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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
ESTRUTURA GENÉTICA DAS POPULAÇÕES DE Leopardus tigrinus
(CARNIVORA, FELIDAE) NO SUL, SUDESTE E CENTRO-OESTE DO
BRASIL INFERIDA PELA ANÁLISE DE MICROSSATÉLITES
Tatiane Campos Trigo
Orientador: Dr. Thales R. O. de Freitas
Co-orientador: Dr. Eduardo Eizirik
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Genética e Biologia
Molecular da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul para a obtenção do Título
de Mestre em Genética e Biologia
Molecular
Porto Alegre
2003
Aos meus pais
“ O homem é o único animal de que tenho medo.
Nunca admirei a coragem dos domadores de leões,
já que, pelo menos enquanto estão dentro da jaula,
estão livres de serem atacados por outros homens.
Os leões não são perigosos pois não têm ideais,
nem religião, nem credo político, nem
cavalheirismo ou preocupações de linhagem. Em
suma, não há motivos para que eles destruam
qualquer coisa que não queiram comer.”
G. Bernard Shaw
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório
de Citogenética do Departamento de Genética
do Instituto de Biociências da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, subvencionado
por: Coordenação de Aperfeiçoamento do
Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação
de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio
Grande do Sul (FAPERGS) e (CNPq).
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS............................................................................................ vi 1. INTRODUÇÃO
1.1 Biologia da Conservação................................................................................ 1 1.2 Genética da Conservação............................................................................... 2
1.2.1 Variabilidade Genética.............................................................................. 2 1.2.2 Análise de Estruturas Familiares e Parentesco......................................... 4 1.2.3 Estrutura Populacional e Filogeografia..................................................... 5 1.2.4 Filogenia................................................................................................... 7
1.3 Marcadores Moleculares................................................................................ 9 1.3.1 Microssatélites.......................................................................................... 9
1.4 Ordem Carnivora............................................................................................ 11 1.5 Família Felidae............................................................................................... 11 1.6 Os Felídeos Neotropicais............................................................................... 14 1.7 O gato-do-mato-pequeno............................................................................... 15 1.8 Estudos Moleculares em Felídeos.................................................................. 18
1.8.1 Padrões Filogenéticos entre os Felídeos da Região Neotropical.............. 18 1.8.2 Variabilidade e Estrutura Genética em Felídeos Neotropicais................. 21
2. OBJETIVOS......................................................................................................... 25 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção de Amostras................................................................................... 26 3.2 Extração de DNA........................................................................................... 31 3.3 Amplificação por PCR “Polymerase Chain Reaction” dos Locos de Microssatélite.......................................................................................................
33
3.4 Determinação dos Alelos e Genótipos dos Indivíduos.................................. 36 3.5 Análise dos Dados.......................................................................................... 37
4. RESULTADOS 4.1 Características dos Locos de Microssatélite Analisados em Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi................................................................................
40
4.2 Estrutura Genética de Leopardus tigrinus..................................................... 50 5. DISCUSSÃO
5.1 Variabilidade Genética, Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de Ligação em Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi..........................................
64
5.2 Reconhecimento de Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi como Unidades Geneticamente Distintas.......................................................................
66
5.3 Considerações sobre os Índices de Diferenciação Genética Fst e Rst........... 72 5.4 Estrutura Genética de Leopardus tigrinus...................................................... 76 5.5 Implicações para a Conservação.................................................................... 80
6. RESUMO E CONCLUSÕES............................................................................... 83 7. SUMMARY AND CONCLUSIONS................................................................... 86 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................. 89 9. ANEXOS.............................................................................................................. 100
AGRADECIMENTOS
Ao professor Thales de Freitas, pela orientação, confiança, paciência e amizade.
Ao Eduardo Eizirik, pela orientação (mesmo à distância), confiança, todos os
ensinamentos, amizade e, principalmente, por ter tornado real meu sonho de trabalhar
com felinos.
Aos colegas e amigos do laboratório: Lígia Tchaicka, Vanessa Andrade, Camila
Castilhos, Vanina Heuser, Adriana Gava, Gabriela Fernandez, Elise Giacomoni, Juliana
da Silva, Leandro Jerusalinsky, Lucas Klassmann, Tarik El Jundi, Gislene Gonçalves,
Juliano Coelho, Pedro Fruet, Paulo Ott, Daniel Prá, Jorge Marinho, Ana Lupe, Priscila
Farinha, Thaís, Thaísa e em especial às novas colegas no estudo dos carnívoros Vanessa
Lipp e Cristine Trinca, por terem tornado os dias de trabalho mais alegres e agradáveis.
À Lígia Tchaicka pela parceria de festas, cursos e preocupações nas disciplinas e
desenvolvimento das técnicas de laboratório, e sobretudo por ter se tornado uma grande
amiga.
Aos professores do Departamento de Genética, por toda contribuição e
ensinamentos.
Ao Elmo, Helen, Lucia Andréa, por toda ajuda na resolução de vários problemas
do dia-a-dia.
À Rose e ao Luciano, por todo o trabalho no laboratório indispensável para a
realização deste estudo e por todas as conversas divertidas.
À minha irmã Cariane Trigo e as grandes amigas Ana Paula Serafim, Aniele
Giacomini, Ana Paula Brandt e Aline Lorenz, por agüentarem meu mau-humor, minhas
constantes reclamações das “análises”, total paciência e todas as ajudas prestadas (em
todos os assuntos!).
vi
À Cibele Indrusiak, por toda atenção, ensinamentos, ajuda na coleta de amostras,
amizade e por ser um exemplo de pesquisadora na área de carnívoros.
Ao Jan Mähler, Dênis Sana, Flávio Rodrigues, Paulo Ott, Edson Salomão, Tiago
Breier, Juliana da Silva, Fernanda Bittencourt, Lauren Veronese, Fernanda Trierveiler,
Márcio Martins, Cariane Trigo, Miguel Andrade, Adriano Scherer, Lázaro Cabral,
Sônia Cechin, Lúcia Olímpio e Kuriakin Toscan pela ajuda na coleta das amostras
utilizadas neste estudo.
À Associação Mata Ciliar / Plano de Manejo de Felinos Brasileiros, pela coleta
de grande parte das amostras de Leopardus tigrinus provenientes de cativeiro.
À CAPES, CNPq e FAPERGs pelo apoio financeiro.
Aos meus pais Vilmarina e Constantino Campos Trigo e à minha tia Mara, por
todo o amor, dedicação e confiança depositadas em mim durante toda minha vida e por
serem responsáveis pela pessoa que sou hoje.
Ao Ziggy, Misha, Manu, Kinder, Malani, Tibot e aos que já se foram mas jamais
serão esquecidos Simba, Mâli, Nala e Kali, por terem sido sempre meus companheiros,
motivos de alegria e meus consolos nos momentos mais difíceis, e a todos felinos,
selvagens ou não, simplesmente por existirem!
vii
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Biologia da Conservação
O crescimento populacional humano, contínuo e desenfreado, vem provocando
uma enorme crise da biodiversidade, com a devastação de milhares de comunidades
biológicas que levaram milhões de anos para se desenvolver. Inúmeras são as
transformações de sistemas naturais diretamente relacionadas à atividade humana, como
a diminuição da distribuição e densidade de muitas espécies devido à caça predatória,
destruição de habitats e ação de predadores e competidores introduzidos pelo homem. A
partir destas ameaças surge a necessidade de se fazer algo para impedir esta destruição,
concentrando esforços para se salvar espécies e ambientes degradados.
A Biologia da Conservação constitui uma ciência multidisciplinar desenvolvida
como resposta à crise com a qual a diversidade biológica se confronta atualmente.
Como uma ciência multidisciplinar, engloba uma variedade de disciplinas como a
Antropologia, Ecologia, Biologia Evolutiva, Genética, Legislação e Política Ambiental,
que geram, em conjunto, informações aplicadas para o manejo dos recursos naturais
(PRIMACK & RODRIGUES, 2001).
A diversidade biológica é o ponto central da Biologia da Conservação. Podemos
reconhecer três níveis principais de diversidade biológica: a diversidade em nível de
espécies, de variação genética e de variação entre as comunidades (PRIMACK &
RODRIGUES, 2001). Todos estes níveis estão inteiramente interligados, sendo que a
alteração da diversidade em um deles provavelmente afetará a dos outros. Para fins de
conservação, é necessário que todos estes níveis sejam estudados para que recebam a
proteção adequada.
2
1.2. Genética da Conservação
Preocupações com a conservação da biodiversidade representam também a
conservação da diversidade genética (AVISE, 1994). A Genética da Conservação é a
disciplina que tem como objetivos o estudo e a preservação desta diversidade, assim
como dos processos evolutivos atuantes sobre as populações naturais e dos ambientes
nos quais estes processos que nutrem a diversidade biológica sejam mantidos
(SCHONEWALD-COX et al., 1983; AVISE, 1994).
A diversidade genética apresenta-se extremamente importante para a evolução e
viabilidade a longo prazo das populações. Além disso, ela pode ser utilizada como
instrumento de investigação por ecólogos e sistematas para verificar as afinidades e os
limites entre as espécies através da filogenia, detectar modos de reprodução e estrutura
familiar e definir estruturas populacionais, estimando níveis de migração e dispersão nas
populações (AVISE, 1994).
1.2.1 Variabilidade Genética
A variabilidade genética é a matéria-prima da evolução, é através dela que a
seleção natural atua gerando novas formas adaptativas (DOBZHANSKY et al., 1977).
Desta maneira, altos níveis desta variabilidade serão, geralmente, importantes para a
viabilidade das populações por apresentarem uma maior amplitude de possibilidades
onde a seleção natural possa agir, gerando um maior número de adaptações e assim
tendendo a aumentar a probabilidade de sobrevivência destas populações ao longo do
tempo evolutivo e ecológico (AVISE, 1994).
Como todos os níveis de diversidade - genética, espécies e comunidades - estão
interligados, se a variabilidade genética é importante para a viabilidade das populações,
3
também será para os níveis mais altos de biodiversidade dos quais estas populações são
componentes funcionais.
A deriva genética – flutuação ao acaso das freqüências alélicas entre gerações - e
o endocruzamento – cruzamento entre aparentados - constituem dois processos de
fundamental importância dentro da Genética da Conservação, pois podem provocar a
perda da variabilidade genética principalmente em populações isoladas e de tamanho
reduzido (LACY, 1997; AMOS & BALMFORD, 2001). Além disso, o excesso de
endocruzamento dentro de uma população pode levar ao fenômeno da Depressão
Endogâmica.
Diversos mecanismos na natureza evitam a endogamia na maioria das
populações selvagens, no entanto quando a densidade demográfica é baixa e nenhum
outro acasalamento é possível, estes mecanismos podem falhar. O desenvolvimento
contínuo de eventos de endogamia pode levar à depressão endogâmica, que expressa
coletivamente os vários impactos no valor adaptativo das espécies provocados pelo
endocruzamento (KELLER & WALLER, 2002). Ao provocar um acréscimo no número de
homozigotos dentro de uma população, o endocruzamento pode levar a um aumento da
exposição de alelos deletérios recessivos em homozigose, que pode ser o responsável
pelos impactos surgidos no valor adaptativo das espécies ou populações, juntamente
com a existência de uma vantagem adaptativa dos heterozigotos sobre os homozigotos
(AMOS & BALMFORD, 2001; KELLER & WALLER, 2002).
Vários são os impactos conhecidos no valor adaptativo das espécies provocados
pelo endocruzamento, como altas taxas de mortalidade, baixa fecundidade, reduzida
habilidade de acasalamento, crescimento lento, instabilidade no desenvolvimento e
4
grande suscetibilidade a doenças (ver por exemplo LACY, 1997; CRNOKRAK & ROFF,
1999; KELLER & WALLER, 2002).
Muitas espécies selvagens estudadas, que sofreram reduções populacionais
drásticas, naturais ou provocadas pelo homem, revelaram uma acentuada perda da
variabilidade genética associada a efeitos negativos em seu valor adaptativo. Casos
clássicos incluem o guepardo Acinonyx jubatus (O’BRIEN et al., 1983; O’BRIEN et al.,
1985; O’BRIEN et al., 1986), o Puma da Flórida Puma concolor coryi (BARONE et al.,
1994), uma população isolada de leões africanos Panthera leo leo e a única população
remanescente de leões asiáticos Panthera leo persica (O’BRIEN et al., 1987; WILDT et
al., 1987).
Tendo em vista a importância da diversidade genética para as populações e as
possíveis conseqüências de alterações em seus padrões naturais, os estudos genéticos
nesta área envolvem, principalmente, a caracterização dos níveis de variabilidade
genética dentro das populações e espécies, e a identificação de como as atividades
humanas estão afetando estes níveis (como exemplos NADER et al. 1998; SUCHENTRUNK
et al., 1999; GRATIVOL et al., 2001; LU et al., 2001; DALLAS et al. 2002; ÚJVÁRI et al.,
2002).
1.2.2 Análise de Estruturas Familiares e Parentesco
Estudos das relações de parentesco, estruturas sociais e sistemas de
acasalamento pela análise de marcadores moleculares, freqüentemente, geram
informações preciosas sobre a biologia e história natural das espécies (AVISE, 1994).
Os estudos moleculares podem auxiliar no esclarecimento de vários aspectos da
biologia reprodutiva das espécies, como a definição do sucesso reprodutivo em machos
5
e fêmeas e dos sistemas e estratégias de acasalamento (como exemplos CONRAD et al.,
2001; CONSTABLE et al. 2001; DAVIS et al., 2001; GARNIER et al., 2001).
A definição de estruturas sociais e familiares, bem como de padrões de migração
sexo-específico e comportamento migratório, também pode ser realizada pela análise de
marcadores moleculares. Estudos genéticos, por exemplo, permitiram verificar que
várias espécies de cetáceos (BAKER & PALUMBI, 1996), tartarugas marinhas (BOWEN &
AVISE, 1996) e inúmeras aves (HAIG & AVISE, 1996), de difícil acompanhamento na
natureza, apresentam comportamento migratório com fidelidade à região natal –
filopatria e, freqüentemente, se mantêm agrupadas em estruturas familiares muito
fechadas com pouco intercâmbio entre grupos.
A definição exata destes aspectos biológicos, é de fundamental importância na
elaboração de programas de manejo, principalmente reprodutivos, para as espécies tanto
em cativeiro quanto em ambiente selvagem (AVISE, 1994).
1.2.3 Estrutura Populacional e Filogeografia
O estudo das estruturas populacionais por marcadores moleculares, talvez seja a
parte mais importante da Genética da Conservação.
As populações naturais geralmente não mantêm panmixia, ou seja, a
probabilidade de reprodução entre dois indivíduos quaisquer não é sempre a mesma,
dependendo de fatores biológicos e geográficos. Esta ausência de panmixia,
freqüentemente, determina uma variabilidade genética não uniformemente distribuída
ao longo de toda a área de uma espécie. Os fatores que limitam a panmixia incluem a
pequena capacidade de deslocamento dos adultos, seleção de habitat com fidelidade
natal – filopatria , cruzamento com escolha de parceiro, distância e barreiras geográficas
(WRIGHT, 1978).
6
Um dos principais aspectos nos estudos de estruturas populacionais constitui a
determinação dos níveis de fluxo gênico entre as populações, pois este é o maior
componente da estrutura populacional, determinando a extensão a qual cada população
local de uma espécie é uma unidade geneticamente diferenciada (SLATKIN, 1994).
Os padrões históricos da distribuição geográfica da diversidade genética, e dos
princípios e processos governantes desta, são definidos através dos estudos
filogeográficos. A filogeografia constitui uma disciplina interativa que une dados da
genética molecular, genética de populações, demografia e geografia histórica, a fim de
delimitar a história evolutiva das linhagens genealógicas, especialmente ao nível intra-
específico (AVISE, 1998; BERMINGHAM & MORITZ, 1998; AVISE, 2000).
O acesso à distribuição geográfica da variabilidade genética dentro de cada
espécie assume central importância em programas de manejo e conservação, pois
permite a identificação de áreas geográficas com restrita troca de indivíduos que
reflitam linhagens evolutivamente independentes, além da identificação de áreas
prioritárias para o monitoramento, manejo e proteção (AVISE, 1994; MORITZ & FAITH,
1998; TAYLOR & DIZON, 1999).
A partir de estudos de filogeografia e estrutura populacional podemos identificar
dentro de cada espécie dois tipos de linhagens evolutivas para fins de manejo: as
Unidades Evolutivamente Significativas (UES) e as Unidades de Manejo (UM).
As UES consistem de populações substancialmente isoladas reprodutivamente
de outros grupos co-específicos e representam, assim, um importante componente da
herança evolutiva de uma espécie (MORITZ, 1994; EIZIRIK, 1996; KING & BURKE,
1999). As UES são caracterizadas por populações, dentro de uma espécie, formando
agrupamentos monofiléticos recíprocos para seqüências de DNA mitocondrial (DNAmt)
e/ou demonstrando divergências significativas nas freqüências alélicas em locos
7
nucleares, em conseqüência a um isolamento demográfico histórico (MORITZ, 1994). No
contexto da biologia da conservação, acredita-se que cada UES deva ser protegida e
manejada de forma independente, na intenção de manter os processos evolutivos
identificados para a espécie em questão (MORITZ, 1994; EIZIRIK 1996).
As UM representam um nível de unidade de conservação abaixo das UES,
consistindo de populações regionais com restrita conexão demográfica entre si,
reconhecidas por divergências significativas nas freqüências alélicas, mitocondriais ou
nucleares, não importando a diferenciação filogenética dos alelos. O foco das UM reside
mais na estruturação contemporânea da população do que em fatores históricos
(MORITZ, 1994).
A aplicação destes conceitos em programas de conservação de espécies é
direcionada na intenção de se preservar os padrões históricos de diferenciação das
populações que podem, por sua vez, representar padrões de adaptações ecológicas locais
(DIMMICK et al., 2001).
Vários tem sido os estudos realizados na busca da definição de estruturas
populacionais, níveis de fluxo gênico e identificação de linhagens evolutivas com fins
de auxiliar no manejo de espécies ameaçadas como, por exemplo, no peixe-boi marinho
Trichechus manatus (GARCIA-RODRIGUEZ et al., 1998), no lobo cinza Canis lupus
(VILÀ et al., 1999), na jaguatirica Leopardus pardalis e no gato-maracajá Leopardus
wiedii (EIZIRIK et al., 1998) e na onça pintada Panthera onca (EIZIRIK et al., 2001).
1.2.4 Filogenia
Os dados moleculares combinados com descrições morfológicas provêm uma
chave para a classificação biológica ou taxonômica. Para espécies ameaçadas, estes
avanços são criticamente importantes, pois o reconhecimento das categorias
8
sistemáticas - subespécies, espécies, gêneros, família - suportam a base para a legislação
de proteção (O’BRIEN, 1994). A incapacidade de distinguir claramente estas categorias
retarda os esforços de preservação, dificultando a elaboração de leis eficazes para sua
proteção (O´BRIEN & MAYR, 1991).
Os estudos filogenéticos, além de importantes para a identificação das categorias
taxonômicas, podem ser utilizados na definição de hierarquias de prioridade para a
conservação de espécies ameaçadas, que envolvem, normalmente a distinção
taxonômica ou a profundidade da divergência filogenética. Espécies sem parentes
próximos, por exemplo, com uma divergência extremamente antiga de grupos
aparentados, têm maior prioridade na conservação do que espécies recentes e
proximamente relacionadas a outros táxons (O´BRIEN & MAYR, 1991).
A diversidade filogenética também pode ser utilizada como auxiliar na
identificação de áreas prioritárias para a conservação da biodiversidade, que envolve
muitas vezes, o máximo de informação taxonômica possível, como riqueza e padrões de
distribuição de táxons, grau de endemismos e complementariedade taxonômica entre
áreas (POSADAS et al., 2001; RODRIGUES & GASTON, 2002).
Além de todas estas contribuições à Genética da Conservação, a análise
filogenética pode revelar eventos de hibridação e introgressão entre espécies selvagens,
como no caso do lobo cinza Canis lupus e do coiote Canis latrans (WAYNE, 1996) e
entre espécies exóticas com selvagens, como lobos cinzas com cães domésticos (RANDI
& LUCCHINI, 2002) ou gatos selvagens com gatos domésticos (BEAUMONT et al., 2000).
9
1.3 Marcadores Moleculares
Os dados básicos para os estudos em Genética da Conservação constituem,
geralmente, os chamados marcadores moleculares. É através destes marcadores que
podemos avaliar a variabilidade genética existente nas populações e espécies.
A genética molecular tem proporcionado numerosas técnicas de acesso à
variabilidade dentro e entre populações, tanto através de polimorfismos de proteínas
quanto de DNA (AVISE, 1994).
Os polimorfismos de DNA têm sido analisados principalmente através de genes
do DNAmt e Microssatélites. O DNAmt constitui um sistema matrilinear na maioria das
espécies, sem recombinação intermolecular, apresentando altas taxas evolutivas, e por
isso tem sido muito utilizado em estudos de diversidade genética e padrões
filogeográficos (AVISE, 1998). No entanto, devido a sua herança uniparental, este
marcador tende a não revelar os padrões genealógicos representativos da população
como um todo (HARE, 2001).
1.3.1 Microssatélites
Dentre os marcadores moleculares mais utilizados ultimamente em estudos de
diversidade genética e estrutura populacional, encontram-se os Microssatélites que estão
incluídos dentro das seqüências de DNA nuclear denominadas de SSRs “Simple
Sequence Repeats”, (KASHI et al., 1997) ou VNTRs “Variable Number of Tandem
Repeats” (MURRAY, 1996). Estas seqüências consistem de segmentos de DNA com um
número variável de unidades repetitivas organizadas lado a lado, e se dividem em duas
categorias de acordo com o tamanho destas unidades: (1) Minissatélites, apresentando
10
repetições de 15-70 pares de base e (2) Microssatélites, com repetições que variam de 1
a 6 pares de base (MURRAY, 1996).
Os microssatélites apresentam-se como locos altamente polimórficos, com alelos
codominantes, encontrando-se amplamente dispersos em genomas eucarióticos e
podendo ocorrer também em genomas procarióticos sob baixas freqüências
(SCHLOTTERER, 1998). As mutações que ocorrem nestes marcadores são,
principalmente, mudanças no número de repetições, causadas por erros de pareamento
devido ao deslizamento das fitas no momento da replicação. Estes erros são
responsáveis pela adição ou deleção de repetições que conferem o caráter altamente
polimórfico destes locos (SCHLOTTERER, 1998).
Além do alto nível de polimorfismo e alta taxa de mutação, estes locos
geralmente apresentam-se seletivamente neutros, sendo assim compatíveis com vários
dos pressupostos usualmente utilizados em genética de populações (MURRAY, 1996).
Por apresentarem alelos menores do que 1Kb, permitem a utilização de DNA altamente
fragmentado ou em pequenas quantidades, inclusive obtido a partir de amostras antigas
(BRUFORD & WAYNE, 1993).
As características apresentadas por estes locos permitem sua utilização em uma
ampla variedade de estudos, como na identificação de indivíduos ou espécies (ERNEST,
et al., 2000), na comparação da variabilidade genética entre espécies e populações
(MENOTTI-RAYMOND & O’BRIEN, 1995; JOHNSON et al., 1999), no grau de estrutura das
populações e migração (CIOFI & BRUFORD, 1999; WAITS et al., 2000) e na
determinação de parentesco e estruturas sociais (MORIN et al., 1994; NESJE et al., 2000).
11
1.4 A Ordem Carnivora
A ordem Carnivora inclui táxons extremamente heterogêneos que variam
consideravelmente em tamanho, dieta e especializações locomotoras. Tal amplo alcance
de adaptações tem levado a vários exemplos de paralelismo e convergência na evolução
de características morfológicas, os quais têm dificultado os esforços dos taxonomistas
em relacionar certos grupos (WAYNE et al., 1989). Uma das classificações mais aceita
divide os carnívoros em duas grandes superfamílias: os Arctoidea ou Canoidea com as
famílias Canidae, Ursidae, Procyonidae, Mustelidae, Phocidae, Odobenidae e Otaridae,
e os Aeluroidea ou Feloidea com as famílias Viverridae, Herpestidae, Hyaenidae e
Felidae (WOZENCRAFT, 1993).
Uma das principais características de seus integrantes refere-se à adaptação
morfológica dos dentes ao hábito carnívoro: os dentes caninos são fortes, encurvados e
bastante desenvolvidos e os pré-molares e molares são usualmente adaptados para
cortar, sendo o último pré-molar superior e o primeiro molar inferior denominados
carniceiros (NOWAK, 1999).
Os Carnívoros apresentam um papel importante na estrutura de comunidades,
controlando a abundância relativa de suas presas, sendo que a remoção de um carnívoro
topo pode provocar um desequilíbrio ecológico dentro de uma guilda ou ecossistema
(EISENBERG, 1989).
1.5 Família Felidae
Os felídeos são exímios predadores, apresentando várias especializações em sua
forma, estrutura e comportamento que refletem seu hábito estritamente carnívoro
(KITCHENER, 1991). Dentro da Ordem Carnivora representam o maior desenvolvimento
dos carniceiros, assim como a maior redução dentária (NOWAK, 1999) em reflexo a uma
12
dieta constituída quase exclusivamente de carne (EISENBERG & REDFORD, 1999). Os
sentidos são aguçados para detectar a presa, com um grande desenvolvimento do olfato,
da audição e de olhos especializados para visão binocular (KITCHENER, 1991). Com
exceção do guepardo Acinonyx jubatus que é um caçador corredor por curtas distâncias,
os felídeos são especializados em camuflagem e um rápido avanço sobre a presa
(EISENBERG, 1989). Apresentam garras retratéis que ficam protegidas do desgaste,
sendo mantidas sempre afiadas para o momento da captura (KITCHENER, 1991; NOWAK,
1999).
A maioria de seus integrantes é noturna, mas com alguns ativos principalmente
durante o dia (OLIVEIRA, 1994; NOWAK, 1999). Com exceção dos leões e guepardos,
todas as demais espécies de felídeos, para as quais há dados disponíveis, são solitárias
(SANDELL, 1989). A mais comum unidade social é formada pela mãe e sua prole semi-
dependente (KITCHENER, 1991; EISENBERG & REDFORD, 1999).
Mesmo sendo solitários os felídeos apresentam-se políginos ou até promíscuos
(KITCHENER, 1991). A poliginia é mantida indiretamente pela defesa de uma área
exclusiva, pelo macho, que geralmente compreende a área de duas ou mais fêmeas
(KITCHENER, 1991; OLIVEIRA, 1994).
Toda a evolução dos felídeos verdadeiros e de seus ancestrais foi marcada por
uma grande quantidade de extinções e eventos de convergência e paralelismo que
levavam a novas formas extremamente semelhantes às já extintas (MARTIN, 1989). As
primeiras formas semelhantes aos felídeos eram gatos-dente-de-sabre, incluídos na
família Nimravidea, surgidos há cerca de 35 milhões de anos (KITCHENER, 1991), que já
apresentavam a maioria das adaptações básicas encontradas nos felídeos atuais, como
garras retráteis, dentes carniceiros, e caninos bem desenvolvidos (MARTIN, 1989). Os
13
primeiros gatos verdadeiros apareceram no Oligoceno na América do Norte, Eurásia e
mais tarde na África (MARTIN, 1989; EISENBERG & REDFORD, 1999).
A Família Felidae encontra-se distribuída por todo o planeta, à exceção dos
pólos, Austrália, Nova Zelândia, Madagascar e certas ilhas da Australásia e do Caribe
(NOWAK, 1999). WOZENCRAFT (1993), reconhece três sub-famílias, 18 gêneros e 36
espécies dentro da família. No entanto, há uma grande diversidade de opiniões de como
os gatos devam ser classificados, principalmente, ao nível de subfamílias e gêneros (ver
NOWAK, 1999).
Os felídeos têm sido parte do ambiente, cultura e mitologia humana há milhões
de anos (NOWELL & JACKSON, 1996). No entanto, esta família vem sofrendo inúmeras
ameaças à sua sobrevivência, o que tornou muitas de suas espécies e subespécies raras
ou ameaçadas em pelo menos parte de suas distribuições. O principal fator afetando o
“status” da vida selvagem hoje, incluindo a maioria das espécies de felídeos, constitui a
alteração e fragmentação de seus habitats naturais devido à atividade humana (JACKSON,
1992; NOWELL & JACKSON, 1996). Além da destruição de habitats, os felídeos vêm
sofrendo sérias ameaças devido ao comércio ilegal de peles, à caça esportiva, à
perseguição direta devido a conflitos com produtores rurais, e até mesmo à caça para
obtenção de partes de seus corpos com supostos fins medicinais (NOWELL & JACKSON,
1996; NOWAK, 1999).
Juntamente com todos estes fatores, há ainda, um conhecimento muito limitado
sobre a distribuição, biologia e comportamento de quase todas as espécies de felídeos,
dificultando o planejamento e implementação de medidas efetivas de conservação
(NOWELL & JACKSON, 1996).
14
1.6 Os Felídeos Neotropicais
Dentro da região zoogeográfica Neotropical, que se estende desde o sul da
América do Norte até o extremo sul da América do Sul (EMMONS & FEER, 1997),
podemos encontrar, atualmente, dez espécies de felídeos: a onça Panthera onca, o puma
Puma concolor, o jaguarundi Herpailurus yagouaroundi, a jaguatirica Leopardus
pardalis, o gato-maracajá Leopardus wiedii, o gato-do-mato-pequeno Leopardus
tigrinus, o gato-do-mato-grande Oncifelis geoffroyi, o güiña Oncifelis guigna, o gato-
palheiro Lynchailurus colocolo e o gato-andino Oreailurus jacobita.
Apenas o güiña e o gato-andino não ocorrem em território brasileiro, sendo
espécies raras e de distribuição restrita, sendo a primeira encontrada nas partes sul e
central do Chile e a segunda nas regiões dos Andes no sul do Peru, no centro e oeste da
Bolívia, noroeste da Argentina e nordeste do Chile (OLIVEIRA, 1994).
A onça é o maior felídeo das Américas e o único representante atual do gênero
Panthera no Novo Mundo (NOWELL & JACKSON, 1996). A distribuição geográfica da
espécie é extremamente similar a da jaguatirica, maracajá, gato-do-mato-pequeno e
jaguarundi, compreendendo desde as planícies costeiras do México até o norte da
Argentina. As cinco espécies mencionadas, parecem ter fortes preferências por áreas
florestadas a áreas de vegetações mais abertas (OLIVEIRA, 1994; NOWELL & JACKSON,
1996; EISENBERG & REDFORD, 1999).
O puma constitui a segunda maior espécie de felídeo do Brasil (OLIVEIRA &
CASSARO, 1999). A espécie possui a maior distribuição latitudinal dentre todas as
espécies de felídeos selvagens, sendo encontrada em todos os tipos de habitats do
Canadá até a Patagônia (KITCHENER, 1991).
O gato-palheiro e o gato-do-mato-grande são espécies de pequeno porte que
ocorrem nas regiões mais ao sul da América do Sul e parecem ser características de
15
regiões mais abertas de campos, savanas e florestas secas. O gato-palheiro encontra-se
desde o sul da Patagônia, através da Argentina, Uruguai, Paraguai, sul e oeste da
Bolívia, Peru, Equador e sul, sudoeste e centro do Brasil. Já o gato-do-mato-grande
ocorre desde a Bolívia, Argentina, Paraguai, Uruguai e sul do Brasil (KITCHENER, 1991;
NOWELL & JACKSON, 1996; EISENBERG & REDFORD, 1999).
1.7 O gato-do-mato-pequeno
O gato-do-mato-pequeno Leopardus tigrinus é a menor espécie de felídeo do
Brasil, tendo porte e proporções corporais semelhantes às do gato doméstico, com
comprimento médio total de 75,5 cm e peso variando de 1,75 a 3,5 kg (OLIVEIRA &
CASSARO, 1999). A coloração da pelagem é castanho-amarelada com manchas amplas e
escuras formando rosetas, podendo ocorrer indivíduos melânicos (EISENBERG &
REDFORD, 1999) (Figura 1).
Acredita-se que a espécie ocupe predominantemente áreas de floresta úmida
tropical e sub-tropical (NOWAK, 1999), no entanto, existem registros nos mais variados
ambientes, incluindo florestas subtropicais e decíduas, cerrados, florestas secundárias,
plantações abandonadas de eucaliptos, áreas próximas a plantações e altamente afetadas
por desmatamentos (OLIVEIRA, 1994; NOWELL & JACKSON, 1996; OLIVEIRA &
CASSARO, 1999).
A espécie distribui-se por uma área bastante extensa, ocorrendo desde a Costa
Rica até o sul do Brasil e nordeste da Argentina (OLIVEIRA, 1994; NOWELL & JACKSON,
1996; EISENBERG & REDFORD, 1999) (Figura 2). No entanto, esta distribuição, não está
completamente definida e parece não ser contínua, principalmente pela falta de
evidências da sua ocorrência na região da Bacia Amazônica (NOWELL & JACKSON,
1996).
16
Nas décadas de 1970 e 1980, o gato-do-mato-pequeno foi extremamente
perseguido para o comércio internacional de peles. Juntamente com o gato-do-mato-
grande, esta espécie alcançou a posição de liderança entre os felídeos neotropicais
capturados para este comércio (OLIVEIRA, 1994). Atualmente, a espécie encontra-se
bastante ameaçada devido principalmente à destruição de seus habitats, sendo
considerada “vulnerável” pela IUCN “União Internacional de Conservação da
Natureza” e constando do Apêndice I - espécies ameaçadas -, da CITES “Convenção
sobre o Comércio Internacional das Espécies Ameaçadas da Fauna e Flora Selvagem”
(WOZENCRAFT, 1993). Além destes fatores, o gato-mato-pequeno, é, hoje, uma das
espécies de felídeos neotropicais mais desconhecidas, pouco se sabendo sobre seus
hábitos na natureza, densidade, relações com outras espécies e requerimento de habitats
(NOWELL & JACKSON, 1996).
Devido a estes fatores, a compreensão de sua variabilidade e estrutura genética
na natureza é fundamental para se auxiliar na definição de áreas prioritárias e estratégias
adequadas para sua conservação em vida selvagem, e também para embasar a seleção de
indivíduos em projetos de reprodução em cativeiro.
17
Figura 1 – Leopardus tigrinus (Schereber, 1775). Foto: Tadeu G. de Oliveira. Fonte: OLIVEIRA & CASSARO (1999).
Figura 2 - Distribuição geográfica de Leopardus tigrinus. A área vermelha representa a distribuição da espécie. Modificado a partir de OLIVEIRA (1994) e EISENBERG & REDFORD (1999) .
18
1.8 Estudos Moleculares em Felídeos
1.8.1 Padrões Filogenéticos entre os Felídeos da Região Neotropical
A definição das relações evolutivas entre as espécies é um componente integral
dos programas de conservação da Família Felidae (O´BRIEN, 1994).
A classificação sistemática e evolutiva dos felídeos a partir de critérios
morfológicos e comportamentais produz classificações amplamente diferenciadas, visto
que grande parte destes critérios estão relacionados a função de captura de presas
resultando em uma grande similaridade entre todos os gatos (KITCHENER, 1991). No
entanto, o desenvolvimento de técnicas moleculares e celulares tem contribuído muito
para o esclarecimento de suas relações filogenéticas.
Estudos moleculares recentes usando citogenética (WURSTER-HILL &
CENTERWALL, 1982), distâncias imunológicas (COLLIER E O’BRIEN, 1985), hibridização
DNA-DNA (WAYNE et al., 1989), aloenzimas (PECON-SLATERRY et al., 1994),
DNAmtRFLPs (JOHNSON et al., 1996) e seqüenciamento de genes mitocondriais
(MASUDA et al., 1996), indicaram a existência de pelo menos três linhagens maiores
dentro da família Felidae. Estas linhagens seriam formadas por: 1) Linhagem da
jaguatirica, incluindo os pequenos felídeos da Região Neotropical; 2) Linhagem do gato
doméstico, com os pequenos felídeos da Região Mediterrânea e 3) Linhagem dos
panteríneos, consistindo de um grupo heterogêneo de felídeos de médio e grande porte,
incluindo o gênero Panthera. Posteriormente, a linhagem dos panteríneos foi
subdividida em seis linhagens diferentes (JOHNSON & O’BRIEN, 1997; PECON-
SLATERRY & O’BRIEN, 1998; MATTERN & MCLENNAN, 2000).
A linhagem da jaguatirica compreende sete das dez espécies de felídeos da
Região Neotropical: Leopardus pardalis, Leopardus wiedii, Leopardus tigrinus,
19
Lynchailurus colocolo, Oncifelis geoffroyi, Oncifelis guigna e Oreailurus jacobita. As
relações filogenéticas entre os integrantes desta linhagem apoiam o agrupamento de L.
pardalis-L. wiedii-O. jacobita e O. guigna-O. geoffroyi (MASUDA et al., 1996; JOHNSON
et al., 1998, 1999). As evidências moleculares mais recentes (JOHNSON et al. 1998,
1999) apoiam o posicionamento filogenético de L. tigrinus como espécie-irmã do par
guigna-geoffroyi. Algumas análises posicionaram L. tigrinus como espécie-irmã de O.
colocolo, mas mesmo estas indicaram que este par estaria mais proximamente
relacionado ao sub-grupo guigna-geoffroyi do que ao pardalis-wiedii-jacobita
(MATTERN & MCLENNAN, 2000).
O mais recente ancestral comum entre os pequenos felídeos da América do Sul,
segundo dados moleculares, deve ter ocorrido a 5,10 milhões de anos (JOHNSON &
O’BRIEN, 1997), seguido de diferenciação há 2-5 milhões de anos (JOHNSON et al.,
1996). As evidências biogeográficas são condizentes às relações moleculares
observadas entre os integrantes desta linhagem, sendo os períodos de diferenciação das
espécies segundo datações moleculares coincidentes com a formação do Istmo do
Panamá há 3-5 milhões de anos, o qual permitiu a troca de faunas entre as Américas do
Sul e do Norte até então isoladas (MARTIN, 1989). Provavelmente, um ancestral dos
pequenos felídeos sul-americanos tenha migrado da América do Norte durante e após a
formação do Istmo para a América do Sul, dando origem às espécies atuais (JOHNSON et
al., 1996; JOHSON & O’BRIEN, 1997).
Estudos citogenéticos comparativos oferecem, também, fortes evidências para o
agrupamento desta linhagem, tendo seus integrantes um número diplóide de 36
cromossomos em contraste com todos os outros felídeos, com um número diplóide de
38 (WURSTER-HILL & CENTERWALL, 1982).
20
As outras três espécies restantes da Região Neotropical estão incluídas em dois
grupos monofiléticos distintos.
A onça encontra-se dentro da linhagem Panthera que é composta pelas cinco
espécies do gênero Panthera (P. leo, P. pardus, P. tigris, P. onca e P. uncia) e pelo
leopardo nebuloso Neofelis nebulosa. O grupo, segundo estimativas baseadas em
seqüências de genes mitocondriais (JOHNSON & O’BRIEN, 1997), compartilha um
ancestral comum que divergiu dos outros felídeos modernos há 6,0 milhões de anos. A
primeira espécie a divergir parece ter sido o leopardo nebuloso seguido do leopardo da
neve P. uncia, no entanto a resolução das outras quatro espécies do gênero Panthera
permanece mal-resolvida, provavelmente devido a uma recente divergência a 2-3
milhões de anos (JOHNSON & O’BRIEN, 1997; KIM et al., 2001).
O puma Puma concolor e o jaguarundi Herpailurus yaguaroundi encontram-se
dentro do mesmo grupo monofilético, juntamente com o guepardo Acinonyx jubatus,
tendo este se diferenciado dos outros felídeos modernos há cerca de 8,2 milhões de anos
(JOHNSON et al., 1997). Análises recentes baseadas exclusiva ou parcialmente em dados
moleculares indicam que o puma e o jaguarundi são espécies-irmãs, sendo o guepardo a
divergência mais basal neste grupo (JOHNSON & O’BRIEN 1997; MATTERN &
MCLENNAN, 2000).
Várias relações entre os integrantes da família Felidae ainda permanecem não
resolvidas, como as relações hierárquicas entre os oito grupos atualmente definidos. As
relações filogenéticas em Felidae são difíceis de se esclarecer devido a um grande
número de autapomorfias e simplesiomorfias, padrão típico de grupos que sofreram uma
diversificação relativamente rápida e recente em sua história evolutiva (MATTERN &
MCLENNAN, 2000).
21
1.8.2 Variabilidade e Estrutura Genética em Felídeos Neotropicais
Vários estudos moleculares têm sido realizados com o intuito de analisar os
níveis de variabilidade genética e padrões filogeográficos nas espécies de felídeos
neotropicais. Com, exceção do jaguarundi H. yagouaroundi, todas as outras nove
espécies apresentam estudos neste sentido.
EIZIRIK et al. (1998), através do sequenciamento da região controladora do
DNAmt, analisou os níveis de variabilidade genética e padrões filogeográficos de L.
pardalis e L. wiedii ao longo de suas distribuições geográficas. Ambas as espécies
apresentaram altos níveis de diversidade genética e evidentes partições geográficas
semelhantes. As subdivisões geográficas encontradas para as duas espécies foram
basicamente concordantes, com o reconhecimento de três grupos maiores: América
Central, Norte da América do Sul e Sul da América do Sul, sendo os dois últimos
provavelmente isolados pelo Rio Amazonas. Foram, também, identificadas
diferenciações mais discretas dentro de alguns dos grandes grupos para cada uma das
espécies, provavelmente refletindo padrões históricos de isolamento pela distância.
Os três grupos maiores para cada espécie puderam claramente ser considerados
como Unidades Evolutivamente Significativas, devendo ser conservados e manejados
como entidades distintas. As subdivisões menores dentro das duas espécies foram
indicadas pelo menos como Unidades de Manejo, pois o grau de diferenciação do
DNAmt indicou uma baixa conexão demográfica entre estas regiões.
JOHNSON et al. (1999), pesquisaram quatro espécies de pequenos felídeos
neotropicais da linhagem da jaguatirica: O. guigna, O. geoffroyi, L. tigrinus e L.
colocolo. A análise baseada no sequenciamento de genes mitocondriais nas quatro
espécies, e 20 locos de microssatélite nas duas primeiras, revelou níveis consideráveis
de variabilidade genética e padrões de estruturação diferenciados entre elas.
22
O. guigna e O. geoffroyi não demonstraram padrões geográficos discerníveis ao
longo de sua distribuição. Em contraste, L. tigrinus e L. colocolo revelaram grupos
intraespecíficos bem definidos.
A ausência de um padrão filogeográfico em O. geoffroyi, constitui um indicativo
de que a espécie, provavelmente, mantém uma grande população panmítica sem
barreiras significativas ao fluxo gênico. No entanto, a ausência de uma estruturação
populacional definida em O. guigna, pode ter sido tanto um artefato do pequeno
tamanho populacional analisado (n=6), quanto refletir os padrões de uma espécie de
pequena distribuição geográfica sem barreiras efetivas ao fluxo gênico.
Em L. tigrinus foi identificada a existência de dois grupos filogeográficos
extremamente distintos, correspondendo a duas das quatro subespécies atualmente
reconhecidas, L. t. oncilla, da Costa Rica e L. t. guttula, do Brasil, que teriam sido
isoladas provavelmente pela bacia do rio Amazonas há cerca de 3,7 milhões de anos. A
divergência genética encontrada entre estes dois grupos dentro de L. tigrinus foi
comparável a valores interespecíficos encontrados na linhagem da jaguatirica, sendo
sugerido por estes autores como um exemplo de espécies crípticas.
L. colocolo demonstrou níveis de variabilidade relativamente altos e uma grande
quantidade de subdivisão geográfica com a existência de pelo menos três grupos
distintos: Argentina Central/Chile Central, Norte do Chile e Bolívia/Brasil/Uruguai,
sugerindo a hipótese de que historicamente, as bacias do Paraguai e Rio da Prata
formaram barreiras significantes ao fluxo gênico na espécie.
JOHNSON et al. (1998), através do sequenciamento de segmentos de genes
mitocondriais, em exemplares do raro gato-andino O. jacobita, verificaram níveis
moderados de variabilidade genética e nenhuma estruturação populacional. No entanto,
o pequeno tamanho amostral (n=9), pode ter influenciado os resultados, sendo
23
necessárias informações mais detalhadas para refinar o conhecimento dos padrões
genéticos nesta espécie.
CULVER, et al. (2000) analisaram a variabilidade e estrutura genética das
populações de Puma concolor pela análise de seqüências do DNAmt e 10 locos de
microssatélite. Apesar de apresentar níveis relativamente altos de diversidade genética,
especialmente em locos de microssatélite, esta espécie exibiu uma pequena estruturação
geográfica. Um nível moderado de diferenciação genética foi observado a nível macro-
geográfico, sendo semelhante ao padrão observado em L. pardalis e L. wieddi, porém
sem monofilia recíproca dos grupos regionais. Estes resultados sugerem uma origem
sul-americana relativamente recente para as populações atuais desta espécie.
EIZIRIK et al. (2001), investigaram a diversidade genética, estrutura populacional
e história demográfica em Panthera onca ao longo de sua distribuição geográfica, pela
análise da região controladora do DNAmt e 29 locos de microssatélite. Os níveis de
diversidade genética encontrados foram baixos a moderados para os dados de DNAmt e
altos para os de microssatélites.
Não foram encontrados fortes suportes para a definição de estruturas geográficas
maiores, todavia os dados permitiram o reconhecimento de até quatro partições
filogeográficas incompletamente isoladas, extremamente similares às encontradas no
puma, jaguatirica e maracajá. As implicações para o manejo e conservação da espécie
incluíram a não-definição de sub-grupos diferenciados constituindo Unidades
Evolutivamente Significativas, e a indicação de alternativas de manejo, possivelmente
incluindo intervenção ativa para mediar o fluxo gênico entre as populações
remanescentes e, atualmente, isoladas de P. onca.
Apesar da realização de todos estes estudos sobre os padrões filogeográficos nas
espécies de felídeos neotropicais, permitindo a definição de suas estruturas genéticas em
24
uma escala global, estes não foram capazes de definir estruturas genéticas em um
padrão local ou regional, principalmente por apresentarem, em sua grande maioria, um
pequeno tamanho amostral. Para a análise de tais padrões, é necessária uma amostragem
maior e mais concentrada em determinadas regiões, permitindo uma análise mais
minuciosa sobre suas relações populacionais e geográficas.
25
2. OBJETIVOS
Este trabalho tem por objetivos:
1. Investigar a diversidade genética existente em oito locos de microssatélite em
populações do gato-do-mato-pequeno Leopardus tigrinus amostradas nas regiões
Sul, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil e em indivíduos do gato-do-mato-grande
Oncifelis geoffroyi, a fim de se avaliar os níveis de variabilidade intra e inter-
específicos;
2. Utilizar as informações obtidas para analisar a distribuição geográfica da
variabilidade genética ao longo da área que compreende o limite sul da distribuição
de Leopardus tigrinus no Brasil, analisando processos de fluxo gênico, estrutura
populacional e existência de Unidades Evolutivamente Significativas e/ou
Unidades de Manejo nesta espécie;
3. Relacionar os resultados obtidos com informações disponíveis sobre a biologia
desta espécie, a fim de contribuir para a elaboração de estratégias adequadas para
sua conservação e manejo em campo e cativeiro.
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Obtenção de Amostras
A amostra total utilizada neste trabalho, consistiu de 54 indivíduos de Leopardus
tigrinus provenientes das regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste do Brasil, e 20 indivíduos
de Oncifelis geoffroyi a serem utilizados para comparação dos níveis de variabilidade
interespecíficos e como grupo externo nas análises populacionais de L. tigrinus.
As amostras de Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi utilizadas neste estudo
foram obtidas da seguinte maneira:
Amostras de tecido sangüíneo
Indivíduos mantidos em cativeiro com procedência geográfica conhecida;
Indivíduos capturados em campo por projetos de Ecologia realizados pela
Associação Pró-Carnívoros;
Indivíduos capturados por fazendeiros do interior do Estado do Rio Grande
do Sul e posteriormente liberados em seu habitat.
Amostras de tecido muscular
Animais encontrados mortos em estradas, vítimas de atropelamento;
Animais abatidos por caçadores e apreendidos pelas organizações
competentes.
Um total de nove estados do Brasil foi amostrado para L. tigrinus: Rio Grande
do Sul (n=16), Santa Catarina (n=1), Paraná (n=7), São Paulo (n=23), Rio de Janeiro
(n=1), Espírito Santo (n=1), Mato Grosso (n=1), Mato Grosso do Sul (n=2) e Goiás
(n=2) (Tabela 1). As amostras de O. geoffroyi foram coletadas em sua maioria no
Estado do Rio Grande do Sul (n=18), sendo as duas amostras restantes provenientes do
27
Uruguai e Argentina (Tabela 2). Das 54 amostras de L. tigrinus coletadas, 46
apresentam procedência ao nível de Município, totalizando 34 municípios amostrados
ao logo de toda a área estudada (Figura 3). Apenas oito amostras apresentaram
procedência somente ao nível de Estado, devido a falta de registros precisos obtidos
pelos zoológicos no momento de entrada dos animais. Todas as amostras de O.
geoffroyi, com exceção dos indivíduos provenientes do Uruguai e Argentina,
apresentam procedência ao nível de município (Tabela 2).
As amostras de sangue foram preservadas com anticoagulantes K3 EDTA ou
Citrato de Sódio e acondicionadas a temperatura de 4oC. As amostras de tecido
muscular foram preservadas em álcool 70% a temperatura ambiente.
28
A maioria das amostras de sangue de animais mantidos em cativeiro foram obtidas
através da colaboração com o “Plano de Manejo de Felinos Brasileiros” desenvolvido
pela Associação Mata Ciliar – São Paulo.
Tabela 1 – Caracterização da amostra de Leopardus tigrinus utilizada no presente estudo. AMC = Amostras coletadas pela Associação Mata Ciliar – Plano de Manejo de Felinos Brasileiros.
Procedência Código Tecido Estado Município
Instituição
Lti01 Músculo RS Triunfo Animal atropelado Lti04 Sangue RS --- Zoo Sapucaia do Sul - RS Lti05 Sangue RS --- Zoo Sapucaia do Sul - RS Lti09 Músculo RS Cachoeira do Sul Zoo Sapucaia do Sul - RS Lti10 Sangue RS Guaporé Zoo Sapucaia do Sul - RS Lti24 Sangue GO --- Zoo Goiânia - GO Lti43 Sangue PR Curitiba Zoo Curitiba - PR Lti44 Sangue SC Curitibanos Zoo Curitiba - PR Lti46 Sangue RS Garibaldi Zoo Particular M. Forestier - RS Lti47 Sangue RS Garibaldi Zoo Particular M. Forestier - RS Lti48 Sangue RS Estrela Zoo Sapucaia do Sul - RS Lti49 Músculo RS Guaíba Animal atropelado Lti50 Músculo RS Palmeira das Missões Animal atropelado Lti53 Sangue RJ Valença Zoo Rio de Janeiro – RJ/AMC Lti54 Sangue SP Moji Guaçú Zoo Mogi Guaçú – SP/AMC Lti55 Sangue SP Limeira Zoo Limeira – SP/AMC Lti56 Sangue SP Piracicaba Zoo Piracicaba – SP/AMC Lti57 Sangue SP Piracicaba Zoo Piracicaba – SP/AMC Lti58 Sangue SP Americana Zoo São B. do Campo – SP/AMC Lti59 Sangue SP Moji Guaçú Zoo São B. do Campo – SP/AMC Lti60 Sangue SP Rafard Zoo Campinas – SP/AMC Lti61 Sangue SP São Carlos Zoo Campinas – SP/AMC Lti62 Sangue SP Campinas Zoo Campinas – SP/AMC Lti64 Sangue SP --- Zoo São J. Rio Pardo– SP/AMC Lti65 Sangue SP --- Zoo São J. Rio Pardo – SP/AMC Lti66 Sangue SP Sorocaba Zoo São J. Rio Pardo – SP/AMC Lti68 Músculo RS Montenegro Animal atropelado Lti69 Músculo RS Santa Cruz do Sul Animal atropelado Lti70 Sangue SP Sorocaba Zoo Sorocaba – SP/AMC Lti71 Sangue SP Sorocaba Zoo Sorocaba – SP/AMC Lti72 Sangue MS Miranda Zoo Catanduva – SP/AMC Lti73 Sangue SP Campinas Zoo São J. Rio Preto – SP/AMC Lti74 Sangue SP São José do Rio Preto Zoo São J. Rio Preto – SP/AMC Lti75 Sangue SP Bauru Zoo Bauru – SP/AMC Lti76 Sangue SP Pedreira Zoo Pedreira – SP/AMC Lti77 Sangue SP Pedreira Zoo Pedreira – SP/AMC Lti78 Sangue SP Leme Zoo Leme – SP/AMC Lti79 Músculo RS Guaíba Animal atropelado Lti80 Músculo RS Santo A. da Patrulha Animal atropelado
29
Lti81 Sangue MS Anaurilândia Capturado em campo/PróCarnívoros Lti84 Sangue SP --- Zoo Jundiaí – SP / AMC Lti85 Sangue GO --- Zoo Goiânia – GO / AMC
Tabela 1. Continuação
Procedência Código Tecido Estado Município
Instituição
Lti86 Sangue SP Moji Mirim Zoo Jundiaí – SP / AMC Lti87 Sangue SP Moji Mirim Zoo Jundiaí – SP / AMC Lti88 Sangue PR --- Zoo Maringá – PR/AMC Lti89 Sangue PR Pato Branco Zoo Cascavel – PR/AMC Lti90 Sangue PR Nova Aurora Zoo Cascavel – PR/AMC Lti91 Sangue PR Curitiba Zoo Curitiba – PR/AMC Lti92 Sangue PR Curitiba Zoo Curitiba – PR/AMC Lti93 Sangue PR Curitiba Zoo Curitiba – PR/AMC Lti94 Músculo RS Ibarama Animal abatido por caçadores Lti96 Músculo MT Águas Boas Animal atropelado Lti97 Músculo ES Dom Martins Animal atropelado Lti98 Músculo RS Restinga Seca Animal atropelado
Tabela 2 – Caracterização da amostra de Oncifelis geoffroyi utilizada no presente estudo.
Procedência Código Tecido Estado/País Município
Instituição
Oge01 Sangue RS Santa Cruz do Sul Zoo Sapucaia do Sul - RS Oge02 Sangue RS Cachoeira do Sul Zoo Cachoeira do Sul - RS Oge03 Sangue RS Cachoeira do Sul Zoo Cachoeira do Sul - RS Oge04 Sangue RS Cachoeira do Sul Zoo Cachoeira do Sul - RS Oge05 Sangue RS Cachoeira do Sul Zoo Cachoeira do Sul - RS Oge07 Sangue RS Cachoeira do Sul Zoo Cachoeira do Sul - RS Oge08 Músculo RS Cachoeira do Sul Animal atropelado Oge09 Sangue Argentina --- Zoo Cordoba - ARG Oge10 Músculo RS Cachoeira do Sul Animal atropelado Oge11 Músculo RS Cachoeira do Sul Animal atropelado Oge12 Músculo RS Cachoeira do Sul Animal atropelado Oge13 Músculo RS Eldorado do Sul Animal atropelado Oge20 Músculo Uruguai --- Museo de C. Naturales - URU Oge28 Músculo RS Arambaré Animal atropelado Oge29 Sangue RS Quaraí Capturado por fazendeiros Oge32 Sangue RS Pantano Grande Capturado por fazendeiros Oge33 Músculo RS Alegrete Animal atropelado Oge36 Músculo RS Taim Animal atropelado Oge37 Sangue RS São Lourenço Zoo Sapucaia do Sul - RS Oge38 Músculo RS Santa Maria Animal atropelado
30
Figura 3 - Distribuição aproximada das amostras obtidas de Leopardus tigrinus com procedência ao nível de município. Cada ponto vermelho representa um município de origem de uma ou mais amostras.
31
3.2 Extração de DNA
Para a extração do DNA, foram utilizados dois protocolos diferentes de acordo
com o tipo de tecido.
Para a extração do DNA a partir de amostras de tecido muscular foi utilizado
protocolo retirado de MEDRANO et al. (1990) que consiste na extração do DNA sem
utilização de Fenol/Clorofórmio, como descrito a seguir:
1) 0,1 a 0,5 gramas de tecido;
2) Adição de 750µl de tampão de extração STE pH 8,0 (100 mM NaCl; 10 mM Tris-
HCl; 1 mM EDTA);
3) Centrifugação por 10 minutos a 4000rpm;
4) Descarte do sobrenadante e repetição dos passos 2 e 3;
5) Descarte do sobrenadante e adição de 550µl de Tampão de Lise (50 mM Tris-HCl pH
8,0; 20 mM EDTA pH 8,0; 1% SDS; 200 mM NaCl; 1% β-Mercapto-Ethanol) e
proteinase K (10 mg/ml), para ruptura das células liberando-se o DNA na solução;
6) Banho-maria a 37o C “overnight” ou 55-60o C por 3 horas;
7) Adição de 350µl de Cloreto de Sódio 5M para precipitação das proteínas e outros
restos celulares;
8) Agitação em Vórtex por 15 segundos;
9) Centrifugação por 30 minutos a 13000rpm;
10) Isolamento do sobrenadante e adição de 2 vezes o volume retirado de Etanol
Absoluto para precipitação do DNA;
11) Estocagem a 4o C “overnight”;
12) Centrifugação por 30 minutos a 13000rpm;
32
13) Descarte do sobrenadante e adição de 1000µl de Etanol 70%;
14) Centrifugação por 5 minutos a 6000rpm;
15) Repetição dos passos 13 e 14;
16) Descarte do sobrenadante e secagem a temperatura ambiente por 30 minutos;
17) Eluição do DNA precipitado em 100µl de Tampão TE (10mM de Tris-HCl pH8,0;
1mM EDTA).
Para as amostras de sangue foi utilizado protocolo para o isolamento do DNA
com o uso de Fenol/Clorofórmio, modificado a partir de PALUMBI et al. (1991), LAIRD
et al., (1991) e HILLIS et al. (1996). As extrações de sangue foram realizadas a partir de
sangue total, e não somente dos leucócitos, a fim de se obter o DNA possivelmente
liberado no plasma com a ruptura natural das células. Devido à grande quantidade de
hemoglobina presente nas amostras, o uso de Fenol/Clorofórmio se mostrou mais
eficiente na remoção dos restos celulares. O protocolo adaptado seguiu os seguintes
passos:
1) 600µl de sangue total;
2) Adição de 575µl de Tampão de Lise (idem ao protocolo descrito acima) e 25µl de
proteinase K (10mg/ml) para ruptura das células;
3) Banho-maria a 37o C “overnight” ou 55o C por 2 horas;
4) Adição de 600µl de Fenol e agitação em vórtex por 15 segundos;
5) Centrifugação por 10 minutos a 4000rpm;
6) Isolamento do sobrenadante e estimativa do seu volume;
7) Adição de 1 vez o volume retirado de Fenol-Clorofórmio (1:1) e agitação em vórtex
por 15 segundos;
8) Centrifugação por 10 minutos a 4000rpm;
33
9) Isolamento do sobrenadante e estimativa do seu volume;
10) Adição de 1vez o volume retirado de Clorofórmio e agitação em vórtex por 15
segundos;
11) Isolamento do sobrenadante, estimativa do seu volume e adição de 1/10 do volume
retirado de NaCl 2M e 2,5 vezes o volume de Etanol Absoluto para a precipitação do
DNA;
12) Estocagem a 4o C “overnight”;
13) Centrifugação por 10 minutos a 10000rpm;
14) Descarte do sobrenadante e adição de 1000µl de Etanol 70%;
15) Repetição dos passos 13 e 14;
16) Descarte do sobrenadante e secagem a temperatura ambiente por 30 minutos;
17) Eluição do DNA em 100µl de Tampão TE.
O resultado das extrações foi verificado por eletroforese horizontal em gel de
agarose 1% com Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X , corado com Brometo de
Etídeo e visualizado em translumidor de luz ultra-violeta. A quantificação aproximada
do DNA obtido foi realizada pela comparação com fragmentos de Fago-λ de
concentração conhecida.
3.3 Amplificação por PCR “Polymerase Chain Reaction” dos Locos de
Microssatélite
Foram selecionados oito primers para locos de microssatélite descritos para o
gato-doméstico (Felis catus) por MENOTTI-RAYMOND et al. (1999), que se apresentaram
polimórficos para esta espécie: FCA391, FCA424, FCA441, FCA453, F42, F98, F124 e
34
F146. Todos os locos encontram-se em diferentes cromossomos no gato doméstico com
exceção de FCA453, F42 e F146 (Tabela 3).
Todos os primers selecionados foram desenhados para locos com repetições de
quatro nucleotídeos, o que facilita a análise em gel de poliacrilamida por gerarem uma
menor quantidade de artefatos produzidos por PCR do que locos com repetições de dois
ou três nucleotídeos (SCHLOTTERER, 1998).
Os locos selecionados foram amplificados por PCR “Polymerase Chain
Reaction” (PALUMBI, 1996) em reações de 15µl que consistiam de:
cerca de 25 ng de DNA genômico;
1X Tampão PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl);
1,5-3,0 mM de MgCl2 - as concentrações de MgCl2 variaram de acordo com
o primer utilizado, ver Tabela 4;
0,5 Unidades de Taq DNA Polimerase/GIBCO BRL;
0,2 mM de dNTPs;
0,1 µM da solução contendo cada par de Primers;
Água Miliq para completar o volume.
As reações de PCR foram realizadas em termocicladores, consistindo das
seguintes condições de amplificação: 3 minutos de desnaturação inicial a 94oC; 30
ciclos de 45 segundos de desnaturação a 94oC, 45 segundos de anelamento a 48-60oC (a
temperatura de anelamento variou de acordo com o primer utilizado, ver Tabela 4), 1
minuto de extensão a 72oC, e um período de 15 minutos para extensão final a 72oC.
O resultado das amplificações foi verificado por eletroforese horizontal em gel
de agarose 1,5% com Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X, corado com Brometo de
Etídeo e visualizado em translumidor de luz ultra-violeta.
35
Tabela 3- Descrição dos oito locos de microssatélite utilizados neste estudo e as heterozigosidades (H) e tamanho dos fragmentos de DNA gerados por PCR em Felis catus, em pares de base. Dados retirados de MENOTTI-RAYMOND et al. (1999). Locos Cromossomo Primer 1
5’ 3’
Primer 2
5’ 3’
H Tamanho dos
fragmentos
FCA391 B3 GCCTTCTAACTTCCTTGCAGA TTTAGGTAGCCCATTTTCATCA 0,81 237-273
FCA424 C2 TGGAAAAATGTGGAATACTGAA CCAATTTGTAGTGACATCCCC 0,68 171-187
FCA441 D3 ATCGGTAGGTAGGTAGATATAG GCTTGCTTCAAAATTTTCAC 0,74 153-183
FCA453 A1 AATTCTGAGAACAAGCTGAGG ATCCTCTATGGCAGGACTTTG 0,62 186-198
F42 A1 CCCACGTGGACTAATCAAAT CACTGCACAAATTAAAGAGGC 0,83 205-231
F98 B4 TCAGAGCCTGCTTGGGATTC GTTTGTACTGCTATTGGTGG 0,53 171-183
F124 E1 TGCTGGGTATGAAGCCTACT ATTGCCTCAACTACCTAGGC 0,88 208-249
F146 A1 TTACGGTCTCTCCACAAGTC GAACCAGGTGATGAGAACTG 0,73 145-158
36
Tabela 4 – Condições de amplificação dos locos analisados em Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi.
Locos Concentração de
MgCl2 (mM)
Temperatura de
Anelamento (o C)
FCA391 2,0 56
FCA424 2,0 53
FCA441 2,0 49
FCA453 1,5 60
F42 2,0 57
F98 2,0 56
F124 2,0 57
F146 3,0 48
3.4 Determinação dos Alelos e Genótipos dos Indivíduos
Os produtos de PCR obtidos foram analisados em eletroforese vertical, em géis
de poliacrilamida 6% não-desnaturante, a fim de se determinar os alelos e genótipos de
cada indivíduo. Os géis foram confeccionados em placas de vidro de 32cm de
comprimento por 20cm de largura, com espaçadores de 0,8mm. A eletroforese foi
realizada com tampão TBE 1X, a uma potência constante de 40 Watts. O tempo de
corrida variou de duas a três horas e meia, dependendo do tamanho dos fragmentos
gerados por PCR para cada um dos locos. Posteriormente, os géis foram corados com
nitrato de prata, seguindo protocolo descrito por TEGELSTROM (1992) e plastificados
com celofane.
O genótipo e o tamanho dos alelos encontrados para cada indivíduo analisado
foram determinados manualmente por comparação com um marcador molecular de 25
pares de base (Gibco/BRL) e com uma “Escada alélica” construída com os próprios
alelos encontrados para cada loco (Figura 4).
37
Para a amostragem total, incluindo L. tigrinus e O. geoffroyi, foram realizadas de
25% a 75% de repetições por loco das análises em gel de poliacrilamida para a
confirmação dos genótipos e tamanho dos alelos encontrados. Para todas as repetições
realizadas, houve 100% de confirmação dos dados.
3.5 Análise dos Dados
A diversidade genética encontrada nos locos analisados para Leopardus tigrinus
e Oncifelis geoffroyi foi estimada pelo número de locos polimórficos, número de alelos
por loco, número de alelos exclusivos, heterozigosidade observada (Ho) e
heterozigosidade esperada (He) a partir das freqüências alélicas supondo equilíbrio de
Hardy-Weinberg para cada um dos locos.
O programa ARLEQUIN 2.1 (SCHNEIDER et al., 2000), foi utilizado para o
cálculo das heterozigosidades observadas e esperadas, assim como para os testes de
desvios do Equilíbrio de Hardy-Weinberg, utilizando o teste exato baseado no método
descrito por GUO & THOMPSON (1992). A distribuição das freqüências alélicas, presença
175
183
187 191
195
200
Figura 4 – Gel de Poliacrilamida 6% não-desnaturante, corado com Nitrato de Prata demonstrando o padrão de bandas obtidas para o loco FCA424. Escada Alélica, Marcador de 25 pares de base. Em branco, o tamanho dos fragmentos de DNA em pares de base.
38
de alelos exclusivos e teste de desequilíbrio de ligação entre os locos foram obtidas pelo
programa GENEPOP 3.1d (RAYMOND & ROUSSET, 1995). Os níveis de significância
para os desvios do Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de Ligação foram
ajustados segundo método sequencial de Bonferroni para múltiplas comparações (RICE,
1989).
O programa MICROSAT (MINCH, 1997) foi utilizado para o cálculo de duas
medidas de distância genética entre os indivíduos: Dps – proporção de alelos
compartilhados e Dkf - proporção de parentesco. As matrizes de distâncias resultantes
foram utilizadas para a construção de árvores filogenéticas segundo método de
Neighbor Joining (SAITOU & NEI, 1987) com o programa NEIGHBOR, incluso no
pacote PHYLIP 3.5 (FELSENSTEIN, 1993).
O programa STRUCTURE (PRITCHARD et al., 2000) foi utilizado para inferir a
estrutura populacional de Leopardus tigrinus, assim como para associar indivíduos à
sua população fonte. Para tal, o programa utiliza-se de um método de agrupamento
Bayesiano. Este modelo assume que há K populações (onde K pode ser desconhecido),
cada uma das quais caracterizada por um conjunto de freqüências alélicas para cada
loco. Os indivíduos da amostra são atribuídos probabilisticamente às populações, ou
juntamente a duas ou mais populações se seus genótipos indicarem que eles são
miscigenados. Este método pode ser utilizado para detectar a presença de uma estrutura
populacional críptica e para realizar o teste de atribuição dos indivíduos às populações.
O modelo assume Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Equilíbrio de Ligação entre os locos
dentro de cada população, sendo que a existência de desvios do equilíbrio leva a
população a ser dividida em subpopulações, às quais os indivíduos são alocados. Os
resultados apresentados neste trabalho são baseados em 100.000 interações e 100.000
“burn-in”.
39
Estimativas de diferenciação entre as subpopulações foram obtidas no programa
ARLEQUIN 2.1 pela análise da variância molecular – AMOVA (EXCOFFIER et al.,
1992) a partir dos índices de fixação Fst (WEIR & COCKERHAM, 1984) e Rst (SLATKIN,
1995a). A significância estatística dos valores encontrados para os dois índices
utilizados foi testada utilizando-se 10.000 permutações pelo programa ARLEQUIN 2.1.
40
4. RESULTADOS
4.1 Características dos Locos de Microssatélite Analisados em Leopardus tigrinus e
Oncifelis geoffroyi
Os oito locos de microssatélite analisados revelaram-se polimórficos para as
duas espécies. Para Leopardus tigrinus foi encontrado um total de 56 alelos, sendo F124
o loco mais polimórfico com 13 alelos. Apenas um loco, F98, apresentou desvios
signifcativos entre a proporção de heterozigotos observada e a esperada de acordo com
o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p<0,05, após correção de Bonferroni) (Tabela 5). Para
Oncifelis geoffroyi foi encontrado um total de 40 alelos, sendo F42, o loco mais
polimórfico com 9 alelos. Nenhum dos locos analisados para esta espécie apresentou
desvios significativos entre a proporção de heterozigotos observada (Ho) e esperada
(He) (Tabela 6).
Os níveis de variabilidade genética encontrados para as duas espécies foram
relativamente altos e semelhantes, tendo L. tigrinus apresentado uma heterozigosidade
média observada e número médio de alelos por loco levemente maiores do que O.
geoffroyi (Tabelas 5 e 6). L. tigrinus apresentou 17 alelos exclusivos em relação a O.
geoffroyi que por sua vez, apresentou apenas um alelo privado (221) para o loco F42,
sendo todos os demais compartillhados com L. tigrinus (Figura 5).
O teste de desequilíbrio de ligação indicou dois locos ligados – F42 e FCA424 –
em L. tigrinus e nenhum desequilíbrio em O. geoffroyi (nível de significância ∝=0,05,
incluindo correção de Bonferroni para 24 comparações).
As distribuições das freqüências alélicas tanto em L. tigrinus quanto em O.
geoffroyi demonstraram-se aproximadamente unimodais (Figura 5), o que pode ser
esperado para populações que sofreram uma expansão demográfica no passado recente
(REICH & GOLDSTEIN, 1998).
41
Tabela 5 - Características dos locos de microssatélite analisados para Leopardus tigrinus, considerando a amostra como uma única população (n=54). Número de alelos por loco (A), tamanho dos fragmentos de DNA gerados por PCR (pb = pares de base), heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He).
Loco A Fragmento (pb) Ho He
FCA391 7 219-247 0.833 NS 0.783
FCA424 5 183-203 0.611 NS 0.662
FCA441 5 134-150 0.593 NS 0.695
FCA453 5 192-208 0.667 NS 0.664
F42 9 225-257 0.796 NS 0.855
F98 5 163-179 0.296 * 0.428
F124 13 164-216 0.815 NS 0.809
F146 7 148-172 0.537 NS 0.658
Média 7 --- 0,645 0,694
NS = diferenças não significativas entre a proporção de heterozigotos observada e a esperada de acordo com o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05, após correção de Bonferroni).* diferenças significativas (p< 0,05) Tabela 6 – Características dos locos de microssatélite analisados para Oncifelis geoffroyi. Número de alelos por loco (A), tamanho dos fragmentos de DNA gerados por PCR (pb = pares de base), heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada (He).
Loco A Fragmentos (pb) Ho He
FCA391 5 219-235 0.800 NS 0.806
FCA424 3 183-195 0.350 NS 0.433
FCA441 5 134-150 0.700 NS 0.671
FCA453 4 192-208 0.700 NS 0.687
F42 9 221-253 0.700 NS 0.877
F98 3 163-175 0.600 NS 0.697
F124 6 172-196 0.600 NS 0.832
F146 5 148-168 0.650 NS 0.633
Média 5 --- 0,638 0,705
NS = diferenças não significativas entre a proporção de heterozigotos observada e a esperada de acordo com o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05, após correção de Bonferroni).
42
Figura 5 – Histogramas ilustrando a distribuição das freqüências dos alelos encontrados para os locos de microssatélites analisados em Oncifelis geoffroyi e Leopardus tigrinus
FCA391
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
219 223 227 231 235 239 243 247
FCA424
00,10,20,30,40,50,60,70,8
183 187 191 195 199 203
FCA441
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
134 138 142 146 150
FCA453
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
192 196 200 204 208
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Alelos
AlelosAlelos
Alelos
FCA391
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
219 223 227 231 235 239 243 247
FCA424
00,10,20,30,40,50,60,70,8
183 187 191 195 199 203
FCA441
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
134 138 142 146 150
FCA453
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
192 196 200 204 208
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Alelos
AlelosAlelos
Alelos
43
Figura 5 - Continuação. Oncifelis geoffroyi Leopardus tigrinus
F42
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
221 225 229 233 237 241 245 249 253 257
F98
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
163 167 171 175 179
F124
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
164 168 172 176 180 184 188 192 196 200 204 208 212 216
F146
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
148 152 156 160 164 168 172
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Alelos
Alelos Alelos
Alelos
F42
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
221 225 229 233 237 241 245 249 253 257
F98
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
163 167 171 175 179
F124
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
164 168 172 176 180 184 188 192 196 200 204 208 212 216
F146
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
148 152 156 160 164 168 172
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Freq
üênc
ia R
elat
iva
dos
Ale
los
Alelos
Alelos Alelos
Alelos
44
A análise da variância molecular (AMOVA) de acordo com os índices de
fixação Fst e Rst foi utilizada para o teste de diferenciação genética entre as duas
espécies. O valor obtido para Fst (=0,065, p<0,01) indicou a existência de diferenciação
significativa entre as espécies, no entanto o valor de Rst (=0,059, p>0,05) não
apresentou-se significativo. Apesar da significância encontrada para o Fst, o valor
obtido apresentou-se extremamente baixo em relação a valores usualmente observados
entre espécies (JOHNSON et al., 1999; RANDI & LUCCHINI, 2002).
Para o teste de agrupamento dos indivíduos entre as duas espécies foram
construídas árvores filogenéticas de acordo com o método de Neighbor Joining. Foram
utilizadas duas estimativas de distância para a construção das árvores, Dps - proporção
de alelos compartilhados e Dkf - coeficiente de parentesco. Para cada um dos índices
foram construídas duas árvores: Dps (1-ps e –ln(ps)) e Dkf (1-kf e -ln (kf)). As quatro
árvores geradas revelaram resultados semelhantes, sendo somente duas delas exibidas
neste trabalho (Figura 6). Os valores de “bootstrap” obtidos foram extremamente
baixos, não sustentando a formação de agrupamentos distintos (monofiléticos) para as
duas espécies, e assim invalidando a utilização de O. geoffroyi como grupo externo nas
análises populacionais de L. tigrinus.
Como as árvores filogenéticas construídas por Neighbor Joining, falharam na
distinção genética entre as duas espécies, o programa STRUCTURE foi utilizado para
resolver estes padrões. A análise utilizando STRUCTURE, foi realizada de duas
maneiras principais. Na primeira não foi utilizada a informação prévia da espécie de
origem para cada indivíduo, assumindo-se que a amostra total de O. geoffroyi e L.
tigrinus continha um número K de populações diferenciadas. O objetivo desta análise é
identificar a existência de estrutura populacional, ou seja, K>1, e estimar a
probabilidade do número de populações diferenciadas dentro da amostra geral. Neste
45
caso foi utilizada a opção USEPOPINFO=0, a qual não incorpora informações pré-
definidas da origem geográfica ou fenotípica dos indivíduos. O número de populações
existentes, é então, determinado somente a partir dos dados genéticos. A probabilidade
do número de populações para todos os dados foi estimada fixando-se valores de K=1-
5, e comparando-se a probabilidade de cada valor. Um total de cinco análises
independentes para cada valor de K foi rodado, a fim de se testar a consistência dos
dados obtidos. Os valores gerados para cada K, apresentaram-se bastante semelhantes,
variando apenas na ordem de um a dois decimais. A maior probabilidade encontrada foi
a da existência de duas subpopulações (P = 0,998), indicando que a população como um
todo contém pelo menos dois grupos geneticamente distintos.
A partir destes dados, foi estimada a proporção de associação (q) de cada
população pré-definida (O. geoffroyi e L. tigrinus) aos dois grupos encontrados pela
primeira análise. A proporção de associação (q) constitui na proporção média dos
genótipos de cada população pré-definida que foram inferidas como sendo de cada um
dos grupos pelo programa. A análise revelou uma maior associação de L. tigrinus ao
Grupo I (q=0,659) e O. geoffroyi ao Grupo II (q=0,820). As duas espécies foram
essencialmente separadas em dois grupos distintos baseados somente em sua
constituição genética, no entanto foram encontradas proporções relativamente altas de
associação de L. tigrinus ao Grupo II, referente a O. geoffroyi (Tabela 7a). Estes dados
indicam que apesar de haver dois grupos geneticamente distintos, a amostra apresenta
indivíduos não totalmente diferenciados entre as duas espécies.
Na segunda análise realizada, foi utilizada a informação prévia de espécie,
considerando-se duas populações, L. tigrinus e O. geoffroyi, usando a opção
USEPOPINFO=1. Esta opção é utilizada para que o programa possa inferir o
agrupamento correto ou não dos indivíduos e suas ancestralidades. Definindo-se
46
previamente as populações, o programa estima as probabilidades de cada indivíduo
pertencer exclusivamente à população de origem pré-definida, bem como de pertencer a
outra população, ou apresentar ancestralidade significativa nesta em até duas gerações
no passado. As probabilidades de associação (q) para cada indivíduo, que representam a
proporção de cada genótipo individual que teria sido originada em um ou mais de um
grupo, foram estimadas utilizando dois valores diferentes para a taxa de migração prévia
entre os grupos (v) de 0,05 e 0,1, como recomendado por PRITCHARD et al. (2000),
gerando dados concordantes. Neste contexto, um migrante entre as duas espécies
equivale a um híbrido. Somente indivíduos de L. tigrinus demonstraram ancestralidade
significante em O. geoffroyi, sendo estes listados na Tabela 8. Segundo esta análise
todos estes indivíduos podem ser considerados como híbridos entre as duas espécies.
Nove indivíduos de L. tigrinus foram considerados como híbridos pela análise
do programa STRUCTURE, sendo que destes, Lti49, Lti85 e Lti98, demonstraram
probabilidades extremamente altas (>0,9) de pertencer a população de O. geoffroyi, para
as duas taxas de migração prévia utilizadas. Os indivíduos Lti09, Lti79 e Lti88,
demonstraram probabilidades intermediárias (>0,5) de pertencer a população de O.
geoffroyi, com valores relativamente altos de ancestralidade nesta população.
Os mesmos indivíduos de L. tigrinus identificados como possíveis híbridos pelo
programa STRUCTURE aparecem agrupados próximos a indivíduos de O. geoffroyi nas
análises filogenéticas (Figura 6).
Dos nove indivíduos de L. tigrinus que apresentaram ancestralidade significativa
em O. geoffroyi pela análise do programa STRUCTURE, cinco deles são provenientes
da região central do Estado do Rio Grande do Sul, um indivíduo proveniente do Estado
do Paraná, dois do Estado de Goiás e um do Mato Grosso do Sul. A origem geográfica
dos indivíduos considerados como possíveis híbridos, na maioria dos casos, foi
47
concordante com áreas de contato entre as distribuições geográficas das duas espécies
(Anexo 1). Analisando os alelos obtidos para cada uma das espécies, pôde-se verificar
que dois alelos, nos locos F98 e F124, foram encontrados somente em O. geoffroyi e em
indivíduos provenientes do Estado do Rio Grande do Sul, e dois outros (nos locos
FCA391 e FCA441) somente em O. geoffroyi e indivíduos provenientes dos Estados do
Rio Grande do Sul, Paraná, Goiás e Mato Grosso do Sul (dados não exibidos). Estes
resultados podem indicar a ocorrência de introgressão de alelos exclusivos de O.
geoffroyi em L. tigrinus, a partir da hibridação entre as duas espécies em suas áreas de
contato.
Retirando-se os possíveis híbridos, identificados pela análise do programa
STRUCTURE, os valores obtidos para os dois índices de fixação tornaram-se
significativos e mais elevados no caso do Fst (Fst = 0,103, p<0,01 e Rst= 0,0368,
p<0,05).
Da mesma maneira, a análise realizada com STRUCTURE, utilizando-se
USEPOPINFO=0 e retirando-se os híbridos sugeridos pelo mesmo programa, revelou
um aumento na proporção de associção (q) de L. tigrinus ao Grupo I, subindo de 0,659
para 0,725 (Tabela 7b).
Análises posteriores do Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de
Ligação, com a exclusão dos nove indivíduos considerados como híbridos pelo
programa STRUCTURE, não demonstraram desvios significativos do número de
heterozigotos observado e esperado para nenhum dos locos em nenhuma das duas
espécies, assim como nenhum evento de desequilíbrio de ligação.
48
Figura 6 - Relações filogenéticas entre os oito locos de microssatélite analisados para Leopardus tigrinus (Lti) e Oncifelis geoffroyi (Oge). Os indivíduos de Lti, em roxo e negrito constituem os prováveis híbridos detectados pelo programa STRUCTURE. Árvores construídas a partir do método de Neighbour Joining com o programa NEIGHBOUR do pacote PHYLIP, através de duas estimativas de distância: A) Proporção de alelos compartilhados (Dps, opção: 1 - (ps)); B) Coeficiente de kinship (Dkf, opção: 1 - (kf)). Valores demonstrados nos ramos representam o suporte para 100 replicações “bootstraps” (somente os valores acima de 30 estão sendo exibidos).
10
Lti98Oge38
Oge28Lti0932
Lti79Oge12
Oge11Oge03
Oge13Oge3657
Lti85Lti2471
Lti44Lti4844
Lti73Lti87Lti56
Lti77Lti7639
Lti84Lti89
Lti91Lti9735
Lti59Lti66
Lti55Lti78
Oge07Oge32Lti94
Lti72Lti58
Lti61Lti9069
Lti43Lti74
Lti96Lti65
Lti04Oge0838
Lti80Lti68Oge37Lti05
Lti69Lti9336
Lti57Lti46
Lti64Lti70
Lti86Lti53
Lti54Lti6039
Oge04Lti01
Lti10Lti50Oge33Oge20
Lti71Oge05Lti81Lti92
Lti75Lti62Lti47
Lti88Lti49
Oge09Oge0145
36
Oge29Oge10Oge02
A)
Oge01Oge09
10
Lti88Lti49
4331
Oge02Oge1031
Oge29Lti71Lti86
Lti70Lti91Lti97Lti57Lti4630
Lti89Lti64
Lti10Lti92
Oge08Lti0432
Oge05Lti96
Oge32Lti94
Oge04Oge38Lti75Lti62
Lti66Lti47Lti50Lti59
Lti56Lti76
Lti65Lti73
Lti87Lti78Lti55Lti48Lti4438
Lti53Lti54Lti6038
Oge11Lti79Oge12Lti93Lti69
Lti09Oge03Oge28
Lti98Oge13Oge3633
Lti24Lti81Lti85
Oge33Oge2033
Lti72Lti84Lti77
Lti58Lti74Lti43
Lti80Lti6831
Lti90Lti6159
Oge37Lti05
Lti01Oge07
B)10
Lti98Oge38
Oge28Lti0932
Lti79Oge12
Oge11Oge03
Oge13Oge3657
Lti85Lti2471
Lti44Lti4844
Lti73Lti87Lti56
Lti77Lti7639
Lti84Lti89
Lti91Lti9735
Lti59Lti66
Lti55Lti78
Oge07Oge32Lti94
Lti72Lti58
Lti61Lti9069
Lti43Lti74
Lti96Lti65
Lti04Oge0838
Lti80Lti68Oge37Lti05
Lti69Lti9336
Lti57Lti46
Lti64Lti70
Lti86Lti53
Lti54Lti6039
Oge04Lti01
Lti10Lti50Oge33Oge20
Lti71Oge05Lti81Lti92
Lti75Lti62Lti47
Lti88Lti49
Oge09Oge0145
36
Oge29Oge10Oge02
A)
10
Lti98Oge38
Oge28Lti0932
Lti79Oge12
Oge11Oge03
Oge13Oge3657
Lti85Lti2471
Lti44Lti4844
Lti73Lti87Lti56
Lti77Lti7639
Lti84Lti89
Lti91Lti9735
Lti59Lti66
Lti55Lti78
Oge07Oge32Lti94
Lti72Lti58
Lti61Lti9069
Lti43Lti74
Lti96Lti65
Lti04Oge0838
Lti80Lti68Oge37Lti05
Lti69Lti9336
Lti57Lti46
Lti64Lti70
Lti86Lti53
Lti54Lti6039
Oge04Lti01
Lti10Lti50Oge33Oge20
Lti71Oge05Lti81Lti92
Lti75Lti62Lti47
Lti88Lti49
Oge09Oge0145
36
Oge29Oge10Oge02
A)
Oge01Oge09
10
Lti88Lti49
4331
Oge02Oge1031
Oge29Lti71Lti86
Lti70Lti91Lti97Lti57Lti4630
Lti89Lti64
Lti10Lti92
Oge08Lti0432
Oge05Lti96
Oge32Lti94
Oge04Oge38Lti75Lti62
Lti66Lti47Lti50Lti59
Lti56Lti76
Lti65Lti73
Lti87Lti78Lti55Lti48Lti4438
Lti53Lti54Lti6038
Oge11Lti79Oge12Lti93Lti69
Lti09Oge03Oge28
Lti98Oge13Oge3633
Lti24Lti81Lti85
Oge33Oge2033
Lti72Lti84Lti77
Lti58Lti74Lti43
Lti80Lti6831
Lti90Lti6159
Oge37Lti05
Lti01Oge07
B)
Oge01Oge09
10
Lti88Lti49
4331
Oge02Oge1031
Oge29Lti71Lti86
Lti70Lti91Lti97Lti57Lti4630
Lti89Lti64
Lti10Lti92
Oge08Lti0432
Oge05Lti96
Oge32Lti94
Oge04Oge38Lti75Lti62
Lti66Lti47Lti50Lti59
Lti56Lti76
Lti65Lti73
Lti87Lti78Lti55Lti48Lti4438
Lti53Lti54Lti6038
Oge11Lti79Oge12Lti93Lti69
Lti09Oge03Oge28
Lti98Oge13Oge3633
Lti24Lti81Lti85
Oge33Oge2033
Lti72Lti84Lti77
Lti58Lti74Lti43
Lti80Lti6831
Lti90Lti6159
Oge37Lti05
Lti01Oge07
B)
10
Lti88Lti49
4331
Oge02Oge1031
Oge29Lti71Lti86
Lti70Lti91Lti97Lti57Lti4630
Lti89Lti64
Lti10Lti92
Oge08Lti0432
Oge05Lti96
Oge32Lti94
Oge04Oge38Lti75Lti62
Lti66Lti47Lti50Lti59
Lti56Lti76
Lti65Lti73
Lti87Lti78Lti55Lti48Lti4438
Lti53Lti54Lti6038
Oge11Lti79Oge12Lti93Lti69
Lti09Oge03Oge28
Lti98Oge13Oge3633
Lti24Lti81Lti85
Oge33Oge2033
Lti72Lti84Lti77
Lti58Lti74Lti43
Lti80Lti6831
Lti90Lti6159
Oge37Lti05
Lti01Oge07
B)
49
Tabela 7 – Proporção de associação de cada população pré-definida (Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi) aos dois grupos inferidos pelo programa STRUCTURE. a) Amostra total de Leopardus tigrinus (n=54); b) Amostra de Leopardus tigrinus com exclusão dos possíveis híbridos (n=45).
a) Grupos Inferidos População Grupo I GrupoII
Oncifelis geoffroyi 0,180 0,820 Leopardus tigrinus 0,659 0,341
b) Grupos Inferidos
População Grupo I Grupo II Oncifelis geoffroyi 0,180 0,820 Leopardus tigrinus 0,725 0,275
Tabela 8- Proporção de associação (q) dos genótipos de cada indivíduo de Leopardus tigrinus, que demostraram ancestralidade significativa na população de Oncifelis geoffroyi segundo o programa STRUCTURE. Neste caso são estimadas as probabilidades de cada indivíduo pertencer exclusivamente à população de origem fenotípica (sem ancestrais imigrantes), pertencer à outra população (imigrante) ou apresentar ancestrais nesta na primeira e na segunda geração passada. População
L. tigrinus População
O. geoffroyi
Indivíduo v Sem ancestrais imigrantes
Imigrante Imigrantes na 1a geração
Imigrantes na 2a geração
Lti01 0,05 0,421 0,013 0,367 0,198 0,1 0,220 0,019 0,502 0,258 Lti09 0,05 0,107 0,583 0,226 0,084 0,1 0,043 0,622 0,246 0,090 Lti24 0,05 0,064 0,853 0,055 0,028 0,1 0,022 0,900 0,053 0,025 Lti49 0,05 0,010 0,912 0,060 0,018 0,1 0,003 0,931 0,052 0,014 Lti79 0,05 0,126 0,505 0,247 0,122 0,1 0,050 0,543 0,276 0,131 Lti81 0,05 0,597 0,168 0,138 0,096 0,1 0,415 0,253 0,192 0,139 Lti85 0,05 0,014 0,963 0,016 0,007 0,1 0,003 0,981 0,012 0,004 Lti88 0,05 0,207 0,563 0,155 0,075 0,1 0,083 0,677 0,164 0,076 Lti98 0,05 0,018 0,918 0,047 0,017 0,1 0,005 0,941 0,041 0,013
50
4.2 Estrutura Genética de Leopardus tigrinus
Dois tipos de análises foram conduzidos para a definição dos padrões de
distribuição geográfica da variabilidade genética em Leopardus tigrinus. A primeira
análise envolveu a amostra total obtida para a espécie (n=54), juntamente com
comparações com a amostra obtida para Oncifelis geoffroyi. A segunda análise diferiu
da primeira, pela exclusão dos nove indivíduos de L. tigrinus considerados como
possíveis híbridos entre as duas espécies pelo programa STRUCTURE. A retirada
destes indivíduos foi realizada com intuito de se analisar com mais objetividade apenas
a estrutura genética de L. tigrinus, procurando descartar os efeitos da possível
hibridação com O. geoffroyi sobre sua estrutura.
Para a primeira análise incluindo todos os indivíduos de L. tigrinus (n=54), foi
utilizado o programa STRUCTURE com a opção USEPOPINFO=0, para definição do
número de populações K sem informações prévias de origem geográfica. Foram fixados
valores de K=1-5 e realizadas cinco análises independentes pra cada valor de K. Ao
contrário do obtido no teste do número de populações para a amostra total de L. tigrinus
com O. geoffroyi, os valores resultantes para cada K variaram intensamente, não sendo
possível se obter estimativas consistentes. Neste caso, o programa STRUCTURE não
demonstrou-se eficiente na identificação das populações e agrupamento dos indivíduos.
A população total de L. tigrinus foi então testada sob quatro diferentes cenários.
O primeiro cenário consistiu de duas populações: 1) Região Sul + Região
Centro-Oeste (n=29), incluindo os indivíduos provenientes dos Estados do Rio Grande
do Sul, Santa Catarina, Paraná, Goiás, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul e 2) Região
Sudeste (n=25), com os indivíduos dos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito
Santo.
51
O segundo cenário consistiu, também, de duas populações, apenas diferindo do
primeiro com o agrupamento das amostras do Centro-Oeste com as do Sudeste.
O terceiro cenário envolveu três populações: 1) Região Sul (n=24), incluindo
todos os indivíduos amostrados para os Estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e
Paraná; 2) Região Sudeste (n=25), incluindo os indivíduos amostrados para os Estados
de São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito Santo e 3) Região Centro-Oeste (n=5), incluindo
os indivíduos provenientes de Goiás, Mato Grosso e Mato-Grosso do Sul.
O quarto cenário incluiu quatro populações formadas por: 1) Estados do Rio
Grande do Sul - RS e Santa Catarina - SC (n=17) 2) Estado do Paraná - PR (n=7), 3)
Estados de São Paulo - SP, Rio de Janeiro - RJ e Espírito Santo - ES (n=25) e 4)
Estados de Goiás - GO, Mato Grosso - MT e Mato Grosso do Sul - MS (n=5). A
amostra proveniente de Santa Catarina, Lti44, foi testada juntamente com a população
do Rio Grande do Sul em uma análise, e com a do Paraná em outra, gerando resultados
semelhantes. O agrupamento com o Estado do Rio Grande do Sul, escolhido para
inclusão no presente trabalho, foi definido com o auxílio das análises filogenéticas por
Neighbor Joining, que em todas as opções testadas revelaram um agrupamento entre
Lti44 com Lti48 do Rio Grande do Sul.
A análise de um maior número de cenários não foi possível devido ao pequeno
tamanho da amostra para alguns estados.
Foram realizados testes de Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de
Ligação para todos os locos em cada uma das populações definidas para os cenários
testados. Em nenhuma destas populações, houve desvios significantes para ∝=0,05,
após correção de Bonferroni (dados não exibidos).
Os resultados da AMOVA para os quatro cenários pré-definidos apresentaram
resultados semelhantes, sendo os maiores valores de Fst e Rst encontrados para o
52
Cenário 3. O segundo valor mais alto do Rst, apesar de não ter sido significante, foi
encontrado para o Cenário 4, e o segundo maior Fst para o Cenário 1 (Tabela 9).
Tabela 9 – Resultados da AMOVA obtidos para os quatro cenários pré-definidos para a amostra total de Leopardus tigrinus (n=54). Cenário 1 – Região Sul + Centro-Oeste x Região Sudeste; Cenário 2 – Região Sul x Centro-Oeste + Região Sudeste; Cenário 3 – Região Sul x Região Sudeste x Região Centro – Oeste; Cenário 4 – RS/SC x PR x SP/RJ/ES x GO/MT/MS. Porcentagem de Variação
Cenário 1 Cenário 2 Cenário 3 Cenário 4
Inter-populacional 5,37 2,99 5,68 5,22
2,95 2,81 12,26 9,92
Intra-populacional 94,63 97,01 94,32 94,78
97,05 97,19 87,74 90,08
Índice de fixação Fst = 0,0537 ** Fst = 0,0299 ** Fst = 0,0568 ** Fst = 0,0522 **
Rst = 0,0295 * Rst = 0,0281 Rst = 0,1226 * Rst = 0,0992
# Os valores superiores referem-se aos dados do Fst e os inferiores e em negrito aos do Rst. **p<0,01, *p<0,05
Foram realizadas comparações múltiplas entre as populações definidas para cada
cenário e para O. geoffroyi, utilizando os dois índices de fixação: Fst e Rst. Os valores
de Fst foram significantes para todas as comparações com exceção do Sul x Centro-
Oeste e O. geoffroyi x Centro-Oeste no Cenário 3, RS/SC x PR, PR x GO/MT/MS, PR x
SP/RJ/ES e GO/MT/MS x O. geoffroyi, no Cenário 4. Os valores de Rst foram em sua
maioria não significantes, apresentando significância normalmente para comparações
entre as populações das regiões Sul e Sudeste - Cenário 1 e Cenário 3 - e entre a
população do RS com O. geoffroyi - Cenário 2 e Cenário 3 - (Tabela 10).
A ausência de significância para os valores de Fst nas comparações realizadas no
Cenário 3, revela a influência dos indivíduos considerados como híbridos nestas
53
regiões, provocando uma homogeneização genética entre estas. No Cenário 4, a
ausência de significância para os valores obtidos em todas as comparações com a
subpopulação do Paraná, parecem revelar um padrão de isolamento pela distância, com
a população intermediária dentro da área analisada, não apresentando-se diferenciada
geneticamente das populações extremas.
Os valores encontrados de Fst em todas as comparações parecem, ainda, revelar
uma tendência de aumento da diferenciação genética entre L. tigrinus e O. geoffroyi de
acordo o aumento da distância da área de contato entre as duas espécies, tendo as
populações definidas como Sudeste ou SP índices mais elevados do que as populações
mais ao sul e ao centro do país (Tabela 10). Estes dados coincidem com a definição dos
possíveis híbridos pelo programa STRUCTURE, sendo todos eles provenientes dos
Estados do Rio Grande do Sul, Paraná, Goiás e Mato Grosso do Sul.
54
Tabela 10 – Resultados dos testes de diferenciação populacional utilizando os índices de fixação Fst e Rst. Comparações múltiplas entre as populações de Leopardus tigrinus estabelecidas para os quatro cenários pré-definidos, incluindo a amostra total (n=54), e comparações entre cada população de Leopardus tigrinus com Oncifelis geoffroyi. Cenário 1
Sul/Centro-Oeste Sudeste O. geoffroyi
Sul/Centro-Oeste --- 0,0295* 0,0517
Sudeste 0,0537** --- 0,0408
O. geoffroyi 0,0313** 0,1294** ---
Cenário 2
Sul Sudeste/Centro-Oeste O. geoffroyi
Sul --- 0,0281 0,0760**
Sudeste/Centro-Oeste 0,0299** --- 0,0279
O. geoffroyi 0,0426** 0,0944** ---
Cenário 3
Sul Sudeste Centro-Oeste O. geoffroyi
Sul --- 0,0481** 0,3089 0,0760*
Sudeste 0,0490** --- 0,1884 0,0408
Centro-Oeste 0,0373 0,1115** --- 0,0384
O. geoffroyi 0,0426** 0,1294** 0,0105 ---
Cenário 4
RS/SC PR SP/RJ/ES GO/MT/MS O. geoffroyi
RS/SC --- 0,0023 0,0450 0,2436 0,0612
PR 0,0074 --- -0,0029 0,1419 0,0151
SP/RJ/ES 0,0584 ** 0,0343* --- 0,1884 0,0408
GO/MT/MS 0,0873 * 0,0094 0,1115 ** --- 0,0384
O. geoffroyi 0,0445 ** 0,0422 * 0,1294 ** 0,0105 ---
# Os valores de Rst encontram-se acima da diagonal e os de Fst abaixo. Níveis de significância **p<0,01, *p<0,05.
55
Na segunda análise, onde foram retirados os indivíduos considerados como
possíveis híbridos, a identificação do número de populações K pelo programa
STRUCTURE, sem informações prévias de procedência geográfica, geraram resultados
bem mais consistentes, com uma probabilidade maior de 0,999 da existência de apenas
uma população em Leopardus tigrinus, ao longo da área geográfica estudada.
A análise filogenética conduzida pelo método de Neighbor Joining, com a
exclusão dos possíveis híbridos, também não demonstrou forte suporte para a existência
de maiores divisões filogeográficas. O padrão geral das árvores obtidas apresentou
ramos curtos com pouca estrutura definida, sendo característico de uma expansão
populacional relativamente recente (AVISE, 2000). Os valores de “bootstrap” obtidos
foram extremamente baixos, não sustentando fortes agrupamentos. No entanto, alguns
dos agrupamentos entre indivíduos de localidades próximas repetiram-se em todas as
análises com as diferentes estimativas de distância utilizadas, como por exemplo Lti71
+ Lti86, Lti55 + Lti78 e Lti54 + Lti60, todos de São Paulo; Lti68 + Lti80, ambos do Rio
Grande do Sul; e Lti44 + Lti48, de Santa Catarina e Rio Grande do Sul, respectivamente
(Figura 7).
Apesar da alta probabilidade da existência de uma única população em L.
tigrinus ao longo da área estudada, foram definidos dois cenários diferentes de acordo
com a distribuição geográfica das amostras para verificar a ocorrência de alguma
estruturação que possa não ter sido detectada pelo programa STRUCTURE.
A construção dos dois cenários foi baseada na amostra com a exclusão dos nove
indivíduos considerados como possíveis híbridos, além dos dois indivíduos restantes
para a região Centro-Oeste, devido ao pequeno tamanho amostral resultante para esta
área. A amostra utilizada nesta análise, dessa maneira, totalizou 43 indivíduos.
56
No primeiro cenário, a amostra foi subdividida em duas populações, de acordo
com as regiões geográficas amostradas: 1) Região Sul (n=18), com os Estados do Rio
Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, e 2) Região Sudeste (n=25), com os Estados de
São Paulo, Rio de Janeiro e Espírito Santo.
No segundo cenário, a amostra foi sudividida em estados. Como alguns dos
estados amostrados apresentavam apenas um indivíduo, foram realizados diferentes
agrupamentos que geraram resultados semelhantes, sendo aqui representado somente o
seguinte: 1) RS/SC (n=12), 2) PR (n=6) e 3) SP/RJ/ES (n=25).
Assim como na primeira análise da diferenciação entre as populações de L.
tigrinus com a amostra total, nenhuma das populações pré-definidas apresentou desvios
significantes para Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de Ligação (∝=0,05,
incluindo correção de Bonferroni).
Os resultados da AMOVA revelaram os maiores valores de Fst e Rst em L.
tigrinus para o Cenário 1, sendo os dois estatisticamente significantes (Tabela 11).
Após a análise da AMOVA para os dois cenários pré-definidos, foram realizadas
comparações múltiplas entre as populações de L. tigrinus com O. geoffroyi, para cada
um dos cenários. Os valores de Fst foram significantes para todas as comparações, com
exceção de RS/SC x PR e PR x SP/RJ/ES no Cenário 2. O único valor significante para
Rst foi o da comparação entre Sul x Sudeste para o Cenário 1 (Tabela 12).
A ausência de significância para os valores de Fst nas comparações do Cenário 2
sugere um padrão de isolamento pela distância, no qual a população intermediária, PR,
não apresenta-se significantemente diferente das populações extremas.
A análise dos histogramas das freqüências alélicas obtidas para as três
populações revelaram um padrão condizente ao isolamento por distância, com a
população do Paraná apresentando alelos compartilhados somente com a população do
57
RS/SC – 235, 150 e 179, dos locos FCA391, FCA441 e F98, respectivamente, e alelos
compartilhados somente com a população de SP/RJ/ES – 164, 168 e 184 para o loco
F124 e 156 para o loco F146 (Figura 8).
As populações consideradas, RS/SC, PR e SP/RJ/ES, apresentaram um total de
4, 1 e 7 alelos exclusivos respectivamente, sendo que a análise das duas primeiras em
conjunto, correspondendo desta maneira ao agrupamento Sul x Sudeste, apresenta um
total de 8 e 7 alelos exclusivos respectivamente (Figura 8). O número de alelos
exclusivos encontrados, pode ser considerado relativamente alto, indicando uma
diferenciação moderada entre as regiões consideradas.
58
Figura 7 - Relações filogenéticas entre os oito locos de microssatélites analisados para Leopardus tigrinus (n=45, amostra sem prováveis híbridos). Árvores construídas a partir do método de Neighbor Joining com o programa NEIGHBOR do pacote PHYLIP, através de duas estimativas de distância: A) Proporção de alelos compartilhados (Dps, opção: 1 - (ps)), e B) Coeficiente de parentesco (Dkf, opção: 1 - (kf)). Valores demonstrados nos ramos representam o suporte para 100 replicações “bootstraps” (somente os valores acima de 30 estão sendo representados). Ao lado do número de identificação de cada indivíduo está demonstrado o código do estado de sua procedência.
59
Tabela 11 - Resultados da AMOVA obtidos para os dois cenários pré-definidos para a amostra de Leopardus tigrinus com exclusão dos nove indivíduos considerados como possíveis híbridos entre Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi, e das duas amostras restantes de L. tigrinus provenientes da região Centro-Oeste (n=43). Cenário 1 – Região Sul x Região Sudeste; Cenário 2 – RS/SC x PR x SP/RJ/ES. Porcentagem de Variação
Cenário 1 Cenário 2
Inter-populacional 3,74 3,65
5,05 2,88
Intra-populacional 96,26 96,35
94,95 97,12
Índice de Fixação Fst = 0,0374 ** Fst = 0,0366 **
Rst = 0,0505 * Rst = 0,0288
# Os valores superiores referem-se aos dados do Fst e os inferiores e em negrito aos do Rst. Nível de significância **p<0,01, *p<0,05.
Tabela 12 - Resultados dos testes de diferenciação populacional utilizando os índices de fixação Fst e Rst. Comparações múltiplas entre as populações de Leopardus tigrinus estabelecidas para os dois cenários pré-definidos para a amostra com exclusão dos nove indivíduos considerados como possíveis híbridos entre Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi, e dos dois indivíduos restantes de L. tigrinus provenientes da região Centro-Oeste (n=43) e comparações entre cada população de L.tigrinus com O. geoffroyi. Cenário 1
Sul Sudeste O. geoffroyi
Sul --- 0.0505* 0.0762
Sudeste 0.0374** --- 0.0408
O. geoffroyi 0.0851** 0.1294** ---
Cenário 2
RS/SC PR SP/RJ/ES O. geoffroyi
RS/SC --- - 0.0085 0.0487 0.0633
PR 0.0127 --- - 0.0073 0.0101
SP/RJ/ES 0.0494 ** 0.0228 --- 0.0408
O.geoffroyi 0.0973** 0.0653** 0.1294** ---
# Os valores de Rst encontram-se acima da diagonal e os de Fst abaixo. Nível de significância **p<0,01, *p<0,05.
60
Figura 8 - Histogramas ilustrando a distribuição das freqüências alélicas obtidas para cada um dos locos de microssatélite analisados em Leopardus tigrinus. População com a exclusão dos indivíduos considerados híbridos e dos dois indivíduos restantes para a região Centro-Oeste (n=43), dividida em estados {Rio Grande do Sul/RS e Santa Catarina/SC (n= 12); Paraná/PR (n=6); São Paulo/SP, Rio de Janeiro/RJ e Espírito Santo/ES (n= 25)}.
61
Figura 8 - Continuação
62
Figura 8 - Continuação
63
Figura 8 - Continuação
64
5. DISCUSSÃO
5.1 Variabilidade Genética, Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de
Ligação em Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi
Os níveis observados de diversidade genética nos locos de microssatélite
analisados foram altos, tanto para Leopardus tigrinus quanto para Oncifelis geoffroyi,
sendo estes levemente maiores para a primeira espécie. Apesar da amostra de O.
geoffroyi ser constituída principalmente de indivíduos provenientes do estado do Rio
Grande do Sul, não sendo amostrada grande parte de sua distribuição, a detecção do
número de alelos para esta espécie parece ter sido bastante razoável.
Uma análise anterior de microssatélites em indivíduos de O. geoffroyi
provenientes de grande parte de sua distribuição geográfica (JOHNSON et al., 1999)
compreendeu três dos oito locos analisados neste trabalho: FCA391, FCA424 e
FCA441, onde foram encontrados dez, três e cinco alelos, respectivamente. Nossa
amostragem permitiu a detecção de todos os alelos encontrados anteriormente por
JOHNSON et al. (1999) para o loco FCA424, quatro para FCA441 e cinco para FCA391.
A análise realizada por JOHNSON et al. (1999) definiu uma distribuição bastante
homogênea da variabilidade genética em O. geoffroyi ao longo de toda sua área de
ocorrência. Este padrão nos propiciou uma definição bastante razoável dos níveis de
variabilidade nesta espécie, apesar da amostra concentrada regionalmente.
Apesar da impossibilidade de se fazer comparações diretas dos níveis de
variabilidade genética entre L. tigrinus e outras espécies de felídeos, devido ao fato de
geralmente os locos analisados em diferentes trabalhos não serem os mesmos, podemos
realizar avaliações mais gerais entre estas espécies. Ao compararmos os níveis de
diversidade genética (heterozigosidade média observada e número médio de alelos por
65
loco) encontrados em L. tigrinus com outras espécies de felídeos também analisadas por
microssatélites, encontramos níveis tão ou mais altos de diversidade para esta espécie
(MENOTTI-RAYMOND & O’BRIEN, 1995; JOHNSON et al., 1999; SPONG et al., 2000;
EIZIRIK et al., 2001).
Os testes de Equilíbrio de Hardy-Weinberg revelaram a existência de desvios
significativos entre a proporção de heterozigotos observada e esperada para um loco
(F98) em Leopardus tigrinus e em nenhum dos locos para Oncifelis geoffroyi. No caso
do loco F98, foi detectado um déficit de heterozigotos de acordo com o esperado. A
deficiência no número de heterozigotos pode ser atribuída a diversas causas como a
existência de seleção sob o loco em questão, a presença de alelos nulos levando a uma
falsa observação do excesso de homozigotos, existência de endocruzamento e a
presença de subestruturação, levando ao efeito Wahlund (MURRAY, 1996).
A presença de seleção agindo sob o loco foi, primeiramente, afastada devido a
neutralidade seletiva apresentada por estes maracdores (MURRAY, 1996). No entanto,
SLATKIN (1995b) demonstrou a possibilidade de existência de ligação entre locos de
microssatélite a locos não neutros, que estariam sob pressão seletiva, diminuindo os
níveis de variabilidade do marcador.
A existência de alelos nulos não pode ser totalmente descartada, sendo
necessárias análises mais detalhadas sobre este loco para verificação desta hipótese,
envolvendo, por exemplo, a análise de pedigrees conhecidos (MURRAY, 1996).
A ocorrência de endocruzamento foi afastada em favor da hipótese de existência
de uma subestruturação populacional. Se houver uma subestruturação natural e
considerarmos a amostra como uma única população, um déficit de heterozigotos pode
ser encontrado mesmo que cada subpopulação encontre-se em equilíbrio de Hardy-
Weinberg, evento conhecido como Efeito Wahlund (NEI, 1987).
66
Esta possibilidade torna-se extremamente plausível devido à detecção de
indivíduos identificados fenotipicamente como L. tigrinus com ancestralidade
significante em O. geoffroyi. A análise posterior do teste de Equilíbrio de Hardy-
Weinberg, com exclusão destes indivíduos (não mais revelando desvios significantes
entre a proporção de heterozigotos observada e esperada para nenhum dos locos)
corrobora esta hipótese. Possivelmente, a existência de indivíduos de L. tigrinus com
características genéticas de O. geoffroyi tenha provocado os desvios significativos,
sendo a população desta espécie subestruturada em indivíduos puros e híbridos com O.
geoffroyi.
Da mesma maneira, a existência de desequilíbrio de ligação entre locos pode ser
tanto indicação de uma ligação real entre os locos, quanto gerada por artefatos de uma
sub-estruração ou endocruzamento existente entre as populações (OTHA, 1982), assim
como devido a ocorrência de eventos de hibridação (ALLENDORF et al., 2001). Como os
locos encontrados em desequilíbrio para L. tigrinus encontram-se em diferentes
cromossomos em Felis catus (MENOTTI-RAYMOND et al. 1999), e devido a eliminação
deste evento na análise posterior com exclusão dos possíveis híbridos, possivelmente
este tenha sido gerado também pela ocorrência de hibridação entre as duas espécies.
5.2 Reconhecimento de Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi como Unidades
Geneticamente Distintas
Os alelos detectados para os locos de microssatélite analisados foram em sua
grande maioria compartilhados entre as duas espécies, tendo L. tigrinus apresentado um
maior número de alelos exclusivos comparados a O. geoffroyi. Para a maioria dos casos
as freqüências alélicas encontradas também foram bastante semelhantes entre as duas
espécies.
67
A primeira análise de diferenciação genética entre as duas espécies gerou valores
de Rst baixos e não significantes (p>0,05) e Fst significativos (p<0,01), mas
extremamente baixos para considerações entre espécies. Valores altos normalmente são
encontrados para comparações interespecíficas, como por exemplo, Fst=0,33 e Rst=0,26
(p<0,01) para lobos cinza Canis lupus e cães domésticos Canis familiaris (RANDI &
LUCCHINI, 2002).
A análise filogenética entre as duas espécies através do método de Neighbor
Joining, assim como a definição das proporções de atribuição destas a diferentes grupos
pelo programa STRUCTURE, falharam em definir grupos completamente distintos
entre elas. No entanto, o método Bayesiano utilizado pelo programa STRUCTURE
mostrou-se bem mais eficiente neste agrupamento do que o método de distância
empregado pela análise por Neighbor Joining. Os métodos baseados em distâncias entre
os indivíduos sofrem de várias desvantagens, como a identificação dos agrupamentos,
que podem ser fortemente dependentes da medida de distância utilizada e do método de
representação gráfica escolhido, dificultando sua confiabilidade. Além disso, neste
método a incorporação de informações adicionais como procedência geográfica ou
características fenotípicas dos indivíduos torna-se complicada. Assim, métodos
baseados em distâncias genéticas podem ser vistos como sendo mais apropriados para
análises exploratórias dos dados do que para inferências estatísticas (PRITCHARD et al.
2000).
A ausência da identificação de grupos totalmente distintos entre as duas espécies
pode ser devida a uma separação evolutiva incompleta entre elas; à existência de um
alto número de homoplasias, saturando os locos utilizados como marcadores
informativos; ou a um reflexo da existência de eventos de hibridação e introgressão.
68
A separação evolutiva incompleta entre as duas espécies parece pouco provável
tendo em vista análises prévias sob diferentes marcadores moleculares revelando uma
clara diferenciação monofilética entre estas (como por exemplo MASUDA et al., 1996;
JOHNSON et al., 1996; JOHNSON & O´BRIEN, 1997; JOHNSON et al., 1999; MATTERN &
MCLENNAN, 2000).
As duas outras possibilidades não podem ser totalmente descartadas. A
existência de um grande número de homoplasias realmente poderia levar a uma
saturação dos locos escolhidos como marcadores informativos. O aumento do nível
taxonômico a ser comparado (como interespecífico) aumenta também a quantidade de
homplasias que afetam a eficiência dos microssatélites neste tipo de comparação
(MURRAY, 1996; CULVER et al., 2001).
A existência de hibridação e introgressão entre as duas espécies também pode
ser responsável pelo padrão observado e apresenta, segundo nossas análises, grandes
indícios de veracidade. Estes indícios são principalmente devidos ao aumento nos
valores de Fst, Rst e “q” de associação das espécies aos respectivos grupos definidos
pelo programa STRUCTURE, assim como pela eliminação de desvios significantes do
equilíbrio de Hardy-Weinberg e Desequilíbrio de Ligação em L. tigrinus, após a
exclusão dos nove indivíduos considerados como híbridos. Juntamente a estes fatores,
podemos considerar ainda a existência de alelos compartilhados apenas por O. geoffroyi
e as populações de origem dos possíveis híbridos identificados, podendo sugerir a
existência de introgressão entre estas espécies. Além disso, os nove indivíduos
identificados por nossa análise como possíveis híbridos apresentam em sua maioria
procedências geográficas compatíveis a de uma zona de hibridação, sendo cinco deles
provenientes do estado do Rio Grande do Sul, três da região Centro-Oeste e um do
Paraná.
69
Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi apresentam distribuições basicamente
parapátricas na Região Neotropical, com a primeira ocorrendo do sul da Costa Rica até
o Rio Grande do Sul e nordeste da Argentina e a segunda desde a Bolívia e o chaco
paraguaio até o sul do Chile, cobrindo praticamente toda a Argentina, o Uruguai e parte
da região sul brasileira (OLIVEIRA, 1994; EISENBERG & REDFORD, 1999) (Anexo 1).
Segundo E. EIZIRIK (dados não publicados), as duas espécies apresentam uma
fina área de sobreposição na região central do estado do Rio Grande do Sul, coincidente
com as procedências de cinco indivíduos considerados como possíveis híbridos, sendo
dois deles do município de Guaíba e um para cada um dos municípios de Triunfo,
Cachoeira do Sul e Restinga Seca.
Além da definição desta área de sobreposição, a identificação de características
fenotípicas ambíguas em indivíduos das duas espécies já havia sido observada nesta
região (E. EIZIRIK, com. pes.). Os principais caracteres usados para a diferenciação entre
as duas espécies, constituem o tamanho corporal e o padrão da pelagem. L. tigrinus
apresenta um comprimento total entre 60,4 – 91,1 cm e peso de 1,75 – 3,5 kg, e sua
pelagem, geralmente é ocre com manchas formando rosetas de bordas negras e centro
castanho. O. geoffroyi apresenta um porte levemente maior com comprimento total de
67 - 105,6 cm e peso de 2 - 6 kg, sendo sua pelagem cinza, com pequenas pintas pretas
sólidas e bem próximas (OLIVEIRA & CASSARO, 1999) (Anexo 2). Os indivíduos
identificados como possíveis híbridos no estado do Rio Grande do Sul foram todos
identificados por nossa equipe, apresentando características diagnósticas de L. tigrinus,
sendo pelo menos para estes casos afastada a hipótese de identificação incorreta. Os
indivíduos provenientes das outras áreas geográficas foram coletados por colaboradores
do projeto, sendo apenas as amostras enviadas para o laboratório. No entanto, a
70
identificação de espécies por estes colaboradores é bastante confiável, o que dificulta a
possibilidade de identificação incorreta.
A detecção de indivíduos híbridos é feita normalmente pela análise de
características morfológicas, entretanto, nem toda variação morfológica apresenta uma
base genética. A detecção de híbridos utilizando caracteres morfológicos geralmente
assume que estes serão fenotipicamente intermediários em relação às espécies genitoras,
mas muitas vezes indivíduos híbridos que contêm muitos dos genes de um dos táxons
parentais são frequentemente morfologicamente indistinguíveis deste (ALLENDORF et
al., 2001).
A avaliação da existência de hibridação entre O. geoffroyi e L. tigrinus na região
Centro-Oeste, onde foram identificados possíveis híbridos nos estados de Goiás e Mato
Grosso do Sul, é dificultada pela falta de registros precisos de ocorrência da primeira
espécie. Segundo a literatura, a distribuição norte de O. geoffroyi estende-se até o
Paraguai, no entanto sua entrada em território brasileiro por estas vias permanece
obscura (OLIVEIRA, 1994). A vegetação característica desta área parece ser favorável ao
deslocamento e ocorrência de O. geoffroyi que caracteriza-se por apresentar
preferências por habitats abertos (NOWELL & JACKSON, 1996). A região do Chaco
Paraguaio, de ocorrência confirmada para a espécie, apresenta-se como uma
continuação do cerrado característico da região Central do Brasil.
A verificação de eventos de hibridação e introgressão nesta área envolve maiores
estudos tanto ecológicos quanto genéticos. Ecologicamente, é necessária a definição
exata da ocorrência e possível contato entre as duas espécies nestas áreas.
Geneticamente, a análise de outros marcadores moleculares, com uma maior
amostragem para esta região, torna-se imprenscindível, principalmente para verificação
de que a identificação destes indivíduos como híbridos não constituam artefatos de
71
nossa análise. É possível que os indivíduos desta área apresentem características
genéticas diferenciadas dos outros L. tigrinus analisados, que por falta de um tamanho
amostral mais adequado acabaram por agrupar com O. geoffroyi equivocadamente.
Além destes fatores, a hipótese de procedência incorreta pelo menos para Lti24,
não pode ser descartada, pois este constitui um indivíduo de cativeiro sem procedência a
nível de município coletada pela instituição responsável. O mesmo ocorre para Lti88,
proveniente do Paraná e considerado como um possível híbrido por nossas análises. É
bastante razoável que estes indivíduos, apresentem uma procedência provável nos
registros das Instituições que podem não revelar a sua verdadeira origem.
A possibilidade de hibridação entre L. tigrinus e O. geoffroyi também torna-se
extremamente viável, visto a existência de registros confirmados pela análise de
DNAmt e sequenciamento de genes do cromossomo Y, de casos de hibridação entre L.
tigrinus e Lynchailurus colocolo nas áreas de contato entre as duas espécies (JOHNSON
et al. 1999). É possível que a existência de eventos de hibridação, ou até mesmo de
zonas híbridas, seja um fato razoavelmente comum entre os felídeos de pequeno porte
da região neotropical.
A existência de uma possível hibridação entre as duas espécies pode nunca ter
sido sugerida por outros estudos moleculares, devido à falta de uma amostragem mais
concentrada nas regiões de contato entre as duas espécies. A confirmação exata destes
eventos deve ser realizada através da caracterização genética das duas espécies pela
análise de outros marcadores moleculares, como seqüências de segmentos do DNAmt e
de genes localizados em diferentes autossomos e nos cromossomos X e Y, incluindo
uma boa amostragem das regiões de contato entre elas, assim como de toda sua
distribuição geográfica. Além da análise molecular, a avaliação de uma possível zona
híbrida entre as duas espécies deve ser melhor avaliada por estudos mais aprofundados
72
sobre a ocorrência geográfica exata de cada uma das espécies, da amplitude das áreas de
contato entre elas e de suas relações ecológicas e padrões morfológicos nestas em
comparação a áreas fora do contato.
Se houver, realmente, a confirmação da existência de hibridação entre as espécies,
diversas outras análises serão necessárias para um melhor entendimento deste processo
como: 1) a definição do tipo de hibridação, se casual ou com a manutenção de uma zona
híbrida constante; 2) a investigação da existência de processos de introgressão
avançados, se unidirecionais ou bidirecionais e em que magnitude; 3) a avaliação da
viabilidade dos híbridos e suas características ecológicas e reprodutivas; 4) a definição
das causas deste evento, se originados durante uma divergência primária ou após um
contato secundário entre as duas espécies; e 5) a investigação de se a hibridação é
resultado de eventos históricos de origem natural ou recentes de origem antropogênica
(HARRISON, 1993; ALLENDORF et al., 2001; BARTON, 2001; HEWITT, 2001).
5.3 Considerações sobre os Índices de Diferenciação Genética Fst e Rst
Uma das medidas mais adequadas da subdivisão populacional constitui na
estatística F de WRIGHT (1965). Um grande número de estimadores baseados nesta
estatística tem sido desenvolvidos.
As estimativas de diferenciação genética com a utilização de microssatélites
podem ser resumidas em duas categorias extremas: os estimadores baseados em
modelos de evolução IAM “Infinite Alleles Model” (KIMURA & CROW, 1964) e em
modelos SMM “Stepwise Mutation Model” (KIMURA & OTHA, 1978). O modelo IAM
de alelos infinitos assume que cada mutação origina um novo alelo não encontrado
previamente na população, a uma dada taxa µ. Neste caso, alelos idênticos
compartilham a mesma ancestralidade e são idênticos por descendência. O modelo
73
SMM assume que cada mutação cria um novo alelo, que já poderia estar presente
previameente na população (alelos idênticos por estado), tanto pela adição quanto pela
deleção de uma ou mais unidades repetitivas, com uma probabilidade µ/2 em ambas as
direções. Consequentemente, alelos de tamanhos muito diferentes serão mais
distantemente relacionados do que alelos similares (KIMURA & CROW, 1964; KIMURA &
OTHA, 1978). Além disso, este modelo considera a existência de homoplasias de
tamanho, uma condição sob a qual alelos comigrantes de mesmo tamanho não são
idênticos por descendência ou em seqüência de DNA entre diferentes indivíduos
(CULVER et al., 2001).
Tanto estimadores baseados em modelos IAM quanto SMM têm sido utilizados
em estudos de estruturas populacionais com microssatélites, não havendo um consenso
quanto ao melhor modelo a ser utilizado.
Os dois estimadores utilizados no presente trabalho representam os dois modelos
evolutivos, sendo o Fst análogo de WEIR & COKERHAM (1984), assumindo o modelo de
IAM e considerando somente a variância nas freqüências alélicas e a identidade dos
alelos, e o Rst de SLATKIN (1995a), o modelo SMM, considerando a variância no
número de repetições e relacionando diferenças de tamanho a distâncias evolutivas entre
os alelos.
Os locos de microssatélite parecem assumir, de modo geral, uma evolução do
tipo SMM (VALDEZ et al., 1993). Assumindo-se este modelo, as mutações em locos de
microssatélite tenderiam a resultar em alelos com número de repetições similares aos
alelos dos quais se originaram, gerando eventos de homoplasia que poderiam levar a
uma subestimativa da real diferenciação entre as populações (SLATKIN, 1995a;
GOLDSTEIN et al., 1995). Neste caso os valores obtidos para Rst seriam mais adequados
para a interpretação dos dados, ao considerarem a ocorrência destes eventos.
74
No entanto, o processo mutacional dos microssatélites ainda permanece não
totalmente compreendido, existindo várias controvérsias quanto ao modelo a ser
assumido, sendo que nenhum deles parece se ajustar perfeitamente a todos
microssatélites (ESTOUP & CORNUET, 1999; BALLOUX & LUGON-MOULIN, 2002).
A aplicabilidade do modelo de mutação SMM para descrever a evolução dos
alelos de microssatélite permanece em aberto, e mesmo sob estritas condições de
“stepwise-mutation”, os valores obtidos para Rst ainda podem ser menos apropriados
para a interpretação da diferenciação populacional do que os de Fst, devido à alta
variância associada àqueles. Sob um modelo estrito de SMM, Rst irá gerar melhores
resultados que o Fst ao reduzir-se a variância amostral, por exemplo, pelo aumento do
número de populações amostradas, do número de indivíduos por população ou do
número de locos analisados (GAGGIOTTI et al., 1999; BALLOUX & GOUDET, 2002).
Os valores obtidos neste trabalho para a diferenciação populacional de L.
tigrinus mostraram-se moderadamente distintos entre os índices Rst e Fst, com o último,
na maioria das vezes, indicando níveis superiores de diferenciação com valores
geralmente significantes. Como não há um consenso quanto ao melhor estimador a ser
utilizado, a melhor alternativa consitui a comparação crítica dos valores obtidos para os
dois índices e da situação analisada, de maneira a obter as melhores informações sobre a
estrutura genética das populações em questão (BALLOUX & LUGON-MOLIN, 2002).
A tendência geral quanto à melhor avaliação dos dois estimadores é de que para
períodos curtos de tempo (na ordem de dezenas a centenas de gerações), onde os efeitos
das mutações são mínimos e as diferenças nas freqüências alélicas são determinadas
principalmente pela deriva genética, os estimadores baseados no modelo IAM seriam os
mais adequados. Para períodos de tempo mais longos, onde os efeitos das mutações
75
aumentam, os estimadores segundo modelo SMM geram as medidas mais apropriadas
(SLATKIN, 1995a; GOLDSTEIN et al., 1995; MURRAY, 1996).
Levando-se em conta estes aspectos e considerando L. tigrinus como uma
espécie evolutivamente jovem, cujas populações do Sudeste e Sul do Brasil parecem ter
sofrido uma expansão bastante recente com base em dados do DNAmt (JOHNSON et al.,
1999; E. EIZIRIK, com. pes.), os valores obtidos para Fst, assumindo modelo IAM
seriam os mais adequados para a interpretação da estrutura populacional de L. tigrinus.
Os níveis de fluxo gênico e o grau de estruturação das populações também
podem ser utilizados como auxiliares na interpretação dos valores obtidos. Segundo
BALLOUX & GOUDET (2002), quando as populações apresentam-se fortemente
estruturadas, com um nível restrito de fluxo gênico, os efeitos da mutação podem
tornar-se importantes relativos a migração gerando valores de Rst mais adequados.
Todavia, quando as populações estão fracamente estruturadas, com altos níveis de fluxo
gênico, diluindo os efeitos das mutações, a melhor estimativa constituiria no Fst.
(BALLOUX & LUGON-MOULIN, 2002).
Novamente, os dados obtidos e as informações disponíveis para L. tigrinus são
condizentes à interpretação dos valores de Fst. Nossos resultados, tanto pela análise
filogenética quanto Bayesiana, não revelaram uma estruturação populacional acentuada
dentro da área estudada, sugerindo que estas populações de L. tigrinus são
caracterizadas por uma história evolutiva recente e altos níveis de fluxo gênico.
Outro aspecto a ser considerado constitui a avaliação dos valores de Fst e Rst
obtidos. SLATKIN (1995a) sugere a comparação destes valores, sendo que, se o modelo
mutacional SMM aplicar-se melhor aos locos de microssatélite utilizados, os valores de
Rst encontrados tenderão a ser maiores que os de Fst. Segundo esta informação, os
locos analisados neste trabalho podem assumir um modelo de evolução IAM, visto que
76
a maioria dos valores de Fst foram mais elevados que os obtidos para Rst. Do mesmo
modo, LUGON-MOULIN et al. (1999) relatam a ocorrência de valores de Fst maiores que
os de Rst para populações com baixos níveis de diferenciação como as de L. tigrinus.
O tamanho da amostra utlizada também pode influenciar a interpretação dos
resultados, sendo que GAGGIOTTI et al. (1999), ao comparar os índices Fst e Rst,
concluíram que a performance relativa destes é dependente principalmente do tamanho
amostral analisado, com Fst sendo o melhor estimador para amostras pequenas (n<50),
o que adequada-se a nossos dados.
5.4 Estrutura Genética de Leopardus tigrinus
As análises da estrutura genética em L. tigrinus não demonstraram fortes
evidências de uma subdivisão maior da espécie dentro da área estudada.
Apesar de a primeira análise de definição da estrutura populacional, realizada
incluindo a amostra total (n=54), não ter gerado resultados satisfatórios pelo programa
STRUCTURE, a segunda análise com a exclusão dos híbridos, revelou uma
probabilidade extremamente alta da existência de apenas uma grande população ao
longo da área estudada. A falta de resolução do número de populações na primeira
análise pode ter sido provocada pela influência dos indivíduos considerados como
prováveis híbridos com O. geoffroyi. Provavelmente, a presença das características
genéticas de O. geoffroyi nos indivíduos considerados como híbridos tenha dificultado a
definição do número de populações em L. tigrinus.
As análises filogenéticas realizadas corroboram os resultados encontrados pelo
programa STRUCTURE, não indicando agrupamentos geográficos consistentes, com
exceção de poucos indivíduos de localidades próximas, sugerindo altos níveis de fluxo
gênico para esta espécie. O padrão obtido nas árvores filogenéticas aproxima-se de uma
77
filogenia do tipo estrela, com ramos curtos e pouca estruturação, característico de uma
expansão populacional relativamente recente (AVISE, 2000). Da mesma maneira, a
distribuição basicamente unimodal das freqüências alélicas obtidas para todos os locos
analisados corroboram este padrão de expansão demográfica (REICH & GOLDSTEIN,
1998).
Apesar da ausência de diferenciações populacionais profundas dentro da área
estudada, a análise de diferentes cenários construídos de acordo com a distribuição
geográfica das amostras obtidas revelou alguns níveis de diferenciação.
Os valores de Fst foram maximizados (tanto na análise com toda a amostra
quanto com a exclusão dos híbridos) nos cenários que consideram as regiões Sul e
Sudeste como populações distintas. Os valores de diferenciação, obtidos para estas
comparações podem ser considerados de leves a moderados (0<Fst<0,15) (HARTL &
CLARK, 1997), o mesmo ocorrendo para os cenários considerando a divisão em estados.
Esta diferenciação pode também ser verificada pelo número relativamente elevado de
alelos exclusivos presentes nas populações Sul e Sudeste.
Considerando-se as comparações entre estados na amostra com exclusão dos
possíveis híbridos, podemos observar um padrão sugestivo de isolamento pela distância,
com os extremos da distribuição analisada, RS/SC e SP/RJ/ES diferenciando-se
significativamente entre si e não em relação à população intermediária PR. Na análise
incluindo toda a amostra este padrão não demonstra-se tão claro, principalmente devido
aos valores significantes de Fst entre PR e SP/RJ/ES. Este pode claramente ter sido
influenciado pelo agrupamento de Lti88, identificado como possível híbrido, à amostra
do PR, principalmente considerando-se o pequeno tamanho amostral desta área.
As primeiras análises geradas com toda a amostra de L. tigrinus demonstram
claramente a influência dos possíveis híbridos na definição da estrutura genética da
78
espécie. As comparações entre regiões revelaram valores maiores de Fst entre Sul e
Sudeste quando a amostra do Centro-Oeste estava adicionada ao primeiro grupo, assim
como uma maior diferenciação entre Sudeste e O. geoffroyi. A inclusão da amostra do
Centro-Oeste ao grupo da região Sudeste diluiu a diferenciação genética entre todos os
grupos. Neste caso, a existência de possíveis híbridos com O. geoffroyi nas regiões Sul e
Centro-Oeste levou a uma homogeneidade maior entre estas populações e a uma maior
diferenciação com o Sudeste, onde não foi detectada a existência de nenhum híbrido.
Na segunda análise (com a exclusão dos híbridos), os valores de diferenciação
entre Sul e O. geoffroyi tornaram-se mais elevados, sendo considerados níveis
moderados de diferenciação (HARTL & CLARK, 1997). No entanto, uma maior
diferenciação entre O. geoffroyi e Sudeste permaneceu se comparada a O. geoffroyi e
Sul. Estes resultados podem indicar a presença de maiores níveis de hibridação e
introgressão entre as duas espécies que não foram detectados por nossas análises.
Infelizmente, o tamanho amostral extremamente reduzido da amostra restante do
Centro-Oeste, após a exclusão dos híbridos, impediu uma avaliação mais detalhada da
relação estrutural desta região dentro de L. tigrinus.
Estimativas do número de migrantes por geração (Nm) entre as populações
foram realizadas a partir dos índices Fst e Rst, obtendo-se valores altos, acima de 1, para
todas as comparações. Entretanto, estes valores não podem ser interpretados
corretamente neste caso, como uma medida de fluxo gênico, pois podem facilmente
estar sendo superestimados ao considerarmos a existência de uma origem recente
comum entre estas populações (TEMPLETON, 1998).
Apesar da forte carência em estudos ecológicos em ambiente selvagem para esta
espécie, sendo praticamente desconhecidos seus hábitos na natureza, densidade,
relações com outras espécies e requerimento de habitats (NOWELL & JACKSON, 1996),
79
algumas informações existentes quanto à sua biologia são coerentes com nossa
inferência de altos níveis de fluxo gênico e ausência de uma estrutura genética bem
definida dentro da área estudada.
Apesar de se acreditar que a espécie ocupe predominantemente áreas de florestas
úmidas tropicais e subtropicais a níveis elevados acima de 100 metros do nível do mar
(NOWAK, 1999), existem registros nos mais variados ambientes, incluindo florestas
secundárias, cerrados, plantações abandonadas de eucaliptos, áreas próximas a
plantações, urbanizações e altamente afetadas pelo desmatamento, além de áreas
bastante baixas, principalmente ao nível do mar (OLIVEIRA, 1994; NOWELL & JACKSON,
1996; OLIVEIRA & CASSARO, 1999). A existência destes registros pode sugerir uma alta
capacidade de dispersão ao longo de diferentes habitats e até mesmo uma certa
tolerância a alterações ambientais. Além disso, considerando-se dados para outras
espécies de felídeos, normalmente os integrantes desta família apresentam-se como
dispersores a longas distâncias compreendendo grandes áreas de vida (OLIVEIRA, 1994;
NOWELL & JACKSON, 1996).
De modo geral, o padrão de estrutura genética observado em L. tigrinus pode ser
interpretado como resultado de uma recente expansão populacional da espécie dentro da
área estudada, com um tempo e/ou barreiras insuficientes para extensiva diferenciação
genética, acompanhado por altos níveis de fluxo gênico. Provavelmente a região
analisada neste estudo compreenda uma grande população, apresentando apenas um
isolamento dos indivíduos de áreas extremas pela distância geográfica existente entre
eles.
80
5.5 Implicações para a Conservação
Nossos resultados apresentam implicações relevantes para a conservação e o
manejo de Leopardus tigrinus tanto em ambiente selvagem quanto em cativeiro.
Os dados obtidos não indicaram a existência de partições geográficas históricas
dentro da espécie, não tendo sido possível a identificação de Unidades Evolutivamente
Significativas. No entanto, a obtenção de valores moderados de Fst entre os indivíduos
provenientes das regiões Sul e Sudeste, gerando evidências de um padrão de isolamento
pela distância, podem requerer certo cuidado no manejo destas populações,
principalmente no caso da possibilidade de hibridação com O. geoffroyi em suas áreas
de contato. Este cuidado é também apropriado considerando a possibilidade da
existência de adaptações locais não detectadas por nossos marcadores (LYNCH, 1996).
A partir dos resultados obtidos, sugerimos que as populações das regiões Sul e
Sudeste sejam consideradas pelo menos como Unidades de Manejo distintas, sendo a
reprodução de indivíduos mantidos em cativeiro provenientes dos extremos desta
distribuição, assim como a translocação destes, evitada, de maneira a manter a estrutura
genética observada na natureza.
De modo geral, a distribuição da variabilidade genética em L. tigrinus parece
não apresentar barreiras geográficas ou ecológicas significativas ao fluxo gênico, sendo
necessária a consideração destes aspectos na elaboração de estratégias para a
conservação da espécie e de seus habitats. A manutenção e proteção das áreas florestais
remanescentes ao longo desta área que podem funcionar como corredores de dispersão
entre os indíviduos de localidades diferentes, associado a um estudo aprofundado dos
requerimentos específicos de habitat pela espécie e seus padrões de dispersão e
tolerância a alterações ambientais, são fundamentais para uma melhor estratégia de
conservação.
81
Associado a estes aspectos, torna-se de fundamental importância a investigação
minuciosa da existência de possíveis zonas híbridas entre L. tigrinus e O. geoffroyi.
Nossos dados fornecem fortes evidências destes eventos, no entanto é necessário que
diversos outros estudos, tanto moleculares quanto morfológicos e ecológicos, sejam
conduzidas nestas duas espécies a fim de se desvendar estes processos.
Segundo ALLENDORF et al. (2001), dois tipos de estudo a respeito da hibridação
entre espécies são de fundamental importância para sua conservação. O primeiro inclui
a definição da causa destes eventos: será a hibridação entre L. tigrinus e O. geoffroyi um
evento histórico e natural, ou recente e provocado pela alteração de seus habitats? A
resolução desta questão pode ser complexa, mas é também crucial para a elaboração de
estratégias específicas de manejo e conservação.
A hibridação ocorrendo naturalmente não necessariamente provoca impactos
negativos na persistência das espécies, sendo neste caso considerada como um processo
evolutivo natural, constando como parte do legado histórico das espécies (WAYNE &
BROWN, 2001). Centenas de zonas híbridas têm sido documentadas em vertebrados,
sendo a maioria delas de distribuição reduzida se comparada à distribuição geográfica
total das espécies hibridizantes (HARRISON, 1993).
A hibridação torna-se um problema para a conservação se for provocada por
mudanças no habitat ou na composição das espécies. Se realmente estes processos
estiverem sendo causados por um contato secundário entre as duas espécies, provocados
pela ação humana, medidas urgentes de manejo devem ser tomadas de maneira a
impedir um comprometimento de suas histórias evolutivas e integridade genética
(WAYNE & BROWN, 2001).
Casos de hibridação entre espécies de carnívoros provocados pela intervenção
humana têm sido documentados, gerando medidas específicas de manejo, como por
82
exemplo, entre coiotes Canis latrans e lobos cinza Canis lupus devido a alterações em
seus habitats e suas densidades relativas por programas de controle de predadores
(WAYNE & BROWN, 2001).
O segundo tipo de estudo envolve a investigação da existência da fertilidade,
vigor e adaptação local dos híbridos. Se estes constituírem indivíduos férteis, adaptados
às condições locais, e acasalarem tanto entre si quanto com indivíduos parentais, após
algumas gerações este processo pode levar a uma população na qual essencialmente
todos os indivíduos são de origem híbrida. Com o avanço de sucessivas gerações na
população, a proporção de indivíduos de origem híbrida pode aumentar
progressivamente, enquanto que a proporção de indivíduos parentais decair, podendo
levar a eventos de extinção local das populações puras (ALLENDORF et al., 2001).
Como medidas imediatas para auxiliar no manejo e conservação de O. geoffroyi
e L. tigrinus, sugerimos que nenhum indivíduo proveniente das áreas de contato entre as
duas espécies seja utilizado em programas de reprodução em cativeiro, até que haja um
maior esclarecimento desta questão. A reprodução de indivíduos provenientes destas
áreas de contato com indivíduos de áreas mais distantes pode acentuar os efeitos de uma
zona de hibridação, se esta for natural, o que não seria condizente com a história
evolutiva das espécies. No caso de uma zona de hibridação provocada pela alteração de
habitats, a realização de tais acasalamentos seria mais drástica ainda, pois estaríamos
acentuando um processo não natural, de maneira irreversível e de profundas
conseqüências negativas para a conservação destas espécies, como a erosão de suas
integridades genéticas.
83
6. RESUMO E CONCLUSÕES
Preocupações com a conservação da biodiversidade representam também a
conservação da diversidade genética, que constitui o foco central da Genética da
Conservação. Estudos realizados nesta área têm gerado informações preciosas e
aplicáveis diretamente no manejo e conservação das espécies, tanto em ambiente
selvagem quanto em cativeiro.
Leopardus tigrinus constitui uma das espécies mais desconhecidas dentre os
felídeos da Região Neotropical. Atualmente, a espécie encontra-se ameaçada
principalmente pela destruição dos ambientes naturais onde ocorre. Além disso, a
definição de estratégias adequadas para sua conservação é dificultada pela falta de
conhecimentos específicos sobre seus hábitos na natureza, densidade, estrutura
populacional e requerimento específico de habitats.
Com o objetivo de se avaliar os níveis de variabilidade e estrutura genética das
populações de L. tigrinus nas regiões Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil de maneira a
auxiliar em programas de conservação da espécie, foram analisados oito locos de
microssatélite em 54 indivíduos provenientes da natureza ou de cativeiro. A análise
envolveu ainda 20 indivíduos de Oncifelis geoffroyi, espécie proximamente relacionada
a L. tigrinus, provenientes basicamente do Estado do Rio Grande do Sul, a serem
utilizados como grupo externo nas análises populacionais e como comparação dos
níveis de diversidade genética interespecíficos.
Foram encontrados níveis semelhantes e relativamente altos de diversidade
genética para as duas espécies, sendo estes levemente maiores para L. tigrinus. Nossos
resultados revelaram uma grande similaridade genética nestes marcadores entre L.
tigrinus e O. geoffroyi.
84
Análises utilizando métodos Bayesianos para alocar indivíduos a suas
populações de origem, identificaram nove espécimes de L. tigrinus com ancestralidade
significante em O. geoffroyi. Estes indivíduos, considerados como possíveis híbridos
entre as duas espécies, foram retirados das análises gerando uma maior diferenciação
genética entre L. tigrinus e O. geoffroyi. Provavelmente, as características miscigenadas
encontradas nos possíveis híbridos estariam provocando uma maior homogeneização
genética entre as duas espécies.
Os nove indivíduos identificados como possíveis híbridos apresentaram em sua
maioria, procedências geográficas compatíveis a uma zona de hibridação. Cinco destes
foram provenientes da região central do Estado do Rio Grande do Sul, onde é
comprovado o contato entre as duas espécies; três da região central do Brasil, onde a
ocorrência de O. geoffroyi não é confirmada, mas as características da vegetação local
propiciam sua dispersão; e um indivíduo proveniente do Paraná, sendo possivelmente
explicado por uma procedência geográfica incorreta.
A análise da estrutura populacional de L. tigrinus revelou um padrão esperado
para populações que sofreram com uma recente expansão demográfica, com um tempo
e/ou barreiras insuficientes para gerar uma estruturação populacional extensiva. No
entanto, diferenciações moderadas detectadas entre indivíduos provenientes das regiões
Sul e Sudeste do Brasil indicam um padrão de isolamento pela distância dentro da área
estudada. Comparações entre populações de L. tigrinus e O. geoffroyi com a exclusão
dos nove indivíduos considerados como híbridos indicam ainda haver uma maior
similaridade entre indivíduos provenientes da região Sul do país do que da região
Sudeste a O. geoffroyi, sugerindo que os eventos de hibridação entre estas espécies
possam apresentar maior magnitude do que a detectada neste trabalho.
85
Podemos concluir, a partir dos resultados obtidos, que L. tigrinus apresenta-se
como uma espécie evolutivamente recente, com moderados níveis de variabilidade
genética, altos níveis de fluxo gênico e sem uma diferenciação populacional histórica
significativa. A estrutura genética dentro de L. tigrinus nesta área parece ser recente e
provocada principalmente pelo isolamento dos indivíduos de localidades extremas pela
distância geográfica, e pela influência de possíveis eventos de hibridação com O.
geoffroyi em suas áreas de contato.
Para fins de manejo, as populações das regiões Sul e Sudeste podem ser
consideradas como Unidades de Manejo distintas, sendo evitados os cruzamentos e
translocações entre indivíduos provenientes das áreas extremas desta distribuição.
Para a conservação das duas espécies em questão, é extremamente necessária a
condução de estudos mais aprofundados que esclareçam os padrões de hibridação entre
L. tigrinus e O. geoffroyi, sendo sugerido como medida imediata que nenhum indivíduo
proveniente das áreas de contato entre as duas espécies seja utilizado em programas de
reprodução em cativeiro até que estes padrões estejam resolvidos de forma mais
detalhada.
86
7. SUMMARY AND CONCLUSIONS
Conservation of biodiversity includes conservation of the genetic diversity, which
is the focus of Conservation Genetics. Studies in such discipline have provided
important information that can be applied directly to the management and conservation
of species in their natural environment as well as in captive state.
Leopardus tigrinus constitutes one of the most unknown species of Felidae in the
Neotropical region. Nowadays, this species is endangered due to the destruction of its
habitats. Moreover, the definition of adequate strategies for its conservation is difficult
because of the lack of specific knowledge about their behavior in natural environment,
population density and structure and even requirements in terms of habitat.
The main goal of the present work was to investigate the population structure and
genetic variability of populations of L. tigrinus in the South, South-East and Middle-
West regions of Brazil in order to provide informational support for programs
concerning the conservation of this species. We examined eight loci of microsatellite
DNA in 54 individuals. Material was collected either from specimens in their natural
environment or in captive state. The analysis involved also 20 individuals from
Oncifelis geoffroyi, species closely related to L. tigrinus, which were collected in Rio
Grande do Sul state, and used as an outgroup in the population analysis as well as to
determine the levels of interspecific genetic diversity.
We found high levels of genetic diversity that are similar for these two species,
being slightly larger in L. tigrinus. Our results showed also that there is high genetic
similarity between these molecular markers in L. tigrinus and O. geoffroyi.
Analysis using Bayesian methods to link individuals to their original populations
allowed us to identify nine specimens of L. tigrinus with significant ancestors in
common with O. geoffroyi. These individuals were considered as possible hybrids
87
between the two species and were excluded from the analyses, which caused a greater
genetic differentiation between L. tigrinus and O. geoffroyi. The mixed characteristics
found in the possible hybrids were probably introducing a greater genetic
homogenization between the two species.
Almost all the nine individuals identified as possible hybrids came from geographic
regions that are compatible to hybrid zones. Five individuals considered as hybrids
came from the central region of Rio Grande do Sul, where for sure there is contact
between the two species; three specimens came from the Brazilian central region, where
the occurrence of O. geoffroyi is not confirmed, but the local vegetation provides
favorable conditions for the species dispersion; finally, one exemplar was from Paraná,
and is likely to have a wrong collection site recorded.
The analysis of population structure of L. tigrinus revealed a pattern that is typical
for populations that have undergone recent population expansion, without enough time
and/or barriers to restructure the population extensively. However, moderate differences
detected in individuals from the Brazilian South and South-East regions indicate a
distance isolation pattern. Comparison of L. tigrinus and O. geoffroyi populations
(excluding the nine possible hybrids) indicate that O. geoffroyi has higher similarity
with individuals from the South region than with southeastern specimens. This suggests
that hybridization events between these species may present a larger magnitude than
that was detected in this work.
Our results allow concluding that L. tigrinus can be considered a recent species,
with moderate levels of genetic variability, high levels of gene flow and lacking a
historical population differentiation. The genetic structure of L. tigrinus in the studied
area seems to be recent and caused by the isolation of individuals in geographically
88
distant localities, as well as by the influence of hybridization events with O. geoffroyi in
the contact areas.
Regarding management, populations in the South and South-East regions can be
considered as Management Units, thus avoiding the contact and translocations between
individuals from areas that are far from each other in this distribution.
For the conservation of these two species, further studies are needed in order to
clarify the hybridization patterns between L. tigrinus and O. geoffroyi, being strongly
suggested that no specimen coming from the contact areas be used in reproduction
programs with captive animals until these patterns are well established.
89
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Anexo 1 – Distribuição geográfica de Leopardus tigrinus e Oncifelis geoffroyi. Modificado a partir de OLIVEIRA (1994) e EISENBERG & REDFORD (1999).
Leopardus tigrinusLeopardus geoffroyi Potencial zona de contato
101
Anexo 2 - A) Leopardus tigrinus; B) Oncifelis geoffroyi.
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