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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Estudo de propriedades da Clorofila a e da Feofitina a visando a Terapia Fotodinâmica
Rafael Ribeiro da Silva Soares
Orientador: Prof. Dr. Noboru Hioka
Co-Orientadora: Profª Dra. Elza Kimura Grimshaw
Maringá, março de 2006
"A verdadeira grandeza de um homem reside na consciência de um propósito honesto na vida, alicerçado
numa estimativa justa de sua pessoa e de tudo o mais; num freqüente auto exame, numa firme obediência às regras
por ele tidas como certas, sem perturbar-se com o que os outros possam vir a pensar ou dizer, ou com fazerem elas,
ou não, aquilo que ele pensa, diz e faz."
(Marco Aurélio)
“Só a experiência própria é capaz de tornar sábio o ser humano.”
(Sigmund Freud)
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, por estar sempre presente em minha vida
À minha mãe Fátima, pelo amor e compreensão, em todos os momentos dessa
longa caminhada e por me transmitir força e exemplo de vida
Especialmente ao Prof. Dr. Noboru Hioka, pela orientação, mas principalmente
pelo respeito, ética, confiança, transmissão de sábios conhecimentos e por me
ajudar em muitos momentos, alguns deles difíceis, desde a época da graduação
À Profª Dra. Elza Kimura Grimshaw, do DFF / UEM, pela co-orientação e pela
enorme paciência em nos ensinar as técnicas do trabalho com microrganismos
Ao Prof. Dr. Vagner Roberto de Souza, pela imensa paciência, otimismo e boa
vontade, sempre com disposição a ajudar com suas valiosas dicas
Ao Prof. Dr. Hueder Paulo Moisés de Oliveira pelos conselhos e prontidão
Ao professor Adelar Bracht, do DBQ / UEM, por abrir as portas de seu
laboratório, o que possibilitou a realização de medidas de emissão de
fluorescência e RLS
A todos os colegas do grupo, que trabalharam comigo no laboratório, em
especial aos amigos André, Simone, Lilian, Eliane e Augusto
Um agradecimento todo especial ao Carlos Eduardo, Adriana e Angela, por
terem me ajudado e “me agüentado” com muita paciência, bom humor e amizade
À minha eterna amiga Ana Paula, sempre presente em todos os momentos
dessa trajetória
Aos bons amigos do bloco 31, especialmente: a Ana Cláudia e o Jaime, demais
colegas, funcionários e professores do Departamento de Química (DQI / UEM)
Ao meu grande amigo Cleverson que, mesmo tão longe, esteve sempre
próximo e presente, muitas vezes ouvindo meu dia-a-dia de laboratório
Ao Juliano A. Bonacin (IQ – USP) pela prontidão e auxílio com algumas
medidas de fluorescência
Aos professores e funcionários do DFF / UEM que trabalham no anexo P02,
pelo acolhimento e paciência, em especial a Lucivânia e o Prof. Osvaldo
Cavalcanti
Ao CNPq, pela bolsa de estudos concedida
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................i
ABSTRACT ......................................................................................................iv
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................01
1.1. Terapia Fotodinâmica ...............................................................................01
1.2. TFD: mecanismos de ação.......................................................................02
1.3. Oxigênio singlete (TFD tipo II) ..................................................................05
1.4. Reações de Foto-branqueamento ............................................................07
1.5. Características dos fármacos para TFD ...................................................08
1.6. Compostos porfirínicos e Agregação........................................................09
1.7. Clorofilas...................................................................................................11
1.7.1. Clorofila a e Feofitina a ..........................................................................12
1.8. Fontes de Luz na TFD..............................................................................14
1.9. Dificuldades da TFD .................................................................................15
1.10. Ensaios biológicos in vitro ......................................................................16
2. OBJETIVOS ................................................................................................18
3. MATERIAIS E MÉTODOS ..........................................................................19
3.1. Materiais ...................................................................................................19
3.2. Equipamentos e Métodos .........................................................................19
3.2.1. Obtenção da Clorofila a .........................................................................19
3.2.2. Preparação da Feofitina a .....................................................................20
3.2.3. Estudo da reação de desmetalação da clorofila a e o efeito
de pH do meio .......................................................................................21
3.2.4. Solução Estoque dos compostos ..........................................................22
3.2.5. Estudo dos compostos em misturas água / etanol quanto à
auto-agregação......................................................................................22
3.2.6. Estudo dos compostos em soluções aquosas de tensoativos ..............23
3.2.7. Sistema de iluminação...........................................................................23
3.2.8. Ensaio de toxicidade frente a Artemia salina.........................................24
3.2.9. Ensaio in vitro com culturas de microrganismos ...................................25
3.2.10. Reações de Foto-branqueamento .......................................................26
3.2.11. Teste do Ácido Úrico ...........................................................................27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................28
4.1. Obtenção e caracterização dos compostos..............................................28
4.2. Reação de Desmetalação da Clorofila a e estudo do pH do meio ...........32
4.3. Auto-agregação em misturas água / etanol ..............................................37
4.3.1. Efeito da composição da mistura (teor de água em relação a etanol) ..37
4.3.2. Efeito da concentração de cromóforos ..................................................47
4.3.3. Constantes de Agregação .....................................................................52
4.4. Estudos em soluções aquosas de agentes tensoativos ...........................56
4.5. Fonte de luz ..............................................................................................59
4.6. Ensaio de toxicidade frente a Artemia salina............................................61
4.7. Ação fotodinâmica in vitro sobre culturas de microrganismos..................63
4.8. Reações de Foto-branqueamento ............................................................68
4.9. Teste do Ácido Úrico ................................................................................72
5. CONCLUSÕES ...........................................................................................76
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................78
i
RESUMO
A Terapia Fotodinâmica (TFD) usa um composto fotossensitizador e
luz na geração de espécies citotóxicas (tais como o oxigênio singlete) para
o tratamento de diversas doenças, entre elas, o câncer. Atualmente, a
aplicação da TFD vem sendo investigada em infecções cutâneas,
infestações microbianas e erradicação de bactérias. Diante do elevado
custo dos medicamentos e equipamentos empregados na TFD, a busca por
compostos fotossensitizadores de baixo custo e fácil acesso, bem como
fontes de luz alternativas, tem sido aumentada.
Investigaram-se as propriedades, visando a TFD, da clorofila a e do
seu derivado feofitina a (sem o átomo de magnésio na estrutura), sobretudo
com relação ao processo de auto-agregação (em misturas água / etanol e
soluções aquosas de agentes tensoativos) e a estabilidade frente à luz. A
ação fotodinâmica dos compostos foi investigada utilizando ensaios in vitro
com microorganismos e LED como fonte luminosa.
Os estudos em soluções água / etanol, para diversas proporções de
água, mostraram que a clorofila a e a feofitina a sofrem o fenômeno de
auto-agregação em misturas contendo alto teor de água. Verificou-se tratar
de um processo complexo, muito rápido, seqüencial (etapas), e que possui
perfil diferente para cada composto, sendo este não só altamente
dependente do teor de água, mas também da concentração: em soluções
de feofitina aumentando-se o teor de água ou a concentração do substrato
verificou-se diminuição relativa do pico de monômero em 667 nm com
simultâneo surgimento de um pico adicional no espectro de absorção,
referente às espécies agregadas (região de 690 nm); no caso da clorofila,
ii
observou-se apenas a diminuição da intensidade do pico de monômeros
(665 nm) com um pequeno deslocamento da banda (670 nm).
Ensaios de fluorescência mostraram que em soluções de clorofila
com alto teor de água não se observa emissão de luz (característica
intrínseca a agregados devido ao processo de auto-supressão de energia),
ou seja, a banda a 670 nm é de agregados que absorvem em comprimento
de onda próximo ao característico dos monômeros; ao mesmo tempo, com
a feofitina foi confirmado, pelo espectro de excitação, que a banda na
região de 690 nm refere-se a agregados.
O cálculo das constantes de agregação teve êxito somente em
soluções com baixo teor de água por se tratar de um equilíbrio entre
monômeros e dímeros; os experimentos de RLS corroboram com essa
proposição. Os cálculos falham nas soluções ricas em água devido à
existência de equilíbrios múltiplos, envolvendo diversas espécies de
agregados coexistindo entre si; o espectro de RLS confirmou a presença de
grandes agregados nestes meios.
O comportamento da clorofila a e da feofitina a em soluções aquosas
de agentes tensoativos indicou que aqueles neutros e que formam micelas
volumosas como o Triton X-100 e o Tween 80 são mais indicados a manter
os compostos na forma monomérica, ao contrário dos iônicos, tais como o
SDS e CTABr.
No teste preliminar utilizando Artemia salina, foi observado efeito
fotodinâmico para os dois fotossensitizadores, usando como surfactante o
Tween 80. Já nos testes frente aos microorganismos, apenas a feofitina
apresentou ação fotodinâmica, sendo de baixa eficácia para a bactéria
Staphylococcus aureus e significativamente alta para a levedura Candida
iii
albicans, mostrando que a luz vermelha (LED) potencializou o seu efeito
microbicida. Não se observou efeito para a bactéria Escherichia coli.
Embora os dois compostos apresentassem habilidade para gerar
oxigênio singlete (dados de rendimento quântico da literatura, e
comprovada pelo teste do ácido úrico), a ausência de atividade
fotodinâmica da clorofila nos ensaios com microorganismos em parte pode
ser justificada por reações de foto-branqueamento. Enquanto a feofitina
mostrou-se estável à luz, a clorofila sofreu foto-degradação com os LED,
mesmo em soluções desaeradas, sugerindo baixa participação do oxigênio
singlete nesta reação. A determinação da atividade fotodinâmica na escala
do método do ácido úrico mostrou a maior eficácia teórica da feofitina sobre
a clorofila, resultado condizente com aqueles obtidos nos ensaios in vitro.
Assim, os estudos demonstraram que a feofitina a é um candidato
potencial a uma nova geração de fármacos, podendo vir a constituir um
princípio ativo de medicamentos para a Terapia Fotodinâmica.
iv
ABSTRACT
Photodynamic therapy (PDT) uses a photosensitizer compound and
light to generate cytotoxic species (like singlet oxygen) to treat several
diseases, such as cancer. Nowadays, PDT has started to be used in
cutaneous infections, microbial infestations and bacterial eradication.
Because of the high cost of the medicines and equipment used in PDT, the
search for low cost and easily available photosensitizers, and alternative
light sources, has increased.
The properties of chlorophyll a and pheophytin a (a derivative without
a magnesium atom in its structure), were investigated for use in PDT, mainly
relating to the self-aggregation process (in water / ethanol mixtures and in
surfactant aqueous solutions) and the stability in the presence of light. The
photodynamic action of the compounds in in vitro assays with
microorganisms and a red LED system as light source were investigated.
Studies using water / ethanol solutions, in different water proportions
showed that chlorophyll a and pheophytin a undergo a self-aggregation
phenomenon in mixtures with high water content. A complex, very fast and
sequential process (steps), which enables a different profile for each
compound was observed. They were highly dependent no only on the water
percentage, but on the concentration as well. In pheophytin solutions, as the
water percentage or pheophytin concentration increased, a decrease in the
monomer peak (667 nm) and the simultaneous appearance of an additional
band in UV-Vis absorption spectra corresponding to aggregate species (690
nm) was observed. For chlorophyll, only a decrease in the monomer peak
intensity (665 nm) was observed, with a small wavelength shift (to 670 nm).
v
Fluorescence assays showed that chlorophyll solution with high water
content showed no light emission (an intrinsic characteristic of aggregates
caused by the self-quenching of energy), which means that the band at 670
nm was caused by aggregates that absorb close to the region of the
monomers. In the same way, in pheophytin solutions it was confirmed that
the band in the region of 690 nm was caused by aggregate.
The aggregation constant calculation succeeded only in low water
content solutions because it refers to a simple equilibrium between
monomers and dimers; the RLS experiments confirmed that the aggregates
are dimers. The calculation failed for solutions with high water percentage
due to multiple equilibrium, which involved several coexisting aggregates;
the RLS spectrum confirms the presence of large aggregates in these
media.
The behavior of chlorophyll a and pheophytin a in surfactant aqueous
solutions showed that the neutral amphiphiles, like the ones which form
large micelles such as Triton X-100 and Tween 80, are more suitable for
keeping these compounds in monomer form than ionic surfactants like SDS
and CTABr.
In the preliminary bioassay tests, using the surfactant Tween 80,
against Artemia salina, both photosensitizers showed photodynamic effect.
However against the microorganisms, only pheophytin presented a PDT
action, where a high growth inhibition of Candida albicans, a mild effect
against Staphylococcus aureus, and no effect against Escherichia coli was
observed. Even with these different effects, the red light (LED) was effective
for microbial growth inhibition.
Although both compounds present the ability to generate singlet
oxygen (quantum yield data from previous literature, and checked by the
vi
uric acid test), the lack of a photodynamic effect by chlorophyll against the
microorganisms may be explained partially by photobleaching side
reactions. While pheophytin is stable when it is exposed to LED red light,
chlorophyll undergoes photo-degradation, even in de-aerated solutions,
suggesting that the singlet oxygen is not involved in this reaction. The
photodynamic activity measured by the uric acid scale indicated that
pheophytin exhibits higher efficiency than chlorophyll in theory, which was
confirmed by the in vitro assays.
From these results, pheophytin a is a potencial candidate for a new
generation of medicines, and may become an important active
photosensitizer compound for Photodynamic Therapy.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Terapia Fotodinâmica
A terapia fotodinâmica (TFD), uma não tão recente modalidade
terapêutica, envolve o uso de reações fotoquímicas mediante a combinação
de agentes fotossensitizadores e luz para o tratamento de diferentes tipos de
afecções que apresentam como característica comum um crescimento celular
anormal. Entre elas, destaca-se o câncer que é uma das doenças mais
temidas entre tantas que assolam a humanidade.
A medicina vem utilizando, já há algum tempo, diversas tecnologias no
tratamento do câncer que, combinadas, podem oferecer melhor qualidade de
vida para o paciente ou, em muitos casos, a cura total. Dentre as técnicas
mais utilizadas podem-se citar a quimioterapia, a radioterapia e a cirurgia
(Simplicio et al, 2002).
Comparando-se a TFD aos tratamentos convencionais, esta oferece a
vantagem de ser um método eficiente, não-invasivo, com mínimo efeito
colateral e seletivo na destruição do tecido doente, sem danificar os tecidos
saudáveis ao redor da massa tumoral (Ishii et al, 2005). Na TFD, a interação
da luz com cromóforos específicos adsorvidos em tecidos não sadios
desencadeia uma série de processos fotofísicos e fotoquímicos, gerando
espécies reativas, que destroem as células / tecidos in situ (Sternberg e
Dolphin, 1998).
A Terapia Fotodinâmica tem sido consignada como uma nova
modalidade promissora no tratamento de câncer desde o começo de 1980
(Schuitmaker et al, 1996) e atualmente, o interesse pelo uso da TFD tem
aumentado como resultado do seu reconhecimento por parte do FDA (Food
2
and Drug Administration — Estados Unidos), como um tratamento eficaz para
diversas doenças, incluindo o câncer (Oleinick e Evans, 1998).
Entre as moléstias para as quais a TFD tem sido investigada e aplicada
cita-se: degeneração macular da retina, miopia patológica, psoríase, artrite
reumatóide sistêmica, arteriosclerose, infestações microbianas, entre outras
(Sternberg et al, 1996; Sternberg e Dolphin, 1998; Machado, 2000 e Levy,
1995).
Durante as últimas décadas, a TFD tem-se mostrado eficaz como
técnica tanto à cura clínica, como ao diagnóstico de certas enfermidades por
fluorescência (Itri, 2002). Para ser implantada, a TFD exige uma grande
diversidade de conhecimentos, incluindo fatores químicos, físicos, médicos e
biológicos (Itri, 2002).
1.2. TFD: mecanismos de ação
Na TFD o fármaco (composto fotossensitizador) é administrado ao
paciente por uma rota específica (tópica, oral ou intravenosa), sendo
aguardado o tempo para atingir seletivamente o tecido alvo com máximo
acúmulo. Esta seletividade é obtida, pois, em geral, estes compostos têm
maior afinidade por tecidos neoplásicos, levando a um maior acúmulo nestes,
além do que, o tempo de eliminação do fármaco nestas células é longo
quando comparado com o de células sadias (Gomes, 2004).
Posteriormente, o tecido é irradiado por luz visível (Sternberg e Dolphin,
1998). A maior penetração de luz implica em maior eficiência no combate ao
tecido doente, por atingir regiões mais internas deste; portanto, os fármacos
desenvolvidos para uso em TFD devem ser cromóforos (corantes) que
absorvam na região visível próxima ao infravermelho (Bonnet e Martinez,
3
2001), uma vez que a radiação eletromagnética nesta região de freqüência
apresenta maior penetrabilidade em tecidos humanos (Jori, 1996; Sternberg e
Dolphin, 1998) (Figura 1).
Figura 1: Dependência do grau de penetração de luz em um tecido em função do
comprimento de onda (Sternberg e Dolphin, 1998).
É importante ressaltar que, ao receber luz de comprimento de onda
superior a 800 nm, ocorre absorção da energia pelas moléculas de água, sem
excitação eletrônica, ocasionando apenas aquecimento do tecido. Por outro
lado, a baixa penetrabilidade de radiações de freqüências maiores (região
ultravioleta) é decorrente da forte absorção desta por componentes do extrato
biológico e ao acentuado espalhamento de luz. Assim sendo, a denominada
“janela terapêutica” da TFD compreende classicamente a região de
comprimento de onda entre 600 e 800 nm (Simplicio et al, 2002).
Durante a iluminação, o fármaco já acumulado no tecido doente é
excitado, acarretando na formação de espécies reativas que participarão da
etapa que leva o tecido doente à necrose e/ou apoptose (Hebderson e
Dougherty, 1992). Ao ser irradiado por radiação de comprimento de onda
4
adequado, o fármaco passa do estado singlete fundamental para o estado
singlete excitado. Neste estado, a molécula pode perder a energia por
processos não-radiativos ou emitir luz por fluorescência. Dentre os processos
não-radiativos, a mudança de spin, mecanismo denominado de cruzamento
entre sistemas, implica na transformação do fármaco a seu estado triplete,
ponto de partida para as reações fotodinâmicas.
Dois tipos de mecanismo de dano foto-induzido em tecidos neoplásicos
são propostos na TFD: tipo I, no qual o fotossensitizador excitado (triplete)
induz dano diretamente a alvos biológicos a partir de processos de
transferência de elétrons, gerando espécies instáveis que reagem com o meio
produzindo, entre outros, oxi-radicais, como o ânion-radical superóxido e
peróxidos (Machado, 2000); e tipo II, no qual a foto-oxidação é mediada pelo
oxigênio singlete (1O2), espécie altamente reativa gerada através da reação do
fármaco excitado com o oxigênio molecular (3O2), espécie naturalmente
encontrada no estado triplete (Jori e Fabris, 2000; Foote, 1991). O Esquema 1,
a seguir, apresenta as possíveis reações para cada mecanismo mencionado.
Existem várias evidências que sugerem que o mecanismo tipo II ocorre
com maior freqüência; logo, o 1O2 é a principal espécie citotóxica ativa na TFD
(Aveline et al, 1995), reagindo principalmente com espécies celulares ricas em
elétrons, como a guanina, lipídeos insaturados, ácidos nucléicos, entre outros.
Este fato resulta em danos à parede celular, mitocôndrias e lisossomos,
comprometendo a integridade celular (Machado, 2000).
5
Esquema 1: Mecanismos tipo I e tipo II na TFD (Machado, 2000). S representa o
fotossensitizador e A, uma molécula que será oxidada.
1.3. Oxigênio singlete (TFD tipo II)
O oxigênio molecular (3O2) tem estado fundamental triplete (3Σg-), ou
seja, seu nível eletrônico ocupado de mais alta energia é constituído por dois
orbitais degenerados π* (orbitais diferentes com a mesma energia) ocupados
por dois elétrons, sendo que cada elétron ocupa um orbital π* numa
configuração com os spin paralelos (Halliwell e Gutteridge, 1982). Esta
característica conferiria ao oxigênio uma alta reatividade. Entretanto, sua
redução direta por reativos com dois elétrons com spins antiparalelos é
proibida pela regra de conservação de spin, tornando-o “relativamente inerte”
(Schneider et al, 2000).
Absorção de energia (luz) pelo fármaco (fotossensitizador)
1S0 + hν → 1S1*
Cruzamento entre sistemas: mudança de spin
1S1* → 3S1
*
Mecanismo tipo I
3S1* + 1A0 → 3[S---A]* → 3[.-S---A+.]
3[.-S---A+.] + 3O2 → 1S0 + .A+ + .O2-
Mecanismo tipo II
3S1* + 3O2 → 1S0 + 1O2
6
O oxigênio molecular, ao receber energia, devido à reação com um dado
substrato no estado excitado triplete, passa de seu estado fundamental
(triplete) para um estado excitado com inversão de um dos seus spins,
configuração singlete, com duas possíveis configurações conforme mostrada
na Tabela 1.
Tabela 1: Distribuição eletrônica nos orbitais moleculares (π*) do oxigênio no estado
excitado singlete (1Σg+, 1∆g) e no estado fundamental triplete (3Σg
-), (Gomes, 2004).
Estado Orbitais π* Energia (kcal/mol)
1Σg+
↑ ↓ 37,5
1∆g ↑↓ g
22,5
3Σg-
↑ ↑
De acordo com a Tabela 1, uma vez que o estado 1Σg+ possui mesma
simetria que o estado fundamental, o tempo de vida da espécie nesta
configuração é muito curto, da ordem de picossegundos. O oxigênio no estado
excitado que se apresenta com a configuração denominada 1∆g é que é a
espécie realmente ativa, sendo esta responsável pelo efeito foto-terapêutico.
O oxigênio singlete possui um tempo de vida relativamente longo (2 a 4
µs em H2O) e por isto é um importante agente oxidante. Em sistemas
biológicos, o tempo de vida do 1O2 é muito menor, inferior a 0,04 µs, devido à
presença de inúmeras biomoléculas, com as quais o oxigênio singlete reage
rapidamente. Dessas reações competitivas pode-se ter o comprometimento de
mecanismos vitais à sobrevivência celular.
7
1.4. Reações de Foto-branqueamento
O processo denominado foto-branqueamento em substâncias
cromóforas corresponde a reações químicas induzidas pela luz, onde as
moléculas são transformadas em outros compostos. O decréscimo da
concentração do fotossensitizador original no sítio de ação da TFD e mesmo o
menor poder de absorção de luz do cromóforo modificado, no comprimento de
onda da fonte utilizada, acarreta em menor quantidade de princípios ativos
excitados, situação que diminui a ação fotodinâmica. Em conseqüência tem-se
menor formação de espécies citotóxicas, ou seja, é um aspecto negativo na
eficácia do tratamento (Sternberg e Dolphin, 1998, Simplicio et al, 2002).
O oxigênio singlete, por ser uma espécie extremamente reativa, pode
por si levar a degradação dos compostos fotossensitizadores (os seus próprios
precursores iniciais), caracterizando um tipo especial de foto-branqueamento.
Em resumo, ao receber luz, o fármaco gera 1O2, que por sua vez pode reagir
com as próprias moléculas do substrato que o produziu, ocasionando nestas
modificações químicas (Esquema 2).
Esquema 2: Reações do oxigênio singlete no meio biológico. Reações com
moléculas do próprio fotossensitizador caracterizam uma via de reação de foto-
branqueamento.
Formação de 1O2 pelo fotossensitizador
3S1* + 3O2 → 1S0 + 1O2
Reação do 1O2 com espécies do meio biológico
1O2 + 1A0 → produtos (reações posteriores)
ou 1O2 + 1S0 → reação de foto-branqueamento
8
1.5. Características dos fármacos para TFD
Considerando que o principal agente ativador no processo fotodinâmico
é o corante fotossensível, este deve possuir várias propriedades físico-
químicas, farmacológicas e fotobiológicas que o qualifiquem como bom agente
para a terapia, isto é, ter alta eficiência e ao mesmo tempo apresentar
mínimos efeitos colaterais.
Neste sentido, as principais características necessárias a um fármaco (e
seus formulados) com potencialidade em TFD são:
• alta seletividade (afinidade e penetração no tecido doente);
• baixa toxicidade no escuro;
• facilidade de obtenção e simplicidade na formulação;
• alta estabilidade;
• favorável farmacocinética de eliminação.
Com relação às principais propriedades fotofísicas que o composto deve
apresentar, destacam-se:
• alta absorção de luz na região de 600 a 800 nm;
• não sofrerem reações de foto-branqueamento;
• alto rendimento quântico de formação de 1O2 (TFD tipo II).
As porfirinas e seus derivados (purpurinas, clorinas, bacterioclorinas e
ftalocianinas) são os principais compostos de interesse para aplicação em
TFD, por apresentarem a grande maioria das características favoráveis à
técnica. Estes compostos, como agentes fotossensitizadores aplicados a TFD,
têm sido extensivamente estudados na destruição de bactérias e inativação de
vírus (MacDonald e Dougherty, 2001).
9
NH N
N HN
NH N
N HN
NH N
N HN
1.6. Compostos porfirínicos e Agregação
As porfirinas constituem uma classe muito importante de moléculas que
estão presentes em muitos sistemas biológicos, como por exemplo, nos
citocromos e hemoglobinas, os quais são responsáveis pela transferência de
elétrons na cadeia respiratória e pelo transporte de oxigênio na corrente
sanguínea, respectivamente (White et al, 1968).
As porfirinas (Esquema 3) e seus derivados compreendem um grande
grupo de diversas entidades químicas que são constituídas essencialmente de
quatro anéis pirrólicos ligados entre si por uma ponte metínica, formando um
grande macrociclo. As diferenças estruturais na série de porfirinas decorrem
do grau de insaturação dos anéis, na composição das cadeias laterais
anexadas aos anéis pirrólicos e nas posições axiais do macrociclo (Sternberg
e Dolphin, 1998).
Esquema 3: Estruturas da porfirina, clorina e bacterioclorina, respectivamente.
Duas importantes classes de derivados das porfirinas compreendem as
clorinas e as bacterioclorinas (Esquema 3). No primeiro caso, um dos anéis
pirrólicos é reduzido, enquanto que no segundo, são dois anéis reduzidos. A
quebra da simetria do anel porfirínico, casos da clorina e da bacterioclorina,
faz com que estes derivados possuam alta absorção de luz na banda Q
10
(proibida por simetria na porfirina), região de 600 nm, portanto compostos
altamente promissores para aplicação em TFD.
Moléculas de porfirinas podem formar complexos com íons metálicos
por coordenação através dos quatro átomos de nitrogênio pirrólicos, no
entanto, muitas existem naturalmente sob a forma desmetalada. Estes
compostos possuem uma alta hidrofobicidade, sobretudo na forma
desmetalada, aspecto interessante a TFD, pois a menor compatibilidade com
a água implica, em geral, em maior afinidade por tecidos celulares. Por outro
lado, essa propriedade faz com que haja grande tendência a esses compostos
se auto-agregarem em solução aquosa (Sternberg et al, 1996).
O efeito da agregação sobre as propriedades fotofísicas de um fármaco,
particularmente a fluorescência, a energia dos estados excitados gerados, a
capacidade de transferência de energia e elétrons, é de fundamental
importância na avaliação do potencial fotodinâmico destes compostos nas
reações foto-oxidativas (Gomes, 2004). Os mecanismos que regem o
fenômeno de auto-agregação ainda não estão estabelecidos. Entretanto, é
conhecido que forças de natureza eletrostática, forças de van der Waals, o
efeito hidrofóbico, etc. contribuem para a formação destes agregados (Hunter
e Sanders, 1990).
A auto-agregação de porfirinas gera espécies pequenas (dímeros e
trímeros) a agregados grandes (poliméricos). Este estado afeta fortemente
suas propriedades espectrais e energéticas, reduzindo o tempo de vida dos
estados excitados, conseqüentemente o rendimento quântico de formação de
oxigênio singlete e, portanto, comprometendo a eficácia em TFD (Borissevitch
e Gandini, 1998). Ao mesmo tempo, a agregação pode levar a precipitação do
fármaco com perdas de materiais, ou mesmo obstrução de artérias no corpo
humano (Aveline et al, 1995).
11
Desta forma, a auto-agregação de fármacos deve ser evitada para
aplicação em TFD, ou seja, desde as etapas de processamento industrial,
aplicação clínica, circulação corpórea, até o momento da iluminação, o
fármaco deve ser mantido no estado monomérico.
Apesar do problema da auto-agregação de derivados porfirínicos em
água, estes são os princípios ativos dos mais usados medicamentos em TFD.
A incessante busca de novos e mais eficientes fotossensitizadores centrados
em porfirinas advém, em parte, da facilidade sintética destes obtendo produtos
com diferentes cadeias laterais ao macrociclo tetrapirrólico, proporcionando
assim uma enorme variedade de modificações.
1.7. Clorofilas
Clorofilas são pigmentos verdes encontrados em plantas. De um modo
geral, são encontradas em todos os organismos capazes de realizar
fotossíntese. Tanto as clorofilas, quanto o processo de fotossíntese, são
restritos ao reino vegetal (Dolphin, 1978).
As clorofilas absorvem luz visível, que é então convertida em energia
química potencialmente usada no processo de fotossíntese. Assim sendo, as
clorofilas atuam como foto-receptores no ato primário de conversão de luz em
energia química. O processo de fotossíntese serve para a produção
fotoquímica de matéria orgânica e para a liberação de oxigênio em todas as
plantas autotróficas, isto é, aquelas capazes de sintetizar o próprio alimento.
Em plantas maiores ou superiores e muitas algas, as clorofilas ocorrem
em organelas subcelulares, denominadas cloroplastos. Em bactérias
fotossintéticas as clorofilas são localizadas em unidades macromoleculares, os
cromatóforos (Dolphin, 1978). Geralmente, estão associadas a pigmentos
12
carotenóides amarelos e às vezes componentes vermelhos ou azuis,
protéicos, como em certas espécies de algas (Tregub et al, 1996). O estudo da
química e de outras propriedades destes pigmentos tem prosperado desde o
final do século XIX.
Na natureza, o número de clorofilas diferentes não é muito grande.
Aproximadamente cerca de 10 tipos de clorofilas têm sido isoladas de partes
verdes de plantas. Em alguns organismos, apenas uma clorofila é detectada,
enquanto em outros, a clorofila majoritária é acompanhada por outros
pigmentos verdes auxiliares. O componente verde mais abundante é a clorofila
a, seguido pela clorofila b, as clorofilas c (c1 e c2), clorofila d e protoclorofila.
Em bactérias fotossintéticas têm-se as bacterioclorofilas (Dolphin, 1978).
Do ponto de vista estrutural, há uma íntima relação entre as clorofilas e
as porfirinas: são ciclos tetrapirrólicos complexados com o íon magnésio
(Mg2+). Dentro da classificação dos derivados porfirínicos, a clorofila pertence
à classe das clorinas (Esquema 3). Uma outra característica estrutural das
clorofilas é a presença de um quinto anel, anexo ao macrociclo porfirínico.
Este anel de cinco membros contém um grupo carbonílico de cetona, e a
presença deste grupo é suficiente para caracterizar o composto como sendo
uma clorofila, independente de suas cadeias laterais ou estados de oxidação.
1.7.1. Clorofila a e Feofitina a
A estrutura da clorofila a foi confirmada por síntese total e a sua
configuração absoluta foi da mesma forma estabelecida. A clorofila a é
encontrada em todas as plantas que tem a participação do oxigênio durante o
processo de fotossíntese e é a principal clorofila encontrada nas algas e em
plantas que produzem sementes, podendo ser facilmente extraída destes
13
CH3CH3
CH3
H3C
CH3O
OCH2
C
H
MgN N
N N
CH
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
CH2
C
OCH3
H3C
CH2 HO
O
vegetais (Smith et al, 1985). Trata-se do único pigmento verde encontrado em
algas amarelo-verdes, azul-verdes e algumas algas vermelhas. Em plantas
superiores é encontrada acompanhada por menores quantidades de outras
clorofilas.
A clorofila a (Esquema 4, a seguir) é uma clorina metalada com um íon
Mg2+ e que contém uma cadeia fitílica (por alusão ao álcool fitol) anexa ao anel
porfirínico. A presença desta cadeia longa e apolar confere uma alta
hidrofobicidade à molécula. A clorofila a, bem como os seus derivados que
contêm a cadeia fitílica são insolúveis em meio aquoso.
Esquema 4: Estrutura molecular da clorofila a.
A clorofila a pode ser modificada para a sua versão desmetalada — a
qual é chamada feofitina a — onde o íon metálico Mg2+ é substituído por dois
átomos de hidrogênio (Esquema 5). A obtenção deste derivado se dá através
da reação de hidrólise ácida (Dujardin et al, 1975).
14
H
HN N
N N
CH
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
O
CH2
C
OCH3
H3C
CH2 HOCH2
COO C20H39
H
N N
N N
CH
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
O
CH2
C
OCH3
H3C
CH2 H
Mg
H
C20H39COO
CH2O
2 H
Esquema 5: Estrutura e obtenção da feofitina a, a partir da clorofila a.
O espectro de absorção da clorofila a e da feofitina a mostra alta
absorção na região de 660 a 670 nm, um fato extremamente favorável para a
aplicação em TFD. Os dois compostos conhecidamente geram oxigênio
singlete, cujos rendimentos quânticos de formação (Φ∆) variam de 0,60 até
0,85 quando estão em solvente orgânico puro (Nyman e Hynninen, 2004), ou
seja, quando estão na forma de monômeros.
1.8. Fontes de Luz na TFD
Desde o surgimento dos primeiros equipamentos lasers, esta fonte de
luz tem sido atraente para a TFD devido a sua facilidade de uso, potência,
emissão de um único comprimento de onda e possibilidade de acoplamento a
fibras ópticas (essenciais para tratamento de enfermidades em órgãos
internos), propriedades que fazem com que os lasers se mostrem mais
efetivos que as lâmpadas convencionais. Um grande impulso na utilização de
15
fontes de luz lasers em TFD foi o desenvolvimento dos aparatos baseados em
diodos, que aliam alta potência (particularmente na região do vermelho) com
custos menores que os sistemas lasers convencionais.
Uma alternativa adicional razoável é a utilização de LED’s (diodo
emissor de luz), disponíveis no mercado em todas as regiões espectrais,
incluindo-se a do vermelho (Mang, 2004). As fontes à base de LED, apesar de
apresentarem potência muito inferior aos lasers, são muito mais baratas.
1.9. Dificuldades da TFD
Apesar da larga aplicabilidade da TFD e do seu grande apelo clínico e
comercial, dois fatores dificultam a disseminação do tratamento: o custo dos
medicamentos e dos equipamentos. Com relação aos fármacos, cujos
princípios ativos são sintéticos, apresentam sérias restrições econômicas
decorrentes das dificuldades de produção e dos custos do desenvolvimento
tecnológico. No caso de equipamentos, o alto custo dos lasers onera a técnica
(Ackroyd et al, 2001); até mesmo os lasers de diodo para a região do
vermelho, de custo inferior aos lasers convencionais, ainda são caros.
É interessante notar que para minimização de custos, produtos de
fontes naturais e/ou de facilidade sintética, como a clorofila a, podem
eventualmente ser utilizados como fármacos em TFD. Adicionalmente, fontes
de luz não-convencionais, como os LED’s, podem ser utilizadas como
equipamentos. Neste caso o sistema à base de LED pode ser promissor para
tratamento de doenças na superfície ou mesmo em situações experimentais
investigativas de novos fotossensitizadores / formulações.
Salienta-se que muitos estudos in vivo e in vitro não são
correlacionados; assim necessita-se de testes clínicos a fim de verificar o real
16
potencial aplicativo do fármaco na técnica. Dessa forma, enquanto um dado
fármaco não for testado em cobaias para uma rigorosa avaliação clínica este
não pode ser descartado (Aveline et al, 1995).
1.10. Ensaios biológicos in vitro
Os maiores avanços da terapia fotodinâmica atualmente são no
combate ao câncer. Porém, a TFD já se mostrou uma efetiva alternativa no
tratamento de infecções principalmente quando estas se mostram localizadas,
relativamente superficiais ou de acesso facilitado. (Ackroyd et al, 2001).
Um dos grandes inconvenientes em se utilizar antibióticos ou
substâncias antimicrobianas para o controle de infecções é que seu uso pode
levar à seleção de microrganismos resistentes aos medicamentos, tornando
cada vez mais difícil o tratamento de novas infestações (Itri, 2002; Ackroyd et
al, 2001).
Adicionalmente, testes in vitro com culturas de microrganismos, tais
como bactérias e leveduras, podem ser um excelente modelo para mimetizar
células tumorais. Bactérias são microrganismos resistentes que possuem alta
velocidade de reprodução, identificando-se e relacionando-se com células
doentes (ex. tecidos em metástase) que se reproduzem mais rapidamente do
que células normais. Quando determinadas substâncias apresentam atividade
frente a estes microrganismos, acredita-se que as mesmas interferem na
síntese protéica (principalmente DNA e RNA), inviabilizando a reprodução
celular, fato que poderia ser repetido com células tumorais.
Acrescenta-se intuitivamente que, por exemplo, Escherichia coli,
bactéria que se desenvolve em ambientes internos ao corpo humano, é um
bom modelo para enfermidades acometidas em órgãos internos, enquanto que
17
Staphylococcus aureus, que se desenvolve bem em superfícies corpóreas,
acaba sendo um bom modelo para doenças na pele.
Além de ensaios com microrganismos, um teste interessante para a TFD
é o bioensaio com o microcrustáceo Artemia salina, de maneira similar aos
empregados em ensaios sobre poluição de águas no meio ambiente e de
avaliação terapêutica de produtos naturais. Diversos trabalhos tentam
correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com atividades biológicas tais
como antifúngica, antiviral, antimicrobiana, parasiticida, antitumoral e
tripanossomicida (MacRae e Hudson, 1988; Sahpaz et al, 1994).
18
2. OBJETIVOS
Investigar a possibilidade de desenvolvimento de novos sistemas de
aplicação à TFD, visando novos fármacos e sistemas de iluminação
alternativos, combinando alta eficiência e custo reduzido.
• Objetivos específicos:
Investigar algumas propriedades físico-químicas da clorofila a e da
feofitina a importantes para utilização em TFD, particularmente avaliar o
processo de auto-agregação destes fotossensitizadores em soluções aquosas.
Mensurar propriedades fotofísicas e fotoquímicas destes cromóforos,
incluindo reações de foto-branqueamento e habilidade destes na geração de
oxigênio singlete. Particularmente, os sistemas de formulação a serem
avaliados são:
i) sistemas água / etanol, possível formulação para aplicação tópica;
ii) soluções aquosas de agentes tensoativos, possível formulação
tópica e intravenosa.
Testar a atividade fotodinâmica in vitro dos compostos estudados frente
ao microcrustáceo Artemia salina (ensaio preliminar) e a culturas das bactérias
Staphylococcus aureus e Escherichia coli e da levedura Candida albicans.
Desenvolver um sistema de iluminação (fonte de luz) alternativo que
seja útil nos estudos in vitro da ação fotodinâmica dos fármacos testados.
19
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais
A clorofila a foi obtida por extração a partir de folhas de espinafre
(Dolphin, 1978), enquanto que a feofitina a foi sintetizada da clorofila a, por
reação de hidrólise ácida (Dujardin, et al, 1975).
Os solventes utilizados para a preparação de soluções e purificação dos
compostos foram de alto grau de pureza. Os demais reagentes utilizados no
trabalho (solventes, sais, tensoativos, etc) foram de qualidade P.A. A água
utilizada foi bidestilada.
Para os ensaios biológicos, trabalhou-se com cepas das bactérias
Staphylococcus aureus (ATCC 26923) e Escherichia coli (ATCC 26922) e da
levedura Candida albicans (ATCC 90028). Agar nutriente, caldo nutriente
Difco, caldo Muller Hinton (CMH) e solução fisiológica peptonada (0,1%) foram
os materiais utilizados para a preparação e padronização das amostras
biológicas. Os ovos de Artemia salina foram adquiridos em loja locais de
animais de estimação.
3.2. Equipamentos e métodos
3.2.1. Obtenção da Clorofila a
Aproximadamente 1 kg de folhas de espinafre foi mergulhado em água
fervente por 1 a 2 minutos. Posteriormente, as folhas foram lavadas com água
fria e secas entre tolhas de papel para retirar o excesso de água. Em um
frasco erlenmeyer, adicionou-se às folhas uma mistura de 1 L de metanol e
20
500 mL de éter de petróleo. A extração ocorreu em banho de gelo e com
agitação ocasional por 30 minutos. A solução dos pigmentos foi armazenada
em um frasco e repetiu-se o procedimento de extração com as folhas por mais
duas vezes. Por fim, lavaram-se as folhas com uma mistura de 300 mL de éter
de petróleo e 300 mL de éter dietílico.
Cada fração recolhida (contendo os pigmentos extraídos) foi transferida
para um funil de separação, estas foram lavadas com solução aquosa
saturada de NaCl. A fase orgânica de cada fração foi separada e depois
lavada diversas vezes com água destilada. As frações orgânicas foram
recolhidas num balão de fundo redondo e rotaevaporadas a 40 ºC com baixa
pressão.
Os pigmentos foram re-dissolvidos em um pequeno volume de éter de
petróleo para efetuar-se a separação. A técnica usada para esta separação foi
a cromatografia de camada delgada circular (CCDC), em um Chromatotron
(Harrison Research, modelo 8924), usando-se como eluente uma solução de
éter de petróleo / etanol (95:5, v/v). As frações recolhidas correspondentes à
clorofila a foram novamente lavadas, em funil de separação, com
aproximadamente 500 mL de água destilada e posteriormente rotaevaporadas
(40 ºC e baixa pressão). A clorofila a foi caracterizada pelos espectros de
absorção na região do visível e por espectroscopia de RMN de 1H
(espectrômetro de RMN Varian – Gemini, 300 MHz).
3.2.2. Preparação da Feofitina a
A síntese da espécie feofitina a foi realizada adicionando-se gotas de
ácido clorídrico 2 mol L-1 sobre uma solução de clorofila a em etanol. Após a
mudança de coloração da solução, extraiu-se o composto com éter etílico. A
21
mistura orgânica foi lavada diversas vezes com água e purificada através de
CCDC, utilizando como eluente uma solução de éter de petróleo / etanol (95:5,
v/v). O derivado foi caracterizado através do espectro de absorção na região
do visível e de RMN de 1H.
3.2.3. Estudo da reação de desmetalação da clorofila a e o efeito de pH
do meio
Além de obter-se a feofitina a em condições preparativas, a reação de
desmetalação (transformação da clorofila a em feofitina a) foi monitorada
cineticamente, em etanol, utilizando a técnica de stopped-flow (utilizada para
reações rápidas). O aparato de stopped-flow, confeccionado por nosso grupo
de pesquisas (Batistela et al, 2005), foi construído com materiais de baixo
custo. Trabalhou-se com solução etanólica de clorofila a (1,28 x 10-5 mol L-1) e
ácido clorídrico (1,28 x 10-2 mol L-1) nas seringas de reagentes do aparato
(ambas 5,0 mL). A cinética foi monitorada junto a 665 nm com intervalo de
leitura de 2,4 s.
Adicionalmente, foi estudada a protonação dos átomos de nitrogênio
livres da feofitina a, pelo método espectrofotométrico. Prepararam-se diversas
soluções 10% água / etanol, variando-se o pH das mesmas através da
variação da concentração de HCl. As medidas de pH foram realizadas em um
pHmetro Meterlab pHM 240 com eletrodo de vidro acoplado a um eletrodo de
referência de calomelano, sistema específico para medidas de pH em
solventes aquosos com álcool etílico (Nicholson et al, 1997). Acrescentou-se
pequeno volume da solução estoque de feofitina a, igualmente em todas as
soluções preparadas, e registraram-se os espectros de absorção.
22
3.2.4. Solução Estoque dos compostos
As soluções estoque foram preparadas em DMSO, dissolvendo-se
pequena quantidade do composto puro, sendo posteriormente armazenadas
no escuro e congeladas. Para uso, agitou-se a solução em vórtex para garantir
que não houvessem precipitados. As soluções foram padronizadas via
espectrofotometria de absorção, utilizando um espectrofotômetro UV-Vis
Varian, modelo Cary-50, acoplado a um microcomputador e um banho
termostatizador. Como solvente para a padronização, usou-se acetona (ε =
92600 L mol-1 cm-1 em 663 nm para a clorofila a e ε = 68000 L mol-1 cm-1 em
667 nm para a feofitina a) (Dolphin, 1978).
3.2.5. Estudo dos compostos em misturas água / etanol quanto à auto-
agregação
As misturas água/etanol foram preparadas através da adição de
volumes pré-determinados dos dois solventes, nas quais a composição é
sempre expressa na forma de porcentagem em volume de água. A
termostatização da mistura a 30,0 ºC foi realizada em cubeta de quartzo ou
poliestireno, com 1,00 cm de caminho ótico. Para as soluções mais diluídas,
utilizou-se uma cubeta especial de vidro de 10,0 cm de caminho ótico. A
seguir, introduzia-se um pequeno volume da solução estoque dos compostos
estudados através de uma microseringa, seguido por vigorosa agitação.
Igualmente, registraram-se espectros de emissão de luz com o
espectrofluorômetro Perkin Elmer, modelo LS-5 no intervalo de 460 – 800 nm
(λmáx de emissão centrado a 680 nm; e excitação a 430 nm – clorofila a, e a
410 nm – feofitina a, fendas 2,5 / 2,5 nm). Investigou-se soluções dos
23
compostos nas diversas misturas água/etanol, a 30,0 ºC, avaliando-se o efeito
do aumento do teor de água.
Os estudos de RLS (ressonance light scattering — espalhamento de luz
ressonante) foram realizados em um espectrofluorômetro Shimadzu, modelo
RF-5301PC, através da varredura simultânea dos monocromadores de
excitação e emissão (sincronismo), com fendas de 3 nm, no intervalo de 300 a
800 nm, para soluções de clorofila a e feofitina a em água/etanol, a 30,0 ºC.
Para o cálculo das constantes de equilíbrio de auto-agregação, estudou-
se o efeito da concentração de cromóforo em todas as soluções trabalhadas.
De posse de equações baseadas no balanço de massas e do programa de
ajuste de curvas KaleidaGraph, avaliou-se a qualidade do ajuste dos dados
aos tratamentos matemáticos / modelos propostos.
3.2.6. Estudo dos compostos em soluções aquosas de tensoativos
Foram preparadas soluções aquosas de alguns tensoativos (em m/v):
SDS 5,0%, CTABr 1,0%, Pluronic F-127 2,0%, Triton X-100 1,0% e Tween 80
1,0%. As soluções foram autoclavadas após o preparo para evitar
contaminações biológicas indesejáveis. Realizou-se o estudo da variação da
concentração dos compostos ativos estudados, a fim de avaliar a manutenção
das moléculas em sua forma monomérica.
3.2.7. Sistema de iluminação
Um sistema de fonte de luz foi construído para os ensaios fotoquímicos,
tais como a verificação de reações de foto-branqueamento e para os ensaios
in vitro com organismos. Foi feito com LED vermelho, empregando-se 6
24
unidades individuais, em paralelo, constituindo assim um conjunto fonte. O
espectro de emissão dos LED’s foi obtido em um espectrofluorômetro SPEX
Fluorolog2 modelo 1680 e a potência individual de cada LED foi medida
através de um Handheld Laser Power Meter (Edmund Optics Inc.), no
comprimento de onda de 663 nm.
3.2.8. Ensaio de toxicidade frente a Artemia salina
Adotou-se metodologia adaptada da proposta por Meyer (Meyer et al,
1982). Os ovos de Artemia salina foram eclodidos em água salina (NaCl 3,8 g
L-1), no interior de um recipiente retangular, construído com uma divisão
interna (com orifícios) constituindo dois compartimentos. Os ovos foram
adicionados no compartimento menor, protegido da luz. O compartimento
maior foi externamente iluminado com lâmpada de 60 W apenas para atrair as
cobaias eclodidas (camarões). Após 48 horas, em temperatura ambiente,
foram transferidos cerca de 20 camarões para cada tubo de ensaio, utilizando
uma pipeta do tipo Pasteur. Adicionou-se 1,5 mL de solução aquosa de Tween
80, 2% (m/v), com clorofila (ou feofitina) no tubo e o volume foi completado até
3 mL com água salina. Na seqüência constituíram-se dois grupos de amostras:
as submetidas à iluminação com luz vermelha (1 hora, LED) e as sem
iluminação, incluindo-se os controles para evitar resultados falso-positivos.
Após duas horas de iluminação, realizou-se a contagem dos animais vivos e
mortos de cada tubo. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
25
3.2.9. Ensaio in vitro com culturas de microrganismos
As bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli, bem como a
levedura Candida albicans, foram estocadas em uma placa de Petri contendo
agar nutriente, a 4 ºC. Uma colônia de cada microrganismo foi transferida para
um tubo de ensaio contendo CMH e incubou-se por aproximadamente 15
horas a 37 ºC, em estufa para cultura bacteriológica (Fanem, modelo Orion
502). A suspensão de microrganismo foi centrifugada a 3000 rpm por 15
minutos, sendo o sobrenadante descartado e o concentrado de inóculo re-
suspenso e lavado com soro fisiológico peptonado, repetindo-se o
procedimento por mais duas vezes.
O inóculo foi re-suspendido com solução fisiológica e calibrado em
espectrofotômetro (Spectronic 20 Bausch, para leitura em tubos de ensaio
13x100 mm) a 580 nm em transmitância de 25-30%. Desta suspensão, foram
realizadas as diluições necessárias em solução Tween 80 1,0 % (m/v)
obtendo-se a suspensão de células calibradas na concentração média de 108
UFC mL-1, para todos os microrganismos.
A um volume de 400 µL do inóculo calibrado, foram adicionados 100 µL
de solução de clorofila a (ou feofitina a), em Tween 80 1,0% (m/v) a diferentes
concentrações, em cada um dos orifícios de placas com 4 poços. Dois grupos
com a mesma concentração de substâncias ativas foram preparados; cada
grupo foi submetido a diferentes tratamentos, um com incidência de luz e o
outro sem iluminação. A iluminação foi realizada diretamente sobre as placas
com as amostras, utilizando o LED como fonte, em mesa agitadora (Tecnal,
TE-424) a 80 rpm e 25,0 ºC, durante 30 minutos.
Terminada a iluminação, transferiu-se o conteúdo das placas para tubos
de ensaio, completou-se o volume até 4,0 mL com CMH e mediu-se a
26
transmitância (580 nm) de cada tubo. As amostras foram incubadas em estufa
a 37 ºC e mediu-se a transmitância após 2, 4 e 6 horas, do início da
incubação, para mensurar a taxa de reprodução / crescimento dos
microrganismos. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e os
controles necessários foram realizados. Deve-se enfatizar que a diminuição
dos valores de porcentagem de transmitância indica o crescimento microbiano.
Testes iniciais para adequação e sistematização do protocolo adotado
foram realizados com o corante azul de metileno, seguindo os procedimentos
descritos acima; alguns resultados serão apresentados neste trabalho para
fins de comparação e discussão.
3.2.10. Reações de Foto-branqueamento
Para verificar a existência de reações de foto-branqueamento para a
clorofila a e a feofitina a, iluminaram-se soluções de cada composto utilizando-
se a fonte de LED. Registraram-se espectros de absorção das amostras a
cada 5 minutos de exposição à luz vermelha. Trabalhou-se com soluções
aeradas e desaeradas.
No preparo de soluções desaeradas, borbulhou-se N2 (99,99% de
pureza) através da solução por cerca de 30 minutos, previamente a exposição
à luz. Alternativamente, para garantir a ausência de oxigênio dissolvido,
aplicou-se adicionalmente o método de congelamento (nitrogênio líquido, -196
ºC) – vácuo (bomba de vácuo por cerca de 5 minutos para retirada de gases
acima do congelado) – descongelamento (temperatura ambiente, com
agitação), seguida de novo ciclo, com 8 repetições.
27
3.2.11. Teste do Ácido Úrico
A fim de verificar a atividade fotodinâmica dos compostos estudados,
relacionando-se com a habilidade de formação de oxigênio singlete, realizou-
se o teste do ácido úrico, com metodologia adaptada da literatura (Maestrin et
al, 2004; Serra et al, 2002). Uma mistura de 3 mL de ácido úrico (10-4 mol L-1)
e do composto testado (10-6 mol L-1) em etanol, foi colocada em uma cubeta
de quartzo. A solução foi agitada e mantida à temperatura ambiente durante
as medidas. Iluminou-se a solução com a fonte de LED, registrando-se
espectros de absorção (250-800 nm) a cada três minutos de irradiação.
Baseando-se no teste do ácido úrico, calculou-se o valor da atividade
fotodinâmica (PA), a partir da equação [1], abaixo:
PA = ∆AUA x 105 / W t APsλirr [1]
onde, PA: atividade fotodinâmica (escala teórica e comparativa); ∆AUA:
variação da absorbância a 293 nm da solução após o tempo total de
irradiação; W: potência da luz (mW); t: tempo de irradiação e APsλirr: valor de
absorbância do fotossensitizador na solução, no comprimento de onda de
irradiação da fonte.
28
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Obtenção e caracterização dos compostos
A extração da clorofila a a partir de folhas de espinafre é um método
simples, no entanto, os gastos com solventes são elevados. Adicionalmente, a
etapa subseqüente de separação dos pigmentos é consideravelmente
demorada e trabalhosa, como é comum em separações de extratos de
plantas. Para esta etapa, foram realizados testes preliminares utilizando
coluna cromatográfica, mas os resultados não foram satisfatórios, havendo um
elevado consumo de solventes, com demasiado tempo e trabalho dedicado.
Entretanto, com o procedimento adotado de separação dos pigmentos
por CCDC conseguiu-se rapidez e eficiência, com redução razoável de custos.
O Chromatotron facilitou o trabalho devido às principais vantagens da técnica
de CCDC: rapidez durante a separação dos compostos, boa separação
(mesmo sendo muitos compostos com Rf bem próximos entre si), alta
economia de solventes, maior quantidade de amostra aplicada (o
Chromatotron é capaz de separar até 1,0 g de mistura por corrida na placa de
4 mm de espessura) e relativa facilidade de limpeza da placa de adsorvente
(sílica gel), com possibilidade de efetuar-se diversas corridas cromatográficas
com uma única placa.
Apesar destas vantagens, devido às altas quantidades de materiais que
se perdem e os baixos teores de clorofila a nas folhas de espinafre, foram
necessárias diversas repetições dos procedimentos acima durante a execução
do trabalho.
Entre os pigmentos encontrados no extrato do espinafre estão os
compostos carotenóides (de coloração amarela e mais baixa polaridade),
29
clorofila b (também presente em quantidade relativamente grande em plantas)
e outros compostos de coloração esverdeada como criptoxantinas,
zeaxantinas, entre outros (Dolphin, 1978).
A clorofila a, obtida com alto grau de pureza, apresenta a estrutura
mostrada no Esquema 6. Nesta, foi incluída a atribuição de seus principais
átomos de hidrogênio.
Esquema 6: Estrutura da clorofila a com a atribuição dos átomos de hidrogênio.
A confirmação da boa pureza e a identificação da clorofila a foi feita
pelos espectros de RMN de 1H e eletrônico de absorção na região do visível.
Na Figura 2 apresenta-se o espectro de RMN de 1H e na Tabela 2 mostram-se
os principais sinais característicos observados no espectro. Salienta-se que
em campo baixo (deslocamentos químicos na região de 0 a 3 ppm), o espectro
se apresenta confuso, devido à sobreposição de diversos sinais, com altas
multiplicidades, provenientes dos hidrogênios da cadeia fitílica da clorofila a.
α
β δ
N
N
Mg
N
N
O
OO
CH2
CH3
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3CH3
HH
3a2b
2a
1a 4a4b
5a
10b
78
8a
7a
7b
10
P1
P2
30
Figura 2: Espectro de RMN de 1H para a clorofila a, em acetona-d6, a 300 MHz.
Tabela 2: Deslocamentos químicos e tipos de sinal para os principais átomos de
hidrogênio da clorofila a, verificados no espectro de RMN1H em acetona-d6, a
300MHz, tendo como referência o TMS (δ = 0 ppm). (s): singleto; (dd): duplo dubleto;
(m): multipleto.
H δ(ppm) Sinal H δ(ppm) Sinal
α 9,45 (s) 10 6,00 (s)
β 9,80 (s) P2 5,15 (m)
δ 8,60 (s) P1 4,50 (m)
2a 8,15 (dd) 5a 3,60 (s)
2b 6,20 (dd) 4a 3,80 (m)
Uma ferramenta importante para a caracterização da clorofila a foi o
espectro de absorção na região do visível (mostrado a seguir). Segundo a
literatura (Dolphin, 1978), os pigmentos do extrato do espinafre possuem
espectros de absorção bastante diferenciados.
31
400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Abso
rbân
cia
Comprimento de Onda (nm)
A feofitina a, obtida a partir da clorofila a pura, foi caracterizada da
mesma forma. No entanto, para a feofitina a, o espectro de absorção foi
decisivo para a identificação, uma vez que o espectro de RMN de 1H possui o
mesmo perfil que o da clorofila a, apresentando diferenças de deslocamento
químico muito pequenas. Os espectros de absorção na região do visível para
os dois pigmentos são apresentados na Figura 3.
Figura 3: Espectro eletrônico da clorofila a (—) e feofitina a (- - -), 7,5 x 10-6 mol.L-1, a
30,0 ºC, em acetona.
Observa-se na Figura 3 que, embora a presença do metal magnésio na
estrutura afete o espectro, ambos compostos apresentam alta absorção na
região de 665 nm (banda Q, relativa a monômeros), característica muito
favorável a compostos candidatos a fármaco em TFD. Esta banda é menos
intensa na feofitina. Adicionalmente na região de 400 a 430 nm, tem-se a
banda de Soret, característica de porfirinas e seus derivados; a clorofila a
apresenta máximo de absorção em 430 nm, enquanto a feofitina a em 410 nm.
32
0 20 40 60 80 1000,40
0,45
0,50
0,55
0,60
0 500 1000 15000,40
0,45
0,50
0,55
0,60
Abso
rbân
cia
tempo (s)
Abso
rbân
cia
(665
nm
)
tempo (s)
4.2. Reação de Desmetalação da Clorofila a e estudo do pH do meio
A transformação da clorofila a em feofitina a consiste na troca do íon
metálico Mg2+ da clorofila por dois íons hidrogênio (H+), que se ligam a dois
nitrogênios pirrólicos. Este processo de desmetalação é relativamente rápido,
se completando na escala de segundos / minutos em concentrações elevadas
de ácido em relação à clorofila.
A desmetalação foi monitorada cineticamente empregando um
dispositivo de stopped-flow (construído pelo grupo), com condições
experimentais de pseudo ordem (concentração de HCl 1000 vezes superior à
de clorofila a). As duas seringas de igual capacidade (diluição 1:1),
proporcionaram as concentrações iniciais de 6,4 x 10-3 e 6,4 x 10-6 mol L-1,
respectivamente para o HCl e a clorofila a na cubeta de análise
(acompanhamento cinético na Figura 4).
Figura 4: Cinética da desmetalação da clorofila a em meio etanólico ácido, a ~ 30 ºC.
A inserção exibe uma seqüência de corridas obtidas no stopped-flow.
33
Do tratamento matemático de primeira ordem, obteve-se um bom ajuste
(não mostrado, com coeficiente de correlação médio ~ 0,999), com constante
de velocidade observada de 0,111 s-1. Diante da concentração de HCl, obteve-
se a constante de velocidade de segunda ordem de 17,3 L mol-1 s-1. A cinética
de desmetalação da clorofila a em meio etanólico ácido foi utilizada na
verificação da eficiência do aparato de stopped-flow construído (Batistela et al,
2005), apresentando valores condizentes com os dados da literatura (Levanon
e Neta, 1980).
Torna-se importante frisar que em tecidos tumorais ocorre uma ligeira
redução do pH local em comparação com tecidos sadios (Gerweck e
Seetharanan, 1996; Pannock e Rotin, 1989). Assim, a realização de estudos
envolvendo o efeito do pH e a determinação do pKa de fármacos potenciais
em TFD se faz importante para garantir a estabilidade e o entendimento sobre
mecanismos de ação no tecido doente, sobretudo nos casos em que há a
possibilidade de injeção intravenosa.
Dessa forma, investigou-se o efeito do pH sobre a clorofila a em
soluções 10% água / etanol, onde o composto mantém-se essencialmente na
forma monomérica. Essa condição de baixo teor de água é importante, pois se
verificou que sob determinadas condições experimentais, tanto a clorofila
quanto a feofitina apresentam tendência à auto-agregação, principalmente em
meios ricos em água.
Primeiramente, determinou-se a região de pH na qual ocorre a reação
de desmetalação e, em segundo, avaliou-se o equilíbrio de protonação
adicional dos nitrogênios da feofitina a em meio mais ácido (reação de troca e
protonação, respectivamente, ilustradas no Esquema 7, a seguir).
Trabalhando-se em condições específicas de pH, inicialmente
constatou-se que as três possíveis formas atribuídas à clorofila possuem
34
H
HN N
N N
CH
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
O
CH2
C
OCH3
H3C
CH2 HOCH2
COO C20H39
H
N N
N N
CH
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
O
CH2
C
OCH3
H3C
CH2 H
Mg
H
C20H39COO
CH2O
H
C20H39COO
CH2O
N HN
NH N
CH
CH3
CH3
CH2CH3
CH3
O
CH2
C
OCH3
H3C
CH2 H
H
H+
+ H+ H+
640 660 680 7000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
(c)
(b)
(a)
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
espectros de absorção distintos, fato que justifica a utilização do método
espectrofotométrico para a investigação do efeito de pH e a determinação de
pKa. Na figura 5, a seguir, apresentam-se os espectros comparativos das três
estruturas mostradas no Esquema 7.
Esquema 7: Estruturas da clorofila a, feofitina a e feofitina protonada (dicatiônica).
Figura 5: Comparação entre os espectros de absorção da clorofila a (a), feofitina a
(b) e a forma dicatiônica da feofitina (c).
35
0 2 4 6 8
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Abso
rbân
cia
(665
nm
)
pH
A forma dicatiônica, observada quando compostos porfirínicos se
encontram em meio mais ácido, apresenta menor conjugação eletrônica do
macrociclo tetrapirrólico, devido à diminuição da densidade eletrônica do anel.
Este fato justifica o deslocamento hipsocrômico observado na Figura 5.
Dados de absorbância (a 665 nm) obtidos após tempos suficientemente
longos (minutos a horas) para se atingir o equilíbrio, para diversas soluções de
clorofila a, em diferentes valores de pH, são apresentados na Figura 6.
Figura 6: Absorbância (665 nm) em função do pH para soluções de clorofila (3,90 x
10-6 mol L-1) em 10% água / etanol, após o equilíbrio, a 30,0 ºC.
Pode se observar que ao se trabalhar com soluções a pH 8,0 até ao
redor de 5,3, a clorofila a é estável, ou seja o metal magnésio é mantido na
estrutura. Nas soluções cujo pH se encontra entre 3,7 e 5,3 ocorre a reação de
desmetalação (reação de troca com os prótons) sendo esta parcial ou
completa, dependendo do teor de H+. Nesta região, consegue-se monitorar
facilmente a diminuição da absorbância da clorofila com o tempo,
especialmente nas soluções de pH mais elevado, devido ao fato da
36
desmetalação ser mais lenta nestas condições experimentais. Próximo a pH
5,0 verifica-se que a reação é de segunda-ordem; ressalta-se que o tempo de
meia vida de uma reação de segunda ordem aumenta à medida que a
concentração dos reagentes diminui (Espenson, 1981), ou seja, a reação é
muito mais lenta comparada a reações de primeira ordem (pH menores).
Na Figura 6, observa-se ainda um platô na intensidade na faixa de pH
entre 3,7 e 2,0 aproximadamente: é nesta região que se verifica a perda do
metal por parte da totalidade das moléculas de clorofila a, ou seja, tem-se
presente apenas a feofitina a. Nestas condições de pH, a transformação é
muito rápida, como já discutida anteriormente.
Em meio muito ácido (pH abaixo de 2,0), onde se tem apenas a feofitina,
verificou-se a protonação dos outros dois nitrogênios do anel porfirínico,
ficando os quatro nitrogênios protonados; isto é, nesta região de pH dá-se o
equilíbrio ácido-base da feofitina com a sua forma ácida, a espécie dicatiônica
(conforme ilustrado anteriormente no Esquema 7). O valor de pKa para este
equilíbrio foi determinado a partir do gráfico da Figura 6 pelo ponto de inflexão
e pelo método gráfico baseado na equação de Henderson-Hasselbalch
(Previdello et al, 2005), resultando em 1,1.
Na forma dicatiônica, mesmo em soluções com maior teor de água, o
composto manteve-se na forma monomérica devido à presença das cargas na
molécula, dificultando o fenômeno da auto-agregação.
37
400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4 0 % água 20 % água 40 % água 50 % água 60 % água 80 % água 100 % água
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5 0 % água 20 % água 40 % água 50 % água 60 % água 80 % água 100 % água
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
4.3. Auto-agregação em misturas água / etanol
4.3.1. Efeito da composição da mistura (teor de água em relação a etanol)
Os estudos realizados com a clorofila a e a feofitina a em diversas
composições água / etanol mostraram que os espectros de absorção destes
compostos, quando registrados imediatamente após a adição dos mesmos à
solução, variam de acordo com o teor de água da mistura, conforme se ilustra
na Figura 7, a seguir.
Figura 7: Espectros de absorção da clorofila a (à esq.) e da feofitina a (à dir.), a 3,32
x 10-6 mol.L-1 e 30,0 ºC, imediatamente após as adições em misturas água / etanol.
De acordo com a Figura 7, em etanol puro, os compostos apresentam-
se totalmente na forma monomérica, com absorção máxima na banda Q —
clorofila a (665 nm) e feofitina a (667 nm) — e na banda de Soret. À medida
que se aumenta a porcentagem de água na mistura, observa-se um
decréscimo do pico referente aos monômeros, fato que provavelmente está
38
associado ao fenômeno da auto-agregação em meio rico em água, diante da
alta hidrofobicidade de ambos os compostos.
Para a clorofila a, observa-se a diminuição gradativa da banda Q nas
soluções contendo até 50% de água. A partir da solução contendo 60% de
água, juntamente com a diminuição da intensidade de absorção, há um
pequeno deslocamento do pico para a região em torno de 670 nm (Figura 7, à
esquerda). Para a feofitina a observa-se, paralelamente à diminuição do pico a
667 nm, a formação de um pico adicional a 692 nm para as soluções de 40 e
50% água / etanol. No entanto, acima de 60% de água, a intensidade máxima
de absorção é observada na região de 674 nm (Figura 7, à direita).
Conforme apresentado, as soluções de clorofila a, com o aumento do
teor de água na mistura, apenas mostraram a diminuição da banda Q
(acompanhada de pequeno deslocamento), enquanto que algumas de feofitina
a exibiram pico de agregados. A diminuição do pico correspondente a
monômeros é um forte indicativo de auto-agregação, entretanto a presença
(ou ausência) de pico correspondente às espécies agregadas nos diversos
sistemas é regida, segundo a teoria do Exciton Molecular (Kasha, 1976;
Kasha, 1963; Tessaro et al, 2005), pela orientação relativa dos momentos
dipolares de transição individual de cada monômero quando este compõe o
agregado.
Durante a formação da espécie agregada, as unidades monoméricas se
associam e se estabelecem de maneiras diversas, sendo possíveis diferentes
orientações de momentos dipolares de transição de cada monômero. Como o
momento dipolar de transição é uma propriedade vetorial, em alguns casos a
resultante vetorial ao compor o agregado se anula, caso de ausência de pico;
em outros, ocorre sobreposição positiva levando ao surgimento de bandas
adicionais relativas a esses agregados (exemplificado no Esquema 8).
39
µR ≠ 0 µR = 0 Ausência de pico Presença de pico
µ µ µ µ
Esquema 8: Representação da orientação vetorial de dois momentos dipolares de
transição (µ), com alinhamento no mesmo sentido (esq.) e com alinhamento em
sentidos opostos (dir.) e valor do momento dipolar de transição resultante
correspondente ao agregado (µR).
No exemplo utilizado, têm-se os dipolos de transição orientados em
linha, que é o caso que levaria a pico de agregado com deslocamento
batocrômico em relação ao de monômeros, quando a resultante µR não é nula,
situação da esquerda no Esquema 8 (Kasha, 1976; Kasha, 1963; Tessaro et
al, 2005).
Apesar de toda a discussão levantada em torno de agregados quanto às
orientações de momento dipolar de transição de seus monômeros, sobre a
geração ou não de pico correspondente, existem dúvidas. Caberia um
questionamento sobre o fato de na solução de clorofila a 100% de água onde,
a princípio, ter-se-iam apenas espécies agregadas, o espectro exibir picos
(Figura 7, à esq.). Neste caso, a banda é muito similar a de monômeros,
podendo levar a erros na atribuição. Como o deslocamento dos picos entre o
cromóforo em etanol (665 nm) e em água (670 nm) é de apenas 5 nm, este
poderia ser confundido com deslocamento batocrômico, devido simplesmente
ao efeito de solvente. Caso contrário, o pico deslocado, que se apresenta em
40
400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4 0 % água 20 % água 40 % água 50 % água 60 % água 80 % água 100 % água
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5 0 % água 20 % água 40 % água 50 % água 60 % água 80 % água 100 % água
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
670 nm poderia corresponder ao agregado de clorofila a. Este ponto será
discutido posteriormente.
De qualquer forma, os resultados indicam que não se tem apenas um
tipo de agregado entre as soluções de clorofila e feofitina e, mesmo entre
soluções do mesmo cromóforo os resultados indicam a geração de agregados
diferentes que são dependentes do teor de água na mistura solvente.
Adicionalmente, monitorou-se o comportamento destas soluções com o
tempo, esperando-se o sistema atingir o equilíbrio químico. Os espectros finais
a cada porcentagem de água na mistura são apresentados na Figura 8. Não
se observou a presença de ponto isosbéstico na superposição de espectros,
sejam no tempo zero (Figura 7) ou no equilíbrio (Figura 8) em ambos
cromóforos, fato que reforça a existência de múltiplos equilíbrios envolvendo
monômeros e diferentes espécies de agregados (Espenson, 1981).
Figura 8: Espectros de absorção da clorofila a (à esq.) e da feofitina a (à dir.) a 3,32
x 10-6 mol.L-1, no equilíbrio, em misturas água / etanol, a 30,0 ºC.
41
0 20 40 60 80 100
0,25
0,50
0,75
1,00
tempo zero tempo infinito
Abso
rbân
cia n
orm
aliza
da
% de água na mistura (v/v)
0 20 40 60 80 100
0,50
0,75
1,00
tempo zero tempo infinito
Abso
rbân
cia n
orm
aliza
da
% de água na mistura (v/v)
Dos espectros iniciais - tempo zero (Figura 7) e espectros no equilíbrio -
tempo infinito (Figura 8) construiu-se a Figura 9, onde se ilustra a cada teor de
água, a absorbância dos compostos observada no comprimento de onda onde
o monômero tem sua máxima intensidade.
Nota-se que a cada composição de solvente, praticamente não existe
diferença entre as absorbâncias do tempo inicial e do equilíbrio para as
soluções de feofitina a (Fig 9, à dir.). No caso das soluções de clorofila a, as
mudanças são mais evidentes (Fig 9, à esq.), porém ainda pequenas,
sobretudo para as soluções onde o teor de água é baixo. Entretanto como
neste caso monitorou-se apenas um comprimento de onda fixo, a percepção
dos fenômenos temporais é restrita.
Figura 9: Absorbâncias normalizadas para a clorofila a em 665 nm (à esq.) e a
feofitina a em 667 nm (à dir.), nos tempos inicial e final a cada uma das misturas
água/etanol. C= 3,32 x 10-6 mol L-1 e 30,0 ºC.
Para ambos os compostos, em soluções contendo de 0 a 20% de água
não se observaram mudanças espectrais, ou seja, os monômeros se
mantiveram estáveis. Nas demais soluções, com maiores teores de água,
42
observaram-se as modificações citadas anteriormente. Em alguns casos o
equilíbrio químico foi atingindo após cerca de 40 horas, um processo bastante
lento. Apesar da aparente lentidão, o espectro inicial (tempo zero) dessas
soluções com maior teor de água, imediatamente após mistura, é
notavelmente diferente do espectro de monômeros. Mesmo com a ferramenta
de stopped-flow não se obteve êxito em monitorar este passo muito rápido
dentro do processo global de auto-agregação. No entanto, observou-se uma
etapa posterior bastante lenta até atingir-se o equilíbrio final dos agregados
em solução, sendo esta seqüência com poucas mudanças espectrais.
No caso das soluções de clorofila a com teores na faixa de 60 a 100%
de água, verificou-se um desvio de tendência com o aumento da porcentagem
de água para as intensidades medidas no tempo infinito (Figura 9); o mesmo
não foi observado para a feofitina a, onde se vê um platô. Por exemplo, o
ponto experimental a 80% água / etanol para a clorofila a (situação de
equilíbrio), poderia ser facilmente confundido com um erro experimental. No
entanto, ao trabalhar-se com soluções dos compostos em outras
concentrações fixas (13 séries de concentrações, no intervalo de 6,71 x 10-7 a
2,5 x 10-5 mol L-1), verificou-se o mesmo perfil. Ou seja, a anormalidade
observada em soluções a 80% água / etanol (comparadas a de 60% e 100%
de água), para a clorofila a, é real e, provavelmente, decorre da formação de
diferentes estados agregados, sobretudo com relação ao número de
agregação e geometria do agregado, que devem ser dependentes da
proporção de água na mistura de solventes.
Para responder a essas questões, comparou-se a diminuição da
intensidade de absorção dos compostos em água / etanol com a diminuição da
emissão de fluorescência das mesmas (Figura 10). Para a fluorescência,
obtiveram-se as mesmas intensidades no tempo zero e no equilíbrio.
43
0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fluorescência absorção
Inte
nsid
ade
Norm
aliza
da
% de água na mistura (v/v)0 20 40 60 80 100
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
fluorescência absorção
Inte
nsid
ade
Norm
aliza
da
% de água na mistura (v/v)
Figura 10: Intensidades normalizadas de emissão fluorescente em 680 nm (■) e de
absorção (□) para a clorofila a (à esq.) e a feofitina a (à dir.), em função do teor de
água, no equilíbrio; 5 x 10-7 mol L-1 e 30,0 ºC (λexc = 430 nm e absorbância
acompanhada em 665 nm e λexc = 410 nm e absorbância em 667 nm, para a clorofila
e feofitina, respectivamente).
Um procedimento técnico adotado no experimento foi proteger a
amostra / cubeta da exposição contínua à luz a fim de minimizar reações de
foto-branqueamento do cromóforo pela luz de excitação do aparelho durante a
análise fluorométrica.
Conforme os resultados mostrados na Figura 10, com o aumento do teor
de água na mistura de solventes, a intensidade de fluorescência diminui de
maneira similar à absorbância, em ambos os compostos analisados.
Avaliando-se a figura, verifica-se que até um certo gradiente de água, a
intensidade de fluorescência decai aos poucos. Este decaimento pode ser, em
parte, devido ao efeito de solvente sobre as espécies no estado excitado e
fundamental, decorrente da solvatação e micro-viscosidade do meio. A água,
mais polar e com ligações hidrogênio, leva a estados altamente solvatados,
ocasionando maior número de choques solvente-fluoróforo excitado,
aumentando a eficácia de desativação de energia por processos não-
44
radiativos do composto no estado singlete excitado, em detrimento a
fluorescência (Dupuy e Montague, 1997; Cehelnik et al, 1975).
Entretanto, o perfil mostrando uma região com queda abrupta na
intensidade de fluorescência, chegando a praticamente zero de emissão,
indica não se tratar apenas de efeito específico de solvente. Sabe-se que a
formação de agregados envolvendo o fluoróforo em solução reduz
drasticamente a intensidade de emissão de luz (Ricchelli et al, 1994). Espécies
agregadas são praticamente não-fluorescentes, porque a energia do composto
no estado excitado (que seria liberada na forma de luz) é suprimida por
vibrações e dispersões que ocorrem entre as próprias unidades monoméricas
desse agregado, fenômeno denominado de auto-supressão de energia,
levando à desativação (Ricchelli et al, 1994).
Observação adicional é feita quanto a situações de fluorescência
praticamente nula em soluções acima de 60% de água. Esse resultado nos
obriga a retornar às Figuras 7 e 8, discussão sobre quais são as
características espectrais absortivas dos cromóforos no estado agregado. A
não emissão de fluorescência nas soluções acima de 60% de água em etanol
implica que quase a totalidade das moléculas encontra-se no estado
agregado, ou seja, as bandas observadas nos espectros de absorção dessas
soluções correspondem às espécies preponderantemente agregadas (Figura 7
e 8). Portanto, no caso da clorofila a, o pico de absorção ao redor de 670 nm,
e mesmo o que aparece em 710 nm para 60 % água na Figura 8, devem ser
de espécies de agregados; no caso da feofitina ter-se-iam agregados que
absorvem em 692 nm e outros em 674 nm (neste último caso, situação de
soluções com 80 e 100% de água).
Uma importante evidência da presença de agregados em solução é
apresentada na Figura 11, a qual mostra a sobreposição dos espectros de
45
absorção e de excitação para uma solução de feofitina a que apresenta o pico
adicional na absorção, referente a um possível agregado.
Figura 11: Espectros de excitação e de absorção para a solução de feofitina a (5,0 x
10-7 mol L-1) em 50% água / etanol, no equilíbrio, e de absorção da feofitina a em
etanol, a 30 ºC. O comprimento de onda de emissão foi fixado em 720 nm para se
obter o espectro de excitação.
Observa-se claramente no espectro de excitação da Figura 11, a
presença de um pico na região a 667 nm, a mesma região de absorção
máxima de monômeros (na figura incluiu-se o espectro de absorção da
feofitina a em etanol puro para efeitos de comparação). Entretanto, na região a
690 nm, onde se tem intensidade máxima de agregados no espectro de
absorção desta solução, não se observa banda correspondente no espectro
de excitação. Este experimento mostrou que a entidade que absorve a 690 nm
na solução de feofitina a (mistura a 50% água / etanol), não é a emissora da
fluorescência; logo, essa espécie é atribuída ao agregado formado num
processo de auto-agregação. O pico a 667 nm observado no espectro de
400 450 500 550 600 650 700
100
200
300
400
500
600
700 excitação
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsid
ade
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
absorção absorção (etanol puro)
Absorbância
46
300 400 500 600 700 800
0
200
400
600
800
Inte
nsida
de
Comprimento de onda (nm)
0% água 20% água 40% água 50% água 60% água 80% água 100% água
300 400 500 600 700 8000
200
400
600
800
0% água 20% água 40% água 50% água 60% água 80% água 100% água
Inte
nsida
de
Comprimento de onda (nm)
excitação deve-se a monômeros ainda presentes, em equilíbrio, na solução
(emissores de fluorescência).
Estudos com a técnica de espalhamento de luz ressonante (RLS, do
inglês resonance light scattering) foram realizados para investigar-se o perfil
do processo de agregação nas soluções trabalhadas. A Figura 12 apresenta a
sobreposição de espectros de RLS, obtidos pelo método de sincronismo dos
monocromadores de excitação e emissão no espectrofluorômetro.
Figura 12: Espectros de RLS para soluções de clorofila a (à esq.) e feofitina a (à
dir.), a 5,00 x 10 -7 mol L-1, em diversas misturas água / etanol, a 30 ºC.
Conforme se observa na Figura 12, verifica-se que existem diferentes
perfis para cada solução água / etanol. Salienta-se que os espectros RLS dos
compostos em etanol puro apresentaram um pequeno sinal na região de 665
nm, sendo que este diminui conforme é aumentado o teor de água na mistura.
Espectros de RLS em soluções onde não existem agregados deveriam
resultar em ausência de sinal, uma vez que se associa o efeito ressonante a
uma interação da luz com o momento dipolar de transição do agregado, aliado
47
à sua polarizabilidade, sendo maior o sinal quanto maior é o tamanho dessa
espécie. Por outro lado, existem citações na literatura apontando que soluções
concentradas de derivados de porfirinas em solvente orgânico puro
apresentam agregados pequenos (Dolphin, 1978). No entanto, no presente
caso a concentração do fluoróforo é pequena, insuficiente para acreditar-se
que haja forte agregação; adicionalmente, se o agregado em etanol é
pequeno, normalmente não se observa sinal no espectro RLS. Assim o
pequeno pico observado em 665 nm em etanol não deve ser de agregado,
podendo-se tratar de artefato instrumental do aparelho utilizado.
Em soluções com maior teor de água (limites inferiores de 50% para a
clorofila e 40%, para a feofitina) observou-se o aparecimento de sinais na
RLS, na região de 400 a 600 nm, evidenciando o espalhamento de luz
ressonante, fato que sugere a presença de espécies agregadas grandes nas
referidas soluções. De acordo com a Figura 12, os sinais têm diferenças
significativas nas intensidades dos espectros entre soluções de clorofila e
feofitina em 80% e em água pura do espectro em solução a 60 % água.
A diferença nestes perfis indica a possível diferença existente nos
agregados, ou seja, na maneira como ele é formado e se apresenta em
solução, com relação à geometria e número de agregação.
4.3.2. Efeito da concentração de cromóforos
Realizou-se o estudo da variação da concentração de clorofila a e de
feofitina a nas misturas água / etanol. Trabalhou-se com 13 valores diferentes
de concentração, na faixa de 6,71 x 10-7 a 2,50 x 10-5 mol L-1. A sobreposição
de espectros numa mesma mistura água / etanol, a diferentes concentrações
48
600 650 700 7500,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
Abso
rtivid
ade
(L m
ol-1 cm
-1)
Comprimento de onda (nm)600 650 700 750
0,0
2,0x104
4,0x104
6,0x104
8,0x104
Abso
rtivid
ade
(L m
ol-1 cm
-1)
Comprimento de onda (nm)
após atingir-se o equilíbrio, é mostrada na Figura 13, dada pelos espectros
expressos em termos de absortividade molar (ε).
Figura 13: Espectros (na forma de absortividade molar) para a clorofila a em 50%
água / etanol (à esq.) e a feofitina a em 40% (à dir.), em diversas concentrações, a
30,0 ºC, no equilíbrio. O sentido das setas mostra a tendência das bandas à medida
que se aumenta a concentração do composto de 6,71 x 10-7 a 2,50 x 10-5 mol.L-1.
Conforme se pode observar, tanto o aumento na concentração da
clorofila a como da feofitina a promovem a diminuição da absortividade no
comprimento de onda referente às espécies monoméricas (respectivamente
665 e 667 nm). Para a clorofila a, em 50% água / etanol, observa-se apenas a
diminuição do pico referente a monômeros acompanhado de ligeiro
deslocamento no comprimento de onda, enquanto que para a feofitina a, em
40% água / etanol, observa-se adicionalmente a formação de pico (em 692
nm). Estes perfis são similares aos observados no estudo com variação da
composição de água na mistura solvente; assim em ambos os cromóforos, o
fenômeno da auto-agregação não é somente dependente do teor de água na
mistura, mas também se mostrou fortemente associada à concentração do
composto.
49
Novamente não se observou ponto isosbéstico na sobreposição dos
espectros, fato que sustenta a idéia da existência de mais de um equilíbrio
entre monômeros e diferentes agregados. Para se avaliar o grau de agregação
em cada composição das misturas, foram construídos gráficos de valores de
absorbância em função da concentração dos compostos, no comprimento de
onda da espécie monomérica, para cada solução água / etanol (Figura 14).
Nestes são incluídos dados com concentrações muito baixas (2,00 x 10-8 a
3,00 x 10-7 mol L-1), obtidos com cubeta de vidro de 10,0 cm de caminho ótico.
Os valores para cada série de concentrações variáveis foram tomados após
atingir-se o equilíbrio (mesmo porque as diferenças em relação ao espectro
inicial eram pequenas).
Figura 14: Valores de absorbância obtidos no equilíbrio (665 nm para a clorofila a, à
esquerda; 667 nm para a feofitina a, à direita) em função da concentração, em
diversas misturas água / etanol a 30,0 ºC.
Conforme se observa na Figura 14, em etanol puro, ambos os
compostos seguem a Lei de Lambert-Beer, até valores de absorbância
0,0 5,0x10-6 1,0x10-5 1,5x10-5 2,0x10-5 2,5x10-5
0,0
0,5
1,0
1,5
0 % água 20% água 40% água 50% água 60% água 80% água 100% água
Abso
rbân
cia
(667
nm
)
Concentração (mol L-1)0,0 5,0x10-6 1,0x10-5 1,5x10-5 2,0x10-5 2,5x10-5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5 0% água 20% água 40% água 50% água 60% água 80% água 100% água
Abso
rbân
cia
(665
nm
)
Concentração (mol L-1)
50
próximos de 2. O cálculo do coeficiente de absortividade molar resultou em
93300 L mol-1 cm-1 para a clorofila a, em 665 nm, e 67000 L mol-1 cm-1 para a
feofitina a, em 667 nm, valores condizentes com a literatura (Dolphin, 1978).
As demais misturas apresentaram desvios em relação ao solvente
orgânico puro. Para as soluções 20% água / etanol, em ambos os compostos,
o desvio (negativo) foi pequeno e a Lei de Beer continua sendo obedecida.
Nestas soluções, não há variação espectral com o tempo, ou seja, assim que
o composto entra em contato com a solução, apresenta esta pequena queda
no valor de absorção, ou seja, o equilíbrio é atingido imediatamente.
Analisando o gráfico da Figura 14, para a clorofila a observa-se que os
desvios negativos da Lei de Beer são maiores para soluções acima de 50% de
água. No caso da feofitina a, a solução com 40% de água já apresentou um
desvio significativo que se acentuam com o aumento da concentração.
Observa-se ainda que em ambos compostos à medida que se aumenta a
concentração, as soluções contendo 60% e, principalmente de 50% de água /
etanol exibem os desvios mais acentuados em relação ao etanol puro,
inclusive apresentam valores de absorbância menores do que as soluções de
80% e de água pura. Acreditamos que os agregados formados nas soluções
próximas a 50% de água no etanol sejam diferentes daqueles formados nos
meios de 80 % ou água pura, com tamanhos e/ou geometrias diferentes. Estes
fatos reforçam os estudos anteriores.
Um outro ponto a ser discutido é a provável diferença existente entre os
agregados de clorofila a e de feofitina a. Ao se trabalhar com concentrações
de clorofila a acima de 8,0 x 10-6 mol L-1, nas soluções contendo 50 e 60% de
água em etanol, observou-se a presença de precipitados na solução após
tempos longos, fato que indica a formação de agregados muito grandes
51
(pouco solúveis). A precipitação não foi verificada em nenhuma das soluções
de feofitina a.
Quanto ao mecanismo da agregação, a presença do metal magnésio na
clorofila parece ser decisiva para a estrutura das espécies agregadas (Dolphin,
1978). Em geral, os compostos derivados da clorofila que possuem o átomo
de magnésio coordenado ao macrociclo apresentam o metal central com
número de coordenação igual a 4. No entanto, este valor pode ser superior,
devido à possibilidade de coordenação de moléculas doadoras de elétrons nas
posições axiais do complexo. Assim, átomos de oxigênio carbonílicos,
presentes na clorofila, podem se coordenar ao átomo de magnésio de outra
molécula, formando espécies diméricas, mesmo em solventes orgânicos puros
(Dolphin, 1978). A situação acima é descrita para soluções concentradas em
etanol, que não é o nosso caso, porém este mecanismo pode estar presente
nas soluções investigadas de clorofila com altos teores de água.
Quanto à feofitina a, espécie desmetalada, as interações são
provavelmente mais “fracas”, predominando-se as forças de van der Waals
entre os macrociclos tetrapirrólicos de cada unidade monomérica, decorrentes
da alta deslocalização no sistema π de elétrons.
Assim, o perfil diferente de mecanismo de agregação poderia acarretar
em diversas espécies agregadas, fato que pode explicar o porquê não se
observou precipitação em soluções de feofitina nas mesmas condições
experimentais da clorofila. Adicionalmente, as diferenças entre os espectros
de absorção das espécies agregadas e monoméricas podem denotar que, no
caso da clorofila, apesar da alta agregação, como a interação supostamente
se daria entre grupos aceptores (magnésio) e doadores (carbonilas), não se
teriam perturbações acentuadas nas nuvens eletrônicas da parte cromofórica;
neste caso o espectro eletrônico do agregado seria similar ao do monômero.
52
Este resultado é concordante com a observação de que ao aumentar-se
a agregação em clorofila (por aumento no teor de água ou de concentração)
não se tem banda adicional, apenas um pequeno deslocamento no
comprimento de onda relativo a máxima absorção (665 para 670 nm), ou seja,
o responsável pelo pico em 670 nm deve ser o agregado.
Já na feofitina, devido ao mecanismo de agregação depender de
interações diretas das nuvens eletrônicas da parte cromófora, que inclusive
devem afetar os momentos dipolares dos estados excitado e fundamental,
levariam a espectros de absorção de monômero e agregados diferentes, como
é a situação observada.
4.3.3. Constantes de Agregação
Dos espectros obtidos em diversas concentrações no equilíbrio químico,
objetivou-se calcular os valores das constantes de equilíbrio para o processo
de auto-agregação em cada composição de mistura de solventes estudada.
De posse dos resultados obtidos nos estudos anteriormente realizados,
inicialmente, supuseram-se agregados maiores do que dímeros, com número
de agregação qualquer; assim ter-se-ia o equilíbrio abaixo:
x M A
onde x é o número de agregação, M representa os monômeros e A, a espécie
agregada.
A partir deste equilíbrio, desenvolveu-se uma equação geral [2],
baseada no balanço de massas, que permite o cálculo da constante de
53
equilíbrio — neste caso, de agregação, Ka — e ainda fornece o valor numérico
de x.
ln [M] = 1x
1)M])ln(([Po]/[−
− - 1−xK .x ln a [2]
onde [M]: concentração de espécies monoméricas, dada pelo valor da
absorbância referente ao monômero dividida pela absortividade (ε) do
monômero e [Po]: concentração total de clorofila a (ou feofitina a).
Infelizmente não se obteve sucesso no ajuste dos dados à equação [2],
isto é, os gráficos de ln [M] versus ln (([Po]/[M]) -1)) não apresentaram
linearidade, impossibilitando a obtenção de constantes e número de
agregação por este método. Salienta-se que este método necessita de bons
ajustes para o fornecimento de valores confiáveis, uma vez que tanto x quanto
Ka estão relacionados com os coeficientes angulares e lineares de uma reta.
Adicionalmente na aplicação da metodologia acima, requer-se que apenas a
espécie monomérica absorvesse radiação no comprimento de onda utilizado,
fato que não corresponde à realidade no sistema investigado.
Posteriormente assumiu-se um equilíbrio mais simples, entre
monômeros e agregados diméricos (x = 2):
M + M D
onde a constante de equilíbrio é dada por KD, constante de dimerização.
KD = 2MD
54
Das duas equações anteriores, obteve-se a equação [3], a seguir.
AbsM = ((1+ 8Kd [Po])0,5 - 1). εM / (4Kd) [3]
onde AbsM é a absorbância referente às espécies monoméricas e εM o
coeficiente de absortividade do monômero. Neste método também se assume
a não sobreposição de bandas entre monômeros e agregados.
Os ajustes com a equação [3] foram realizados através dos gráficos de
absorbância em função da concentração total do composto (Figura 14) através
de método iterativo, no programa computacional Kaleida Graphs.
Para a clorofila a, foi possível calcular KD apenas para as soluções
contendo 20, 40 e 50% de água, situações onde as quantidades de agregados
são relativamente pequenas e o problema da sobreposição de picos é
minimizado. Os dados não se ajustaram à equação [3] para as demais
soluções água / etanol (soluções acima de 50%). Para a feofitina a, obtiveram-
se bons ajustes apenas para as soluções contendo 20 e 40% de água. Os
resultados estão presentes na Tabela 3.
Tabela 3: Valores de KD (obtidos pela equação [3]) para soluções de clorofila a e
feofitina a, a 30,0 ºC, com o coeficiente de correlação (cc) do ajuste.
% de água KD (104 L.mol-1) cc
Clorofila a 20 0,11 0,9999
0,55 0,9995
40
50 15,5 0,9954
Feofitina a 20 0,12 0,9997
40 10,6 0,9875
55
Mesmo nos casos apresentados na tabela onde os teores de água são
maiores, a qualidade do ajuste é ruim, comparada pelos valores de cc. Desses
dados pode-se apontar que, em soluções onde a quantidade de água é baixa,
têm-se majoritariamente agregados diméricos, enquanto que em meios mais
ricos em água, casos de porcentagens superiores a 50% e 40% em sistemas
com a clorofila e a feofitina, respectivamente, deve-se ter agregados maiores.
Adicionalmente, os experimentos de RLS (Figura 12) mostram que em
soluções de 20 e 40% na clorofila e 20% na feofitina não se tem sinal,
confirmando a inexistência de agregados grandes nestes meios. Outro fato a
ser mencionado é que a sobreposição de espectros de absorção (Figuras 7, 8
e 13), não exibindo ponto isosbéstico reafirma a existência de múltiplos
equilíbrios envolvendo outros estados agregados, especialmente em meios
ricos em água.
Apesar de se aplicarem outras equações para calcular as constantes de
agregação (ou de dimerização), diante da complexidade agregacional dos
sistemas estudados, não se obteve êxito, já que a grande maioria dos
métodos aplicados a derivados porfirínicos considera a dimerização como
processo único ou preponderante desconsiderando outros equilíbrios. Nos
casos investigados, verificam-se equilíbrios múltiplos envolvendo diversas
formas agregadas.
De qualquer forma, as KD calculadas aumentam nas séries com o maior
teor de água no meio (Tabela 3), dentro do esperado, e os valores encontram-
se na ordem de grandeza compatível para este processo (Paoli, 2005). Para o
caso da TFD, a agregação induz profundas alterações nas propriedades
fotofísicas dos fármacos, reduzindo a eficiência fotodinâmica (Paoli, 2005).
Entretanto, é a água o solvente mais adequado a aplicações terapêuticas (ver
discussão na seqüência).
56
4.4. Estudos em soluções aquosas de agentes tensoativos
Os estudos realizados com a clorofila a e a feofitina a em soluções
aquosas de etanol mostraram que o fenômeno da auto-agregação ocorre
mesmo em soluções com teor de água relativamente baixo. Ressalta-se que a
utilização de formulados com altas porcentagens de solventes orgânicos é
imprópria para aplicação por injeção intravenosa devido à toxicidade, ou
mesmo não muito adequada no caso de aplicação tópica, por
incompatibilidade clínica dos solventes orgânicos com superfícies corpóreas
expostas (tais como em tecidos ulcerados) devido à dor causada aos
pacientes (exemplo, o etanol). Dessa forma, uma formulação conveniente é
aquela que tem como veículo a água. Entretanto, moléculas como a clorofila e
seus derivados com cadeia fitílica (longa e apolar), devem ser preparados de
modo a evitar a agregação num dado meio.
Para se conseguir solubilizar moléculas hidrofóbicas em meio aquoso, o
uso de agentes tensoativos, ou surfactantes, que formem micelas em solução
é empregado. Os sistemas onde se tem a incorporação de moléculas
hidrofóbicas em ambientes micelares podem: (a) promover a estabilização de
fármacos no estado monomérico de maneira a ter as propriedades fotofísicas
similares à do composto em solvente orgânico; (b) facilitar a infiltração dos
fármacos pelos tecidos adiposos; (c) propiciar maior seletividade e eficiência
de entrega dos fármacos a tecidos alvos principalmente diante de interações
específicas entre as estruturas do tensoativo e de componentes do tecido
celular; (d) evitar perdas de materiais devido à baixa solubilidade; (e) adequar
a viscosidade da solução a fluídos biológicos; (f) promover alterações
localizadas de pH sem interferir na acidez de fluídos do corpo; (g) exercer
57
620 640 660 680 700 7200,0
0,1
0,2
0,3
0,4 Etanol Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)620 640 660 680 700 720
0,0
0,1
0,2
0,3 Etanol Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
atividades necróticas a microrganismos nocivos com propriedades
cooperativas do surfactante ao fármaco; etc.
Assim, estudou-se o comportamento da clorofila a e da feofitina a em
soluções aquosas de agentes tensoativos neutros e iônicos (espectros
mostrados na Figura 15). Tomou-se o cuidado de se trabalhar com tensoativos
em concentrações seguramente acima da concentração micelar crítica (CMC)
e com baixas concentrações de cromóforos, a fim de garantir a possível
incorporação das moléculas às micelas em solução.
Figura 15: Espectros da clorofila a (à esq.) e da feofitina a (à dir.), 4,42x10-6 mol L-1,
30,0 ºC em soluções aquosas de agentes tensoativos: (■) Triton X-100 1,0%
(1,55x10-2 mol L-1); (■) Tween 80 1,0% (7,63x10-3 mol L-1); (■) Pluronic F-127 2,0%
(1,59x10-3 mol L-1); (■) CTABr 1,0% (2,75x10-2 mol L-1) e (■) SDS 5,0% (1,74x10-1
mol L-1). Comparação com (■) etanol puro.
De acordo com a Figura 15, verifica-se que a clorofila a, apesar de um
pequeno decréscimo na absorbância e deslocamento de pico, aparentemente
se manteve na forma de monômeros estáveis na maior parte dos sistemas de
tensoativos, com exceção em SDS; o efeito dos tensoativos Tween 80, Triton
58
0,0 5,0x10-6 1,0x10-5 1,5x10-5 2,0x10-5 2,5x10-50,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5 Etanol Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS
Abso
rbân
cia
Concentração (mol L-1)
0,0 5,0x10-6 1,0x10-5 1,5x10-5 2,0x10-5 2,5x10-50,0
0,4
0,8
1,2
1,6 Etanol Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS
Abso
rbân
cia
Concentração (mol L-1)
X-100, Pluronic F-127 e CTABr foi praticamente o mesmo neste composto. No
caso da feofitina a, houve um decréscimo maior de intensidade na região da
banda Q indicando aparentemente uma estabilização menor; neste os
melhores resultados foram obtidos em soluções de CTABr 1,0% e Triton X-100
1,0%; apesar do maior decréscimo de intensidade, principalmente em Triton X-
100 não se observa pico adicional (região de 690 nm). Para Tween 80 e
Pluronic F-127, observou-se um alargamento da banda Q, sugerindo pequena
formação de agregados, mesmo em meio micelar.
A Figura 16 apresenta dados de absorbância, no comprimento de onda
máximo da espécie monomérica, em função da concentração de clorofila a (à
esq.) e de feofitina a (à dir.)
Figura 16: Absorbância (668 nm clorofila a, à esq.; 671 nm feofitina a, à dir.) em
função da concentração em soluções aquosas de tensoativos, a 30,0 ºC. (□) Triton X-
100 1,0% (1,55x10-2 mol L-1); (●) Tween 80 1,0% (7,63x10-3 mol L-1); (○) Pluronic F-
127 2,0% (1,59x10-3 mol L-1); (▲) CTABr 1,0% (2,75x10-2 mol L-1), (∆) SDS 5,0%
(1,74x10-1 mol L-1) e comparação com (■) etanol puro.
59
De acordo com a Figura 16, observa-se que no caso da feofitina a existe
um grande desvio entre os valores de absorbância em etanol puro e os
mesmos encontrados nas soluções aquosas de tensoativos, além disso, em
meios de Tween 80 e Pluronic F-127 foram notados tendência a picos
adicionais de agregados (Figura 15, à dir.). Desvios no valor de absortividade
molar (ε) e/ou mudanças espectrais podem ser explicados por ação do
solvente, mas estes normalmente não são grandes.
Agentes tensoativos neutros, tais como o Triton X-100, Tween 80 e
Pluronic F-127 seriam, a princípio, os mais indicados para a manutenção de
monômeros de moléculas hidrofóbicas grandes e neutras, como é o caso dos
compostos investigados, devido ao tamanho de suas micelas ser maior em
relação àquelas formadas por SDS e CTABr. Este resultado foi confirmado
para o caso de SDS e de CTABr (com feofitina a). De qualquer forma e no
geral, o tensoativo que melhor manteve os cromóforos na forma monomérica,
aparentemente, foi o Triton X-100 seguido pelo Tween 80.
4.5. Fonte de luz
Para a realização dos experimentos envolvendo luz, utilizou-se do
conjunto constituído por 6 LED’s, apresentado na Figura 17.
Figura 17: Ilustração da fonte de luz a base de LED vermelho.
60
620 640 660 680 700
0
1x105
2x105
3x105
4x105
5x105
6x105
Inte
nsid
ade
de E
mis
são
(U.A
.)
Comprimento de Onda (nm)
Figura 18: Espectro de emissão da fonte de luz a base de LED.
A Figura 18 apresenta o espectro de emissão da fonte de LED. A janela
de emissão desta (640 a 680 nm, com máximo de emissão em 665 nm)
compreende a região de absorção máxima dos compostos estudados (Figura
3, banda Q) quando estes se encontram na forma monomérica, ou seja, a
fonte de luz escolhida é totalmente adequada. Cada unidade de LED
apresentou potência aproximada de 5 mW (medida em 663 nm).
O tratamento normal em TFD utiliza fontes de radiação laser. Porém
além do alto custo, a luz é muito focalizada, dificultando o uso clínico em
lesões de diâmetros grandes. O sistema, construído de 6 LED’s, além de
barato, permite a realização de 6 experimentos simultâneos.
A fonte de LED mostrou-se eficiente e adequada para os estudos com
iluminação, tanto da parte fotoquímica com soluções em cubetas quanto de
ensaios in vitro de microrganismos (como será demonstrado nos resultados a
seguir). Adicionalmente, a junção de vários LED’s, permite supor que o
sistema pode ser empregado em tratamentos clínicos para lesões de
superfícies pouco profundas de tamanho pequeno a médio.
61
4.6. Ensaio de toxicidade frente a Artemia salina
Esse teste, um bioensaio rápido, simples e de baixo custo, permite
quantificar a letalidade de micro-crustáceos de acordo com tratamentos /
compostos. Esse ensaio tem sido usado amplamente nos estudos de
compostos com potencial atividade biológica e demonstra boa correlação com
atividade antitumoral (MacRae e Hudson, 1988; Sahpaz et al, 1994). Neste
caso, adaptou-se o ensaio para a verificação da ação fotodinâmica da clorofila
a e da feofitina a, avaliando-se a potencialidade desses compostos.
A metodologia padrão deste bioensaio consiste na contagem dos
microcrustáceos vivos em tubo após 24 horas de contato com a substância a
qual se testa a atividade. No caso, após 24 horas de contato com os reativos
químicos aqui estudados, observou-se a morte dos animais não submetidos à
luz do LED (controle avaliando a citotoxicidade intrínseca do composto ativo e
do surfactante / solvente) e com iluminação (1 hora). Assim para a ação
fotodinâmica, a contagem foi realizada duas horas após a iluminação, onde foi
possível verificar uma diferença significativa entre os tubos que receberam a
iluminação e os que não receberam.
Reações de controle averiguando-se a letalidade dos componentes das
formulações (sem o fotossensitizador) mostraram que os tensoativos CTABr,
SDS e o Triton X-100, provocam a morte das larvas, enquanto que a luz
vermelha e Tween 80 foram inertes. A figura 19, a seguir, apresenta os
resultados obtidos para os compostos avaliados em Tween 80.
62
0
20
40
60
80
100
1 5 10 50
Concentração (ug/mL)
% d
e M
orte
0
20
40
60
80
100
1 5 10 50
Concentração (ug/mL)
% d
e M
orte
Figura 19: Morte percentual média de Artemia salina para soluções aquosas a
diferentes concentrações de clorofila a (acima) e feofitina a (abaixo) em Tween 80
2% (m/v). Colunas coloridas são para amostras iluminadas/LED (1 hora).
De acordo com a Figura 19, mesmo sem iluminação a clorofila a e a
feofitina a são tóxicas para a Artemia salina. A toxicidade variou com a
concentração de composto aplicada, mas não apresentou dependência
completamente linear. Nos testes com incidência de luz por LED, o grau de
mortalidade foi notavelmente maior, ou seja, a iluminação com a fonte de LED
construída potencializou a mortandade dos organismos. O efeito é maior
quanto maior é a concentração do composto foto-ativo. Ambos
fotossensitizadores demonstraram atividade fotodinâmica.
63
S
N
NN
CH3
CH3
CH3
H3C
Cl
4.7. Ação fotodinâmica in vitro sobre culturas de microrganismos
Nas bactérias Staphylococcus aureus e Escherichia coli e na levedura
Candida albicans, infestações muito comuns e ao mesmo tempo culturas
bastante utilizadas em testes de atividade biológica, efetuaram-se
investigações preliminares com o corante azul de metileno, AM (Esquema 9).
Este, por possuir ação antimicrobiana comprovada mesmo na ausência de luz,
foi bastante útil para a criação de sistemáticas de otimização e controle
rigoroso nos procedimentos adotados, uma vez que se trata de estudos
envolvendo organismos vivos.
Nesta etapa inicial, investigaram-se as condições de crescimento celular
dos microrganismos, efetuando-se padronizações de método a fim de se obter
as culturas na concentração desejada de 108 UFC mL-1.
Esquema 9: Estrutura molecular do azul de metileno (AM).
Testes prévios demonstraram que tanto as bactérias quanto a levedura
não resistem ao etanol. Assim sendo, a utilização de solventes orgânicos para
estes ensaios biológicos foi evitada. A água é o meio ideal para solubilizar o
inóculo dos microrganismos, sendo muitas vezes utilizado como solução de
NaCl a 0,9% (soro fisiológico). No caso dos ensaios biológicos realizados com
o AM empregou-se este meio.
Os resultados confirmaram a ação antimicrobiana do azul de metileno
na ausência de luz. Esta é dependente da concentração do corante (Figura 20,
64
0 2 420
30
40
50
60
70
80
90
100
S. aureus controle 10 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 100 µg/mL
% T
rans
mitâ
ncia
(580
nm
)
Tempo (horas)0 2 4
20
40
60
80
100
+ LUZ (30 min)S. aureus controle 10 µg/mL 20 µg/mL 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL 100 µg/mL
% T
rans
mitâ
ncia
(580
nm
)
Tempo (horas)
lado esquerdo, S. aureus como exemplo). Entretanto, nas amostras que foram
iluminadas por 30 minutos com os LED’s observou-se acentuada inibição do
crescimento microbiano em todas as amostras, sendo que com 100 µg/mL de
AM a inibição foi total, ou seja, a luz vermelha potencializou a ação
fotodinâmica do corante (Figura 20, à direita).
Figura 20: Crescimento celular de S. aureus (em CMH) de acordo com o tempo de
incubação, a 37,0 ºC, para amostras com azul de metileno/água. O gráfico à
esquerda não teve aplicação de luz. À direita, representam-se as amostras que
receberam a iluminação com LED por 30 minutos.
Diante destes resultados (Figura 20), ampliaram-se os estudos com os
demais fotossensitizadores e microrganismos, incluindo-se ensaios sobre a
influência do tempo de iluminação e metodologias diferentes para acompanhar
o desenvolvimento celular, por exemplo, com a utilização de placas de Petri e
a técnica de contagem de colônias.
Com o problema do uso de solventes orgânicos e diante da
insolubilidade e tendência à auto-agregação da clorofila e da feofitina em
água, adicionou-se um agente tensoativo na formulação aquosa. A Figura 21,
a seguir, apresenta os resultados dos testes inicialmente realizados para
65
0 2 4 6
50
60
70
80
90
100
(a)
S. aureus controle Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS
% d
e Tr
ansm
itânc
ia (5
80 n
m)
Tempo (horas)0 2 4 6
50
60
70
80
90
100
(b)
E. coli controle Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS%
de
Tran
smitâ
ncia
(580
nm
)Tempo (horas)
0 2 4 6
50
60
70
80
(c)
C. albicans controle Triton X-100 Tween 80 Pluronic F-127 CTABr SDS%
de
Tran
smitâ
ncia
(580
nm
)
Tempo (horas)
verificar a influência dos agentes tensoativos no crescimento dos
microrganismos no escuro (teste de controle positivo).
Figura 21: Influência de agentes tensoativos no crescimento microbiano de S.
aureus (a); E. coli (b) e C. albicans (c); na ausência da fonte de iluminação.
Os tensoativos foram utilizados nas mesmas concentrações
empregadas para o estudo do comportamento dos fotossensitizadores quanto
à auto-agregação. De acordo com a Figura 21, verifica-se que o Tween 80 e o
Pluronic F-127, não atrapalham o crescimento celular de S. aureus, E. coli e C.
albicans. A escolha da solução de Tween 80 a 1,0% foi motivada pela maior
66
0 2 4 6
50
60
70
80
90
100
Controle sem luz com luz
% d
e Tr
ansm
itânc
ia
Tempo (horas)0 2 4 6
40
50
60
70
80
90
100
Controle sem luz com luz
% d
e Tr
ansm
itânc
ia
Tempo (horas)
semelhança da curva de mortandade desta solução com a de controle (sem
surfactantes). Os demais tensoativos (SDS, CTABr e Triton X-100) inibiram
totalmente o crescimento de S. aureus, enquanto que o Triton X-100 inibiu
parcialmente o crescimento de C. albicans e E. coli. Adicionalmente a escolha
do Tween 80 deve-se a este sistema micelar inibir satisfatoriamente a
agregação.
Nos ensaios realizados com a clorofila a e a feofitina a submetidos a
iluminação, trabalhos iniciais com concentrações baixas, na mesma faixa
daquelas utilizadas no ensaio com AM (10 a 100 µg mL-1), não exibiram ação
sobre os microrganismos. Mesmo com concentrações maiores, de 100 e 200
µg mL-1 não se teve foto-atividade frente às duas bactérias, isto é, as curvas
de crescimento celular praticamente coincidem com o controle positivo (luz
aplicada por 30 minutos). Entretanto os resultados com concentração maior,
de 300 µg mL-1 de composto e em S. aureus foram diferentes, conforme
observado na Figura 22.
Figura 22: Crescimento celular de S. aureus (em CMH) de acordo com o tempo de
incubação, a 37,0 ºC. Ensaio realizado na concentração de 300 µg mL-1, para a
clorofila a (à esq.) e para a feofitina a (à dir.).
67
Na concentração de 300 µg mL-1, novamente observa-se que para a
clorofila a não houve efeito, entretanto na feofitina a verificou-se uma pequena
ação fototóxica na inibição da reprodução celular de S. aureus, de 20,4 %
(Figura 22). No caso de E. coli, em nenhuma das concentrações trabalhadas
de ambos os fotossensitizadores observou-se ação fotodinâmica.
A literatura reporta que bactérias gram-negativas, como E. coli, são
significativamente mais resistentes a fotossensitizadores utilizados na TFD,
enquanto que bactérias gram-positivas, como a S. aureus, são mais
susceptíveis à inativação fotodinâmica (Malik et al, 1992). As diferenças
existentes entre bactérias do tipo gram-negativas e do tipo gram-positivas
consistem nas estruturas básicas da parede celular destes microrganismos.
Apesar do pequeno efeito com a feofitina em S. aureus, de um modo
geral os dois compostos não apresentaram bom desempenho frente às
bactérias. Uma das explicações pode ser relacionada à baixa proximidade
entre sítios biológicos alvos nos microrganismos e o local de geração das
espécies oxidantes ativas, ou seja, do local em que se encontra o composto
fotossensível. Sabe-se que o tempo de vida de espécies como o oxigênio
singlete em tecidos biológicos é muito pequeno, inferior a 0,04 µs, o que
restringe muito o raio de ação ao redor do seu foto-gerador (Foote et al, 1995).
Os resultados obtidos com a levedura C. albicans mostraram que nesta
a clorofila novamente não exerceu efeito, porém a feofitina a foi diferente; os
resultados são apresentados na Figura 23, a seguir. Neste caso, a feofitina
apresentou toxicidade mesmo na ausência de luz e esta foi dependente da
concentração.
De acordo com os resultados da Figura 23, a luz vermelha potencializa a
morte da levedura em 7,3; 52,4 e 63,2 %, respectivamente para as
concentrações de 100, 200 e 300 µg mL-1 de feofitina a, demonstrando um
68
0 2 4 640
50
60
70
80
90
C. albicans Controle 100 µg mL-1
200 µg mL-1
300 µg mL-1
% T
rans
mitâ
ncia
(580
nm
)
Tempo (horas)0 2 4 6
40
50
60
70
80
90
+ LUZ 30 min
C. albicans Controle 100 µg mL-1
200 µg mL-1
300 µg mL-1
% T
rans
mitâ
ncia
(580
nm
)
Tempo (horas)
bom nível de ação fotodinâmica. Em todos os ensaios, não foi possível
trabalhar com concentrações superiores a 300 µg mL-1, por questões de
solubilidade e inviabilidade em termos de dose.
Figura 23: Crescimento celular de C. albicans (em CMH) de acordo com o tempo de
incubação, a 37,0 ºC, para testes em diversas concentrações de feofitina a. À
esquerda as amostras não foram iluminadas. O gráfico à direita representa as
amostras que receberam iluminação com LED por 30 minutos.
Uma comparação com os ensaios realizados com o corante azul de
metileno (Figura 20) mostra que a eficiência da feofitina é menor, pois mesmo
com doses menores de AM atingiu-se inibição total de crescimento. Apesar
deste fato acreditamos que a feofitina a é promissora, podendo quando melhor
formulado, vir a ser um novo medicamento em TFD.
4.8. Reações de Foto-branqueamento
Diante da importância do processo de foto-branqueamento para reações
sensitizadas por cromóforos, submeteram-se as soluções dos fármacos
potenciais à iluminação com a fonte de LED, utilizando-se as 6 unidades do
69
400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Abs
orbâ
ncia
Comprimento de onda (nm)
conjunto de fonte simultaneamente por cubeta investigada. Os resultados são
apresentados na Figura 24, para o sistema clorofila a / etanol.
Figura 24: Sobreposição de espectros da clorofila a (5,00 x 10-6 mol L-1) em etanol,
obtidos a intervalos de 5 min em amostra iluminada. As setas indicam a diminuição
das bandas com a exposição contínua à luz vermelha - LED.
Observa-se na Figura 24 que ocorre intensa reação de foto-
branqueamento da clorofila a. Tomando-se o espectro inicial como referência,
calculam-se cerca de 70% de perda do composto para um tempo total de 50
minutos de iluminação. Com sua diminuição de concentração e capacidade de
absorção de luz (processo primário a TFD) compromete-se a geração de
oxigênio singlete (TFD tipo II) ou de radicais livres (TFD tipo I). Assim, o foto-
branqueamento sofrido pela clorofila a é uma das justificativas da ausência de
atividade fotodinâmica observada nesta nos ensaios in vitro sobre os
microrganismos investigados.
Uma das possíveis causas de reações de foto-branqueamento em
soluções de agentes fotossensitizadores é a possibilidade do oxigênio
70
0 20 40 60 80 1000.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45 atmosfera normal desaerado - cong/evac desaerado - N2 c/ benzotriazol
Abso
rbân
cia
(665
nm
)
Tempo (minutos)
singlete, por eles mesmos gerados, reagir com moléculas do próprio
fotossensitizador (para a clorofila a têm-se Φ∆ = 0,70 em etanol — Nynan e
Hynninen, 2004). Para uma análise quantitativa do efeito de oxigênio traçou-se
o perfil da diminuição dos valores de absorbância monitorados na banda Q da
clorofila com o tempo de iluminação em diferentes condições de
desaeramento. Dos experimentos com amostras (etanólicas e aquosas de
Tween 80), no ar ambiente e também desaeradas (com borbulhamento de N2
e/ou com o método do congelamento / desaeramento) observou-se ainda
intenso foto-branqueamento da clorofila a. Adicionalmente, trabalhou-se com
amostras contendo benzotriazol, um composto seqüestrante de oxigênio
singlete. Os resultados são apresentados na Figura 25.
Figura 25: Absorbância (665 nm) em função do tempo de iluminação com LED, de
uma solução de clorofila a, a 5,00 x 10-6 mol L-1, em etanol.
A partir dos dados apresentados na figura, verifica-se que não há
diferenças entre os perfis de decaimento na solução etanólica não desaerada
e em amostra onde se borbulhou N2 (desaeramento simples). Já na amostra
71
contendo benzotriazol verifica-se uma pequena inibição do fotobranqueamento
da clorofila e na solução desaerada pelo método do congelamento /
desaeramento a inibição do processo foi mais contundente. Conhecidamente
este método de desaeramento permite obter amostras consideradas
praticamente isentas de oxigênio.
Assim, até onde os resultados indicam, a eficiência do processo de foto-
branqueamento da clorofila a depende apenas parcialmente da presença do
oxigênio molecular na solução, apesar de seu alto Φ∆ . Neste caso o processo
ocorre apenas parcialmente via oxigênio singlete, pois esta não é única, uma
vez que o processo não foi totalmente inibido na amostra desaerada. Assim, a
fotólise deste fotossensitizador deve ter a participação de espécies
radicalares, entre outras.
Adicionalmente tentou-se determinar a ordem cinética da reação de foto-
branqueamento; no entanto, os tratamentos clássicos de primeira e de
segunda ordem não se ajustaram aos resultados. Este fato indica que o
processo deve ter mecanismo complexo e constituído por etapas consecutivas
e/ou em paralelo, uma vez que a reação tende a continuar, mesmo que mais
lentamente, após longos tempos de irradiação (Figura 25, amostra em etanol).
Por outro lado, os formulados com a feofitina a não apresentaram foto-
branqueamento com a exposição à luz vermelha, situação favorável a TFD.
Voltando-se à questão da ação fotodinâmica em microrganismos, as
diferenças nas atividades da clorofila em relação a feofitina, não podem ser
justificadas apenas pela reação de foto-branqueamento, embora exista uma
forte contribuição da mesma, justificando em parte a menor ação da clorofila.
72
300 400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abso
rbân
cia
Comprimento de Onda (nm)300 400 500 600 700 800
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Abso
rbân
cia
Comprimento de onda (nm)
4.9. Teste do Ácido Úrico
O ácido úrico (AU), um conhecido captor eficiente de oxigênio singlete,
tem sido usado como um reagente para a determinação química quantitativa
da ação fotodinâmica de compostos fotossensitizadores em TFD, nos casos
em que a produção de oxigênio singlete esta associada ao processo (Maestrin
et al, 2004). A reação de foto-oxidação do ácido úrico via 1O2 pode levar à
formação de produtos como a triuréia, a alantoxaidina, o íon oxanato e a CO2
(Canellakis e Cohen, 1955).
Assim, amostras de clorofila a e da feofitina a, irradiadas na presença de
ácido úrico com a fonte vermelha de LED (o ácido não absorve luz nesta
região), teve seus espectros de absorção obtidos a tempos de iluminação
determinados. Na Figura 26 apresentam-se os espectros obtidos.
Figura 26: Variação espectral de soluções de clorofila a (à esq.) e feofitina a (à dir.),
a 10-6 mol L-1 na presença de AU (10-4 mol L-1) em etanol, com a irradiação de luz
vermelha (LED, a cada 3 min). As setas indicam o que acontece com as bandas no
transcorrer da iluminação.
73
0 10 20 30 40
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,10
Abso
rbân
cia
(665
nm
)
Tempo (minutos)
Nos dois casos da Figura 26, observa-se o decaimento da banda
característica do ácido úrico, em 293 nm, indicando que ocorre a reação de
decomposição deste pelo 1O2 (formado pelos fotossensitizadores excitados). A
queda inicial é bastante forte devido à presença de maiores quantidades de
oxigênio molecular solubilizado no meio que, por conseguinte, levam a
grandes quantidades iniciais de oxigênio singlete.
Atenta-se para o fato de que enquanto a feofitina a novamente não sofre
foto-reação, na solução de clorofila, concomitante ao decréscimo da banda do
AU, ocorre o decaimento das suas bandas características, ou seja, a sua
reação de foto-branqueamento ocorre mesmo na presença de um forte
seqüestrante de oxigênio singlete (similar ao experimento com benzotriazol).
Entretanto, o gráfico de intensidade de absorbância da banda relativa à
monômeros de clorofila a em função do tempo de irradiação permitiu notar-se
um comportamento diferente (Figura 27).
Figura 27: Absorbância (665 nm) em função do tempo de iluminação (LED) para a
solução etanólica de clorofila a (10-6 mol L-1) contendo AU (10-4 mol L-1).
74
De acordo com a Figura 27, verificou-se uma constância inicial na
intensidade até aproximadamente 7 minutos; após esse período o
fotobranqueamento da clorofila ocorre acentuadamente. Assim a presença do
AU na solução retardou o processo de foto-branqueamento da clorofila a, fato
que não ocorreu nos testes anteriormente realizados.
No caso, o excesso de ácido úrico na solução pode fazer com que o
possível oxigênio singlete gerado no meio seja seletivo na reação, preferindo
de início reagir com o AU (alta concentração) do que com a própria clorofila,
sendo que posteriormente poderia haver participação do oxigênio reativo na
decomposição da clorofila.
Baseando-se no teste do ácido úrico, define-se uma escala de atividade
fotodinâmica (PA), que pode ser útil para a comparação da eficácia de
diferentes compostos fotossensitizadores / formulados. De acordo com a
equação [1], apresentada na seção de Materiais e Métodos, calcularam-se os
valores de PA para a clorofila a e feofitina a. Para efeitos de comparação,
aplicou-se o teste para o corante azul de metileno. Na Tabela 4 apresentam-se
os resultados.
Tabela 4: Valores de PA para a clorofila a, feofitina a e o azul de metileno em etanol,
determinados pela equação [1], teste do ácido úrico.
Fotossensitizador ∆AUA t (s) APSλirr PA
Clorofila a 0,1741 2700 0,1019 2,109
Feofitina a 0,1964 2160 0,0759 3,993
Azul de metileno 0,2684 2160 0,1115 3,715
∆AUA = variação da absorbância em 293 nm da solução após o tempo total de irradiação; t = tempo de irradiação; APSλirr = valor de absorbância do fotossensitizador na solução, no comprimento de onda de irradiação da fonte e PA = atividade fotodinâmica.
75
Apesar dessa escala ser um pouco arbitrária, a maior atividade
fotodinâmica calculada da feofitina em comparação com a clorofila, foi
coerente com os resultados nos ensaios in vitro. Em relação ao azul de
metileno e feofitina, as atividades teóricas se igualam, mas nos
microrganismos a efetividade do corante foi maior.
76
5. CONCLUSÕES
A clorofila a e a feofitina a são compostos de fácil obtenção e a custos
reduzidos, com características investigáveis para aplicação em TFD. A
identidade / estabilidade dos compostos é mantida com controle de pH do
meio. Em soluções com pH ligeiramente ácidos (abaixo de pH 5,3) a clorofila a
se transforma em feofitina a. Entretanto, em meios muito ácidos (abaixo de pH
2,0) cria-se, em equilíbrio, a sua forma dicatiônica sendo o pKa do nitrogênio
pirrólico de aproximadamente 1,1.
Devido à alta hidrofobicidade apresentada por ambas, o processo de
auto-agregação ocorre facilmente na presença de água. Os agregados
formados em misturas água / etanol são dependentes do teor de água da
mistura e das concentrações dos compostos ativos, sobretudo com relação ao
número de agregação e geometria, havendo nesses sistemas múltiplos
equilíbrios envolvendo vários agregados diferentes. A incorporação das
moléculas de clorofila a e feofitina a em micelas de agentes tensoativos como
o Tween 80 ou Triton X-100 promove a estabilidade destes compostos no
meio aquoso, onde permanecem na forma monomérica.
O sistema de iluminação à base de LED mostrou-se bastante
satisfatório, principalmente nos ensaios com microrganismos, permitindo
antever mais estudos futuros de forma otimizada e sistemática na busca de
novos princípios ativos e sistemas de formulação.
Apesar do bom desempenho da ação fotodinâmica contra a Artemia
salina, tanto a clorofila a como a feofitina a praticamente não apresentaram
ação no crescimento de S. aureus e E. coli. Este fato deve ser, no caso da
clorofila, em parte motivada pela sua forte reação de foto-branqueamento. A
feofitina, que apresentou melhor desempenho nos ensaios in vitro,
77
destacando-se uma boa ação fotodinâmica frente à C. albicans, e que, ao
mesmo tempo, demonstrou ser foto-estável, necessita de mais estudos
buscando sistemas de formulações mais eficazes, isto é, melhores
surfactantes. Neste caso, as propriedades da feofitina permitem elegê-la como
candidata potencial a princípio foto-ativo em medicamentos eficazes na TFD.
78
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