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ESTRATGIAS DE CONTROLE BIOLGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGNICOS
CSAR RONALD PEREIRA GOMES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ NOVEMBRO - 2009
ESTRATGIAS DE CONTROLE BIOLGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGNICOS
CSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de Cincias e Tecnologias Agropecurias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigncias para obteno do ttulo de Doutor em Produo Vegetal.
Orientador: Prof. Richard Ian Samuels
CAMPOS DOS GOYTACAZES RJ NOVEMBRO - 2009
ESTRATGIAS DE CONTROLE BIOLGICO DE LARAVAS DE
MOSQUITO Aedes aegypti COM FUNGOS
ENTOMOPATOGNICOS
CSAR RONALD PEREIRA GOMES
Tese apresentada ao Centro de
Cincias e Tecnologias
Agropecurias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, como parte das
exigncias para obteno do
ttulo de Doutor em Produo
Vegetal.
Aprovada em
Comisso Examinadora:
Prof. Francisco Jos Alves Lemos (Ph.D., Bioqumica) - UENF
Prof. Milton Erthal Junior (D.Sc., Produo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof. Claudio Luiz Melo de Souza (D.Sc., Produo Vegetal) - ISTCA-FAETEC
Prof. Richard Ian Samuels (Ph.D., Entomologia) - UENF
Orientador
Dedico esse trabalho de concluso de Doutoramento minha companheira
Elda Albertini pelos nossos trinta anos de luta juntos desde nossa juventude, nas
agruras do exlio, por sua incondicional solidariedade e companheirismo em todos
os projetos aos quais dediquei minha vida profissional.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Richard Ian Samuels por tudo que aprendi sobre Controle
Biolgico de Vetores, mas principalmente por haver-me ensinado com seu
exemplo pessoal que ser Mestre muito mais do que proporcionar informaes.
Ser Mestre, ensinou-me a convivncia com o Professor Richard, sentir-se
responsvel pelo aprendizado, pelo crescimento cientifico e pela responsabilidade
social de seus discpulos.
Ao Professor Franze por sua permanente atitude de estmulo e
colaborao.
Ao Adriano de Paula, Paulo Csar Pedra Junior e Gilliana Neves por sua
ajuda e companheirismo.
SUMARIO
Pgina
LISTA DE QUADROS ------------------------------------------------------------ Vii
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------- ix
RESUMO ---------------------------------------------------------------------------- Xi
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------- xiii
1 INTRODUO ---------------------------------------------------------------- 1
2 - REVISO BIBLIOGRFICA ----------------------------------------------- 4
2.1 - Dados Biolgicos de Aedes aegypti ------------------------------ 4
2.2 - Caractersticas do Vrus ---------------------------------------------- 12
2.3 - Controle Qumico e Biolgico de Vetores de Doenas ------- 18
2.3.1 - Controle de Aedes aegypti --------------------------------- 18
2.4 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sade Humana -------- 22
2.5 - Fungos Entomopatognicos----------------------------------------- 23
2.6 - Utilizao de Fungos Entomopatognicos para o Controle
de Vetores de Doenas Humanas ----------------------------------------
26
3 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------- 28
3.1 - Objetivo geral ------------------------------------------------------------ 28
3.2 - Objetivos especficos -------------------------------------------------- 28
4 MATERIAL E MTODOS --------------------------------------------------
29
4.1 - Criao das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller 29
4.2 Bioensaio 1: Teste de Virulncia larval -------------------------- 30
4.3 Preparo das Suspenses de Fungo para os Experimentos
de Laboratrio e de Semi-campo -----------------------------------------
31
4.4 Bioensaio 2: Persistncia da virulncia da Suspenso do 32
Fungo ESALQ 818 em gua. ---------------------------------------------
4.5 Bioensaio 3: Infeco das Larvas com Fungos em Arroz -- 32
4.6 Persistncia da virulncia do Fungo Crescidos e Aderidos
no Gro de Arroz. ------------------------------------------------------------
33
4.7 Virulncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gro de
Arroz em Condies de Semicampo para Larvas de Aedes
aegypti ---------------------------------------------------------------------------
33
4.8 Persistncia da virulncia do Fungo Crescido e Aderido
em Gros de Arroz -----------------------------------------------------------
34
4.9 Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no
Desenvolvimento de Aedes aegypti -------------------------------------
34
4.10 Virulncia em Condies de Laboratrio do Isolado
ESALQ 818 Contra Larvas Selvagens de Aedes aegypti
oriundas de Ovos Colhidos no Campo ----------------------------------
35
4.11 Virulncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e Aplicado em
Gro de Arroz em Condies de Semi-campo para Larvas
Selvagens de Aedes aegypti. ---------------------------------------------
36
4.12 Avaliao da mortalidade das larvas --------------------------- 36
4.13 Forma de Anlise dos Resultados ------------------------------ 36
5. RESULTADOS ------------------------------------------------------------------ 38
5.1 Seleo em Laboratrio de Fungos Virulentos para Larvas
de Aedes aegypti (Rockefeller ) -------------------------------------------
38
5.1.1 Persistncia em gua da Suspenso de Fungo
ESALQ 818 para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) ---
40
5.1.2 Virulncia do Fungo ESALQ 818 Crescido e
Aderido no Gro de Arroz para Larvas Rockefeller -----------
42
5.1.3 Persistncia em gua do Fungo ESALQ 818
Crescido e Aderido no Gro de Arroz ----------------------------
42
5.2 Testes de Semi-Campo com Larvas de Aedes aegypti
(Rockefeller) --
44
5.2.1 Virulncia do ESALQ 818 Crescido e Aderido em
duas Quantidades de Gro de Arroz para Larvas de Aedes
aegypti (Rockefeller) --------------------------------------------------
44
5.2.2 Persistncia em gua da Virulncia do Fungo
ESALQ 818 Crescidos e Aderidos em 20 Gros de Arroz
para Larvas de Aedes aegypti (Rockefeller) --------------------
45
5.3 - Virulencia do ESALQ 818 e LPP 133 Contra Populao
Natural de Larvas Aedes aegypti em Laboratrio - ------------------
46
5.3.1 Virulncia do ESALQ 818 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
5.3.2 Virulncia de LPP 133 para os Diversos Instares
Larvais de Aedes aegypti --------------------------------------------
46
5.4 Virulncia de Diferentes Quantidades de ESALQ 818
Crescido e Aderido em Gro de Arroz Contra uma Populao
Natural de Larvas de Aedes aegypti em condies de Semi-
campo ----------------------------------------------------------------------------
47
5.5 Influncia da Infeco do ESALQ 818 no desenvolvimento
de Aedes aegypti --------------------------------------------------------------
49
5.6 Influncia da Infeco do LPP 133 no desenvolvimento de
Aedes aegypti------------------------------------------------------------------
51
6 DISCUSSO ------------------------------------------------------------------- 53
7 CONCLUSES --------------------------------------------------------------- 59
8 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ------------------------------------- 60
LISTA DE QUADROS
Pgina
Tabela 1 Isolados de fungos entomopatognicos usados para
virulncia contra larvas de Aedes aegypti. ----------------------------------
30
Tabela 2 Mdia de mortalidade (%) desvio padro das larvas
expostas por 8 dias a dois isolados de Beauveria bassiana (Bb) e
oito isolados de Metarhizum anisopliae (Ma).-------------------------------
39
Tabela 3 Sobrevivncia (SOBR) desvio padro (DP) e tempo
mdio de sobrevivncia (S50) das larvas expostas ao Fungo ESALQ
818+Tween inoculado na gua por diferentes perodos (Tempo
zero, 3, 5, 10 dias). O tratamento controle foi feito somente com
Tween. --------------------------------------------------------------------------------
41
Tabela 4 Taxa de sobrevivncia desvio padro (DP) e tempo
mdio sobrevivncia (S50) das larvas expostas ao gro de arroz
com ESALQ 818 inoculado em gua por diferentes perodos
(Tempo zero, 3, 5, 10 dias). O tratamento controle foi feito da
mesma forma com arroz autoclavado e sem fungo. ----------------------
43
Tabela 5 Sobrevivncia desvio padro (DP) e tempo mdio de
sobrevivncia (S50) das larvas exposta aos gros de arroz com
fungo mantidos em gua por (Tempo zero, 5, 10 e 20 dias). ----------
46
Tabela 6 - Porcentagens de mortalidade das larvas expostas a 10 e
20 gros de arroz com fungo (% MORT. LARVAL) desvio padro
(DP) da mortalidade de larvas, porcentagem da formao de pupas
das larvas que no foram mortas pelo fungo.---------------------- 48
Tabela 7 - Porcentagem de mortalidade das larvas, pupas e
adultos; formao de pupas e adultos e desvio padro (DP) do
tratamento fungo ESALQ 818 e tratamento controle.-------------------
50
Tabela 8 - Porcentagem de mortalidade das larvas, pupas e
adultos; formao de pupas e adultos de insetos tratamentos com
fungo LPP 133 e os tratamentos controles.----------------------------------
52
LISTA DE FIGURAS
Pgina
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ------------------------------------ 6
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp. da dengue ---------------------------- 13
Figura 3 - Notificaes de dengue no Brasil de 1990 a 2008------------- 16
Figura 4 Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro
de 1986 a 2009 -----------------------------------------------------------------------
17
Figura 5 - Sobrevivncia das larvas tratadas com fungos
entomopatognicos e dos grupos controle com desvio padro.----------
40
Figura 6 Sobrevivncia com desvio padro das larvas expostas ao
Fungo ESALQ 818+Tween armazenado em gua por diferentes
perodos (Tempo zero, 3, 5 e 10 dias) para a avaliao da
patognicidade do fungo.-----------------------------------------------------------
41
Figura 7 Sobrevivncia com desvio padro das larvas colocadas na
gua com um gro de arroz do isolado ESALQ 818. O tratamento
controle foi feito com um gro de arroz sem condios e autoclavado. --
42
Figura 8 Curvas de sobrevivncia com desvio padro das larvas
expostas ao gro de arroz com o fungo ESALQ 818 por diferentes
perodos (Tempo zero, 3, 5, 10 dias). ----------------------------
43
Figura 9- Curvas de Sobrevivncia com desvio padro das larvas da
linhagem Rockfeller expostas a diferentes quantidades de gros de
arroz (10 20 gros) com fungos ESALQ 818. ------------------------------
44
Figura 10 Sobrevivncia com desvio padro das larvas expostas
ao fungo inoculado em gros de arroz que permaneceram em gua
por diferentes tempos (tempo zero, 5, 10, e 20 dias) ---------------------- 45
Figura 11 Sobrevivncia (%) dos diferentes instars larvais
infectados com o isolado ESALQ 818. Os tratamentos controle foram
feitos apenas com 0,05% Tween 80. -------------------------------------------
46
Figura 12 - Porcentagem de sobrevivncia dos diferentes instars
larvais infectados com o isolado LPP 133 A + 0,05% Tween 80. O
tratamento controle foi feito apenas com 0,05% Tween 80. --------------
47
Figura 13 - Sobrevivncia com desvio padro da populao de larvas
do municpio de Campos dos Goytacazes expostas a diferentes
quantidades de gros de arroz (10 20 gros de arroz). -----------------
48
Figura 14 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado ESALQ 818 e os tratamentos controle. -------------
-
50
Figura 15 Desenvolvimento das larvas em pupas nos tratamentos
feitos com o isolado LPP 133 e os tratamentos controle. -----------------
51
RESUMO
PEREIRA GOMES, CSAR RONALD; D.Sc. ; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, novembro de 2009, Seleo e Formas de Inoculao de Fungos Entomopatognicos para o Controle Biolgico de Aedes Aegypti (Diptera:Culicidae). Professor orientador: Richard Ian Samuels. Professores Conselheiros: Francisco Jos Alves Lemos, Milton Erthal Junior, Claudio Luiz Melo de Souza.
Dengue uma das mais srias doenas transmitidas por mosquitos o que
instiga pesquisas para novos mtodos de controle do vetor Aedes aegypti. A
patogenicidade e virulncia de vrios isolados do fungo entomopatognico
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram investigadas em laboratrio
contra larvas do 2 3 instares de Ae. aegypti. Suspenses de fungo foram
adicionadas em copos de plsticos contendo as larvas dos mosquitos e a
mortalidade foi monitorada diariamente. As larvas expostas aos diferentes
isolados dos fungos tiveram de 6 a 90% de mortalidade. Trs dos isolados foram
considerados virulentos (CG24; CG114; ESALQ818) sem diferena
estatisticamente significativa entre eles. As curvas de sobrevivncia mostraram
que o isolado CG 144 de M. anisopliae causou 50% mortalidade das larvas em 5
dias. Anlise de Probit foi usada para estimar a concentrao letal do CG144. Foi
determinado que o valor do CL50 foi de 3.16 x 105 conidios mL-1. Numa segunda
etapa foi avaliado a virulncia e a persistncia do fungo contra larvas da linhagem
Rockefeller e larvas selvagens oriundas de ovos coletadas na Cidade de Campos
dos Goytacazes, RJ. Este teste foi feito em condio de semi-campo. O presente
estudo mostrou que o fungo ESALQ818 (1x108 condios mL-1) manteve-se vivel
por 10 dias depois de inoculado em copos plsticos com 50 mL de gua.
Observaes do desenvolvimento das larvas formando pupas, mostrou que
aproximadamente 20% das pupas morreram, ou seja no resultaram em adultos.
Entretanto, dos adultos emergindo das pupas, a longevidade foi considerada
normal. O isolado LPP133 foi re-isolado de cadveres de larvas de Aedes aegypti
e um aumento na virulncia foi subsequentemente observado. O isolado
originalmente causou 8% de mortalidade de larvas enquanto aps o re-
isolamento, o fungo causou 60% mortalidade em 2 dias. Gros de arroz com
fungo aderido tambm foram usados para verificar a virulncia e a persistncia do
fungo na gua. Para isso foi testado virulncia dos condios depois de diferentes
tempos da sua permanncia na gua (Tempo zero, 5, 10 e 20 dias). Foi
adicionado 1 gro de arroz em 50 mL de gua para verificao da persistncia. O
tempo zero representou o controle positivo no sentido que as larvas so
expostas ao fungo imediatamente. Foi observada uma queda na mortalidade
conforme a passagem do tempo entre a inoculao do fungo na gua e a adio
das larvas. Os valores do tempo mdio de sobrevivncia das larvas (S50)
aumentaram gradativamente, sendo de sete dias quando o fungo foi deixado na
gua por 10 dias antes de colocar as larvas. Porm, a mortalidade ainda foi
considerada alta, com somente 25% de sobrevivncia das larvas. Os prximos
experimentos foram feitos para testar o uso do fungo aplicado nos gros de arroz
numa simulao de campo. Foi testado o efeito da inoculao de 10 e 20 gros
de arroz em 1 litro de gua. O uso de 20 gros de arroz foi mais eficiente do que
10 gros, com 5% das larvas sobreviventes aos 7 dias do experimento. O valor de
S50 foi o menor de todos os experimentos, sendo de um dia. Este resultado
mostrou que o fungo pode ser promissor no controle biolgico de larvas de Ae.
aegypti quando inoculados em recipientes usados para a oviposio de fmeas
do mosquito. Este mtodo reduziria a populao deste inseto e portanto a
incidncia da Dengue.
ABSTRACT
PEREIRA GOMES, CSAR RONALD; D.Sc. ; Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, november 2009, Selection and forms of inoculation of fungal isolates for the biological control of Aedes aegypti (Diptera:Culicidae). Supervisor: Richard Ian Samuels. Committee Members: Francisco Jos Alves Lemos, Milton Erthal Junior, Claudio Luiz Melo de Souza.
Dengue is one of the most serious diseases transmitted by mosquito
vectors and has lead to the search for new control methods for the vector Aedes
aegypti. The pathogenicity and virulence of a range of entomopathogenic fungal
isolates of the species Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana were
tested under laboratory conditions against 2nd 3rd instar Ae. aegypti larvae.
Fungal suspensions were added to plastic cups containing larvae and the mortality
was monitored on a daily basis. The larvae exposed to different isolates showed a
range of virulence, with 6 to 90% mortality. Three of the isolates were considered
virulent (CG24; CG114; ESALQ818) with no statistical difference between them.
Survival curve analysis showed that isolate CG144 M. anisopliae caused 50%
larval mortality within 5 days. Probit analysis showed that the LC50 for CG144 was
3.16 x 105 conidia mL-1. In the next phase of the experiments, the virulence and
persistence of the fungi were investigated using the Rockefeller strain and wild-
type larvae, obtained from eggs collected in the city of Campos dos Goytacazes,
RJ. Results showed that ESALQ818 (1x108 condios mL-1) was viable for 10 days
following inoculation in water. Observations of insect development of the larvae
surviving to form pupae, showed approximately 20% mortality of these pupae,
previously exposed to the fungus. However, adult emergence/longevity from
surviving pupae was considered normal. Isolate LPP133 was re-isolated from
Aedes larval cadavers and a significant increase in virulence was observed,
originally this isolate caused 8% mortality, but following re-isolation, caused 60%
mortality in 2 days. Rice grains on which the fungus had been cultivated were
used in a simplified application technique, adding the rice grains to water
containing larvae. The persistence of the fungi thus applied was tested during a 20
day time period (time zero, 5, 10 and 20 days). For tests in plastic cups with 50 mL
water, 1 rice grain was added to each cup. Survival curves showed that there was
a gradual decline in virulence over time. The S50 values increased from 2 days for
time zero (positive control) to 7 days following a 10 day incubation of the fungus in
the water before adding larvae. However, the mortality was still considered high,
with only 25% of the larvae surviving. Experiments were then carried out under
field conditions. The larvae were exposed to fungi in plastic buckets with 1 L of
water. In this case 10 and 20 rice grains were tested. It was seen that 20 rice
grains with fungi were more efficient than 10 rice grains. However, the fungal
persistence experiments showed a rapid decline in virulence over time. Even so,
the results show that following future studies of fungal formulation, it should be
possible to improve field persistence. Entomopathogenic fungi are an alternative to
currently used techniques for larval control and the reduction of mosquito
populations will result in reduced incidence of Dengue fever.
1 - INTRODUO
O crescimento da populao de Aedes aegypti, principal mosquito vetor da
Dengue, deve-se ao aumento do uso de recipientes no bio-degradveis oriundos
da estratgia da Obsolescncia Planejada, aos sistemas de coleta de lixo
deficientes, ao aumento da densidade populacional em reas urbanas, m
qualidade das habitaes, decadncia dos sistemas de sade e, principalmente,
s condies precrias de saneamento, s quais a maioria da populao
brasileira est submetida (Alva, 1997).
A persistncia da hiperinfestao de Ae. aegypti deve-se tambm, entre
outros fatores, ao acmulo de gua das chuvas no interior dos objetos de uso
humano lanados nos peridomiclios1 e nos refugos que no so devidamente
acondicionados para recolhimento pelo servio de coleta de lixo urbano, tornando-
se os principais focos de proliferao de mosquitos (FUNASA, 2002).
Normalmente, os criadouros iniciais desses dpteros so os terrenos
baldios, ferros-velhos, recauchutadoras, borracharias e cemitrios. A permanncia
dessas condies predispe o ambiente surtos e/ou epidemias, combatidos
pelos servios de vigilncia sanitria com a aplicao de larvicidas e inseticidas
organofosforados. Mesmo em baixas doses, essas substncias entram no
ecossistema e tm ao cumulativa sobre a flora e a fauna regional, e em longo
prazo, sobre a sade humana. Cabe ressaltar a ocorrncia de populaes de
Aedes sp. resistentes aos organofosforados usados habitualmente como
larvicidas e inseticidas (Montella et al, .2007).
O Dengue vrus (DENV) a mais importante arbovirose que afeta o
homem e constitui-se em um dos maiores problemas de sade pblica,
especialmente nos pases tropicais. A pandemia de dengue que teve em meados
do sculo XX, vem intensificando-se nas ltimas dcadas, com a expanso da 1-Peridomicilio compreende a rea exterior casa, porm no interior do terreno, como o quintal e os jardins.
distribuio geogrfica dos seus mosquitos vetores e dos quatro sorotipos do
vrus. A Organizao Mundial da Sade estima que cerca de 100 milhes de
pessoas se infectem anualmente em 100 pases, de todos os continentes, com
exceo da Europa. Dessas pessoas, cerca de 550 mil necessitam de
hospitalizao e pelo menos 20 mil morrem da doena (Silva Jnior e Pimenta
Jnior, 2008).
At o final da dcada de 1970, devido ao Programa Continental de
Erradicao de Ae. aegypti que praticamente eliminou o vetor do continente
naquela ocasio, a dengue, nas Amricas, deixou de ser um problema importante
de sade pblica. O programa foi na realidade, executado com o objetivo de
eliminar a febre amarela, e com exceo de poucos pases, como a Venezuela, o
sul dos EUA, as Guianas e algumas reas do Caribe, o vetor desapareceu do
continente americano. Infelizmente, o programa foi suspenso e a partir de ento o
mosquito foi sendo gradativamente reintroduzido a partir das reas onde no
havia sido erradicado (Schatzmayr, 2008).
Desde o comeo do sculo XX os agentes qumicos tm sido usados para
combater e controlar a populao de Ae. aegypti. Aps a descoberta do
Diclorodifeniltricloroetano (DDT), este se tornou o principal mtodo utilizado em
programas tendentes erradicao do mosquito. O uso intensivo e prolongado do
DDT provocou resistncia na populao de Ae. aegypti e, com isso, foi necessria
a sua substituio pelos inseticidas organofosforados. No entanto, o uso intensivo
e prolongado de organofosforados provocou resistncia na populao desse
mosquito (Giannini, 2001). Apesar dos efeitos negativos do uso dos qumicos
contra o mosquito, esses salvaram muitas vidas e durante um perodo foram
bastante eficientes no combate do vetor. O mosquito vetor da dengue foi
erradicado no Brasil com o uso de DDT na dcada de 50 e somente aps o
ressurgimento desse vetor no pas, devido a fatores externos como o no controle
nos pases vizinhos, o DDT passou a no apresentar eficincia contra esse inseto
(Consoli e Oliveira, 1998).
As bactrias so os agentes de controle biolgico dos mosquitos mais
utilizados em todo o mundo. As duas espcies mais estudadas e utilizadas so
Bacillus thuringiensis e Bacillus sphaericus, que possuem elevadas propriedades
larvicidas e produzem endotoxinas proticas as quais, quando ingeridas pelas
larvas, atacam e destroem o epitlio do intestino mdio, levando-as morte (Neto
& Oliveira, 1985). Atualmente no Brasil, B. thuringiensis variedade israelensis
(Bti), est sendo amplamente utilizada para o controle da fase larval de Ae.
aegypti, enquanto peritrides esto sendo aplicados para o controle da fase
adulta. Ainda, no existe um programa de uso de controle biolgico para
mosquitos adultos de quaisquer espcies (Vilarinho et al, 1998).
A possibilidade de utilizar fungos entomopatognicos para o controle de
larvas de uma gama de espcies de mosquitos vetores tem sido a meta de muitas
pesquisas, sem chegar ao nvel de programa de controle biolgico (Scholte et al.,
2004b).
O uso de fungos entomopatognicos para o controle de adultos das
espcies de mosquitos vetores da Malaria, recentemente tem gerado muito
interesse, no somente pela possibilidade de reduzir as populaes de vetores,
mas tambm pelo fato, que os mosquitos infectados com os fungos no
transmitem a doena na mesma taxa que os mosquitos no infectados (Thomas e
Read, 2007).
Pesquisas de nosso grupo recentemente mostraram que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram patognicos e virulentos
contra larvas de Ae. aegypti (Pereira et al., 2009), e contra adultos dessa memsa
espcie (Paula et al., 2008).
O presente trabalho investigou a seleo de fungos entomopatognicos
para o controle de larvas de Ae. aegypti, visando sua futura aplicao em campo.
2 REVISO BIBLIOGRFICA
2.1 Dados Biolgicos de Aedes aegypti
O vetor da dengue um inseto domstico, inteiramente relacionado
populao humana, sendo tambm o principal vetor da febre amarela urbana.
Est presente na frica, nas Amricas e na sia, sendo provavelmente originrio
do continente africano (FUNASA, 1998), na regio da Etipia, onde se encontram
trs formas dessa espcie: o Ae. aegypti na forma tpica, o Aedes
queenslandensis e o Aedes formosus, um mosquito silvestre e mais escuro.
Somente as duas primeiras formas so encontradas no continente americano,
que provavelmente foram transportadas em tambores de gua dos barcos durante
as primeiras exploraes e colonizaes europias (Silva Junior e Pimenta Junior,
2008).
Ae. aegypti se adaptou intimamente ao homem em regies ridas,
utilizando seus reservatrios de gua junto s moradias para postura e,
conseqentemente, passando a utilizar o homem como sua fonte de repasto
sangineo, de preferncia a outros mamferos (Schatzmayr, 2008).
A longa associao de Ae. Aegypti com a espcie humana parece t-lo
dotado de certa habilidade para escapar de ser morto por sua vtima durante o
repasto sanguneo. Se o hospedeiro produz algum movimento, mesmo que
suave, a fmea de Ae. Aegypti prontamente o abandona procurando outra vtima
ou voltando a atac-lo depois de cessado o perigo de ser atingido. Esta
peculiaridade tem grande importncia epidemiolgica, pois uma s fmea de Ae.
aegypti infectada pode fazer vrias alimentaes curtas em diferentes
hospedeiros e disseminar rapidamente o vrus da dengue ou da febre amarela
(Consoli e Oliveira, 1998).
Devido s suas caractersticas biolgicas, Ae. aegypti tem criadouros
transitrios, que so condicionados diretamente pelas chuvas, como os seus
preferenciais. Decorrente disso, sua populao de alados sofre flutuao grande e
abrupta de densidade no ciclo anual, isto , seu ciclo anual influenciado pela
quantidade de chuvas e pela temperatura ambiental. Seus criadouros,
representados pelas poas d'gua e pelos recipientes naturais e artificiais, so
preenchidos quase somente na poca chuvosa. Com o aumento da precipitao
pluviomtrica simultnea s ascenses trmicas que precedem a chegada do
vero e que se mantm durante esta estao, estes criadouros passam a ser
ciclicamente reabastecidos de gua, desencadeando o processo de ecloso dos
ovos depositados ali meses antes. Assim, as chuvas influenciam positivamente na
densidade populacional desses insetos (Consoli e Oliveira, 1998).
O ciclo biolgico de Ae. aegypti compreende as seguintes fases: ovo, larva,
pupa e adulto (Figura 1). O ovo tem forma elptica com cor varivel, de marrom a
negra, e possui forma alongada e fusiforme. Seu desenvolvimento embrionrio
dura de 2 a 3 dias. A larva tem antenas cilndricas e curtas, cerdas antenais
curtas e simples. As cerdas ceflicas 5, 6, e 7 so simples. O trax tem espinhos
fortes e laterais no meso e metatorax. No oitavo segmento abdominal existem
espinhos, dispostos em uma fileira nica. O estgio larval tem o perodo entre 5 a
7 dias. A pupa possui cefalotorax com trompetas respiratrias curtas e escuras.
Abdome tem a cerda n 1 do primeiro segmento com tufo de plos simples ou
bfida e cerda n 9 do oitavo segmento em forma de penacho com poucos plos.
A palheta natatria tem plos curtos em sua borda. A fase de pupa tem o ciclo de
2 a 3 dias (Consoli e Oliveira, 1998).
Figura 1 Ciclo biolgico do Aedes aegypti (Fonte: FUNASA, 1998)
Ae. aegypti um pernilongo de colorao escura com faixas brancas no
trax, formando uma lira na parte superior (Figura 1). As pernas possuem anis
brancos e o macho se distingue da fmea pelas antenas, que so mais plumosas.
A fmea pica, preferencialmente, durante o dia e pe seus ovos, tanto em
criadouros naturais, como artificiais, de preferncia naqueles que contenham
gua limpa, pobre em sais e matria orgnica (FUNASA, 1998).
Os machos de Ae. aegypti so atrados pela freqncia vibratria do
batimento das asas da fmea da mesma espcie. Na superfcie interna da bomba
cibarial, em machos e fmeas de Ae. aegypti, encontram-se numerosas clulas
de funo supostamente quimioreceptora que as fmeas utilizam para avaliar as
caractersticas dos possveis locais para oviposio. (Clements, 1963).
Em laboratrio uma fmea pode viver at 2 meses. Em condies normais
uma fmea pode fazer 12 ou mais repastos sangneos em um ms o que de
grande importncia na transmisso da dengue e da febre amarela. Somente as
fmeas dos mosquitos so hematfagas. Os estiletes bucais so introduzidos na
pele do hospedeiro e a saliva inoculada pode conter anticoagulantes, aglutininas e
substncias eventualmente alergnicas, mas no h evidncias que contenham
enzimas digestivas. O volume de sangue ingerido varia conforme a espcie, em
Ae aegypti tem sido assinalado de 1,5 a 4,2 mm3 (Clements, 1963).
A digesto sangunea ocorre em 2 dias. Pouco aps a ingesto, forma-se
uma camada de material quitinoso, secretado pelas clulas do intestino, a
membrana peritrfica, que separa a superfcie interna do intestino e o sangue
ingerido. Se um segundo repasto sanguneo ocorre antes que o primeiro tenha
sido totalmente digerido, forma-se uma segunda membrana peritrfica
circundando a primeira e o novo sangue ingerido. A membrana peritrfica
permevel s enzimas proteolticas e aos produtos da digesto que so
absorvidos. Diferenas na formao da membrana peritrfica esto relacionadas
com diferenas na suscetibilidade de Ae. aegypti e Anopheles a microorganismos
patognicos para o homem (Consoli e Oliveira, 1998).
Um ou dois dias aps emergirem, os adultos se acasalam, sendo que as
fmeas fazem o repasto sangneo. Em relao ao acasalamento Ae. aegypti se
acasala em pequenos espaos durante o vo ou pousados sobre uma superfcie.
Embora as cpulas intraespecficas sejam a regra, cruzamentos interespecficos
podem ocorrer entre Ae. aegypti e Ae. albopictus. O acasalamento pode se dar
antes ou aps a ingesto do primeiro repasto sanguneo, mas freqentemente
anterior a este (Consoli e Oliveira, 1998).
A escolha do local para oviposio por parte das fmeas o principal fator
responsvel pela distribuio dos mosquitos nos criadouros e da maior
relevncia para a distribuio das espcies na natureza. Fatores fsicos, qumicos
e biolgicos, como a intensidade luminosa, comprimento da onda de luz refletida,
temperatura, grau de salinidade, presena de vegetais, microorganismos e
substncias diversas podem influenciar nessa seleo (Consoli e Oliveira, 1998).
A oviposio ocorre, em geral, em recipientes escuros ou sombreados,
com superfcies speras, preferindo gua limpa e cristalina, ao invs de gua
trbida ou muito poluda com matria orgnica. Em geral, a fmea distribui cada
postura em recipientes diferentes (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).
O mosquito Ae. aegypti holometablico, ou seja, desenvolve-se atravs
de metamorfose completa. Seu ciclo vital sofre metamorfoses de acordo com
cada estdio e o tempo de desenvolvimento depende das condies da gua,
temperatura e da alimentao do mosquito em seus estgios iniciais (Consoli e
Oliveira, 1998).
Fase 1 - a do ovo, que para se desenvolver dependente da atividade
hematfaga da fmea em homens ou outros animais. Os ovos tm aspecto
alongado, simetria bilateral e so envolvidos por uma capa composta de 3
camadas: a fina membrana vitelina interna, que envolve o ncleo, o citoplasma e
o vitelo, o endocrio endurecido e grosso; e o exocrio fino e transparente que
constitui o envoltrio externo. O embrio depende da estrutura e propriedades da
casca para sua proteo mecnica, passagem de gases respiratrios e
resistncia perda de gua (Consoli e Oliveira, 1998).
Os ovos se desenvolvem em cerca de trs dias aps a cpula e so postos
isoladamente pela fmea, no havendo formao de nichos. Cada fmea pode
pr de 70 a 150 ovos. Alm disso, so bastante resistentes a perodos de seca e
baixas temperaturas, podendo resistir nessas condies at um ano depois de
postos pela fmea (Secretaria Estadual de Sade, 1998).
As fmeas fixam os ovos, individualmente, nas paredes internas dos
recipientes, na rea mida logo acima da superfcie da gua. Em geral, seu
desenvolvimento embrionrio demora 48 horas, quando o ambiente mido e
quente ou podem suportar longos perodos de dessecao dependendo das
condies ambientais. Em contato novamente com a gua a maioria dos ovos
eclode rapidamente embora alguns necessitem ser molhados vrias vezes para
eclodirem (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).
Em geral, os ovos postos 1 a 2 mm prximos superfcie da gua eclodem
assim que completam o seu desenvolvimento embrionrio. Quando deixados fora
da gua os ovos podem apresentar uma diapausa facultativa e sobreviver por
perodos mais longos. Aps um perodo de maturao inicial em ambiente mido
(30 a 48 horas) que corresponde ao desenvolvimento embrionrio, a resistncia
dos ovos em diapausa em ambiente seco pode ser muito prolongada em Ae.
aegypti (Secretaria Estadual de Sade, 1998).
Pesquisadores da Fundao Oswaldo Cruz descobriram que, 15 horas
depois de postos, os ovos do Ae. aegypti formam uma pelcula protetora com uma
camada transparente e impermevel, que os fazem resistentes a cloro e a
inseticidas. Assim que depositados, os ovos passam a absorver gua, aumentam
de volume, desenvolvem uma casca escura e rgida e tornam-se impermeveis,
adquirindo grande resistncia em ambientes pouco favorveis, onde no existe
gua. Dessa forma, por exemplo, podem sobreviver durante a poca seca do ano
e se desenvolver em larvas somente no incio do vero seguinte, com a chegada
de condies ambientais mais favorveis. Os ovos se tornam rgidos e escuros
em cerca de trs horas aps a postura. (Rezende et al., 2008). A ecloso larvria
auxiliada pelo atrito de um dente quitinoso situado dorsalmente na cabea da
larva de 1 estgio contra a casca do ovo e ainda ao seu engurgitamento e aos
movimentos pulsteis no interior do ovo (Secretaria Estadual de Sade, 1998).
A fase 2 - a ecloso de larvas de 1 nstar ocorre a partir de dois a trs dias
at vrios meses aps a postura dos ovos, que eclodem quando em contato com
a gua. As larvas possuem sifo respiratrio, os espirculos se abrem na
extremidade desse rgo e posiciona-se em ngulo com a superfcie lquida. As
larvas so providas de grande mobilidade e tm como funo primria o
crescimento. As larvas se alimentam indistintamente do microplncton existente
nos seus habitats constitudo por algas, rotferos, bactrias, esporos de fungos ou
quaisquer partculas de matria orgnica. O movimento das escovas orais faz
com que a gua flua em direo cabea, trazendo as partculas de alimento
para a parte inicial do aparelho digestivo onde ser filtrada em uma proporo de
at 2 litros por dia. No selecionam alimentos, o que facilita a ao dos larvicidas,
bem como no toleram elevadas concentraes de matria orgnica na gua
(Consoli e Oliveira, 1998).
A durao da fase larval, em condies favorveis de temperatura (25 a
29 C) e de boa oferta de alimentos, de 5 a 10 dias, podendo se prolongar por
algumas semanas em ambiente adequado (Consoli e Oliveira, 1998).
As larvas passam por quatro estdios de desenvolvimento, sendo o ltimo
destes o mais prolongado. Os machos tm em mdia um desenvolvimento
larvrio mais rpido do que as fmeas (Consoli e Oliveira 1998). A durao
desses estgios depende da temperatura, da disponibilidade de alimentos e da
densidade larvria no recipiente. Em condies timas, o perodo entre a ecloso
do ovo e a pupao pode no exceder cinco dias, ou, em condies mais
adversas, com baixas temperaturas ou alimentao insuficiente, pode se estender
por vrias semanas (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).
As larvas nadam at a superfcie para respirar e descansar, utilizando,
alm das nadadeiras, o sifo respiratrio situado na extremidade do abdmen
para auxiliar o movimento em S caracterstico dessa etapa. A larva assume uma
posio vertical em relao ao nvel aqutico e apresenta fotofobia, reagindo
imediatamente presena da luz (Secretaria Estadual de Sade, 1998).
Embora aquticas, as larvas respiram sempre o oxignio do ar,
necessitando para isso chegar superfcie da gua aspirando o ar atravs do seu
sifo respiratrio. O tempo que as larvas suportam longe da superfcie da gua
varia com a espcie, idade e estado fisiolgico (Clements, 1963).
A presena de substncias oleosas na gua prejudicial s larvas por
dificultar ou impedir mecanicamente a sua respirao e por essa caracterstica
vrios tipos de leos minerais e vegetais combinados ou no com detergentes
foram utilizados para controle das larvas de mosquito na primeira metade do
sculo passado (Rosen, 1994).
A temperatura tima para o desenvolvimento larvrio situa-se entre 24 e
28C e Ae. aegypti pode desenvolver-se em lugares onde haja pouca ou nenhuma
luz como as galerias de gua ou de esgoto, preferindo entretanto colees de
gua com concentraes salinas muito baixas (Consoli e Oliveira 1998).
Aps, aproximadamente, 7 a 10 dias as larvas se desenvolvem em pupas.
So bastante mveis quando perturbadas, mas esto quase sempre paradas em
contato com a superfcie da gua. A pupa possui trombeta alongada, geralmente
de forma cilndrica e de abertura estreita, possui sifes na extremidade da cabea
e palhetas natatrias na extremidade abdominal. No se alimenta e movimenta-se
apenas por contraes. Inicialmente tem a mesma cor da larva que lhe deu
origem, mas escurece a medida que se aproxima o momento da emergncia do
adulto. Esta fase dura de dois a trs dias (FUNASA, 2000).
O adulto, alm das caractersticas morfolgicas citadas anteriormente
apresenta uma tromba longa chamada probscida, que a fmea usa para sugar o
sangue necessrio maturao de seus ovos, e os machos a utilizam para se
alimentar do nctar das plantas. Essa fase tem durao de 30 a 35 dias. Ae.
aegypti adulto pousa paralelamente ao plano (mesa, parede, etc). Assim,
contabilizando a durao das diversas formas, a vida mdia de uma gerao de
Ae. aegypti duraria em torno de 5 a 7 semanas, desde a postura do ovo at o fim
da fase adulta (FUNASA, 2000).
Outro mosquito existente no Estado do Rio de Janeiro e que tem
participao crescente na transmisso da dengue Aedes albopictus, que
tambm se faz presente em outros Estados, como Minas Gerais e Esprito Santo.
Seu ciclo biolgico semelhante ao de Ae. aegypti, e exerce um papel de
fundamental importncia no mecanismo de transmisso da dengue (FUNASA,
2000) pois at hoje um importante vetor desses ciclos naturais com a
participao de primatas e, ocasionalmente, do homem. Todos os quatro
sorotipos de dengue foram demonstrados nesses ciclos silvestres na sia
enquanto que apenas o sorotipo 2 foi encontrado na frica, o que refora o
conceito da origem asitica do vrus (Schatzmayr, 2008).
O Aedes albopictus uma espcie silvestre, que se adaptou aos
ambientes rurais, suburbanos e urbanos. muito menos relacionado ao homem
que o Ae. aegypti, pois se alimenta e faz oviposio no ambiente peridomiciliar,
sendo a sua disperso pelo vo maior que a de Ae. aegypti, em mdia 500
metros, adaptando-se melhor s regies frias, como o norte da sia, onde seus
ovos passam o inverno em diapausa (Silva Junior e Pimenta Junior, 2008).
Percentuais prximos de 1% de infestao domiciliar so considerados
suficientes para o surgimento de epidemias ou surtos de dengue. Percentuais
prximos de 4% so considerados condio predisponente para epidemias, ou
surtos de febre amarela, caso haja importao para essa rea de casos alctones
originrios de reas de febre amarela silvestre (SES-RJ,1999).
Assim, permanece fortalecida a convico de que a eliminao do vetor ,
at o presente momento, a maneira mais eficaz para controlar e erradicar a
dengue de uma regio ou de um pas.
2.2 - Caractersticas do vrus
O vrus causador da dengue do tipo RNA, da famlia Flaviviridae e do
gnero Flavivirus (Figura 2). Existem quatro sorotipos da dengue: DENV 1, 2, 3 e
4. Segundo Figueiredo e Fonseca (1996), o gnero Flavivirus compreende 60
vrus diferentes, entre os quais se destacam por sua importncia epidemiolgica o
vrus da dengue, da febre amarela, o vrus rocio e o vrus da encefalite de Saint
Louis (FUNASA, 2000).
O perodo de transmissibilidade viral ocorre em dois ciclos:
Intrnseco - o que se passa no homem. Comea um dia antes do
aparecimento dos sintomas e vai at o 6 dia da doena. Durante esse perodo, o
vrus est presente no sangue e os mosquitos que o sugarem podem se infectar.
Extrnseco - o que se d no mosquito. Os vrus ingeridos juntamente com
o sangue multiplicam-se nas glndulas salivares de 8 a 12 dias aps um repasto
de sangue infectado, os mosquitos se tornam infectantes, isto , capazes de
transmitir a doena e assim continuaro por toda a sua vida (FUNASA, 2000).
O vrus da dengue no se transmite de pessoa a pessoa, nem por qualquer
outro mecanismo que no seja atravs da picada dos mosquitos do gnero
Aedes, principalmente, de Ae. aegypti. Portanto, s possvel interromper o ciclo
da doena com o controle ou erradicao do mosquito transmissor (FUNASA,
2000).
Quando acontece a primo infeco por qualquer sorotipo, habitualmente o
paciente apresenta uma forma benigna da doena chamada de dengue clssica.
Quando ocorre a convivncia simultnea, ou seqencial, de dois ou mais
sorotipos de vrus e o paciente reinfectado por um sorotipo diferente do que o
infectou a primeira vez, particularmente pelo sorotipo 2, podem ocorrer formas
mais graves da doena, como a dengue hemorrgica, que tem maior potencial
de letalidade (FUNASA, 1998).
Figura 2 - Estrutura de Flavivirus sp. da dengue
Fonte: Silva Jnior, J.B. & Pimenta J.F.G. (2008)
Basicamente, o vrus da dengue necessita do mosquito para sobreviver e
assim poder infectar os indivduos. O mosquito fmea, ao picar um indivduo
infectado, se contamina ao sugar seu sangue onde h vrus circulando. A partir
da, o vrus migra para as glndulas salivares da fmea e para seus ovos, caso j
tenham sido fecundados. A transmisso pode ocorrer a partir de dois
mecanismos: 1) a fmea contaminada pica um indivduo sadio para obter mais
sangue e sustentar seus ovos, contaminando ento a pessoa picada com o vrus
que est alojado nas glndulas salivares; ou 2) a fmea ao picar um indivduo
contaminado, transmite o vrus para os seus ovos fecundados (mecanismo
transovariano), contaminando a gerao seguinte cujas larvas eclodiro j
possuindo em seu interior, o vrus da dengue. Esse mecanismo de transmisso
tambm denominado de transmisso vertical (SES-RJ, 1999).
A Dengue transmitida por picada de mosquitos infectados. Assim, o
conhecimento acerca da interao entre o mosquito e o vrus pode revelar
elementos crticos para o controle desta doena. O perodo de incubao da
doena no homem, ou seja, o perodo entre a picada infectante e o aparecimento
de sintomas, pode variar de 3 a 15 dias, sendo, em mdia, de 5 a 6 dias e o
perodo de transmissibilidade ocorre enquanto houver vrus no sangue (perodo
de viremia). Este perodo comea um dia antes do aparecimento dos sintomas e
vai at o 6 dia da doena (FUNASA, 2002).
Para infectar uma clula necessria a interao de protenas virais com
molculas presentes na superfcie celular que funcionam como receptores. No
caso do gnero Flavivirus, o papel de adeso e fuso desempenhado pela
protena E (Figura 2). No entanto, o receptor celular utilizado ainda no conhecido
(Martinez, 1999).
Diferentes linhagens de Ae. aegypti apresentam diferentes nveis de
susceptibilidade e refratariedade infeco. Um candidato a mediar esta
susceptibilidade/refratariedade, seria o sistema imune do vetor (Silva, 2008).
Os Flavivirus podem ter a capacidade de escapar dos sistemas celulares de defesa anti-virais do
mosquito, possibilitando a infeco persistente e a transmisso do vrus. RNAi um mecanismo de defesa do
genoma contra genes aberrantes que podem ser gerados por transposons, transgenese ou ainda durante a
replicao viral. Este mecanismo tem sido descrito nos ltimos anos em um grande nmero de modelos,
incluindo insetos. possvel que exista uma associao entre virulncia de diferentes cepas de dengue e sua
capacidade de suprimir a resposta celular mediada por RNAi em Ae. aegypti. Existe a hiptese de trabalho de
que populaes de insetos refratrios ao vrus provavelmente apresentam uma forte resposta celular
presena dos mesmos. Em contrapartida, o vrus pode ter desenvolvido mecanismos para escapar desta
resposta celular. Assim, o ciclo do vrus no inseto e, consequentemente, o
comportamento cclico da endemia, pode estar relacionado s alteraes dos
mecanismos de escape do vrus s respostas celulares do inseto ou s alteraes
primrias dessas respostas celulares do inseto ou, at mesmo, a concomitncia
de ambos os mecanismos (Petretski et al., 2009).
A epidemia de dengue sorotipo 1 na Amrica do Sul comeou em 1978,
afetando inicialmente Venezuela, Colmbia e as Guianas. Cerca de 702 mil casos
foram reportados Organizao Pan Americana de Sade (OPAS), no perodo de
1977-1980, mas calcula-se, com base em dados da Colmbia e da Venezuela,
que mais de 5 milhes de pessoas se infectaram nesses anos. Essa mesma
amostra de dengue 1 espalhou-se posteriormente, para outros pases da Amrica
do Sul, chegando ao Brasil por Roraima em 1981/1982 e no Rio de Janeiro em
1986. Casos de dengue hemorrgica surgiram, quando da entrada posterior da
dengue sorotipo 2 em pases como Bolvia, Paraguai, Equador, Peru e Argentina
e, em 1990, no Brasil (Schatzmayr, 2008).
No Brasil, o primeiro registro da doena foi no Rio de Janeiro, em 1846,
citada por e denominava-se polka pela maneira desajeitada de caminhar
provocada pelas mialgias e artralgias tpicas da dengue (Figueredo & Fonseca,
1996). A campanha de erradicao do Ae. aegypti, motivada pela epidemia de
febre amarela, comeou em 1903 com Emlio Ribas e Osvaldo Cruz e, em 1953, o
mosquito foi considerado erradicado do pas, sendo reintroduzido em 1967 e
eliminado em 1973. Reapareceu em 1976, na Bahia, em 1977, no Rio de Janeiro,
e, em Roraima, em 1981-1982. O mosquito disseminou-se nacionalmente a partir
de 1986-1987, 1990-1991, comportando-se em progresso ascendente desde
1994. Em 1995 o Brasil apresentava 1753 municpios infestados enquanto que no
ano de 2008 j totalizavam 4006 municpios com presena de A. aegypti
confirmada (Aguiar, 2009).
A incidncia da doena apresentou comportamento ascendente,
hiperendmico, em concordncia com a expanso do vetor, com variaes
cclicas, entretanto, dependentes de outros fatores como sorotipos circulantes,
disponibilidade de populaes suscetveis, pluviosidade sazonal e outros fatores.
A incidncia de casos da dengue notificados no Brasil saiu de patamares
das duas epidemias anteriores, de 1987, com 89.394 casos notificados e de 1991,
com 97.209 casos notificados, para 56.621 casos notificados em 1994. De 1995 a
1998 o nmero de casos notificados saiu de 128.619 para 528.000 at que em
2002 794.219 casos foram notificados, o que representou na poca um estado
hiperendmico2 de dengue em nvel nacional, sem precedentes na histria do
Brasil (FUNASA, 2008).
No Brasil, desde 1986 vm ocorrendo epidemias de dengue nos principais
centros urbanos do pas foram notificados cerca de 3 milhes de casos
(SESDEC-RJ/SVS/SVEA/CVE/DTI/SDTVZ 2008).
Esse aumento descrito anteriormente se deu basicamente por um aumento
acentuado da incidncia de casos notificados nas regies Nordeste e Sudeste do
Brasil conforme a figura 3. Do total de 528.000 casos em 1998, o Nordeste
contribuiu com 259.574 casos e o Sudeste com 250.065 casos notificados.
Figura 3 - Notificaes de dengue no Brasil de 1990 a 2008 (Fonte: PNCD,
2009)
A maioria dos casos de dengue notificados refere-se queles que procuram
algum servio mdico, implicando, em mdia, em 3 dias de afastamento do
trabalho. Embora nem todos os casos notificados digam respeito a pessoas da
faixa etria produtiva, a maioria deles notificada exatamente por circunstncias
laborais (Figueiredo e Fonseca, 2006).
2- Hiperendmico a presena habitual da doena, porm com incidncia muito elevada.
O Estado do Rio de Janeiro nos anos de 1986 e 1987 apresentou
respectivamente uma epidemia de dengue sorotipo 1, com 50.000 e 96.000 casos
notificados (Figura 4). No inqurito sorolgico realizado no ano seguinte pelo
Ministrio da Sade, constatou-se a presena de um milho de pessoas
sensibilizadas para o sorotipo responsvel pela epidemia. Essa observao
permite deduzir que para cada caso de dengue notificado, provavelmente ocorram
outros nove casos assintomticos ou oligossintomticos, porm no notificados e,
conseqentemente, no contabilizados (Secretaria Estadual de Sade, 1998).
Figura 4 Casos de dengue notificados no Estado do Rio de Janeiro de
1986 a 2009 (SESDEC, 2009).
Esses ndices elevados de infestao esto ocorrendo em uma
comunidade que atualmente registra um altssimo percentual de pessoas com a
presena de anticorpos IgG e presena de clulas de memrias especficas para
vrus da dengue, concausa imprescindvel para eventos de dengue hemorrgica.
Segundo Martinez (1999), Guimares (1999) e Figueredo & Fonseca (1996), a
primoinfeco geralmente provoca a presena de clulas de memria por um
perodo mnimo de cinco anos, podendo significar que a populao
imunologicamente predisposta a contrair dengue hemorrgica a soma da
populao primoinfectada nos ltimos cinco anos. De acordo com pesquisas
realizadas em Cuba e publicadas em 1999, acredita-se que a primoinfeco deixa
a memria imunolgica sensibilizada para o resto da vida das pessoas infectadas
(Martinez, 1999).
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Na Regio Sudeste, o Estado do Rio de Janeiro apresenta h mais tempo
a convivncia simultnea de dois sorotipos diferentes de vrus desde 1990, com
uma nica interrupo na simultaneidade dessa co-ocorrncia em 1997, sendo
retomada em 1998. No ano 2000 foi registrada a presena do sorotipo 3 pela
primeira vez na Baixada Fluminense, o que contribuiu para agravar o quadro
epidemiolgico do Estado (SES-RJ 2001).
Os primeiros casos de dengue hemorrgica no Estado do Rio de Janeiro
foram notificados no ano de 1990, devido a presena dos dois sorotipos diferentes
simultnea no mesmo perodo (FUNASA, 2000).
O Estado do Rio de Janeiro rene o maior nmero de variveis pr-
disponentes a uma epidemia de dengue do tipo hemorrgica na Regio Sudeste,
caso no sejam revertidas essas condies, particularmente aquelas que dizem
respeito aos nveis de infestao domiciliar do mosquito. O Estado do Rio de
Janeiro composto de 92 municpios, dos quais 90 apresentavam no ano 2001
infestaes domiciliares confirmadas pela Fundao Nacional de Sade,
conforme boletim epidemiolgico oficial (FUNASA, 2001).
2.3 - Controle Qumico e Biolgico de Vetores de Doenas
2.3.1 - Controle de Aedes aegypti
As prticas para controle de insetos so muito antigas. H registro de seu
uso na China h mais de 2.000 anos. No final do sculo XIX, descobriu-se que
certas espcies de insetos e outros artrpodes eram responsveis pela
transmisso de algumas das mais importantes doenas. Vacinas ou
medicamentos efetivos contra a maioria delas ainda no estavam disponveis e o
controle da transmisso era, todavia, fortemente centralizado no combate ao
vetor.
O manejo integrado trata do planejamento unificado de controle, de acordo
com as condies ambientais e a dinmica populacional do vetor. O manejo
ambiental lana mo de medidas para eliminar o vetor ou seus focos, ou, ainda,
para impedir o contato homem-vetor, como a eliminao de criadouros, a
drenagem e a instalao de telas em portas e janelas. So selecionados os
mtodos de controle apropriados e as populaes do vetor so mantidas em
nveis que no causam dano sade (Braga & Valle, 2007).
Os componentes do controle integrado de vetores incluem vigilncia,
reduo da fonte (ou manejo ambiental), controle biolgico, controle qumico com
uso de inseticidas e repelentes, armadilhas e manejo da resistncia a inseticidas.
O controle qumico, com inseticidas de origem orgnica ou inorgnica, uma das
metodologias mais adotadas como parte do manejo integrado para o controle de
vetores em Sade Pblica (Rose, 2001).
Desde o comeo do sculo XX, os agentes qumicos tm sido usados
para combater e controlar as populaes do mosquito Ae. aegypti. Durante as
primeiras campanhas, diferentes tipos de leos eram colocados em recipientes
com gua com a finalidade de inibir o desenvolvimento e matar as larvas que j
haviam eclodido. Com a descoberta do composto Diclorodifeniltricloroetano (DDT)
o mosquito transmissor da dengue foi erradicado de muitos pases, principalmente
do Brasil. No entanto, pases vizinhos ao Brasil no erradicaram o mosquito o que
resultou na reinvaso desse vetor em alguns estados brasileiros. Fato que
corroborou com o uso intensivo e indiscriminado do DDT e conseqentemente
para o aparecimento de populaes de Ae. aegypti resistentes a este composto.
Observado a resistncia dos mosquitos ao DDT o organofosforado passou a ser
utilizado para o combate a este vetor. Porm, semelhante ao DDT, os inseticidas
organofosforados causaram o surgimento de populaes resistentes de Ae.
aegypti (Consoli et al., 1986).
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por perodos
longos foi um dos mais importantes avanos no controle de insetos no sculo XX.
O primeiro inseticida de efeito prolongado, ou propriedade residual, foi o
diclorodifeniltricloroetano (DDT), um organoclorado desenvolvido em 1939, que,
quando aplicado em paredes e tetos de casas, permanecia ativo contra os insetos
por vrios meses (Rozendaal, 1997).
Inseticidas sintticos como os piretroides tm sido usados para o controle
dos mosquitos adultos enquanto os organofosforados, como o temefs, esto
sendo usados para o controle da fase larval. Uma alternativa ao controle qumico
da fase larval est baseada na eliminao fsica dos criadouros e o uso de
bactrias entomopatognicos. Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) tem sido
usados com sucesso desde os anos 80 para controle dos mosquitos e simulideos
(Lacey & Undeen, 1986).
Os inseticidas tm sido bastante usados na agricultura, agropecuria e na
sade pblica. Seu uso continuado tem provocado o aparecimento de populaes
resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores. Resistncia tem
sido detectada para todas as classes de inseticidas, afetando direta e
profundamente a re-emergncia das doenas transmitidas por vetores (Brogdon
et al., 1998). Por esse motivo, a partir de 2009 est sendo introduzido o
diflubenzuron que um inibidor da sntese de quitina, nas atividades de controle
das larval de Ae. aegypti (PNCD, 2009).
A resistncia definida pela OMS como a habilidade de uma populao de
insetos tolerar uma dose de inseticida que, em condies normais, causaria sua
morte. A resistncia a inseticidas pode ser pensada como um processo de
evoluo acelerada de uma populao que responde a uma intensa presso
seletiva, com a conseqente sobrevivncia dos indivduos que possuem alelos
que conferem resistncia. A resistncia pr-adaptativa, resultado de mutaes
(Braga & Valle, 2007).
Alm de provocar resistncia o uso indiscriminado dos inseticidas
clorados e organoclorados causa formao de resduos txicos a sade
humana (DAmato, 2002). Resistncia tem sido detectada para todas as classes
de inseticidas, afetando, a re-emergncia das doenas transmitidas por vetores
(Brogdon & McAllister 1998). Apesar dos importantes avanos alcanados no
desenvolvimento de mtodos alternativos, os inseticidas qumicos continuam
sendo uma importante ferramenta dos programas integrados de controle (Rose,
2001). Nesse contexto, o monitoramento e o manejo da resistncia, assim como o
uso de substncias com modos de ao diferentes dos inseticidas qumicos
convencionais, so elementos de suma importncia em qualquer programa de
controle de vetores (Ferrari, 1996).
Os mecanismos que tm provocado a resistncia de insetos aos patgenos
incluem mudanas no comportamento, na cutcula, mudana no ciclo das clulas
do intestino mdio, reduo da afinidade de protenas no intestino mdio e
imunidade maturao. O desenvolvimento da resistncia aos patgenos, em
especial aos que no atuam por meio de uma toxina, dever ser de natureza
diferente da resistncia aos inseticidas qumicos e poder progredir mais
lentamente. Desse modo, populaes de insetos, caros e outros artrpodes,
naturalmente, apresentam uma proporo de indivduos que tenham alelos que
lhes confiram resistncia a um determinado produto qumico. Populaes
resistentes podem surgir como resultado do uso persistente de pesticidas que
matam indivduos com alelos suscetveis e no matam aqueles que possuam
alelos resistentes. Assim, um pequeno nmero de indivduos possui
caractersticas que permitem sua sobrevivncia sob doses de inseticidas
normalmente letais. O prprio inseticida no produz uma mudana gentica; seu
uso continuado, entretanto, pode selecionar indivduos resistentes. Apesar dos
vrios estudos documentados sobre a resistncia, o nmero de mecanismos
envolvidos bastante pequeno e inclui diminuio da taxa de penetrao pela
cutcula, detoxificao metablica aumentada e diminuio da sensibilidade do
stio alvo. (Braga & Valle, 2007).
O manejo por ataque mltiplo envolve a utilizao de dois ou mais produtos
em rotao ou mistura. O princpio da rotao de produtos baseado no fato de
que a freqncia de resistncia a um produto (A) diminui quando produtos
alternativos (por ex. B e C) so utilizados (Georghiou, 1983; Tabashnik, 1989;
Roush, 1989). Sendo assim, para o sucesso da rotao h a necessidade de
assumir que existe custo adaptativo dos indivduos resistentes na ausncia da
presso de seleo e que no existe resistncia cruzada entre os componentes
da rotao. O princpio da mistura de dois produtos (A e B) se baseia no fato que
os indivduos resistentes ao produto A sero controlados pelo produto B e vice-
versa. Porm existe a possibilidade de se encontrarem indivduos resistentes ao
produto A e B atravs da resistncia mltipla. Dentre as vrias condies para o
sucesso da mistura esto: baixa freqncia de resistncia, ausncia de
resistncia cruzada e persistncia biolgica semelhante para os dois compostos.
O surgimento de populaes resistentes tem ocasionado srios problemas para o
controle de mosquitos. Alterao na susceptibilidade tem sido detectada para
todas as classes de inseticidas, afetando diretamente a re-emergncia das
doenas transmitidas por vetores (Brogdon & McAllister, 1998). Apesar de
importantes avanos em metodologias alternativas, os inseticidas qumicos so
uma poderosa ferramenta contra vetores e continuaro desempenhando papel
importante no controle integrado. Porm, eles possuem desvantagens, como o
custo elevado, riscos a sade humana e a organismos no alvo, bioacumulao e
desenvolvimento de resistncia dos organismos alvo (Thatheyus 2007 apud
Fonseca et al, 2009), pelo menos at a descoberta de mtodos alternativos
sustentveis que permitam um controle rpido e seguro de vetores. Com a alta
densidade e disperso de Ae. aegypti e Ae. albopictus, muitas vezes coexistindo,
em diversos estados brasileiros, faz-se necessrio, na vigilncia entomolgica, o
monitoramento de mudanas comportamentais que favoream o surgimento de
resistncia destes vetores, fornecendo informaes importantes na transmisso
de arboviroses, como a dengue e a febre amarela. Sobretudo, pensando em
contribuir efetivamente no controle destas espcies de Culicidae ( WHO 1990;
Braks et al. 2003).
Alm dos inseticidas qumicos propriamente ditos, outros produtos vm
sendo usados no controle de vetores. Eles pertencem, principalmente, aos grupos
dos inseticidas biolgicos e com isso foi dada grande importncia ao uso de
microrganismos biolgicos patognicos e virulentos contra populaes de
mosquitos vetores de doenas humanas. Isolados de fungos, bactrias e vrus
entomopatognicos apresentam baixa contaminao ao ambiente especificidade
aos organismos-alvo, baixa probabilidade do mosquito tornar-se resistente, e
ademais possibilita a auto-disperso (Giannini, 2001).
2.4 - Ecologia de Fungos na Agricultura e Sade Humana
Os fungos constituem um grupo de seres vivos muito numerosos e
hererogneos e so encontrados nos mais diversos nichos ecolgicos do planeta.
Excluindo-se os insetos, os fungos constituem um dos mais numerosos seres
vivos existentes (Esposito & Azevedo, 2004).
Os fungos so responsveis pela produo de importantes cidos
orgnicos, como o cido ctrico, pela produo de enzimas de interesse industrial
e de elevado valor econmico, destacando-se as celulases, lacases, xilanases,
pectinases e amilases, pelo controle biolgico de insetos-pragas da agricultura,
pelo controle de inmeras molstias que atacam plantas cultivadas e pela
produo de etanol. Mais ainda, so eles que tornam a vida no planeta mais
agradvel, pois sem os fungos no existiriam bebidas fermentadas como as
cervejas e vinhos e queijos dos mais diversos tipos e em ecossistemas florestais
os fungos so os principais decompositores de celulose e lignina, os
componentes primrios da madeira (Esposito & Azevedo, 2004).
Fungos ligninolticos, como Phanerochaete chrysosporium, so capazes
degradar vrios poluentes, incluindo o DDT, diferentes PCbs, dioxina, lindane e
benzo[a]pireno (Bumpus et al., 1985). Degradam tambm plsticos
biodegradveis incluindo poliidroxibutirato. Com relao aos metais txicos,
fungos filamentosos introduzidos em solos contaminados por metais pesados e
radioativos, absorveriam esses metais e, por meio de translocao, os
concentrariam nos basidiocarpos, que, eventualmente, seriam colhidos e os
metais extrado e reutilizados, ou ainda, eliminados de maneira apropriada (Gray,
1998). Os fungos tm potencial de serem utilizados tambm na remoo de
corantes e na decomposio de matria orgnica em lagos e crregos de uso
humano.
2.5 - Fungos Entomopatognicos
Os fungos foram os primeiros agentes patognicos de insetos a serem
utilizados no controle de pragas. Em condies naturais a ocorrncia de fungos
entomopatognicos tem sido, no Brasil e em outros pases, um fator importante
para reduzir as populaes de pragas. Aproximadamente 80% das doenas de
insetos tm como agentes etiolgicos os fungos, pertencentes cerca de 90
gneros e mais de 700 espcies (Alves, 1998).
Os fungos entomopatognicos so mais empregados para o controle de
pragas agrcolas, o interesse no uso destes fungos para o controle de artrpodes
vetores de doenas tem sido crescente devido aumento de incidncia de
doenas, tais como a dengue, e pelos altos nveis de resistncia dos mosquitos
aos inseticidas atualmente disponveis no mercado (ffrench-Constant, 2005).
O uso de fungos entomopatognicos para o controle de larvas de mosquitos
tem sido tema de vrios estudos (Clark et al., 1968; Goettel, 1988; Alves et al.,
2002), porm somente um produto baseado na espcie Lagenidium giganteum foi
comercializado at agora (Laginex), embora fosse retirado em 1999 (Scholte et
al., 2004).
Pesquisas com o uso de fungos entomopatognicos para o controle dos
mosquitos transmissores da malria Anopheles gambiae e A. stephensi
demonstrou que os fungos Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana foram
patognicos e virulentos contra a forma adulta desse vetor (Scholte et al., 2003;
Blanford et al., 2005; Scholte et al., 2005). Scholte et al. (2007) mostrou que o
fungo M. anisopliae foi patognico contra o mosquito adulto de Aedes aegypti e
Ae. albopictus, vetores da dengue e da febre amarela. Recentes estudos
demonstraram que vrios isolados de M. anisopliae so virulentos contra adultos
de Ae. aegypti (Paula et al., 2008) com potencial para serem usados em
programas de controle desse vetor.
A grande variabilidade gentica desses entomopatgenos pode ser
considerada uma das suas principais vantagens no controle microbiano de
insetos. Com tcnicas apropriadas de bioensaios possvel selecionar isolados
de fungos altamente virulentos, com caractersticas adequadas para serem
utilizados como inseticidas microbianos (Hajek & St. Leger 1994).
Essa caracterstica dos fungos tem despertado interesse crescente no
ambiente cientfico na utilizao dos fungos como agentes de controle microbiano.
Mais de 50% dos trabalhos de patologia de insetos e controle microbiano
publicados no Brasil so sobre fungos entomopatognicos, sendo que 90% deles
foi desenvolvido nas duas ltimas dcadas (Alves, 1998).
As espcies que parasitam insetos esto presentes em todos os grupos
taxonmicos de fungos conhecidos. Esses parasitos apresentam, dois modos de
colonizao do hospedeiro: ectoparasitismo e endoparasitismo. Os ectoparasitas
provocam infeces superficiais no hospedeiro, crescendo sobre os tecidos do
inseto e penetrando-o, geralmente, por meio de uma estrutura especializada, o
haustrio, para obteno de alimento. Os fungos endoparasitas so aqueles que
crescem dentro do inseto hospedeiro e tem caracterstica de matar o hospedeiro
em poucas semanas ou dias (Alves, 1998).
M. anisopliae, conhecido anteriormente como anisopliae de
Entomophthora, distribudo habitando o solo. O primeiro uso de M. anisopliae
como um agente microbiano para combater insetos realizou-se em 1879, quando
Elie Metchnikoff o usou em testes experimentais para controlar o besouro do gro
do trigo, austraca de Anisoplia. Foi usado mais tarde para controlar o gorgulho da
beterraba de acar. Um membro da classe de Hyphomycetes dos fungos, M.
anisopliae categorizado como um fungo verde do muscardine devido cor
verde das colnias em esporulao. M. anisopliae encontra-se naturalmente
sobre mais de 300 espcies de insetos das diferentes ordens (Alves, 1998).
M. anisopliae penetra nos insetos atravs da cutcula. Uma vez dentro do
inseto, o fungo produz uma extenso lateral das hifas que eventualmente
proliferam e consomem os tecidos dos rgos internos do inseto. O crescimento
das hifas continua at que o inseto esteja totalmente colonizado por miclios
(Cole, 2003)
Foram realizados estudos de toxicidade/patogenicidade em ratos
compreendendo estudos de toxicidade/patogenicidade pulmonar aguda, estudos
de toxicidade/patogenicidade aguda com aplicao intravenosa, toxicidade
dermatolgica e de irritao conjuntival em coelhos. Os estudos indicaram que M.
anisopliae incapaz de crescer em temperaturas acima de 35C. Os resultados
dos estudos de toxicidade/patogenicidade no mostraram nenhum efeito txico,
patognico ou adverso. Esses estudos demonstraram que os roedores
neutralizam eficazmente os fungos de seus corpos mesmo depois de inoculados
em quantidades elevadas. Os resultados do estudo do crescimento da
temperatura mostram em que o M. anisopliae no pode crescer em temperaturas
dos corpos dos mamferos e, conseqentemente, no crescem em rgos ou
tecidos humanos (Cole, 2003).
Embora M. anisopliae no seja infeccioso ou txico para mamferos, a
inalao dos esporos pode causar reaes alrgicas em indivduos sensveis
(Alves, 1998). A maioria dos produtos resultantes da transformao fngica
menos mutagnica do que os compostos originais, e no caso de poluentes em
geral, a transformao de compostos precursores txicos resulta em compostos
intermedirios mais polares, portanto, mais disponveis, e que sero facilmente
eliminados do ambiente. Como exemplo, os epxidos e as quinonas formados a
partir de hidrocarbonetos aromticos policclicos, so compostos muito instveis
que so fcil e rapidamente eliminados bitica e abioticamente (Silva e Espsito,
2004).
A ocorrncia desses fungos, em condies naturais, tanto enzotica como
epizooticamente, tem sido, aqui e em outros pases, um fator importante na
reduo das populaes de pragas (Alves, 1998).
2.6 - Utilizao de Fungos Entomopatognicos para o Controle de Vetores de
Doenas Humanas
Alm de causarem incmodo, sensao de repulsa, aflio, algumas
espcies de insetos so causadores de doenas que comprometem a sade
humana, o que agrava so os altos ndices de pessoas acometidas por essas
doenas e o elevado nvel de mortalidade entre a populao. A mosca flebtomo
transmite para o homem, atravs de sua picada, a doena leishimaniose (WHO,
1990). Estudos laboratoriais tm demonstrado que os fungos entomopatognicos
so virulentos a estas moscas (Reithinger et al., 1997).
A doena de Chagas, um dos mais graves problemas de sade pblica no
Brasil, tem como causa de infeco a presena do parasito Trypanosoma cruzzi
transmitido pelos insetos triatomideos. Os vetores mais importantes desta doena
so Triatoma infestans, T. brasilienses, Rhodnius prolixux e T. dimidiata, que tem
sido combatido com o uso de fungos entomopatognicos (Costa et al., 2003).
Mosquitos do gnero Culex so vetores da filariose humana, doena
endmica no nordeste do Brasil. A partir de 1970 vrios casos de resistncia
deste tem sido evidenciado neste mosquito como conseqncia do uso excessivo
de inseticidas qumicos (Consoli et al., 1986). Por esses motivos fungos
entomopatognicos como M. anisopliae e Lagenidium giganteum, e tambm
bactrias do gnero Bacillus tem sido testados como tentativa de controle
biolgico desses insetos.
Daoust & Roberts (1982) testaram o fungo M. anisopliae observando alta
virulncia para larvas de Culex pipiens, Ae. aegypti e Anopheles stephens. De
acordo com Riba et al., (1986), o segundo estgio de Ae. aegypti o de maior
resistncia infeco pelo fungo; porm, quando testado, o fungo Penicillium spp.
foi altamente patognico e virulento s larvas de Ae. aegypti.
Scholte et al., (2004a), observou em laboratrio que fmeas adultas de
Anopheles gambiae infectadas com M. anisopliae infectam o macho durante a
cpula. E que, possivelmente, o macho infectado dissemina o fungo para outras
fmeas. Scholte et al., (2005) testaram tecidos pretos, impregnado com o fungo
M. anisopliae suspensas em habitaes humanas na frica, e observaram a
reduo da populao de Anopheles.
Blanford et al., (2005) usando B. bassiana, infectou fmeas de Anopheles
stephensi, previamente inoculadas com Plasmodium chaboudi, e constatou que
durante a infeco as fmeas param de se alimentar. Com isso,
conseqentemente, ocorre a reduo da transmisso do Plasmodium, o que
diminui a incidncia de malria na populao.
A partir de tais pesquisas pode-se observar no ambiente acadmico um
maior interesse na busca de fungos entomopatognicos virulentos e que infecte
todos os estgios de desenvolvimento: ovo, larva e adultos de mosquitos vetores
de doenas humanas.
3 - OBJETIVOS
3.1 - Objetivo geral
Elaborar estratgias de aplicao de fungos entomopatognicos em
possveis criadouros do mosquito.
3.2 - Objetivos especficos
Determinar em condies de laboratrio a virulncia de isolados de fungos
entomopatognicos para larvas de segundo e terceiro instar de Ae. aegypti.
Avaliar a persistncia ou efeito residual dos isolados mais virulentos para
larvas de segundo e terceiro instar de Ae. aegypti em condies de semi-campo.
Avaliar o efeito da infeco fungica no desenvolvimento do ciclo de vida de
Ae. aegypti.
4 - MATERIAL E MTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratrio de Entomologia e Fitopatologia
(LEF) da Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Campos dos
Goytacazes, Estado do Rio de Janeiro.
4.1 - Criao das Larvas de Aedes aegypti Linhagem Rockfeller
As larvas do mosquito Ae. aegypti (Linhagem Rockfeller) foram criadas no
insetrio do Laboratrio de Biotecnologia (CBB/UENF).
Para a criao, mosquitos machos e fmeas foram mantidos em uma
gaiola de plstico (30 cm x 20 cm x 20 cm) a fim que ocorresse o acasalamento.
As fmeas foram nutridas com sangue de camundongo, o que propiciou a
maturao dos ovos.
Para oviposio, copos plsticos de volume de 100 mL, contendo papel-
filtro em seu interior como stio de oviposio e mantidos com 50 mL de gua,
foram colocados dentro da gaiola para que a fmea ovipositasse. O papel-filtro
contendo os ovos foi retirado e colocado dentro de uma bandeja (10 cm x 30 cm x
20 cm) com gua estimulando a ecloso das larvas. As larvas foram alimentadas
com rao de camundongo no primeiro dia de ecloso.
A temperatura usada para criao foi de 25C, com Umidade Relativa (UR)
de 70 10 %.
4.2 Bioensaio 1: Teste de Virulncia larval
Foram testados dois isolados de B. bassiana e oito isolados de M. anisopliae
oriundos de diferentes regies do Brasil para selecionar aqueles com maior
virulncia. (Tabela1).
Tabela 1 Isolados de fungos entomopatognicos usados para virulncia contra
larvas de Ae. aegypti
Numerao Espcies Hospedeiro Origem Geogrfica
CG 24 B. bassiana Euschistus heros Fabr.
(Heteroptera: Pentatomidae)
Londrina, Parana
CG 494 B. bassiana
Dptera Rio do Pomba, Bahia,
CG 144 M. anisopliae Piezodorus guildinii
(Heteroptera: Pentatomidae)
Goiania, Goias
ESALQ 818 M. anisopliae Isolado de solo Piracicaba, So Paulo
LPP 96 M. anisopliae
Isolado de solo So Francisco de
Itabapoana, Rio de
Janeiro
LPP 137 M. anisopliae
Isolado de solo Campos, Rio de
Janeiro.
LPP 87 M. anisopliae
Isolado de solo Rondnia, Roraima
LPP 45 M. anisopliae Isolado de solo Rondnia, Roraima
LPP 128 M. anisopliae
Isolado de solo Rondnia, Roraima,
LPP 133 M. anisopliae Isolado de solo Montenegro, Roraima
Os isolados de M. anisopliae e B. bassiana foram obtidos da coleo do
CENARGEN (CG) em Braslia, ESALQ 818 em Piracicaba (So Paulo) e os
isolados denominados LPP, do LEF da Universidade Estadual do Norte
Fluminense. Os fungos foram cultivados em Dextrose Agar (dextrose 10g;
peptona 2,5g; extrato de levedura 2,5g; agar 20g em 1L H20) a 270 C por 15 dias
para depois serem usados nos experimentos.
Isolados de M. anisopliae e B. bassiana foram testados contra larvas de
Ae. aegypti adicionando-se a suspenso de fungo em copos de plsticos
descartveis de 200 mL contendo 50 mL de gua e 10 larvas por copo. Foram
usados 50 larvas para cada tratamento e os experimentos foram repetidos 3
vezes. Cada copo foi inoculado com 1 mL da suspenso de fungo com 1 x 108
condios ml-1 (Tween 80 0,05% em gua destilada) sendo a concentrao final de
5 x 105 condios ml-1. As larvas foram alimentadas com 0,5 g da rao animal a
cada copo no incio do experimento. Os copos foram mantidos em BOD em 25C;
UR de 70 10% e fotofase de 12:12 (L/E).
Os ensaios foram realizados com larvas de 2 e 3 instar e descartadas
aquelas que se transformaram em pupas.
Como tratamento controle foram usados cinco copos plsticos contendo
cada um 50 mL de agua destilada e 10 larvas de Ae. aegypti em cada copo aos
quais foi adicionado 1 mL de Tween sem a presena de condios para avaliao
da mortalidade natural, se possa aferir a presena de possveis variveis
intervenientes.
Em experimento preliminar condios in-ativados com radiao ultravioleta
por 10 minutos em cmara de fluxo foram usados nos controles para testar os
possveis efeitos fsicos dos condios suspensos na gua na sobrevivncia das
larvas. Um mL de suspenso desses condios de M. anisopliae na concentrao
de 108 condios/mL foi adicionado a cada frasco.
4.3 Preparo das Suspenses de Fungo para os Experimentos de Laboratrio e
de Semi-campo
Todo o processo da coleta de condios do fungo crescidos no arroz foi feito
em cmera de fluxo laminar devidamente desinfetada com lcool 70% e 15
minutos de exposio UV. A quantificao dos condios foi feita em Cmara de
Neubawer e uma vez estabelecida foi realizada diluio consecutiva usando
Tween 80 a 0,05% at a obteno da concentrao de 1x108 condios/mL-1,
suspenso padro usada nos testes. Os tratamentos controles foram feitos
somente com Tween 80 (TW) a 0,05%.
Tambm foram feitos testes usando gros de arroz com condios do fungo
aderidos; Neste caso o tratamento controle foi feito com gros de arroz sem
condios do fungo e devidamente autoclavado durante 15 minutos a 1 atm (121o
C).
As suspenses do fungo foram preparadas com Tween 80 (0,05%) em
gua destilada estril. Os condios dos isolados dos fungos foram coletados das
placas de cultivo utilizando-se uma ala de platina esterilizada para serem
utilizados como fonte dos inculos. A concentrao de condios foi avaliada por
contagem na cmara de Neubawer. O Tween atua como um dispersante
diminuindo a hidrofobicidade dos condios. Essa suspenso estoque foi preparada
uma concentrao de 109 condios/mL, e diluda e agitada em Vortex de modo a
obter-se uma concentrao final de 108 condios/mL no dia de sua utilizao nos
experimentos
4.4 Bioensaio 2: Persistncia da virulncia da Suspenso do Fungo ESALQ 818
em gua.
Para verificar a persistncia do fungo na gua, 1 mL da suspenso ESALQ
818 + TW (1x108 ml-1) foi adicionada em um copo de plstico com 50 mL de gua
destilada. O copo foi armazenado em BOD a 25C; UR 70 10%; fotofase de
12:12 (L/E) nos perodos de tempo: zero, 3, 5 e 10 dias. Completados os dias de
armazenamento as larvas foram colocadas e a mortalidade foi avaliada durante
os prximos 8 dias. O tratamento controle consistiu de Tween 80 a 0,05%.
Utilizou-se 3 repeties de 1 copo plstico com 10 larvas 2 e 3 instar de
Ae. aegypti.
4.5 Bioensaio 3: Infeco das Larvas com condios aderidos ao Arroz
Foram utilizados os condios do isolado ESALQ 818 cultivados em placas
de Petri contendo meio slido SDA (Dextrose 10g; Peptona 2,5g; Extrato de
levedura 2,5g; gar 20g e gua destilada 1L), por duas semanas, a 27o C, em
cmara climatizada e depois armazenados a 4 oC em refrigerador.
Para a produo massal do fungo foram usados Erlemeyers de 250 mL
contendo 25 g de arroz parboilizado cru + 10 mL de gua destilada como meio de
cultura, autoclavados durante 15 minutos a 1 atm (121o C).
Aps a autoclavagem os condios foram adicionados ao meio com o auxlio
de uma colher estril. Movimentos circulares foram feitos para homogenizar os
condios entre os gros de arroz.
Os Erlemeyers com o fungo crescido no arroz foram mantidos em cmera
climatizada a 27 oC.
4.6 Persistncia da virulncia do Fungo Crescidos e Aderidos no Gro de Arroz.
Para a determinao da persistncia da virulncia do fungo crescidos e
aderidos nos gros de arroz, foram usados copos plstico com 50 mL de gua e
adicionados 1 gro de arroz contendo condios do isolado ESALQ 818, com
concentrao final de 59 x104 . O tratamento controle foi feito com 1 gro de arroz
autoclavado sem fungo.
4.7 Virulncia do Fungo Crescido e Aplicado em Gro de Arroz em Condies
de Semi-campo para Larvas de Aedes aegypti
Este trabalho foi conduzido na varanda do insetrio do Laboratrio de
Entomologia e Fitopatologia (LEF), da Universidade Estadual do Norte
Fluminense (UENF), Campos dos Goytacazes, RJ. Os testes ficaram protegidos
contra luminosidade solar direta e chuva por uma cobertura de alvenaria e telha.
Foram utilizados baldes de oito litros tampados com organza nesse teste
para verificar a virulncia do fungo ESALQ 818 aderidos em gros de arroz contra
larvas de Ae. aegypti (linhagem Rockefeller). Dentro de cada balde foi 1 L de
gua e 50 larvas do 2 e 3 instar de Ae. aegypti. Foram adicionados 10 ou 20
gros de arroz em cada balde.
A concentrao final do isolado ESALQ 818 nos baldes contendo 10 gros
arroz foi 2,9 x 105. A concentrao final do isolado ESALQ 818 nos baldes
contendo 20 gros arroz foi 5,9 x 105.
4.8 Persistncia da virulncia do Fungo Crescido e Aderido em Gros de Arroz
Foi usado o mesmo procedimento do item 4.7, porm somente 20 gros de
arroz com o fungo foram adicionados nos baldes de 8L contendo 1 L de gua e
deixados em condies de semi-campo. Foram realizados trs testes com
diferentes perodos de tempo de inoculao do fungo na gua: Tempo zero, 5, 10
e 20 dias. Completados os dias de inoculao do fungo na gua, as larvas foram
colocadas ento iniciando a avaliao da mortalidade.
4.9 Efeitos do Fungo ESALQ 818 e LPP 133 no Desenvolvimento de Aedes
aegypti
Vinte gros de arroz contendo fungo foram adicionados nos baldes
contendo 1L de gua e 50 larvas do 2 e 3 instar de Ae. aegypti. Durante 14 dias
foi avaliada a mortalidade das larvas e tambm coletada e quantificada o nmero
de pupas que emergiram durante o teste. Estas pupas foram colocadas em copos
plsticos com 100 mL de gua. Os copos com as pupas ficaram dentro de uma
gaiola coberta com tecido de organza at a ecloso dos mosquitos adultos que
foram observados durante 8 dias com o intuito de avaliar a possvel mortalidade
decorrente da exposio das larvas ao fungo. Os mosquitos adultos foram
alimentados com uma soluo de sacarose (10%). Os mosquitos mortos foram
submersos em lcool 70% por 30 segundos, depois colocados dentro de uma
cmara mida por 10 dias para observar a ocorrncia do processo de
conidiognese, com a finalidade de confirmar a mortalidade do mosquito pela
infeco do fungo.
Em todos os testes feitos em condies de semi-campo foram montados 3
baldes para o tratamento com fungo e 3 baldes para o controle.
O fungo LPP 133 que no primeiro experimento havia apresentado baixa
virulncia, foi submetido sucessivas passagens por larvas de Ae. aegypti e
melhorou sua eficincia diminuindo a taxa de sobrevivncia larval.
A concentrao final do isolado ESALQ 818 (20 gros arroz) inoculado em
1000 mL de gua foi de 5,9 x105 condios. A concentrao final do isolado LPP
133 (20 gros arroz) inoculado em 1000 mL de gua foi de 6,5 x 105 condios.
4.10 Virulncia em Condies de Laboratrio do Isolado ESALQ 818 Contra
Larvas Selvagens de Aedes aegypti oriundas de Ovos Colhidos no Campo
Armadilhas