Estratégias moleculares para obten ção de fungos transgênicos · Sumário Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Introdução Ana Paula de S. Pallu Tozadori

Programa de PPrograma de Póóss--graduagraduaçção em Genão em Genéética e tica e

Melhoramento de PlantasMelhoramento de Plantas

LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM

GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS

EstratEstratéégias moleculares para obtengias moleculares para obtençção ão

de fungos transgênicosde fungos transgênicos

Pós-graduanda: Eng. Agr. MS Ana Paula de Souza Pallu Tozadori

Orientadora: Profa. Dra. Aline Pizzirani-Kleiner

Co-orientador: Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo

Departamento de GenéticaAvenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil

Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php

Sumário

Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos

Introdução

Ana Paula de S. Pallu Tozadori

Comparação

Considerações finais

Fungos transgênicos

Mecanismos de Integração

Construção do vetor


�� Antes do microscAntes do microscóópio: cogumelo. pio: cogumelo.

�� ConotaConotaçção mão míística:stica:

-- EgEgíípcios: fermentapcios: fermentaçção = presente do Deus Osão = presente do Deus Osííris (panificaris (panificaçção).ão).

-- Gregos e Romanos: fermentaGregos e Romanos: fermentaçção = presente dos Deuses Dionão = presente dos Deuses Dioníísio e Baco.sio e Baco.

-- Romanos: cogumelos e trufas = associados a raios enviados a TerRomanos: cogumelos e trufas = associados a raios enviados a Terra por ra por

JJúúpiter.piter.

-- Cogumelos alucinCogumelos alucinóógenos: civilizagenos: civilizaçções prões préé--colombianas da Amcolombianas da Améérica Central e rica Central e

MMééxico.xico.


IntroduçãoHistórico da Micologia


�� PierPier Antonio Antonio MicheliMicheli (1679(1679--1737): 1737):

FUNDADOR DA MICOLOGIA.FUNDADOR DA MICOLOGIA.

-- ““Nova Nova PlantarumPlantarum GeneraGenera”” (1729). (1729).


�� AntonAnton de Bari (1831de Bari (1831--1888): FUNDADOR DA 1888): FUNDADOR DA

MICOLOGIA MODERNA.MICOLOGIA MODERNA.

-- Descobertas: a natureza dos liquens, reproduDescobertas: a natureza dos liquens, reproduçção ão

sexuada em diversos fungos. sexuada em diversos fungos.

Histórico da MicologiaIntrodução

Tabela 1. Diversidade de microrganismos.

Microrganismo EspMicrorganismo Espéécies Ncies Nºº estimado Relaestimado Relaçção ão Conhecidas de espConhecidas de espéécies %cies %

BactBactééria 4 700 40 000 ria 4 700 40 000 11,7511,75

Fungo 74 000 1 500 000 Fungo 74 000 1 500 000 4,604,60

Alga 40 000 60 000 Alga 40 000 60 000 66,6766,67

VVíírus 5 000 130 000 rus 5 000 130 000 3,85 3,85

Esposito & Azevedo, 2004.

Estratégias moleculares para obtenção de fungos transgênicos Ana Paula de S. Pallu Tozadori

DiversidadeIntrodução

Importância dos fungos

Figura 1. Utilizações dos fungos.

�� DoenDoençças em seres humanos, animais e plantas;as em seres humanos, animais e plantas;

�� DeterioraDeterioraçção de alimentos armazenados;ão de alimentos armazenados;

�� Fungos venenosos e Fungos venenosos e aluginaluginóógenosgenos..

Introdução

DiversidadeDiversidadeImportância Importância dos fungosdos fungos

Potencial Potencial

Busca por novas Busca por novas tecnologias tecnologias

��

��


Transformação em fungosIntrodução

�� Final da dFinal da déécada de 70: primeiros trabalhos com transformacada de 70: primeiros trabalhos com transformaçção de ão de

fungos.fungos.

�� HinnenHinnen etet al., 1978 al., 1978 –– PROTOPLASTOS/TransformaPROTOPLASTOS/Transformaçção de linhagens ão de linhagens

de de SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae leu2leu2-- com plasmcom plasmíídio contendo o gene dio contendo o gene

leu2. leu2.

�� Case Case etet al., 1979 al., 1979 –– ESFEROPLATOSESFEROPLATOS/Transforma/Transformaçção de linhagens ão de linhagens

de de NeurosporaNeurospora crassa crassa qaqa22-- com plasmcom plasmíídio contendo o gene qa2dio contendo o gene qa2..

Histórico da transformação


Introdução

Figura 2. Número de artigos publicados sobre transformação de fungos nas

décadas de 80, 90 e 2000.

Histórico da transformação


Introdução

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1980-1989 1990-1999 2000-2008

Décadas

Número de artigos publicados

1980-1989

1990-1999

2000-2008

Fonte: Web of Science



�� Vetor de expressãoVetor de expressão:: plasmplasmíídiosdios bacterianos onde foram bacterianos onde foram clonadosclonados os os

genes a serem introduzidos no genoma do fungo.genes a serem introduzidos no genoma do fungo.

-- cassete de expressão contendo o gene de interessecassete de expressão contendo o gene de interesse

-- gene de resistênciagene de resistência

-- origem de replicaorigem de replicaççãoão

�� Cassete de expressãoCassete de expressão:: promotorpromotorseqseqüüência ência codificadoracodificadorasinal de sinal de poliadenilapoliadenilaççãoão ((terminadorterminador))

�� Gene de seleGene de seleççãoão:: resistência a antibiresistência a antibióóticoticocrescimento em fonte C alternativacrescimento em fonte C alternativa

�� PromotorPromotor para a expressão do gene.para a expressão do gene.


Figura 3. Plasmídio contendo origem de replicação para E. coli e S. cerevisiae, URA3 para seleção em S. cerevisiae, resistência a amplicilina para E. coli e

seqüência ativadora upstream GAL e promotor (P-CYC).



Figura 4. (a) e (b): procedimentos para interrupação do gene. (c): procedimento

para substituição do gene.


Fonte: Finchan, 1999.

cc

aa

bb



�� Dois tipos de vetores:Dois tipos de vetores:

Replicativos ou autônomos

Integrativos


Figura 5. Três modelos de integração de DNA de S. cerevisiae.

Tipo 3Tipo 3

Tipo 1Tipo 1

Tipo 2Tipo 2

Crossing-over: integração do plasmídio.

Integração ectópica. Substituição.

Mecanismos de integração



Figura 6. Interação em S. cerevisiae entre um plasmídio com “gap” no

marcador e o locus do cromossomo homólogo com o alelo mutante.

Mecanismos de integração


Reparo sem crossing-over.

Reparo com crossing-over.



�� MMéétodos Cltodos Cláássicosssicos

-- GeraGeraçção de mutantesão de mutantes

-- RecombinaRecombinaççãoão

�� MMéétodos Molecularestodos Moleculares

espontâneasespontâneas

induzidasinduzidas agentes fagentes fíísicos e qusicos e quíímicosmicos

baixa freqbaixa freqüüênciaência

ciclos sexual e ciclos sexual e parassexualparassexual

�� EstratEstratéégias moleculares:gias moleculares:

-- ProtoplastoProtoplasto

-- BiobalBiobalíísticastica

-- TransformaTransformaçção via ão via AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens

-- RNARNA

-- TransposonsTransposons}} Silenciamento gênicoSilenciamento gênico


Protoplasto

�� Protoplastos originados a partir da digestão enzimProtoplastos originados a partir da digestão enzimáática da parede tica da parede

celular de hifas e esporos (etapa crucial): celular de hifas e esporos (etapa crucial):

-- AAçção do agente fusogênico ão do agente fusogênico polietilenoglicolpolietilenoglicol ((PEGPEG) e ) e ííons cons cáálcio (CaCllcio (CaCl22).).

-- EletroporaEletroporaçção (descrito em 1989 por ão (descrito em 1989 por WardWard & & BarnesBarnes, para , para AspergillusAspergillus awamoriawamori e e

AspergillusAspergillus nigerniger). ).

Figura 7. Protoplastos de Aspergillus niger.

ProtoplastoControle biológico

�� PlasmPlasmíídio dio pEGFPpEGFP--C1C1, , contendocontendo gene gene gfpgfp e gene de resistência a e gene de resistência a

higromicina.higromicina.

�� BioensaioBioensaio: recombinante de : recombinante de C. C. rosearosea crescidocrescido emem BDABDA, com o , com o

nematnematóóideide PanagrellusPanagrellus redivivusredivivus (20(20--30). 30). IncubadosIncubados a 26a 26°°C C porpor 2 e 5 2 e 5

diasdias..



ProtoplastoControle biológico

Figura 8. Processo de infecção do fungo transformado observado sob microscopia

de luz e de fluorescência.


ProtoplastoIndústria



Figura 9. Construção do plasmídio pAN52-Plg1.

Fonte: Cardoso et al., 2008.


Fonte: Cardoso et al., 2008.

Tabela 2. Atividade de pectina liase.

Tabela 3. Atividade de pectina liase em diferentes fontes de carbono.

Atividade de pectina

liase 57 vezes maior

que a selvagem.

132 vezes maior que a selvagem.


Biobalística

�� DDéécada de 90: transformacada de 90: transformaçção genão genéética de mictica de micéélio ou conlio ou coníídios de dios de

fungos filamentosos: fungos filamentosos: NeurosporaNeurospora crassacrassa ((ARMALEOARMALEO etet al. 1990)al. 1990), ,

PhytophthoraPhytophthora sppspp. . ((BAILEYBAILEY etet al. 1993)al. 1993) e e AspergillusAspergillus nidulansnidulans ((FUNGAROFUNGARO

etet al. 1995).al. 1995).


Figura 10. Biobalística na transformação de fungos.

Biobalística

Fonte: www.bio-rad.com


BiobalísticaMicorriza

Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry

Vol. 71 (2007) , No. 1 pp.47-50.

Masahide SUNAGAWA, Hitoshi MURATA, Yasumasa MIYAZAKI and Masaya NAKAMURA

�� Transformation of the Transformation of the MycorrhizalMycorrhizal BasidiomycetesBasidiomycetes, , SuillusSuillus

grevilleigrevillei and and S. S. bovinusbovinus, by Particle Bombardment, by Particle Bombardment

�� PlasmPlasmíídio dio pHHMpHHM 192192, , contendocontendo cassetecassete de de expressãoexpressão dada

higromicina B higromicina B fosfotransferasefosfotransferase e o e o cassetecassete de de expressãoexpressão desred2desred2..

�� TransformaTransformaççãoão de de micmicéélioslios porpor biobalbiobalíística (Biostica (Bio--RadRad, CA)., CA).

BiobalísticaMicorriza

Pressão de hélio (psi)

Distância (cm)

5 8 11 14,5650 0 0 0 01100 3 2 1 01300 0 1 1 0

Pressão de hélio

(psi)

Distância (cm)5 8 11 14,5

650 0 0 0 01100 2 2 0 01300 0 0 0 0

Tabela 4. Número de transformantes de S. grevillei.

Tabela 5. Número de transformantes de S. bovinus.

�� FreqFreqüüência de transformaência de transformaçção: 1,2 e 0,6 transformantes/ão: 1,2 e 0,6 transformantes/µµg de DNA de g de DNA de S. S. grevilleigrevillei

e de e de S. S. bovinusbovinus respectivamente.respectivamente.


Transformação via Agrobacterium tumefaciens

�� TransformaTransformaçção genão genéética de leveduras tica de leveduras ((BUNDOCKBUNDOCK etet al. 1995)al. 1995) e fungos e fungos

filamentosos filamentosos (De (De GROOTGROOT etet al. 1998).al. 1998).

Figura 11. Transformação genética

de fungos via A. tumefaciens.

micmicééliolio

protoplastosprotoplastosesporosesporos

corpos decorpos defrutificafrutificaççãoão

AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens

HifasHifas

CoCo--cultivocultivo

Meio lMeio lííquidoquido

SeleSeleçção dos transformantes em ão dos transformantes em placas de placas de PetriPetri

Fonte: Michielse et al., 2005.

Transformação via Agrobacterium tumefaciens

Figura 12. Transformação genética de fungos via A. tumefaciens.

Fonte: Michielse et al., 2005.


AlimentoAgrobacterium tumefaciens

�� Primeira transformaPrimeira transformaçção de micão de micéélio vegetativo de uma linhagem lio vegetativo de uma linhagem

comercial de comercial de A. A. bisporusbisporus..

�� Gene de resistência a higromicina B.Gene de resistência a higromicina B.


AlimentoAgrobacterium tumefaciens

�� NNúúmero de integramero de integraçções entre uma e oito, mas a maioria dos ões entre uma e oito, mas a maioria dos

transformantes de duas a quatro ctransformantes de duas a quatro cóópiaspias..

Figura 13. Southern blot com sonda hyg. Linha 1 a 19 transformantes, linha 20:

controle.


PatógenoAgrobacterium tumefaciens

�� LeptosphaeriaLeptosphaeria maculansmaculans, L. , L. biglobosabiglobosa, , OculimaculaOculimacula yallundaeyallundae ee O. O.

acuformisacuformis foram transformados foram transformados via via AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens com com

genes genes DsRedDsRed e e gfpgfp..

�� VetoresVetores pCAMDsRedpCAMDsRed e e pCAMBgfppCAMBgfp..

Figura 14. Vetor usado para a transformação.

Agrobacterium tumefaciens

Figura 15. Micrografias de fluorescência. a-d: Oculimacula yallunde (GFP) e O. ocuformis (DsRed), co-cultivo, permitindo que o micélio das suas espécies cresçam

junto. e-h: Hifas maduras de L. biglobosa (DsRed) e L. maculans (GFP).

Patógeno

Agrobacterium tumefaciens

Figura 16. Micrografias de fluorescência. i-n: L. maculans (DsRed) e L. biglobosa(GFP) na planta.

Patógeno


Métodos baseados no RNA

�� EstratEstratéégia alternativa: mgia alternativa: méétodos que silenciam expressão de gene todos que silenciam expressão de gene

ppóóss--transcricionalmentetranscricionalmente. .

Fonte: Meyer, 2008.

�� Três mTrês méétodos:todos:

-- RNA RNA antisenseantisense, ,

-- RibozimasRibozimas, ,

-- RNA de interferência (RNA de interferência (quellingquelling))..


�� Vantagens do silenciamento via RNA:Vantagens do silenciamento via RNA:

-- Não considera a eficiência da RecombinaNão considera a eficiência da Recombinaçção homão homóóloga exigida para a loga exigida para a

interrupinterrupçção de genes. ão de genes.

-- Silenciamento Silenciamento éé independente do lindependente do lóócus e mediada por um sinal cus e mediada por um sinal transtrans--atuanteatuante

mmóóvel no citoplasma.vel no citoplasma.

-- Permite flexibilidade nos experimentos de inativaPermite flexibilidade nos experimentos de inativaçção gênica, jão gênica, jáá que induzem a que induzem a

supressão do gene na seqsupressão do gene na seqüüência especência especíífica e não no lfica e não no lóócuscus--especespecíífico.fico.

VantagensMétodos baseados no RNA


�� Vantagens do silenciamento via RNA:Vantagens do silenciamento via RNA:

-- Permite o estudo de expressão gênica em um estPermite o estudo de expressão gênica em um estáágio especgio especíífico do fico do

desenvolvimento ou como o gene afeta diferentes partes do organidesenvolvimento ou como o gene afeta diferentes partes do organismo.smo.

-- Permite a diminuiPermite a diminuiçção da expressão do gene, jão da expressão do gene, jáá que algumas vezes a total que algumas vezes a total

interrupinterrupçção do gene pode ser letal para o fungo.ão do gene pode ser letal para o fungo.

VantagensMétodos baseados no RNA


�� RNA RNA antisenseantisense hibridiza com o RNA alvo, inibindo a traduhibridiza com o RNA alvo, inibindo a traduçção ou ão ou

processamento do processamento do mRNAmRNA alvo.alvo.

RNA antisense

Figura 17. Mecanismo de silenciamento gênico via RNA antisense.



RNA antisense

�� BiPABiPA éé uma uma chaperonachaperona molecular responsmolecular responsáável pelo dobramento da vel pelo dobramento da

proteproteíína na TaumatinaTaumatina..

Chaperona

Figura 18. Cassete de superexpressão do gene bipA.

�� PlasmPlasmíídio dio

pGpdpGpd--BiPBiP--H;H;

�� ProtoplastoProtoplasto..


RNA antisenseChaperona

Figura 19. Northern blot dos transformantes

superexpressando o gene bipA.

Figura 20. Imunoblot com anticorpo

taumatina.

Figura 21. Relação entre secreção de

taumatina e níveis de expressão de bipA.


RNA antisenseChaperona

Figura 22. Um fragmento do gene bipA, na posição antisense.

Figura 23. Correlação entre secreção de

taumatina e níveis de expressão do

antisense bipA.


�� MolMolééculas de RNA com atividade catalculas de RNA com atividade catalíítica, hibridiza com RNA alvo.tica, hibridiza com RNA alvo.

�� SeqSeqüüência especência especíífica de clivagem do RNA alvo.fica de clivagem do RNA alvo.

�� Menor, mais conhecida e mais amplamente usada.Menor, mais conhecida e mais amplamente usada.

Ribozimas

Figura 24. Estrutura de uma

ribozima – Seqüência de

reconhecimento “NHH”, N: A, C,

G ou U e H: C, A ou U.

RibozimaRibozima SubstratoSubstrato

SSíítio de clivagemtio de clivagem


Fonte: Mueller et al., 2006.


Ribozimas

�� TransformaTransformaçção de ão de A. A. giganteusgiganteus via via protoplastoprotoplasto..

ß-glucuronidase

Figura 25. Representação esquemática

do plasmídio.

Gene da ß-glucuronidase de E. coli.


Ribozimasß-glucuronidase

Figura 26. Ensaio in vitro de sete ribozimas com o substrato uidA.


Ribozimasß-glucuronidase

Tabela 6. Determinação in vivo da atividade de GUS após a indução da expressão

da ribozima.


�� A dupla fita de A dupla fita de RNA RNA éé transformadotransformado emem pequenaspequenas molmolééculasculas de de

RNA (RNA (siRNAssiRNAs), ), queque hibridizamhibridizam com o RNA com o RNA alvoalvo e e guiamguiam parapara um um

complexocomplexo de silenciamento (RISC), de silenciamento (RISC), queque degradadegrada o RNA o RNA alvoalvo..

RNAi ou quelling

Figura 27. Modelo de duas vias de

silenciamento de RNA. A) Durante a

fase vegetativa; B) Durante a

meiose.

Fonte: Nakayashiki, 2005.


RNA iPatógeno humano

Figura 28. Representação esquemática da construção do plasmídio.


RNA iPatógeno humano

Figura 29. Análise do fenótipo dos transformantes (a) em meio com glicose

(b) meio com carboximetilcelulose.


Transformação via transposons

�� Duas classes de Duas classes de transposonstransposons

em fungos:em fungos:

--Classe I: elementos Classe I: elementos transpontransponííveisveis

via um RNA intermedivia um RNA intermediáário usando rio usando

uma uma transcriptasetranscriptase reversa.reversa.

--Classe II: elementos Classe II: elementos transpontransponííveisveis

ao nao níível de DNA por excisão de um vel de DNA por excisão de um

ssíítio doador e reintegratio doador e reintegraçção em outro ão em outro

local do genoma.local do genoma.

Figura 30. Classes de transposons.



Figura 31. Vetores para uso em fungos filamentosos.

Fonte: Kempken &

Kuch, 1998.


Figura 32. Representação da transformação de um gene alvo mediada por

transposon.

Fonte: Mullins &

Kang, 2001.


Transposon

�� Mutante com defeitos fisiolMutante com defeitos fisiolóógicos (redugicos (reduçção do crescimento ão do crescimento

micelialmicelial, redu, reduçção da hifa aão da hifa aéérea e alterarea e alteraçção de pigmentaão de pigmentaçção).ão).

�� MutanteMutante nãonão patogênicopatogênico (Rev77), (Rev77), nãonão causacausa lesõeslesões emem folhasfolhas de de

arrozarroz e e cevadacevada..

Mutagênese insercional

TransposonMutagênese insercional

Figura 31. Representação

esquemática de inserção de impalana ORF Rev-77.

Figura 33. Patogenicidade de Rev-77.

Folhas de cevada inoculadas com (a)

selvagem e (b) mutante Rev-77.

Comparação entre os métodos

Tabela 7. Comparação entre os métodos (princípio, vantagens e desvantagens).Método Princípio Vantagens DesvantagensProtoplasto Preparação de protoplasntos usando Uso de diferentes tipos celulares Enzimas líticas alteram a taxa de transformação

enzimas de degradação da parede celular (esporos, hifas) Requer procedimento de regeneraçãoRemoção do DNA é alcançada pela adição Número de cópias de inserções de DNA é altade PEG e CaCl2 Trabalhoso

Biobalística Partículas (tungstenio, ouro) são cobertas com Não necessita de pré-tratmento Requer equipamento especialDNA e aceleradas em alta velocidade para dentroda célula

Agrobacterium Carrega dois vetores (vetor binário contendo o Uso de diferentes tipos celulares (esporos, hifas) Afetada por parametros durante o co-cultivoDNA de interesse entre uma borda de 24 bp e o Número de inserções de DNA é baixa Demanda maior tempovetor T contendo a região de virulência para trans- Permite a integração alvoferência) Simples e eficienteTransferência de DNA é alcançada durante o Alta porcentagem de transformantes com uma co-cultivo entre a bactéria e o fungo única cópia

RNA antisense RNA antisense hibridiza por pareamento Watson- Simples e barato Baixa afinidade ao RNA alvo devido a estrutura Crick para o RNA alvo secundária da molécula antisenseTradução e processamento do mRNA alvo tornan-se inibidos

Ribozimas Pequena molécula catalítica de RNA hibridiza Alta especificidade Trabalhosocom o RNA alvo Difícil predizer o melhor sítio alvoClivagem da sequencia-específica de RNA alvo As vezes baixa atividade

RNAi Dupla fita de RNA é coratada em siRNAs Alta atividade Requer a atividade de complexos de proteínassiRNAs hibridiza com o RNA alvo e guia para um Possível instabilidadecomplexo de silenciamento (RISC) que degrada oRNA alvo

Transposons Silenciamento é baseado na inativação de um gene Simples Ineficiente em vários fungospor integração de um transposon no promotor ou região codificadora




�� A importância dos fungos, aliada aos avanA importância dos fungos, aliada aos avançços despertou o os despertou o

interesse da aplicainteresse da aplicaçção de estratão de estratéégias moleculares para obtengias moleculares para obtençção ão

de fungos transformados geneticamente.de fungos transformados geneticamente.

�� Não hNão háá regra geral entre as estratregra geral entre as estratéégias e as diferentes espgias e as diferentes espéécies cies

de fungosde fungos: necessidade de otimizar cada m: necessidade de otimizar cada méétodo para cada todo para cada

espespéécie de fungo estudada. cie de fungo estudada.

�� A escolha do mA escolha do méétodo depende do objetivo.todo depende do objetivo.



SuperexpressãoSuperexpressão do genedo geneEx: Ex: superexpressãosuperexpressão de protede proteíínas e metabnas e metabóólitoslitos

ProtoplastoProtoplasto BiobalBiobalíísticastica AgrobacteriumAgrobacterium

IntegraIntegraçção ão heterheteróólogaloga(m(múúltiplas cltiplas cóópias)pias)

Atinge Atinge gene de interessegene de interesse por um spor um síítio tio ativo transcricionalmente via ativo transcricionalmente via RecombinaRecombinaçção homão homóólogaloga

ProtoplastoProtoplasto



DownregulaDownregulaççãoão do genedo geneEx: reduEx: reduçção da formaão da formaçção de produtos ou eliminaão de produtos ou eliminaçção de proteão de proteíínas repressorasnas repressoras

ProtoplastoProtoplasto ProtoplastoProtoplastoAgrobacteriumAgrobacterium

Silenciamento gênico via Silenciamento gênico via RNA RNA antisenseantisense ououtecnologia do tecnologia do RNAiRNAi

DeleDeleçção do gene ão do gene ou interrupou interrupçção viaão via

RecombinaRecombinaçção homão homóólogaloga

ParcialParcial(se o gene (se o gene éé essencial)essencial)

CompletaCompleta(se o gene não (se o gene não éé essencial)essencial)

ProtoplastoProtoplasto

Silenciamento gênicoSilenciamento gênicovia via ribozimasribozimas, , transposonstransposons


E-mail: [email protected]

Obrigada

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