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Estudo epidemiológico e molecular dos hemangiomas de pacientes tratados no
Hospital Materno Infantil no Estado de Goiás
Camila Hamú Rafael Souto
Zacharias Calil
Camila Hamú Rafael Souto
Zacharias Calil
Estudo epidemiológico e molecular dos hemangiomas de pacientes tratados no
Hospital Materno Infantil no Estado de Goiás
Projeto a ser apresentado ao Programa de Pós-
Graduação da Universidade Federal Goiás como
requisito parcial à obtenção de vaga para ingresso
em curso strictum sensu: título de Doutor.
Goiânia
2008
TERMO DE ACEITE DE ORIENTAÇÃO
Eu,________________________________________________________, Professor
e Orientador Credenciado junto ao Programa de Pós-Graduação
em__________________________________________________ aceito orientar o(a)
Sr.(a) __________________________________________________________...
durante o seu curso de (doutorado), se a sua matrícula vier a ser efetivada pela
Comissão do Curso de Pós-Graduação em
___________________________________________________________________ .
Declaro ainda ter ciência dos Regulamentos e Normas de Admissão do Programa de
Pós-Graduação em ____________________________________________ .
Goiânia, ____... de __________________...de 2008.
Assinatura
Projeto a ser aprovado para ingresso, em ______________ /_____ /_____.,
pela banca examinadora constituída pelos professores:
_________________________________________________ Profª. Drª. – Orientadora
_________________________________________________ Prof. Dr.
_________________________________________________ Profª. Drª.
À minha família, em especial. aos meus amigos.
AGRADECIMENTOS
Aos profissionais da unidade do Hospital Maternos Infantil, pelo auxílio a ser
disponibilizado;
Aos pacientes que necessitam do tratamento contra o hemangioma, pessoas
fundamentais para a realização deste estudo. Obrigado por acreditar e participar;
à Deus, que me permitiu o acesso ao conhecimento e à oportunidade de aplicar um
pouco do que aprendi em prol de outras pessoas. Obrigado por colocar em meu
caminho pessoas as quais me orgulho muito de conviver.
Dedico este trabalho a aqueles que amam e incondicionalmente se utilizam do amor como fonte inspiradora da vida...
Àqueles que sempre buscam realizar-se em um novo amor,
assim como o autor a obra.
Rafael Souto
SUMÁRIO
RESUMO ...................................................................................................................11
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................12
1.1 Aspectos Clínicos e Genéticos dos Hemangiomas.........................................14
1.2 Fisiopatologias dos Hemangiomas..................................................................17
2 OBJETIVOS..........................................................................................................22
3 MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................23
3.1 População estudada........................................................................................23
3.2 Entrevista e coleta de material biológico.........................................................23
3.3 Avaliação da expressão gênica.......................................................................24
3.3.1 Detecção por Microarrays...............................................................................24
3.3.2 Análise de dados............................................................................................25
4 CRONOGRAMA DE ATIVIDADES.......................................................................26
5 ORÇAMENTO......................................................................................................27
5.1 Orçamento detalhado...........................................................................................27
5.1.1 Equipamentos e Material Permanente.............................................................27
5.1.2 Reagentes e Material de Consumo..................................................................28
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .....................................................................30
ANEXO.......................................................................................................................32
LISTA DE FIGURAS
1A - Figura Modificada de Chiller et.,al, 2002. Esquema numérico de localização
anatômica usado para classificar os hemangiomas...................................................15
1B - Genes a serem estudados por clusters H e P com alta similaridade de
expressão no Hemangioma........................................................................................35
1C - Referem somente aos clusters H e P com alta similaridade de expressão no
Hemangioma...............................................................................................................36
LISTA DE QUADROS
1- Modificada de Felmeden et al., 2002. As fases da angiogêneses.........................19
RESUMO
As anomalias vasculares são alterações de etiologia congênita ou adquirida, que
comprometem as estruturas vasculares, conseqüentemente a organização tissular
Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma classificação para as anomalias
vasculares baseada no comportamento biológico das lesões, correlacionando
características celulares às características clínicas e a história natural destas lesões.
Duas principais categorias foram definidas: os hemangiomas e as malformações
vasculares. Hemangiomas são neoplasias propriamente ditas, apresentando
proliferação endotelial pré-natal ou pós-natal. Apresentam crescimento acelerado
durante a infância e regressão espontânea, nunca surgindo na idade adulta.
Malformações vasculares são consideradas erros de desenvolvimento, constituídas
de vasos displásicos revestidos por endotélio quiescente; nunca involuem e
freqüentemente apresentam crescimento progressivo. A prosposta de estudo tem por
objetivo avaliar os fatores epidemiológicos, determinar a expressão dos principais
genes controladores da angiogênese, bem como as freqüências mutacionais nos
espécimes a serem estudados. A metodologia a ser disponibilizada para o alcance
das metas estabelecidas é o método de Seqüenciamento, Microarrays associado
com as análises epidemiológicas. Os resultados dependerão de uma interpolação de
dados gerados e analisados pelas diversas metodologias.
12
1.0 INTRODUÇÀO
As anomalias vasculares são alterações de etiologia congênita ou adquirida, que
comprometem as estruturas vasculares, conseqüentemente a organização tissular
(Goldenberg et al., 2001).
Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma classificação para as anomalias
vasculares baseada no comportamento biológico das lesões, correlacionando
características celulares às características clínicas e história natural destas lesões.
Duas principais categorias foram definidas: os hemangiomas e as malformações
vasculares. Hemangiomas são neoplasias propriamente ditas, apresentando
proliferação endotelial pré-natal ou pós-natal. Apresentam crescimento acelerado
durante a infância e regressão espontânea, nunca surgindo na idade adulta.
Malformações vasculares são consideradas erros de desenvolvimento, constituídas
de vasos displásicos revestidos por endotélio quiescente; nunca involuem e
freqüentemente apresentam crescimento progressivo (Mulliken & Glowacki, 1982;
Gontijo et al., 2003; Gontijo et al., 2004; Miika,2007).
A Sociedade Internacional para o Estudo de Anomalias Vasculares (ISSVA)
modificou essa classificação em 1996 e optou por dividir as lesões vasculares em
malformações vasculares (capilar, venosa, linfática, arterial e combinada) e tumores
vasculares (Miika, 2007).
Estes últimos têm como característica marcante a proliferação das células
endoteliais e são divididos em hemangioma, hemangioma congênito rapidamente
13
involutivo, hemangioma congênito não involutivo, granuloma piogênico,
hemangioendotelioma kaposiforme e angioma em tufos (Della nina et al.,2006).
Hemangioma é o tumor benigno mais comum da infância, e sua freqüência é
estimada em 10-12% das crianças durante o primeiro ano de vida. Ocorre mais
freqüentemente no sexo feminino e em prematuros, sendo observado em 23-30%
das crianças com peso ao nascimento inferior a 1.000g (Goldenberg et al., 2001;
Della nina et al.,2006). Pode ocorrer em qualquer raça, mas parece haver propensão
por pessoas de pele clara (Della nina et al.,2006). As lesões são únicas em 80% dos
casos, e as áreas mais acometidas são cabeça e pescoço (60%), tronco (25%) e
extremidades (5%) [Goldenberg et al., 2001, Della nina et al., 2006].
A aparência clínica do hemangioma varia de acordo com a profundidade de
acometimento do tumor. Os hemangiomas da infância são divididos em superficiais,
profundos e combinados. Os superficiais acometem a derme superficial e são vistos
clinicamente como lesões elevadas, bem delimitadas, de cor vermelho-vivo, com
pele normal ao redor e pouco compressíveis à palpação. Os hemangiomas
profundos acometem a derme profunda e o tecido subcutâneo, poupando a derme
papilar. Apresentam-se como nódulos da cor da pele ou azulados, compressíveis,
podendo apresentar telangiectasias em sua superfície e vasos de drenagem na
periferia (Della nina et al., 2006).
14
1.1 Aspectos Clínicos e Genéticos dos Hemangiomas
O hemangioma é um dos tumores mais comuns da mucosa bucal. Estudos em
1.308 lesões deste tipo demonstraram que a região de cabeça e pescoço é
acometida entre 50 a 60% dos casos (Della nina et al., 2006).
O hemangioma dos tecidos moles da boca é semelhante ao hemangioma da
pele: aparece vermelho ou vermelho-azulado, geralmente não se apresenta bem
circunscrito, podendo ser uma lesão plana ou elevada. Quando profundo na
cavidade bucal (tecidos moles), apresenta uma superfície lisa ou produz uma massa
nodular, mas não aparece sob forma de pólipo ou pedúnculo. A localização mais
comum é nos lábios, na língua, na mucosa jugal e no palato. É chamado de nevo
flâmeo quando seu sítio é em palato ou pele e apresenta-se de forma plana. Já na
gengiva, sua forma é nodular e de coloração vinhosa. Intra-oral, pode ainda ocorrer
na mandíbula ou maxila sob forma intra-óssea, outras localizações estão descritas
na figura abaixo (Martins da Silva et al., 2000, Chiller et.,al 2002; Taksande &
Vilhekar, 2008).
15
Histologicamente é formado por inúmeros capilares pequenos revestidos por
uma camada única de células endoteliais sustentada por tecido conjuntivo. Os
hemangiomas cutâneos podem ser classificados em capilares, cavernosos e mistos
(Martins da Silva et al., 2000).
Figura 1A. Modificada de Chiller et.,al, 2002. Esquema numérico de localização anatômica usado para classificar os hemangiomas. A lista parcial na parte B se aplica às partes A e B representando a localização anatômica que não poderia ser ilustrada (adequadamente) sobre o esquema.
16
O hemangioma capilar existe já no nascimento ou aparece durante o primeiro
mês de vida como uma lesão bem definida na face. Com freqüência, aumenta
rapidamente de tamanho e, quando submetido à palpação, pode apresentar
característica de lesão pulsátil. Usualmente, ocorre regressão espontânea que deixa
marcas, mas poderá ser necessário o tratamento cirúrgico por motivos estéticos,
fisiológicos, regressão demorada ou, até mesmo, a não regressão da lesão. Um tipo
específico, tipo moriforme, cresce rapidamente nos primeiros meses de vida, porém
80% dos casos regridem totalmente até os cinco anos de idade (Eerola et al., 2003).
O hemangioma cavernoso é menos circunscrito e tende a estender-se mais
profundamente pelos tecidos subcutâneos. Pode ocorrer nos lábios, na língua e nos
ossos. Seu crescimento é mais lento. O misto, descrito por Regezi & Sciubba, é uma
combinação de ambos, tendo proliferações de vasos com lesões definidas e áreas
difusas, podendo encontrar-se, inclusive, infiltrado nos tecidos ósseos adjacentes.
Berg e colaboradores através de seus estudos demonstraram a perda de
heterosigosidade (LOH) no hemangioma, em especificico no cromossoma 5q (17),
sugerindo que a perda de função contribui para o desenvolvimento do tumor
(Marchuk, 2001).
Estudos recentes têm demonstrado que a angiogênese é estritamente regulada
pela relação entre genes promotores e inibidores da angiogênese. Assim, sugere
que a LOH nas regiões gênicas contendo inibidores da angiogênese no cromossoma
5q pode ser um estímulo ao desenvolvimento tumoral, em analogia os hemangiomas
(Marchuk, 2001).
17
1.2 Fisiopatologias dos Hemangiomas
A formação do sistema vascular é obtida basicamente por três processos.
Durante a embriogênese ocorre a diferenciação das células embrionárias
mesênquimais (células precursoras do endotélio ou angioblastos). Estas células
precursoras são recrutadas de áreas de mesoderma adjacentes ao embrião e/ou,
originadas por divisão celular local, organizado ilhotas sangüíneas e estabelecendo
um plexo vascular primordial (vasculogenese) [Ruiter et al., 1992].
O Segundo refere-se à angiogênese na formação de novos vasos sangüíneos o
evento dá-se pelo “brotamento”, ou seja, desenvolvimento de pequenos vasos pré-
existentes no adulto e tecidos embrionários (angiogênese por brotamento) ou pela
subdivisão intravascular. O processo angiogênico é regulado por diversos fatores
ativadores incluindo o bFGF (fibroblast growth factor – basic, ou, type – 2), o VEGF-
A (vascular endothelial growth factor – Type A) além de outros membros da família
VEGF. Estes fatores interagem com as glicosaminoglicanas (GLG) e proteoglicanas,
tais como HSPG’s (Heparan Sulfate Proteoglycans) presente na matriz extracelular,
na lâmina basal e em receptores da superfície celular, regulando o crescimento, a
proliferação, a migração, a diferenciação e a sobrevivência das células endoteliais
entre uma variedade de tipos celulares (Solimene et al., 1999; Chipperfield et al.,
2002).
18
Uma hipótese atual é que sulfatos de heparana de HSPG orientam a ligação de
FGF a regiões de ligação especifica em receptores de FGF (FGFRs), formando
complexo de ativação de alta afinidade (Nuggent & Iozzo, 2000).
Os vasos que surgem podem ser transformados por processos moleculares de
ajustes finos e precisos que auxiliam na remodelagem do novo vaso. Nesse
contexto, é sugerido que polissacarídeos estruturalmente análogos poderiam ligar
fatores de crescimento a regiões específicas de receptores competentes, modulando
ou antagonizando as respostas ao formar complexos de maior afinidade do que
aqueles endogenamente mediados por sulfato de heparana.
O terceiro processo é definido com de proliferação rápida de vasos colaterais
pré-existentes. A angiogênese demonstra ser órgão específico um processo
relevante no estágio microvascular. Assim, a angiogênese parece desempenhar um
papel importante na fisiopatologia de várias doenças, recentes tentativas têm sido
feitas para utilizar o conhecimento no desenvolvimento de novas abordagens
terapêuticas. A exemplo, os inibidores de angiogênese que têm sido utilizados no
combate ao crescimento de tumores, espalhamento de metástase bem como nas
artrites reumatóides sempre que o objetivo for diminuir a infiltração das células
inflamatórias e dos mediadores solúveis (Felmeden et al., 2002).
19
Eventos Chaves da Angiogênese
Fases Eventos Chaves
Células endoteliais e ativação de pericito
Alterações morfológicas das células endoteliais conduzem para a proliferação e secreção, local vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, acúmulo de fibrina extravascular
Degradação da membrana basal
Estímulos angiogénicos resultam na degradação proteolítica da membrana vascular
Migração de células endoteliais
Factores quimiotático produzidos por fibroblastos, monócitos e plaquetas induzem a células endoteliais a migração e brotos
Proliferação de Células Endoteliais
A produção de mitôgenos locais induz a células endoteliais a síntese de DNA e consequentemente a mitose
Diferenciação de células endoteliais
A diminuição da proliferação de células endoteliais e o re-estabelecimento do contado célula-célula leva ao brotamento de estrutura no lúmen
Reconstituição da membrana basal A maturação dos vasos realizados pela reconstituição da membrana basal e sintetizada pelas células endoteliais e do pericito
Maturação vascular e estabilização Remodelação capilar por estabilização e regressão
Quadro 1. Modificada de Felmeden et al., 2002. . As fases da angiogêneses
Para melhor compreensão do complexo processo de angiogênese é
fundamental o estudo dos elementos genéticos controladores deste evento, bem
como identificar os papeis característico de genes relacionados à morfofisiologia do
processo. Assim é salutar o estudo de determinados genes como descritos
posteriormente e relacionados à proliferação, diferenciação e migração de células
endoteliais (Yu et al., 2001, Dandras et al., 2004).
A importância na atividade especifica angiogênica de VEGF e a interação de
receptores no processo de proliferação de célula endoteliais, diferenciação,
20
migração e crescimento foram consideravelmente reforçadas através de estudos em
camundongos o padrão de anormalidade observados fornecem algumas evidências
para o função de VEGF e receptores Flt-1, KDR e Flt-4, juntamente com Tie-2/Tek e
seus ligantes angiopoietinas 1 e 2 (Risau & Flamme, 1995; Berard et al., 1997; Risau
1997; Risau 1998; Yu et al., 2001, Dandras et al., 2004, Anfonsso et al., 2006).
Certamente, todos os quatro receptores são essenciais para a vasculogênese,
assim, mutações em loci de qualquer dos gene que codifica para estes receptores
leva a letalidade embrionária devido a falhas na linhagem de células hematopoiética
e endoteliais (Yu et al., 2001).
As mutações em genes que codificam para VEGF ou seus receptores tornam-se
evidentes os diferentes defeitos fenotípicos. A homozigose de genes VEGF
defectivos resultam na morte embrionária e podem favorecer o encontro de
indivíduos heterozigotos para VEGF na população (Risau & Flamme,1995; Berard et
al., 1997; Risau, 1997; Risau, 1998; Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004; Anfonsso
et al., 2006).
Existem também diferentes padrões decorrentes dos receptores mutantes. Ao
contrário KDR, Flt-1 não afecta apenas proliferação e diferenciação de células
endoteliais, mas também na construção dos vasos sanguíneos como demonstrado
por certas mutações em Flt-1 responsável por provocar letalidade embrionária
devido à inadequada associação dos vasos sangüíneos (Risau & Flamme,1995;
Berard et al., 1997; Risau, 1997; Risau, 1998; Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004;
Anfonsso et al., 2006).
21
Após inativação do gene Flt-4, a vasculogênese e angiogênese ocorre, mas os
grandes vasos sanguíneos desenvolvem de forma irregular e desorganizada levando
a alterações cardiovasculares (Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004; Anfonsso et al.,
2006).
No entanto, mutações nos genes para angiopoietina e receptores, resultam na
quebra da estrutura do vaso e funções capilares diminuída levando a hemorragias
(Yu et al., 2001).
Os resultados obtidos em estudos sugerem que na vasculogênese embrionárias,
KDR é mediado por processos que precedem Flt-1. KDR está envolvido na formação
de células endoteliais, proliferação e migração na fase inicial do vasculogênese,
enquanto Flt-1 desempenha um papel vascular embrionários na diferenciação de
células endoteliais (Risau & Flamme,1995; Berard et al., 1997; Risau, 1997; Risau,
1998; Yu et al., 2001; Dandras et al., 2004; Anfonsso et al., 2006).
Até mesmo em um estágio posterior Flt-4 está envolvida na organização de
grandes vasos linfáticos, e a emergente formação de vasos linfáticos, mas que
precede a formação angiopoietina e seus receptores (Yu et al., 2001; Dandras et al.,
2004; Anfonsso et al., 2006).
22
2.0 OBJETIVOS
- Avaliar os fatores epidemiológicos relacionados à incidência, prevalência,
mortalidade, sobrevida, cura e recidiva dos hemangiomas, sob a óptica do
tratamento que utiliza a "associação do acetato de triancinolona 40mg com o
nitrato de prata a 0,5% no tratamento dos hemangiomas e dos
linfohemangiomas por infiltração intralesional em crianças”, método
devidamente registrado no Instituto Nacional de Propriedade Industrial sob
número Pio 2000827-0;
- Determinar a expressão dos principais genes controladores da angiogênese
em pacientes diagnosticados previamente pelo corpo clínico do Hospital
Materno Infantil no Estado de Goiás com indicações clínicas de
hemangiomas, porém anterior ao tratamento que utiliza "associação do
acetato de triancinolona 40mg com o nitrato de prata a 0,5% no tratamento
dos hemangiomas e dos linfohemangiomas por infiltração intralesional em
crianças”, método devidamente registrado no Instituto Nacional de
Propriedade Industrial sob número Pio 2000827-0;
- Determinar as freqüências mutacionais dos genes controladores da
angiogênese em pacientes com hemangiomas bem como os impactos que
23
possíveis alterações venham causar no desenvolvimento da referida patologia
bem como no organismo humano.
3.0 MATERIAL E MÉTODOS
3.1- População estudada
A população a ser estudada é constituída de pacientes, advindo de diversas
regiões do Brasil, em especifico, do Estado de Goiás onde o serviço clínico de
Diagnóstico e tratamento de hemangiomas é realizado. O número determinístico de
pacientes a ser analisados poderá chegar a 950 pessoas, porém, devido aos altos
custos das análises este não ultrapassará 80 indivíduos estudados. Sendo 40
haplótipos de cada tipo de hemangiomas, plano e cavernoso.
Os pacientes serão convidados a participar do presente estudo, sendo
selecionados os pacientes ausentes de qualquer tratamento prévio e devidamente
diagnosticado com hemangiomas. A respectiva proposta de estudo será
encaminhada ao Comitê de Ética da Superintendência Leide das Neves para avaliar
os aspectos éticos e legais do estudo.
3.2- Entrevista e coleta de material biológico
As entrevistas serão realizadas pela equipe do Hospital Materno Infantil do
Estado de Goiás, durante os meses de Janeiro e dezembro de 2009, após
consentimento dos responsáveis pelas unidades, bem como dos pacientes e de
24
seus responsáveis legais. Será utilizado um questionário padronizado (em anexo), o
qual foi elaborado para obtenção dos dados sócio-demográficos dos pacientes e
fatores clínicos, famílial e genéticos dos hemangiomas.
Em seguida, a coleta de material biológico, ou seja, tecidos representativos da
lesão serão realizados pelo corpo clínico do hospital e seguirão para o
processamento e armazenamento dos fragmentos tissulares e posteriormente para
as análises genéticas moleculares. Os materiais serão alíquotados e conduzidos
para serem mantidos em cultura 37º C até a realização dos testes.
3.3 - Avaliação da Expressão Gênica
Para detectar a expressão dos genes referendados no estudo serão utilizados
a técnica de extração de Ácidos Ribonucléicos (RNA) e Retro-transcrição para
construção de cDNA (DNA complementar), em seguida, tais produtos deverão ser
encaminhados para Microarrays. Os genes a serem estudados estão descritos em
anexo nas figuras 2 e 3.
3.3.1 - Detecção por Microarrays
O RNA total será isolado de hemangioma em proliferação utilizando o
RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) seguindo as instruções do fabricantes.
Dez microgramas de RNA de cada tecido será utilizado para transcrição
reversa em cDNA marcados com [α-33P] dCTP e hibridizado separado em filtro
GeneFilter GF211 (ResGen/Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA). Padrões de
25
expressão serão reveladas por imagens fosfóricas (Cyclone,Molecular Dynamics,
Sunnyvale, CA) e analizada pelo software (ResGen/Invitrogen Corp).
3.3.2 - Análises dos dados
Os dados das entrevistas e os resultados obtidos dos microarrays serão
analisados pelo software (ResGen/Invitrogen Corp) e os dados estatísticos,
epidemiológicos pelo programa EpiInfo versão 6.04 (Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, GA). Prevalência e estimativas de risco serão calculadas com
intervalo de confiança de 95%. Fatores de risco associados ao hemangioma será
determinada pela análise univariada e análisados por regressão logística múltipla
através do programa EpiInfo 2000 (Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, GA).
26
4.0 Cronogramas de Atividades
A presente proposta de estudo poderá ser executada em 3 anos, com início em Janeiro/2009 e término previsto para
janeiro/2012. O Quadro a seguir descreve as etapas principais envolvidas na execução do projeto, indicando período provável
destinado a elas.
Etapas do Projeto 2009/ 2010/ 2011/ 2012
Pesquisa bibliográfica; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ Estudo e nivelamento de conhecimentos e condutas; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ Preparo de materiais para coleta de dados, início de treinamento do grupo e determinação dos códigos a serem usados para garantir caráter confidencial dos participantes;
♦ ♦
Aquisição do material permanente e de consumo; ♦ ♦ Organização física dos ambulatórios para a realização do projeto; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ Testes dos equipamentos utilizados para as análises dos pacientes participantes do grupo; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦
Início dos atendimentos aos pacientes participantes do grupo; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ Inicio da Realização dos Exames Laboratoriais; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ Discussão semanal sobre o andamento do projeto com seminários mensais sobre um tema relevante ao projeto; ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦
Análise estatística dos resultados obtidos no projeto; ♦ ♦ Elaboração de palestras e construção de pôsteres para a apresentação dos resultados e conclusões para a comunidade científica nacional e internacional. ♦ ♦
27
5.0 Orçamento
Elemento de Despesa Total (R$) Equipamentos e Material Permanente 198.509,00
Material de Consumo 134.940 Total (R$) 333.449,00
O quadro acima ilustra o orçamento resumido para o desenvolvimento do referido projeto.
5.1 Orçamento Detalhado
5.1.1 Equipamentos e Material Permanente
Estimativa de Custo (R$)
Quantidad
e
Discriminação
Unitário Total 01 Forno de hibridizacao
7.660,00 7.660,00
03 Camara rotatoria para forno de hibridizacao 1.568,00 4.704,00
02 Camara de hibridizacao SureHyb 848,00 1.696,00
01
Axon GenePix® 4400A Scanners Setting The Standard For High Resolution, High Uniformity, and Sample Type Flexibility
170.200,00 170.200,00
01 Câmera Digital SLR Canon EOS 450 – Rebel XSi, 12.1 Megapixels ( Corpo de Câmera e lentes )
3.200,00 3.200,00
02
Notebook Completo Dell: Processador Intel® Core™ 2 Duo T8300 (2.40 GHz, 3 MB L2 Cache, 800 MHz FSB) com 250 GB de disco rígido (7200 RPM sensor de queda livre), Placa Gráfica Nvidia GeForce® 8400M GS de 128MB (64 Bit), ram 4GB, Gravador de DVD 8X +/-RW, kit multimídia e placa de rede Dell Wireless 360 Bluetooth Interno para Windows Vista, Miniplaca 4965AGN Wireless-N sem fio da Intel , com monitor anti-reflexo LCD 15.1”, Webcam de 2.0 Megapixels e Microfone Integrado, Mouse sem fio laser, Leitor de Impressões Digitais e Software UPEK® Protector Suíte, Módulo Trusted Platform 1.2 com Software de Gerenciamento de Segurança Infineon, Windows Vista® Ultimate SP1 Original em
4.635,00 9.270,00
28
Português, McAfee Security Center 2008 com VirusScan, Anti- Spyware, Firewall, SpamKiller, Controle de Privacidade em Português - 30 dias MCFE30P
01 Impressora HP Multifuncional Color LaserJet CM1312nfi MFP
1779,00 1.779,00
Total N/A 198.509,00
5.1.2 Reagentes e Material de Consumo
Estimativa de Custo
(R$)
Quantidade
Discriminação Unitário Total
01 Kit de completo de extração de RNA e Retro-transcrição – Para p/250 testes
8.250,00 8.250,00
23 Laminas de vidro customizada – 15.000 Spots gênicos
2.000,00 46.000,00
05 Aparato de vedacao p/ câmara de hibridizacao (c/5 de 8X15K)
352,00 1.760,00
10 Reagentes p/ microarrays Quick Amp 20 reacoes
2.340,00 23.400,00
10 Cianina CTP-1 cor (20 reacoes)
2.000,00 20.000,00
02 Reagentes p/ controle "RNA Spike-In one color"
1.210,00 2420,00
10 Conj. de reag. p/ hibridação de cRNA fluorescentes
450,00 4.500,00
10 Tampao para lavagem "Gene Expression" (Buffer 2- 4L)
352,00 3.520,00
10 Solucao de lavagem e estabilizacao para microarrays
192,00 1.920,00
03 Luvas cirúrgicas descartáveis – cx c/ 1000 143,00 429,00
15 Ponteiras plásticas p/ microp. – 10 ml (4 pacotes de 50) 57,00 855,00
10 Ponteiras plásticas p/micropipeta -1000µl (10 pct. de 1000) 241,00 2.410,00
10 Ponteiras plásticas p/ microp. – 200 e 20µl (10 pct. De 1000) 241,00 2.410,00
05 Ponteiras plásticas para micropipeta - 2µl 369,00 1.845,0050 Tubos Ependorf – 2 ml 20,00 1.000,0050 Tubos Ependorf – 0.5 ml 18,00 900,0020 Tubos para PCR – US-1402-3500 114,00 2.280,0005 Tubos cônicos de plásticos c/ tampa - 15ml 158,00 790,00
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05 Tubos cônicos de plásticos c/ tampa - 50ml 158,00 790,0004 Taq DNA polimerase (1000 U), Pharmacia Biotech 400,00 1.600,0005 Tubos cônicos de plásticos c/ tampa - 50ml 158,00 790,0001 Ácido Cítrico – lL 50,00 50,0005 Ácido Bórico - 1Kg 10,00 50,0001 Citrato de Sódio – 1Kg 50,00 50,0010 Etanol – lL 10,00 100,0005 Isopropanol – lL 20,00 100,0001 Na2EDTA – 1Kg 50,00 50,0001 Iodeto de Sódio, 1Kg 220,00 220,00
01 Primers – conjunto completo para a amplificação de Genes da Angiogenese 150,00 6.000,00
10 litros Etanol (95%) 24,50 240,005 litros Éter 35,20 176,001 litro Ácido Clorídrico 35,00 35,00Total N/A 134.940
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6.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Anfosso L, Efferth T, Albini A, Pfeffer U. Microarray expression profiles of angiogenesis-related genes predict tumor cell response to artemisinins. The Pharmacogenomics Journal, (2006), 6, 269–278. 2. Berard M, Sordello S, Ortega N, Carrier J L, Peyri N, Wassef M, Bertrand N, Enjolras O, Drouet L, Plouett J. Vascular Endothelial Growth Factor Confers a Growth Advantage in Vitro and in Vivo to Stromal Cells Cultured from Neonatal Hemangiomas. American Jounial of Pathology, (1997), 4,150. 3. Chiller KG, Passaro D, Frieden IJ. Hemangiomas of infancy: clinical characteristics, morphologic subtypes, and their relationship to race, ethnicity, and sex. Arch Dermatol, (2002), 138, 1567-76. 4. Chipperfield H, Kuldip S B, Simon MC, Nurcombe V. Heparan Sulfates isolated from adult neural progenitor cells can direct phenotypic maturation. Int. J. Dev Biol, (2002), 46, 661-670. 5. Dandras S S, North P E, Bertoncini J, Mihm M C, Detmar M. Infantile hemangiomas are arrested in an early developmental vascular differentiation state. Modern Pathology, (2004), 17, 1068–1079 6. Della Nina B I, Prado de Oliveira Z N, Rivitti Machado M C M, Macéa J M. Apresentação, evolução e tratamento dos hemangiomas cutâneos – Experiência do Ambulatório de Dermatologia Infantil do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Anais Brasileiros de Dermatologia, (2006), 81(4), 323-7. 7. Eerola I, Boon L M, Mulliken J B, Burrows P E, Dompmartin A, Watanabe S, Vanwijck R, Miikka V. Capillary Malformation–Arteriovenous Malformation, a New Clinical and Genetic Disorder Caused by RASA1 Mutations. The American Society of Human Genetics, (2003), 73, 1240–1249. 8. Felmeden D C, Blann A D, Lip G Y H.. Angiogenesis: basic pathophysiology and implications for disease. European Heart Journal, (2003), 24, 586–603. 9. Goldenberg DC, Cristofani LM, Almeida MTA, Filho VO, Ferreira MC. Tratamento dos hemangiomas cutâneos. Pediatria (São Paulo), (2001), 23, 45-51. 10. Gontijo B, Silva CMR, Pereira LB. Hemangioma da infância. Anais Brasileiro Dermatologia, (2003), 78, 651-73.
31
11. Gontijo B, Silva CMR, Pereira LB. Malformações vasculares. Anais Brasileiros de Dermatologia, (2004), 79, 7-25. 12. Marchuk D A. Pathogenesis of hemangioma. The Journal of Clinical Investigation, (2001), 107 (6), 665-666. 13. Martins da Silva F, Moacir F B A, de Figueiredo P J. HEMANGIOMA. Faculdade de Odontologia de Lins / UNIMEP, (2000), 12, 57-59. 14. Miikka V. Angiogenomics: towards a genetic nosology and understanding of vascular anomalies. European Journal of Human Genetics, (2007), 15, 821–822. 15. Mulliken JB, Glowacki J. Hemangiomas and vascular malformations in infants and children: a classification based on endothelial characteristics. Plast Reconstr Surg, (1982),69,412-20. 16. Nugent M A, Iozzo R V. Fibroblast Growth factor-2. Int. J. Biochem. Cell. Biol, (2000), 32, 115-120. 17. Risau W, Flamme I. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol, (1995), 11, 73–91. 18. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature, (1997), 386, 671–4. 19. Risau W. Angiogenesis Is Coming of Age. Circulation Research, (1998), 82, 926-928. 20. Ruiter MC; De Poelmann E, Mentink, MMT; Vaniperen L; Gittenberger-de-Groot AC. The early formation of the vascular system in quail embryos. In: Development of the vascular system in the embryo. Ruiter Mc (ed) A concept of the origin of systemic-pulmonary collateral arteries. Cap 5. Koninklijk, e. Leiden, (1992), 99-186. 21. Solimene ACC, Boscardin SB, Ferraz MGC, Chammas R. Angiogenesis in solid tumors. SBOC, (1999), 1, 9-20. 22. Taksande A M, Vilhekar KY. Cavernous hemangioma of the buccal mucosa in child. Journal of Chinese Clinical Medicine, (2008), 3 (2), 95-97. 23. Yu Y, Varughese J, Brown L F., Mulliken J B., Bischoff J. Increased Tie2 Expression, Enhanced Response to Angiopoietin-1, and Dysregulated Angiopoietin-2 Expression in Hemangioma-Derived Endothelial Cells. American Journal of Pathology, (2001), 159, 6.
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ANEXOS Anexo I
Estudo epidemiológico e molecular dos hemangiomas de pacientes tratados no Hospital Materno Infantil no
Estado de Goiás
1. Unidade:___________________________________________ Unid.( )
2. Número: RC__________ Data: ___/___/_____ R ( )
3. Nome:___________________________________________________________
4. Endereço residencial
Rua: ______________________________________________________________
Bairro:________________________ Município:___________________________
Telefone para contato:_____________________
5. Idade:________________________________ Age ( )
6. Sexo: Feminino ( ) Masculino ( ) Sex ( )
7. Naturalidade:__________________________ Nat ( )
8. Estado Civil
Solteiro (1) Casado (2) Amasiado (3) Viúvo (4) Separado (5) E. Civil ( )
9. Grau de instrução
1º Grau (1) 2º Grau (2) Inst.( )
3º Grau (3) Nenhum (4)
10. Renda Familiar
≤ 1 salário (1) 2 a 5 salários (3) R. familiar ( )
6 a 10 salários (2) > 10 salários (4)
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11. Profissão: ______________________________________________________
12. Já teve alteração nas veias, artéria ou circulação diagnosticada por outro
médico?
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Hep. ( )
13. Algum caso de hemangioma na família?
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Fam. Hep. ( )
Em caso afirmativo, grau de parentesco:
Cônjuge (1) Mãe (2) Pai (3) Irmão (4) Outros (5)
14. Já recebeu tratamento anteriormente ?
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Tratament ( )
Em caso afirmativo, Qual:____________________
1 vez (1) 2 a 5 vezes (2) N. Tratament ( )
6 a 10 vezes (3) > 10 vezes (4)
15. Quando foi o primeiro tratamento ?______________ (Ano)
16. Já sofreu alguma cirurgia?
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Cir. ( )
17. A criança nasceu com a lesão relatada?
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Lesão. ( )
18. O aparecimento da lesão deu-se após o nascimento?
Não (1) Sim (2) Sem informação (9) Lesão.após ( )
19. Doença de base ou Genética :_____________________________ D.base ( )
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20. Testes laboratoriais
Anti-Fosfolípides ( )SNR ( )SR ..... Anti-fosfol. ( )
Anti trombina ( )SNR ( )SR .. Anti-trombin( )
Fibrinólise ( )SNR ( )SR Fibrinólise ( )
Fator VII ( )SNR ( )SR ... Fator VII ( )
Inibidor ativador de plasminogênio ( )SNR ( )SR I. A. Plasm.( )
21. Testes por Imagem
Rx ( )SNR ( )SR .................................... Rx . ( )
Tomografia ( )SNR ( )SR ......................... TM . ( )
Ressonância ( )SNR ( )SR ......................... RE.. ( )
22. Outros Testes
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Anexo II
Figura 1B. Modificada de Carmen M. Barne´ s*, 2005. Genes a serem estudados descritos na figura abaixo Referem somente aos clusters H e P com alta similaridade de expressão no Hemangioma.
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Figura 1C. Modificada de Carmen M. Barne´ s*, 2005. Referem somente aos clusters H e P com alta similaridade
de expressão no Hemangioma.
