrometro CC: Corrente Contínua CA : Corrente Alternada HE: Hematoxilina eosina
13
Sumário
1. INTRODUÇÃO ...........................................................................................15
1.1 Motivação....................................................................................................................16
1.2 Justificativa .................................................................................................................16
1.3 Objetivo.......................................................................................................................17
2. CONCEITOS TEÓRICOS ASSOCIADOS AO PROJETO .....................18
2.1 A pele...........................................................................................................................18 2.1.1 A epiderme ............................................................................................................19 2.1.2 A derme .................................................................................................................20
2.2. A hipoderme...............................................................................................................20
2.3 O tecido conjuntivo .....................................................................................................20 2.3.1 Fibroblastos ...........................................................................................................21 2.3.2 Fibras colágenas.....................................................................................................23
2.4 Processo de reparo tecidual ou processo cicatricial...................................................27 2.4.1 Fase inflamatória....................................................................................................28 2.4.2 Fase proliferativa ou de granulação ........................................................................29 2.4.3 Fase de modelamento ou maturação .......................................................................30
3. CONTEXTUALIZAÇÃO ...........................................................................32
3.1 Efeito da Eletro-estimulação na cicatrização.............................................................32
3.2 Estimulação elétrica por microcorrente na cicatrização...........................................34
3.3 Estudos Comparativos entre a microcorrente e outras técnicas de reparo tecidual 38
4. METODOLOGIA........................................................................................40
4.1 Procedimento cirúrgico ..............................................................................................40
4.2 Eletroestimulação (MENS).........................................................................................42
4.3 Análise qualitativa da cicatrização.............................................................................44
4.4 Análise histológica.......................................................................................................45
4.4.1 Observações no microscópio óptico com luz polarizada......................................47
14
4.5 Processamento das imagens........................................................................................49
4.5.1 Processamento em Lote.........................................................................................50
4.6 Análise estatística........................................................................................................51
5. RESULTADOS............................................................................................52
5.1 Análise qualitativa ......................................................................................................52
5.2 Análise histológica.......................................................................................................53
5.3 Análise estatística........................................................................................................61
6. DISCUSSÃO ................................................................................................63
7. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS ........................................66
REFERÊNCIAS .............................................................................................67
ANEXO - PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA CEMEA ................................72
APÊNDICES........................................ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
15
1. Introdução
O processo cicatricial é um tema importante para toda a equipe multidisciplinar da área
da saúde. Pesquisas que colaboram com recursos de fácil acesso e que visam diminuir as
infecções, o tempo de cicatrização e melhorar a qualidade final da cicatriz, são de grande
importância para os profissionais que lidam com o paciente no pós-operatório. As intervenções
cirúrgicas geralmente deixam uma cicatriz de extensão variável, dependendo do local, do ato
cirúrgico e outros fatores internos (NETO, 1994). A cicatrização ocorre com a finalidade de
restabelecer a homeostasia do tecido, com alterações da sua atividade funcional pela formação
do tecido fibroso (BALBINO et al, 2005). A cicatrização é um parâmetro de cirurgia bem
sucedida, pois quanto menor for a duração das fases, inflamatória, proliferativa ou de
granulação e a de maturação, menores serão as chances de contaminações e a qualidade do
tecido cicatricial.. Também convém ressaltar que a formação rápida do tecido fibroso,
constituído por fibras colágenas, possibilita um melhor restabelecimento da força de tensão do
tecido e conseqüentemente da cicatriz. (COTRAN,1996;GYTON, 1997;MAIO,2004).
As cicatrizes podem levar à alterações psicológicas, desconfortos e debilidades físicas
(LEDERMAN; 2001). Vários recursos são utilizados pelos profissionais que lidam com o
paciente no pós-operatório, tais como medicamentos, curativos, nutrição e técnicas específicas
como intervenções eletroterapêuticas que utilizam a corrente elétrica como recurso físico não-
invasivo para tratar e previr infecções, como também diminuir a dor e acelerar o processo de
reparo tecidual (GUIRRO e GUIRRO, 2003). Entretanto, existem controvérsias a respeito dos
mecanismos envolvidos no processo de cicatrização estimulados por diferentes tipos de
corrente elétrica.
A estimulação elétrica utilizando baixas correntes, na ordem de microampères, é
considerada como uma estimulação compatível aos valores das correntes endógenas, que
segundo Cheng et al (1982); e Okuno et al (1986) agem no organismo em nível celular,
16
interagindo no processo de reparo tecidual, acelerando a cicatrização e melhorando a qualidade
do tecido cicatricial.
1.1 Motivação
O mecanismo de interação da microcorrente no tecido não excitável é alvo de muitas
pesquisas. No reparo tecidual, há uma variação enorme em relação ao tipo de lesão e ao tecido
estudado em diferentes tempos e parâmetros, porém expande o vasto campo de atuação do
pesquisador, frente às possibilidades de uso dessa modalidade de corrente.
Até o momento não foram encontradas na literatura pesquisas científicas analisando os
efeitos da microcorrente na modalidade MENS (microcurent electrical neuromuscular
stimulation), sobre a síntese dos colágenos I e III em feridas cirúrgicas, o que contribui sobre a
hipótese sobre seus efeitos no aumento da síntese protéica no reparo tecidual.
Devido à relevância da aceleração do processo de cicatrização, tanto no bem estar do
paciente, quanto na saúde, a investigação de um método que possua as vantagens clínicas
como a terapia com microcorrentes é considerável. Em relação a outras modalidades de eletro-
estimulação, a aplicação da microcorrente, além de não ser invasiva, está baseada em efeitos
em nível celular (CHENG, 1982) devidos ás baixas intensidades da ordem da corrente
endógena do corpo, promovendo efeitos sub-sensoriais (indolor). Além disso, este método não
apresenta efeitos colaterais, apresentando de baixo custo e fácil aplicação.
1.2 Justificativa
Alguns estudos realizados com o uso de correntes elétricas de baixa intensidade,
denominadas microcorrentes, evidenciaram uma aceleração do processo de cicatrização
(ALVAREZ et al.,1983; VODOVNIK e KARBA,1992; CANSERVEN e ATALAY,1996;
17
SANTOS,2002). Enquanto, outros autores não encontraram efeitos positivos na aplicação de
correntes nas intensidades de microampêres (LEFFMAM et al.,1994; BYL et al.;1994).
Porém, a variabilidade dos parâmetros utilizados na literatura, em relação ao reparo tecidual,
dificulta a comparação inter-estudos dessa modalidade de corrente.
De uma maneira geral, os estudos in vivo mostram uma forte discrepância no que diz
respeito aos parâmetros empregados na aplicação da microcorrente para o reparo tecidual,
como mostra a Tabela 1, elaborada com o objetivo de otimizar a escolha desses parâmetros
para o nosso estudo.
Tabela 1:Comparações entre os parâmetros de microcorrentes utilizados na literatura.
Autores
corrente
Intensidade
Duração
Periodicidade
Tempo
tratamento
Aplicação
Carley et al. (1985)
CC 100 µA 2 h 2 vezes / dia 5-7 dias Cicatrização em úlceras (humano)
Byl et al. (1994)
CA 100 µA
1 h Diário 5 dias Cicatrização Incisão cirúrgica (Porcos)
Leffmann et al. (1994)-
CA 100 µA
2 h diário 14 dias Cicatrização cutãnea Incisão circular (ratos)
Taskan et al. (1997)
CC 300 µA 30 min Diário 30 dias Cicatrização de incisão aberta (ratos)
Reger et al.(1999)
CC
CA
600 µA
7-10 mA
2 h 5 vezes na
semana
30 dias. Úlceras de decúbito (porcos monoplégicos)
Demir et al. (2004)
CC 300 µA 0-30 min Diário 10 dias Cicatrização (ratos)
Santos et al. (2004)
MENS 50 µA
20 min 2 dias 21 dias Restauração da pele (ratos)
1.3 Objetivo
O objetivo deste estudo foi quantificar os efeitos da estimulação elétrica neuromuscular
por microcorrente (MENS) sobre a densidade do colágeno tipo I e tipo III, nas diferentes fases
da cicatrização em ratos, no pós-operatório com sutura.
18
2. Conceitos Teóricos Associados ao Projeto
2.1 A pele
A pele é um órgão de revestimento do corpo dividido anatomicamente em: epiderme,
derme e hipoderme (Figura 1). Possui função relacionada à proteção mecânica e imunológica,
homeostase térmica e química com o meio ambiente, reflete alterações internas, tem grande
importância estética e psicológica.
A pele se origina de folhetos embrionários ectodérmicos e mesodérmicos. Do ectoderma
se origina os folículos pilosos, as glândulas sudoríparas e as unhas, do neuroectoderma
derivam os nervos e os melanócitos. Do mesoderma derivam à derme e hipoderme. A origem
das células permite conhecer melhor seu processo de diferenciação e função no tecido
(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
A seguir apresentamos as principais características da epiderme e da derme.
Figura 1: A pele e suas divisões anatômicas: epiderme, derme e hipoderme (adaptado de Bear et al,2002)
Epiderme
Derme
Hipoderme
19
2.1.1 A epiderme
A epiderme possui espessura variada, de 1,6 mm em regiões palmoplantares a 0,04 mm
nas pálpebras. É constituída por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado, que se
alimentam por difusão dos leitos capilares da derme. As camadas (ou estratos) são divididas de
fora para dentro em: camada córnea, lúcida, granulosa, espinhosa e basal (Figuras 2a e 2b).
Essas camadas se diferenciam pelo formato das células. Na camada lúcida, as células também
estão intimamente ligadas, são achatadas e organizadas em vários estratos. Esta camada está
presente nas áreas de pele espessa. A camada granulosa é constituída por células que contem
grânulos de querato-hialina e melanina. As células da camada espinhosa são responsáveis pela
coesão da epiderme, exercendo função de resistência ao atrito. Na camada basal, as células
queratinócitos apresentam intensa atividade mitótica e forte galvanotaxia quando exposta a
corrente elétrica in vitro (SAMPAIO e RIVITTI, 2000).
Godbout e Frenette (2006) observaram efeitos de galvanotaxia para os queratinócitos,
em baixas voltagens, assim como já descritos por outros autores como Nishimura et al. (2005)
e Zhao et al. (1996), correlacionados com a corrente endógena.
Figura 2:Epiderme e as suas divisões, (a) Representação esquemática; (b) Imagem obtida num microscópio óptico, com aumento de 50x, de uma lamina histológica, corada com Tricrômio de Mallory.
Camada córnea
Camada granulosa
Camada espinhosa
Camada basal
(a) (b)
20
2.1.2 A derme
A derme é constituída por tecido conjuntivo não modelado, e é didaticamente dividida
em derme papilar e reticular. A derme papilar é constituída de fibras elásticas e colágenos, e de
um tecido conjuntivo frouxo. A derme reticular é mais espessa, possui um tecido conjuntivo
denso, com muitas fibras colágenos, e apresenta um rico suprimento sanguíneo, com capilares
que se estendem em alças para dentro do tecido conjuntivo (MAIO,2004)
Na derme encontram-se fibras de colágeno, elastina e reticulares, células de
fibroblastos, mastócitos, linfócitos e também estruturas como as glândulas sudoríparas,
sebáceas, folículos pilosos e terminações nervosas, também os vasos linfáticos e músculos
eretores dos pêlos. A derme está conectada com a fáscia dos músculos por uma camada de
tecido conjuntivo frouxo, a hipoderme, ou tela subcutânea, que une a pele com os órgãos.
2.2 A hipoderme
A hipoderme é denominada tela subcutânea e não faz parte da pele, ela é formada por
tecido conjuntivo frouxo e possui a característica de deslizamento entre a derme e os órgãos
subjacentes, têm função de armazenamento de energia através dos adipócitos.
2.3 O tecido conjuntivo
O tecido conjuntivo apresenta abundante material intercelular, grande quantidade de
proteínas, com funções de sustentação, preenchimento, defesa, nutrição, transporte e reparação
(CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Possui vasos sanguíneos, nervos e células em
justaposição.
Pode ser classificado como frouxo ou denso; modelado ou não-modelado;
hematopoiético, do tipo mielóide ou linfóide; cartilaginoso e ósseo.
21
Neste trabalho, trataremos do processo de cicatrização do tecido conjuntivo da derme
reticular, do tipo frouxo e não-modelado; frouxo, por apresentar muita substância intercelular
amorfa com muitas fibras colágenas dispostas em trama densa.
A substância intercelular amorfa é rica em água e macromoléculas como as
glicosaminoglicanos (GAGs), proteoglicanos, glicoproteínas e ácido hialurônico. Encontram-
se também proteínas fibrosas, estruturais como as fibras colágenas, elastinas e reticulares, e
adesivas como a fibronectina e a laminina. Além disso, são presentes células típicas como os
fibroblastos, macrófagos e plasmócitos.
As células do tecido conjuntivo, como o fibroblasto, possuem a capacidade de se
multiplicar para regenerar o tecido destruído (COTRAN et al,1996; GYTON,1997 SAMPAIO
e RIVITI,2000, JUNQUEIRA e CARNEIRO,2004).
2.3.1 Fibroblastos
Trata-se da célula mais comum do tecido conjuntivo, e é responsável pela síntese das
fibras colágenas e elásticas, como também pelo material intercelular amorfo. A forma ativa do
fibroblasto apresenta prolongamentos citoplasmáticos irregulares; o seu núcleo tem uma forma
ovóide, o citoplasma é basófilo, devido a intensa atividade de síntese protéica. A forma inativa
chama-se fibrócito; é uma célula fusiforme de tamanho menor e com ínfimos prolongamentos,
com núcleo alongado e um citoplasma acidófilo. Na cicatrização, os fibrócitos são estimulados
pelas citoquinas e assumem a forma ativa; eles se dividem em mitose, e migram por
quimiotaxia para a lesão, onde estimulam a síntese de colágeno, substancia fundamental
amorfa e citoquinas, a fim de formar o novo tecido, o tecido conjuntivo fibroso característico
da cicatriz.
As citoquinas fazem partes dos fatores de crescimento, que são essenciais para a
cicatrização. Outros fatores de crescimento são: o fator de crescimento epidérmico (EGF), o
22
fator de crescimento fibroblasto (FGF-β e FGF-α), o fator de crescimento insulina (IGF), o
fator de crescimento queratinócito (KGF), o derivado de plaquetas (PDGF), o transformador
do crescimento (TGF-β, TGF-α), e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF)
(COTRAN et al,1996).
O fator beta transformador do crescimento (TGF-β) é produzido por células endoteliais,
macrófagos, neutrófilos, plaquetas, linfócitos T e B. O TGF-β estimula células em repouso e
inibe células ativadas; sua ação pró-inflamatória inclui quimiotaxia para macrófagos e
fibroblastos. Além disso, o fator beta também possui ação angiogênica e promove a
proliferação de colágeno.
O fator alfa transformador (TGF-α) é um fator polipeptídico de crescimento para
células epiteliais e mesenquimais, sendo produzido por queratinócitos, macrófagos e plaquetas.
O fator de crescimento epidérmico (EGF) é um polipeptídio que estimula a proliferação de
células epidérmicas, fibroblastos e células endoteliais. Os fatores de crescimento exercem
funções como, angiogênico, quimiotático, indutores ou inibidores da diferenciação celular,
transformação ou indução da síntese de proteínas (MEDEIROS et al, 2003).
A ativação do fibroblasto se faz por fatores de crescimento derivados de plaqueta
(PDGF), fator de crecimento fibroblástico (FgFb), interleucinas 1 (IL-1), fator de necrose
tumoral (TNF) alfa e fator de trasnsformação do crescimento (TGF)beta ( ROCHA;2004).
A motilidade celular resulta da coordenação de movimentos das células, sendo
caracterizada pela polaridade, em resposta a sinais dados pelo ambiente, como sinais químicos
(quimiotaxia), aonde a célula vai à direção de um gradiente favorável. O movimento ocorre
com protusão, e translocação da ligação ao substrato, desfazendo a aderência anterior. As
células com movimentos lentos, como o fibroblasto, projetam sua membrana em forma de
“dedos”, chamados filopódios, como mostra a Figura 3.
23
Figura 3:Ilustração da migração de uma célula de fibroblasto, mostrando a direção do movimento, os prolongamentos celulares formando a margem de ataque, a profilina e a zona de polimerização de actina
Estudos sobre a influência da corrente elétrica diretamente sobre a galvanotaxia do
fibroblasto também geram controvérsia entre autores.
Sun et al; (2004) propõem que estudos em matriz 3D de colágeno permite a observação
do movimento do fibroblasto em resposta ao estímulo elétrico, concluindo respostas positivas
para pequenas correntes na ordem de 0,1V/cm.
Godbout e Frenette; (2006) não encontram galvanotaxia para fibroblastos in vitro,
estimulados por corrente elétrica tratadas em várias voltagens, e defendem que altas voltagens
reduzem a velocidade de migração e associa a redução da protusão das membranas aos efeitos
deletérios da corrente direta.
2.3.2 Fibras colágenas
As fibras colágenas, são proteínas fibrosas insolúveis de função estrutural, encontradas
na matriz extracelular. São as mais freqüentes em todo o corpo. Os colágenos podem ser
classificados em diferentes grupos, segundo a seqüência de aminoácidos; as fibras se diferem
(JUNQUEIRA E CARNEIRO,2004).
Dos fatores que podem influenciar na produção do colágeno, está a deficiência de
vitamina C, ou ácido ascórbico (que leva a deficiência na síntese de colágeno), a presença de
24
oxigênio, a participação do fator de crescimento local, a interferência na ativação da
colagenase, a interferência no fluxo de íons sódio e cálcio nos fibroblastos e as alterações
hormonais.
A biossíntese do colágeno pode ser dividida em duas etapas, a intrafibroblástica e a
extrafibroblástica. Na intrafibroblástica, ou seja, dentro do fibroblasto, no retículo
endoplasmático rugoso, ocorre a síntese de cadeias polipeptídicas, como a união por ligação
das cadeias por pontes de hidrogênio e por ligação tipo Van der Walls dos aminoácidos glicina
com prolina e hidroxiprolina ou com lisina e hidroxilisina. Para a transformação em pro -
colágeno pela hidroxilação da prolina e lisina do pro - colágeno, é preciso a presença de
oxigênio, ácido alfacetoglutárico, ferro ferroso e vitamina C. Ocorre também nessa etapa a
adição de glicose nas extremidades da hidroxiprolina. O pro-colágeno sofre a ação da enzima
pro-colágeno peptidase transformando-se em tropocolágeno. O requerimento de energia para a
biossíntese do colágeno é muito alto; por exemplo, cada ligação peptídica sintetizada, requer a
quebra de quatro ligações de alta energia, e assim a célula consome muita energia para o
processo total.
Na etapa extrafibroblástica ocorre o alinhamento das moléculas de tropocolágeno, e a
atração das extremidades formando as cadeias entrelaçadas em tripla hélice (Figura 4). Essa
polimerização é dependente do equilíbrio eletrolítico da substância fundamental amorfa, e
produz um arranjo regular e paralelo das moléculas regulares, o que as torna muito resistente
às proteases.
25
Figura 4:Estrutura em tripla hélice, mostrando a conformação das cadeias do colágeno, com a repetição periódica
de prolina, responsável pelo enrolamento das cadeias.
Na Tabela 2, são mostrados os diferentes tipos de colágenos, com as respectivas
localizações. Neste trabalho será investigada a densidade de colágeno do tipo I e III, em
diferentes fases do processo de reparo tecidual. Ambos os tipos estão presentes na pele. O
colágeno do tipo I é característico do tecido conjuntivo frouxo denso e não-modelado,
formando fibras e feixes. O tipo III é formado de fibras reticulares, presentes principalmente
ao redor dos vasos, músculos eretores do pelo e glândulas.
As fibras de colágeno na derme reticular se apresentam entrelaçadas, e são constituídas
por 90% do tipo I, e 10% do tipo III. Mas quando ocorre uma lesão do tecido, as fibras do tipo
III são predominantes na fase de granulação e sofrem remodelagem, sendo substituídas pelas
fibras do tipo I em longo prazo, no tecido fibroso cicatricial.
26
Tabela 2:Principais tipos de colágeno, com a localização e a função.
Tipo Localização Função
I Pele, tendão, osso, dentina Resistência a tensão
II Cartilagem, corpo vítreo Resistência a pressão
III Pele, músculo, vasos observado junto
com o tipo I
Manutenção da estrutura de órgãos
expansíveis
V Tecidos fetais, pele, osso, placenta Participa na função do tipo I
IX cartilagem Participa na função do tipo II
Nas Figuras 5a e 5b, são mostradas a título ilustrativo as imagens do colágeno dos tipos
I e III, respectivamente. Essas imagens foram obtidas mediante um microscópio óptico com
luz polarizada, que possibilita a discriminação entre esses dois tipos de colágeno numa lâmina
histológica corada com Picro-sirius Red. Em decorrência das propriedades de birrefringência
do colágeno, colorações distintas podem ser observadas para os tipos I e III, sendo
avermelhada-laranjada e esverdeada, respectivamente. Além disso, o tipo I tem um tamanho
maior que o tipo III, como mostra as figuras 5a e 5b.
Figura 5a Figura 5b
Figura 5: Imagens, obtidas num microscópio óptico com polarizadores cruzados, do colágeno da derme corado com picrosirius red. a) as fibras vermelhas correspondem ao colágeno de tipo I; b) as pequenas fibras verdes são
as fibras de colágeno tipo III. Aumento de 500x.
27
Os efeitos dos fatores de crescimento de fibroblastos básico na cicatrização em ratos,
foram estudados por Dantas et al (2007), onde encontraram aumento significativo no aumento
do colágeno tipo I em relação ao tipo III no 3º dia.
Baranauskas,Vidal e Parizotto (1998) estudaram o colágeno através de microscopia de
força atômica e observaram que a molécula do colágeno sofre um auto arranjo que é
influenciado por forças físico-químicas, como transmissão de sinais elétricos que influenciam
na ordenação e organização padrão das fibras no processo estrutural.
2.4 Processo de reparo tecidual ou processo cicatricial
A cicatrização depende de fatores locais e gerais, como tipo de pele, raça, técnica
cirúrgica, idade, estado nutricional, doenças de base como diabetes, alterações
cardiovasculares, de coagulação, aterosclerose, disjunção renal, quadros infecciosos sistêmicos
e uso de drogras sistêmicas, cuidados com a ferida, como manter a umidade e higiene diária.
A cicatrização pode ser dividida em cicatrização por primeira, segunda e terceira
intenção. Na cicatrização por primeira intenção, ocorre aproximação das bordas e epitelização
rápida, como nas feridas cirúrgicas suturadas. Enquanto que a cicatrização por segunda
intenção ocorre quando a ferida cicatriza sem aproximação das bordas, como nas feridas
crônicas, abertas ou inflamadas que não podem ser suturadas. Alguns autores se referem à
cicatrização por terceira intenção como uma de primeira intenção tardia (HESS; 2002).
O processo de reparo tecidual ou cicatricial é dividido normalmente em 3 fases distintas
mas sobrepostas: inflamatória, proliferativa ou de granulação e de maturação ou
remodelamento (Figura 6). Considera-se que a fase inflamatória dura de 2 a 3 dias; se a
duração for maior, a ferida fica mais exposta a agentes infecciosos e há perda de tecido,
comprometendo a cicatriz. A fase proliferativa ou de granulação se estende geralmente até o
10º dia. Por fim, a fase de maturação pode durar, depende da ferida, até um ano (NETTO;
28
1994). Observa-se na Figura 6 que o acúmulo de colágeno de remodelamento aumenta com
uma taxa constante desde o 3º dia após a lesão.
Figura 6:Fases da cicatrização em relação ao tempo.( Robbinson;Collins, )
2.4.1 Fase inflamatória
Uma atividade máxima ou fase de inflamação aguda é atingida em dois a três dias,
onde logo após a lesão do tecido observa-se a formação do coágulo ou processo de coagulação,
fechando os vasos sanguíneos abertos com a lesão, para evitar a perda de sangue. Uma matriz
de fibrinas desorientadas se forma, onde as células migratórias se fixam principalmente;
fibroblasto, células endoteliais e queratinócitos, sintetizam a fibronectina celular, que permite a
adesão da fibrina ao colágeno e que tem propriedades quimiotáxicas para as células de defesa.
Ocorre uma migração de leucócitos (polimorfonucleares (neutrófilos), mononucleares
(monócitos) e linfócitos) no sítio lesado. Os neutrófilos iniciam a digestão de fragmentos. Os
monócitos, os mais importantes leucócitos, são atraídos por agentes quimiotáxicos, e são
transformados em macrófagos, que têm como função principal, junto com os linfócitos, dar
continuidade à fagocitose, e a produção de citocinas.
29
Por volta do 3º dia os fibroblastos iniciam a produção de fibrilas que se agregam ao
acaso onde se seguir a polimerização das fibras dentro dos feixes de colágeno. (Balbino;
2005).
2.4.2 Fase proliferativa ou de granulação
A fase de granulação tem a sua maior atividade mais ou menos três dias após a lesão e se
estende por até 10 dias. A região lesada se preenche de tecidos neoformados através de
brotamentos das células endoteliais dos capilares vizinhos que crescem e penetram à zona
agredida. Durante a neoangiogênese ocorre a regeneração epidérmica, a síntese de colágeno
pelos fibroblastos e a contração da cicatriz pelos miofibroblastos. A maior parte das atividades
nessa fase é regida por fibroblastos, células epiteliais, células endoteliais e macrófagos.
A formação do tecido de granulação é dependente do fibroblasto, pois ele produz
colágeno, elastina, fibronectina, glicosaminoglicanas e proteases.
A epitelização é feita por mitose das células da camada basal da epiderme e o local
lesado é preenchido por tecido de granulação que é formado por uma coleção de elementos
celulares, como fibroblastos, células inflamatórias, componentes neovasculares e da matriz
como fibronectina, glicosaminoglicanas e colágeno.
O tecido de granulação vai sendo substituído por tecido conjuntivo mais denso e menos
vascularizado, pois as fibras colágenas comprimem os capilares neoformados e diminuem a
vascularização.
A Figura 7 mostra a região limítrofe que separa a derme sem lesão da derme com lesão.
Observa-se na região da derme sem lesão, uma maior densidade de colágeno.
Existe a possibilidade de ocorrência de fibrose, pelo desequilíbrio da síntese da matriz
formada pela fibrogênese e sua degradação pela fibrólise, o que pode resultar em uma cicatriz
30
maior, mais saliente. Quando o tecido conjuntivo fibroso, por razões genéticas e endógenas,
produz mais colágeno que sua degradação, ocorre as cicatrizes hipertróficas e formação de
quelóide.
A síntese e degradação do colágeno são influenciadas pelos fatores de crescimento
(TGFbeta; PDGF;TNF).
Figura 7:Imagem obtida num microscópio óptico (com aumento de 50x), de uma lâmina histológica mostrando a divisão entre a derme sem lesão (lado esquerdo) e com lesão (lado diretio), corada pela técnica de tricrômio de
mallory.
2.4.3 Fase de modelamento ou maturação
Na remodelação ocorrem modificações no colágeno e na matriz, no sentido de aumentar
a força de tensão e diminuir o tamanho da cicatriz, para isso ocorre a reformulação dos
colágenos, reabsorção de água e diminuição da vascularização.
A fase de modelamento pode durar mais de 1 ano. O tecido cicatricial é um tecido que
apresenta um alto risco de ser destruído, pois sua força de tensão é inferior a da pele não-
lesada. Isto é devido ao fato que as fibras colágenas ao amadurecer diminuem de tamanho e
perdem a sua elasticidade.
Durante a cicatrização, o colágeno do tipo I substitui o colágeno do tipo III, conferindo
maior força de tensão, porém a cicatriz ainda é um tecido com 80% da força de tensão.
31
Na fase de remodelamento, há diminuição de todos os elementos celulares,
fibroblastos, vasos neoformados e ocorre uma organização das fibras colágenas por ação das
colagenases e outras proteases produzidas por macrófagos.
Alguns fatores importantes que podem estimular a cicatrização são: umidade da ferida,
perfusão sanguínea, disponibilidade de oxigênio, prevenção de contaminação de bactérias,
manutenção do gradiente de voltagem entre a ferida e a pele adjacente (Weiss, 1990).
32
3. Contextualização
3.1 Efeito da Eletro-estimulação na cicatrização
O uso da estimulação elétrica no tecido lesado tem como principal objetivo acelerar o
processo de reparo cicatricial. Estudos pré-clínicos mostraram que a eletro-estimulação induz
um aumento da concentração de ATP nos tecidos, um aumento da síntese proteica, a migração
de células epiteliais e fibroblastos para a região da lesão, a redução de edema e a inibição do
crescimento de alguns patógenos (EVANGELISTA et al,2003).
Segundo dados da tabela de Robinson e Snyder (2002), para cicatrização da ferida, os
tipos de correntes mais comuns são a corrente contínua abaixo de 1mA por 1 -2 horas de
aplicação, e corrente pulsada com fases de duração entre 2-150 pps, abaixo do limiar motor por
45 minutos.
As três modalidades de tratamento comumente usadas na eletro-estimulação (ES) são:
corrente contínua (DC), corrente pulsada (PC) e corrente alternada (AC), como é ilustrado na
Figura 8.
Figura 8:. Formato de ondas a) contínua;b)alternada;c) pulsada
A passagem de uma corrente elétrica no tecido não-excitável, tal como a epiderme e a
derme, pode produzir efeitos térmicos e químicos, que são responsáveis por vários processos
fisiológicos. Os efeitos térmicos (efeitos Joules) são devidos à alta resistência elétrica da pele.
Esses efeitos, induzidos pelo uso de correntes contínuas (DC), podem danificar o tecido,
33
dependendo da intensidade da corrente e duração da aplicação. As correntes DC causam
também reações eletro-químicas, decorrentes da migração de íons, como o sódio (Na+), o
próton (íon hidrogênio, H+), e o cloreto (Cl-), nos eletrodos colocados na região lesada.
A migração direcional de íons pela aplicação de um campo elétrico, processo conhecido
como galvanotaxia, é considerado como um dos mecanismos mais importantes evolvidos no
reparo tecidual. Segundo os trabalhos de Cheng (1982) e de Becker (1985), a estimulação
elétrica na região lesada provoca um aumento na produção de ATP, decorrente do maior fluxo
de prótons. De fato, os átomos de hidrogênio são extremamente reativos, e ao combinar-se
com o oxigênio nas mitocôndrias, provocam a liberação de uma grande quantidade de energia,
que é usada na conversão de grande quantidade de ADP em ATP.
Salmons e Heriksson (1981) relacionam o aumento de fornecimento de ATP, ao aumento
do metabolismo celular, da capacidade de metabolizar oxidativamente gorduras e carboidratos,
do número de mitocôndrias, mioglobinas e capilares, como também a síntese protéica.
Nishimura et al (1996) mostraram, num estudo in vitro, que a aplicação de um campo
elétrico de 5 mV/mm induz a migração dos queratinócitos, o que pode proporcionar uma
aceleração do reparo tecidual.
A mobilidade do fibroblasto sob campo elétrico foi investigada, in vitro, por Grinel et al
(2006), que mostram diferenças importantes na regulação da migração do fibroblasto em
matrizes do colágeno tridimensional. Enquanto que Godbout e Frenette (2006), em estudos
realizados, in vitro, em um modelo de células de cultura de fibroblastos, afirmam que não
houve migração das células usando diferentes intensidades do campo elétrico: 85, 120, 165, e
215 mV/mm. Os autores ressaltam que a corrente contínua não promove o fechamento de
ferida.
Mesmo se os efeitos da eletro-estimulação no nível celular suscitam ainda controvérsias
em relação aos processos envolvidos no reparo tecidual, encontra-se na literatura um grande
34
número de trabalhos realizados in vivo que evidenciam a aceleração da cicatrização pela
aplicação de correntes elétricos.
Reger et al. (1990) realizaram um estudo sobre os efeitos da estimulação elétrica na
úlcera de pressão em porcos monoplégicos, mostrando que as duas modalidades de corrente,
contínua e alternada, produziram uma redução no tempo de cura; a corrente contínua provocou
uma diminuição rápida da área da ferida; enquanto, a corrente alternada reduziu o volume mais
rapidamente. Além disso, os autores ressaltaram que a aplicação de correntes elétricas
proporciona uma orientação das novas fibras de colágeno.
Uma meta-análise realizada por Kloth e Mcculloch, em 1996, sobre a estimulação
elétrica na ferida crônica, mostrou que a estimulação elétrica facilita a cicatrização das feridas
crônicas.
3.2 Estimulação elétrica por microcorrente na cicatrização
Atualmente, há um grande interesse em realizar estudos sobre os efeitos da estimulação
por microcorrentes em vários processos fisiológicos, como o reparo tecidual. Por
microcorrente (ou micro-amperagem) entendem-se estímulos elétricos de baixa intensidade, na
faixa de 20 a 600 µA, considerados subsensoriais. O uso de microcorrentes para o reparo
tecidual se baseia no fato que a pele humana pode se comportar como uma bateria que permite
a circulação de uma corrente elétrica na região lesada. A existência de correntes endógenas
que, segundo Okuno (1986), correspondem ao estímulo elétrico natural do corpo
(bioeletricidade celular), é na faixa de microampéres, e conseqüentemente a aplicação de
microcorrentes seria compatível com as funções de homeostasia ou ativação celular (Smith,
2002). Essas correntes exógenas possibilitam o restabelecimento da bioeletricidade na região
lesada da pele. Vale ressaltar que a região lesada apresenta uma resistência elétrica mais baixa,
em relação à pele intacta, o que facilita a passagem da corrente e os efeitos relacionados.
35
A terapia com microcorrentes é considerada catalisadora nos processos iniciais e de
sustentação em numerosas reações químicas e elétricas que ocorrem no processo cicatricial.
(Franchine et al;2006)
Na Figura 9 é ilustrado o tipo de microcorrente comumente usado em eletro-
estimuladores comerciais, denominado MENS (Microcurrent Electrical Neuromuscular
Stimuation). Neste exemplo, trata-se de uma corrente pulsada monofásica, com inversão da
polaridade a cada 2,5s.
Figura 9:Formato típico de onda de microcorrente gerado por um eletro-estimulador.
Os primeiros estudos realizados com baixas intensidades, ou seja, microcorrentes para o
reparo tecidual, foram publicados por Assimacopoulos (1998), utilizando corrente contínua em
tratamento de úlceras em pé diabético.
Ulceras isquêmicas tratadas com microcorrentes, segundo Gault e Gatens (1976),
apresentaram melhora três vezes mais rápidas que as não tratadas, sugerindo aumento do
aporte sanguíneo.
Alvarez et al. (1983) estudaram os efeitos da corrente elétrica contínua na faixa de 50 a
300 µA, na cicatrização da pele de porcos jovens. As diferentes camadas da pele foram
estudadas separadamente. Os autores observaram uma diferença estatisticamente significante
na produção de colágeno no 5ª, 6ª e 7ª dia de tratamento com a corrente contínua. A taxa de
reepitelização apresentou-se também mais alta no grupo tratado, sugerindo que a capacidade
36
proliferativa e migratória das células epiteliais e do tecido conjuntivo, envolvidos no reparo e
regeneração, pode ser influenciada por campo elétrico externo.
Carley e Wainapel (1985) utilizaram eletrodos de superfície, para aplicação de
microcorrente na faixa de 200 µA a 800 µA, em humanos com úlceras crônicas; encontraram
diferenças estatisticamente significativas, entre os grupos submetidos à microcorrente em
relação ao grupo controle, quanto á ocorrência de infecção, menor desconforto na área da
lesão, o que possibilitou menos debridamento e uma cicatriz mais resistente.
Weiss (1990), num artigo de revisão sobre a estimulação elétrica na cicatrização,
ressaltaram que a corrente exógena pode acelerar o processo de reparo tecidual.
Vodovnik e Karba (1992) relatam também que a aplicação de microcorrente provoca um
aumento na reação mitótica no tecido lesado, e destacam que os diferentes parâmetros de
eletro-estimulação utilizados em vários trabalhos publicados dificultam qualquer comparação
como também a aplicabilidade do tratamento.
Woode et al. (1994) realizaram um estudo em diferentes estágios das úlceras, tratadas
com corrente pulsada em baixa intensidade, de 300µA a 600µA, e mostraram a ocorrência de
um fluxo rápido de cálcio na epiderme, o que provoca o crescimento de fibroblastos e
queratinócitos, e conseqüentemente uma diminuição do tempo de fechamento das úlceras.
Canserven e Atalay (1996) estudaram os efeitos diretos da microcorrente, na faixa de 200
e 400µA, sobre a síntese de colágeno na cicatrização em peles de coelhos, com aplicação
durante 8h por dia, com um total de 3 dias de tratamento; foi observado um aumento de
hidroxiprolina, indicando que a corrente elétrica promove aumento na síntese de colágeno.
Kloth et al. (1996) defendem que a estimulação elétrica baseada no sistema de
biocorrente, contribui para a cicatrização através de fatores quimiotáxicos de neutrófilos,
macrófagos, fibroblástos e células epidérmicas, o que permite uma aceleração da cicatrização.
37
Bogie et al. (2000) aplicaram a estimulação elétrica na úlcera de decúbito e alcançaram
resultados positivos na cicatrização em mais de 50% do grupo de porcos, tratados por um
longo período, com eletrodos implantados, com dois tipos de correntes, contínua e alternada,
utilizando uma densidade de corrente de 127 µA/cm² e 1,125 µA/cm², respectivamente.
Enquanto, em um estudo anterior feito por Steckel et al. (1984) a análise histológica mostrou
que o uso de eletrodos implantados na cicatrização aberta em cavalos, com corrente contínua
de 10 ou 20 µA, provoca uma reação ao implante do eletrodo, e conseqüentemente um efeito
negativo sobre o processo cicatricial.
Robinson e Snyder (2001) apresentaram vários estudos que evidenciam que o uso de
corrente contínua, de intensidades abaixo de 1mA, com o ânodo colocado diretamente sobre
ferida, proporciona uma aceleração da cicatrização da lesão. Porém, apesar de as
microcorrentes serem freqüentemente utilizadas na prática clínica, mas defendem que ainda
faltam bases científicas significativas para justificar a aceleração do processo cicatricial em
relação às fases de reparo, para que se interfira de forma adequada e com parâmetros
otimizados.
Segundo Hampton e King (2005) a estimulação bioelétrica não pode contribuir para o
reparo de úlceras, sendo os níveis de corrente elétrica insuficientes para alcançar o interior da
ferida.
Byl et al. (1994) também não encontraram evidencias de aumento na taxa de
cicatrização em porcos com feridas suturadas, tratados com microcorrentes, mas sugerem a
necessidade de novas pesquisas. A mesma conclusão foi expressa por Leffman et al. (1994),
que estudaram os efeitos da microcorrente na cicatrização em ratos, e não encontraram
diferença estatisticamente significante nas análises histológicas depois de 14 dias de
tratamento.
38
As contra-indicações para as microcorrentes são as mesmas para qualquer corrente da
eletroterapia, como na gravidez, pacientes com marcapasso, diretamente sobre feridas
infectadas, sobre tumores malignos e benignos, sobre o globo ocular, sobre o sino carotídeo,
osteomielite, sobre a musculatura laríngea e na presença de substâncias tópicas contendo íons
metálicos. (Gonzáles; 1989)
3.3 Estudos Comparativos entre a microcorrente e outras técnicas de reparo tecidual
Estudos comparativos envolvendo as microcorrentes são importantes para futuras
escolhas na terapêutica clinica.
Taskan et al. (1997) compararam os efeitos da eletroestimulação em 300 µA corrente
contínua (com mudança de polaridade após o terceiro dia) e do ultrassom (com densidade de
potência 0,1W/cm² e em modo pulsado) na cicatrização; os resultados mostraram que ambas as
técnicas apresentaram efeitos positivos; porém, a microcorrente proporciona uma melhor
resposta na aceleração do processo inflamatório e na fase de maturação.
Estudos realizados por Demir et al. (2004) sobre a aplicação do laser e a estimulação
elétrica na faixa de microampéres, em feridas produzidas em ratos, mostraram que ambas
técnicas tem efeitos estatisticamente iguais, e são efetivas em relação ao grupo controle,
provocando um aumento da força de ruptura da cicatriz. Entretanto, foi observado que a
estimulação elétrica, com corrente contínua de 300 µA, aplicada durante 30 minutos por dia
num período de 10 dias, com inversão da polaridade da tensão após o terceiro dia, apresentou
um efeito mais expressivo na fase inflamatória do que o tratamento com o Laser Gallium-
arsenide (GaAs).
Sonnewend et al. (2004) investigaram os efeitos da radiação infravermelha (efeito
térmico, 36 oC) e da microcorrente (160µA) sobre o processo de reparo de feridas abertas em
39
ratos, com aplicações de 30 minutos, analisando o diâmetro das feridas após 3 dias e avaliando
o processo inflamatório (através da presença de edema) e as crostas; os autores obtiveram
efeitos positivos para os grupos tratados com ambas as intervenções terapêuticas.
Franchine et al (2006), realizaram estudos histológicos coradas com H/E, observando as
fases inflamatória e de granulação ou proliferativa de feridas induzidas cirurgicamente em
ratos, tratadas com aloe vera, microcorrente, neomicina e terapias combinadas, e observaram
uma melhora na cicatrização em relação a hiperplasia fibroblástica, epitelização, angiogênese e
reorganização tecidual no grupo tratado com aloe vera combinado com microcorrente.
40
4. Metodologia
Para a realização do trabalho, o projeto foi aprovado pela comissão de ética em
manipulação e experimentação animal, CEMEA/UMC (Anexo I).
Os experimentos foram realizados no Biotério da UMC, onde os ratos foram alojados em
caixas individuais e supridos adequadamente de ração e água pelo técnico responsável, sob
supervisão veterinária.
Foram utilizados 30 ratos Wistar machos, sendo todos adultos jovens (idade média de 3
meses), e com peso corporal médio de 300 gramas. Cada rato foi submetido a dois cortes
cirúrgicos, na parte dorsal, que foram em seguida suturados. Este procedimento permite ter o
controle no mesmo animal submetido ao tratamento. Os ratos foram divididos em três grupos
de dez ratos, de acordo com o início da aplicação da MENS:
• grupo 1 (G1): uma lesão de cada rato desse grupo foi submetida à microcorrente
desde o primeiro dia até o terceiro dia (G1-T), enquanto a outra foi considerada
como controle (G1-C);
• grupo 2 (G2): com aplicação da MENS desde o primeiro dia até o sétimo dia. As
lesões tratada e controle foram denominadas G2-T e G2-C, respectivamente;
• grupo 3 (G3): a aplicação da MENS foi do primeiro dia ao décimo quarto dia
(G3-T); o controle foi denominado G3-C.
4.1 Procedimento cirúrgico
Para a realização do ato cirúrgico, após identificação, os animais foram pesados a fim de
aplicar uma dose anestésica de cloridrato de Xilazina (Vetbrands TM)) associado ao Cloridrato
de Cetamina (Vetbrands TM). No caso de ratos de laboratório, a dose recomendada pelo
41
fabricante para aplicação intramuscular é de 1 ml/Kg para a Ketamina e 0,1 ml/kg para a
Xilazina.
Uma vez o animal anestesiado, iniciou-se os procedimentos de assepsia e de preparação
do campo cirúrgico. A tricotomia foi realizada com lâmina elétrica veterinária pré-cirúrgica nº
40, para evitar lesão e irritação da pele do rato, (Figura 10).
Figura 10:Tricotomia com lâmina no 40 sem lesionar a pele do animal.
Todos os cortes foram padronizados, utilizando um “punch” de 5 mm de diâmetro, que é
um instrumento projetado para a realização de colheita de material das superfícies cutâneas
para diagnóstico histopatológico. Nas Figuras 11a e 11b, são mostradas as imagens da região
do corte cirúrgico feito na região dorsal do rato, antes e após a retida do tecido,
respectivamente.
Figura 11:Imagens mostrando as regiões dos corte cirúrgicos; (a) demarcação da região para a realização da lesão, com auxílio de um ‘punch’; (b) as duas lesões, antes da satura.
(a) (b)
42
A sutura foi realizada utilizando fio nylon agulhado 4/0, com auxílio de porta agulha
controlando o nó para evitar o estrangulamento do tecido, a fim de induzir uma cicatrização de
primeira intenção. Em seguida, foi realizada uma assepsia e ministrada uma dose única de
analgésico (0,22 ml de paracetamol). Nas Figuras 12a e 12b, são mostradas as imagens
referentes às regiões lesionadas após a sutura.
Figura 12:a) Imagem das lesões, após a sutura; b) Detalhes das duas lesões, sendo uma para aplicação da Mens e outra para controle.
4.2 Eletroestimulação (MENS)
Para a aplicação da MENS, foi empregado um gerador de microcorrentes, da marca
IBRAMED (Brasil), modelo Neuro Esthetic, que permite as seguintes opções de aplicação:
ondas retangulares, pulsos monofásicos, inversão da polaridade em 3 segundos fixos,
intensidade de 0 a 500 µA , controle de freqüência de 2 a 500 Hz.
As figuras 13a e 13b mostram uma imagem do aparelho de MENS e do sinal elétrico
visualizado na tela de um osciloscópio, respectivamente. O uso do osciloscópio permite
verificar se os parâmetros do sinal elétrico na saída do aparelho estão de acordo com aqueles
desejados (mostrados na tela do aparelho). Esse procedimento possibilita averiguar se o
aparelho está calibrado.
A MENS foi aplicada somente na ferida superior, ou seja, naquela mais próxima à
cabeça, sendo a outra ferida (inferior) foi considerada como controle (sem aplicação).
(a) (b)
Lesão superior
Lesão inferior
43
Entretanto, a fim de reproduzir as mesmas condições de umidade e de tensão, ambas feridas
foram umedecidas com um gel condutor, e um par de eletrodos (tipo caneta) foi posicionado
longitudinalmente, com de 1 cm de separação um do outro. Ressaltamos que os eletrodos
posicionados na “ferida controle” não foram conectados ao aparelho.
Figura 13:Imagem (a) do eletroestimulador utilizado e (b) da visualização do sinal elétrica na tela do osciloscópio.
Para a aplicação da MENS, os ratos foram acomodados numa caixa de contenção
construída de tal maneira que a tampa superior possua uma abertura para posicionamento dos
eletrodos (Figura 14). Os ratos foram submetidos à MENS desde o primeiro dia, uma vez por
dia, durante 15 minutos, até o sétimo dia, quando é realizada a eutanásia, sob sobredose
anestésica, seguida de decapitação. Os parâmetros de eletro-estimulação utilizados foram: uma
corrente de 300 µA de intensidade, uma freqüência de 100 Hz, e inversão de polaridade a cada
3 s. Esses parâmetros foram escolhidos baseados na revisão bibliográfica (Tabela 1.).
Após cada tratamento, as lesões foram limpas com soro fisiológico, para retirada do
excesso de gel.
(a) (b)
44
Figura 14:(a) Disposição dos dois pares de canetas utilizados para aplicação de microcorrente na lesão, com o rato na caixa de contenção; (b) Posicionamento das canetas na lesão.
4.3 Análise qualitativa da cicatrização
A evolução durante a cicatrização do aspecto físico da lesão, ou seja, a presença de
líquido, de crosta e de coloração como também do tamanho, foi acompanhada por imagens
digitais, a fim de avaliar a influência da MENS. Para a padronização da captação das imagens,
um sistema de fixação foi desenvolvido, permitindo controlar a distância entre a maquina e o
rato, como também a luminosidade (sendo vedada para entrada da luz ambiente), como mostra
a Figura 15. Para a determinação do tamanho da cicatriz, foi empregado um gabarito de 10 mm
de comprimento, posicionado junto às feridas, como mostra a Figura 16.
Figura 15:Imagem da caixa de fixação da máquina fotográfica, contendo a caixa de contenção.
Caixa de contenção
Suporte da máquina fotográfica
(a) (b)
45
Figura 16:Rato A com corte tratado e corte controle no dorso, separados 2 cm, com o corte superior tratado e o inferior controle.
4.4 Análise histológica
A confecção dos blocos com a inclusão das amostras de fragmentos de pele, para as
lâminas histológicas, foi realizada seguindo as etapas descritas na Tabela 3
Tabela 3:Descrição das etapas para confecção do bloco para as lâminas histológicas
ETAPAS FINALIDADE DURAÇÃO
1.Fixação em fixador simples formol/paraformol ou em mistura fixadora (líquido de Bouin, Helly, etc)
Preservar a morfologia e a composição dos tecidos
Cerca de 12h, dependendo do fixador e do tamanho da peça
2.Desidratação em álcool etílico de concentrações crescentes, começando com álcool a 70% e terminando com álcool absoluto
Remover a água dos tecidos 6 a 24h, dependendo do tamanho da peça
3.Clareamento ou diafanização em benzol, xilol ou tuluol, solventes do álcool e da parafina
Embeber a peça em substância miscível com a parafina
1 a 6h, dependendo do tamanho da peça
4.Impregnação pela parafina fundida, geralmente realizada em estufa a 60ºC
Impregnar a parafina nas estruturas teciduais, para facilitar a obtenção dos cortes no micrótomo
30 min a 6h, dependendo do tamanho da peça
5.Inclusão: a peça é colocada num molde retangular contendo parafina fundida.
Obtenção do bloco de parafina de forma regular e, para ser cortado no micrótomo
-
Enfatizamos que, por motivos técnicos, somente os blocos de parafina foram preparados
no laboratório da UMC, sendo o corte, a coração e a fixação nas lâminas foram feitos na
Histotech Laminas Didáticas Ltda.
46
Cortes de 4 µm de espessura foram feitos a fim de obter uma lâmina fina e transparente,
para uma melhor observação das fibras colágenas no microscópio óptico. Os cortes no
micrótomo foram padronizados para proporcionar uma análise da secção transversal da lesão,
tendo o ponto de sutura como referencia da região da lesão. A figura 17a e 17b mostram o
bloco de parafina com o fragmento de pele inserido e os possíveis cortes transversais à lesão,
respectivamente.
A reprodutibilidade do corte em relação à localização da região central da lesão é
fundamental para a análise das laminas histológicas, pois a densidade das fibras de colágeno
depende da área da lesão (periférica ou central), como mostrado na Figura 18.
Figura 17:(a) Bloco de parafina contendo o região da lesão (em amarelo); (b) esquema representando os possíveis cortes transversais no fragmento de tecido com a região da lesão.
Figura 18:Lâmina histológica com dois cortes histológicos contendo a lesão e um esquema ilustrando os dois cortes: (a) região periférica e (b) região central.
(a
(b
(a)
(b)
47
Optamos por utilizar o Picro - Sírius Red, em detrimento ao HE e tricrômio de Azan-
Mallory, devido ao fato que uma melhor diferenciação do colágeno com luz polarizada é
obtida com este corante. De fato, em decorrência da birrefringência das fibras de colágeno, a
coração com Picro - Sírius Red possibilita a observação discriminada das fibras de colágeno
tipo I (colágeno maduro) e tipo III (colágeno imaturo), e conseqüentemente a análise do
amadurecimento das fibras.
4.4.1 Observações no microscópio óptico com luz polarizada
As lâminas histológicas foram observadas mediante um microscópio óptico de luz
polarizada, da marca Leica DMLP. As imagens foram capturadas por uma câmera acoplada ao
microscópio e analisadas através de um software de imagens. Na primeira abordagem,
utilizamos o software de imagens Leica Q500MC, que permite a demarcação de regiões em
termos dos níveis de vermelho, verde e azul (RGB). Entretanto para discriminação das regiões
avermelhadas correspondentes as fibras de colágeno tipo I e esverdeadas, correspondentes as
fibras de colágeno tipo III, os procedimentos do software implicou uma interferência do
examinador, ou seja, uma certa subjetividade, mesmo com resultados aceitáveis, surgiu a
necessidade de um software mais específico, por isso foi desenvolvido pelo laboratório
Aladim da UMC, o software denominado Proc Image (CFC v.1.0), que possibilitou uma
quantificação do colágeno tipos I e III. Na Figura 19 é mostrado o esquema de captura das
imagens. Cada imagem, de tamanho 512 X 456, foi registrada considerando uma média de 32
imagens, a fim de eliminar os ruídos.
48
Figura 19:Esquema de sistema de captura de imagens para análise das lâminas histológicas.
Uma comparação entre os dados obtidos pelos dois softwares mostrou resultados
semelhantes, o que permitiu de validar o software desenvolvido, o qual foi escolhido para
análise de todas as imagens. Enfatiza-se que esse software é mais específico para esse tipo de
análise, proporcionando maior confiabilidade dos dados.
A fim de efetuar uma análise mais precisa da densidade de colágeno, para cada lâmina,
foram consideradas três regiões ao longo da secção transversal da lesão, com uma espessura da
ordem de 0,5 mm, como é ilustrado na Figura 20:
� a região superficial, R1, corresponde à epiderme e a derme papilar;
� a região central, R2, da derme reticular;
� a região profunda, R2, limite derme reticular e tela subcutânea.
Nas Figuras 21a, 21b e 21c, são mostradas as imagens observadas no microscópio
óptico, entre polarizadores cruzados, com aumento de 200x, relativas às regiões superficial,
central e profunda, respectivamente.
Microscópio óptico
Câmera fotográfica
49
Figura 20:Ilustração da divisão da lâmina vista em aumento 50x, em 3 regiões, R1, R2, R3, padronizadas no microscópio por uma rotação correspondendo a 5 mm.
Figura 21: Regiões analisadas em aumento de 200x, visualizadas entre polarizadores cruzados referentes à região (a) superficial, R1; (b) central, R2, e (c) profunda, R3.
4.5 Processamento das imagens
Para o processamento das imagens, foi desenvolvido um programa que permite uma
quantificação das tonalidades dos pixels, e o cálculo da área correspondendo às fibras do tipo I
(avermelhadas) e III (verdes). Na figura 22 é mostrada uma ilustração da janela do programa
durante o processamento de uma imagem, com a inserção dos parâmetros de ajuste das
proporções das tonalidades da cor verde e do azul, para definição das áreas referentes às fibras
de colágeno e ao fundo, respectivamente. Também, foi inserido um parâmetro, denominado
“Nível de Alpha”, que permite o controle da transparência da imagem processada, e
consequentemente uma sobreposição das imagens processada e original, o que possibilita uma
R1
R2
R3
(a) (c) (b)
50
análise mais precisa. Uma vez inseridos esses parâmetros, o processamento é realizado através
do menu Cálculos>Processar na parte superior da janela do programa. Este menu executa um
algoritmo que varre toda a imagem e conta a quantidade de pixels correspondentes à cores
verde e vermelha, conforme os parâmetros inseridos no programa. O resultado do
processamento é exibido numa janela mostrando essencialmente as duas cores verde e
vermelha, referentes às áreas ocupadas pelas fibras dos tipos I e III, respectivamente, como é
ilustrado na figura 25.
Figura 22: Interface do programa de análise de imagem, com a imagem em aumento de 200x entre polarizadores cruzados, a sobreposição da imagem para controle dos parâmetros determinados para reconhecimento dos tons de
vermelho e verde na imagem em pixel.
4.5.1 Processamento em Lote
Para facilitar o processamento de várias imagens, foi elaborado um algoritmo que
processa todas as imagens automaticamente, com parâmetros pré-estabelecidos. Os dados
resultantes do processamento das imagens são armazenados em um arquivo texto, com uma
identificação segundo a seqüência de imagens, com o nome e as áreas de verde (“G” para
“green”) e de vermelho (“R” para “red”). Na figura 23 é mostrado um exemplo de arquivo
gerado, com a organização dos dados.
51
Figura 23:.Arquivo de texto gerado permitindo identificar os grupos G1, G2, G3, o nº da lâmina processada de 1 a 20, a classificação entre tratada (t) e controle (c) e as regiões às quais pertenciam , sendo mais superficial (1R),
central (2R), ou profunda (3R), com os valores correspondentes a área em pixel.
4.6 Análise estatística
Para interpretar os dados experimentais, uma análise estatística foi feita mediante o
software MINITAB®, que permite a execução de vários testes de hipóteses, a fim de verificar
a igualdade entre duas médias, para um determinado nível de significância. O teste t-student
foi escolhido devido o seu amplo emprego na literatura científica para analisar dados clínicos,
e a sua simplicidade, além do pequeno tamanho da amostra. Na mesma análise, um teste de
análise de variância ANOVA one-way (Tukey) foi conduzido a fim de comparar também as
médias em relação às regiões da lesão e os dias correspondentes às fases da cicatrização. Foi
considerado um nível de significância de p < 0,05, ou seja, para um valor p menor ou igual a
0,05 a hipótese nula de igualdade das médias é rejeitada. No caso contrário, as médias podem
ser consideradas estatisticamente iguais (hipótese nula aceita).
52
5. Resultados
5.1 Análise qualitativa
As imagens digitais das lesões, obtidas no final do tratamento, ou seja, no 7º dia,
mostram a ausência de líquido e de infecção em todos os 30 ratos, quer seja na lesão tratada ou
controle. Entretanto, foi observado que a lesão não-tratada apresenta uma maior presença de
crosta em comparação à região tratada, como mostra a Figura 24.
Figura ...
Figura 24: a) cicatrizes das lesões superior e inferior após 7 dias, b) ampliação da região da lesão (superior) tratada (c) ampliação da região da lesão (inferior) controle.
Após a remoção dos pontos de sutura, evidenciou-se que a cicatriz da lesão controle
apresenta uma extensão da coloração avermelhada maior, em comparação à lesão tratada,
indicando que o processo de reepitelização sem uso de MENS não é completa no 7º dia.
Figura 25:a) cicatrizes no 7o dia, após remoção dos pontos de sutura; b) ampliação da região da lesão tratada; (c) ampliação da região da lesão controle.
No que diz respeito ao tamanho da cicatriz, em comprimento, nenhuma diferença nítida
ao comparar a lesão tratada com a de controle.
(a) (b) (c)
(a) (b) (c)
53
5.2 Análise histológica
A fim de quantificar os efeitos da MENS na cicatrização, as lâminas histológicas da
região das lesões foram observadas através de um microscópio óptico com luz polarizada e
analisadas por imagens digitais.
Nas Figuras 26a e 26b são mostradas, o título ilustrativo, as imagens das lâminas
histológicas obtidas no 7º dia das lesões tratada e não-tratada, respectivamente. Para a
confecção dessas lâminas, foi empregado o corante HE, que permite observar a celularidade do
tecido. Destaca-se uma presença maior de núcleos celulares na lesão tratadas, em comparação
com a lesão controle. Esta observação pode ser feita também com as lâminas preparadas com o
Azan-Mallory, como mostram as Figuras 27a e 27b.
Figura 26:.Imagens obtidas com aumento 100x, no microscópio óptico (polarizadores paralelos) das lâminas confeccionadas com Azan-Mallory. (a) na região da lesão tratada com MENS;
(b) na região da lesão controle no 7º dia.
Figura 27:Imagens obtidas com aumento 100x, no microscópio óptico (polarizadores paralelos) das laminas confeccionadas com Azan-Mollary. (a) na região da lesão tratada com MENS;
(b) na região da lesão controle no 7º dia.
(a) (b)
(a) (b)
54
Ressaltamos que os corantes HE e Azan-Mallory, mesmo sendo bastante utilizados na
literatura para o estudo da cicatrização, não permitem uma diferenciação das fibras de
colágeno. Entretanto, a determinação da densidade e do tipo de colágeno (I e III) é importante
para analisar o processo de maturação da cicatriz.
Portanto, a escolha do Picro-Sírius Red como corante pode ser justificada pelo fato de
possibilitar a distinção entre os tipos I e III de colágeno, através da microscopia óptica com luz
polarizada, devido à propriedade de birrefringência das fibras de colágeno.
Nas Figuras 28a e 28b são mostradas as imagens das lâminas coradas com Picro-Sírius,
obtidas no microscópio óptico com os polarizadores paralelos e cruzados (ângulo entre
polarizadores de 90o), respectivamente. Podemos notar que a observação entre polarizadores
cruzados permite descriminar nitidamente a presença das fibras de colágeno.
Figura 28:Imagens obtidas com aumento 100x, no microscópio óptico, das lâminas confeccionadas com Picro-Sírius Red. a) entre polarizadores paralelos; e b) com polarizadores cruzados.
Para identificar as fibras do tipo I e III do colágeno, foram consideradas imagens com
200x de aumento da área da lesão, baseando-se na coloração esverdeada e avermelhada dessas
fibras, como é ilustrado nas Figuras 29a e 29b. A quantificação das fibras de colágeno foi feita
utilizando o software Proc Image (CFC v.1.0), que permite o cálculo de números áreas na
imagem correspondendo às fibras avermelhadas (tipo I), AR, e verdes (tipo III), AG. Para a
análise estatística, consideramos os seguintes dois parâmetros:
55
• Percentual de fibras totais (Tipo I e III), em relação à área da imagem (AIm):
• A razão entre as fibras tipo I e III:
Figura 29:Imagens obtidas no microscópio óptico, com aumento de 200X, mostrando a área com lesão, na região central do corte.
Nas Tabelas 4 a 6 são apresentados os dados do colágeno total, referentes aos grupos
controles e tratados, para o 3º, o 7º e o 14º dias, nas regiões superficial (R1), central (R2) e
profunda da lesão (R3), respectivamente.
Ressaltamos que devido à ocorrência de cortes sem a presença da região central,
algumas lâminas foram descartadas. No Anexo 2, são mostradas as imagens referentes a todos
os cortes.
(a) (b)
100.ImA
AAColTot
GR+
=
G
R
GR
A
AR =_
56
Tabela 4:Colágeno total, ColTot(%), na região superficial (R1)
Tabela 5:Colágeno total, ColTot(%), região central (R2)
G1-C G1-T G2-C G2-T G3-C G3-T 16,52 44,75 14,78 19,26 13,80 62,25 12,84 24,02 15,44 7,27 23,05 28,06 5,67 26,90 22,99 18,13 42,75 36,60 28,10 29,69 58,44 46,56 19,66 34,02 3,20 11,38 24,49 15,93 30,92 47,14 27,84 10,59 15,69 28,00 26,66 38,17
Tabela 6:Colágeno total, ColTot(%), região profunda (R3)
G1-C G1-T G2-C G2-T G3-C G3-T 10,71 11,14 10,72 19,41 49,32 22,32 29,39 32,70 27,88 32,93 52,65 48,70 16,19 18,21 45,40 20,92 36,96 40,59 11,90 40,12 38,14 31,36 34,99 62,19 7,70 2,52 11,79 16,00 36,98 38,24 23,95 11,64 - - 5,02 38,17
Os dados obtidos da razão das fibras tipo I em relação às fibras tipo III são mostrados
nas Tabelas 7, 8 e 9 para as três regiões investigadas.
Tabela 7:Razão de colágeno, RR_G, região superficial (R1)
G1-C G1-T G2-C G2-T G3-C G3-T 0,014 0,32 0,965 4,95 0,360 0,98 0,001 1,76 4,999 4,63 4,707 1,96 2,237 5,22 2,303 4,71 2,950 1,17 1,952 7,46 22,725 12,70 2,173 7,13 0,000 0,07 5,402 49,69 1,490 1,95 8,055 12,36 4,541 4,20 2,189 2,21
G1-C G1-T G2-C G2-T G3-C G3-T 3,11 0,54 9,45 34,63 7,81 11,05 0,41 8,02 6,01 7,70 10,60 18,31 3,90 3,34 22,52 11,35 18,74 20,53 3,29 15,88 11,69 36,60 8,12 19,88 2,48 0,29 13,89 19,12 24,64 13,64 8,61 10,71 2,72 10,22 22,35 21,75
57
Tabela 8:Razão de colágeno, RR_G, região central (R2)
Tabela 9:Razão de colágeno, RR_G, região profunda (R3)
G1-C G1-T G2-C G2-T G3-C G3-T 1,56 1,05 1,30 22,89 17,87 1,06 0,57 1,11 2,05 1,37 9,34 6,06 1,50 2,36 8,99 1,38 7,45 1,84 0,50 0,97 0,90 1,68 2,09 6,09 2,89 1,73 6,03 9,36 7,13 3,93 1,37 8,69 0,77 8,02 0,23 8,02
Nas tabelas 10 e 11 são apresentadas as médias e os desvio padrões da porcentagem do
colágeno total utilizados na elaboração dos gráficos
Tabela 10:média e desvio padrão dos colágenos totais, ColTot(%), das regiões, R1,R2 e R3, no 3º, 7º e 14º
dias.
Região superficial (R1) Região central (R2) Região profunda (R3)
controle tratado controle tratado controle tratado
média 3,63 6,46 15,69 24,56 16,64 19,39 3º dia
despad 2,72 6,20 10,65 12,72 8,41 14,29
média 11,04 19,94 25,31 22,52 22,32 24,13 7º dia despad 6,89 12,74 16,76 13,52 17,65 6,76
média 15,38 17,53 26,14 41,04 35,99 41,70 14º dia despad 7,46 4,24 10,03 12,11 16,84 13,19
G1-C G1-T G2-C G2-T G3-C G3-T 3,139 11,33 1,056 3,95 1,417 22,89 2,013 5,88 7,088 0,70 2,212 1,368 14,398 8,59 0,586 6,46 4,611 1,378 7,138 14,80 33,07 34,50 6,655 1,675 16,787 9,76 6,444 9,39 3,418 9,356 0,708 9,85 12,05 9,62 8,020
58
Tabela 11:Média e desvio padrão das razões, RR_G, entre os colágenos tipo I e III, das regiões, R1,R2 e R3, no 3º, 7º e 14º dias
Região superficial (R1) Região central (R2) Região profunda (R3)
controle tratado controle tratado controle tratado
média 2,04 4,53 6,82 13,48 2,31 2,57 3º dia
despad 3,12 4,81 7,98 18,03 1,46 2,29
média 7,36 10,04 10,05 10,77 3,66 7,00 7º dia despad 6,77 2,96 12,05 12,11 2,07 6,17
média 1,40 2,65 3,34 7,45 7,35 4,50 14º dia despad 0,86 3,01 3,39 8,36 6,21 2,70
Nas Figuras 30a a 30c, são apresentados os gráficos do colágeno total dos grupos
tratado e controle, no 3º, 7º e 14º dias, para as regiões superficial, central e profunda,
respectivamente. Pode-se observar que, de uma maneira geral, o percentual de colágeno total
aumenta do 3º a 14º dia.
A razão entre as fibras vermelhas e verdes, ou seja, a proporção entre os colágenos de
tipo I e III, é mostrada na Figura 31, para o 3º, 7º e 14º dias, nas regiões da lesão investigadas.
Destaca-se que, para o grupo tratado, a proporção de colágeno tipo I em relação ao tipo
III apresenta um aumento do 3º ao 7º dia, e uma diminuição no 14º dia, para as regiões
superficial e profunda. Enquanto que para a região central, houve uma diminuição do 3º ao 14º
dia.
59
Figura 30:Percentual do colágeno total, dos grupos tratado e controle, em relação ás áreas: (a) superficial; (b) central e (c) profunda.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
% C
olá
gen
o T
ota
l
Dia 3 Dia 7 Dia 14
região profunda
Grupo Contr
Grupo Trat
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
%C
olá
gen
o T
ota
l
Dia 3 Dia 7 Dia 14
Região superficial
Grupo Contr
Grupo Trat
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
%C
olá
gen
o T
ota
l
Dia 3 Dia 7 Dia 14
Região central
Grupo Contr
Grupo Trat
(a)
(b)
(c)
60
No caso do grupo controle, a razão entre o colágeno de tipo I e III aumentou do 3º a 7º
para as regiões superficial e central, e diminuiu no 14º dia. Na região profunda, observa-se um
aumento contínuo do 3º ao 14 dia.
Figura 31:Razão entre o colágeno tipo I e o tipo III, dos grupos tratado e controle, em relação ás áreas: (a) superficial; (b) central e (c) profunda.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170
5
10
15
R/G
Dia 3 Dia 7 Dia 14
Região superficial
Grupo Contr
Grupo Trat
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170
5
10
15
20
25
30
R/G
Dia 3 Dia 7 Dia 14
Região central
Grupo Contr
Grupo Trat
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 170
5
10
15
R/G
Dia 3 Dia 7 Dia 14
região profunda
Grupo Contr
Grupo Trat
(b)
(c)
(a)
61
5.3 Análise estatística
Os dados foram analisados utilizando a estatística t-student, a fim de comparar o
percentual de colágeno total e a razão entre os tipos I e III das lesões tratadas e controles, após
o 3º, o 7º e o 14º dias, para as regiões superficial, central e profunda. Nas Tabelas 12 e 13 são
apresentados os resultados da análise estatística, ou seja, o valor p obtido, para o colágeno total
e a razão entre os colágenos tipos I e III, respectivamente.
Tabela 12:Valor p da comparação entre os grupos tratados e controles, referentes ao colágeno total, nas três
regiões da lesão.
Região superficial Região central Região profunda
3º dia 0,330 0,553 0,693
7º dia 0,164 0,758 0,739
14º dia 0,553 0,043 0,528
Tabela 13:Valor p da comparação entre os grupos tratados e controles, referentes à razão, nas três regiões da lesão.
Região superficial Região central Região profunda
3º dia 0,313 0,428 0,823
7º dia 0,397 0,920 0,330
14º dia 0,350 0,291 0,327
Destaca-se desta análise estatística que, em relação ao colágeno total, não houve
diferença significativa entre o grupo controle e o grupo tratado com MENS no 3º e no 7º dias,
independentemente da região da lesão. Entretanto, no 14º dia, uma diferença significativa é
encontrada na região central.
No que diz respeito à razão entre o colágeno tipo I e tipo III, nenhuma diferença
estatisticamente significativa foi encontrada nas várias situações analisadas.
A fim de comparar a evolução da cicatrização nas três regiões investigadas (superficial,
central e profunda), realizamos uma análise estatística utilizando o teste t-student e ANOVA
(Tukey), com 95% de intervalo de confiança, mediante o programa “Minitab 14.1”. Na Tabela
14 são apresentados os resultados obtidos da análise estatística, ou seja, o valor p comparando
o colágeno total nos 3º, 7º e 14º dias, para cada região. Na tabela 15 são mostrados os
62
resultados da mesma análise considerando à razão entre a densidade de colágeno do tipo I e III,
para as três regiões da pele.
Tabela 14:Valor p da comparação da densidade de colágeno total entre o 3º, 7º e 14º dias, para cada região.
Região superficial Região central Região profunda
Grupo Controle 0,014 0,321 0,090
Grupo Tratado 0,035 0,047 0,018
Tabela 15:Valor p da comparação da razão de colágeno tipos I / III, entre o 3º, 7º e 14º dias, para cada região.
Região superficial Região central Região profunda
Grupo Controle 0,059 0,420 0,112
Grupo Tratado 0,009 0,743 0,260
Na Tabela 16 são apresentados os resultados da análise estatística considerando
especificamente a evolução da cicatrização, em termos de colágeno total, entre o 3o e o 7o dias
como também entre o 7o e o 14o dias, para as três regiões nas lesões controle e tratada.
Tabela 16:Valor p da comparação da densidade de colágeno total entre o 3º e 7º e entre o 7º e o 14º dias, para
cada região.
Os resultados obtidos mostram que a aplicação da MENS produz um aumento
significativo de colágeno total nas regiões central e profunda da lesão, o que pode proporcionar
uma evolução da derme com uma melhora da qualidade da cicatriz (resistência e elasticidade).
Comparação 3o/7o 7o/14o
Controle 0,034 0,321
Região superficial Tratado 0,042 0,670
Controle 0,263 0,919
Região central Tratado 0,794 0,031
Controle 0,199 0,374
Região profunda Tratado 0,523 0,027
63
6. Discussão
Neste trabalho, investigamos o efeito da microcorrente sobre a cicatrização, analisando
a quantidade total de fibras colágenas, como também a proporção entre as fibras de tipo I e III,
nas fases inflamatória, proliferativa e de maturação. Este estudo foi baseado na hipótese
segundo a qual a microcorrente pode aumentar a síntese de colágeno. O trabalho pioneiro de
Cheng et al. (1982), in vitro, mostrou que o uso de correntes com intensidade abaixo de 1 mA
numa cultura de fibroblasto induz um aumento da produção de ATP, e por conseqüência da
síntese protéica. Bailley (1999) mostrou que estimulação elétrica com intensidade na faixa de
200 até 800 µA sobrecarrega o tecido com ATP pela geração de um gradiente de prótons (H+)
entre os eletrodos, que estimula a fosforilação oxidativa. Este acúmulo de ATP disponibiliza
energia para o fibroblasto e conseqüentemente para a síntese de colágeno. Vodovnik e Karba
(1992), Kloth (2005) relatam, em base de uma revisão da literatura, que a microcorrente
produz um aumento na reação mitótica no tecido lesado e da síntese de proteínas.
A análise qualitativa feita da reepitelização da lesão indica que o grupo tratado com
microcorrente no 7º dia apresenta uma melhor cicatrização, quando comparado com o grupo
controle;entretanto, no 14º dia os grupos controle e tratado mostram a mesma aparência da
cicatriz. Santos et al. (2004) quantificaram a área da lesão tratada com MENS, no que diz
respeito a reepitelização da pele de ratos, e observaram uma diferença estatisticamente
significativa na redução da área da lesão em relação à lesão não-tratada, entre o 7º e 14º dia.
Alvarez et al. (1983) também encontram uma taxa de reepitelizacão mais alta nos grupos
tratados com microcorrente (C.C.).
A análise quantitativa realizada mostra um aumento estatisticamente significativo do
colágeno total do 7º para o 14º dia; isto sugere uma maior síntese de colágeno pelos
fibroblastos neste período, decorrente provavelmente a um aumento da densidade de
64
fibroblastos. Porém, a análise das razões entre os tipos de colágeno I e III, não mostra
diferença estatisticamente significativa entre os grupos, não permitindo assim a inferência dos
resultados para o tipo de fibra predominante nas diferentes fases.
Alvarez et al. (1983) encontram também um aumento significativo na produção do
colágeno no 5º, 6º e 7º dia da lesão tratada com corrente contínua (C.C.), na faixa de 50 a 300
µA. Canserven e Atalay (1996) observaram um aumento da hidroxiprolina em grupos tratados
por 3 dias com microcorrente, indicando que a estimulação por microcorrente aumenta a
síntese de colágeno.
Um estudo estatístico complementar feito para comparar o comportamento dos grupos
no 3º, 7º e 14º dia, em relação a região da lesão (superficial, central e profunda) mostra que a
evolução da lesão apresenta diferenças significativas do colágeno total entre a região central e
profunda, só para os grupos tratados. Isso leva a argumentar sobre a melhor evolução do tecido
cicatricial nos grupos tratados. Na região superficial houve diferença estatisticamente
significativa tanto nos grupos tratados quanto nos controles, o que sugere que a aparência da
cicatriz tende a se igualar na evolução do processo cicatricial. Na análise entre as regiões, em
relação à razão dos tipos de colágeno, foi observada uma diferença apenas na região superficial
tratada, o que pode ser devido ao fechamento da lesão mais rápido no grupo tratado e
conseqüentemente aumento no colágeno tipo I na evolução das fases. Esse resultado foi
reforçado pela diferença estatisticamente significativa observada no colágeno total nas regiões
central e profunda das lesões tratadas em comparação às lesões controle, a partir do 7o dia.
Na revisão da literatura, feita até o presente momento, não foram encontrados trabalhos
utilizando microcorrente no reparo tecidual, focando na análise dos diferentes tipos de
colágenos ao longo da lesão (superficial, central e profunda). Dantas et al. (2007) estudaram os
diferentes tipos de colágeno na investigação sobre a influência dos fatores de crescimento na
cicatrização em ratos e encontraram aumento significativo no colágeno tipo I em relação ao
65
tipo III no 3º dia. O que mostra a relevância da metodologia, ressaltando-se que no trabalho
citado, os autores analisaram uma ferida aberta de 1cm de tamanho e em nosso trabalho foi
investigado uma lesão suturada (cicatrização por 1º intenção) de área da ordem de 0,2 cm
pensando-se na proporção do rato no caso pós-operatório com padronização da sutura.
Acreditamos que o efeito da microcorrente possa ser melhor investigada considerando uma
ferida aberta com uma área maior.
66
7. Conclusão e perspectivas futuras
No estudo da estimulação elétrica neuromuscular por microcorrente MENS
(microcurent electrical neuromuscular stimulation) não encontramos diferenças significativas
entre os colágenos tipo I e tipo III nas regiões: superficial, central e profunda da lesão.
Entretanto, ocorre um aumento significativo no colágeno total no 14º dia na regiões central e
profunda da lesão tratada.
Como estudos futuros, pode-se propor a realização de uma análise da orientação das
fibras de colágeno. Acredita-se que a qualidade do tecido cicatricial depende da organização
das fibras de colágeno. Também, seria de interesse, otimizar o software desenvolvido para a
detecção e quantificação do fibroblasto, a fim de comprovar os resultados obtidos neste
trabalho referentes ao aumento do colágeno total no início da fase de maturação.
67
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72
ANEXO A - Parecer do comitê de Ética CEMEA
73
74
APÊNDICES –Imagens das lâminas
75
G13c1r
G13t1r
G13c2r
G13t2r
G13c3r
G13t3r
G14c1r
G14t1r
76
G14c2r
G14t2r
G14c3r
G14t3r
G15c1r
G15t1r
G15c2r
G15t2r
77
G15c3r
G15t3r
G16c1r
G16t1r
G16c2r
G16t2r
G16c3r
G16t3r
78
G17c1r
G17t1r
G17c2r
G17t2r
G17c3r
G17t3r
G18c1r
G18t1r
79
G18c2r
G18t2r
G18c3r
G18t3r
G19c1r
G19t1r
G19c2r
G19t2r
80
G19c3r
G19t3r
G21c1r
G21t1r
G21c2r
G21t2r
G21c3r
G21t3r
81
G24c1r
G24t1r
G24c2r
G24t2r
G24c3r
G24t3r
G26c1r
G26t1r
82
G26c2r
G26t2r
G26t3r
G27c1r
G27t1r
G27c2r
G27t2r
83
G27c3r
G27t3r
G28c1r
G28t1r
G28c2r
G28t2r
G28c3r
G28t3r
84
G210c1r
G210t1r
G211c1r
G211t1r
G211c2r
G211t2r
G211c3r
G211t3r
G35c1r
G35t1r
85
G35c2r
G35t2r
G35c3r
G35t3r
G36c1r
G36t1r
G36c2r
G36t2r
86
G36c3r
G36t3r
G38c1r
G38t1r
G38c2r
G38t2r
G38c3r
G38t3r
87
G39c1r
G39t1r
G39c2r
G39t2r
G39c3r
G39t3r
G310c1r
G310t1r
88
G310c2r
G310t2r
G3103r
G3103r
G311c1r
G311t1r
G311c2r
G311t2r
89
G311c3r
G311t3r
G312c1r
G312t1r
G312c2r
G312t2r
G312c3r
G312t3r
90
APÊNDICES –Tabelas de dados experimentias
91
Controle Tratado
imagem Red Green R/G ColTot %ColTot Imagem Red Green R/G ColTot %ColTot
G14C1R 99,00 7.110,00 0,014 7.209,00 3,11 G14T1R 303,00 953,00 0,32 1.256,00 0,54
G15C1R 1,00 958,00 0,001 959,00 0,41 G15T1R 11.846,00 6.732,00 1,76 18.578,00 8,02
G16C1R 6.233,00 2.786,00 2,237 9.019,00 3,90 G16T1R 6.488,00 1.244,00 5,22 7.732,00 3,34
G17C1R 5.034,00 2.579,00 1,952 7.613,00 3,29 G17T1R 32.422,00 4.349,00 7,46 36.771,00 15,88
G18C1R 1,00 5.740,00 0,000 5.741,00 2,48 G18T1R 43,00 635,00 0,07 678,00 0,29
G19C1R 17.738,00 2.202,00 8,055 19.940,00 8,61 G19T1R 22.938,00 1.856,00 12,36 24.794,00 10,71
Média 4.851,00 3.562,50 2,043 8.413,50 3,63 12.340,00 2.628,17 4,53 14.968,17 6,46
Despad 6.894,12 2.346,52 3,119 6.293,33 2,72 13.009,23 2.412,21 4,81 14.349,47 6,20
G1R
1
E. pad. 1,11 2,53
G14C2R 18.786,00 19.473,00 0,965 38.259,00 16,52 G14T2R 86.210,00 17.401,00 4,95 103.611,00 44,75
G15C2R 24.774,00 4.956,00 4,999 29.730,00 12,84 G15T2R 45.741,00 9.886,00 4,63 55.627,00 24,02
G16C2R 9.160,00 3.977,00 2,303 13.137,00 5,67 G16T2R 51.375,00 10.918,00 4,71 62.293,00 26,90
G17C2R 62.313,00 2.742,00 22,725 65.055,00 28,10 G17T2R 63.719,00 5.019,00 12,70 68.738,00 29,69
G18C2R 6.250,00 1.157,00 5,402 7.407,00 3,20 G18T2R 25.837,00 520,00 49,69 26.357,00 11,38
G19C2R 52.822,00 11.631,00 4,541 64.453,00 27,84 G19T2R 19.811,00 4.712,00 4,20 24.523,00 10,59
Média 29.017,50 7.322,67 6,823 36.340,17 15,69 48.782,17 8.076,00 13,48 56.858,17 24,56
Despad 23.283,53 6.956,79 7,977 24.648,59 10,65 24.518,29 5.934,03 18,03 29.441,11 12,72
G1R
2
E. pad. 4,35 5,19
G14C3R 6.562,00 18.239,00 0,360 24.801,00 10,71 G14T3R 12.785,00 13.016,00 0,98 25.801,00 11,14
G15C3R 56.128,00 11.925,00 4,707 68.053,00 29,39 G15T3R 50.159,00 25.558,00 1,96 75.717,00 32,70
G16C3R 28.003,00 9.491,00 2,950 37.494,00 16,19 G16T3R 22.715,00 19.437,00 1,17 42.152,00 18,21
G17C3R 18.869,00 8.684,00 2,173 27.553,00 11,90 G17T3R 81.465,00 11.427,00 7,13 92.892,00 40,12
G18C3R 10.672,00 7.162,00 1,490 17.834,00 7,70 G18T3R 3.850,00 1.974,00 1,95 5.824,00 2,52
G19C3R 38.064,00 17.387,00 2,189 55.451,00 23,95 G19T3R 18.559,00 8.401,00 2,21 26.960,00 11,64
Média 26.383,00 12.148,00 2,312 38.531,00 16,64 31.588,83 13.302,17 2,57 44.891,00 19,39
Despad 18.547,25 4.658,68 1,460 19.474,63 8,41 28996,66 8292,0271 2,287 33.087,822 14,290
G1R
3
E. pad. 3,43 5,83
92
Controle Tratado
imagem Red Green R/G ColTot %ColTot Imagem Red Green R/G ColTot %ColTot
G24C1R 16.585,00 5.284,00 3,139 21.869,00 9,45 G24T1R 73.681,00 6.503,00 11,33 80.184,00 34,63
G26C1R 9.291,00 4.615,00 2,013 13.906,00 6,01 G26T1R 15.241,00 2.590,00 5,88 17.831,00 7,70
G27C1R 48.750,00 3.386,00 14,398 52.136,00 22,52 G27T1R 23.549,00 2.740,00 8,59 26.289,00 11,35
G28C1R 23.734,00 3.325,00 7,138 27.059,00 11,69 G28T1R 79.381,00 5.363,00 14,80 84.744,00 36,60
G210C1R 30.350,00 1.808,00 16,787 32.158,00 13,89 G210T1R 40.164,00 4.116,00 9,76 44.280,00 19,12
G211C1R 2.609,00 3.687,00 0,708 6.296,00 2,72 G211T1R 21.486,00 2.181,00 9,85 23.667,00 10,22
média 21.886,50 3.684,17 7,364 25.570,67 11,04 42.250,33 3.915,50 10,04 46.165,83 19,94
despad 16.462,48 1.196,98 6,769 15.953,71 6,89 27.861,54 1.730,77 2,96 29.506,66 12,74
G2R
1
E. pad. 2,81 5,20
G24C2R 17.584,00 16.649,00 1,056 34.233,00 14,78 G24T2R 35.576,00 9.011,00 3,95 44.587,00 19,26
G26C2R 31.335,00 4.421,00 7,088 35.756,00 15,44 G26T2R 6.921,00 9.901,00 0,70 16.822,00 7,27
G27C2R 19.669,00 33.564,00 0,586 53.233,00 22,99 G27T2R 36.344,00 5.624,00 6,46 41.968,00 18,13
G28C2R 131.337,00 3.972,00 33,066 135.309,00 58,44 G28T2R 104.765,00 3.037,00 34,50 107.802,00 46,56
G210C2R 49.091,00 7.618,00 6,444 56.709,00 24,49 G210T2R 33.343,00 3.551,00 9,39 36.894,00 15,93
G211C2R 33.541,00 2.784,00 12,048 36.325,00 15,69 G211C2R 58.718,00 6.105,00 9,62 64.823,00 28,00
média 47.092,83 11.501,33 10,048 58.594,167 25,306 45.944,50 6.204,83 10,77 52.149,33 22,52
despad 42.792,22 11.926,05 12,049 38.803,159 16,759 33.179,27 2.791,47 12,11 31.303,15 13,52
G2R
2
E. pad. 6,842 5,52
G24C3R 14.546,00 10.265,00 1,417 24.811,00 10,72 G24T3R 17.959,00 26.991,00 0,67 44.950,00 19,41
G26C3R 44.455,00 20.098,00 2,212 64.553,00 27,88 G26T3R 70.994,00 5.261,00 13,49 76.255,00 32,93
G27C3R - - 0,00 G27T3R 29.273,00 19.173,00 1,53 48.446,00 20,92
G28C3R 86.381,00 18.732,00 4,611 105.113,00 45,40 G28T3R 68.154,00 4.446,00 15,33 72.600,00 31,36
G210C3R 76.777,00 11.537,00 6,655 88.314,00 38,14 G210T3R 29.646,00 7.411,00 4,00 37.057,00 16,00
G211C3R 21.123,00 6.180,00 3,418 27.303,00 11,79 G211T3R
média 48.656,40 13.362,40 3,663 62.018,800 22,321 43.205,200 12.656,400 7,003 55.861,600 24,126
despad 32.222,56 5.888,84 2,065 35.862,853 17,649 21.954,45 8.916,99 6,17 15.644,37 6,76
G2R
3
E.pad 7,205 3,084
93
Controle Tratado
imagem Red Green R/G ColTot %ColTot Imagem Red Green R/G ColTot %ColTot
G35C1R 11.012,00 7.069,00 1,56 18.081,00 7,81 G35T1R 13.124,00 12.471,00 1,05 25.595,00 11,05
G36C1R 8.964,00 15.590,00 0,57 24.554,00 10,60 G36T1R 22.274,00 20.112,00 1,11 42.386,00 18,31
G38C1R 26.052,00 17.347,00 1,50 43.399,00 18,74 G38T1R 33.381,00 14.161,00 2,36 47.542,00 20,53
G39C1R 6.306,00 12.500,00 0,50 18.806,00 8,12 G39T1R 22.611,00 23.420,00 0,97 46.031,00 19,88
G310C1R 42.396,00 14.666,00 2,89 57.062,00 24,64 G310T1R 20.020,00 11.565,00 1,73 31.585,00 13,64
G311C1R 29.950,00 21.806,00 1,37 51.756,00 22,35 G311T1R 45.169,00 5.195,00 8,69 50.364,00 21,75
média 20.780,00 14.829,67 1,40 35.609,67 15,38 26.096,50 14.487,33 2,65 40.583,83 17,53
despad 14.308,48 4.924,76 0,86 17.282,51 7,46 11.391,17 6.488,28 3,01 9.824,78 4,24
G3R
1
E. pad. 3,05 1,73
G35C2R 18.031,00 13.911,00 1,30 31.942,00 13,80 G35T2R 138.098,00 6.032,00 22,89 144.130,00 62,25
G36C2R 35.846,00 17.522,00 2,05 53.368,00 23,05 G36T2R 37.529,00 27.437,00 1,37 64.966,00 28,06
G38C2R 89.077,00 9.911,00 8,99 98.988,00 42,75 G38T2R 49.114,00 35.637,00 1,38 84.751,00 36,60
G39C2R 21.509,00 24.001,00 0,90 45.510,00 19,66 G39T2R 49.332,00 29.445,00 1,68 78.777,00 34,02
G310C2R 61.417,00 10.186,00 6,03 71.603,00 30,92 G310T2R 98.608,00 10.540,00 9,36 109.148,00 47,14
G311C2R 26.773,00 34.967,00 0,77 61.740,00 26,66 G311T2R 78.576,00 9.798,00 8,02 88.374,00 38,17
média 42.108,83 18.416,33 3,34 60.525,17 26,14 75.209,50 19.814,83 7,45 95.024,33 41,04
despad 27.775,24 9.657,02 3,39 23.226,11 10,03 38.168,64 12.470,00 8,36 28.028,89 12,11
G3R
2
E. pad. 4,10 4,94
G35C3R 108.134,00 6.052,00 17,87 114.186,00 49,32 G35T3R 26.585,00 25.100,00 1,06 51.685,00 22,32
G36C3R 110.110,00 11.785,00 9,34 121.895,00 52,65 G36T3R 96.787,00 15.978,00 6,06 112.765,00 48,70
G38C3R 75.460,00 10.127,00 7,45 85.587,00 36,96 G38T3R 60.921,00 33.068,00 1,84 93.989,00 40,59
G39C3R 54.819,00 26.202,00 2,09 81.021,00 34,99 G39T3R 123.678,00 20.320,00 6,09 143.998,00 62,19
G310C3R 75.095,00 10.533,00 7,13 85.628,00 36,98 G310T3R 70.582,00 17.951,00 3,93 88.533,00 38,24
G311C3R 2.206,00 9.415,00 0,23 11.621,00 5,02 G311T3R 78.576,00 9.798,00 8,02 88.374,00 38,17
media 70.970,67 12.352,33 7,35 83.323,00 35,99 76.188,17 20.369,17 4,50 96.557,33 41,70
despad 39.848,77 7.052,93 6,21 38.980,09 16,84 32.894,64 8.006,53 2,70 30.544,34 13,19
G3R
3
E. pad. 6,87 5,39
94
Apêndice –Análise estatística
95
______________________________________________________________________________________
Análise do colágeno total com t Análise do colágeno total com t Análise do colágeno total com t Análise do colágeno total com t----studentstudentstudentstudent ______________________________________________________________________________________
Results for: Worksheet %ColTot R1Results for: Worksheet %ColTot R1Results for: Worksheet %ColTot R1Results for: Worksheet %ColTot R1
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG1R1C; ColTotG1R1T Test and CI: ColTotG1R1C; ColTotG1R1T Test and CI: ColTotG1R1C; ColTotG1R1T Test and CI: ColTotG1R1C; ColTotG1R1T
Two-sample T for ColTotG1R1C vs ColTotG1R1T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG1R1C 6 3,63 2,72 1,1
ColTotG1R1T 6 6,46 6,20 2,5
Difference = mu (ColTotG1R1C) - mu (ColTotG1R1T)
Estimate for difference: -2,83000
95% CI for difference: (-8,98644; 3,32644)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,02 P-Value = 0,330 DF = 10
Both use Pooled StDev = 4,7857
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG2R1C; ColTotG2R1T Test and CI: ColTotG2R1C; ColTotG2R1T Test and CI: ColTotG2R1C; ColTotG2R1T Test and CI: ColTotG2R1C; ColTotG2R1T
Two-sample T for ColTotG2R1C vs ColTotG2R1T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG2R1C 6 11,05 6,89 2,8
ColTotG2R1T 6 19,9 12,7 5,2
Difference = mu (ColTotG2R1C) - mu (ColTotG2R1T)
Estimate for difference: -8,89000
95% CI for difference: (-22,06867; 4,28867)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,50 P-Value = 0,164 DF = 10
Both use Pooled StDev = 10,2445
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----TestTestTestTest and CI: ColTotG3R1C; ColTotG3R1T and CI: ColTotG3R1C; ColTotG3R1T and CI: ColTotG3R1C; ColTotG3R1T and CI: ColTotG3R1C; ColTotG3R1T
Two-sample T for ColTotG3R1C vs ColTotG3R1T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG3R1C 6 15,38 7,46 3,0
ColTotG3R1T 6 17,53 4,24 1,7
Difference = mu (ColTotG3R1C) - mu (ColTotG3R1T)
Estimate for difference: -2,15000
95% CI for difference: (-9,95952; 5,65952)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,61 P-Value = 0,553 DF = 10
Both use Pooled StDev = 6,0708
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG1R2C; ColTotG1R2T Test and CI: ColTotG1R2C; ColTotG1R2T Test and CI: ColTotG1R2C; ColTotG1R2T Test and CI: ColTotG1R2C; ColTotG1R2T
Two-sample T for ColTotG1R2C vs ColTotG1R2T
96
N Mean StDev SE Mean
ColTotG1R2C 6 15,7 10,6 4,3
ColTotG1R2T 6 24,6 12,7 5,2
Difference = mu (ColTotG1R2C) - mu (ColTotG1R2T)
Estimate for difference: -8,86000
95% CI for difference: (-23,94696; 6,22696)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,31 P-Value = 0,220 DF = 10
Both use Pooled StDev = 11,7279
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG2R2C; ColTotG2R2T Test and CI: ColTotG2R2C; ColTotG2R2T Test and CI: ColTotG2R2C; ColTotG2R2T Test and CI: ColTotG2R2C; ColTotG2R2T
Two-sample T for ColTotG2R2C vs ColTotG2R2T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG2R2C 6 25,3 16,8 6,8
ColTotG2R2T 6 22,5 13,5 5,5
Difference = mu (ColTotG2R2C) - mu (ColTotG2R2T)
Estimate for difference: 2,78000
95% CI for difference: (-16,80708; 22,36708)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,32 P-Value = 0,758 DF = 10
Both use Pooled StDev = 15,2261
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG3R2C; ColTotG3R2T Test and CI: ColTotG3R2C; ColTotG3R2T Test and CI: ColTotG3R2C; ColTotG3R2T Test and CI: ColTotG3R2C; ColTotG3R2T
Two-sample T for ColTotG3R2C vs ColTotG3R2T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG3R2C 6 26,1 10,0 4,1
ColTotG3R2T 6 41,0 12,1 4,9
Difference = mu (ColTotG3R2C) - mu (ColTotG3R2T)
Estimate for difference: -14,9000
95% CI for difference: (-29,1996; -0,6004)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -2,32 P-Value = 0,043 DF = 10
Both use Pooled StDev = 11,1158
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG1R3C; ColTotG1R3T Test and CI: ColTotG1R3C; ColTotG1R3T Test and CI: ColTotG1R3C; ColTotG1R3T Test and CI: ColTotG1R3C; ColTotG1R3T
Two-sample T for ColTotG1R3C vs ColTotG1R3T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG1R3C 6 16,64 8,41 3,4
ColTotG1R3T 6 19,4 14,3 5,8
Difference = mu (ColTotG1R3C) - mu (ColTotG1R3T)
Estimate for difference: -2,74833
95% CI for difference: (-17,83159; 12,33492)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,41 P-Value = 0,693 DF = 10
Both use Pooled StDev = 11,7250
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG2R3C; ColTotG2R3T Test and CI: ColTotG2R3C; ColTotG2R3T Test and CI: ColTotG2R3C; ColTotG2R3T Test and CI: ColTotG2R3C; ColTotG2R3T
Two-sample T for ColTotG2R3C vs ColTotG2R3T
97
N Mean StDev SE Mean
ColTotG2R3C 5 26,8 15,5 6,9
ColTotG2R3T 5 24,12 7,56 3,4
Difference = mu (ColTotG2R3C) - mu (ColTotG2R3T)
Estimate for difference: 2,66200
95% CI for difference: (-15,11054; 20,43454)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 0,35 P-Value = 0,739 DF = 8
Both use Pooled StDev = 12,1860
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: ColTotG3R3C; ColTotG3R3T Test and CI: ColTotG3R3C; ColTotG3R3T Test and CI: ColTotG3R3C; ColTotG3R3T Test and CI: ColTotG3R3C; ColTotG3R3T
Two-sample T for ColTotG3R3C vs ColTotG3R3T
N Mean StDev SE Mean
ColTotG3R3C 6 36,0 16,8 6,9
ColTotG3R3T 6 41,7 13,2 5,4
Difference = mu (ColTotG3R3C) - mu (ColTotG3R3T)
Estimate for difference: -5,71500
95% CI for difference: (-25,17094; 13,74094)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,65 P-Value = 0,528 DF = 10
Both use Pooled StDev = 15,1241
_________________________________________________________________________________
t t t t----student para a razão entre tipo I e IIIstudent para a razão entre tipo I e IIIstudent para a razão entre tipo I e IIIstudent para a razão entre tipo I e III ______________________________________________________________________________________
Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG1R1C; RazG1R1T Test and CI: RazG1R1C; RazG1R1T Test and CI: RazG1R1C; RazG1R1T Test and CI: RazG1R1C; RazG1R1T
Two-sample T for RazG1R1C vs RazG1R1T
N Mean StDev SE Mean
RazG1R1C 6 2,04 3,12 1,3
RazG1R1T 6 4,53 4,81 2,0
Difference = mu (RazG1R1C) - mu (RazG1R1T)
Estimate for difference: -2,48850
95% CI for difference: (-7,70300; 2,72600)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,06 P-Value = 0,313 DF = 10
Both use Pooled StDev = 4,0535
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG2R1C; RazG2R1T Test and CI: RazG2R1C; RazG2R1T Test and CI: RazG2R1C; RazG2R1T Test and CI: RazG2R1C; RazG2R1T
Two-sample T for RazG2R1C vs RazG2R1T
N Mean StDev SE Mean
RazG2R1C 6 7,36 6,77 2,8
RazG2R1T 6 10,04 2,96 1,2
Difference = mu (RazG2R1C) - mu (RazG2R1T)
Estimate for difference: -2,67117
95% CI for difference: (-9,39202; 4,04969)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,89 P-Value = 0,397 DF = 10
98
Both use Pooled StDev = 5,2245
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG3R1C; RazG3R1T Test and CI: RazG3R1C; RazG3R1T Test and CI: RazG3R1C; RazG3R1T Test and CI: RazG3R1C; RazG3R1T
Two-sample T for RazG3R1C vs RazG3R1T
N Mean StDev SE Mean
RazG3R1C 6 1,398 0,867 0,35
RazG3R1T 6 2,65 3,01 1,2
Difference = mu (RazG3R1C) - mu (RazG3R1T)
Estimate for difference: -1,25333
95% CI for difference: (-4,09866; 1,59199)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,98 P-Value = 0,350 DF = 10
Both use Pooled StDev = 2,2118
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG1R2C; RazG1R2T Test and CI: RazG1R2C; RazG1R2T Test and CI: RazG1R2C; RazG1R2T Test and CI: RazG1R2C; RazG1R2T
Two-sample T for RazG1R2C vs RazG1R2T
N Mean StDev SE Mean
RazG1R2C 6 6,82 7,98 3,3
RazG1R2T 6 13,5 18,0 7,4
Difference = mu (RazG1R2C) - mu (RazG1R2T)
Estimate for difference: -6,65750
95% CI for difference: (-24,59395; 11,27895)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,83 P-Value = 0,428 DF = 10 Both use Pooled StDev = 13,9430
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG2R2C; RazG2R2T Test and CI: RazG2R2C; RazG2R2T Test and CI: RazG2R2C; RazG2R2T Test and CI: RazG2R2C; RazG2R2T
Two-sample T for RazG2R2C vs RazG2R2T
N Mean StDev SE Mean
RazG2R2C 6 10,0 12,0 4,9
RazG2R2T 6 10,8 12,1 4,9
Difference = mu (RazG2R2C) - mu (RazG2R2T)
Estimate for difference: -0,722000
95% CI for difference: (-16,259428; 14,815428)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,10 P-Value = 0,920 DF = 10
Both use Pooled StDev = 12,0781
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG3R2C; RazG3R2T Test and CI: RazG3R2C; RazG3R2T Test and CI: RazG3R2C; RazG3R2T Test and CI: RazG3R2C; RazG3R2T
Two-sample T for RazG3R2C vs RazG3R2T
N Mean StDev SE Mean
RazG3R2C 6 3,34 3,39 1,4
RazG3R2T 6 7,45 8,36 3,4
99
Difference = mu (RazG3R2C) - mu (RazG3R2T)
Estimate for difference: -4,11000
95% CI for difference: (-12,31703; 4,09703)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,12 P-Value = 0,291 DF = 10
Both use Pooled StDev = 6,3798
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG1R3C; RazG1R3T Test and CI: RazG1R3C; RazG1R3T Test and CI: RazG1R3C; RazG1R3T Test and CI: RazG1R3C; RazG1R3T
Two-sample T for RazG1R3C vs RazG1R3T
N Mean StDev SE Mean
RazG1R3C 6 2,31 1,46 0,60
RazG1R3T 6 2,57 2,29 0,93
Difference = mu (RazG1R3C) - mu (RazG1R3T)
Estimate for difference: -0,255167
95% CI for difference: (-2,723989; 2,213655)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0,23 P-Value = 0,823 DF = 10
Both use Pooled StDev = 1,9191
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG2R3C; RazG2R3T Test and CI: RazG2R3C; RazG2R3T Test and CI: RazG2R3C; RazG2R3T Test and CI: RazG2R3C; RazG2R3T
Two-sample T for RazG2R3C vs RazG2R3T
N Mean StDev SE Mean
RazG2R3C 5 3,66 2,07 0,92 RazG2R3T 5 7,00 6,90 3,1
Difference = mu (RazG2R3C) - mu (RazG2R3T)
Estimate for difference: -3,34140
95% CI for difference: (-10,77016; 4,08736)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1,04 P-Value = 0,330 DF = 8
Both use Pooled StDev = 5,0936
TwoTwoTwoTwo----Sample TSample TSample TSample T----Test and CI: RazG3R3C; RazG3R3T Test and CI: RazG3R3C; RazG3R3T Test and CI: RazG3R3C; RazG3R3T Test and CI: RazG3R3C; RazG3R3T
Two-sample T for RazG3R3C vs RazG3R3T
N Mean StDev SE Mean
RazG3R3C 6 7,35 6,21 2,5
RazG3R3T 6 4,50 2,71 1,1
Difference = mu (RazG3R3C) - mu (RazG3R3T)
Estimate for difference: 2,85167
95% CI for difference: (-3,31290; 9,01623)
T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = 1,03 P-Value = 0,327 DF = 10
Both use Pooled StDev = 4,7920
100
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Análise Colágeno total por região com OneAnálise Colágeno total por região com OneAnálise Colágeno total por região com OneAnálise Colágeno total por região com One----wwwway ANOVA, Tukey 95%ay ANOVA, Tukey 95%ay ANOVA, Tukey 95%ay ANOVA, Tukey 95%
Comparação entre os 3Comparação entre os 3Comparação entre os 3Comparação entre os 3oooo, 7, 7, 7, 7oooo e 14 e 14 e 14 e 14o o o o diasdiasdiasdias
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ _____________________________________ _____________________________________ _____________________________________
Análise região superficialAnálise região superficialAnálise região superficialAnálise região superficial ________________________________________________________________________________________
Results for: Worksheet %ColTot R1Results for: Worksheet %ColTot R1Results for: Worksheet %ColTot R1Results for: Worksheet %ColTot R1
OneOneOneOne----way ANOVA: ColTotG1R1C; ColToway ANOVA: ColTotG1R1C; ColToway ANOVA: ColTotG1R1C; ColToway ANOVA: ColTotG1R1C; ColTotG2R1C; ColTotG3R1C tG2R1C; ColTotG3R1C tG2R1C; ColTotG3R1C tG2R1C; ColTotG3R1C
Source DF SS MS F P
Factor 2 423,2 211,6 5,74 0,014
Error 15 552,8 36,9
Total 17 976,0
S = 6,071 R-Sq = 43,36% R-Sq(adj) = 35,81%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------
ColTotG1R1C 6 3,633 2,718 (--------*--------)
ColTotG2R1C 6 11,047 6,890 (-------*--------)
ColTotG3R1C 6 15,377 7,463 (--------*-------)
---+---------+---------+---------+------
0,0 6,0 12,0 18,0
Pooled StDev = 6,071
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
ColTotG1R1C subtracted from:
Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+------
ColTotG2R1C -1,682 7,413 16,509 (--------*---------)
ColTotG3R1C 2,648 11,743 20,839 (--------*--------)
---+---------+---------+---------+------
-10 0 10 20
ColTotG2R1C subtracted from:
Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+------
ColTotG3R1C -4,766 4,330 13,426 (--------*--------)
---+---------+---------+---------+------
-10 0 10 20
101
OneOneOneOne----way ANOVA: ColTotG1R1T; ColTotG2R1T; ColTotG3R1T way ANOVA: ColTotG1R1T; ColTotG2R1T; ColTotG3R1T way ANOVA: ColTotG1R1T; ColTotG2R1T; ColTotG3R1T way ANOVA: ColTotG1R1T; ColTotG2R1T; ColTotG3R1T
Source DF SS MS F P
Factor 2 619,5 309,7 4,25 0,035
Error 15 1094,3 73,0
Total 17 1713,7
S = 8,541 R-Sq = 36,15% R-Sq(adj) = 27,63%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--------
ColTotG1R1T 6 6,463 6,198 (--------*--------)
ColTotG2R1T 6 19,937 12,744 (--------*--------)
ColTotG3R1T 6 17,527 4,244 (--------*--------)
-+---------+---------+---------+--------
0,0 8,0 16,0 24,0
Pooled StDev = 8,541
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
ColTotG1R1T subtracted from:
Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+------
ColTotG2R1T 0,676 13,473 26,270 (---------*----------)
ColTotG3R1T -1,734 11,063 23,860 (---------*----------)
---+---------+---------+---------+------
-12 0 12 24
ColTotG2R1T subtracted from:
Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+------
ColTotG3R1T -15,207 -2,410 10,387 (----------*----------)
---+---------+---------+---------+------
-12 0 12 24
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Análise região central Análise região central Análise região central Análise região central
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
OneOneOneOne----way ANOVA: ColTotG1R2C; ColTotG2R2C; ColTotG3R2C way ANOVA: ColTotG1R2C; ColTotG2R2C; ColTotG3R2C way ANOVA: ColTotG1R2C; ColTotG2R2C; ColTotG3R2C way ANOVA: ColTotG1R2C; ColTotG2R2C; ColTotG3R2C
Source DF SS MS F P
Factor 2 404 202 1,23 0,321
Error 15 2474 165
Total 17 2878
S = 12,84 R-Sq = 14,05% R-Sq(adj) = 2,58%
102
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+----
ColTotG1R2C 6 15,70 10,65 (----------*----------)
ColTotG2R2C 6 25,31 16,76 (----------*----------)
ColTotG3R2C 6 26,14 10,03 (----------*----------)
-----+---------+---------+---------+----
10 20 30 40
Pooled StDev = 12,84
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
ColTotG1R2C subtracted from:
Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+------
ColTotG2R2C -9,63 9,61 28,85 (-----------*------------)
ColTotG3R2C -8,80 10,44 29,69 (------------*------------)
---+---------+---------+---------+------ -15 0 15 30
ColTotG2R2C subtracted from:
Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+------
ColTotG3R2C -18,41 0,83 20,08 (------------*-----------)
---+---------+---------+---------+------
-15 0 15 30
OneOneOneOne----way ANOVA: ColTotG1R2T; ColTotG2R2T; ColTotG3R2T way ANOVA: ColTotG1R2T; ColTotG2R2T; ColTotG3R2T way ANOVA: ColTotG1R2T; ColTotG2R2T; ColTotG3R2T way ANOVA: ColTotG1R2T; ColTotG2R2T; ColTotG3R2T
Source DF SS MS F P
Factor 2 1237 619 3,78 0,047
Error 15 2455 164
Total 17 3693
S = 12,79 R-Sq = 33,51% R-Sq(adj) = 24,64%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+--------
ColTotG1R2T 6 24,56 12,72 (--------*---------)
ColTotG2R2T 6 22,53 13,52 (---------*--------) ColTotG3R2T 6 41,04 12,11 (--------*--------)
-+---------+---------+---------+--------
12 24 36 48
Pooled StDev = 12,79
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
103
Individual confidence level = 97,97%
ColTotG1R2T subtracted from:
Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+
ColTotG2R2T -21,20 -2,03 17,14 (---------*---------)
ColTotG3R2T -2,68 16,49 35,65 (--------*---------)
---------+---------+---------+---------+
-20 0 20 40
ColTotG2R2T subtracted from:
Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+
ColTotG3R2T -0,65 18,52 37,68 (--------*---------)
---------+---------+---------+---------+
-20 0 20 40
_________________________________________________________________________________
Análise região profundaAnálise região profundaAnálise região profundaAnálise região profunda _________________________________________________________________________________
OneOneOneOne----way ANOVA: ColTotG1R3C; ColTotG2R3C; ColTotG3R3C way ANOVA: ColTotG1R3C; ColTotG2R3C; ColTotG3R3C way ANOVA: ColTotG1R3C; ColTotG2R3C; ColTotG3R3C way ANOVA: ColTotG1R3C; ColTotG2R3C; ColTotG3R3C
Source DF SS MS F P
Factor 2 1124 562 2,88 0,090
Error 14 2731 195
Total 16 3854
S = 13,97 R-Sq = 29,15% R-Sq(adj) = 19,03%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+---
ColTotG1R3C 6 16,64 8,41 (---------*---------)
ColTotG2R3C 5 26,79 15,49 (----------*----------)
ColTotG3R3C 6 35,99 16,84 (---------*---------)
------+---------+---------+---------+---
12 24 36 48
Pooled StDev = 13,97
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
ColTotG1R3C subtracted from:
Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+---
ColTotG2R3C -11,98 10,15 32,27 (----------*----------)
ColTotG3R3C -1,75 19,35 40,44 (----------*---------)
------+---------+---------+---------+---
104
-20 0 20 40
ColTotG2R3C subtracted from:
Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+---
ColTotG3R3C -12,92 9,20 31,33 (----------*----------)
------+---------+---------+---------+---
-20 0 20 40
OneOneOneOne----way ANOVA: ColTotG1R3T; ColTotG2R3T; ColTotG3R3T way ANOVA: ColTotG1R3T; ColTotG2R3T; ColTotG3R3T way ANOVA: ColTotG1R3T; ColTotG2R3T; ColTotG3R3T way ANOVA: ColTotG1R3T; ColTotG2R3T; ColTotG3R3T
Source DF SS MS F P
Factor 2 1639 820 5,41 0,018
Error 14 2119 151
Total 16 3759
S = 12,30 R-Sq = 43,61% R-Sq(adj) = 35,55%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------
ColTotG1R3T 6 19,39 14,29 (--------*--------)
ColTotG2R3T 5 24,12 7,56 (---------*---------)
ColTotG3R3T 6 41,70 13,19 (--------*--------) ---+---------+---------+---------+------
12 24 36 48
Pooled StDev = 12,30
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
ColTotG1R3T subtracted from:
Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+
ColTotG2R3T -14,76 4,74 24,23 (--------*---------)
ColTotG3R3T 3,73 22,31 40,90 (--------*--------)
---------+---------+---------+---------+
-20 0 20 40
ColTotG2R3T subtracted from:
Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+
ColTotG3R3T -1,92 17,58 37,07 (---------*---------) ---------+---------+---------+---------+
-20 0 20 40
105
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Análise Raz Análise Raz Análise Raz Análise Razão Colágeno Tipo I/Tipo III total por região ão Colágeno Tipo I/Tipo III total por região ão Colágeno Tipo I/Tipo III total por região ão Colágeno Tipo I/Tipo III total por região
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Análise região superficial Análise região superficial Análise região superficial Análise região superficial ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3Results for: Worksheet Raz_G R1_R2_R3
OneOneOneOne----way ANOVA: RazG1R1C; RazG2R1C; RazG3R1C way ANOVA: RazG1R1C; RazG2R1C; RazG3R1C way ANOVA: RazG1R1C; RazG2R1C; RazG3R1C way ANOVA: RazG1R1C; RazG2R1C; RazG3R1C
Source DF SS MS F P
Factor 2 128,6 64,3 3,43 0,059
Error 15 281,5 18,8
Total 17 410,1
S = 4,332 R-Sq = 31,36% R-Sq(adj) = 22,21%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+--
RazG1R1C 6 2,043 3,119 (----------*----------)
RazG2R1C 6 7,364 6,769 (----------*----------)
RazG3R1C 6 1,398 0,867 (----------*----------)
-------+---------+---------+---------+--
0,0 3,5 7,0 10,5
Pooled StDev = 4,332
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
RazG1R1C subtracted from:
Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+-
RazG2R1C -1,170 5,321 11,811 (---------*--------)
RazG3R1C -7,136 -0,645 5,846 (--------*--------)
--------+---------+---------+---------+-
-7,0 0,0 7,0 14,0
RazG2R1C subtracted from:
Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+-
RazG3R1C -12,456 -5,966 0,525 (--------*---------)
--------+---------+---------+---------+-
-7,0 0,0 7,0 14,0
106
OneOneOneOne----way ANOVA: RazG1R1T; RazG2R1T; RazG3R1T way ANOVA: RazG1R1T; RazG2R1T; RazG3R1T way ANOVA: RazG1R1T; RazG2R1T; RazG3R1T way ANOVA: RazG1R1T; RazG2R1T; RazG3R1T
Source DF SS MS F P
Factor 2 176,7 88,3 6,47 0,009
Error 15 204,7 13,6
Total 17 381,3
S = 3,694 R-Sq = 46,33% R-Sq(adj) = 39,17%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+-------
RazG1R1T 6 4,532 4,810 (--------*--------)
RazG2R1T 6 10,035 2,961 (---------*--------)
RazG3R1T 6 2,652 3,006 (---------*--------)
--+---------+---------+---------+-------
0,0 3,5 7,0 10,5
Pooled StDev = 3,694
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
RazG1R1T subtracted from:
Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+-
RazG2R1T -0,031 5,503 11,038 (-------*-------)
RazG3R1T -7,414 -1,880 3,654 (-------*-------)
--------+---------+---------+---------+-
-7,0 0,0 7,0 14,0
RazG2R1T subtracted from:
Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+-
RazG3R1T -12,918 -7,383 -1,849 (------*-------)
--------+---------+---------+---------+-
-7,0 0,0 7,0 14,0
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Análise região central Análise região central Análise região central Análise região central ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
OneOneOneOne----way ANOVA: RazG1R2C; RazG2R2C; RazG3R2C way ANOVA: RazG1R2C; RazG2R2C; RazG3R2C way ANOVA: RazG1R2C; RazG2R2C; RazG3R2C way ANOVA: RazG1R2C; RazG2R2C; RazG3R2C
Source DF SS MS F P
Factor 2 135,1 67,5 0,92 0,420
Error 15 1101,7 73,4
Total 17 1236,7
S = 8,570 R-Sq = 10,92% R-Sq(adj) = 0,00%
107
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+--
RazG1R2C 6 6,823 7,977 (-----------*------------)
RazG2R2C 6 10,048 12,050 (------------*-----------)
RazG3R2C 6 3,340 3,392 (------------*-----------)
-------+---------+---------+---------+--
0,0 6,0 12,0 18,0
Pooled StDev = 8,570
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
RazG1R2C subtracted from:
Lower Center Upper +---------+---------+---------+---------
RazG2R2C -9,615 3,226 16,066 (------------*------------)
RazG3R2C -16,323 -3,483 9,358 (------------*-----------)
+---------+---------+---------+---------
-20 -10 0 10
RazG2R2C subtracted from:
Lower Center Upper +---------+---------+---------+---------
RazG3R2C -19,548 -6,708 6,132 (------------*------------)
+---------+---------+---------+---------
-20 -10 0 10
OneOneOneOne----way ANOVA: RazG1R2T; RazG2R2T; RazG3R2T way ANOVA: RazG1R2T; RazG2R2T; RazG3R2T way ANOVA: RazG1R2T; RazG2R2T; RazG3R2T way ANOVA: RazG1R2T; RazG2R2T; RazG3R2T
Source DF SS MS F P
Factor 2 109 55 0,30 0,743
Error 15 2708 181
Total 17 2818
S = 13,44 R-Sq = 3,88% R-Sq(adj) = 0,00%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+----
RazG1R2T 6 13,48 18,03 (--------------*-------------)
RazG2R2T 6 10,77 12,11 (-------------*--------------)
RazG3R2T 6 7,45 8,36 (-------------*--------------)
-----+---------+---------+---------+----
0,0 8,0 16,0 24,0
Pooled StDev = 13,44
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
RazG1R2T subtracted from:
108
Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--
RazG2R2T -22,84 -2,71 17,42 (------------*-------------)
RazG3R2T -26,16 -6,03 14,10 (------------*------------)
-------+---------+---------+---------+--
-15 0 15 30
RazG2R2T subtracted from:
Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--
RazG3R2T -23,45 -3,32 16,81 (-------------*------------)
-------+---------+---------+---------+--
-15 0 15 30
++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
Análise região profunda Análise região profunda Análise região profunda Análise região profunda ++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++
OneOneOneOne----way ANOVA: RazG1R3C; RazG2R3C; RazG3R3C way ANOVA: RazG1R3C; RazG2R3C; RazG3R3C way ANOVA: RazG1R3C; RazG2R3C; RazG3R3C way ANOVA: RazG1R3C; RazG2R3C; RazG3R3C
Source DF SS MS F P
Factor 2 81,0 40,5 2,57 0,112 Error 14 220,8 15,8
Total 16 301,8
S = 3,971 R-Sq = 26,85% R-Sq(adj) = 16,40%
Individual 95% CIs For Mean Based on
Pooled StDev
Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-----
RazG1R3C 6 2,312 1,460 (-----------*----------)
RazG2R3C 5 3,663 2,065 (-----------*------------)
RazG3R3C 6 7,352 6,214 (-----------*----------)
----+---------+---------+---------+-----
0,0 3,0 6,0 9,0
Pooled StDev = 3,971
Tukey 95% Simultaneous Confidence Intervals
All Pairwise Comparisons
Individual confidence level = 97,97%
RazG1R3C subtracted from:
Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--
RazG2R3C -4,940 1,351 7,642 (---------*----------) RazG3R3C -0,958 5,040 11,039 (---------*---------)
-------+---------+---------+---------+--
-6,0 0,0 6,0 12,0
RazG2R3C subtracted from:
Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+--
RazG3R3C -2,602 3,689 9,980 (---------*----------)
-------+---------+---------+---------+--
-6,0 0,0 6,0 12,0
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