Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de Epilepsia …livros01.livrosgratis.com.br/cp013687.pdf · 2016-01-25 · André, Sandra Valente, Leandro e Alexandre. -Aos funcionários

LEONARDO COUTINHO FARIA

Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de

Epilepsia Induzido pela Pilocarpina

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo – Escola Paulista de Medicina para

obtenção do Título de Doutor em Ciências.

SÃO PAULO

2005

Livros Grátis

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ii




Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo – Escola Paulista de Medicina para

obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro.

Co-Orientador: Profa. Dra. Margareth Rose Priel

SÃO PAULO

2005

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE NEUROLOGIA E NEUROCIRURGIA

Chefe de Departamento:

Profa. Dra. Débora Amado Scerni

Coordenador do Curso de Pós Graduação:

Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro

iv




PRESIDENTE DA BANCA

Prof. Dr. Esper Abrão Cavalheiro

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Istvan Mody

Profa. Dra. Elza Márcia Yacubian

Prof. Dr. Fernando Cendes

Prof. Dr. Jaderson Costa da Costa

SUPLENTES

Prof. Dr. Ricardo Mário Arida

Profa. Dra. Maria José Fernandes

Aprovada em: / /

v

Esta tese foi realizada na Disciplina de Neurologia Experimental do

Departamento de Neurologia e Neurocirurgia da Universidade Federal de São

Paulo – Escola Paulista de Medicina, durante o curso de pós-graduação em

Neurologia – Neurociências, com o auxílio financeiro de CNPq, FAPESP,

PRONEX e CAPES. O autor foi bolsista do CNPq.

Agradeço a bolsa de doutorado “sanduíche” concedida pela CAPES.

Uma parte do trabalho experimental realizou-se na University of California at Los

Angeles – UCLA, USA.

vi

A toda minha família e meus amigos que sempre me apoiaram.

Agradeço especialmente a minha esposa Viviane e ao Darwin pelo amor e por

me aturarem esse tempo todo. Vocês estão sempre em primeiro plano.

Aos meus pais, Sonia e Marcio, que sempre me incentivaram e aos meus avós

Antonio, Ecilda, Hilton (em memória) e Maria Zoelinda.

Um agradecimento enorme a minha dupla de irmãos Lipe e Lele e também a Kiki

pelos sábios conselhos.

A meus tios Joyce, Alexandre, Márcia e Paulo. Um grande agradecimento

também a meus primos jovens Bernardo e Bruno e aos mais experientes: Gui,

Gu e Té.

Agradeço também a TODA a família da Vi, que me recebeu de braços abertos.

vii

AGRADECIMENTOS

- Ao Dr. Esper Abrão Cavalheiro por ter acreditado e me dado a

oportunidade de fazer exatamente o que eu queria: ciência.

- A Dra. Margareth Priel pelo exemplo de dedicação e pela paciência na

minha co-orientação durante esses anos.

- To Dr. Istvan Mody and people from Modylab for all the support and

friendship.

- Ao Dr. Emilio Sanabria que me trouxe a UNIFESP e foi fundamental para

a realização deste trabalho.

- Aos professores Maria da Graça Naffah-Mazzacoratti, Débora Amado,

Maria José Fernandes, Ricardo Arida e Fulvio Scorza.

- Aos demais alunos, companheiros de pós-graduação, em especial ao

André, Sandra Valente, Leandro e Alexandre.

- Aos funcionários da UNIFESP, em especial Marco Aurélio, Edvaldo,

Luizinho, Silvando e D. Hilda.

- As agências de fomento CNPq, CAPES e FAPESP pela imprescindível

ajuda financeira.

- A todos os amigos que fiz por onde passei, seja no Rio de janeiro, São

Paulo ou Los Angeles.

viii

SUMÁRIO

1. DEDICATÓRIA............................................................................................vi

2. AGRADECIMENTOS..................................................................................vii

3. LISTA DE FIGURAS...................................................................................ix

4. LISTA DE TABELAS...................................................................................xi

5. LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................xii

6. RESUMO...................................................................................................xiii

7. INTRODUÇÃO.............................................................................................1

5. OBJETIVOS...............................................................................................25

6. MATERIAL E MÉTODOS. ........................................................................26

7. RESULTADOS...........................................................................................43

8. DISCUSSÃO..............................................................................................61

9. CONCLUSÕES..........................................................................................75

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................76

11. ABSTRACT..............................................................................................96

ix

LISTA DE FIGURAS

1 - Esquema feito por Camilo Golgi do córtex cerebelar humano....................9

2 - Esquema representativo das principais conexões do cerebelo................10

3 - Neurônio de Purkinje impregnado pela técnica de Golgi..........................11

4 - Câmara de registro eletrofisiológico in vitro, micromanipuladores e

microeletrodos................................................................................................29

5 - Isolamento do cerebelo e plano de corte das fatias horizontais...............31

6 - Setup de registro eletrofisiológico in vitro. Sistema de registro

eletrofisiológico in vitro...................................................................................32

7 - Registro de potenciais de ação espontâneos e do potencial de campo...35

8 – Plano de corte do cerebelo utilizado na histologia...................................38

9 - Traçado representativo do disparo espontâneo de alta freqüência

registrado nos NP...........................................................................................45

10 - Efeito do análogo de GMPc, 8p-CPT-GMPc (50µm) na freqüência de

disparos espontâneos em animais controle e com epilepsia....................47;48

11 - Fatias horizontais do cerebelo................................................................51

12 - Registro eletrofisiológico em fatia cerebelar horizontal: potencial de

campo e registro intracelular de PA...............................................................51

13 - Gráfico do tipo Input-Output mostrando os registros de potenciais de

campo.............................................................................................................52

x

14 - Amplitude do potencial de campo nos grupos controle, latente e com

epilepsia crônica.............................................................................................52

15 - Duração do potencial de campo nos grupos controle, latente e com

epilepsia crônica.............................................................................................53

16 - Limiar para obtenção dos registros de potenciais de campo..................53

17 - Traçados sobrepostos do potencial de campo na camada de NP..........54 18 - Gráfico ilustrando a morte dos neurônios de Purkinje nos diferentes

grupos.............................................................................................................57

19 - Neurônios de Purkinje em ratos Wistar controle e com epilepsia do lobo

temporal.........................................................................................................57

20 - Densidade de espinhos dendríticos nos NP...........................................58

21 - Alterações nas concentrações de aminoácidos no cerebelo de ratos

submetidos às fases aguda e crônica do modelo de ELT induzido pela

pilocarpina..................................................................................................... 60

xi

LISTA DE TABELAS

1 - Drogas utilizadas nos registros de eletrofisiologia in vitro..............................36

2 - Disparo espontâneo em animais controle e com epilepsia e efeito do análogo

de cGMP, 8p-CPT-cGMP (50µm)........................................................................45

3 - Densidade dos neurônios de Purkinje nos diferentes grupos estudados......56

4 - Comparação dos valores absolutos de aminoácidos dosados no cerebelo de

ratos controle e experimentais............................................................................60

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

AMPA α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazole propionato

CNQX 6-ciano-7-nitro-quinoxalina-2,3-dione

DP Desvio padrão ELT Epilepsia do Lobo Temporal

GABA Ácido y-aminobutírico GMPc Guanosina monofosfato IC Índice de confiança LCRa Líquido Cefalorraquiano Artificial MED Média NMDA N-metil-D-aspartato NP Neurônio (s) de Purkinje PA Potencial (ais) de ação

PEPS Potencial pós sináptico excitatório PIPS Potencial pós sináptico inibitório PILO Pilocarpina PTZ Pentilenetetrazol SE Status epilepticus TTX Tetrodo toxina

xiii

A epilepsia do lobo temporal vem sendo amplamente investigada com diferentes

técnicas tanto em pacientes como em modelos experimentais, entre os quais se

destaca aquele induzido pela pilocarpina. Assim como as estruturas

hipocampais têm sido apontadas como responsáveis pela gênese do foco

epiléptico, o cerebelo vem sendo considerado como uma importante estrutura de

caráter inibitório, desde a primeira observação feita por Russel em 1894. Este

papel se deve à presença abundante de neurônios GABAérgicos no córtex e

núcleos cerebelares, com função inibitória, entre os quais se destacam os

neurônios de Purkinje (NP).

Os estudos eletrofisiológicos in vitro demonstraram uma alteração no padrão de

disparos espontâneos dos animais com epilepsia. Contrariamente aos controles,

freqüentemente as células de animas com epilepsia não disparavam potencias

de ação (PA) de forma espontânea. Outro fator importante foi à diferença de

potenciação dos disparos espontâneos nos grupos controle e portador de

epilepsia em resposta a análogo de óxido nítrico (NO). Camundongos

portadores de epilepsia aumentaram a sua freqüência de disparo em relação à

linha de base, porém, este aumento foi significativamente menor do que o

observado no grupo controle. A concentração dos principais aminoácidos foi

quantificada pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os

resultados revelaram diferenças significativas no cerebelo entre as fases aguda

e crônica do modelo. As concentrações de aspartato (ASP), glutamato (GLU),

taurina (TAU) e GABA, aumentaram na fase aguda. Durante a fase crônica do

modelo, houve diminuição significativa das concentrações de todos os

xiv

aminoácidos testados. Também podemos observar um comportamento distinto

ao compararmos as análises dos aminoácidos realizadas no cerebelo e as de

estudo prévio no hipocampo. Através dos estudos anatômicos, constatamos que

a fase silenciosa do modelo já induz perda dos neurônios de Purkinje, que é

agravada pelo aparecimento das crises espontâneas recorrentes. Essas células

também comprovaram ser bastante susceptíveis aos efeitos do envelhecimento

e quando este se encontra associado à epilepsia, ocorre a morte de um número

próximo a 50% do total de neurônios de Purkinje.

De uma maneira geral, os resultados demonstram alterações estruturais e

eletrofisiológicas no cerebelo de roedores com epilepsia. Estas lesões

cerebelares são posteriormente agravadas pela ação das crises epilépticas

recorrentes, o que possivelmente compromete a capacidade inibitória do

cerebelo.

xv

Faria, Leonardo Coutinho Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de Epilepsia Induzido pela Pilocarpina. / Leonardo Coutinho Faria. – São Paulo, 2005. P:117 Tese (Doutorado – Ciências) – Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina. Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em Neurologia/Neurociências Título em Inglês: Study of Cerebellar Alterations in the Model of Epilepsy Induced by Pilocarpine. Palavras-chave: 1. Epilepsia. 2. Cerebelo. 3. Pilocarpina. 4. Neurônios de

Purkinje. 5. Eletrofisiologia in vitro.

xvi

A epilepsia do lobo temporal (ELT)

A epilepsia é considerada um distúrbio cujo principal sintoma é a presença de crises epilépticas recorrentes e espontâneas. As crises per se são eventos comuns que acometem cerca de 10% da população pelo menos uma vez na vida (Hauser et al., 1996). Como fenômeno isolado, as crises não são classificadas como epilepsia. As epilepsias têm um alto custo sócio-econômico e, somente nos Estados Unidos, estima-se que 2.5 milhões de pessoas são portadoras de epilepsia, das quais 30% (750.000) são de difícil controle medicamentoso. Entre estas, a metade é diagnosticada como portadora de epilepsia do lobo temporal (Engel, 2003). As diferentes formas de epilepsia apresentam características próprias, dependendo das diferentes áreas cerebrais envolvidas em sua origem. Particularmente, a epilepsia do lobo temporal (ELT) tem como características a possibilidade de ter diferentes e múltiplas etiologias e apresentar diversos substratos anatômicos e moleculares. A ELT é considerada uma síndrome crônica que afeta mais de 1% da população mundial, podendo ter maior incidência nos países em desenvolvimento (Sander e Shorvon, 1996). As crises epilépticas na ELT são geralmente parciais, simples ou complexas, e podem evoluir para a generalização secundária. Uma porcentagem considerável de pacientes portadores de ELT não consegue melhorar ou ficar livres das crises, mesmo com o uso de drogas anti-epilépticas atuais (Mukahira et al., 1998; Wolf, 1998; Ojemann, 1997; Engel, 1992). Muito comumente, e devido a esse difícil controle medicamentoso, o tratamento cirúrgico com remoção da área considerada epileptogênica tem sido eficaz em reduzir as crises epilépticas (Spencer, 2002). Este fato tem levado os centros de pesquisa de todo o mundo, inclusive no Brasil, a investir pesadamente no estudo deste tipo específico de epilepsia, na procura de entender melhor sua fisiopatologia. Os mecanismos básicos de epileptogênese crônica no tecido cerebral de pacientes portadores de epilepsia ainda permanecem em fase de elucidação. O avanço no conhecimento dos mesmos permitirá a adoção de terapêuticas mais racionais e específicas.

Foco Epileptogênico na Epilepsia do Lobo Temporal

Uma questão fundamental na ELT é a identificação da estrutura cerebral que dá origem às crises epilépticas, bem como os fatores responsáveis pela sua generalização, duração e evolução temporal. Como a atividade epileptiforme tem a capacidade de se alastrar rapidamente em direção às estruturas adjacentes, a identificação do seu local de origem pode ser uma tarefa difícil. As estruturas hipocampais parecem ter uma sensibilidade aumentada para a gênese de atividade epileptiforme e tem sido uma das regiões mais estudadas por meio de diferentes técnicas eletrofisiológicas. Investigações por meios não invasivos

xvii

(eletrencefalografia) e invasivos (registros profundos) têm verificado a presença de espículas interictais e atividade ictal em estruturas temporais mesiais (Sano, 1997; Brooks et al., 1992) em pacientes portadores de epilepsia. Esses achados foram recentemente confirmados em estudos in vitro (Cohen et al., 2002; Gabriel et al., 2004) realizados no hipocampo de pacientes submetidos à cirurgia para o tratamento da epilepsia. Em casos de pacientes com ELT refratários à medicação antiepiléptica e submetidos ao tratamento cirúrgico (ex: lobectomia temporal e/ou hipocampectomia), foi observada uma melhora significativa das crises nos casos em que o estudo pré-operatório tinha comprovado o início das crises ou atividade interictal em estruturas temporais (Brooks et al., 1992; Sano et al., 1997). Mais recentemente, Cohen et al. (2002) demonstraram que a atividade interictal poderia ser gerada no subículo após serem registrados disparos em forma de “burst” somente nesta região. Estes autores observaram, também, que o subículo, quando isolado das demais estruturas límbicas, mantinha a atividade rítmica e sincrônica associada à atividade interictal. Foi então sugerido que o foco epileptogênico poderia originar-se nesta estrutura e rapidamente alastrar-se às demais regiões. Entretanto, mais estudos científicos e maior desenvolvimento tecnológico são necessários para que se possa determinar, com maior precisão, qual ou quais os locais de origem da atividade epileptogênica. Alterações da neurotransmissão na Epilepsia do Lobo Temporal.

Hiperfunção dos receptores glutamatérgicos tipo NMDA e AMPA

Tem se proposto, nos últimos anos, que alterações sinápticas glutamatérgicas na circuitaria hipocampal podem causar hiperexcitabilidade (Mody et al., 1992). Mais especificamente tem-se sugerido um aumento exagerado do número de receptores pós-sinápticos glutamatérgicos (Mathern et al., 1996). Dentre os mecanismos responsáveis pela gênese da atividade epileptiforme, têm sido proposta à participação de redes neuronais nas quais os potenciais dependentes de receptores tipo NMDA e AMPA atuariam com cinética alterada. Estudos em modelos agudos de crises epilépticas in vitro (aplicação de convulsivantes ou aumento de potássio extracelular) mostraram que a gênese da atividade interictal poderia ser bloqueada pela aplicação de antagonistas dos receptores glutamatérgicos (Baldino et al., 1986; Hoffman e Haberly, 1989). Em relação à participação dos receptores glutamatérgicos nas sinapses da rede hipocampal epileptogênica, diferentes modelos e hipóteses têm sido propostos, todos baseados em experimentos realizados em tecido epiléptico humano ex vivo obtido de cirurgias para o tratamento de ELT ou em modelos experimentais de epilepsia. Alterações na estrutura molecular dos receptores glutamatérgicos se associam a mudanças nas propriedades cinéticas (condutância, permeabilidade a íons, etc), ficando difícil separar ou classificar essas alterações. De forma geral essas alterações são compatíveis com a idéia da existência de canais iônicos epilépticos na gênese da atividade epileptiforme crônica.

xviii

Alterações dos mecanismos inibitórios dependentes de GABA

A atividade epileptiforme está amplamente associada a uma hipofunção dos sistemas inibitórios, fundamentalmente daqueles de neurotransmissão mediados por GABA. A facilidade em localizar neurônios inibitórios GABAérgicos, por detecção da enzima descarboxilase do ácido glutâmico (GAD), levou muitos autores a pesquisar se as epilepsias se acompanham da perda de neurônios GAD-positivos (Ribak, et al., 1979). Um estudo imunohistoquímico para GAD demonstrou uma diminuição significativa de terminais GAD-positivos no foco epiléptico induzido experimentalmente em macacos por aplicação cortical de gel de AlCl3 (Ribak et al., 1979). Esses estudos levaram a hipótese de que existe uma redução do controle sináptico inibitório de neurônios piramidais do hipocampo proporcionando uma hipersensibilidade dos mesmos ao influxo excitatório normal. Esta hipótese tem sido considerada a base da teoria do GABA na epilepsia (Avanzini et al., 1985). Neste sentido, vários trabalhos mostraram diminuição da inibição sináptica hipocampal tanto na fase aguda como na crônica do modelo de epilepsia induzido pelo ácido caínico (Sloviter e Damiano, 1981; Fisher e Alger, 1984; Cornish e Wheal, 1989). Apesar das diversas observações de hipofunção GABAérgica, algumas investigações têm demonstrado que muitos interneurônios inibitórios GABAérgicos sobrevivem na ELT humana e em modelos experimentais. Especificamente, no modelo de ELT induzido pela pilocarpina, um estudo imunocitoquímico para GAD, na fase crônica do modelo, demonstrou a preservação de alguns neurônios GAD-imunoreativos no hipocampo de ratos com epilepsia (Cavalheiro, 1990). Esses dados são corroborados por trabalhos em hipocampo humano ressecado de pacientes com epilepsia, onde existe uma perda acentuada de neurônios piramidais, porém muitos interneurônios inibitórios estão, de certa forma, preservados (Babb et al., 1989; Lanerolle et al., 1989). O fato de neurônios GABAérgicos estarem preservados em tecido com comprovada epileptogenicidade levou muitos autores a pensar sobre a existência da hipofunção dos mesmos. Diferentes hipóteses foram propostas para explicar tal déficit inibitório GABAérgico na ELT, desde alterações funcionais no transportador de GABA (During et al., 1995) até alterações nas subunidades do receptor de GABAA (Gibbs et al., 1996). Realmente, as epilepsias como processo de plasticidade neuronal alterada produz mudanças significativas a longo prazo no sistema GABAérgico, as quais podem participar na epileptogênese crônica (Houser e Esclapez, 1996). Apesar do importante papel da inibição GABAérgica, mais recentemente, vem crescendo o número de evidências de sua ação despolarizante. A despolarização induzida por GABA tem sido apontada com papel de destaque na geração de atividade interictal e ictal em modelos experimentais (Higashima et al., 1996; Fujiwara-Tsukamoto et al., 2003) e em tecido humano proveniente de cirurgia de epilepsia (Cohen et al., 2002). Foi proposto que a sincronização das crises poderia ser gerada pela transmissão GABAérgica excitatória num foco epileptogênico que seria propagado sincronicamente para regiões corticais (Isomura et al., 2003). Esta

xix

proposta foi baseada em observações prévias que demonstraram que a atividade interictal seria mediada por ação despolarizante GABAérgica em cooperação com a transmissão glutamatérgica em neurônios do subículo de pacientes com ELT (Cohen et al., 2002). Atividade Inibitória GABAérgica do cerebelo

O papel inibitório do cerebelo nas crises e nas diferentes formas de epilepsias vem sendo abordado há um tempo considerável, valendo-se de diferentes técnicas e modelos experimentais. Geralmente, os estudos são conduzidos lesando e/ou estimulando áreas específicas do cerebelo e verificando, posteriormente, os efeitos facilitadores ou inibitórios sob a atividade epiléptica. Assim como as estruturas hipocampais têm sido apontadas como responsáveis pela gênese da atividade epiléptica, o cerebelo tem sido apontado como elemento importante no controle das crises, como observado em diversos estudos experimentais. O estudo pioneiro de Russel, em 1894, verificou em cães os efeitos da ablação cerebelar nas crises clônicas generalizadas induzidas pela injeção de absinto. Foi observado que os movimentos convulsivos foram de maior intensidade no lado correspondente ao hemisfério cerebelar que foi removido. Como já mencionado, o GABA é o principal neurotransmissor usado nas sinapses com ação inibitória. No cerebelo, os neurônios dos núcleos profundos recebem aferências GABAérgicas dos neurônios de Purkinje (NP) (Ito et al., 1964). A ativação desta via induz potenciais pós-sinápticos inibitórios (PIPS) mediados por receptores tipo GABAA nos núcleos profundos do cerebelo. Esta via cortico-nuclear é a principal eferência do córtex cerebelar. Para podermos compreender melhor as bases fisiológicas que têm fundamentado a noção de que o cerebelo tem função inibitória sobre a atividade epiléptica, passaremos, a seguir, a rever, ainda que brevemente, a estrutura e as principais conexões cerebelares.

A estrutura cerebelar

Juntamente com o cérebro, o cerebelo faz

parte do sistema nervoso supra-segmentar. O

cerebelo, assim como o cérebro, apresenta um

córtex que envolve um centro de substância

branca (corpo medular) onde são observadas

xx

massas de substância cinzenta (núcleos

centrais).

A citoarquitetura do córtex cerebelar é a

mesma em todas as folhas e lóbulos, sendo

constituída de cinco tipos básicos de células:

as granulares e as de Purkinje e três tipos de

interneurônios, as células de Golgi, as

estreladas e as “em cesto”. O córtex cerebelar

recebe três tipos de aferências extra-

cerebelares: as fibras musgosas e trepadeiras,

ambas excitatórias, além de aferências difusas

(monoaminérgicas e colinérgicas). Na figura 1

podemos observar o esquema original do

córtex cerebelar humano feito por Camilo

Golgi. As principais conexões cerebelares

estão ilustradas na fig 2 (adaptado de Carulli et

al., 2004).

As células granulares são pequenos neurônios

(os menores do corpo humano)

glutamatérgicos que são, ao mesmo tempo, os

mais numerosos do sistema nervoso central.

Os terminais das fibras musgosas fazem

contato com os dendritos de diversas células

xxi

granulares em sinapses complexas chamadas

de glomérulos. Os axônios das células

granulares não possuem mielina e ascendem

à camada molecular, onde se bifurcam e

fazem sinapse com os dendritos das células

de Purkinje e com interneurônios inibitórios.

Os neurônios de Purkinje são células piriformes e grandes, GABAérgicas, responsáveis pela eferência do córtex cerebelar. Seus axônios mielinizados são responsáveis pela via eferente do córtex cerebelar e terminam em neurônios dos núcleos cerebelares e do tronco cerebral, enquanto seus dendritos se ramificam na camada molecular. Na figura 3, observamos um neurônio de Purkinje em uma lâmina original de Camilo Golgi.

xxii

Fig1. Esquema feito por Camilo Golgi do córtex cerebelar humano. Nesta figura, pode-se distinguir as três camadas do córtex cerebelar: a camada de células granulares, a dos neurônios de Purkinje e a camada molecular (mais externa). Também pode ser notada a presença de diferentes tipos de interneurônios inibitórios, alguns deles fazendo sinapse com os neurônios de Purkinje.

xxiii

Fig 2. Esquema representativo das principais conexões do cerebelo. Os neurônios de Purkinje (NP) formam a via de saída do córtex cerebelar. Seus axônios se projetam aos núcleos intra-cerebelares (NC) que, por sua vez, recebem duas vias aferentes principais. As fibras musgosas (FM) projetam-se em direção às células granulares (CG) cujos axônios, que em conjunto são denominados de fibras paralelas, terminam nos compartimentos dendríticos dos NP. As fibras trepadeiras (FT) projetam-se diretamente aos NP. Os interneurônios “em cesto” (CC) e estrelados (CE) são excitados pelas fibras paralelas e inibem os NP. As fibras paralelas (FP) e trepadeiras enviam axônios colaterais para os núcleos profundos do cerebelo. Outro interneurônio, as células de Golgi (G), são excitadas pelas fibras musgosas e paralelas e inibem as células granulares. Os núcleos profundos enviam seus axônios para diversas regiões do tronco encefálico e possuem projeções inibitórias para a oliva inferior.

xxiv

Fig 3. Neurônio de Purkinje impregnado pela técnica de Golgi. Esta foto pertence a uma lâmina original guardada no instituto de patologia da Universidade de Pavia, Itália. Pode-se observar a ampla extensão dos dendritos dos NP projetando-se para a camada molecular onde recebem sinapses excitatórias das fibras paralelas.

Conexões aferentes ao cerebelo

xxv

1) Fibras de origem vestibular.

Essas fibras chegam ao cerebelo pelo fascículo vestíbulo-cerebelar, cujas fibras têm origem nos núcleos vestibulares e se distribuem para o arquicerebelo. As informações são trazidas da parte vestibular do ouvido interno e são importantes para a manutenção do equilíbrio e da postura. 2) Fibras medulares. São compostas por dois tractos principais, o espino-cerebelar anterior e o espino-cerebelar posterior. Ambos chegam ao cerebelo pelos pedúnculos cerebelares (superior e inferior, respectivamente) e terminam no córtex do paleocerebelo. Através do tracto espino-cerebelar posterior, o cerebelo recebe, principalmente, sinais sensoriais originados em receptores proprioceptivos que permitem avaliar o grau de contração muscular e a tensão nas cápsulas articulares e tendões. As fibras do tracto espino cerebelar anterior são ativadas por sinais motores que chegam à medula pelo tracto cortico-espinhal, permitindo ao cerebelo avaliar o grau de atividade desse tracto. 3) Fibras de origem pontina: As fibras pontinas ou ponto-cerebelares se originam nos núcleos da ponte e chegam ao cerebelo pelo pedúnculo cerebelar médio, distribuindo-se, principalmente, para o córtex do neocerebelo.

Conexões eferentes

1) Zona medial (vermis).

Os axônios dos neurônios de Purkinje, com origem predominante

arquicerebelar, fazem sinapses principalmente nos núcleos fastigiais. Destes

núcleos sai o tracto fastigio-bulbar, com 2 tipos de fibras diferentes. As fibras

fastígio-vestibulares fazem sinapse nos núcleos vestibulares, local de origem

do tracto vestíbulo-espinhal que se projeta para os neurônios motores. Já as

fibras fastígio-reticulares chegam à formação reticular e, através do tracto

retículo-espinhal, terminam nos neurônios motores.

xxvi

2) Zona intermédia.

Os axônios dos neurônios de Purkinje da zona intermédia cerebelar fazem

sinapse no núcleo interpósito, de onde saem fibras para o núcleo rubro e

para o tálamo contralateral. Pelo tracto rubro-espinhal, o cerebelo age sobre

os neurônios motores através do circuito interpósito-rubro-espinhal. As

eferências talâmicas se dirigem para as áreas motoras do córtex cerebral,

constituindo o circuito interpósito-tálamo-cortical.

3) Zona lateral.

Os axônios das células de Purkinje fazem sinapse no núcleo denteado, de

onde partem fibras para o núcleo rubro. Daí, os impulsos vão ao tálamo

contralateral de onde partem fibras para as áreas motoras do córtex cerebral.

Estas conexões formam o tracto córtico-espinhal, através do qual o núcleo

denteado exerce seu controle sobre a musculatura distal, responsável pelos

movimentos finos.

Núcleos profundos cerebelares

Os núcleos profundos do cerebelo estão divididos em três grupos: núcleo medial ou

fastigial, núcleo interpósito (anterior e posterior) e núcleo lateral ou denteado. Estas

estruturas são simétricas e estão contidas em cada hemisfério cerebelar. O núcleo medial

encontra-se próximo à linha média do Vérmis; o núcleo lateral está localizado nos

hemisférios, enquanto o interpósito se situa entre os núcleos medial e lateral. Juntos, eles

se localizam abaixo do córtex cerebelar e podem ser observados através de cortes

xxvii

coronais do lobo posterior do cerebelo. Os neurônios destes núcleos podem disparar PA

de forma espontânea ou através de despolarização de membrana induzida por injeção de

corrente (Gardette et al., 1985). O significado dos disparos espontâneos nessas células

pode ser interpretado como função da saída contínua de informação. O padrão de disparo

pode modular a ação inibitória dos axônios dos NP, bem como os efeitos de excitação

promovidos pelas fibras musgosas e trepadeiras (Jahnsen, 1986).

Projeções aferentes aos núcleos profundos do cerebelo

Há três aferências bem estabelecidas aos núcleos profundos: projeções diretas dos NP, axônios colaterais vindos da oliva inferior e aferências de neurônios extra-cerebelares. Axônios dos NP: esses axônios fornecem projeções diretas córtico-nucleares

para todas as divisões dos núcleos profundos. Os terminais desses neurônios

fazem sinapse com o soma e com os dendritos de todos os tipos celulares

contidos nesses núcleos. Diversos estudos apontam que esses terminais e o

soma dos NP contém GABA (Chan-Palay, 1977). Ito et al. (1964) demonstraram

que a ativação dos axônios dos NP gera potenciais pós-sinápticos inibitórios

(PIPSs) nos neurônios dos núcleos profundos.

Através do seu curso, da oliva inferior até os NP, as fibras trepadeiras projetam

axônios colaterais que contactam vários tipos celulares, incluindo os neurônios

dos núcleos profundos onde fazem sinapse no soma e nos dendritos (Ikeda e

Matsushita, 1974). Os três núcleos profundos recebem projeções da oliva

inferior. É estabelecido que a ativação desta projeção induz potencial pós-

xxviii

sináptico excitatório (PEPSs) nos neurônios dos núcleos profundos (Ito et al.,

1970).

Por último, as fibras musgosas se projetam ao cerebelo vindo de diversas áreas

extra-cerebelares como o núcleo reticular lateral, a ponte e a rafe. Assim como

nas fibras trepadeiras, a ativação das fibras musgosas evoca respostas

excitatórias nos neurônios dos núcleos profundos cerebelares (Llinás e

Muhlethaler, 1988).

Projeções eferentes dos núcleos profundos cerebelares

Os neurônios dos núcleos profundos projetam seus axônios para diversas áreas do sistema nervoso central, incluindo os núcleos olivares e o córtex cerebral. As eferências núcleo-olivares são compostas por fibras provenientes dos três núcleos cerebelares e constituem uma via recíproca das projeções olivo-nucleares. Os axônios dos três núcleos cerebelares projetam-se para diferentes áreas do córtex cerebelar. Dentre essas áreas, há projeções para a camada de células granulares, aonde se formam os terminas musgosos. Tem sido observado uma via recíproca formada com os axônios dos NP originados na área de projeção dos núcleos profundos. Os núcleos profundos também formam vias não recíprocas em áreas aonde recebem inervação dos NP fora da região cortical. Esses dados indicam que além de formar um ciclo de retroalimentação, as projeções núcleo-corticais constituem vias nas quais diferentes áreas corticais podem comunicar-se com os núcleos profundos do cerebelo. Papel funcional do cerebelo na epilepsia do lobo temporal

Vários trabalhos têm sugerido que o cerebelo exerce ação inibitória sobre as

crises epilépticas, quer em humanos como em modelos animais (Cooke e

Snider, 1955; Davis e Emmonds, 1992; Specht et al., 1997; Bohnen et al.1998).

Os mecanismos através dos quais o cerebelo exerce seu papel inibitório sobre

xxix

as crises epilépticas ainda não são bem conhecidos. Acredita-se que os

neurônios de Purkinje tenham papel importante no controle das crises

epilépticas. A chegada da atividade epiléptica ao córtex cerebelar poderia ativar

estas células que, por sua vez, exerceriam sua atividade inibitória sobre as

crises. Alguns autores têm relatado a ocorrência de perda de NP em pacientes

portadores de epilepsia. Entretanto, de forma contrastante, Rajjoub et al., (1976)

não encontraram relação entre a densidade de NP e incidência de crises

epilépticas.

Considerando a circuitaria cerebelar discutida anteriormente, podemos observar

que vários interneurônios presentes no córtex cerebelar são, também, do tipo

inibitório. Entre eles, destacam-se as células “em cesto”, as estreladas e as

células de Golgi. No entanto, poucos são os trabalhos que tentam relacionar o

papel desses circuitos inibitórios com a ocorrência de crises epilépticas. Como

mencionado, estas células exibem ação inibitória sobre os NP. Caso estas

sinapses sejam ativadas durante as crises epilépticas, poderíamos considerar

que, nestas circunstâncias, a diminuição da inibição tônica exercida pelas

eferências do NP seria a responsável pela ação inibitória do cerebelo sobre as

crises epilépticas.

Desta forma, a riqueza de conexões inibitórias, principalmente GABAérgicas,

existentes no cerebelo pode ser importante para a extinção ou o atenuamento

das crises epiléticas e as duas possibilidades colocadas acima, isto é, ativação

direta dos NP ou sua inibição pelos interneurônios, não podem ser facilmente

responsabilizadas pela ação final. A morte celular causada pela liberação

xxx

exagerada de glutamato decorrente da hiperexcitação neuronal comandada a

partir de um foco distante, principalmente em estruturas límbicas, poderia

contribuir adicionalmente para o comprometimento da função cerebelar

(Stubgen, 1995).

Patologia Cerebelar na Epilepsia do Lobo Temporal

A primeira observação de alteração cerebelar em crises epilépticas foi um

estudo experimental pioneiro realizado por Russel (1894). Posteriormente, a

relação do cerebelo com as epilepsias foi reforçada por estudos experimentais

usando diferentes modelos, tais como, o dos babuínos fotossensíveis

(Brailowsky et al., 1975), gerbilos (Dam et al., 1984), o modelo induzido pela

pilocarpina (Smolders et al., 1997) e o induzido pelo cobalto (Dow et al., 1962).

As primeiras alterações da morfologia cerebelar encontradas em pacientes

portadores de epilepsia foram atribuídas a anóxia presente durante as

convulsões (Spielmeyer, 1927, Liebers, 1929). Mais recentemente, a ação

inibitória do cerebelo sob as crises epilépticas também pode ser verificada em

humanos (Hori et al., 1987; Specht et al., 1997; Vander et al., 2004).

As alterações morfológicas do cerebelo observadas em portadores de epilepsia

são, atualmente, consideradas como conseqüência de uma ampla gama de

xxxi

eventos que incluem, além da anóxia, o uso prolongado de fenitoína e o papel

exercido pelas próprias crises epilépticas.

Estimulação cerebelar

A técnica de estimulação das estruturas cerebelares para obter o bloqueio ou a atenuação da atividade epiléptica é relativamente antiga e já foi, inclusive, utilizada para tratar pacientes portadores de epilepsia. Os estudos iniciais ocorreram em animais e foi observado que a estimulação cerebelar pode suprimir, temporariamente, a atividade epiléptica em um foco induzido experimentalmente (Cooke e Snider, 1955; Hutton et al., 1972). Esses resultados foram confirmados posteriormente quando se demonstrou que o cerebelo poderia abolir crises evocadas em estruturas hipocampais de gatos (Iwata e Snider, 1959). Contrariamente, um trabalho conduzido por Hablitz et al. (1975) mostrou, em macacos, que a estimulação cerebelar poderia deflagrar crises a partir de um foco latente. Após os pioneiros estudos em humanos publicados por Cooper et al. (1973 a, b), a estimulação de estruturas cerebelares começou a ser testada com sucesso para o controle das crises epilépticas (Cooper et al., 1973 a, b, 1974,1976; Davis, 2000; Davis e Emmonds, 1992; Davis et al., 1983), apesar das observações feitas por Moruzzi (1941 a,b,c de acordo com Dow et al., 1962) de que a estimulação do paleocerebelo poderia induzir tanto a facilitação quanto à inibição das crises clônicas induzidas por estriquinina. Entretanto, outras investigações não confirmaram o efeito inibitório do cerebelo (Van Burenet al., 1978; Wright et al., 1984) e esses resultados conflitantes geraram dúvidas sobre a eficácia do tratamento. Hoje, a estimulação cerebelar não vem sendo utilizada na clínica, porém investigações complementares podem fazer com que este procedimento seja revisto e novamente utilizado no tratamento de pacientes com epilepsia (Karceski, 2002). Como apresentado acima, os exatos mecanismos de ação da estimulação cerebelar ainda não são completamente conhecidos. Entretanto acredita-se que a riqueza de interconexões inibitórias do cerebelo com áreas cerebrais, principalmente tálamo, tronco cerebral e córtex cerebral seja uma condição fundamental para o controle da hiperexcitabilidade presente na atividade epiléptica (Bloedel, 1985).

Efeito da cerebelectomia em modelos experimentais de epilepsia

As propriedades inibitórias do cerebelo também foram estudadas através de lesões ou pela própria remoção, total ou parcial, desta estrutura. A hipótese testada nessas

xxxii

investigações era observar se, contrariamente a estimulação, a lesão do cerebelo facilitaria a dispersão das descargas epilépticas. Nesse sentido, em um dos primeiros trabalhos conduzidos por Van den Driessche e Trebaul (1958), foi relatado que, em coelhos submetidos à ablação total do neocerebelo e com destruição parcial do paleocerebelo, observou-se mudanças no padrão clínico das convulsões induzidas por estimulação elétrica ou pela injeção de pentilenetetrazol. Da mesma forma, um trabalho posterior (Dow et al., 1962) onde certas áreas do cerebelo foram lesadas pelo método do resfriamento, observou-se uma facilitação das crises convulsivas induzidas pelo cobalto. Outro estudo experimental conduzido por (Fadiga et al., 1966) demonstrou que, após remoção dos hemisférios cerebelares, houve tendência a hipersincronização cortical. Adicionalmente, observou-se que a ablação total do cerebelo foi capaz de aumentar a duração da atividade epileptiforme induzida pela penicilina em ratos anestesiados (Gartside, 1978). Contrastando com essas evidências, uma investigação realizada no modelo de epilepsia em babuínos fotossensíveis comparou diferentes tipos de lesões, tanto no vermis como nos hemisférios cerebelares (Brailowsky et al., 1975). Os resultados variaram dependendo do tipo de lesão, porém nenhum animal apresentou crises espontâneas o que levou os autores a considerarem o papel inibitório do cerebelo como secundário.

Atrofia cerebelar nas epilepsias

Trabalhos recentes mostram que existem diversas alterações cerebelares

crônicas em pacientes portadores de epilepsia e que a atrofia do cerebelo é

freqüentemente observada (Ney et al., 1994; Bohnen et al., 1998; Sandok et al.,

2000). A atrofia cerebelar tem sido considerada como conseqüência das crises

recorrentes, do uso de altas doses de fenitoína e de outros fatores relacionados

à epilepsia (Botez et al., 1988; Specht et al., 1997).

Estudos in vivo em pacientes portadores de epilepsia, por meio de tomografia

computadorizada, têm demonstrado que a atrofia do cerebelo pode estar

relacionada com a intoxicação por fenitoína (Koller, 1981; Claus, 1982; Masur,

1989). Ney et al. (1994) demonstraram que a atrofia cerebelar ocorre com

xxxiii

freqüência mais significativa nos portadores de epilepsia do que em indivíduos

não portadores. Entretanto, esses autores não observaram relação entre a

atrofia cerebelar e a freqüência de crises ou o uso de fenitoína. Esse trabalho

corrobora um estudo clínico anterior, que não encontrou associação entre

tratamento com fenitoína e atrofia cerebelar (Ballenger et al., 1982). Outros

estudos conduzidos por Luef et al. (1993; 1996) com pacientes portadores de

atrofia cerebelar também não estabeleceram qualquer relação seja com a

gravidade da epilepsia ou com a administração de fenitoína. De acordo com

esses trabalhos, pacientes com epilepsia podem apresentar vários graus de

dano cerebelar (perda de células de Purkinje, atrofia e gliose), sem que a causa

esteja plenamente identificada. Ainda há muita discussão se a magnitude desse

fenômeno pode depender da intensidade e duração das crises epilépticas, do

uso de altas doses de fenitoína ou de ambos. Neste sentido, Botez et al (1988)

sugere que a atrofia cerebelar seja primariamente induzida pela fenitoína, porém

as crises epilépticas podem contribuir com papel secundário. O fenômeno da

diásquise, que consiste na capacidade de um foco epiléptico causar lesões à

distância (cerebelo, no caso) tem, também, sido considerado causa importante

de atrofia cerebelar (Tien e Ashdown, 1992).

Há evidencias mostrando que a atrofia de estruturas cerebelares tem um

importante papel na clínica neurológica, pois tais pacientes apresentam menor

controle das crises epilépticas após serem submetidos a lobectomia temporal

(Specht et al., 1997). Esse estudo sugere que a presença de atrofia cerebelar

xxxiv

deve ser considerada na avaliação para a indicação de neurocirurgia para

pacientes portadores de epilepsia de difícil controle medicamentoso.

Diásquise cerebelar: estudo das conexões aferentes e eferentes do cerebelo na

epilepsia crônica.

Como já mencionado, a diásquise consiste no distúrbio de função em uma determinada

área cerebral resultante da atividade de um foco situado numa região fisicamente

distante, mas anatomicamente interconectada (Sandok et al., 2000). Este fenômeno foi

primeiramente descrito por von Monakow, em 1914 (de acordo com Meyer et al.,

1993). A diásquise no cerebelo foi descrita pela primeira vez em um paciente portador

de epilepsia por Baron et al. (1980). Nos anos seguintes, diversos estudos confirmaram

o fenômeno da diásquise cerebelar (Lenzi et al., 1982; Martin e Raichle, 1983;

Meneghetti et al., 1984). Um dos eventos que se postula como causa do dano

cerebelar na epilepsia é o influxo de atividade epiléptica através das conexões

aferentes ao cerebelo, principalmente pela via córtico-ponto-cerebelar (Pantano et al.,

1986). Nesse contexto, a diásquise cerebelar contralateral é um fenômeno intrigante.

Trabalhos realizados com PET (tomografia por emissão de pósitrons), demonstraram

que a diásquise cerebelar contralateral afeta tanto o consumo de oxigênio quanto à taxa

de utilização da glucose (Lenzi et al, 1982; Martin e Raichle, 1983; Baron et al., 1984;

Kushner et al 1984; Patronas et al 1984). Estudos clássicos realizados por Baron et al.

(1980) e Biersack et al. (1984) demonstraram uma associação significativa entre a

xxxv

ocorrência de déficit motor em portadores de epilepsia e a diásquise cerebelar

contralateral. Por outro lado, Kushner et al. (1984) observaram que dois de quatro

pacientes com epilepsia, mas sem déficit motor, apresentaram diásquise contralateral

significativa. Este fenômeno tem sido estudado tanto em humanos (Lenzi et al., 1982;

Celesia et al., 1984; Stubgen, 1995) como em animais (Ginsberg et al; 1977; Smolders

et al., 1997), mas os resultados têm sido conflitantes em relação à ocorrência e ao

curso de tempo. A diásquise contralateral pode, em alguns poucos casos, desaparecer

com o tempo (Meneghetti et al., 1984; Kushner et al., 1984). Mesmo sendo um

fenômeno com importantes implicações, ainda hoje o seu significado clínico ou

fisiopatogênico não é bem compreendido.

Atividade Espontânea nos Neurônios de Purkinje

A atividade neuronal tem que começar em alguma área e, conseqüentemente, alguns

neurônios disparam potenciais de ação espontâneos, na ausência de qualquer estímulo

externo. Este padrão de atividade pode ser observado em vários tipos de neurônios no

sistema nervoso central (Llinás, 1988). O cerebelo é rico em neurônios com essa

propriedade, isto é, disparos espontâneos são observados em diversos tipos celulares

incluindo os neurônios de Purkinje (Llinás e Sugimori, 1980), neurônios dos núcleos

profundos (Gardette et al., 1985; Sastry et al., 1997) e interneurônios cerebelares

(Häusser e Clark, 1997). As primeiras evidências de potenciais de ação espontâneos, na

xxxvi

ausência de qualquer estímulo externo, originaram-se em experimentos com Aplysia sp

(Alving, 1968). Estes PA têm origem em propriedades intrínsecas da membrana celular

que ocorrem em determinados neurônios (Llinás, 1988). Como exemplo, os neurônios de

Purkinje são capazes de disparar potenciais de ação espontâneos tanto in vivo como in

vitro (Granit e Phillips, 1956; Thach, 1968; Bell e Grimm, 1969; Latham e Paul, 1971

Häusser e Clark, 1997). Após o preparo das fatias cerebelares, os neurônios aí presentes

podem permanecer disparando ritmicamente por períodos prolongados, muitas vezes

superiores a 24 h. Além disso, um único neurônio de Purkinje pode manter seu padrão de

disparo espontâneo sem alterações significativas por cerca de três h. (Llinás e Sugimori,

1980).

Os mecanismos pelos quais os NP regulam seus disparos espontâneos não são

completamente entendidos. Enquanto alguns neurônios dispararam com freqüência

aproximada de 1Hz, outros mostram uma alta freqüência, chegando a 150 Hz (Häusser e

Clark, 1997). De uma maneira geral, as freqüências de disparo dos NP são elevadas, por

volta de 50 Hz (Häusser e Clark, 1997; Womack e Khodakhah, 2002). Estudos iniciais

sugeriram que os disparos espontâneos eram causados por PA iniciados nos dendritos

(Llinás e Sugimori, 1980b). Entretanto, neurônios de Purkinje em cultura são capazes de

apresentar PA espontâneos antes da formação dos dendritos (Gruol et al., 1991). Estudos

subseqüentes demonstraram que o disparo espontâneo continuava presente mesmo em

corpos celulares dissociados (Nam e Hockberger, 1997; Raman e Bean, 1997). Neste

estudo, a atividade espontânea dos neurônios de Purkinje foi utilizada como referência da

atividade da circuitaria cerebelar. A atividade neuronal espontânea tem papel crucial na

transformação da entrada da informação sináptica em uma resposta em forma de disparo,

xxxvii

além de promover mecanismos plásticos numa ampla gama de circuitos neurais (Hausser

et al., 2004).

Este estudo teve como objetivo principal avaliar as alterações estruturais e

eletrofisiológicas no cerebelo de animais com epilepsia do lobo temporal

induzida pela pilocarpina. A hipótese de que o cerebelo poderia atuar como uma

estrutura inibitória da atividade epiléptica foi testada, com enfoque concentrado

nos seguintes aspectos:

- Quantificar através de coloração de Nissl a perda dos NP durante o

período silencioso, assim como na fase crônica do modelo de ELT

induzido pela pilocarpina em ratos adultos jovens e idosos.

- Verificar alterações nas propriedades dos disparos espontâneos

(freqüência, duração, etc.) dos NP na fase crônica do modelo de ELT

utilizando a técnica de eletrofisiologia in vitro “patch-clamp”.

xxxviii

- Avaliar, pela coloração de Golgi, se ocorre alteração do número de botões

sinápticos nos dendritos dos NP em decorrência do aumento na

excitabilidade neuronal induzida pelas crises epilépticas.

- Quantificação das concentrações dos aminoácidos presentes no cerebelo

de animais submetidos ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina.

1. Animais

Na primeira série de experimentos realizados no Laboratório de Neurologia

Experimental da UNIFESP/EPM foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos,

com peso variando entre 200 e 250g, provenientes do biotério central da

UNIFESP/EPM, mantidos com livre acesso à água e comida, ciclo claro-escuro

de 12 horas (claro das 7:00 às 19:00 h) e temperatura controlada (22 - 24° C).

A segunda série de experimentos foi realizada na University of Califórnia at Los

Angeles – UCLA. Exclusivamente para os registros eletrofisiológicos do tipo

patch clamp, foram utilizados camundongos machos adultos, C57BL6 (Harlan,

San Diego, CA), mantidos nas mesmas condições descritas previamente para

os ratos Wistar. Conforme amplamente descrito na literatura, o modelo de ELT

induzido pela pilocarpina em camundongos se desenvolve de maneira similar ao

observado em ratos. O uso de camundongos nestes experimentos deve-se a

xxxix

maior facilidade de manutenção destes animais e, também, por proverem um

número de fatias cerebelares já suficientes para a realização dos protocolos.

Esta segunda fase de experimentação contou com a orientação do Dr. Istvan

Mody.

2. Modelo de ELT induzido pela Pilocarpina

O modelo de ELT induzido pela pilocarpina foi utilizado de acordo com

procedimentos estabelecidos em nosso laboratório (Cavalheiro, 1995;

Cavalheiro et al., 1991,1996). Foi administrada uma injeção intra-peritonial de

Hidrocloreto de Pilocarpina (PILO) 4% (Merk) na dose de 350 mg/kg, precedida

30 minutos por uma injeção subcutânea de Nitrato de Metilescopolamina

(Sigma), na dose de 1mg/kg, para reduzir os efeitos colinérgicos periféricos

(estresse respiratório, salivação, espasmos abdominais). O SE perdurou

aproximadamente 8 horas, sendo bloqueado por Diazepam (1-2mg/kg, sub-

cutâneo) com a finalidade de minimizar as crises comportamentais, buscando

uma maior sobrevida dos animais.

Após a fase aguda os animais foram mantidos em observação em uma sala de

vídeo-monitoração, nas mesmas condições ambientais do biotério da disciplina,

e observados 24h/dia para a detecção da 1ª crise espontânea.

Estes animais foram divididos nos seguintes grupos:

xl

Grupo crônico adulto jovem - animais que apresentaram SE e evoluíram com

crises espontâneas, estudados em torno do 4º mês de vida.

Grupo crônico idoso - animais que apresentaram SE e evoluíram com crises

espontâneas, estudados entre o 12º e o 23º mês de vida.

Grupo controle - animais submetidos aos mesmos procedimentos do grupo

anterior, exceto pela aplicação de solução salina 0.9%, ao invés de pilocarpina e

pareados em idade com os animais crônicos.

Grupo agudo - animais que receberam aplicação de pilocarpina, e foram

utilizados 6 horas após o início do SE.

Grupo silencioso - animais adultos jovens, que apresentaram SE e foram

utilizados antes do aparecimento da primeira crise espontânea.

3. Eletrofisiologia in vitro do Cerebelo

3.1 Preparação das fatias cerebelares sagitais

Os estudos eletrofisiológicos “in vitro” do tipo “patch clamp”, foram

desenvolvidos em fatias cerebelares, especificamente na camada de células de

Purkinje. A técnica de preparação dessas fatias foi desenvolvida de acordo com

procedimentos amplamente descritos por Llinás e Sugimori (1980). Para este

fim, os animais foram anestesiados profundamente com halotano (Sigma

Aldrich) numa câmara apropriada e, posteriormente, decapitados mediante o

xli

uso de uma guilhotina. O crânio foi então rapidamente aberto para retirada do

cerebelo, num procedimento de duração total menor que 2 min. O tecido foi

imediatamente submerso em líquido cefalorraquiano artificial (LCRa) a 0.50C,

contendo 5mM de ácido quinurênico para bloquear receptores tipo NMDA e

AMPA/cainato e oxigenado com uma mistura gasosa de 95% O2 e 5% CO2 na

cuba do vibrátomo. Fatias sagitais de tecido contendo o córtex cerebelar foram

cortadas com espessura de 300 μm, dissecadas manualmente com agulhas

próprias de dissecção em meio iluminado com luz fria (iluminador marca Schott).

As fatias prontas foram colocadas posteriormente num recipiente com LCRa

regular de perfusão (sem a presença do ácido quinurênico). Após 30 minutos de

incubação, 2-3 fatias foram colocadas na câmara de registro (especial para

fatias cerebrais) (ver fig 4) com perfusão contínua de LCRa oxigenado com a

mistura 95% O2/5% CO2. A temperatura na câmara foi mantida a 33 oC por meio

de um termoregulador acoplado à mesma.

xlii

Fig 4. Câmara de registro eletrofisiológico in vitro, micromanipuladores e microeletrodos. Vista superior da câmara utilizada nos registros eletrofisiológicos. Pode ser observado em: (1) microeletrodo de registro extracelular, (2) micromanipulador mecânico, (3) câmara de registro (contendo fatias cerebrais), (4) câmara de estabilização (contendo fatias cerebrais), (5) microeletrodo de registro intracelular, (6) microeletrodo de estimulação e (7) sistema de iluminação por fibra óptica. O sistema está montado sobre uma mesa antivibracional (TMC, MA – USA) e envolto por gaiola de Faraday (não mostrado).

xliii

3.2 Fatias cerebelares horizontais

A preparação das fatias cerebelares horizontais foi obtida com procedimentos

semelhantes aos indicados para os cortes sagitais, variando apenas a secção

de corte. Na fig 5, podemos observar que após o tecido ser removido e

separado das demais estruturas, foi feito um corte na ponte e no tronco com a

finalidade de fornecer uma superfície plana para a fixação do cerebelo na cuba.

Com o cerebelo fixado a cuba de corte, um pequeno bloco de agarose foi

utilizado para dar sustentação ao tecido, enquanto a lâmina cortava as fatias.

xliv

Fig 5. Isolamento da estrutura cerebelar e plano de corte das fatias horizontais. O cerebelo, intacto, é rapidamente isolado das demais estruturas (A, B), fixado numa cuba acoplada ao vibrátomo e cortado horizontalmente (C). Essas fatias cerebelares contêm ambos os hemisférios e a porção medial (vérmis). Figura adaptada de Paxinos e Watson (1982).

A)

B)

C)

xlv

Fig 6 Setup de registro eletrofisiológico in vitro. Sistema de registro eletrofisiológico in vitro, composto por: (1) computador PC, (2) caixa de estimulação, (3) programador de estímulos Master 8, (4) Axopatch 1-D (Axon Instuments), (5) amplificador Axoclamp 2B (Axon Instruments), (6) osciloscópio (Tektronix), (7) termostato, (8) pré-amplificador Neurolog (Digitimer) (9) vídeo cassete.

xlvi

3.3 Estimulação para obtenção de respostas tipo potencial de campo Os potenciais evocados foram obtidos na região do vérmis cerebelar devido a

maior densidade de NP encontrada nessa região. Para evocar esses potenciais,

um eletrodo nicromado, bipolar, isolado por teflon foi posicionado na camada

molecular aonde as fibras paralelas (axônios das células granulares) foram

estimuladas. O eletrodo de registro foi posicionado a aproximadamente 70μm

da região estimulada. Este procedimento garante um espaço mínimo entre o

eletrodo de registro e o de estimulação, evitando a contaminação da resposta

eletrofisiológica pelo artefato de estímulo.

3.4 Microeletrodos para registros eletrofisiológicos “in vitro”

Os registros de potenciais de campo extracelular foram obtidos usando

micropipetas (ou capilares) de vidro (estiradas no equipamento - “puller” -

Modelo P-97, Sutter Instruments). Os microeletrodos para registro extra celular

do potencial de campo apresentaram resistência de 5-10 mOhm (após serem

preenchidos com solução de NaCl 1M). Os eletrodos para registro tipo patch

clamp (loose patch), apresentaram resistência variando entre 15-200 mΩ,

impedância de 1-3 mΩ, foram preenchidos com 119 mM NaCl e posteriormente

tamponados com 10mM HEPES.

xlvii

3.5 Captação de sinais eletrofisiológicos

O presente trabalho foi desenvolvido em sistema de eletrofisiologia “in vitro”

(setup) dentro de gaiola de Faraday para melhor isolamento da interferência

elétrica. O setup de registro foi instalado em mesa antivibracional, com o intuito

de evitar instabilidade dos registros. Os sinais eletrofisiológicos foram captados

e pré-amplificados inicialmente com microamplificadores (“headstages”),

acoplados a amplificador AXOCLAMP-2B (2 canais), e pré-condicionados com

pré-amplificador diferencial (NL-106, Neurolog, Digitimer, Ltd.). O sinal foi

posteriormente digitalizado utilizando a interface (12 bit) DIGIDATA 1200 (Axon

Instruments, Inc) e captado no microcomputador do tipo PC, através de um

circuito de interface para digitalização acoplada ao programa PCLAMP versão 6

(CLAMPEX) (Axon Instruments, Inc). Para a análise posterior (“off-line”) do sinal

digital foi usado os softwares CLAMPFIT do Pclamp 6 (Axon Instruments, Inc) e

EVAN (National instruments).

3.6 Protocolos de estimulação elétrica.

Os protocolos de estimulação elétrica extracelular foram realizados através do sistema MASTER 8 (AMPI), sincronizado a saída digital do computador (via interface DIGIDATA 2000). Antes de chegar nos microestimuladores posicionados nas fibras paralelas, o estímulo foi condicionado em caixa isoladora de ruído elétrico modelo DS2A, da Digitimer. Foram aplicados pulsos de correntes retangulares, de intensidade variável (30-35mA), a cada 15 seg.

3.7 Análise dos PA espontâneos e dos potenciais de campo (População de

espículas).

Excluído: P

xlviii

Os potenciais de ação espontâneos foram analisados levando-se em

consideração a sua freqüência em Hz (eventos por segundo)

conforme o exemplo na fig 7A. Os potenciais de campo (fig 7B)

foram analisados em relação aos parâmetros amplitude (mV) e

duração (ms). Para este tipo de análise foram utilizados os

programas previamente descritos. Ambos os tipos de registros,

assim como suas análises, foram realizados com os programas

CLAMPEX, Pclamp 6 com freqüência de amostragem de 1-50 kHz ou

utilizando o software EVAN (National Instruments, USA).

Fig 7. Registro de potenciais de ação espontâneos e do potencial de campo. A) neste registro tipo loose patch, observa-se os PA espontâneos (traços verticais) registrados no soma dos NP. Pode se observar a linha de base (1) e os PA (2). B) Nota-se o artefato de estimulação (normalmente retirado na edição da imagem) (1), o início do potencial (2),

B A

1 2

1

4

3

2

Excluído: Na fig XXX A, observa-se, como exemplo, um traçado contendo a linha de base (horizontal) e os PA (traços verticais).¶

xlix

o ponto de maior amplitude (3) e o término da atividade (4). Para cálculo da amplitude, foi feita uma média entre as amplitudes dadas por (2-3) e (3-4).

3.8 Drogas e sustâncias químicas utilizadas nos experimentos eletrofisiológicos.

Droga Solvente Concentração Fornecedor

Drogas aplicadas ao banho das fatias cerebrais

Ácido quianurênico Etanol 5 mM Tocris

Picrotoxina Água 0.1 mM Sigma

8pCPT-GMPc Água 50 μM Sigma

CNQX 0.1 NaOH 10 μM Sigma

Tabela 1. Drogas utilizadas nos registros de eletrofisiologia in vitro.

Formatado

Formatado

Formatado

Excluído: Traçados exemplificando os registros dos potenciais de ação (configuração loose patch) e de potenciais de campo.

Excluído: A Parâmetros dos registros de potenciais de ação. Pode se observar, na horizontal, a linha de base (a). Cada traço vertical representa o disparo de um único PA. B Registro de potencial de campo. Nota-se o artefato de estimulação (normalmente retirado na edição da imagem) (a), o início do potencial (b), o ponto de maior amplitude (c) e o término da atividade (d). Para cálculo da amplitude, foi feita uma média entre as amplitudes dadas por (b-c) e (c-d).

Excluído: Tabela.

l

4. ESTUDO HISTOLÓGICO

4.1 Protocolo para método de Golgi

Para a marcação dos neurônios pelo método de Golgi, foi utilizado protocolo

amplamente divulgado em trabalhos anteriores (Shimono e Tsuji, 1987). Para

diminuir a quantidade de precipitados, o tecido permaneceu sob agitação

constante (mesa agitadora orbital Tecnal TE 141) durante todo o protocolo.

Inicialmente, os animais foram perfundidos com solução de bicromato de potássio

3,5% e Formaldeído 10%, na proporção de 4:1. Após a decapitação, os cerebelos

foram isolados e retirados da caixa craniana. Em seguida, o tecido foi incubado em

solução de Bicromato de Potássio 3% (150ml) + Álcool Etílico 96% (50 ml) + Ácido

Acético (50ml), à 37C, durante 24 horas.

No 2° e 4° dia - A solução foi trocada e mantida por mais dois dias em

temperatura ambiente. Após este procedimento, a solução foi incubada em

Bicromato de Potássio 3% por cinco dias em temperatura ambiente.

No 11° dia de protocolo, as fatias ficaram estabilizando em água bi-destilada

durante o dia e foram lavadas por três vezes também em água bi destilada. Em

seguida, o tecido foi impregnado com Nitrato de Prata 0.5% por uma hora e

mantido por quatro dias no Nitrato de Prata 1%. Em seguida, foi feita nova

lavagem com água bi destilada por três vezes e em seguida impregnação com

Nitrato de Prata 2% por cinco dias. No 20° dia, o tecido permaneceu

estabilizando em água bi destilada durante o dia, sendo lavado também com

li

água bi destilada por três vezes. Ao final do processo, o tecido foi embebido em

sacarose 20 % por um dia.

Ao final do protocolo, o cerebelo foi cortado manualmente e as lâminas foram montadas com Bálsamo do Canadá.

4.2 Quantificação dos neurônios de Purkinje e de seus espinhos dendríticos.

Para realizar a contagem dos NP, foi utilizado o método descrito em estudo

prévio (Dam et al., 1984). De forma breve, o cerebelo de ratos Wistar foram

perfundidos e fixados (salina e paraformaldeido 4%). O cerebelo foi então

dividido em 6 blocos, três de cada hemisfério, por cortes sagitais conforme

ilustrado na fig 8. Fatias com 8-10 μm foram cortadas com um criostato e

coradas com a técnica de Violeta de cresila (Nissl). Os NP nucleados foram

contados utilizando-se um microscópio de luz (Nikon – Eclipse), sob aumento de

400X. A extensão da camada de NP foi medida e a densidade celular calculada.

O microscópio estava conectado a um sistema de vídeo (Sony exwave HAD)

acoplado a um computador PC. O software Image tool (versão 2.0 para

Windows, University of Texas, Center of Health and Sciences. USA), foi utilizado

para a contagem neuronal, assim como para a determinação da extensão do

perímetro da camada celular de Purkinje.

No caso da contagem dos espinhos dendríticos, o procedimento foi o descrito

acima, apenas com o diferencial de um aumento maior no campo (1000 X) e a

marcação pelo método de Golgi (descrita anteriormente) ao invés da coloração

Formatado

Excluído: será

Excluído: tecido

Excluído: ¶

lii

de Nissl. Devido à dificuldade na visualização de determinados espinhos

dendríticos, a contagem foi realizada independente de seus subtipos.

Fig 8 Posição dos cortes sagitais através do cerebelo de ratos Wistar para quantificação dos NP e de seus espinhos dendríticos. Ambos os hemisférios cerebelares foram divididos em 3 blocos e fatias de 8-10 μm foram coradas pela técnica de Nissl e, posteriormente, os NP foram quantificados.

5. Cromatografia líquida de alta performance (HPLC)

5.1 Preparação das amostras

Excluído: Fig XXX. Posição dos cortes sagitais através do cerebelo de ratos Wistar para quantificação dos NP e de seus espinhos dendríticos.

liii

Com o intuito de comparar as concentrações dos principais aminoácidos, foi

utilizada a técnica de HPLC. Para tal, foi seguido protocolo amplamente descrito

na literatura. Os animais foram decapitados e os cerebelos, rapidamente

removidos, pesados, e armazenados a – 80 °C . O tecido foi homogeneizado

(sonicado) numa solução 0.1 M de ácido perclórico (HCLO4) contendo 0.02% de

dissulfito de sódio (Na2S2O5), e homoserina (HSER) 10 mg/ml (solução interna

para aminoácidos). Para a homogeneização foi utilizado 15 ml de solução para

cada mg de tecido úmido. As amostras ficaram em repouso durante uma noite

a 0°C para precipitação das proteínas e, posteriormente foram centrifugadas a

11.000 X g durante 50 min. O sobrenadante foi filtrado e submetido a uma

derivatização com o-oftaladeido (OPA) e injetado no HPLC para quantificação

das amostras.

A derivatização dos aminoácidos foi feita dissolvendo-se 27mg de OPA em 1 ml

de metanol, adicionando 5 μl de 2-mercaptoetanol (BME) e 9 ml 0.1 M de

tetraborato de sódio (pH 9.3). Antes da análise das amostras, uma solução foi

preparada diluindo-se 1 ml da solução estoque com 2 ml da solução de

tetraborato de sódio 0.1M. A derivatização pré-coluna se completa reagindo-se

100μl desta solução com 50μl da amostra ou da solução padrão de

aminoácidos, por exatamente 2 min antes da injeção na coluna analítica

(Donzanti et al., 1988).

5.2 Padronização da técnica para análise de aminoácidos

Excluído: ¶

Excluído: e pesados

liv

O sistema de HPLC utilizado consistiu em um modelo isocrático que possui uma

bomba da marca Milton Roy, modelo constametric 3000, um detector de

fluorescência marca Shimadzu RF-10AxL, um injetor de amostras para HPLC

marca Rheodyne mod 7125 com loop de 20 μl, uma coluna RP-18 50 X 4.6 mm

marca Merck chromolith SpeedROD, um degasificador Shimadzu modelo DGU-

4A, um módulo de comunicação Shimadzu CBM-101, um programa de análise

de cromatogramas Shimadzu Class-LC10, acoplado a um microcomputador tipo

PC.

A fase móvel foi constituída por uma mistura de tampão fosfato de sódio 0,04 M

(pH 5,5) com metanol 11,5%. As condições do sistema de HPLC nesse método

foram: fluxo de 1.5 ml por minuto, detecção com excitação de 348 nm e emissão

de 460 nm.

Para estabelecermos o cromatograma padrão, todos os aminoácidos foram

testados (alanina, aspartato, arginina, asparagina, cisteína, fenilanina, GABA,

glutamina, glutamato, glicina, homoserina, histidina, isoleucina, lisina, leucina,

metionina, prolina, serina, taurina, tirosina, treonina, triptofano e valina) e o

tempo de retenção na coluna foi avaliado para cada aminoácido. Desta forma,

pudemos verificar que nas condições empregadas não havia sobreposição de

picos na saída das amostras. Assim a seqüência de aminoácidos que

padronizou este método, por ordem de tempo de retenção, foi o ASP, GLU,

GLN, GLI, TAU e GABA. Foram então feitas soluções estoques contendo ASP,

GLU, GLN, GLI, TAU, ALA e GABA de concentração 1 mg/ml diluídos em ácido

perclórico 0.1M, e a solução de uso foi diluída cem vezes para ser derivatizada.

Excluído: ¶

lv

5.3 Cálculo das concentrações de aminoácidos As concentrações foram obtidas pela aplicação da fórmula descrita abaixo,

obtendo-se os resultados em nanograma por miligrama de tecido (C):

Onde: h= altura; AAS = aminoácido; [ ] = concentração; A = fator de diluição e B =

diluição OPA.

6. Análise estatística

Os resultados foram avaliados de acordo com os seguintes testes estatísticos:

ANOVA, teste-T e teste do qui-quadrado. Quando encontramos diferenças

significantes esta análise foi complementada pelo teste Post-hoc de Scheffé. Em

todos os testes fixamos em 5% o nível para rejeição da hipótese nula e

assinalamos com um asterisco os valores significantes nos gráficos e tabelas.

Nas tabelas, o resultado da análise foi apresentado como média ± desvio

padrão (n), onde “n” é o número de observações.

C = hAAS

hSER

/ hAAS

hSER

. [ ] AAS . A . B

Excluído: ¶

Excluído: ¶

lvi

A organização dos dados obtidos e análise estatística realizou-se mediante o

uso de diferentes programas: EXCEL, SIGMA PLOT (Jandel Scientific),

STATISTICA, MICROCAL ORIGIN 7.0 –Módulo para PCLAMP.

7. Ética dos procedimentos experimentais

Os protocolos experimentais utilizados neste trabalho foram aprovados pelo

Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital São Paulo / Universidade Federal de

São Paulo, CEP No 1134/01. Os experimentos conduzidos na University of

Califórnia at Los Angeles, também seguiram os padrões do comitê de ética da

UNIFESP, assim como os critérios do conselho da UC e do National Institute of

Health (NIH). O número de animais utilizados para esse estudo foi reduzido ao

mínimo possível para gerar os resultados de forma segura.

Excluído: ¶¶

lvii

1. Eletrofisiologia in vitro

A técnica não invasiva de patch clamp loose patch, foi aplicada com o objetivo

de monitorar a geração de PA espontâneos originados no soma de neurônios de

Purkinje, continuamente banhados em antagonistas de GABAA, AMPA e cainato.

Quando diretamente visualizados, os neurônios de Purkinje de animais

portadores de epilepsia crônica apresentavam aspecto saudável, sem alterações

morfológicas e demonstrando as mesmas características observadas nas

células de animais controle. Entretanto, os registros in vitro demonstraram

diferenças significativas relacionadas às propriedades de disparo de PA

espontâneos. Devido a uma pequena variação (inerente à técnica) na distância

entre a ponta do micro-eletrodo e o neurônio, a amplitude dos PA dos NP variou

levemente e, portanto, este parâmetro não foi analisado.

lviii

1.1 Neurônios de Purkinje irresponsivos em animais com epilepsia Como pode ser observado na tabela 2, grande parte dos neurônios de Purkinje

pertencentes ao grupo com ELT não dispararam PA espontâneos na presença

de 50 μm picrotoxina e 5mM ácido quianurênico. O número de NP responsivos

em camundongos com ELT diferiu significativamente quando comparado ao

grupo controle (Teste-Qui2, p< 0.001). Para ser classificado como responsivo,

um dado neurônio deveria manter seu padrão de disparo por um período mínimo

de 5 min. No grupo submetido ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina, a

maioria dos neurônios inicialmente responsivos, não mantiveram o padrão de

disparo de PA espontâneos estável durante o protocolo farmacológico. Este

resultado é contrastante com o obtido em animais controle, cujos NP, na sua

maioria dispararam PA espontâneos que permaneceram estáveis por um

período significativo (ver tabela 2). Nos NP estáveis de ambos os grupos, o

padrão regular de disparo espontâneo de alta freqüência, foi mantido durante o

período de registro aproximado de 50 min.

1.2 A freqüência de disparos dos PA espontâneos não é alterada em

camundongos com epilepsia induzida pela pilocarpina.

Foram observados disparos de espículas simples de PA numa freqüência que

variou entre 36-63 Hz no grupo controle e entre 33-61 Hz no grupo com

epilepsia (tabela 2). A análise estatística não demonstrou diferenças nas

freqüências de disparo entre ambos os grupos. Durante os experimentos, não

lix

foram observados PA em forma de ”burst” ou surto, característicos da ativação

das fibras trepadeiras.

Em poucas células de ambos os grupos foram registrados PA de freqüência

mais elevada que a média, com cerca de 150 Hz, como é mostrado na fig 9.

Entretanto, nenhum desses neurônios manteve o padrão de alta freqüência

estável pelo período mínimo estabelecido (5 min) e foram desconsiderados em

termos estatísticos.

Grupo controle Grupo com ELT

Número de animais 5 7

Células testadas 13 61

Células responsivas 11 (84.6%) 9 * (14.8%)

Células estáveis 7 (53.8%) 5 (8.2%)

ACSF controle

Freqüência média (Hz)

44.9 (9.3) 45.6 (10.5)

8p-CPT-GMPc (50µm)

Freqüência média (Hz)

67.4 (13) 51* (12.5)

lx

Tabela 2. Disparo espontâneo em animais controle e com epilepsia e efeito do análogo de GMPc, 8p-CPT-GMPc (50µm). * Difere significativamente (p< 0.005)

Fig 9. Traçado representativo do disparo espontâneo de alta freqüência registrado nos NP. Ambos os traçados correspondem ao mesmo registro, apresentando uma escala de duração menor no registro inferior. Este padrão foi observado tanto no grupo controle como em animais experimentais.

1.3 Freqüência de disparo de PA espontâneos em resposta a análogo do GMPc.

Em camundongos controles, a perfusão de 8p-CPT-GMPc (50µm), um análogo

do GMPc, no LCRa por 10 min. induziu um aumento de longa duração na

freqüência de disparo espontâneo de PA. Esta condição de hiper-excitabilidade

foi mantida por um período superior a 20 min após o início da lavagem da droga,

chegando a um pico, com aumento médio de aproximadamente 50% (animais

50 ms

200 ms

50

lxi

controle). Nos animais com ELT também se observou uma potenciação em

resposta ao 8p-CPT-GMPc (50µm). Entretanto, o aumento na freqüência de

disparo foi sutil, conforme pode ser visto na fig. 10 A e B.

Quando os grupos são comparados entre si, após 10 min de perfusão do análogo de GMPc, observa-se que os camundongos com epilepsia crônica apresentaram uma resposta significativamente menor que no grupo controle (Teste-T, duas amostras, p<0.001). O aumento médio na freqüência de disparo de PA nos animais com ELT foi cerca de 12% em relação à linha de base.

lxii

-10 0 10 20 30

Tempo (min)

1

1.2

1.4

1.6

Freq

üênc

ia d

e di

spar

os e

spon

tâne

os

de p

oten

ciai

s de

açã

o

8p-CPT-cGMP (50µm)

ControlePilo

1.8

-10 0 10 20 30

Tempo (min)

1

1.2

1.4

1.6

Freq

üênc

ia d

e di

spar

os e

spon

tâne

os

de p

oten

ciai

s de

açã

o

8p-CPT-cGMP (50µm)

ControlePilo

1.8

A

lxiii

Fig 10. Efeito do análogo de GMPc, 8p-CPT-GMPc (50µm) na freqüência de disparos espontâneos em animais controle e com epilepsia. A) Dados referentes à média normalizada de disparo de PA espontâneos nos grupos controle (círculos pretos) e com epilepsia crônica (círculos brancos). Pode-se notar que após a perfusão da droga há uma diferença significante na potenciação das respostas entre os grupos. Camundongos com ELT não tiveram um aumento da freqüência de disparo de PA tão expressivo como observado no grupo controle (MED ± dp). B) Traçados exemplificando o comportamento de animais controle e com ELT após 10 min da adição de 8p-CPT-GMPc (50µm) ao LCRa. 1- traçado obtido previamente à aplicação da droga em animal controle (LCRa regular). 2-Traçado obtido em animal controle após 10 min de perfusão de 8p-CPT-GMPc (50µm). Nota-se que os PA estão mais freqüentes no registro 2 quando comparado ao traçado 1. 3 PA obtidos em animal crônico previamente a perfusão da droga (LCRa regular). 4 – Registro em animal crônico, após a adição de 8p-CPT-GMPc. A potenciação dos disparos de PA espontâneos não é tão expressiva em animais com ELT como o observado em fatias de animais controle.

B

lxiv

2. Fatias cerebelares horizontais

Registros evocados de potencial de campo são difíceis de serem obtidos no

cerebelo sem a significativa ativação de outros elementos neurais. Esta

dificuldade técnica faz com que os registros extracelulares de campo não sejam

muito utilizados para a investigação da circuitaria cerebelar. Para resolver esta

questão, utilizamos um plano de corte horizontal que até então não havia sido

implementado (fig 11 e 12).

As fatias cerebelares mantiveram resposta estável por longos períodos de até 15

horas, porém, os registros mostrados neste estudo foram obtidos com um tempo

de até 9 h após o término de sua preparação. Para demonstrar o

comportamento dos potenciais de campo nessas fatias foram construídas curvas

de estímulo/resposta – Input/Output (I/O), com duração fixa (pulsos retangulares,

duração de 0.2 ms e intensidade de 30mA) e voltagem variante, como pode ser

observado na fig 13. O valor limiar de voltagem para se obter resposta foi de,

aproximadamente, 5V e as fibras paralelas foram estimuladas até 50V. Com

esta máxima estimulação, foram gravados potenciais de campo com amplitudes

entre 8.63 e 10.08 mV em ratos controle (9.73 ± 0.96 mV [média ± dp]).

Potenciais de campo evocados no grupo controle foram comparados aos grupos

latente e crônico. Com parâmetros de 0.2 ms, 30 mA e 50V de estimulação,

lxv

animais na fase latente e crônica do modelo de ELT apresentaram médias de

potenciais de campo com menor valor que o observado no grupo controle

(ANOVA, IC = 95%, ver fig 14).

A duração destes potenciais também foi analisada nos três grupos (ver fig 15). Os valores médios obtidos foram (em ms): grupo controle 4.07 ± 0.53; latente 4.15 ± 0.54; crônico 3.58 ± 0.71. A análise estatística (ANOVA IC = 95%, p=0.29) não demonstrou haver diferenças significativas. Como pode ser observado na fig 16, os valores para o limiar da resposta extracelular não variaram entre os três grupos (ANOVA, p=0.16). Observou-se uma média (em mV, ± dp) de 6,8 ± 2,2 nos animais controle, 6,8 ± 1,7 no grupo latente e 9,2 ± 2,2. Para a obtenção dos registros intracelulares, os NP foram empalados e após 20-

30 min, o que foi considerado como período de estabilização, os registros se

mantiveram constante, tendo seu potencial de repouso em torno de -65mV,

como pode ser observado na fig 12 B.

Com o intuito de demonstrar que as sinapses entre as fibras paralelas e os

dendritos dos NP permaneceram preservados, 6-ciano-7-nitro-quinoxalina-2,3-

dione (CNQX), foi adicionado ao LCRa. Conforme mostrado na fig 17, após 15

min de perfusão de 10μM CNQX, houve uma diminuição da amplitude do

potencial de campo.

lxvi

Fig 11. Fatias horizontais do cerebelo. Visão da fatia cerebelar contendo o Vérmis e ambos os hemisférios observados sob um microscópio de luz num aumento de 100X, coloração de Nissl (A). As três camadas do córtex cerebelar podem ser claramente distinguíveis. Camada molecular (ML), camada das células de Purkinje (PC) e camada granular (GL), vistas sob microscopia de luz, aumento de 200X.

2 mV

5 ms

20 mV

10 ms

2 mV

5 ms

20 mV

10 ms

A B

A B

lxvii

Fig12. Registro eletrofisiológico em fatia cerebelar horizontal: potencial de campo e registro intracelular de PA. Registros in vitro obtidos em resposta a estimulação das fibras paralelas. Potencial extracelular de campo (A), espícula simples registrada no soma dos NP (B).

Fig 13. Gráfico do tipo Input-Output mostrando os registros de potenciais de campo. O potencial de campo nas fatias cerebelares horizontais tem comportamento semelhante ao observado em outros estudos, demonstrando que a resposta é voltagem-dependente, tendo maior amplitude conforme o aumento da estimulação (duração do estímulo = 0.2 ms. Média ± dp).

0 10 20 30 40 500

2

4

6

8

10

Ampl

itude

(mV

)

Estimulo (V)0 10 20 30 40 50

0

2

4

6

8

10

Ampl

itude

(mV

)

Estimulo (V)

Controle Latente Crônico5,0

7,5

10,0

Controle Latente Crônico5,0

7,5

10,0

Am

plitu

de (m

V)

Estímulo

*

lxviii

Fig 14. Amplitude do potencial de campo nos grupos controle, latente e com epilepsia crônica. * A resposta extracelular (média ± dp) foi significativamente menor nos animais com ELT (ANOVA, IC = 95%).

Fig 15. Duração do potencial de campo nos grupos controle, latente e com epilepsia crônica. A duração dos potenciais de campo foi similar nos três grupos. Não foi observada significância estatística (méd ± dp, ANOVA).

Controle Latente Cronico2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

Dura

cao

(ms)

CrônicoLatenteControle

Dur

ação

(ms)

lxix

Controle Latente Cronico2

4

6

8

10

12

Ampl

itude

(mV)

Fig 16. Limiar para obtenção dos registros de potenciais de campo. Os valores obtidos para o limiar do potencial de campo foram semelhantes nos grupos controle, latente e crônico (Méd ± dp, ANOVA, IC = 95%).

Fig 17. Traçados sobrepostos do potencial de campo na camada de NP. Pode-se observar o potencial de campo com LCRa controle (traçado preto) e sobreposto, o registro após 15 min de perfusão de 10μM CNQX (traçado cinza). O bloqueio da transmissão glutamatérgica mediada por receptores tipo AMPA/cainato é responsável pela diminuição de amplitude. Barra de escala vertical = 2mV, escala horizontal = 4ms.

3. Perda Neuronal

Crônico

lxx

A contagem de células de Purkinje no cerebelo foi realizada com o intuito de verificar

os efeitos da ELT sobre estas. Não foi observada diferença entre os hemisférios

cerebelares em nenhum dos grupos estudados.

Em ratos controle, foi observada uma densidade celular média (± dp) de 15.03 ± 0.72

cel/mm. Todos os demais grupos variaram significativamente em relação ao controle

(ANOVA, IC 95%), conforme mostra a fig 18. Na fig 19-A, podemos ver a camada

celular de Purkinje com a sua densidade normal, formando um cinturão compacto,

sem espaços significativos entre os neurônios.

Nos ratos estudados durante a fase latente do modelo, foi observada uma

discreta perda neuronal na camada de Purkinje (ver tabela 3 e fig 19-B). A morte

celular pode ser vista na forma de “clusters” e espaços vazios estão presentes

ao longo da camada. Nestes animais a densidade dos NP variou entre 11.5 e

13.2 células/mm. Neste grupo, a perda neuronal foi significativamente maior que

a observada em animais controle (ANOVA, IC 95%, p = 0.00032). Também foi

obtida significância entre este grupo e os demais grupos experimentais (latente-

crônico p = 0,0028; latente-idoso p = 0,00165; latente-idoso crônico p =

0,00002).

A perda dos NP foi ainda mais acentuada nos ratos adultos jovens com ELT, com uma

média (dp) de 9.97 (± 0.58) cel/mm, conforme a indicado na tabela 3. Este grupo teve

morte neuronal significativamente maior que os animais controle (ANOVA, IC 95%, p

= 0,0028) assim como os experimentais estudados ainda na fase latente (ANOVA, IC

95%, p = 0,00032) e idosos com ELT (p = 0,020). Entretanto, não foi observada

variação estatística em relação ao grupo idoso (ANOVA, IC 95%, p = 0,759).

lxxi

Ratos Wistar idosos (entre 12 e 15 meses) apresentaram uma expressiva perda dos

neurônios de Purkinje, confirmando a hipótese destas células serem susceptíveis aos

efeitos do envelhecimento. A média de NP foi de 10.09 ± 0.86 células/mm. Esse

resultado foi estatisticamente semelhante ao grupo crônico. Quando comparado aos

demais grupos, foram obtidos os seguintes valores de p: idoso-controle = 0.00012;

Idoso-latente =0, 0051; idoso-crônico adulto jovem = 0,76 e idoso-idoso crônico =

0,020.

Entre os animais idosos (12-23 meses) com ELT observamos que todos apresentaram significativa perda dos NP. Este grupo apresentou a mais expressiva morte celular conforme pode ser observado na tabela 3 e na fig 18. O número de NP variou entre 7,06 e 9,01células/mm. Houve diferença significativa (descrita acima) em relação a todos os demais grupos.

Grupo (n) Neurônios / mm

(Média ± DP)

Idade (meses) mm contados

Controle (5) 15.03 ± 0.72 2-3 520

Latente (5) 12.40 ± 0.67 ∗ 2-3 515

Crônico (5) 9.97 ± 0.58 ∗∗ 4 491

Idoso (3) 10.09 ± 0.86 ∗∗ 12-15 612

Idoso Crônico (6) 8.36 ± 0.94 ∗∗∗ 12-23 590

lxxii

Tabela 3. Densidade dos neurônios de Purkinje nos diferentes grupos estudados. * Difere significativamente do grupo controle; ** difere significativamente dos grupos controle e latente; *** difere significativamente do grupo controle, latente, crônico e idoso.

.

Latente Crônico Idoso Idoso cro0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

o co

ntro

le


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

o co

ntro

le

*

*******


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

o co

ntro

le


10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% d

o co

ntro

le

*

*******

lxxiii

Fig 18. Gráfico ilustrando a morte dos neurônios de Purkinje nos diferentes grupos. Todos os grupos diferem significativamente dos animais controle (p < 0.05).* Difere significativamente do grupo controle; ** difere significativamente dos grupos controle e latente; *** difere significativamente do grupo controle, latente, crônico e idoso.

Fig 19 Neurônios de Purkinje em ratos Wistar controle e com epilepsia do lobo temporal. Os neurônios de Purkinje podem ser claramente observados sob microscopia óptica, aumento de 200x. No grupo controle (A), essa camada celular apresenta uma densidade regular, compactada. Os neurônios estão perfeitamente dispostos, formando um cinturão entre a camada granular e a molecular. Nos animais com epilepsia crônica (B) as setas indicam os neurônios de Purkinje remanescentes. Pode se notar um grande espaçamento entre as células.

4. Densidade de espinhos dendríticos nos neurônios de Purkinje Os espinhos dendríticos dos NP localizados nos segmentos terminais foram

quantificados nos grupos: controle e adulto jovem com ELT. No grupo controle

foi observada uma densidade média (dp) de 1.65 ± 0.53 espinhos /10

micrômetros. Nos animais com ELT a média equivaleu a 1.36 ± 0.40células/10

A B

lxxiv

micrômetros. Não foi observada alteração significativa do número de espinhos

dendríticos conforme indicado na fig 20.

Fig 20. Densidade de espinhos dendríticos nos NP. Os grupos não diferem estatisticamente (ANOVA, IC = 95%, p = 0.36).

5. Dosagens de aminoácidos

Controle Crônico0.00.20.4

0.60.81.01.2

1.41.61.8

2.02.2

Den

sida

de d

e es

pinh

os d

endr

itico

s do

s N

P(m

edia

/10m

icra

s)

Controle Crônico0.00.20.4

0.60.81.01.2

1.41.61.8

2.02.2

Den

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Através da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), foram

quantificados os níveis de aminoácidos presentes no cerebelo durante as fases

aguda e crônica do modelo de ELT induzido pela pilocarpina assim como em

ratos controle. Conforme mostrado na fig 21 e na tabela 4, pode-se observar

alterações significativas durante a fase aguda assim como na fase crônica do

modelo.

Os valores absolutos, referentes às concentrações de aminoácidos obtidas nos grupos controle, agudo e crônico podem ser observadas na tabela 4. No grupo agudo, ocorreu aumento da concentração dos aminoácidos ASP, GLU, TAU e de GABA. Por outro lado, não houve variação significativa nas concentrações dos demais aminoácidos: GLN e GLI (ANOVA, IC = 95%). De forma contrastante, no grupo crônico, foi observada uma diminuição significante na concentração de todos os aminoácidos testados.

Tabela 4. Comparação dos valores absolutos de aminoácidos dosados no cerebelo de ratos controle e experimentais. As concentrações estão representadas em nM/g de tecido úmido (média ± dp). Significância estatística

Aminoácidos Controle (n = 9; méd ± dp).

Agudo (n = 6; méd ± dp).

Crônico (n = 10; med ± dp).

ASP 3351.83 ± 259.42 4211.5 ± 278.76 * 2100.73 ± 77.07** GLU 9760.97 ± 532.52 10799.83 ± 811.63 * 6281.16 ± 901.55** GLI 6546.2 ± 318.76 7387.09 ± 929.55 4699.58 ± 759.27** GLN 1684.9 ± 346.99 1749.98 ± 388.55 1003.3 ± 318.12** TAU 5260.36 ± 664.77 6712.44 ± 964.10 * 3196.25 ± 443.27**

GABA 2357.80 ± 207.14 2583.58 ± 224.47 * 1360.75 ± 293.45**

lxxvi

dada pela ANOVA, IC = 95%. * Difere somente do controle; ** difere do controle e do agudo.

Fig 21. Alterações nas concentrações de aminoácidos no cerebelo de ratos submetidos às fases aguda e crônica do modelo de ELT induzido pela pilocarpina. Significância estatística dada pela ANOVA, IC = 95%. * Difere somente do controle; ** difere do controle e do agudo. Nossos resultados sugerem que a ELT induzida pelo modelo da pilocarpina gera lesão,

dano e disfunção no cerebelo de roedores. Esta conclusão está embasada em nossos

experimentos utilizando diferentes técnicas como os registros eletrofisiológicos,

abordagem neuroquímica (HPLC), e protocolos anatômicos.

Através dos registros tipo patch clamp, foram observadas alterações nas propriedades de

disparo espontâneo de PA nos NP de camundongos com ELT.

ASP GLU GLN GLI TAU GABA0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Controle Agudo Cronico

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Controle Agudo Crônico

lxxvii

Nesse sentido, observamos que nos animais com epilepsia induzida pela pilocarpina, um

número significativo de NP não apresentou disparo espontâneo de PA. Quando

diretamente visualizados esses neurônios tinham as mesmas características morfológicas

amplamente conhecidas: células grandes e piriniformes, distribuídas em uma camada

bem definida, criando um cordão celular entre as camadas molecular e granular. Ainda

que estas células estejam aparentemente preservadas, a ELT, por algum mecanismo não

completamente compreendido, deve gerar nesses neurônios uma alteração nas correntes

iônicas ou nas propriedades de membrana que impeça a geração dos PA espontâneos.

Os mecanismos biofísicos pelos quais os neurônios disparam PA de forma

espontânea ainda não são plenamente conhecidos. Recentemente, foi sugerido

que o primeiro nódulo de Ranvier seria o local de deflagração (Clark et al.,

2005). Entretanto, é sabido que para sustentar esta atividade, as correntes

intrínsecas devem interagir para despolarizar a membrana celular até o limiar,

gerar um PA, e em seguida repolarizá-la novamente até potenciais negativos,

possibilitando que a próxima espícula possa ser deflagrada. No caso de

neurônios como os de Purkinje, que apresentam altas freqüências de disparo, a

disponibilidade dos canais de sódio tem um papel importante. Nesses tipos de

neurônios, a recuperação após o disparo de um potencial deve ser rápida o

bastante para compensar o período de inativação. Esta questão é ao menos

parcialmente resolvida pela ação dos canais de Na+ possuidores da chamada

“cinética ressurgente” (Raman e Bean, 1997). Com a despolarização, esses

canais de Na+ dependentes de voltagem sensíveis a tetrodotoxina, abrem-se

brevemente e então se tornam bloqueados. Este bloqueio, feito por proteína

lxxviii

endógena, não somente limita a inativação através da competição pelo sistema

de inativação rápida, como também se desacopla rapidamente em potenciais

negativos. Conseqüentemente, as correntes de Na+ ressurgentes fluem

brevemente enquanto o canal abre com a repolarização. Os canais então,

passam a estar fechados e podem ser reativados rapidamente diminuindo o

período refratário e facilitando o disparo de potenciais espontâneos de alta

freqüência (Raman e Bean, 2001; Grieco et al., 2002; Khaliq et al., 2003).

É estabelecido que os NP disparam PA espontâneos em alta freqüência quando

expostos a antagonistas de GABAA, e de receptores tipo AMPA/cainato. Em

nosso estudo com o grupo controle, observamos a presença desses potenciais

espontâneos em uma grande porcentagem de NP. Esse dado está de acordo

com estudos prévios nos quais a atividade espontânea foi registrada em todas

as células de Purkinje testadas provenientes de animais controle (Raman e

Bean, 1999) ou em cerca de 90% delas (Smith e Otis, 2003).

Em uma outra série de experimentos com registros do tipo patch clamp, a

aplicação de doadores de NO nos animais com epilepsia, resultou em uma sutil

potenciação da freqüência de disparo. Por outro lado, este aumento foi

significativamente menor que o observado no grupo controle. Sabe-se que

doadores de NO podem induzir uma potenciação de longo prazo na freqüência

de disparo de PA espontâneos (Smith e Otis, 2003). Esses resultados foram

reproduzidos no grupo controle, onde foi observado um aumento na freqüência

de até 50% de disparo de PA durante o pico máximo. É sabido que a elevação

da concentração de GMPc poderia agir em 3 diferentes áreas: modulando as

lxxix

concentrações de AMPc, abrindo os canais tipo CNG (importantes na retina e no

sistema olfatório) e ativando as proteínas quinases (Hofmann et al., 2000).

Estes, por sua vez, atuariam na cascata de NO-GMPc, induzindo aumento na

freqüência de disparos. Foi demonstrado, também, que a ativação da PKG

aumenta a probabilidade de abertura do canal e esta modificação tende a

aumentar a excitabilidade, gerando um maior número de PAs em reposta a uma

dada injeção de corrente (Klyachko et al., 2001). Para se obter aumento na

freqüência de disparos espontâneos, é necessário que as condutâncias iônicas

estejam alteradas na membrana celular. Para tal, dois canais são fortes

candidatos: os canais de K+ (BK) ativados por alta condutância de Ca2+ e os

canais ressurgentes de Na+ (Smith e Otis, 2003).

Investigações utilizando diferentes modelos vem demonstrando diminuição e até desaparecimento dos níveis cerebelares de GMPc. Utilizando o modelo “nervous mutant mice” que apresenta perda genética dos NP, Mao et al., (1975) observaram o desaparecimento do GMPc no cerebelo. Neste sentido, um estudo experimental posterior, com o modelo do ácido caínico, também mostrou uma queda brusca nos níveis de GMP cíclico (Biggio et al., 1978). Uma hipótese a ser considerada seria que um efeito semelhante poderia ocorrer no cerebelo de animais submetidos ao modelo de ELT induzida pela pilocarpina, o que responderia pela baixa potenciação dos PA de animais com epilepsia na presença de análogos de GMPc. Esse resultado sugere que a epilepsia do lobo temporal induzida pela pilocarpina promova alterações nas funções de 2º mensageiros nos NP, comprometendo sua atividade. Entretanto, quando consideramos a freqüência de disparo dos poucos NP pertencentes ao grupo com ELT que foram registrados com sucesso, não observamos diferença em relação ao grupo controle. Em LCRa regular, ambos os grupos demonstram alta freqüência de disparo espontâneo de PA in vitro. Foi observada nos NP (dos grupos controle e experimental crônico) uma variação de disparo aproximada entre 30 e 60 Hz. Estes resultados estão de acordo com investigações preliminares onde a freqüências de disparo vaiaram entre 40-50 Hz (Häusser e Clark, 1997; Womack e Khodakhah, 2002), valores muito próximos aos registrados em nosso estudo. Devido à estrutura da circuitaria cerebelar e as complicações decorrentes para se conseguir a estimulação das fibras desejadas sem a ativação significativa de

lxxx

outros elementos neurais, o estudo eletrofisiológico in vitro vem sendo feito principalmente com técnicas de patch clamp. Para tentar viabilizar o registro in vitro dos potenciais de campo, desenvolvemos um novo plano de corte do tecido. Numa fatia de corte sagital, que é amplamente utilizada, as fibras paralelas ficam bastante reduzidas. Em contrapartida, toda a extensão dos dendritos dos NP está preservada. Por outro lado, ao cortar o tecido no plano horizontal, todo o comprimento das fibras paralelas, cerca de 1.5 mm, é preservado. Entretanto, inevitavelmente, parte da arborização dendrítica é perdida, comprometendo as sinapses entre as fibras paralelas e os NP. É sabido que esta transmissão é mediada, principalmente, através de receptores do tipo AMPA e cainato. A preservação destas sinapses em fatias cerebelares horizontais foi comprovada em nosso estudo pela adição de 10 μM CNQX ao LCRa. A imediata diminuição da amplitude dos potenciais de campo indica o bloqueio da transmissão nessas sinapses e sua conseqüente preservação nas fatias cerebelares horizontais. Para complementar os estudos com a técnica de patch clamp, registros

extracelulares de campo foram comparados entre os três grupos: controle,

latente e com epilepsia crônica. Foi observado que animais com epilepsia

apresentavam uma amplitude significativamente menor em relação ao grupo

controle. Porém os valores para o limiar e a duração do potencial de campo não

variaram significativamente. Esses resultados eram esperados devido à prévia

observação da morte dos NP no modelo de ELT induzida pela pilocarpina. Os

registros de potencial de campo são uma referência do número de neurônios

que estão disparando PA na área adjacente ao microeletrodo. Uma densidade

celular menor geraria uma diminuição na amplitude da espícula extracelular.

Esses dados complementam estudos prévios no modelo de ELT induzido pela

pilocarpina (Sanabria, 1999). Nesta investigação foi verificada a perda celular no

hipocampo de animais com ELT crônica, que também apresentavam uma menor

amplitude do potencial de campo. Entretanto, ao contrário do que é vastamente

notado em fatias hipocampais, não foi observada a presença de espículas

recorrentes no córtex cerebelar. Esses potenciais com espículas recorrentes

lxxxi

caracterizam áreas associadas ao foco epileptogênico tanto em modelos

animais como em pacientes com ELT e o cerebelo, mesmo lesado, parece não

os apresentar. Esse resultado era esperado uma vez que o cerebelo é rico em

transmissão sináptica inibitória, principalmente mediada por receptores

GABAérgicos.

Em uma segunda série de experimentos utilizamos a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, HPLC, para o estudo neuroquímico do cerebelo. A análise da concentração dos aminoácidos durante o período agudo do modelo demonstrou um aumento na concentração de ASP e GLU, TAU e GABA. De maneira contrastante, na fase crônica observamos uma redução de todos os aminoácidos testados. Os resultados (em valores absolutos) obtidos no grupo controle estão de acordo com aqueles já descritos em estudo anterior (Eloqayli et al., 2003). Estudo prévio do nosso grupo, efetuado no hipocampo de ratos submetidos ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina (Cavalheiro et al., 1994), mostrou uma diminuição da concentração dos níveis de ASP e GLU associados com um aumento de GABA na fase aguda do modelo. A diminuição da concentração dos aminoácidos foi considerada como indicação do aumento de liberação destes neurotransmissores, responsáveis pela geração do status epilepticus (Cavalheiro et al., 1994). No período crônico, caracterizado pelas crises espontâneas e recorrentes, todos os aminoácidos testados (ASP, GLU, GLN, GLI e GABA) tiveram sua concentração aumentada. De forma contrastante ao hipocampo, observamos no cerebelo um aumento na

concentração dos aminoácidos ASP e GLU durante a fase aguda do modelo. O

GABA também aumentou sua concentração, porém este resultado está de

acordo com o observado no hipocampo. Podemos interpretar este aumento nas

concentrações dos aminoácidos excitatórios e inibitórios como um aumento na

produção desses neurotransmissores. Outra possibilidade é a redução da

liberação sináptica durante o SE. Este fenômeno estaria provavelmente

relacionado a uma tentativa de conter a hiper-excitabilidade desencadeada pela

pilocarpina em estruturas límbicas.

lxxxii

Durante a fase crônica, caracterizada pela presença de crises espontâneas e

recorrentes, todos os aminoácidos tiveram diminuição de concentração no

cerebelo, sugerindo um aumento na liberação ou redução de síntese desses

aminoácidos. Este quadro é exatamente o oposto ao previamente observado na

fase aguda, mostrando que durante o SE ou durante o período crises

espontâneas vias diferentes de ativação e inibição cerebelares são ativadas.

As células granulares do cerebelo, predominantemente glutamatérgicas fazem

sinapse com as células de Purkinje, que são predominantemente GABAérgicas.

Conforme já discutido, a fase crônica é caracterizada por uma expressiva morte

das NP. Como esses neurônios possuem um papel de destaque na circuitaria

cerebelar, esta perda neuronal comprometeria significativamente a via

GABAérgica. Entretanto, os NP sobreviventes podem ter um aumento na

liberação de GABA, na tentativa de conter a excitação, o que justificaria os

níveis de GABA diminuídos. As células granulares projetam seus axônios (fibras

paralelas) em direção aos dendritos dos NP. No caso de morte dos NP, as fibras

paralelas não encontram seu alvo o que pode induzir a morte das células

granulares (Selimi et al. 2000). Além disso, uma diminuição dos níveis de GLU

no cerebelo também pode significar um aumento da liberação desse

neurotransmissor. De forma complementar, é possível ainda que haja uma

proliferação das células da glia, que captam GLU da fenda sináptica e o

transformam em GLN, que de volta ao neurônio seria transformado em mais

GLU e esse seria então liberado, ativando assim os NP e conseqüentemente a

liberação de GABA. Entretanto, a dosagem desses aminoácidos na fase

lxxxiii

silenciosa do modelo poderá vir a dar indicações importantes de como e quando

a liberação de ASP e GLU ocorreram de modo a promover excitotoxidade e a

morte de NP. Essa fase do trabalho já está em andamento.

De qualquer forma, esses resultados refletem diferenças importantes nas funções exercidas pelas áreas hipocampais e cerebelares durante o desenvolvimento da ELT. O hipocampo é considerado como uma área de gênese da atividade epiléptica, enquanto o cerebelo atuaria como um agente inibitório, devido à riqueza de suas conexões GABAérgicas. Posteriormente, realizamos uma investigação anatômica do cerebelo. A análise da morfologia cerebelar em nosso estudo demonstrou que o SE induzido pela pilocarpina, resulta na morte dos NP. Durante a fase latente do modelo foi observada perda desses neurônios, a qual foi agravada no período crônico do modelo, onde há crises espontâneas e recorrentes. O efeito do envelhecimento também foi observado e mostrou ser um indutor de morte neuronal no cerebelo, a qual, é significativamente potencializada quando associada à epilepsia. A perda celular inicial poderia ser causada pela excitotoxidade e anóxia, resultante das 6 h contínuas de SE a que esses animais foram submetidos. Este evento seria então agravado na fase crônica do modelo, aonde ocorrem crises espontâneas e recorrentes. A partir deste período os animais poderiam começar um ciclo de déficits dos mecanismos de inibição GABAérgica. O sutil decaimento do número de NP após o SE levaria a um leve prejuízo da capacidade de inibição do cerebelo. A partir desse momento cada crise teria uma facilidade maior de propagação com maior intensidade, lesando mais NP e comprometendo ainda mais a capacidade de extinção das crises espontâneas e recorrentes. Além disso, estudos experimentais e em seres humanos têm demonstrado que

os NP são bastante vulneráveis aos efeitos do envelhecimento (Pentney, 1986;

Dlugos e Pentney, 1994; Woldenberg et al., 1993; Woodruff-Pak e Trojannowski,

1996). O envelhecimento em humanos começa a induzir perda de NP somente

em indivíduos acima de 60 anos (Woodruff-Pak e Trojanowski, 1996), porém

este fenômeno pode ser observado em roedores com 12 meses de idade

(Rogers et al., 1984). Investigamos a densidade dos NP em animais idosos e,

sobretudo, quando a epilepsia estava associada ao envelhecimento. Nossos

lxxxiv

resultados corroboraram trabalhos prévios indicando a morte de um grande

número de NP em roedores idosos, com idade superior a 12 meses.

O grupo formado por animais idosos com ELT obteve a mais expressiva morte neuronal entre todos os grupos, tendo sido observada em todos os animais que compuseram esse grupo. Este resultado era previsível, visto que esses animais acumularam os efeitos induzidos pelo status epilepticus, pelas crises espontâneas recorrentes e pelo envelhecimento. A morte dos NP é uma das principais características de dano na circuitaria

cerebelar seja induzido pelas epilepsias, crises ou demais fatores. Tem sido

observado que este fenômeno pode ocorrer geneticamente em diversos

modelos de camundongos como nervous (nr/nr), leaner (Cacna1ala/la) (Zanjani

et al., 2004) e toppler (Duchala et al., 2004) ou ainda em ratos CC (Ando et al.,

2004). Também pode ser observado mediante a aplicação de ácido caínico,

sugerindo que diferentes mecanismos podem gerar dano às células de Purkinje,

(Herdon e Coyle, 1977; Biggio et al., 1978).

A morte dos NP pode acarretar também em alterações nas células granulares. É bem estabelecido que a população destas células seja regulada pelos NP e quando ocorre a sua morte, as células granulares diminuem proporcionalmente o seu número. Tem sido especulado que esse fenômeno possa ocorrer por duas vias: pela indução direta de morte celular através da remoção de fatores tróficos ou pela inibição da mitose (Goldowitz e Hamre, 1998). De forma complementar à contagem neuronal, estudamos também a densidade dos espinhos dendríticos localizados nos NP. A quantificação dos espinhos dendríticos foi realizada com o intuito de verificar possíveis alterações decorrentes da indução da epilepsia. O método de marcação neuronal utilizado neste trabalho e desenvolvido por Camilo Golgi, é classicamente utilizado para visualização dos dendritos desde a primeira descrição feita por Ramon y Cajal (1888), de acordo com Lee et al., (2004). Não observamos alteração significativa na densidade de espinhos dendríticos terminais dos NP, porém, vale a pena ressaltar que não procedemos à caracterização de seus subtipos. A perda dos espinhos dendríticos nos NP ocorre devido à ausência das sinapses com as fibras paralelas. Com a morte dos NP, as células granulares, cujos axônios formam as fibras paralelas, perdem seu alvo e conseqüentemente também podem morrer.

lxxxv

Os espinhos dendríticos têm uma capacidade de recuperação relativamente

rápida quando expostos a diferentes condições. Esta poderia ser uma hipótese

para explicar nosso resultado, e neste caso, as crises recorrentes que estão

sempre presentes, não teriam influência ou esta seria apenas secundária.

Recentemente, vêm sendo desenvolvidos alguns modelos de camundongos mutantes com diferentes tipos de alteração cerebelar. A disfunção ou morte dos NP parece ser uma condição se não necessária, ao menos uma característica importante para o aparecimento de epilepsia nesses modelos. Nesse sentido podemos observar a freqüente combinação entre ataxia e epilepsia em camundongos mutantes (Fletcher et al., 1996; Barclay et al., 2001; Ivanov et al., 2001). Até recentemente, sete mutações diferentes em camundongos apresentam ataxia associada à epilepsia de ausência (tottering, leaner, rolling Nagoya, rocker, lethargic, ducky e stargazer). O modelo leaner (Fletcher et al., 1996) apresenta epilepsia associada a uma dramática diminuição na ativação de correntes de Ca2+ tipo P nos NP (Dove et al., 2000). Estas correntes são responsáveis por 90% do fluxo de Ca2+ nos NP e possuem funções importantes como o controle da excitabilidade (Dove et al., 1998). No modelo de neurodegeneração em camundongos Lurcher, ocorre à morte de praticamente todos os NP. Estudo conduzido por Zuo et al., (1997) utilizando esse modelo identificou uma mutação no gen δ2 para os receptores glutamatérgicos como responsável pela morte dos NP. Como conseqüência da mutação, os receptores glutamatérgicos formados permanecem ativos por um período maior permitindo um influxo exagerado de cálcio, gerando excitotoxidade e perda neuronal. Como um mecanismo subseqüente à perda do input GABAérgico nos NP, os neurônios dos núcleos cerebelares profundos têm sua condutância sináptica aumentada neste modelo (Linnemann, 2003). Ao analisarmos nossos resultados em conjunto, estes demonstram diferentes graus de lesão e alteração cerebelar induzidos exclusivamente pela ELT. Conforme mostramos indícios de que o envelhecimento per se também teria esta capacidade, esta conclusão não invalidaria as evidências de morte de NP por intoxicação pela fenitoína e outros agentes. Entretanto sugerimos que a epilepsia per se seja o principal responsável pelos danos ao cerebelo, que seria agravado conforme o aumento da intensidade e freqüência das crises. Crises recorrentes podem induzir lesão no tecido nervoso e os danos foram

inicialmente observados experimentalmente no hipocampo (Sommer, 1880). O

termo excitotoxidade é atribuído a liberação exagerada de glutamato durante as

crises e induz a uma hiper-expressão dos receptores glutamatérgicos. Em

desordens do sistema nervoso central, como nas epilepsias, é estabelecido que

lxxxvi

a excitotoxidade tenha um papel importante na morte celular (Aarts e Tymianski,

2003). Ocorre então um influxo de altas concentrações de Ca2+ que ativa uma

cascata envolvendo enzimas de Ca2+ dependentes (fosfatases, proteases e

lípases). A oxidação de lipídeos também pode levar a produção de radicais livres

e conseqüente morte neuronal. O padrão de morte celular foi inicialmente

identificado como necrose, porém recentemente há indícios de que a apoptose

também possa atuar. Os NP recebem aferências excitatórias tanto das fibras

paralelas quanto das fibras trepadeiras. No caso de uma descarga epiléptica,

essas sinapses poderiam liberar uma quantidade excessiva de glutamato

induzindo a morte dos NP. Este mecanismo de lesão não seria difícil de ser

previsto uma vez que cada NP possui múltiplas sinapses excitatórias com cada

fibra trepadeira e também é excitado em pontos mais específicos por diversas

fibras paralelas.

Assim como os mecanismos de excitotoxidade tem comprovada ação lesiva nas áreas

hipocampais, o mesmo deve acontecer no cerebelo. Pacientes submetidos a esta condição

poderiam perder a capacidade de inibição das crises. Isto explicaria os resultados

controversos que levaram a não utilização da estimulação cerebelar para controle das

epilepsias. Podemos sugerir a hipótese de que pacientes com ELT, durante as crises

iniciais, não apresentem comprometimento da circuitaria cerebelar. Neste sentido seria

interessante estudar os efeitos da estimulação cerebelar nesse grupo.

Grande parte dos aspectos abordados no decorrer desta investigação faz referência à perda do tênue equilíbrio entre os níveis de excitação e inibição no SNC desencadeados pela epilepsia. Esta condição reflete o comprometimento de uma característica fundamental para o desenvolvimento dos seres vivos: a manutenção da homeostase.

lxxxvii

Sistemas homeostáticos podem manter um contínuo balanço interno através de reações específicas a cada mudança no ambiente. Esta capacidade compensatória é necessária para o desenvolvimento de sistemas complexos (Mody, 2004). Os resultados obtidos nesse estudo sugerem que no modelo de ELT induzido pela pilocarpina, haja uma quebra da homeostase GABAérgica no cerebelo. A significativa morte dos NP deve levar a um déficit na produção de GABA. Soma-se a isso o mau funcionamento de alguns neurônios que apesar de estarem preservados não disparavam PA e conseqüentemente não exercem qualquer influência inibitória. Seguindo um mecanismo de feedback, distúrbios na homeostase permitem uma resposta através da regulação da freqüência de disparo de PA (Stemmler e Koch, 1999). Conforme demonstrado nos resultados, esse mecanismo de ação poderia não estar sendo acionado nos animais com ELT. Para a compreensão das anormalidades que poderiam estar ocorrendo é necessário primeiro abordar os mecanismos responsáveis pela manutenção da homeostase. Frente a uma mudança no estímulo de entrada (input), os neurônios poderiam atuar alterando as propriedades das condutâncias tipo voltagem-dependentes ou ajustar a transmissão sináptica, controlando o número e as propriedades de neurotransmissores e receptores (Turrigiano e Nelson, 2000). Os ajustes nas condutâncias de canais voltagem-dependentes são geralmente chamados de “plasticidade intrínseca da homeostase” enquanto o ajuste das sinapses chama-se “plasticidade sináptica da homeostase” (Turrigiano, 2000). Com os dados disponíveis não é possível especificar em que nível a ELT estaria agindo sobre a homeostase GABAérgica. Neste sentido, estudos futuros com a técnica de patch clamp na configuração whole cell poderiam, através do registro das correntes iônicas, fornecer maiores indícios. Este será o principal objetivo de nossos futuros estudos.

lxxxviii

- O modelo de ELT induzido pela pilocarpina provocou diferentes formas de

lesão e dano celular no cerebelo de roedores. Podemos destacar a

significativa morte dos Neurônios de Purkinje, que são indicadores da

viabilidade da circuitaria cerebelar. Os neurônios remanescentes

possuíam alterações nas propriedades de disparo, caracterizadas pela

ausência de potenciais de ação espontâneos e baixa potenciação a

análogos de GMPc.

- Animais idosos também foram avaliados e confirmou-se o resultado de

trabalhos prévios que demonstraram uma importante influência do

envelhecimento nos neurônios de Purkinje. Quando o envelhecimento

estava associado à epilepsia, esses resultados foram ainda mais

expressivos.

- Um foco epiléptico originado em estruturas hipocampais, se propagaria

para o cerebelo gerando uma quebra do estado de homeostase

GABAérgca em animais com ELT. Este quadro levaria a um ciclo aonde

lxxxix

o déficit na inibição facilitaria as crises recorrentes, que por sua vez

atuariam com maior intensidade induzindo dano e lesão às demais

estruturas.

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Due to the exuberance of its inhibitory output toward deep cerebellar nuclei and extracerebellar structures, the cerebellum has been postulated to act inhibiting epileptic activity. However, and depending on the intensity and frequency of the seizures, such inhibitory capacity may be compromised by epilepsy. Epileptic

cx

activity generated in limbic structures could reach the cerebellum, via anatomically distant but interconnected areas, and induce severe degrees of damage. This investigation is aimed at to study the physiological and structural properties of Purkinje neurons (PN) in the model of temporal lobe epilepsy induced by pilocarpine in rodents. In the present study, using patch clamp recordings, we show differences in the spontaneous firing rate pattern of PNs recorded in adult male mice with temporal lobe epilepsy (TLE). Most PN of this group did not fire spontaneously in the presence of 50μm picrotoxin and 5mM kynurenic acid. In addition, mice with epilepsy did not show the same potentiation in spontaneous firing rate in response to NO donor analog 8p-CPT-cGMP (50µm). In addiction, the concentrations of main aminoacids were quantified trough HPLC technique. The concentrations of all aminoacids tested decreased significantly in the chronic phase of the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. PN loss was also investigated, the cerebellum of adult male Wistar rats were cut at 8-10 μm, stained in Nissl preparation and nucleated cells were counted during the silent and chronic phase of the pilocarpine model of TLE. The status epilepticus per se was sufficient to induce neuronal loss, which was aggravated after the beginning of spontaneous recurrent seizures. In addiction, we quantified the dendrite spines in PNs during the chronic phase of the model, however no alteration in density was observed. Taken together, the results showed different levels of alterations and damage to the cerebellar circuitry. As PNs are considered the main element in cerebellar cortex this may represent a larger cascade of events in the whole cerebellum induced by temporal lobe epilepsy.

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Estudo das Alterações Cerebelares no Modelo de Epilepsia …livros01.livrosgratis.com.br/cp013687.pdf · 2016-01-25 · André, Sandra Valente, Leandro e Alexandre. -Aos funcionários