ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA …

INSTITUTO PRESBITERIANO MACKENZIE FACULDADE EVANGÉLICA MACKENZIE DO PARANÁ

HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO MACKENZIE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRINCÍPIOS DA CIRURGIA

Eros Luiz de Sousa

ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA.

Curitiba 2019

2

Eros Luiz de Sousa

ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor. Orientador: Professor Dr. Osvaldo Malafaia Coordenador: Professor Dr. Osvaldo Malafaia

Curitiba 2019

3

Dados Internacionais de Catalogação na Publicaçâo (CIP) (Biblioteca da Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná) S725 Sousa, Eros Luiz de.

Estudo experimental da inibição do VEGF na regeneração hepática / Eros Luiz de Sousa. — Curitiba, 2019.

Orientador : Prof. Dr. Osvaldo Malafaia. Tese (doutorado) – Instituto Presbiteriano Mackenzie, Faculdade

Evangélica Mackenzie do Paraná, Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia, 2019.

1. Regeneração hepática. 2. Bevacizumab. 3. Fígado. I. Título.

CDD 616.362

4

Quem são esses que me olham de

longe com olhos que já foram meus?

Helena Kolody

5

AGRADECIMENTOS

• Ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia (IPEM) da

Faculdade Evangélica Mackenzie do Paraná, representado pelo

Prof. Dr. Osvaldo Malafaia, quem me orientou nessa jornada e com muito

carinho me recebeu.

• Ao Hospital Angelina Caron, representado pelo Coordenador do Centro

de Ensino e Pesquisa, Dr. João Carlos Domingues Repka, o qual

compartilhou sua sabedoria e sua vasta experiência sem restrições, com a

nobreza de um verdadeiro pesquisador.

• Ao Dr. Daniel Dantas Ferrarin, pelo apoio incondicional.

• Aos profissionais do programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia,

do Instituto de Pesquisas Médicas, Bruno e Erika pelas competência,

gentileza e disponibilidade constantes.

• Aos animais que pelas suas mortes contribuíram para promoção da vida de

outras espécies.

• Aos familiares e amigos pelo apoio.

• À CAPES pelo apoio neste estudo e na pesquisa brasileira.

6

RESUMO

Introdução: extensas ressecções e transplantes de partes do fígado são possíveis, graças

à sua capacidade regenerativa que é dependente da ativação do fator de crescimento

vascular endotelial (VEGF) o qual também regula angiogênese. O bevacizumabe (BV),

anticorpo monoclonal inibidor do VEGF é um neoadjuvante amplamente utilizado no

tratamento de cânceres restringindo a densidade microvascular, podendo causar efeitos

indesejáveis na cicatrização pós-operatória e na regeneração hepática. Objetivo: avaliar a

regeneração hepática (RH), pós hepatectomia a 70%, sob ação de uma dose (5mg/kg) de

BV num modelo experimental murino, durante 15 dias. Métodos: utilizaram-se 32 ratos

Wistar submetidos à hepatectomia parcial (HP), separados em dois grupos conforme o

tratamento controle (C) tratados com solução fisiológica e BV tratados com BV, subdivididos

conforme o tempo de observação (48 horas e 15 dias) em C48, BV48 e C15, BV15. Os

efeitos do BV na RH foram avaliados nas avaliações ponderais, função hepática (albumina,

transaminases, bilirrubinas e relação APRI). No fígado remanescente avaliaram-se atividade

mitótica, densidade microvascular (angiogênese), proliferação nuclear, histopatologia para

investigar fibrose, edema e congestão. Empregaram-se ANOVA e T-Student com p≤0,05

para as análises estatísticas. Resultados: no décimo quinto dia pós-HP e tratamento com

BV, não ocorreram diferenças nas avaliações ponderais (p=0,0691), na função hepática e

nos índices mitóticos (p=0,1576). Porém, houve diminuição na viabilidade celular

(p=0,0000), densidade microvascular (p=0,0162) e piora na ocorrência de alterações

histopatológicas como fibrose, edema e congestão hepáticas. Conclusão: a dose única de

BV, não causou, ao décimo quinto dia de evolução, alterações ponderais, bioquímicas

séricas (albumina, bilirrubinas e transaminases) e dos índices mitóticos. Contudo induziu

diminuição da densidade microvascular, viabilidade celular e alterações histopatológicas

hepáticas como edema, congestão e fibrose.

Descritores: Regeneração hepática, angiogênese, bevacizumab, VEGF, ratos Wistar.

7

ABSTRACT

Background: extensive liver resections and transplants of liver parts are possible thanks to

its regenerative capacity which is dependent on vascular endothelial growth factor (VEGF)

activation which also regulates the angiogenesis. Bevacizumab (BV), a monoclonal antibody

VEGF inhibitor, is a neoadjuvant treatment of cancers widely used, restricting microvascular

density and may cause undesirable effects on postoperative healing and liver regeneration

(LR). Objective: to determine the effect of a single dose (5mg/kg) of BV in LR. Methods: 32

rats submitted to partial hepatectomy (PH) were separated into two groups according to

saline solution (C) or BV (BV) treatment. According to the observation time (48h and 15

days) they were subdivided in C48 and BV48 and C15 and BV15 sub-groups. In LR, the BV

effects were evaluated by weight variation and liver function (albumin, transaminase, bilirubin

and APRI ratio) and in remaining liver were evaluated, mitotic activity, microvascular density

(angiogenesis), nuclear proliferation, histopathology for fibrosis, edema and congestion. For

statistical analysis, the ANOVA and T-Student test was used (of statistical significance when

p≤0.05). Results: on the fifteenth day after PH and BV treatment, there were no differences

in weight evaluations (p=0.0691), liver function and mitotic indexes (p=0.1576). However,

there was a decrease in cell viability (p=0.0000), microvascular density (p = 0.0162) and

worsening in the occurrence of histopathological changes such as liver fibrosis, edema and

congestion. Conclusion: a single BV dose, on the fifteenth day of evolution has no

significant effect in weight evolution, serum biochemical evaluations (albumin, bilirubin and

transaminases) and mitotic index. However, it induced microvascular density decreased, cell

viability and liver histopathological changes such as fibrosis, edema and congestion.

Key words: Hepatic regeneration, angiogenesis, bevacizumab, VEGF, Wistar rats.

8

LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - PROMETEU. ESCULTURA DE NICOLAS-SÉBASTIEN ADAM, 1762,

MUSEU DO LOUVRE – PARIS/ FRANÇA ............................................ 20

FIGURA 2 - ILUSTRAÇÃO ORIGINAL PROPOSTA POR FOLKMAN EM 1971 DEMONSTRANDO A ANGIOGÊNESE TUMORAL ..............................

49

FIGURA 3 - AMBIENTE CIRÚRGICO DEMONSTRANDO A MONTAGEM DA MESA CIRÚGICA...................................................................................

56

FIGURA 4 - CORTE HISTOLÓGICO (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO PELA HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS DETALHES AS FIGURAS DE MITOSES ..............................................

60

FIGURA 5 - CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL...................................................................

61

FIGURA 6 - CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL ..................................................................

62

FIGURA 7 - CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO TRICRÔMICO DE GOMORI, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO ÁREAS DE FIBROSE NOS DETALHES “A” E “B”....................................................

63

FIGURA 8 - CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS. NO DETALHE “A” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE HEMORRAGIA E INFLAMAÇÃO INTRAPARENQUIMATOSAS. NO DETLAHE ¨B¨, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE CONGESTÃO INTRAPARENQUIMATOSAS, E NO DETALHE “C” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE INTENSA PROLIFERAÇÃO DUCTAL ..........................

64

https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Nicolas-S%C3%A9bastien_Adam&action=edit&redlink=1

https://pt.wikipedia.org/wiki/Louvre

9

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO PONDERAL DOS SUB-GRUPOS ...........................................................................................

66

GRÁFICO 2 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS .........................................................................

67

GRÁFICO 3 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS ......................................

68

GRÁFICO 4 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS ...............................................................

69

GRÁFICO 5 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DO ÍNDIC APRI DOS SUB-GRUPOS ...........................................................................................

70

GRÁFICO 6 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS .....................................................

71

GRÁFICO 7 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELO ANTÍGENO NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR (PCNA) DOS SUB-GRUPOS ............................................................

72

GRÁFICO 8 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA DENSIDADE MICROVASCULAR DOS SUB-GRUPOS .........................................

73

GRÁFICO 9 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO OCORRÊNCIA DE FIBROSE NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS ......................

74

GRÁFICO 10 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS ............................

75

10

LISTA DE TABELAS TABELA 1 - DEMONSTRATIVO DA ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DO

ESTUDO E PROCEDIMENTOS REALIZADOS ............................... 55

TABELA 2 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS PESAGENS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ....................................................................

66

TABELA 3 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ................................

67

TABELA 4 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS .....................................................................

68

TABELA 5 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS

69

TABELA 6 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DO ÍNDICE DA RELAÇÃO ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS .................

70

TABELA 7 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS ......

71

TABELA 8 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA

72

TABELA 9 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS AVALIAÇÕES DA AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34 ...................................................

73

TABELA 10 - PESAGENS DOS RATOS ................................................................ 99

TABELA 11 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS PESAGENS DOS RATOS NOS TEMPOS 0, 48HORAS E 15 DIAS ...................................................

99

TABELA 12 - ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO E AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DAS MÉDIAS DE PESOS ........................................

100

TABELA 13 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 .........

110

TABELA 14 - RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS (MG/DL) ............................................................................................

110

TABELA 15 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ........................................................................................

112

TABELA 16 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE

11

BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ........................................................................................

113

TABELA 17 - RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES (mg/dl) ...............................................................

115

TABELA 18 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 ..................................................................................

115

TABELA 19 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DOS ÍNDICES ASPARTATO-AMINOTRANSFERASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15 .........................................................................

116

TABELA 20 - RESULTADOS DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES DA RELAÇÃO ASPARTATO AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ......................

117

TABELA 21 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .........

119

TABELA 22 - RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS..........

120

TABELA 23 - RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ..............................................................................................

124

TABELA 24 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS ..............................................................................................

125

TABELA 25 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .........

128

TABELA 26 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .........

129

TABELA 27 - MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE

12

RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .......................................................................

131

TABELA 28 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .......................................................................

132

TABELA 29 - EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS .......................................................................

134

TABELA 30 - RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS .........................................

135

13

LISTA DE ABREVIATURAS µg - Micrograma

µl - Microlitro

µm - Micrômetro

® - Marca Registrada ALR - Aumentador da Regeneração Hepática (Augmenter of Liver Regeneration) ALT - Alanina Aminotransferase APRI - Índice Aspartato Aminotransferase / Plaquetas AST - Aspartato aminotransferase bFGF - Fator Básico de Crescimento Endotelial Vascular BV - Bevacizumabe Ca++ - Cálcio bivalente CD31 - Clone de diferenciação 31 CD34 - Clone de diferenciação 34 CEPA - Comitê de ética em pesquisa em animais cm - Centímetro CMET - Receptor do Fator de Crescimento de Hepatócito COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal CTGF - Fator de Crescimento do Tecido Conjuntivo DNA - Ácido Desoxirribonucleico EGF - Fator de crescimento epidérmico FGF - Fator de crescimento de fibroblasto FIB - Índice de Fibrose Baseado e Quatro Fatores Flt-1 - Precursor 1 do receptor VEGF g - Grama G1 - gap 1 - Pré-síntese G2 - gap 2 - Pós-síntese GGT - Gama Glutamil-transferase GPR - Relação Gama Glutamil-transpeptidase em relação a plaquetas HAC - Hospital e Maternidade Angelina Caron HCV - Vírus da Hepatite C HE - Hematoxilina-eosina HGF - Fator de Crescimento de Hepatócitos IL - Interleucina kD - Kilo-Daltons - Unidade de massa molecular

14

kg - Quilograma Ki-67 - Antígeno Ki-67 M - Mitose MAB - Anticorpo Monoclonal MEC - Matriz Extracelular mg - Miligrama mg/kg - Miligrama por quilograma ml - Mililitro MMP - Metaloproteinases da Matriz NDAPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida NFKB - Fator Nuclear Kappa B nmol/mg - Nanomol por miligrama O2

- Oxigênio ºC - Graus Celsius ON - Óxido nítrico PAF - Fator ativador plaquetário PBS - Solução tampão fosfatos PCNA - Antígeno Nuclear de Proliferação Celular PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF - Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas pH - Potencial hidrogeniônico PHx - Hepatectomia Parcial de 2/3 PMN - Polimorfonucleares RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro ROC - Receiver Operating Characteristic RTKs - Receptores de Tirosinaquinases S - Replicação do DNA TAP - Tempo de Ativação da Protrombina TGF - Fator de crescimento transformador TGF-β - Fator de Crescimento Transformador Beta TGO - Transaminase glutâmico-oxalacética TIMPs - Inibidores Teciduais das Metaloproteinases da Matriz

TNFα - Fator de necrose tumoral alfa

TNF-α - Fator de Crescimento de Necrose Tumoral Alfa TPO - Trombopoetina TTPA - Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada VEGF - Fator de Crescimento Endotelial Vascular

15

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 17 1.1 OBJETIVO ................................................................................................................ 18 2 REVISÃO DA LITERATURA ...................................................................................... 19 2.1 A REGENERAÇÃO HEPÁTICA ............................................................................... 20 2.2 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA ....................................................... 25 2.3 ANGIOGÊNESE E VASCULOGÊNESE .................................................................. 30 2.4 FATORES DE CRESCIMENTO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA ......................... 33 2.4.1 As plaquetas e a regeneração hepática ................................................................ 33 2.4.2 A serotonina e a regeneração hepática ................................................................. 35 2.4.3 O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a regeneração hepática ..... 36 2.4.4 O fator de crescimento de hepatócito (HGF) e a regeneração hepática ............... 38 2.4.5 O fator de necrose tumoral (TNFα) e a regeneração hepática .............................. 39 2.4.6 Fator de crescimento epidérmico (EGF) e a regeneração hepática ...................... 39 2.4.7 Interleucina 6 (IL6) e a regeneração hepática ....................................................... 39 2.4.8 Fator de Crescimento de Fibroblastos Ácido (FGFα) e a regeneração hepática .. 40 2.4.9 Substância estimuladora hepática (HSS) e a regeneração hepática .................... 40 2.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HEPATECTOMIAS PARCIAIS .......................... 41 2.5.1 Anatomia do fígado de ratos .................................................................................. 41 2.5.2 Técnicas de ressecção hepática ........................................................................... 44 2.6 O BEVACIZUMABE .................................................................................................. 47 3 MÉTODO ..................................................................................................................... 55 3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ......................................................................... 55 3.2 EXPERIMENTO ........................................................................................................ 56 3.2.1 Anestesia ............................................................................................................... 57 3.2.2 Hepatectomia parcial ............................................................................................. 57 3.3 TRATAMENTOS ....................................................................................................... 57 3.4 INTERRUPÇÃO DO EXPERIMENTO E COLETA DE AMOSTRAS ........................ 58 3.5 AVALIAÇÕES ........................................................................................................... 58 3.5.1 Avaliação ponderal ................................................................................................ 58 3.5.2 Avaliações bioquímicas séricas ............................................................................. 59 3.5.2.1 Dosagem de Albumina ....................................................................................... 59 3.5.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta ................................................ 59 3.5.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-

pirúvica (TGP) ..................................................................................................... 59

3.5.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI) .......... 59

16

3.5.3 Avaliações microscópicas ...................................................................................... 59 3.5.3.1 Determinação do Índice Mitótico ........................................................................ 60 3.5.3.2 Avaliação da densidade viabilidade celular pelo antígeno nuclear de

proliferação celular (PCNA) ................................................................................ 61

3.5.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ............................................ 62 3.5.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ............................. 63 3.5.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático ............................................ 64 3.5.4 Avaliações estatísticas .......................................................................................... 65 4 RESULTADOS ............................................................................................................ 66 4.1 AVALIAÇÃO PONDERAL ......................................................................................... 66 4.2 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS SÉRICAS ................................................................. 67 4.2.1 Dosagem de Albumina .......................................................................................... 67 4.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta ................................................... 68 4.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica

(TGP) ..................................................................................................................... 69

4.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI) ............. 70 4.3 AVALIAÇÕES MICROSCÓPICAS ........................................................................... 71 4.3.1 Determinação do Índice Mitótico ........................................................................... 71 4.3.2 Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular

(PCNA) .................................................................................................................. 72

4.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 ............................................... 73 4.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ................................ 74 4.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático ............................................... 75 5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 76 5.1 O MODELO EXPERIMENTAL .................................................................................. 76 5.2 ANGIOGÊNESE E REGENERAÇÃO HEPÁTICA .................................................... 77 5.3 A VIABILIDADE CELULAR, ANGIOGÊNESE E A FUNÇÃO HEPÁTICA ................ 78 5.4 OS ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS E A REGENERAÇÃO HEPÁTICA ............. 81 5.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 84 6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 85 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 86 ANEXO ........................................................................................................................... 96 1. PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISAS EM ANIMAIS DE

LABORATÓRIO ........................................................................................................ 96

APÊNDICES ................................................................................................................... 98 1. Protocolo para pesagens de ratos ............................................................................ 98 2. Protocolo para Anestesia em ratos ........................................................................... 100 3. Procedimentos para cirurgias experimentais do laboratório da coordenação de

ensino e pesquisa do Hospital Angelina Caron - Hepatectomia parcial a 70% em ratos ..........................................................................................................................

101

17

4. Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia ............................... 105 5. Dosagem de Albumina ............................................................................................. 109 6. Dosagem de Bilirrubinas ........................................................................................... 111 7. Dosagem de amino-transaminases glutâmico-oxalacética (AST/TGO) e glutâmico-

pirúvica (ALT/TGP) ................................................................................................... 114

8. Determinação do Índice da relação aspartato aminotransferase / plaquetas (APRI) ...................................................................................................................................

116

9. Determinação do Índice Mitótico .............................................................................. 118 10. Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular

(PCNA) ..................................................................................................................... 121

11. Avaliação da densidade microvascular pelo CD34 .................................................. 126 12. Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático ................................... 130 13. Avaliação histopatológica do parênquima hepático .................................................. 133

1. Introdução

17

Os produtos biológicos e biotecnológicos têm ocupado um lugar central no

âmbito da pesquisa e do desenvolvimento terapêutico, especialmente a partir da

década de 1980, quando a farmacologia se reinventou com o surgimento de

produtos elaborados por nova rota, a biotecnológica, objetivando oferecer opções

voltadas à medicina personalizada e à terapia direcionada para células tumorais

(SILVA, SILVA e OSORIO-DE-CASTRO, 2016; VIDAL, FIGUEIREDO e PEPE,

2018).

No Brasil a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) distingue seis

principais grupos de produtos biológicos: vacinas, soros hiperimunes,

hemoderivados, biomedicamentos obtidos a partir de fluidos biológicos, tecidos de

origem animal ou a partir de procedimentos biotecnológicos, medicamentos

contendo microrganismos vivos, atenuados ou mortos e anticorpos monoclonais

(mABs). Os mABs são anticorpos derivados de um mesmo clone de linfócito B, cuja

clonagem e propagação se efetuam em linhas de células contínuas e sob elevada

sofisticação tecnológica (ANVISA). Muitos mABs são produzidos para identificar e se

ligar a antígenos específicos de certos tipos de células tumorais e exercer

citotoxicidade seletivamente sobre estas, preservando as células não tumorais,

sendo esta a grande vantagem quando comparados às terapias quimiocitotóxicas

convencionais (REICHERT e DHIMOLEA, 2012). Com o advento destes

medicamentos biológicos, a sobrevida dos doentes aumentou, influenciada também

pelo aprimoramento das técnicas cirúrgicas e das terapias sistêmicas modernas

(BILCHIK e HECHT, 2008).

Entre os biológicos aplicados na terapia anticâncer o bevacizumabe (BV), um

anticorpo da subclasse IgG1, monoclonal humanizado recombinante, com 93% de

sequência de aminoácidos de origem humana e 7% de origem murina, tem como

1. Introdução

18

alvos as isoformas do receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),

sendo assim classificado como uma droga anti-angiogênica (FOLKMAN, 1995).

O papel bem estabelecido do VEGF na promoção de angiogênese tumoral e

na patogênese de tumores humanos serviu de estímulo para que o BV, um anti-

receptor de VEGF capaz de inibir a angiogênese e consequentemente o crescimento

tumoral, passasse a ser incorporado no tratamento de pacientes, adjuvando outras

opções quimioterápicas em tratamentos pré-operatórios. Entre as indicações

cirúrgicas oncológicas no fígado, se sobressaem as ressecções de metástases em

pacientes portadores de carcinoma colorretal.

O progresso na terapia anti-VEGF revelou paulatinamente seus possíveis

efeitos adversos relacionados ao inadequado fornecimento de sangue para os

tecidos, o que levou à indicação de interrupção do seu uso antes ou depois de

intervenções cirúrgicas. No entanto, estas questões não foram ainda completamente

elucidadas para os diferentes órgãos (PAVLIDIS et al., 2010). Os efeitos da inibição

da angiogênese nos complexos fenômenos inerentes à regeneração hepática não

são bem claros (HURWITZ et al., 2004; FUH et al., 2006; MILLET et al., 2012;

AUSSILHEU et al.,2009; ZORZI et al. 2008; DUPRE et al., 2012).

Considerando que os estudos clínicos não permitem análise precisa da

regeneração hepática e a escassez de estudos experimentais neste domínio

específico, desenvolveu-se o presente estudo com o objetivo abaixo citado.

1.1 Objetivo:

Avaliar a influência da BV na dose de 5mg/kg na regeneração hepática em

ratos Wistar hepatectomizados à 70%, através dos seguintes indicadores: evolução

ponderal dos ratos, índice mitótico, angiogênese, viabilidade celular, histopatologia

do parênquima hepático e avaliação de parâmetros bioquímicos.

2. Revisão da Literatura

19

Não é surpreendente que as vias de sinalização ativadas durante a regeneração do

fígado se assemelhem fortemente às da cicatrização de feridas, observadas em outros

tecidos. A diferença com o processo clássico de cicatrização de feridas é que as alterações

observadas no fígado ocorrem em todo o órgão e que alguns dos sinais podem ser

derivados em parte da circulação periférica. Em um cenário típico de cicatrização de feridas,

a lesão do tecido resulta na ruptura das redes vasculares capilares e extravasamento de

sangue, acompanhada de liberação local de fatores de coagulação, plaquetas, fatores de

crescimento, entre outras. Este não é claramente o caso após hepatectomia a 2/3 na qual

três lobos hepáticos são removidos cirurgicamente sem danificar os dois lobos

remasnescentes.

Mesmo que não haja danos ao tecido remanescente, neste há grandes mudanças

nos padrões de fluxo sanguíneo. Há considerável literatura sugerindo que as alterações

hemodinâmicas precoces após a hepatectomia são importantes e, mesmo não havendo

extravasamento de sangue total, as alterações hemodinâmicas após a hepatectomia

induzem um espectro global de eventos em todo o fígado que se assemelha a uma resposta

cicatricial.

O componente arterial do suprimento de sangue por unidade de tecido hepático não

muda após a remoção de 2/3 do fígado, a distribuição do sangue portal por tecido unitário,

no entanto, triplica e a veia porta continua a transportar todo o fluxo do estômago,intestino,

baço e pâncreas. O fluxo integral agora precisa atravessar um leito capilar cuja seção

transversal é matematicamente até 1/3 do original, Os capilares hepáticos têm células

endoteliais fenestradas que permitem o acesso direto do plasma através das células

endoteliais aos hepatócitos (MICHALOPOULOS, 2007).


20

2.1 A REGENERAÇÃO HEPÁTICA

Desde a antiguidade, já se conhecia o fenômeno da regeneração hepática através

da tragédia grega escrita por Aeschylus, 470 a.C. Neste clássico da mitologia grega,

Prometeu, um titã, filho de Jápeto e irmão de Atlas, foi um defensor da humanidade,

conhecido por sua astuta inteligência, responsável por roubar o fogo de Héstia e o dar aos

mortais. Zeus, que temia que os mortais ficassem tão poderosos quanto os próprios deuses,

além de baní-lo o teria então punido por este crime, deixando-o amarrado a uma rocha no

Monte Cáucaso por toda a eternidade, enquanto um grande abutre comia diariamente seu

fígado (figura 1). Durante a noite o órgão sofria o processo de regeneração, o que

proporcionava ao animal fonte eterna de alimento e também, mantinha Prometeu vivo para

sua tortura eterna (PISTOI, 1996; MICHALOPOULOS, 2007; BARETTA et al., 2015).

FIGURA 1: PROMETEU. ESCULTURA DE NICOLAS-SÉBASTIEN ADAM, 1762, MUSEU DO LOUVRE – PARIS/ FRANÇA.

https://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Nicolas-S%C3%A9bastien_Adam&action=edit&redlink=1

https://pt.wikipedia.org/wiki/Louvre


21

O fígado é um dos órgãos mais complexos do corpo humano e está envolvido em

cerca de 5.000 funções. Ele tem dois suprimentos de sangue diferentes e é composto de

cinco tipos diferentes de células e uma estrutura extracelular complexa. É vulnerável a uma

grande variedade de metabólicos, tóxicos, microbianos, insultos circulatórios e neoplásicos

(BIONDO-SIMÕES et al., 2006; GODOY et al., 2006; MICHALOPOULOS, 2007; MAO e

SCOTT, 2014; BARETTA et al., 2015).

A regeneração do fígado é amplamente estudada através de um procedimento

cirúrgico que remove 2/3 da massa do fígado em roedores (ratos e camundongos), uma

técnica conhecida como “hepatectomia parcial a 2/3 (PHx)”. Devido à estrutura de múltiplos

lóbulos do fígado de roedores, três dos cinco lobos do fígado (representando 2/3 da massa

do fígado) podem ser removidos por um procedimento cirúrgico fácil, sem causar nenhum

dano tecidual aos dois lobos residuais. Os últimos crescem em tamanho para restaurar um

agregado celular equivalente à massa dos cinco lobos originais. O processo, em ratos e

camundongos, é concluído dentro de 5 a 7 dias após a cirurgia (MICHALOPOULOS, 2007).

A regeneração hepática tem início com a proliferação celular iniciada nas vinte e

quatro horas que suscedem a cirurgia. Aproximadamente no oitavo dia ocorre uma onda de

apoptose de células endoteliais, após a qual a proliferação de hepatócitos cessa. O fígado

para de crescer em 10 dias. Contudo, se uma proteína angiogênica, como VEGF ou bFGF,

é administrada sistemicamente, as células endoteliais continuam a proliferar e o fígado

continua a crescer além do seu tamanho normal, Por outro lado, se um inibidor específico da

proliferação endotelial for administrado, a regeneração hepática é evitada e o fígado

permanece a 30% do seu tamanho normal, A descontinuação do inibidor endotelial é

seguida imediatamente pela regeneração hepática completa em 10 dias (GREENE, et al.,

2003).

Estes experimentos indicam que o tecido normal e a regeneração do fígado são

controlados em parte pelo endotélio microvascular. Dada a extensão da proliferação celular

necessária para restaurar a massa original após a hepatectomia, é intuitivo que virtualmente

toda maquinaria celular seja ativada durante a regeneração e isso implica em centenas de


22

caminhos. Estes se inciam por uma ativação inicial da cascata de citocinas nas células de

Kupffer, que estimula o fator de crescimento e as vias metabólicas nos hepatócitos. Outras

células não parenquimatosas (células estreladas, células endoteliais vasculares e biliares)

proliferam após os hepatócitos, presumivelmente respondendo a outro conjunto de sinais

(RIEHLE et al., 2011).

O termo regeneração, que é amplamente aceito, significa apenas a recuperação do

volume do órgão e não a regeneração da parte perdida. O que realmente ocorre é a

hiperplasia global de todo o parênquima. Sabe-se que este é um evento que promove um

crescimento de tecido altamente ordenado e organizado até o fígado atingir o seu peso

original, com uma pequena variação entre 5 e 10% (GREENE et al., 2003; PISTOI, 2006;

BIONDO-SIMÕES et al., 2006; FAUSTO et al., 2006; GODOY et al., 2006; MAO e SCOTT,

2014; BARETTA et al., 2015).

Talvez ainda mais extraordinário do que a capacidade de proliferação dos

hepatócitos seja o fato de que essas células desempenham simultaneamente funções

essenciais para manutenção da homeostase orgânica, como regulação do nível de glicemia,

síntese de proteínas plasmáticas e fatores de coagulação, secreção biliar, ciclo da uréia e

biodegradação de compostos tóxicos (GREENE, et al., 2003; BIONDO-SIMÕES et al.,

2006; BARETTA et al., 2015; KARADENIZ et al., 2019).

Para se estudar o processo regenerativo é essencial que se entenda o ciclo celular.

Ele é constituído de quatro fases distintas: G1, S, G2 e M. A fase G1 ou gap 1 é a fase que

as células preparam a síntese de DNA, e este processo preparatório não é visível ao

microscópio ótico. A fase S se refere à síntese de DNA no ciclo celular. Durante esta fase

ocorre a replicação comossomal de DNA na célula. A fase G2 ou gap 2 é a fase onde a

célula se prepara para a mitose ou para a divisão celular física. A fase M, ou fase mitótica, é

a fase do ciclo celular mais aparente e pode ser facilmente reconhecida ao microscópio

ótico. Transpondo essas informações para a replicação dos hepatócitos, conclui-se que a

cinética da resposta proliferativa inicia-se pela síntese de DNA, que ocorre 12 a 16 horas

após a hepatectomia parcial, sendo o pico máximo observado em 24 a 26 horas após a


23

cirurgia. O aparecimento de mitoses sucede o início da síntese de DNA em seis a oito horas,

atingindo o ápice 48 horas depois da cirurgia (JESUS, WAITZBERG & CAMPOS, 2000;

PISTOI e MORELLO, 1996). Tendo em vista que dois terços do tecido hepático são

ressecados, a restauração do número original de hepatócitos requer, teoricamente, 1,66

ciclos proliferativos por hepatócito residual. Assim, a maioria dos hepatócitos nos lobos

residuais participará de apenas um ou dois eventos proliferativos (MICHALOPOULOS,

2007).

Embora o fígado seja o órgão com maior capacidade de proliferação celular, apenas

0,0012% a 0,01% dos hepatócitos sofrem mitose nos demais momentos da vida. Os

hepatócitos são células de natureza epitelial, altamente diferenciada, que raramente se

divide. Apenas um hepatócito entre 20.000 pode se dividir em algum momento, durante a

vida, sendo que essa divisão pode ocorrer no máximo, uma ou duas vezes para cada célula

Esta baixa taxa de ciclo celular em fígados saudáveis reflete em situações de agressões

hepáticas tóxicas ou ressecções cirúrgicas, quando 3% do hepatócitos sofrem mitose. O

desempenho adequado da regeneração hepática é complexo e dependente da interação de

eventos, que envolve a regulação da matriz extra-celular, espaçamento do intervalo de

junção intercelular, dissolução e ressíntese da membrana altamente especializada dos

hepatócitos, além da liberação e alinhamento de mais de 150 cromossomos, entre os quais

alguns que induzem a mitose (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000; KARADENIZ et al.,

2019).

A evolução das hipóteses referentes aos mecanismos de regeneração hepática pode

ser categorizada em três fases:

1ª) A hipótese original de que um único agente humoral poderia funcionar como uma chave,

capaz de desbloquear todos os eventos necessários para a regeneração do fígado.

2ª) A hipótese de que a ativação de uma via envolvendo múltiplos componentes poderia ser

responsável pela regeneração.

3ª) A hipótese mais recente de que a atividade de 1-3 vias múltiplas são necessárias para a

regeneração do fígado.


24

Esta última formulação ainda é uma simplificação excessiva de uma realidade mais

complexa, pois a regeneração do fígado requer a ativação de múltiplas vias, mas essas vias

não atuam independentemente umas das outras, sendo que uma proposta alternativa seria

que o circuito essencial necessário para a regeneração hepática é composto por três tipos

de vias: citocina, fator de crescimento e redes metabólicas que ligam a função hepática ao

crescimento e à proliferação celular (FAUSTO et al., 2006). Um determinante crítico do

resultado em pacientes submetidos à hepatectomia é o grau de regeneração do fígado que

ocorre após a cirurgia. Estudos em animais demonstraram que a regeneração hepática

depende do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e da angiogênese (VAUTHEY

e ZORZI, 2009).

Em estudos experimentais, as massas hepáticas ressecada e remanescentes podem

ser determinadas através da mensuração e cálculo dos pesos dos fígados através do peso

dos animais. Obviamente, este método não está disponível para a prática clínica. Entretanto,

a tomografia computadorizada e, mais recentemente, a ressonância magnética têm sido

sugeridas como alternativas viáveis para este propósito. O problema é que o peso hepático

varia muito de acordo com o depósito de lipídios, carboidratos e com a presença de células

inflamatórias. Por estas razões, o cálculo da massa do fígado como um marcador de

regeneração hepática esta confinada ao uso em estudos experimentais em animais de

laboratório e raramente representa um parâmetro sólido (ASSY e MINUK, 1997;

BERTICELLI, 2005; BARETTA et al., 2015).

As plaquetas contêm numerosos fatores de crescimento que podem contribuir

teoricamente para a regeneração hepática, havendo aparentemente um único estudo que

contraria tal expectativa, dado que não identificou qualquer correlação entre as plaquetas e

a regeneração hepática do rato, visto que esta ocorreu normalmente em condições de

trombocitopenia. Contudo, grandes avanços técnicos e uso de outras abordagens

experimentais ocorreram desde a publicação desse estudo, e vários estudos mais recentes

demonstraram que a regeneração hepática é claramente influenciada pelo número de

plaquetas (KUWASHIMA et al., 1990).


25

No ano de 2000 surgiu o primeiro artigo dirigido especificamente ao papel das

plaquetas na regeneração hepática. Desde então, os estudos experimentais com plaquetas

evidenciam que elas contribuem expressivamente para a regeneração do órgão, sendo sua

eficácia proporcional à sua quantidade na corrente sanguínea. Tais estudos identificaram

aumentos significativos na velocidade de regeneração do órgão de cobaias portadores de

trombocitose e contagem normal de plaquetas, quando comparadas com trombocitopênicos.

Ainda, alguns autores demonstraram aumento na sobrevida dessas cobaias em relação ao

último grupo (SOBRAL et al., 2016).

2.2 AVALIAÇÃO DA REGENERAÇÃO HEPÁTICA

Nos estudos realizados com hepatectomia a 70%, as provas de função hepática

permanecem dentro dos limites da normalidade. Porém, o estudo de Aguiar e colaboradores

em 2011, mostrou que houve alteração da função hepática no fígado remanescente

relacionada aos níveis de colesterol, proteínas totais, albumina e globulinas e o tempo de

ativação da protrombina (TAP). As transaminases ALT e AST, a fosfatase alcalina, a gama

glutamil transpeptidase, a glicemia, tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), bem

como a excreção de bilirrubinas, apresentaram valores dentro da normalidade.

Alguns testes bioquímicos também podem ser usados para observar o perfil

hepático, como dosagem da ALT, da AST, relação AST/ALT, gama-GT, fosfatase alcalina,

tempo de protrombina, albumina e bilirrubinas. Contudo, a doença hepática grave ainda

pode apresentar níveis normais das enzimas hepáticas, ou acarretar alterações de 1,5 a três

vezes acima dos níveis de referência (ANTONELLO et al., 2010; AGUIAR et al., 2011,

SILVA et al., 2015). A GGT é considerada como um preditor independente de inflamação

hepática moderada a grave (WU et al.,2018).

A alanina aminotransferase é o marcador sérico mais comum para avaliar a lesão

hepática. Recentemente, no entanto, o papel da ALT na previsão da inflamação do fígado


26

tem sido questionado. Alguns pacientes com doença hepática moderada identificada na

histologia podem apresentar uma ALT de nível normal. Estudos mostraram que, mesmo

quando os pacientes com ALT normal ainda podem ter risco significativamente aumentado

de doença hepática ou progressão da doença hepática. Essa reflexão foi citada por Wu e

colaboradores em 2018, quando compararam diferentes marcadores não invasivos e aplicou

o índice de fibrose baseado em quatro fatores (FIB-4), o índice de transaminase de

aspartato em relação à taxa de plaquetas (APRI), a relação gama-glutamil transpeptidase

em relação a plaquetas (GPR) e a distribuição da relação hemácias-plaquetas (RPR) foram

analisados com curvas ROC (características operacionais do receptor), para avaliar sua

capacidade de diagnosticar corretamente a inflamação do fígado. Em conclusão, o estudo

mostrou que a ALT sérica não é robusta o suficiente para diagnosticar a inflamação do

fígado. O APRI e o GPR parecem ser melhores marcadores para diagnosticar inflamação e

fibrose hepática.

Em estudo semelhante realizado por Zhang e colaboradores em 2016, onde além de

comparar métodos não invasivos, avaliaram a aplicação do método APRI e FIB-4 para

avaliar a ocorrência de fibrose grave na cirrose em pacientes infectados pelo vírus da

hepatite B, sendo que o FIB-4 ficou mais indicado para a previsão de cirrose. Concluíram

que a utilidade clínica do FIB-4 e do APRI para fibrose precisa de mais validação externa em

uma grande população antes de ser usada para predizer a fibrose em paciente com infecção

pelo vírus da hepatite B. Segundo Wai e colaboradores em 2003 o APRI é capaz de

confirmar a existência de fibrose significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível,

como alternativa, na prática clínica.

A contagem de figuras de mitoses coradas pela Hematoxilina-Eosina (HE) é um dos

parâmetros mais utilizados para avaliação da regeneração hepática por ser fácil de

reproduzir com custo baixo, e dessa forma é considerado método de referência para

estudos experimentais, porém há incovenientes como o tempo curto em que ocorre a mitose

no ciclo celular (ASSY e MINUK, 1997; SILVA et al., 2015).


27

ANDIRAN e colaboradores em 2000 utilizaram a contagem da média de mitoses

após contagem de dez campos consecutivos de grande aumento corados pelo HE, e

observaram concordância com demais resultados da literatura. Eles usaram apenas figuras

mitóticas evidentes. SELZNER e CLAVIEN, em 2000, também utilizaram a média da

contagem das figuras de mitose, por campo de grande aumento, corados pelo HE ao

avaliarem a regeneração hepática em ratos obesos.

A maioria das técnicas imuno-histoquímicas são baseadas no uso de anticorpos

contra moléculas endógenas como o Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA), o Ki-

67 e a DNA polimerase alfa, que são os métodos mais utilizados. O PCNA é uma proteína

auxiliar da DNA polimerase delta e seu peso molecular é de 36kD. Em células eucarióticas

ele é essencial para a replicação do DNA. Sua expressão é ciclo celular dependente e

começa a ser detectado ao final da fase G1. Seu pico ocorre na fase S (THEOCHARIS, et

al., 1997; GREENE, et al., 2003).

As técnicas de imuno-histoquímica são amplamente utilizadas para demonstrar

PCNA nos hepatócitos. Os espécimes de fígado são incubados com anticorpo anti-PCNA

monoclonal primário. Em seguida, são titulados com um segundo anticorpo. Estreptovidina

conjugada com hidrogênio peroxidase é aplicada e as células com PCNA positivo coram os

núcleos com coloração marrom-avermelhada. As áreas de tecido são avaliadas em aumento

de 400 vezes no microscópio ótico e são contados, randomicamente, cinco a dez campos,

aproximadamente 1000 células por secção. Núcleos fortemente corados são considerados

em fase G1 ou G2 do ciclo celular (ASSY e MINUK, 1997).

O PCNA tem como vantagens a boa correlação com outros marcadores de

proliferação celular, bem como pode ser usado em material de arquivo, possibilitando

estudos retrospectivos. As desvantagens do PCNA incluem a grande variedade de células

intralobulares, levando a super ou sub-estimativas, dependendo da zona avaliada; alteração

da intensidade da coloração quando a lâmina é exposta ao calor e a falta de consenso sobre

o que considerar positivo, qualquer núcleo corado ou somente aqueles com coloração mais

intensa (ASSY e MINUK, 1997).


28

O PCNA é método aceito e comumente usado para monitorar a atividade

regenerativa, por ser de fácil reprodutibilidade e ter seus resultados comparados aos demais

métodos de avaliação com sucesso (SELZNER e CLAVIEN, 2000). O PCNA tem meia vida

de 20 horas, explicando o porquê ele permanece positivo quando o índice mitótico já está

em declínio (THEOCHARIS et al.,1997).

Considerando que o pico da síntese de DNA ocorre em 24-48 horas, HASHIMOTO e

SANJO em 1997 mostraram aumento do PCNA com 24 horas, em estudo da regeneração

hepática de ratos submetidos à hepatectomia parcial. Estudos demonstraram que o PCNA

pode ser comparado a timedina triciada, método consagrado de avaliação da regeneração

hepática (ASSY et al.,1999)

Em 1994, THEOCHARIS et al., compararam a expressão do PCNA à incorporação

de timedina triciada e atividade da timedinaquinase após hepatectomia parcial em ratos. Os

autores encontraram estreita relação entre a incorporação da timedina e a expressão do

PCNA, sugerindo que o PCNA poderia ser usado, com segurança, como marcador de

regeneração hepática.

Dois estudos avaliando a regeneração hepática em fígados patológicos encontraram

correlação entre o resultado da coloração do PCNA quando comparado com a incorporação

de bromodeoxyuridina (BrdU) (ANDIRAN et al.,2000; SELZNER & CLAVIEN, 2000).

GAGLIO e colaboradores em 2002, mostraram a que os resultados do Ki-67, do

índice mitótico e do PCNA foram semelhantes em estudo de regeneração hepática em

modelo primata não- humano (Macaca mulata) após hepatectomia parcial.,

SELZNER e CLAVIEN (2000) relatam que há quebra no processo de regeneração

em fígados esteatóticos. Prova disso é a redução na expressão do PCNA por estes fígados,

o que indica falência na indução das proteínas do complexo polimerase necessárias para a

síntese de DNA.

Ainda nesta discussão, CORBIN e colaboradores em 2002 demonstraram a

existência de métodos não invasivos capazes de monitorar a atividade e a regeneração


29

hepáticas com igual, ou melhor, credibilidade. Eles usaram a ressonância magnética

associada à espectofotometria com fósforo marcado e compararam com métodos

convencionais de avaliação da função hepática e chegaram a resultados similares, com a

vantagem de poder ser utilizada na prática clínica.

JESUS, WAITZBERG e CAMPOS em 2000 separaram os eventos desencadeados

após hepatectomia parcial de ratos Wistar em dois períodos distintos: o período pré-

replicativo (de 0-14 horas) e o período replicativo (14-48 horas), caracterizando o processo

de regeneração. Em estudos prévios diversos autores confirmaram que o pico de mitoses

ocorre entre 24-48 horas para ratos após hepatectomia parcial. Este dado coincide com o

pico máximo da síntese de DNA nos hepatócitos detectado pela timedina triciada (PISTOI e

MORELLO, 1996; THEOCHARIS et al.,1997).

Para a avaliação da densidade vascular em um tecido, tem sido amplamente

utilizado como indicador, a marcação imunoistoquímica com o anticorpo monoclonal contra

o CD34, que é uma glicoproteína transmembranal, de cadeia única com peso molecular de

116 kDa (GUIMARÃES et al., 2013). É expresso em células imaturas progenitoras, linfóides

e mielóides do tecido hematopoético, células endoteliais capilares, fibroblastos embrionários

e raras células gliais do sistema nervoso e sua função é desconhecida. Tem maior

capacidade de destacar vasos sanguíneos e praticamente não detecta os linfáticos, sendo

expresso tanto em pequenos como em grandes vasos, com a mesma intensidade em

tecidos normais e neoplásicos. O CD34 apresenta alta especificidade, apesar de ter alguma

coloração linfática e estromal, porém, outros anticorpos marcadores podem ser usados para

identificação da microvascularização, como o anti-CD31, anti-FVIII e anti-CD105 (HASAN,

BYERS e JAYSON, 2002; SIEMERINK et al., 2012).

Nakamura e colaboradores em 2016, em estudo com transplante de células CD34 na

regeneração hepática em ratos, revelaram o aumento de células endoteliais nos fígados dos

animais que receberam as células CD34, avaliado por imunohistoquímica com marcação

para PCNA e Ki67. Além disso, fizeram a comparação dose dependente do transplante

autólogo de células CD34 com a marcação das células endotelias, afirmando o melhor


30

desempenho da regeneração hepática pelo aumento de células endoteliais, ou seja,

promoção da angiogênese. Desta forma pode-se avaliar a regeneração hepática quando se

avalia a marcação com anti-CD34 no aspecto pró-angiogênico. Observaram também

aumento das metaloproteinases (MMPs) e redução de Inibidores de MMps. Assim, é

possível considerar que uma possível diminuição da marcação de CD34 reflete na

concentração de MMps no tecido hepático, ou seja, a relação da fibrinólise é diretamente

proporcional a marcação do CD34, sendo o CD34 um marcador de amplo espectro no

estudo da regeneração hepática.

Vários estudos em modelos animais demonstram que o bloqueio do fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF) suprime a proliferação hepática após hepatectomia

parcial (AUSSILHOU et al., 2009).

Um método padrão ouro de avaliação da regeneração hepática ainda não foi

identificado. Todos os métodos apresentam vantagens e desvantagens, e ainda existe muita

discrepância entre eles. Portanto, sempre que possível, deve-se utilizar pelo menos dois

métodos diferentes para avaliar com segurança a regeneração hepática.

“...assim como toda rosa tem seus espinhos, cada método tem suas desvantagens...”

(ASSAY e MINUK, 1997).

2.3 ANGIOGÊNESE E VASCULOGÊNESE

Vasculogênese foi definida como a formação de novos vasos sanguíneos em local

onde esses não existiam. Sua formação deve-se aos estímulos e proliferação dos

angioblastos (células precursoras do endotélio), originários do mesoderma esplâncnico.

Entretanto, a angiogênese foi estabelecida como brotamento de novos vasos a partir de

células endoteliais (CE) diferenciadas a partir de um vaso pré-existente, sendo o processo

desenvolvido em duas fases: de brotamento e de maturação (YOSHIDA, 2005). A

arteriogênese é um processo que consiste no desenvolvimento da circulação colateral,


31

tendo como precursoras as anastomoses vasculares pré-existentes, que se desenvolveriam

mediante estímulos de força de cisalhamento, citocinas, moléculas de adesão, entre outras

(CONWAY, COLLEN e CARMELIET, 2001; AUSSILHOU et al., 2009).

A angiogênese ocorre naturalmente no organismo e é um mecanismo fundamental,

tanto na promoção da saúde quanto no desenvolvimento e progressão de doenças. Atua na

cicatrização de feridas, regeneração e reparo tecidual, vascularização de tecidos isquêmicos

e restabelece o fluxo sanguíneo nos tecidos após a lesão. Nas fêmeas, também ocorre

durante o ciclo reprodutivo mensal (para reconstruir o endométrio, a fim de amadurecer o

óvulo durante a ovulação) e durante a gravidez (para construir a placenta, e a circulação

entre mãe e feto). As principais etapas da angiogênese, a partir de vasos pré-existentes,

incluem a vasodilatação, que em resposta ao óxido nítrico provoca o aumento da

permeabilidade dos vasos preexistentes, induzidos pelo fator de crescimento endotelial

vascular (VEGF). A seguir ocorre a degradação proteolítica da membrana basal do vaso

original pelas metaloproteinases da matriz extracelular e o rompimento do contato célula-

célula entre as células endoteliais, pelo ativador do plasminogênio. Posteriormente ocorre a

migração das células endoteliais em direção ao estímulo angiogênico, seguida pela

proliferação e maturação das células endoteliais e das células migratórias. Por fim, ocorre a

inibição do crescimento e remodelagem em tubos capilares e o recrutamento de células

periendoteliais (pericitos e células musculares lisas vasculares) para estabilizar o novo vaso

sanguíneo (FOLKMAN, 1995; CARMELIET, 2004; CARMELIET, 2006; ADAMS e ALITALO,

2007; KERBEL, 2008; ROLAND et al., 2009; SOYSAL et al., 2014).

A angiogênese é uma resposta à lesão hepática que leva ao remodelamento

sinusoidal e com outros eventos reestabelecem a matriz extra-celular (MEC).

Consequentemente, muitos potentes mediadores angiogênicos estão envolvidos na

resposta exagerada da cicatrização de feridas à lesão crônica do fígado, levando a um

acúmulo excessivo de matriz extra-celular (MEC). A MEC também pode afetar indiretamente

a função celular liberando citocinas. Estes incluem fator de crescimento transformador β

(TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento de


32

hepatócitos (HGF), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), fator de necrose

tumoral α (TNF-α), fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF) e fator de

crescimento endotelial vascular (VEGF). A fibrose hepática é um processo dinâmico que

resulta de um desequilíbrio entre a produção e a dissolução da matriz extracelular. O

desenvolvimento de fibrose hepática é orquestrado por muitos tipos de células, incluindo

células estreladas hepáticas. O remodelamento da MEC é fundamental na preservação da

homeostase durante a regeneração hepática. Essa homeostase depende do equilíbrio entre

as metaloproteinases da matriz (MMPs) e seus inibidores teciduais (TIMPs) (ELPEK, 2014).

A compreensão das angiogêneses normal e anormal é necessária para desenvolver

estratégias terapêuticas para combater patologias e estudar a regeneração. Uma vez que a

angiogênese envolve a migração/invasão de células endoteliais para o estroma e ou tecidos

circundantes, proteases, tais como as metaloproteinases da matriz, são criticamente

importantes. Entretanto, há algum tempo ficou claro que o(s) papel(is) das MMPs na

angiogênese é mais complexo do que simplesmente degradar a matriz extracelular (MEC)

para facilitar as células endoteliais invasoras. Várias MMPs também são necessárias para

liberar fatores pro-angiogênicos sequestrados pela MEC, processar fatores de crescimento e

receptores, incluindo integrinas e receptores de adesão, e para gerar compostos

antiangiogênicos endógenos. A MEC atua como um compartimento de sequestro /

armazenamento de fatores de crescimento angiogênico, como o VEGF, o FGF básico

(bFGF) e o TGF1, que podem ser liberados pela degradação proteolítica da MEC. Embora a

degradação dos componentes da MEC para abrir uma avenida para a migração de células

endoteliais seja um requisito essencial para as MMPs na angiogênese, as MMPs contribuem

de muitas maneiras para os processos pró e antiangiogênicos. Na angiogênese, há um

equilíbrio rigidamente controlado entre a sinalização do fator angiogênico, atividade /

sinalização de MMP, inibidores de angiogênese endógena e inibidores de MMP. Isso pode

explicar perfis de fibrose em distúrbios angiogênicos, visto não haver equilibrio (FOLKMAN,

2003; OH et al., 2004; RUNDHAUG, 2005).


33

2.4 FATORES DE CRESCIMENTO NA REGENERAÇÃO HEPÁTICA

Vários fatores de crescimento estão envolvidos na estimulação do fígado para

regeneração, por exemplo, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento

epidérmico (EGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento

derivado de plaquetas (PDGF). Vários investigadores identificaram o TGF-β1 como o

principal inibidor da regeneração hepática. O conceito atual é que existem redes mediadas

por citocinas e fatores de crescimento que promovem a regeneração de vários tipos de

células intra-hepáticas. Muitos fatores relacionados à regeneração hepática foram

extensivamente estudados, entre os quais a serotonina e as plaquetas fizeram

recentemente avanços. A integração precisa de fatores de crescimento é necessária para a

regeneração completa e sincronizada. A falha em ativar essas cascatas de sinalização pode

resultar em atraso do início da regeneração, recuperação inadequada do volume do fígado

e, eventualmente, sinais clínicos de insuficiência hepática (CLAVIEN et al., 2008; IBRAHIN

et al., 2019).

2.4.1 As plaquetas e a regeneração hepática

Nos últimos cinco anos, vários índices não invasivos foram propostos para prever o

grau de fibrose na hepatite viral. O índice relacionado entre a razão de plaquetas com a

aspartato aminotransferase (APRI) apresenta alto grau de precisão na identificação de

presença de fibrose e cirrose significativa em pacientes com hepatite C crônica

(LAMBERTUCCI, SILVA e ANTUNES, 2007). O teste APRI é capaz de confirmar a

existência de fibrose significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível, como

alternativa, na prática clínica (AMARAL, et al., 2007; ANTONELLO et al., 2010; DERBALA

et al., 2015). Os resultados do estudo de DERBALA e colaboradores em 2015 sugerem que

os marcadores bioquímicos/hematológicos não invasivos como o APRI são sensíveis e

específicos no diagnóstico do grau de fibrose e cirrose em pacientes com coinfecção do

HCV e esquistossomose, em comparação com a biópsia.


34

As plaquetas são partículas discóides não nucleadas que são essenciais para a

hemostasia e a trombose. Além da coagulação, as plaquetas contribuem para a reação

inflamatória após muitas formas de lesão tecidual. O fígado e as plaquetas exibem uma

interconexão muito íntima, embora complexa. O fígado desempenha um papel crítico

durante a síntese de plaquetas de megacariócitos por meio da trombopoietina (TPO). A

TPO, o fator de crescimento hematopoiético mais importante na regulação do

desenvolvimento de megacariócitos e produção de plaquetas, é produzido principalmente no

fígado e rim. Portanto, não se espera que as plaquetas funcionem adequadamente nas

alterações hepáticas (ROZMAN e BOLTA, 2007; CLAVIEN, 2008).

Várias proteínas que induzem efeitos opostos na regeneração hepática estão

presentes nas plaquetas. Por exemplo, as plaquetas abrigam importantes fatores de

crescimento para a execução da regeneração hepática como o HGF. Por outro lado, as

plaquetas contêm TGF-α que é necessário para o término da regeneração hepática. Assim,

é plausível que as plaquetas possam participar da orquestração da regeneração hepática

por meio de estimulação harmonizada e inibição de sinais relacionados ao crescimento

(CLAVIEN, 2008; PIETRAMAGGIORI et al., 2010).

Até 2006, não estava claro se as plaquetas seriam promotoras, inibidoras ou até

mesmo ativas na regeneração hepática. Estudos in vitro demonstraram que as plaquetas

contêm vários fatores de crescimento, que podem, teoricamente, contribuir para o processo

de regeneração hepática. No entanto, o único estudo in vivo sobre o papel das plaquetas na

regeneração hepática em ratos não identificou uma correlação entre as plaquetas e a

regeneração hepática (ROZMAN e BOLTA, 2007).

Com a formação do coágulo durante a cicatrização, as plaquetas fornecem um

arcabouço temporário para o crescimento de células e modulam a angiogênese, através de

uma série complexa e indefinida de eventos mediados por fatores de crescimento e células.

O proteoma de plaquetas é rico em vários fatores pró-angiogênicos e anti-angiogênicos.

Descobertas recentes de que fatores pró-angiogênicos e antiangiogênicos são liberados das

plaquetas de maneira seqüencial podem explicar como as plaquetas afetam a angiogênese


35

e a cicatrização de feridas. Plaquetas quiescentes têm um papel crucial na estimulação da

angiogênese e proliferação celular na cicatrização (PIETRAMAGGIORI et al., 2010)

Em estudo sobre a regeneração do fígado em ratos, observou-se que a

esplenectomia aumenta a contagem de plaquetas e acelera a regeneração do fígado por

meio de um mecanismo pouco claro. Num segundo passo, esgotaram as plaquetas para

menos de 5% aplicando um anticorpo específico para plaquetas. Após 70% da ressecção

hepática, esses ratos exibiram uma regeneração hepática significativamente comprometida,

sugerindo que um fator contido nas plaquetas pode ser necessário para induzir ou manter a

regeneração hepática (LESURTEL et al., 2006). Em outro estudo, camundongos

trombocitóticos exibiram aumento da regeneração do fígado, enquanto um grupo

trombocitopênico mostrou regeneração prejudicada (MURATA et al., 2007).

Matsuo e colaboradores em 2008 relataram que o contato direto entre plaquetas e

hepatócitos é necessário para o efeito proliferativo. Esses autores concluíram que o contato

plaqueta-hepatócito inicia a transdução de sinal envolvido na ativação do fator de

crescimento. HGF, VEGF e fator de crescimento semelhante à insulina foram encontrados

nas plaquetas e contribuem principalmente para a proliferação de hepatócitos. Murata e

colaboradores em 2008 demonstraram que as plaquetas promovem a regeneração hepática

mesmo sob condições de depleção de células de Kupffer, estimulando o HGF.

2.4.2 A serotonina e a regeneração hepática

O papel substancial da serotonina como neurotransmissor no sistema nervoso

central, como um hormônio local no sistema vascular periférico e no trato gastrointestinal e

como um mediador da conexão cérebro-intestino, está bem estabelecido. Com relação ao

fígado, vários estudos já focaram a atenção no notável impacto da serotonina na perfusão

microvascular hepática, no diâmetro dos sinusóides hepáticos, na adesão de plaquetas e

leucócitos ao endotélio sinusoidal, na isquemia hepática, lesão por reperfusão e aloenxerto

de células tumorais no fígado.


36

A serotonina está presente em alta concentração nas plaquetas, onde se acumula a

partir do plasma através de um sistema de transporte ativo (CLAVIEN et al., 2008). Estudos

de Lesurtel e colaboradores em 2006, citados em Rudell, Mann e Ramm em 2008,

identificaram as plaquetas como a principal fonte de serotonina que impulsiona a

regeneração hepática em camundongos hepatectomizados.

Há uma grande variedade de isoformas de receptores de serotonina distribuídas nos

neurônios entéricos, células do músculo liso gastrointestinal e possivelmente em enterócitos,

tecidos imunes e hepatócitos (BONHAUS et al., 1995). Entre eles, sete tipos de receptores

de serotonina foram identificados por Barnes e Sharp em 1999.

2.4.3 O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e a regeneração hepática

O macrófago ativado é a principal célula efetora do processo de reparo tecidual,

degradando e removendo componentes do tecido conjuntivo danificado, como colágeno,

elastina e proteoglicanas. Além desse papel na fagocitose de fragmentos celulares, os

macrófagos também secretam fatores quimiotáticos que atraem outras células inflamatórias

ao local da ferida e sintetizam prostaglandinas, que funcionam como potentes

vasodilatadores, afetando a permeabilidade dos microvasos. Os macrófagos produzem

vários fatores de crescimento, tais como o PDGF, o TGF-β, o fator de crescimento de

fibroblastos (FGF) e o VEGF (SANTOS e CLARK,1999).

O gene VEGF-A humano está organizado em oito exons. Splicing alternativo

(remoção dos introns de uma molécula de RNA pré-mensageiro) de exons resulta na

geração de quatro isoformas principais de VEGF, possuindo, respectivamente, 121, 165,

189 e 206 aminoácidos após a clivagem da sequencial, respectivamente VEGF121,

VEGF165, VEGF189 e VEGF206. O VEGF165 é a isoforma predominante o qual é

segregado, mas uma fração significativa permanece ligada à superfície celular e à matriz

extracelular, em virtude das suas propriedades de ligação à heparina. Existem muitas

evidências para indicar que o VEGF165 é a isoforma fisiologicamente mais relevante. A

atividade característica do VEGF é a capacidade de promover o crescimento de células


37

endoteliais vasculares derivadas de artérias, veias e até linfáticos. O VEGF é essencial para

a vasculogênese e angiogênese embrionária normal, de tal forma que a inativação de um

único alelo de VEGF em camundongos resulta em letalidade embrionária. Existem duas

tirosina-quinases receptoras de VEGF (RTKs), Flt-1, conhecidas também como VEGFR-1 e

KDR, Flk-1 ou VEGFR-2. Concorda-se de que o VEGFR-2 é o principal mediador dos efeitos

mitogênicos, angiogênicos e de melhoramento da permeabilidade do VEGF (FERRARA,

HILLAN e NOVOTNY, 2005; FOLKMAN, 2007; TADO et al., 2014; SHANG et al., 2018).

O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um estimulante primário da

angiogênese e é uma proteína quimiotática de macrófagos. A inibição do VEGF é benéfica

em combinação com quimioterapia para alguns pacientes com câncer de mama. No entanto,

o mecanismo pelo qual a inibição do VEGF afeta o crescimento do tumor parece envolver

mais do que seu efeito sobre as células endoteliais (ROLAND et al., 2009; SHANG et al.,

2018).

O VEGF aumenta a permeabilidade vascular e esta propriedade sustenta papéis

importantes dessa molécula na inflamação e em outras condições patológicas (FERRARA,

HILLAN e NOVOTNY, 2005). O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um dos

principais atores da angiogênese. O bloqueio da atividade do VEGF usando anticorpos

específicos ou outras entidades proteicas para prevenir a ligação e a sinalização do VEGF

através de seus receptores tem sido uma das muitas abordagens para reduzir o crescimento

do tumor. O Bevacizumabe, um anticorpo que se liga ao receptor de VEGF humano com

alta afinidade, foi aprovado para o tratamento de pacientes com câncer colorretal (FUH

et al., 2006; AUSSILHOU et al., 2009).

A ativação da proliferação e angiogênese pelo VEGF é essencial para a regeneração

do fígado e reparo de órgãos, ambos dependentes do suprimento de sangue para os

hepatócitos. A onda inicial de proliferação hepática é seguida pela proliferação de células

endoteliais e penetração de ilhas hepatocelulares avasculares levando à formação de novos

sinusóides (BÖNNINGHOFF et al., 2012).


38

2.4.4 O fator de crescimento de hepatócito (HGF) e a regeneração hepática

O HGF injetado sistemicamente é absorvido principalmente pelo fígado. A injeção de

HGF na veia porta de ratos e camundongos normais causa a proliferação de hepatócitos e o

aumento do fígado. A reserva intra-hepática de HGF é consumida durante as primeiras três

horas após a hepatectomia parcial, seguida de nova síntese de HGF. O HGF exerce um

efeito mitogênico direto nos hepatócitos. O receptor de HGF hepático é ativado 30 a 60

minutos após a hepatectomia parcial (CLAVIEN, 2008).

O HGF está presente na matriz hepática em quantidades relativamente grandes,

como também é encontrado na matriz de outros órgãos, como pulmões, baço, placenta,

cérebro, etc. O HGF injetado sistemicamente é sequestrado pelo fígado mais do que

qualquer outro órgão. A eliminação genética do HGF ou seu receptor (cMet) está associada

à letalidade embrionária envolvendo anormalidades em muitos órgãos, principalmente na

placenta (MICHALOPOULOS, 2007; CLAVIEN et al., 2007).

O HGF foi implicado como envolvido na regeneração do fígado pelas seguintes razões:

1ª) Os níveis de HGF no plasma aumentam 10 a 20 vezes após a PHx .

2ª) O HGF ativo é consumido a partir de reservas intra-hepáticas nas primeiras 3 h após a

PHx, seguido por nova síntese de HGF de 3 a 48 h (PEDIADITAKIS et al., 2001)

3ª) O HGF causa uma forte resposta mitogênica e expansão clonal de hepatócitos em

cultura (BLOCK et al., 1996).

4ª) A injeção de HGF na veia porta de ratos e camundongos normais causa proliferação de

hepatócitos e aumento do fígado (PATIJN et al., 1998).

5ª) O receptor do HGF do fígado (cMet) é ativado pela fosforilação da tirosina entre 30 e 60

minutos após a PHx (STOLZ et al., 1999).

6ª) A eliminação genética direcionada do cMet do fígado é associado com regeneração

muito deficiente ou ausência de resposta (BOROWIAK et al., 2004; MONGA et al.,

2002).


39

2.4.5 O fator de necrose tumoral (TNFα) e a regeneração hepática

Esta é uma proteína conhecida por ter uma variedade de efeitos em muitas células e

tecidos. Ao contrário do que o nome indica, o TNFα pode frequentemente ter efeitos pró-

mitogênicos nas células, dependendo das condições que regulam a ativação do fator

nuclear Kappa B (NFkB) (KIRILLOVA et al, 1999). Se as condições favorecerem a ativação

do NFkB, então o TNFα pode potencializar outros sinais de crescimento administrados

concomitantemente. Alternativamente, se a ativação do NFkB não pode ser mediada pelo

TNFα, então o TNFα pode desencadear uma resposta apoptótica. Anticorpos contra o TNFα

administrado no momento da hepatectomia diminuem a resposta regenerativa.

Camundongos com deleções genéticas do receptor 1 do TNFα (TNFR1) têm resposta lenta

e deficiente após PH. Anticorpos contra o TNFα administrado no momento da hepatectomia

diminuem a resposta regenerativa (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000;

MICHALOPOULOS, 2007).

2.4.6 Fator de crescimento epidérmico (EGF) e a regeneração hepática

Experiências em ratos sugeriram que o EGF pode estar envolvido na regeneração do

fígado. A remoção cirúrgica de glândulas salivares, onde o EGF está presente em altas

concentrações, ou a ligadura de suas veias de drenagem diminui significativamente o pico

de síntese de DNA após hepatectomia parcial e resulta em comprometimento da

regeneração hepática. A injeção exógena de EGF compensa os efeitos da ablação da

glândula salivar e restaura a regeneração hepática. O EGF é normalmente fornecido pelas

glândulas de Brunner do duodeno através da circulação portal para ser depositado na matriz

portal (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000; CLAVIEN et al., 2007; CLAVIEN 2008).

2.4.7 Interleucina 6 (IL6) e a regeneração hepática

Existe abundante literatura documentando o papel crucial da IL6 no início da

resposta de fase aguda nos hepatócitos. A IL6 é produzida por macrófagos hepáticos. Os


40

ratos deficientes em IL6 têm uma regeneração hepática deficiente. Isto foi associado com

ativação deficiente de Stat3(signal transducers and activators of transcription 3) . Outros

estudos mostraram, no entanto, que a regeneração do fígado nesses camundongos é

essencialmente normal, embora haja diminuição da ativação do Stat3 (SAKAMOTO et al.

1999; JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000).

A IL6 não é um mitógeno direto para hepatócitos e não aumenta o efeito mitogênico

de outros fatores de crescimento. É, no entanto, um mitógeno direto para as células biliares

(LIU et al. 1998) e tem efeitos importantes sobre a integridade da árvore biliar intra-hepática

regulando a produção de pequenas proteínas ricas em prolina pelos colangiócitos (NOZAKI

et al. 2005; DEMETRIS et al. 2006).

2.4.8 Fator de Crescimento de Fibroblastos Ácido (FGFα) e a regeneração hepática

Também conhecido como fator de crescimento ligante à heparina 1 (Heparin Binding

Growth Factor 1), é secretado por hepatócitos em regeneração, células ovais e de Ito.

Aumenta agudamente por até 24 horas após estímulo, com pico de secreção coincidindo

com o pico de síntese de DNA e permanece elevado durante 7 dias. A elevação dos níveis

de FGFα ocorre após a iniciação de hepatócitos primários, não parecendo ser o

desencadeador do processo regenerativo (JESUS, WAITZBERG e CAMPOS, 2000).

2.4.9 Substância estimuladora hepática (HSS) e a regeneração hepática

Extraído do citosol da célula hepática regenerada, também denominado de

“aumentador da regeneração hepática” (augmenter of liver regeneration – ALR). É

considerado como fator de progressão da replicação, agindo sobre células que estejam

atingindo a fase G1 do ciclo celular. Observam-se valores elevados no fígado de ratos

adultos após 12 horas da hepatectomia com pico máximo em 26 horas e permanecem

elevados por até 72h. No rato, foi comprovada sua atividade inibitória sobre as células

natural killer (NK) presentes no fígado o que poderia impedir a destruição dos hepatócitos


41

nas doenças agudas e, portanto, estimulando a regeneração hepática (JESUS,

WAITZBERG e CAMPOS,, 2000).

2.5 MODELOS EXPERIMENTAIS DE HEPATECTOMIAS PARCIAIS

É impossível instituir regras gerais confiáveis para a validade da extrapolação de

uma espécie para a outra. Isto deve ser avaliado individualmente para cada experimento e

pode, freqüentemente, ser verificado apenas após os primeiros estudos na espécie alvo. A

extrapolação de modelos animais, assim como a própria arte médica continuará sempre

como uma matéria de percepção tardia, destituída de garantias absolutas, embora nós

humanos normalmente demandemos absolutismo da profissão médica e da comunidade de

pesquisa. Ciência é conhecimento em fluxo contínuo e inovador (FAGUNDES e TAHA,

2004).

2.5.1 Anatomia do figado de ratos

O processo de regeneração hepática em roedores e humanos é semelhante e os

resultados obtidos em roedores são aplicáveis ao fígado humano. A hepatectomia a 70% em

ratos é o modelo animal mais valioso e extensivamente estudado para regeneração

hepática.

O processo de regeneração hepática é desencadeado imediatamente após a lesão

e, no rato, a replicação do DNA começa às 16 h após a ressecção. Após uma hepatectomia

de 70% no rato, o peso do fígado remanescente em 24 e 72 horas é de 45 e 70% do peso

original do fígado, respectivamente. Entre 7 e 14 dias, o volume do fígado é de 93%, e no

dia 20 recupera completamente o volume original por hiperplasia dos lobos remanescentes.

Também em humanos, o processo de regeneração ocorre rapidamente. A massa hepática

dobrou aos 7 dias no fígado do doador e 14 dias no receptor após o transplante do lobo

direito. Os fígados doadores e receptores atingiram seu peso original aos 60 dias após a


42

cirurgia. No entanto, apesar da recuperação do peso do parênquima, os processos de

regeneração e remodelação continuam (MARTINS et al. 2008).

O fígado de rato consiste em 4 lobos distintos de tamanhos diferentes. O lobo lateral

esquerdo representa cerca de 30% do peso total do fígado e está localizado na posição

lateral esquerda dorso-caudal ao mediano e cranio-ventral aos lobos caudados e ao

estômago. O pedículo estreito contendo os vasos está ligado à veia cava infra-hepática e à

base da porção esquerda do lobo mediano. Os ligamentos interlobulares conectam o lobo

lateral esquerdo com o lobo caudado superior (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al.

2008).

O lobo mediano representa cerca de 40% do peso total do fígado e consiste em duas

porções, esquerda e direita, separadas por uma fissura profunda. O lobo mediano localiza-

se abaixo do diafragma e é fixado com o ligamento falciforme, que se estende desde o

processo xifoide e diafragma até o fígado, formando a fissura interlobular. A porção

esquerda é menor e representa cerca de um terço do lobo mediano. O lobo mediano

apresenta-se com uma base larga, envolvendo quase a metade da circunferência da veia

cava (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).

O lobo hepático direito está localizado no lado direito da veia cava e consiste

também de duas porções distintas, a superior e inferior do lobo direito. O lobo superior

direito (13%) tem o formato de um ovo assentado na veia cava intra-hepática com uma base

larga que se estende até a parte paracaval do fígado. O lobo inferior direito em forma de

pirâmide com a ponta apontando para a veia cava, compreende 6% da massa total do

fígado e está dorsalmente fixado ao diafragma e latero ventral à veia cava (MADRIHAMOV

et al. 2006; MARTINS et al. 2008).

O lobo caudado, localiza-se no lado esquerdo da veia cava abaixo do lobo lateral

esquerdo e representa 7% da massa hepática total. O lobo é dividido em duas porções: lobo

caudado superior e lobo caudado inferior. O lobo caudado superior é conectado ao lobo

lateral esquerdo através de um ligamento interlobular fino e é totalmente coberto pelo

omento menor. A parte inferior do lobo caudado está localizada atrás do estômago, próxima


43

ao pâncreas e ao baço, e é coberta por uma cápsula fibrosa, presa à parede dorsal do

omento menor (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).

Baseado na principal bifurcação da veia porta e da artéria hepática, o fígado pode

ser dividido em hemi-fígado direito e esquerdo. O lobo lateral esquerdo, a porção esquerda

do lobo mediano e o lobo caudado pertencem ao hemi-fígado esquerdo, enquanto o hemi-

fígado direito é constituído pelo lobo direito e a porção direita do lobo mediano

(MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).

A bifurcação principal divide a veia porta na veia porta mediana direita, apoiando a

porção direita do lobo mediano, e a veia porta esquerda, localizada no pedículo do lobo

lateral esquerdo. Distalmente a essa bifurcação, a veia porta esquerda libera a veia porta

mediana esquerda e a veia porta lateral esquerda suprindo o respectivo lobo hepático

(MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).

O hemi-figado esquerdo é drenado pela grande veia hepática esquerda, coletando

sangue do lobo lateral esquerdo e a porção esquerda do lobo mediano. A veia mediana

esquerda recebe o sangue venoso do território esquerdo do lobo mediano. O ramo mediano

da veia hepática média drena o território mediano intermediário, mas está conectada ao

tronco da grande veia hepática esquerda. Em alguns animais, drena diretamente para a veia

cava. A veia mediana direita drena o pequeno território direito do lobo mediano para a veia

cava (MADRIHAMOV et al. 2006; MARTINS et al. 2008).

A drenagem do hemisférico direito consiste na veia hepática mediana direita drenada

para a veia cava oposta à veia hepática esquerda e caudal à esquerda. O lobo caudado é

drenado por uma veia caudada separada, também drenando para a parte intra-hepática da

veia cava. O fígado paracaval é drenado por múltiplas pequenas veias que entram

diretamente no lado de trás da parte intra-hepática da veia cava (MADRAHIMOV et al.

2006).

A velocidade de regeneração hepática é proporcional à quantidade de tecido

hepático ressecado. Curiosamente, também foi demonstrado que a capacidade regenerativa

dos lobos remanescentes individuais é significativamente diferente. Além disso, ressecções


44

muito grandes (> 85%) ou muito pequenas (<30%) podem resultar em proliferação celular

lenta (MARTINS et al. 2008).

2.5.2 Técnicas de ressecção hepática

Com exceção do mito de Prometeu, o modelo clássico de estudo da regeneração

hepática foi descrito em 1931 no artigo ”Experimental pathology of de liver. Restoration of

the liver of the white rat following partial surgical removal”, onde uma hepatectomia parcial

de 2/3 é realizada no rato. Os pedículos vascular/biliar dos lobos mediano e lateral esquerdo

são ligados. Ambos são ressecados sem prejuízos aos lobos residuais. Não há interferência

com a vascularização/drenagem biliar dos lobos residuais nem reação inflamatória/necrótica

significativa no coto dos lobos ressecados. Foi observado que, de sete a dez dias após

hepatectomia parcial de 2/3. O fígado do rato recupera a sua massa, restabelecendo a

relação normal entre peso do fígado/peso do corpo, que no rato corresponde a 3,58%

(GODOY et al. 2006).

Modelos de roedores de hepatectomia parcial forneceram a abordagem mais

conveniente para o estudo deste processo, dada sua grande semelhança com a situação

humana, ausência de lesão ou inflamação tecidual imediata e definição precisa do ponto

inicial de tempo quando a regeneração hepática é desencadeada (CLAVIEN et al. 2008).

No fígado do rato, como no humano, o segmento hepático ressecado durante a

hepatectomia parcial não se forma de novo. Por definição estrita, não há regeneração

verdadeira, tal como possuem os anfíbios, cuja cauda perdida pode ser reconstituída

integralmente. O fígado recupera sua massa (peso ou volume), mas não recupera sua forma

original. O fígado é o único órgão que possui duas vascularizações sanguíneas distintas:

(i)esplâncnica, a partir da veia porta e (ii) arterial sistêmica, a partir do tronco celíaco

(GODOY et al. 2006; MADRAHIMOV et al. 2006; MELO et al. 2008).

Uma complexa sinalização em cascata inicia-se imediatamente após uma perda

celular, como após uma hepatectomia parcial: mais de 100 genes extremamente precoces


45

são expressos nos hepatócitos dos lobos residuais já no primeiro minuto após hepatectomia

parcial. Todas as funções essenciais à homeostasia são mantidas durante a regeneração.

No fígado normal, as diferentes células parenquimatosas e não parenquimatosas estão em

fase G0 ou fase de repouso em relação ao ciclo celular. São células quiescentes. Ao ciclar,

após hepatectomia parcial, as células hepáticas passarão pelas quatro fases do ciclo

celular: G1, fase S ou fase de síntese de DNA, G2 e mitose. Após ciclarem, retornam ao

estágio G0 ou realizam uma nova divisão celular (GODOY et al. 2006; MELO et al. 2008 ).

Após hepatectomia parcial, a regeneração ocorre graças à proliferação das

diferentes células que compõem os lobos hepáticos residuais: hepatócitos, célula epitelial

biliar, célula endotelial (sinusóide), célula de Kupfer e célula de Ito (célula estrelar). Os

hepatócitos representam 60 a 80% da população celular do fígado. O hepatócito é

tipicamente uma célula quiescente (G0), com vida média de 200 a 400 dias. A proliferação

celular das células parenquimatosas (hepatócitos) ocorre de forma heterogenia em tempo e

localização do hepatócito. A síntese de DNA ocorre em picos, sendo um mais intenso até 33

horas da hepatectomia e um segundo pico menos intenso entre 36 e 48 horas. Entretanto, a

proliferação hepatocelular, também se dá pelas células não parenquimatosas. A síntese de

DNA ocorre 48 horas após hepatectomia parcial nas células epiteliais biliares e células de

Kupffer, e após 96 horas nas células endoteliais (sinusóides) (GODOY et al. 2006; MELO et

al. 2008; ELPEK, 2014).

Ressecções hepáticas em roedores são muito bem toleradas com mortalidade

operatória mínima. Até o momento, quatro técnicas para ressecção hepática em roedores

foram descritas:

1. A técnica clássica (ligadura em bloco na base do lóbulo). Embora seja a técnica mais

comumente utilizada, ela apresenta maior risco de lesões, pois a ligadura em massa

pode comprometer elementos de outros pedículos. O risco de estenose da veia cava e

congestão hepática é particularmente alto quando apenas uma ligadura, tanto para os

pedículos dos lobos lateral esquerdo e mediano, é realizada, devido à compressão da

veia após a ligadura em massa. Esse procedimento pode ser realizado pela técnica


46

convencional (aberta) ou pela técnica laparoscópica. No entanto, a abordagem

laparoscópica não parece fornecer qualquer vantagem sobre outras técnicas. É

demorado e requer equipamento especializado e dispendioso (EULALIO et al. 2018).

2. A técnica de clipe hemostático. Trata-se de uma ligeira modificação da técnica clássica,

em que clipes de titânio são aplicados ao pedículo, ao invés de suturas. Este

procedimento é rápido, mas está associado a complicações semelhantes da técnica de

ligadura em massa. Além disso, preocupações com a interferência no processo de

regeneração foram levantadas, embora isso não tenha sido confirmado em

investigações posteriores (NEVZOROVA, et al. 2015).

3. A técnica de preservação de parênquima orientada para vasos é uma técnica relatada

por Madrahimov e colaboradores em 2006 e não requer ligação prévia no hilo hepático.

Suturas de perfuração sequenciais, proximais à pinça, são posicionadas de acordo com

a anatomia vascular topográfica. Embora essa técnica seja mais rápida do que a técnica

microcirúrgica, descrita a seguir, ela pode causar lesão de outros ramos vasculares

porque os vasos não são visualizados individualmente. Portanto, não é recomendado

para ressecção dos segmentos direito ou esquerdo do lobo mediano.

4. A técnica microcirúrgica orientada para vasos. Essa técnica, primeiramente relatada por

Kubota e colaboradores em 1997, é semelhante à técnica para hepatectomias clínicas.

Os ramos da veia porta e da artéria hepática são ligados antes da ressecção do lobo, e

as veias hepáticas são ligadas dentro do lobo durante a ressecção do parênquima (de

maneira semelhante à técnica de preservação do parênquima). As vantagens desta

técnica são redução do risco de sangramento do coto e redução do risco de constrição

da veia cava. Também é mais apropriado para hepatectomias segmentares, por

exemplo a ressecção da porção direita ou esquerda do lobo mediano, após

delineamento da linha isquêmica após a ligadura. As desvantagens são a exigência de

habilidades e equipamentos microcirúrgicos, risco de lesão da veia porta durante a

dissecção e por consequência mais demorada.


47

2.6 O BEVACIZUMABE

O fígado é o local mais comum de metástase do câncer colorretal, com 25% dos

pacientes apresentando metástases hepáticas no momento do diagnóstico; outros 25% a

45% desenvolvem metástases hepáticas na recorrência da doença. Esses pacientes têm

prognóstico ruim, apesar dos avanços na sobrevida com a quimioterapia. A ressecção

cirúrgica de metástases hepáticas é considerada a única opção de tratamento curativo para

pacientes com metástases hepáticas ressecáveis desconsiderando outros acometimentos

extra-hepáticos. As atuais taxas de sobrevida em 5 anos após a ressecção de metástases

hepáticas são de 25% a 40%. Infelizmente, uma grande proporção de pacientes

(aproximadamente 80%) é considerada irressecável na apresentação devido ao

envolvimento extra-hepático ou insuficiencia do tecido hepático remanescente saudável.

Além disso, aproximadamente 50% dos pacientes apresentam recidiva da doença, que é

confinada ao fígado. A partir disso, o uso do Bevacizumabe é considerado uma boa

alternativa de manejo desses pacientes (GRUENBERGER et al., 2008).

O bevacizumabe é um agente avançado e amplamente utilizado. É um anticorpo

monoclonal humanizado recombinante (IgG1) que se liga ao VEGF, formando uma molécula

complexa e inibe a ligação do VEGF com receptores VEGF de tirosina quinase (VEGFRs),

resultando no bloqueio das vias de sinalização mediadas por VEGF que leva à angiogênese.

Ele se se liga a todas as isoformas biologicamente ativas do VEGF e inibe a ligação desta

citocina aos seus receptores: VEGFR-1 e 2. Neutraliza os efeitos biológicos do VEGF,

incluindo a mitogênese de células endoteliais, o aumento da permeabilidade vascular e a

promoção da angiogênese (BASBUG et al. 2006; VAUTHEY e ZORZI, 2009; PAVLIDIS et

al. 2010; SOYSAL et al. 2014; MACHADO et al. 2015; NAKAMURA et al. 2016; DECKER et

al. 2017; LINDLAY e STEELE, 2019).

O Bevacizumabe (Avastin; Genentech / Roche, São Francisco, CA) é um anticorpo

monoclonal que bloqueia o receptor VEGF, é usado atualmente na terapia direcionada de


48

tumores sólidos, e tem uma meia-vida de 28 dias quando administrado por via intravenosa

(MICHA et al. 2017, BASBUG et al. 2006).

O bevacizumabe é um anticorpo da subclasse IgG1, monoclonal humanizado

recombinante com 93% de sequência de aminoácidos de origem humana e 7% de origem

murina, que se liga a todas as isoformas do receptor do VEGF sendo classificado como uma

droga anti-angiogênica (MACHADO et al. 2015; NAKAMURA et al. 2016).

A observação de que o crescimento tumoral pode ser acompanhado por aumento da

vascularização foi relatada há mais de um século. Em 1939, Ide, Baker e Warren postularam

a existência de um fator estimulante de crescimento de vaso sanguíneo, derivado de tumor,

que poderia servir para fornecer um suprimento neovascular para o tumor em crescimento.

Experimentos realizados em 1968 indicaram que a angiogênese tumoral era mediada por

fatores difusíveis produzidos por células tumorais.

Na sequência da publicação de sua hipótese, Folkman e seus colaboradores

relataram descobertas que foram fundamentais para o avanço das pesquisas neste campo,

incluindo a definição da natureza do switch angiogênico em tumores, aumentando a

consciência da presença de ambos os fatores pró e anti-angiogênicos que medeiam tanto

processos fisiológicos quanto patológicos (FOLKMAN, 1995).

Em 1971, Folkman propôs que a anti-angiogênese poderia ser uma estratégia

terapêutica eficaz para tratar o câncer. É importante ressaltar que estudos recentes

demonstraram que o bevacizumabe, um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado, em

combinação com quimioterapia, resulta em aumento da sobrevida em pacientes com câncer

colorretal metastático previamente não tratado em relação à quimioterapia isolada, levando

à aprovação do primeiro anti-angiogênico (FERRARA et al. 2005).A era do desenvolvimento

da terapia anti-angiogênica teve início em 1971, com a publicação no New England Journal

of Medicine, de um artigo considerado marco no assunto. Escrito por Moses Judah Folkman

(figura 2), postulou a hipótese de que, “com uma toxicidade mínima, a inibição do


49

crescimento de vasos sanguíneos dentro de um tumor poderia prolongar a

dormência tumoral e melhorar a sobrevida dos pacientes”.

Moses Judah Folkman

Cleveland 24 /02/1933 +Denver 13/01/2008

FIGURA 2 – ILUSTRAÇÃO ORIGINAL PROPOSTA POR FOLKMAN EM 1971 DEMONSTRANDO A ANGIOGÊNESE

TUMORAL.

Embora a angiogênese desempenhe um papel essencial no crescimento tumoral, o

benefício terapêutico proposto pelas drogas anti-angiogênica para tratamento do câncer têm

sido amplamente estudadas com o objetivo de validar e consolidar esta modalidade de

tratamento. Certas drogas anti-angiogênicas, tais como bevacizumabe parecem ter pouco

ou nenhum benefício clínico quando usado como monoterapias para tratar a doença

avançada de certas malignidades como o câncer colorretal, entretanto demonstram

benefício clínico quando em combinação com outros agentes (ZUCKER et al. 1998;

FERRARA et al. 2005; JAIN et al., 2006; KERBEL, 2006; FOLKMAN, 2007; KERBEL, 2008)

O bevacizumabe está aprovado como um agente de primeira linha em terapia

combinada para o tratamento de câncer colorretal metastático. Apesar de prolongar a

sobrevida livre de doença, tem sido associado com várias complicações, principalmente na

cicatrização da ferida cirúrgica. As propriedades anti-angiogênicas do bevacizumabe podem


50

alterar o curso natural do processo cicatricial das feridas, evitando a formação de novos

vasos sanguíneos, assim, limitando a capacidade de transporte de células inflamatórias,

nutrientes e oxigênio aos tecidos (HURWITZ et al., 2004; FOLKMAN, 2007).

Bockhorn e colobaradores em 2007 relataram que o bloqueio do VEGF suprimiu

quase completamente a proliferação de hepatócitos medida pela imunomarcação de Ki67,

24 horas após a hepatectomia em ratos. Da mesma forma, Taniguchi e colobaradores em

2001 relataram uma inibição da atividade proliferativa (imunocoloração de Ki 67) dos

hepatócitos, bem como das células endoteliais 48 h e 96 h após hepatectomia de 70% em

ratos pré-tratados com anti-VEGF. Os resultados de Hubert e colobaradores em 2015

contradizem esses resultados, quando relataram que o Bevacizumabe 5 e 10mg/kg não

alterou significativamente a proliferação precoce de hepatócitos após a hepatectomia em

ratos. Kasuya e colaboradores em 2012 também relataram a ausência de efeito de

Bevacizumabe (4 mg / kg, administrado IP 6 vezes entre o dia 1 e 10 após PH), na

regeneração hepática em camundongos. Em ratos pré-tratados com oxaliplatina e 5-

fluorouracil que exibiram uma resposta proliferativa diminuída após a hepatectomia 70%, os

animais que tiveram esse protocolo associado ao Bevacizumabe tendeu a aumentar a

proliferação de hepatócitos precocemente após a hepatectomia de maneira dose-

dependente, 5 ou 10 mg/kg (HUBERT et al., 2015).

Willet e colobaradores em 2004 demonstraram que a infusão do Bevacizumabe,

diminui a perfusão do tumor, o volume vascular, a densidade microvascular, a pressão do

fluido intersticial e o número de células endoteliais circulantes viáveis em seis pacientes com

câncer colorretal.

Soysal e colobaradores em 2014, em seu estudo com implantes intra-uterinos que

induziram a endometriose, sugere que o anticorpo anti-VEGF Bevacizumabe, é tão eficaz

quanto o agonista de GnRH na regressão das lesões endometrióticas no modelo de

endometriose em ratos Wistar. Um mecanismo possível desse efeito é a indução da

apoptose.


51

Micha e colobaradores em 2017 afirmou que o Bevacizumabe pode ser usado como

um potente medicamento antiadesivo, seja instilado localmente, antes do fechamento

abdominal ou combinado com outras moléculas em filmes anti-adesivos e géis para serem

usados em situações de aderências severas, depois que experimentou em ratos Wistar

após abrasão do colon, como um modelo de promoção de aderências. Esse resultado foi

observado no mesmo modelo de ratos Wistar por Basbug e colobaradores em 2006.

Em um experimento com modelo de artrite em ratos, a concentração de IL-1b, TNF-

a, MMP-1 e MMP-3 foi significativamente maior no grupo que utilizou Bevacizumabe do que

no grupo controle, sendo que o Bevacizumabe obviamente reverteu os altos níveis dessas

citocinas induzidas pela lesão da cartilagem articular esportiva, indicando que

Bevacizumabe exerce um efeito anti-inflamatório através de regulação negativa de fatores

inflamatórios (SHANG et al. 2018).

As complicações relatadas incluem tromboses arteriais, venosas, hipertensão,

proteinúria e perfuração gastrointestinal. Complicações importantes que todos os cirurgiões

precisam estar cientes são suas anormalidades associadas à ferida operatória, como

deiscência, equimoses, sangramento do sítio cirúrgico e infecção (ZAKARIJA e SOFFT,

2005; ELLIS, CURLEY E GROTHEY, 2005; GNETECH, 2017).

Neste contexto, em 2003 Kabbinavar e colobaradores em evidenciaram aumento em

59% do risco de hemorragia pós-operatória em pacientes tratados com Bevacizumabe em

comparação com aqueles tratados com quimioterapia (11%) o que foi atribuído à diminuição

da capacidade das células endoteliais em responder às lesões em vigência da inibição do

VEGF.

Em estudo realizado por Hurwitz e colobaradores em 2004, demonstraram uma

significativa quantidade de sangramento do sítio cirúrgico, equimoses, e deiscência de

pacientes dentro de 60 dias após a cirurgia. Por isso, tem sido sugerido que a cirurgia

eletiva deva ser retardada, pelo menos, 6 a 8 semanas (> 40 dias) após a conclusão da

terapia com Bevacizumabe (meia-vida = 20 dias). Além disso, a reintrodução do

Bevacizumabe pós-operatória deve esperar ≥ 28 dias e a incisão cirúrgica deve ser


52

totalmente curada para evitar maior risco de complicações relacionadas à cicatrização

(ELLIS, CURLEY e GROTHEY, 2005; HURWITZ et al., 2004).

Bilchik e Hecht em 2008 em suas reflexões baseadas em evidências, pontuam as

vantagens de um agente quimioterápico como terapia adjuvante nas ressecções

oncológicas hepáticas, onde a redução da massa e a menor distribuição de micro

metástases são vantajosas, porém o aumento de complicações como esteatose por

exemplo são as desvantagens. Relatou que em estudos clínicos iniciais com Bevacizumabe,

houve aumento da incidência de sangramento, hipertensão, perfurações gastrointestinais e

complicações na cicatrização de feridas. Além disso, em modelos animais, a inibição da

angiogênese resultou em comprometimento da cicatrização, assim, tem sido sugerido que a

inibição dos receptores de VEGF nas células endoteliais pode regular a regeneração

hepática.

Em 2005, estudos de fases II e III em pacientes em quimioterapia e Bevacizumabe

versus quimioterapia isolada para o tratamento do câncer metastático de cólon, compararam

a ocorrência de complicações cicatriciais da ferida operatória, demonstrando segurança no

início ou na reintrodução do bevacizumabe, vinte e oito dias após a cirurgia em pacientes

com câncer colorretal (SCAPPATICCI et al., 2005).

Após numerosos ensaios clínicos, o bevacizumabe mostrou-se seguro, eficaz e

proporciona benefícios significativos no tratamento de vários cânceres. No entanto, a ele

também tem sido associadas complicações que impactam diretamente na tomada de

decisão dos cirurgiões, pois a margem de segurança de seis a oito semanas de interrupção

do tratamento previamente ao ato cirúrgico deve se respeitada. Além disso, para o reinício

do tratamento no pós-operatório com o bevacizumabe em pacientes cirúrgicos, sugere-se

aguardar 28 dias para evitar um aumento do risco de complicações cicatriciais da ferida.

Assim sendo, os efeitos adversos de bevacizumabe devem ser considerados em todos os

pacientes cirúrgicos até que se possa compreender completamente seu impacto sobre a

evolução pós-cirúrgica (GORDON, 2009). Contudo, não foram observadas diferenças


53

significativas relacionadas às complicações ao bevacizumabe em um estudo caso-controle

(n=32) com pacientes submetidos à ressecção hepática (D'ANGELICA et al., 2007).

Gruenberger e colobaradores em 2008 relatam um estudo prospectivo de fase II que

avaliou o impacto do bevacizumabe nas complicações cirúrgicas e na regeneração hepática

após a ressecção de metástases hepáticas do câncer colorretal, onde cinquenta e seis

pacientes receberam bevacizumabe, capecitabina e oxaliplatina, sendo o bevacizumabe

suspenso cinco semanas antes da cirurgia. Não houve aumento de complicações cirúrgicas,

sangramento ou diminuição da função hepática em comparação com controles históricos. As

deficiências do estudo incluem números relativamente pequenos e avaliação da

regeneração hepática definida pelos resultados da tomografia computadorizada e funções

do fígado apenas 3 meses após a cirurgia, um período muito curto para avaliar a capacidade

regenerativa total do fígado. No entanto, esses dados sugerem que o bevacizumab pode ser

administrado com segurança no pré-operatório, levando em consideração a possível

hepatotoxicidade dos outros agentes utilizados.

Em condições fisiológicas a angiogênese influencia a embriogênese, o

desenvolvimento tecidual, a ovulação, a formação do corpo lúteo e o processo de

cicatrização e o bevacizumabe interfere diretamente a densidade vascular cicatricial pelo

bloqueio dos receptores do VEGF, limitando desta forma a densidade vascular tecidual

(FOLKMAN, 2007).

Um estudo que avaliava os efeitos do bevacizumabe na anastomose intestinal foi

realizado em ratos, e não relataram diferenças significativas entre o grupo bevacizumabe e

o grupo controle em relação à pressão de ruptura do cólon, o grau de inflamação, o acúmulo

de fibroblastos, deposição de colágeno ou grau de fibrose. Consequentemente, eles

concluíram que a administração de bevacizumabe não teve efeito significativo na

cicatrização de anastomoses no cólon (NAKAMURA et al. 2016). Entretanto, de acordo com

a investigação de LIN e colobaradores em 1999, bevacizumabe, que é um anticorpo

monoclonal “humanizado” recombinante contra VEGF, pode não se ligar ao VEGF no rato

ou camundongo, mas liga-se ao VEGF no coelho.


54

Bockhorn e colaboradores em 2007 mostraram que a administração exógena de

VEGF aumenta a angiogênese e a proliferação após hepatectomia parcial que está

associada a uma modulação dos genes do ciclo celular. Concomitantemente, o bloqueio do

VEGF endógeno leva a uma diminuição da angiogênese, retardo na proliferação de

hepatócitos e re-expressão de genes de controle do ciclo celular. A possibilidade, quando

dado terapeuticamente, em representar uma estratégia para otimizar a regeneração do

fígado dos pacientes humanos, precisa ser esclarecida.

O status hepático não é prejudicado pelo Bevacizumab, mesmo em altas doses. Da

mesma forma, a regeneração hepática após hepatectomia ampliada em animais tratados

com Bevacizumabe estava bem preservada. Ressecções hepáticas prolongadas podem ser

encorajadas em pacientes tratados com Bevacizumabe devido à sua excelente

tolerabilidade e ao bom estado de regeneração hepática (VALVERDE et al., 2019).

Estudos adicionais são necessários para avaliar a tempo ideal para que o

bevacizumabe seja realizado antes da cirurgia e também para avaliar se pode ser

modificado com base na extensão da hepatectomia planejada. Até que mais dados

prospectivos estejam disponíveis, recomenda-se que o bevacizumabe seja interrompido

antes da quimioterapia citotóxica com a qual é administrado no período mínimo de quatro a

seis semanas e suspenso durante as primeiras semanas de quimioterapia pós-operatória

(BILCHIK e HECHT, 2008).

3. Método

55

3.1 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Este estudo foi avaliado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Animais

(CEPA) do Hospital e Maternidade Angelina Caron conforme protocolo nº 015/16

CEPA/HAC (anexo 1). Foram obedecidas as normas contidas na Lei Federal n.º 11.794 e

observaram-se os Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de

Experimentação Animal (COBEA-2000).

Utilizaram-se 32 ratos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia) da linhagem

Wistar, com idades entre 112 e 125 dias e pesos de 201,8 ± 9,27 gramas, provenientes do

Biotério da Universidade Federal do Paraná e mantidos durante o experimento nas

dependências da Coordenação de Ensino e Pesquisa do Hospital e Maternidade Angelina

Caron (tabela 1).

TABELA 1 - DEMONSTRATIVO DA ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DO ESTUDO E PROCEDIMENTOS REALIZADOS:

Grupos Sub-grupos Procedimentos

Controle (C) n=16

Controle 48 n=8

Hepatectomia parcial, tratamento com solução fisiológica e manutenção por 48 horas.

Controle 15 n=8

Hepatectomia parcial, tratamento com solução fisiológica e manutenção por 15 dias.

Bevacizumabe (BV) n=16

BV 48 n=8

Hepatectomia parcial, tratamento com bevacizumabe e manutenção por 48 horas.

BV 15 n=8

Hepatectomia parcial, tratamento com bevacizumabe e manutenção por 15 dias.

Os ratos foram submetidos à triagem através de inspeção da pelagem para

investigação de ectoparasitas, sinais de diarréia e lesões cutâneas.

Foram mantidos em ambiente específico para animais de laboratório com exaustão

forçada de ar (pressão negativa), temperatura controlada entre 19 a 23ºC e ciclos de

iluminação automaticamente regulados a cada 12 horas. Os ratos após a inspeção foram

3. Método

56

separados em grupos de quatro por caixa de polipropileno. As caixas com sepilho eram

substituídas a cada 24 horas e os ratos recebiam ração específica para a espécie (Nuvilab -

Quimitia S.A.®) e água ad libitum. Foram pesados em três momentos, no dia do início do

experimento (T0), quarenta e oito horas de evolução (T48) e quinze dias de evolução (T15),

conforme descrito no apêndice 1.

3.2 EXPERIMENTO

Os procedimentos experimentais foram executados em um único ciclo de atividades,

seguindo os protocolos para anestesia e hepatectomias do Laboratório da Coordenação de

Ensino e Pesquisa do Hospital e Maternidade Angelina Caron (apêndices 2 e 3). Conforme

demonstrado na figura 3, a mesa cirúrgica era montada com proteção esterilizada bem

como os instrumentos e os acessórios e os procedimentos executados em condições de

esterilidade.

Na data dos procedimentos cirúrgicos, os ratos eram pesados em balança analítica

(Coleman® modelo SK280251), separados nos sub-grupos previstos na tabela 1 (apêndice

1).

FIGURA 3 - AMBIENTE CIRÚRGICO DEMONSTRANDO A MONTAGEM DA MESA CIRÚGICA REFERÊNCIA: AUTOR

3. Método

57

3.2.1 Anestesia

A indução anestésica seguiu o protocolo específico disponibilizado no apêndice 2

(tabela 12). Foi utilizada a associação dos anestésicos cloridrato de cetamina (Ketamina-

Agener®) na dose de 80mg/kg e cloridrato de xilasina (Sedanil – solução a 2%®) na dose de

10mg/kg. Previamente à indução anestésica, os ratos foram submetidos à sedação por

inalação de Isoflurano (Isothane-Baxter®) em circuito fechado. E a seguir, injetaram-se os

anestésicos separadamente, por via intramuscular em ambas os membros pélvicos. Fez-se

tricotomia da região torácica e parede abdominal ventral, fixação com fitas adesivas na

prancheta cirúrgica, degermação da área tricotomizada com álcool-iodado e colocação de

campos cirúrgicos fenestrados esterilizados.

3.2.2 Hepatectomia parcial

Conforme descrito no apêndice 3, procedeu-se à laparotomia sub-costal por planos,

liberação dos ligamentos hepáticos e hepatectomia parcial de aproximadamente 70%,

conforme descrito por Martins, Theruvath e Neuhaus (2008). Procederam-se ligaduras dos

pedículos hepáticos com fio de monocril 3.0 e ressecção dos lobos mediano e lateral

esquerdo, seguida de laparorrafia em dois planos (músculo-aponeurótico e pele), com

pontos contínuos utilizando fio prolene 6.0® (Ethicon). Após o fechamento, a ferida cirúrgica

era limpa com solução fisiológica esterilizada (Eurofarma®) e novamente aplicado álcool-

iodado (BRANCO, 2006).

3.3 TRATAMENTOS

Imediatamente após o procedimento cirúrgico e ainda sob plano anestésico, para

analgesia pós-operatória administrou-se por via intraperitoneal Sulfato de Morfina penta-

hidratada (Dimorf®) (tabela 5), na dose de 2mg/kg e 10ml de solução fisiológica por via

subcutânea na região dorsal, para hidratação (INGJATOVIC et al., 2010).

Também se administrou aos ratos do grupo BV, por via intraperitoneal, 5mg/kg de

Bevacizumabe (Avastin®-Roche 100 mg/4 ml) e igual volume de solução salina (Eurofarma®)

aos do grupo controle.

3. Método

58

Mantiveram-se os animais aquecidos até a recuperação anestésica. A seguir,

devolviam-se, os ratos identificados, para as caixas onde permaneceram em regime

alimentar normal.

3.4 INTERRUPÇÃO DO EXPERIMENTO E COLETA DE AMOSTRAS

Nas datas previstas para as aferições (48 horas e 15 dias de evolução), os ratos

foram pesados conforme protocolo descrito no apêndice 1 e a seguir submetidos aos

”Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia”, (apêndice 4) que inclui

sedação por inalação de Isoflurano (Isothane-Baxter®) em circuito fechado, anestesiados

por injeção intramuscular com cloridrato de cetamina (Ketamina-Agener®) na dose de

100mg/kg e procedida punção exanguinativa e indutora de parada cárdio-respiratória, com a

coleta de 8 a 10 ml de sangue, em tubos para obtenção de soro e encaminhados para as

avaliações bioquímicas séricas.

A seguir, após a confirmação do óbito, realizou-se laparotomia mediana ampla e

ressecção dos lobos hepáticos remanescentes os quais foram colocados em frascos

identificados para fixação em Solução de Paraformaldeído 4%, em PBS pH 7,4, por 24

horas e encaminhados para as avaliações histopatológicas e imunohistoquímicas.

3.5 AVALIAÇÕES

As avaliações utilizadas foram dosagens bioquímicas para avaliar a função hepática

e avaliações histológicas patológicas para avaliar as características microscópicas do

parênquima hepático em regeneração e imunohistoquímicas para avaliar através de

marcadores específicos a viabilidade celular e densidade microvascular.

3.5.1 Avaliação ponderal

As pesagens dos ratos foram feitas no T0 (início do experimento), no T48 (48 horas

de evolução) e no T15 (quinze dias de evolução), conforme descrição no apêndice 1.

3. Método

59

3.5.2 Avaliações bioquímicas séricas

Para as avaliações bioquímicas séricas foram coletadas amostras de sangue dos

ratos conforme descritas no ítem 3.4, em tubos de ensaio hermeticamente fechados à vácuo

e sem anticoagulantes.

3.5.2.1 Dosagem de Albumina

As dosagens de albumina foram realizadas por método espectrofotométrico

automatizado em aparelho modelo Dimension Rxl/ExL-Siemens®, com reagentes

específicos marca Siemens®, (apêndice 5).

3.5.2.2 Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta

As dosagens de bilirrubinas total e direta foram realizadas por método

espectrofotométrico automatizado em aparelho modelo Dimension Rxl/ExL-Siemens®, com

reagentes específicos marca Siemens®, (apêndice 6) e as dosagens das bilirrubinas

indiretas foram obtidas por cálculos.

3.5.2.3 Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica

(TGP)

As dosagens de transaminases foram realizadas por método espectrofotométrico

automatizado em aparelho modelo Dimension Rxl/ExL-Siemens®, com reagentes

específicos marca Siemens®, (apêndice 7).

3.5.2.4 Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI)

As determinações dos índices aspartato-aminotransferase / plaquetas foram

executadas conforme descrição no apêndice 8 (GREENSON et al., 2003) através das

dosagens de TGO, das contagens de plaquetas (executadas automaticamente no

equipamento Cell Dyn Ruby – Abbott®), e do valor máximo de referência para as dosagens

de TGO em ratos Wistar na faixa etária de 120 dias (MELO et al., 2012).

3.5.3 Avaliações microscópicas

Após a fixação das amostras de fígado, foram realizadas secções perpendiculares

com 5µm de espessura. A seguir os cortes foram fixados em lâminas e corados pelo

método hematoxilina-eosina (HE) de Harris para avaliar presença de edema, hemorragia,

3. Método

60

congestão, proliferação ductal, inflamação e também para estabelecer o índice mitótico pela

contagem microscópicas das figuras de mitoses. Empregou-se o método de coloração de

tricrômico de Gomori para avaliar a ocorrência de fibrose e o método imunohistoquímico

com anticorpos monoclonais específicos para avaliar a densidade microvascular pela

marcação com anticorpo monoclonal anti-CD34 e viabilidade celular pela marcação com

anticorpo monoclonal anti-antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).

3.5.3.1 Determinação do Índice Mitótico

O índice mitótico foi obtido através da contagem de figuras de mitoses em lâminas

com cortes histológicos de amostras de fígado de ratos coradas pela Hematoxilina & Eosina

de Harris (HE) e contadas em microscopia ótica (ASSY e MINUK, 1997; BIONDO-SIMÕES

et al.,2006 e MELO et al., 2003).

Conforme descrito no apêndice 9, as três lâminas com cortes histológicos corados

pela Hematoxilina-Eosina de Harris foram avaliados por dois patologistas independentes,

sendo contado em microscópio óptico Nikon (Eclipse E 200®) sob magnificação de 40x, o

número de figuras de mitoses em dez campos aleatórios (figura 4).

FIGURA 4 – CORTE HISTOLÓGICO (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO PELA HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS DETALHES AS FIGURAS DE MITOSES.

REFERÊNCIA: AUTOR

Para a obtenção dos resultados, as leituras individuais foram tabuladas em planilha

Excel e submetidas à validação pela aplicação de critérios estatísticos sendo que se os

3. Método

61

valores das três diferentes leituras não apresentassem diferença significante (p>0,05) então

esses resultados eram considerados válidos e era calculada a média das leituras daquele

critério naquele grupo de ratos. Os valores individuais das leituras estão disponibilizados na

tabela 22. A seguir foram calculadas as médias e os intervalos de confiança 95% de cada

sub-grupo e comparados estatisticamente pelo método de t Student.

3.5.3.2 Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)

O antígeno nuclear de proliferação de células (PCNA) é encontrado em todas as

espécies eucarióticas que atua na ativação da DNA-polimerase, que é necessário para a

síntese de DNA durante a replicação, sendo assim reconhecido como marcador de

viabilidade celular (WOJCIECH e ZIEMIENOWICZ, 2013), ou de atividade proliferativa. No

entanto, além da replicação do DNA, outras funções do PCNA se destacam por estarem

associadas a outros processos celulares vitais como remodelação da cromatina, reparo do

DNA, coesão da cromátide irmã e controle do ciclo celular (THEOCHARIS et al.,1981).

FIGURA 5 – CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO NOS DETALHES OS NÚCLEOS POSITIVOS.

REFERÊNCIA: AUTOR

Para a avaliação da viabilidade celular no parênquima hepático de ratos submetidos

à hepatectomia parcial foi empregada técnica imunohistoquímica pela marcação com

anticorpo primário anti-PCNA diluído a 1:100 (marca AbCam, monoclonal de coelho clone

ab18197®) e anticorpo anti PCNA 1:400 (marca Dako, monoclonal de camundongo, clone

3. Método

62

QBEnd10®), (figura 5). As lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido da

identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3 conforme descrito no

apêndice 10. Os valores individuais das leituras estão disponibilizados na tabela 23.

3.5.3.3 Avaliação da densidade microvascular pelo CD34

Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 4µm de espessura

estendidos em lâminas de vidro e submetidos aos anticorpos anti-CD34. A marcação dos

cortes histológicos com anticorpo anti-CD34, permite a quantificação da densidade

microvascular cicatricial. O antígeno CD34 é uma proteína transmembrana encontrada na

superfície de células endoteliais, que atua na ligação com receptores específicos de adesão

celular. O CD34 é expresso difusamente nos microvasos cicatriciais e seus níveis de

expressão podem se correlacionar à qualidade do processo cicatricial (MOLGAARD,

SPURR e GREAVES, 1989).

FIGURA 6 – CORTE HISTOLÓGICO (100X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO CORADO POR TÉCNICA IMUNOHISTOQUÍMICA COM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, APÓS 48 HORAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL.

REFERÊNCIA: AUTOR

Foi empregado o método da imunoperoxidase com o uso da técnica da

estreptavidina-biotina, com controles positivo e negativo, seguindo a especificação do

fabricante (Biotin anti-CD34 antibody clone QBEnd/10®, Dako Corporation Glostrub

Denmark) diluído a 1:350 (HSU, RAINE e FANGER, 1981). As reações foram consideradas

positivas, quando se detectou reação marrom, excluindo-se as prováveis áreas de coloração

3. Método

63

de fundo com padrão de reação nuclear, sendo que qualquer célula endotelial ou grupo de

células endoteliais de coloração marrom, independentemente do tamanho, claramente

separada de outros elementos imunocorados, eram considerados um microvaso (figura 6). A

análise foi realizada por histometria computadorizada, conforme descrito no apêndice 11. Os

resultados foram expressados em densidade tecidual de miocrovasos em uma área de

7.578,94 µ2, como média de três leituras em diferentes campos microscópicos e os valores

individuais das leituras estão disponibilizados na tabela 25.

3.5.3.4 Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático.

As lâminas com cortes histológicos corados pelo Tricrômico de Gomori foram

avaliadas para a pesquisa de áreas fibróticas, caracterizadas pela presença de colágeno

que coravam-se em verde azulado e os demais componentes teciduais em tonalidades

vermelho a laranjadas. Para a obtenção dos resultados, foram procedidas três leituras de 10

campos diferentes em cada lâmina, anotando em protocolo as ocorrências de área fibróticas

(figura 7) (QUARESMA et al., 2006) conforme apêndice 12 e os valores individuais das

leituras estão disponibilizados na tabela 28.

FIGURA 7 – CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO TRICRÔMICO DE GOMORI, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL, DEMONSTRANDO ÁREAS DE FIBROSE NOS DETALHES “A” E “B”.

REFERÊNCIA: AUTOR

3.5.3.5 Avaliação histopatológica do parênquima hepático

A

B

3. Método

64

Para a avaliação histopatológica do parênquima hepático em regeneração foi

utilizada a coloração de Hematoxilina & Eosina de Harris (HE) e as análises foram feitas em

triplicatas por dois avaliadores treinados, não sendo informados dos critérios para as

identificações das lâminas conforme descrito no apêndice 13. Foram avaliadas as seguintes

características histológicas (ROHDEN et al., 2000; QUARESMA et al., 2006):

• Ausência de alterações

• Porcentagens de ocorrências de edema, hemorragia, congestão, proliferação

ductal.

Os valores individuais das leituras estão disponibilizados na tabela 30.

FIGURA 8 – CORTES HISTOLÓGICOS (40X) DE AMOSTRA DE FÍGADO DE RATO TRATADO PELO BEVACIZUMABE, CORADO PELO MÉTODO HEMATOXILINA E EOSINA DE HARRIS. NO DETALHE “A” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE HEMORRAGIA E INFLAMAÇÃO INTRAPARENQUIMATOSAS. NO DETLAHE ¨B¨, APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE CONGESTÃO INTRAPARENQUIMATOSAS, E NO DETALHE “C” APÓS 15 DIAS DE HEPATECTOMIA PARCIAL OBSERVA-SE INTENSA PROLIFERAÇÃO DUCTAL.

REFERÊNCIA: AUTOR

3.5.4 AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS

A B C

3. Método

65

Os resultados foram expressos como média ± intervalo de confiança 95% (IC95%).

Onde:

X= média aritmética, σ= desvio padrão, N= número da amostra.

Empregaram-se os testes de ANOVA e T-Student com p ≤ 0,05 para as

comparações entre os grupos através do software GraphPad InStat®.

4. Resultados

66

4.1. AVALIAÇÃO PONDERAL

Não foram observadas diferenças nas pesagens entre os sub-grupos no início do

estudo (T0) com p = 0,7941. Não ocorreram mortes dos ratos durante o experimento e

houve variação nos pesos conforme os sub-grupos, cujos valores individuais encontram-se

descritos na tabela 10. No gráfico 1 e na tabela 2 pode-se observar a variação das médias

dos pesos, no grupo controle, sub-grupo C48, não houve diferença significante entre T0 e

T48 (p=0,6757). No C15, quando comparados T0 e T48 não houve diferença significante

(p=0,8642), porém houve diferença nas comparações entre T0 e T15 (p=0,0003) e entre T15

e T48 (p=0,0004). No grupo tratado pelo bevacizumabe, BV48, não houve diferença

significante entre T0 e T48 (p=0,4252). No BV15, não houve diferenças significantes quando

comparados T0 e T48 (p=0,6430), T0 e T15 (p=0,4452) e entre T15 e T48 (p=0,7597). Entre

os C15-T15 e BV15-T15 não houve diferenças (p=0,0691).

GRÁFICO 1 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO PONDERAL DOS GRUPOS E SUB-GRUPOS.

TABELA 2 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS PESAGENS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS

Grupos Sub-grupos comparados p

Controle

C48 C48-T0 X C48 - T48 0,6757

C15 C15-T0 X C15-T48 0,8642 X C15-T15 0,0003

C15-T48 X C15-T15 0,0004

Bevacizumabe

BV48 BV48-T0 X BV48 - T48 0,4252

BV15 BV15-T0 X BV15-T48 0,6430 X BV15-T15 0,4452

BV15-48 X BV15-T15 0,7597

4. Resultados

67

4.2. AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS SÉRICAS

4.2.1. Dosagem de Albumina

Conforme demonstrado no gráfico 2 e na tabela 3, não houve diferenças estatísticas

nas dosagens de albumina entre os sub-grupos avaliados em T48 e T15. Os valores

individuais encontram-se descritos nas tabelas 13 e 14.

GRÁFICO 2 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS GRUPOS E SUB-GRUPOS.

TABELA 3 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE ALBUMINA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS

Sub-grupos comparados Valor de p

C48 X C15 0,6928 X BV48 0,8885 X BV15 0,8107

C15 X BV48 0,7169 X BV15 0,6471

BV48 X BV15 0,7804

4. Resultados

68

4.2.2. Dosagem de Bilirrubinas Total, Direta e Indireta

Conforme demonstrado no gráfico 3 e na tabela 4, não houve diferenças estatísticas

nas dosagens de bilirrubina total, bilirrubina direta e bilirrubina indireta entre os sub-grupos

avaliados em T48 e T15. Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 15 e 16.

GRÁFICO 3 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE

BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS.

TABELA 4 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE BILIRRUBINAS TOTAL, DIRETA E INDIRETA DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS

Sub-grupos comparados Valores de p BT BD BI

C48 X C15 0,0809 0,5833 0,4352 X BV48 0,3217 0,5833 0,9557 X BV15 0,7252 0,0000 0,0611

C15 X BV48 0,0152 0,0262 0,4137 X BV15 0,0443 0,0005 0,2275

BV48 X BV15 0,4997 0,1242 0,0503

4. Resultados

69

4.2.3. Dosagem de Transaminases glutâmico-oxalacética (TGO) e glutâmico-pirúvica (TGP)

Conforme demonstrado no gráfico 4 e na tabela 5, houve diminuição estatisticamente

significante na dosagem de transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) entre os grupos C48

e C15 (p=0,0002). Nas dosagens da transaminase glutâmico-pirúvica (TGP) ocorreu

aumento significante no C15 em comparação ao C48 (p=0,0169). Os valores individuais

encontram-se descritos nas tabelas 16 e 17.

GRÁFICO 4 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS DOSAGENS DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) GRUPOS E SUB-GRUPOS.

TABELA 5 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DOSAGENS DE DE TRANSAMINASES GLUTÂMICO-

OXALACÉTICA (TGO) E GLUTÂMICO-PIRÚVICA (TGP) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS

Sub-grupos comparados Valores de p TGO/AST TGP/ALT

C48 X C15 0,0002 0,0169 X BV48 0,5892 0,2487 X BV15 0,0029 0,4449

C15 X BV48 0,0014 0,2476 X BV15 0,4732 0,0902

BV48 X BV15 0,1569 0,6506

4. Resultados

70

4.2.4. Determinação do Índice aspartato-aminotransferase / plaquetas (APRI)

Conforme demonstrado no gráfico 5 e na tabela 6, nas determinações dos índices

aspartato-aminotransferase / plaquetas houve diferença significante entre os sub-grupos

C48 e C15 (p=0,0031), C48 e BV 15 (p=0,0135) e C15 e BV 48 (p=0,0415). Contudo, não

houve diferenças significantes nas comparações entre os grupos C48 e BV 48 (p=0,6782),

C15 e BV 15 (p=0,5814), BV48 e BV15 (p=0,1001). Os valores individuais encontram-se

descritos nas tabelas 19 e 20.

GRÁFICO 5 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DO ÍNDICE

ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS.

TABELA 6 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DO ÍNDICE DA RELAÇÃO ASPARTATO-AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS


C48 X C15 0,0031 X BV48 0,6782 X BV15 0,0135

C15 X BV48 0,0415 X BV15 0,5814

BV48 X BV15 0,1001

4. Resultados

71

4.3. AVALIAÇÕES MICROSCÓPICAS

4.3.1. Determinação do Índice Mitótico

Conforme demonstrado no gráfico 6 e na tabela 7, nas determinações dos índices

mitóticos houve diferença significante entre os sub-grupos C48 e C15 (p=0,0016), C48 e BV

15 (p=0,0002), C15 e BV 48 (p=0,0001) e BV48 e BV15 (p=0,0000). Contudo, não houve

diferenças significantes nas comparações entre os grupos C48 e BV 48 (p=0,7816), C15 e

BV 15 (p=0,1576). Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 21 e 22.

GRÁFICO 6 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DAS

DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS SUB-GRUPOS.

TABELA 7 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES MITÓTICOS DOS DOS SUB-GRUPOS AVALIADOS


C48 X C15 0,0016 X BV48 0,7816 X BV15 0,0002

C15 X BV48 0,0001 X BV15 0,1576

BV48 X BV15 0,0000

4. Resultados

72

4.3.2. Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)

Conforme demonstrado no gráfico 7 e na tabela 8, nas avaliações de viabilidade

celular pela pesquisa imunohistoquímica do PCNA, houve diferença significante entre os

sub-grupos C48 e C15 (p=0,0000), C48 e BV 15 (p=0,0001), C15 e BV 48 (p=0,0000), C15

e BV 15 (p=0,0000) e BV48 e BV15 (p=0,0000). Contudo, não houve diferenças significantes

nas comparações entre os grupos C48 e BV 48 (p=0,0561). Os valores individuais

encontram-se descritos nas tabelas 23 e 24.

GRÁFICO 7 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA

VIABILIDADE CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA

TABELA 8 - AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS DA AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO PCNA


C48 X C15 0,0000 X BV48 0,0561 X BV15 0,0001

C15 X BV48 0,0000 X BV15 0,0000

BV48 X BV15 0,0000

4. Resultados

73

4.3.3. Avaliação da densidade microvascular pelo CD34

Conforme demonstrado no gráfico 8 e na tabela 9, nas avaliações de densidade

vascular pela pesquisa imunohistoquímica do antígeno CD34, não houve diferença

significante entre os sub-grupos C48 e C15 (p=0,8049) e C15 e BV48 (p=0,8644), C15 e BV

48 (p=0,6853). Contudo, houve diferenças significantes nas comparações entre os grupos

C15 e BV 15 (p=0,0162), BV48 e BV15 (p=00080). Os valores individuais encontram-se

descritos nas tabelas 25 e 26.

GRÁFICO 8 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO DA DENSIDADE MICROVASCULAR PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34

TABELA 9 – AVALIAÇÕES ESTATÍSTICAS ENTRE AS AVALIAÇÕES DA AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE PELA PESQUISA IMUNOHISTOQUÍMICA DO CD34


C48 X C15 0,8049 X BV48 0,8644 X BV15 0,0101

C15 X BV48 0,6853 X BV15 0,0162

BV48 X BV15 0,0080

4. Resultados

74

4.3.4. Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático.

Conforme demonstrado no gráfico 9, houve ocorrência de fibrose hepática em todos

os ratos do sub-grupo BV15. Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 27

28.

GRÁFICO 9 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO OCORRÊNCIA DE FIBROSE NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO NOS SUB-GRUPOS.

4. Resultados

75

4.3.5. Avaliação histopatológica do parênquima hepático

Conforme demonstrado no gráfico 10, as porcentagens de alterações

histopatológicas do parênquima hepático diferiram entre os sub-grupos. No sub-grupo C48

houve 37,5% de edema, 25% de congestão e 12,5% de proliferação ductal. No sub-grupo

C15, não ocorreu edema, ocorreram 15% de congestão e 37,5% de proliferação ductal. No

sub-grupo BV48, ocorreu 62,5% de edema, 100% de congestão e 12,5% de proliferação

ductal. No sub-grupo BV15 houve 87,5% de edema, 100% de congestão e 37,5% de

proliferação ductal. Os valores individuais encontram-se descritos nas tabelas 29 e 30.

GRÁFICO 10 - DEMONSTRATIVO DAS MÉDIAS E INTERVALOS DE CONFIANÇA 95% DA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DOS SUB-GRUPOS.

5. Discussão

76

5.1 O MODELO EXPERIMENTAL

A escolha do rato para este estudo foi feita por ser animal de pequeno porte

adaptado ao ambiente laboratorial, aquisição acessível e fácil manejo em alojamento

múltiplo e alimentação específica para espécie, bem como ser possível padronização de

variáveis como raça, idade e sexo (GODOY et al. 2006). A importância dos modelos de

hepatectomia parcial em roedores tem sido ressaltada e bastante utilizada porque estes

propiciam abordagem mais conveniente para o estudo deste processo, dada sua grande

semelhança com a situação humana como ausência de lesão ou inflamação tecidual

imediata e definição precisa do ponto inicial de tempo quando a regeneração hepática é

desencadeada (CLAVIEN et al. 2008, MADRIHAMOV et al. 2006).

No presente estudo foram utilizados 32 ratos da linhagem Wistar, com idades entre

112 a 125 dias e pesos de 201,8 ± 9,27 gramas, separados em quatro grupos com pesos

similares (p=0,7941) o que demonstra a homogeneidade dos grupos no início do

experimento.

O experimento cirúrgico, hepatectomia parcial, foi realizado em todos os ratos em

um único ciclo de atividades por uma equipe treinada para o propósito, sendo os

procedimentos executados em condições de esterilidade. Os princípios do bem estar animal

incluindo o controle da dor e o procedimento de eutanásia (SCHANAIDER e SILVA, 2004)

foram aplicados de acordo com as normativas do Conselho Federal de Medicina Veterinária.

Optou-se pela avaliação dos fígados em regeneração após o tratamento com BV,

nos períodos de 48 horas e 15 dias após a hepatectomia parcial a partir de estudo similar

que avaliou em 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 e 14 dias (DOGRUL et al., 2010).

A dose empregada foi de 5mg/kg de peso (PAVLIDIS et al., 2010, Hubert et al.,

2015), havendo referências de experimentos em diferentes animais e também diferentes

doses. A dose de 2,5mg/kg foi empregada em ratos para avaliar a indução de aderências

intra-abdominais em modelo experimental de abrasão no ceco e observaram menor

severidade das adesões (INGJATOVIC et.al., 2010). Em coelhos utilizaram doses de

50mg/kg BV, superiores às recomendadas em seres humanos, em modelo de cicatrização

5. Discussão

77

de anastomose intestinal e concluíram que o uso pré-operatório de BV pode afetar

negativamente a resistência da anastomose intestinal (NAKAMURA, 2016).

5.2 ANGIOGÊNESE E REGENERAÇÃO HEPÁTICA

Apesar de décadas de pesquisas dedicadas à regeneração do fígado, a

compreensão da sequência e coordenação dos eventos que controlam o processo tem sido

considerada ainda imprecisa, porém ainda assim, sua importância é reconhecida como vital

para a investigação de possibilidades para a obtenção de benefícios clínicos (MAO et al.,

2014).

A regeneração hepática após hepatectomia experimental parcial a 70% está

associada à angiogênese, como consequencia do aumento da densidade vascular. Inibição

da angiogênese leva ao atraso na regeneração hepática, confirmando que esta é, pelo

menos, parcialmente dependente da angiogênese como evidenciado em estudos com

tratamentos antiangiogênicos com angiostatina e fator de crescimento endotelial vascular

(VEGF) (DRIXLER et al., 2002).

A recuperação da massa e da função hepática original, após hepatectomia parcial a

70% é extremamente importante após lesões, ressecções e transplantes de doadores vivos.

Requer interação dinâmica de vários tipos de células com destaque especialmente crítico

para as células endoteliais hepáticas sinusoidais (LSEC), secretoras da angiopoietina-2

(Ang-2). Verificou-se que a Ang-2 era regulada para baixo na fase inicial da regeneração do

fígado (dias 0-3) com recuperação dos níveis de Ang-2 durante a fase posterior da

regeneração do fígado (dias 4 a 8). Como a fase inicial corresponde à proliferação de

hepatócitos e a fase posterior de regeneração de células não parenquimatosas (LSEC,

células de Kupffer e células estreladas) e angiogênese, os autores levantaram a hipótese de

que a Ang-2 derivada da LSEC pode ter ações e mecanismos duais durante ambas as fases

da regeneração hepática. Na fase angiogênica, a supra-regulação de Ang-2 provoca a

sinalização de VEGFR-2 para induzir a proliferação de células não parenquimatosas. Assim,

uma única molécula, Ang-2, pode regular a regeneração hepática através de efeitos

5. Discussão

78

específicos do tipo temporal e celular. Está se tornando cada vez mais reconhecido que a

angiogênese - a formação de nova microvasculatura a partir de vasos sangüíneos

preexistentes - é essencial para a regeneração do fígado prosseguir até a conclusão (DING

et al., 2010).

No presente estudo foi empregado o método imunohistoquímico pela

imunomarcação do antígeno CD34 com anticorpo monoclonal anti-CD34 para avaliar a

densidade microvascular (angiogênese) do parênquima hepático após a hepatectomia

parcial nos períodos propostos. O CD34 é considerado como um dos marcadores de

neovascularização, a expressão de células endoteliais CD34 positivas pode desempenhar

um papel importante na compreensão do processo de angiogênese (AMARAPURKAR et al.,

2008).

O CD34 apresenta alta especificidade, apesar de ter alguma coloração linfática e

estromal (HASAN, BYERS e JAYSON, 2002), porém, outros anticorpos marcadores podem

ser usados para identificação da microvascularização, como o anti-CD31, anti-FVIII e anti-

CD105 (VERMEULEN et al., 2002). No presente estudo as avaliações das imunomarcações

com anticorpo monoclonal anti-CD34 não diferiram (p=0,1276) entre os grupos avaliados

nas 48 horas, C48 e BV48, após a hepatectomia, podendo-se concluir que o BV não exerce

efeito antiangiogênico de forma precoce. Contudo, no décimo quinto dia de evolução, houve

diferença significante (p=0,0162) na imunomarcação entre os grupos tratados com BV,

sendo a média do BV15 inferior à média do BV48 o que permite inferir que houve efeito

antiangiogênico.

5.3 A VIABILIDADE CELULAR, ANGIOGÊNESE E A FUNÇÃO HEPÁTICA

A avaliação do PCNA é consagrada na avaliação da viabilidade celular,

considerando a regeneração como um todo, ou seja, incluindo células parenquimais. Gaglio

e colaboradores em 2002 avaliaram a regeneração hepática em primatas não humanos

comparando Ki-67 e PCNA e os resultados foram semelhantes. Utilizaram amostras de

5. Discussão

79

biopsia por laparoscopia nos dias 1, 2, 7, 14, 30 e 60 em cinco animais com cinco anos de

vida, submetidos à hepatectomia de 30 e 60 %. Nesse mesmo estudo, relatam que entre o

14º e 20º dias houve aumento significativo da marcação, com marcações máximas de

PCNA, o que concluiram coincidir com a regeneração hepática máxima.

Assy e colaboradores (1999) relatam em estudo com ratos após hepatectomia em 0,

3, 6, 12, 24, 48 e 96 horas, aumento abrupto em 48 horas dos níveis de proteína PCNA

marcada pelo Western blotting, considerado quatro vezes maiores que os valores de

referência permanecendo até 72 horas pós-hepatectomia. Este resultado foi comparado com

o estudo de Assy e Minuk (1997), quando também avaliaram a regeneração hepática em

hepatectomia através da imunomarcação de PCNA comparada à incorporação de 3H-

timidina no tecido hepático.

No estudo de Hashimoto e Sanjo (1997), houve aumento da expressão de PCNA nas

24 horas, com pico máximo 36 horas pós hepatectomias em 16 ratos, separados em quatro

grupos de quatro animais, sendo o controle, hepatectomias a 35%, 68% e 85%.

No presente estudo houve aumento significante nas avaliações da viabilidade celular

no grupo controle, sub-grupo C15 (p=0,0000) quando comparado ao C48, sendo

considerado o padrão de normalidade para o pós-hepatectomia parcial sem tratamento. Nos

grupos tratados pelo BV houve comportamento contrário nesta avaliação, pois o BV15

demonstrou média significantemente menor que o C48 (p=0,0000) o que pode ser

considerado como efeito do tratamento com BV.

Quando comparadas as avaliações entre os sub-grupos BV48 e BV15 em relação à

avaliação da viabilidade celular pela imunomarcação com anti-PCNA e a avaliação da

angiogênese pelo anti-CD34 pode-se observar nos gráficos 7 e 8 a mesma tendência

dessas aferições, ou seja os sub-grupos BV15 e BV48 apresentaram diminuição quando

comparada em ambas. É sabido que o bloqueio do VEGF induz a supressão completa da

proliferação de hepatócitos bem como das células endoteliais após a hepatectomia parcial

em ratos (BOCKHORN et al., 2007, TANIGUSHI et al., 2001) o que amparam os resultados

acima discutidos.

5. Discussão

80

As funções do fígado são múltiplas e imprescindíveis para a regulação e equilíbrio

homeostático. Alguns testes bioquímicos podem ser usados para avaliar algumas destas

funções, como dosagem da ALT, da AST, relação AST/ALT, gama-GT, fosfatase alcalina,

tempo de protrombina, albumina e bilirrubinas. Contudo, mesmo na doença hepática grave

ainda pode apresentar níveis normais das enzimas hepáticas, ou acarretar alterações de 1,5

a três vezes acima dos níveis de referência (ANTONELLO et al. 2010; AGUIAR et al. 2011,

SILVA et al. 2015).

Aguiar e colaboradores em 2011 apresentaram estudo relatando alterações da

função hepática no fígado remanescente de 50 ratos após hepatectomia de 70% e

submetidos a diferentes graus de plicatura de veia cava inferior supra-hepática. Além da

lesão tecidual hepática pela hepatectomia, ocorreram diferentes graus de lesões causadas

pela hipertensão que os fígados remanescentes sofreram, confirmadas pelos níveis de

colesterol, proteínas totais, albumina e globulinas e o tempo de ativação da protrombina, as

transaminases ALT e AST, a fosfatase alcalina, a gama-glutamil-transpeptidase, a glicemia,

tempo de tromboplastina parcial ativada e a excreção de bilirrubinas apresentaram valores

dentro da normalidade. Os resultados encontrados no presente estudo, são concomitantes,

sem alterações significativas entre todos os grupos na avaliação de albumina, bilirrubinas

totais, TGO e TGP. Em reflexão citada por Wu e colaboradores em 2017, onde mencionam

que, mesmo quando os pacientes com AST normal, considerada marcador sérico na

previsão da inflamação, eles ainda podem ter risco significativamente agravado ou

progressão de doença hepática o que ampara a observação no presente estudo de que

mesmo que o BV tivesse alterado de forma significativa a regeneração, avaliada por todos

os métodos entre os grupos, poder-se-ia ter encontrado parâmetros normais para as

avaliações laboratoriais bioquímicas. O mais surpreendente do processo regenerativo, além

da capacidade proliferativa do hepatócito, é o fato dessas células manterem

simultaneamente todas as funções fundamentais para manutenção da homeostase, como a

regulação do nível glicêmico, síntese de proteínas plasmáticas e fatores de coagulação,

secreção de bile, ciclo da uréia e biodegradação de compostos tóxicos (MICHALOPOLUS,

2007).

5. Discussão

81

5.4 OS ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS IMUNOHISTOQUÍMICOS E A REGENERAÇÃO

HEPÁTICA

As avaliações histopatológicas do parênquima hepático (gráfico 10) demonstraram

que as porcentagens de ocorrências dos achados edema, congestão e proliferação ductal

variaram conforme os sub-grupos. Quanto às porcentagens de ocorrência de edema o C48

apresentou 37,5%, BV48 62,5% e BV15 87,5%. Destaca-se o sub-grupo BV15 no qual não

foi evidenciado edema, seria então de inferir que no grupo controle, a reparação

parenquimatosa ocorreu antes do décimo quinto dia neste grupo e no BV15 ainda mantinha

alta porcentagem de edema. Quanto à ocorrência de congestão intra-hepática houve

diminuição entre o C48 (25%) e o C15 (12,5%) o que pode ser considerado que no

transcurso da regeneração no grupo controle houve melhora em relação à ocorrência de

congestão (QUARESMA et al., 2007). Sob esse mesmo aspecto, os grupos tratados pelo BV

não apresentaram melhora, pois a porcentagem de 100% de ocorrência de congestão

permaneceu nos sub-grupos BV48 e BV15. Resultados similares foram observados em

estudo sobre os efeitos do alopourinol na isquemia hepática quando concluíram que a

isquemia transitória normotérmica hepática causa significativas alterações histopatológicas

nos fígados de ratos. e o alopurinol exerceu efeito benéfico em relação à necrose

hepatocitária, o que reforça o envolvimento da enzima xantina oxidase no dano decorrente

da isquemia-reperfusão hepática (RHODEN e colaboradores, 2000).

Os achados histopatológicos anteriormente relatados podem ser justificados pelo

fato de que, após hepatectomia parcial o fluxo portal é o principal fator que contribui para a

resposta regenerativa do fígado. O aumento da perfusão hepática decorre de diferença

pressórica entre a veia porta e artéria hepática na parte remanescente, induzindo a uma

forma de infusão sanguínea nos espaços ajuzantes aos vasos dos lobos remanescentes, o

que pode justificar a ocorrência de congestão e edema após as hepatectomias parciais

(PETROIANU, et al., 2004).

Reforçando ainda os argumentos de Petroianu (2004), definiu-se que a hepatectomia

parcial a 70% é reconhecida como estímulo suficiente para o aumento do fluxo sanguíneo

5. Discussão

82

portal em duas a três vezes o volume basal, fato que conduz à lesão da microcirculação nos

10 minutos após a ressecção dos lobos hepáticos mediano e lateral esquerdo. Com o

aumento do fluxo sanguíneo portal em leito vascular reduzido, o qual provoca aumento da

resistência vascular, evidencia-se elevação na pressão da veia porta em 30 a 40%

caracterizando quadro de hipertensão portal transitória pós-hepatectomia o que caracteriza

a hiperplasia (QUARESMA et al., 2007; AGUIAR et al., 2011).

WU e colaboradores em 2017, em estudo para avaliar fibrose hepática e alterações

bioquímicas em pacientes com hepatite B crônica, aplicaram o teste APRI e dosaram TGP,

TGO, GGT, bilirrubinas e albumina em 323 pacientes, entre junho de 2015 a dezembro de

2016. As alterações dessa rotina laboratorial não foram significantes, mesmo em pacientes

que foram classificados com maior intensidade inflamatória ou em pacientes com diferentes

graus de fibrose. Assim, não era de se esperar alterações significantes no presente estudo,

pois os relatos experimentais de que nas hepatectomias a 70%, as provas de função

hepática permanecem dentro dos limites da normalidade (QUARESMA et al., 2007).

Dentro da mesma linha de investigação, os resultados deste estudo referentes à

expressiva ocorrência de fibrose hepática no grupo BV 15, observado pelo método

histoquímico com a coloração tricrômica de Gomori, não se relacionam aos resultados

obtidos no método APRI, quando neste método não houve significância no grupo BV15 em

comparação ao C48, C15 e BV 48 e assim, de acordo com o estudo de Wu e colaboradores

em 2017, pode-se indiciar a ausência de robustez da dosagem sérica de AST para

diagnosticar a inflamação hepática isolada.

O teste APRI é capaz de confirmar a existência de fibrose hepática significativa

(AMARAL, et al. 2007; ANTONELLO et al. 2010; DERBALA et al. 2015). O fator de

crescimento hematopoiético, mais importante na regulação do desenvolvimento de

megariócitos e produção de plaquetas, é produzido no fígado e no rim, portanto não se

espera que estados hepáticos doentes ou que sofrem injúrias físicas, tenham a quantidade e

função das plaquetas preservadas em todos os momentos, considerando a curta meia vida

das mesmas (ROZMAN & BOLTA, 2007; CLAVIEN, 2008). Portanto a insignificância

5. Discussão

83

estatística quando aplicado o método APRI no grupo BV 15, contracenando com a coloração

de Gomori é um dado que merece nova exploração.

Em estudo realizado por Zhang e colaboradores em 2016, onde além de comparar

métodos não invasivos, avaliaram a aplicação do método APRI e FIB-4 para fibrose grave e

na cirrose em pacientes infectados pelo vírus da hepatite B. Concluíram que a utilidade

clínica do FIB-4 e do APRI para fibrose precisa de mais validações externas em uma grande

população, antes de ser aplicada para predizer a fibrose em paciente com infecção pelo

vírus da hepatite B. O estudo de Murata e colaboradores (2008) relata que o contato direto

entre plaquetas e hepatócitos inicia a transdução de sinal de ativação de fatores de

crescimento como o VEGF. Lesurtel e colaboradores (2006) também referem aumento da

velocidade de regeneração hepática pela presença e homogeneidade das plaquetas. Wai e

colaboradores em 2003, citam que o APRI é capaz de confirmar a existência de fibrose

significativa e excluir a cirrose, o que o torna disponível, como alternativa, na prática clínica.

Assim, no presente estudo, a correlação de plaquetas com a regeneração hepática pela

aplicação do método APRI, parece conflitada com a histoquímica pela coloração tricrômica

de Gomori.

A fibrose hepática é um processo dinâmico que resulta de um desequilíbrio entre a

produção e a dissolução da matriz extracelular (ELPEK, 2014). Na angiogênese, há um

equilíbrio rigidamente controlado entre a sinalização do fator angiogênico, atividade /

sinalização de MMP, inibidores de angiogênese endógena e inibidores de MMP. Isso pode

explicar perfis de fibrose em distúrbios angiogênicos, visto não haver equilibrio (FOLKMAN,

2003; OH et al. 2004; RUNDHAUG, 2005).

Utilizou-se um inibidor de VEGF e observou-se fibrose hepática no grupo BV15, pela

histoquímica com coloração tricrômica de Gomori, bem como alterações significativas para

imunomarcação com anti-PCNA entre os grupos C48 e BV48 (p=0,0561) e entre os grupos

C15 e BV15 (p=0,0000). Observa-se que nesse contexto há quebra no equilíbrio da

angiogênese e muito provavelmente desiquilíbrio no comportamento da matriz através das

atividades das MMPs e inibidores das MMps, resultando em fibrose hepática no grupo

BV15.

5. Discussão

84

5.5 CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo contribui com algumas questões importantes e promissoras com

relação à regeneração hepática em vigência de tratamento com o BV, o que atualmente é

ainda pouco explorado na literatura especializada.

Entre os resultados obtidos, destacam-se a diminuição na imunomarcação com anti-

CD34 e anti-PCNA o que mostrou que o BV aos quinze dias de evolução exerceu efeito anti-

angiogênico e diminuiu a viabilidade celular. A ocorrência de fibrose nos ratos deste sub-

grupo poderia estar relacionada com os resultados anteriores? Essa indagação pode ser

considerada como perspectiva para proposta futura a partir deste estudo, abordando a

possibilidade de que o fígado regenerado em vigência de angiogênese comprometida

poderia sofrer estresse oxidativo (EO) e ativação de metaloproteinases como causas de

alterações como a fibrose e ainda como evitar essa condição com o uso e antioxidantes ou

inibidores de enzimas ativadoras de EO.

Outra abordagem futura seria ampliar o período observacional superior a quinze dias

para que as avaliações de viabilidade celular e angiogênese possam ser definidas em maior

prazo e ainda se ocorreria a fibrose ora observada.

Bons resultados não encerram os temas, apenas nos direcionam a mais estudos.

6. Conclusões

85

6.1. A evolução ponderal do modelo experimental de hepatectomia parcial em

ratos não sofreu alterações pelo uso do Bevacizumabe na dose de 5mg/kg no

período de 15 dias de avaliação.

6.2. O Bevacizumabe não alterou o comportamento evolutivo dos índices

mitóticos entre as 48 horas e o décimo quinto dia de evolução pós-

hepatectomia.

6.3. O Bevacizumabe diminuiu a densidade microvascular no décimo quinto dia

de evolução pós-hepatectomia.

6.4. O Bevacizumabe diminuiu a viabilidade celular no décimo quinto dia de

evolução pós-hepatectomia.

6.5. O Bevacizumabe ocasionou alterações histopatológicas do parênquima

hepático quanto aos parâmetros edema, congestão e fibrose.

6.6. Não ocorreram alterações funcionais bioquímicas nos parâmetros Albumina,

Bilirrubinas, Transaminases e ínidice APRI, sob a ação do Bevacizumabe.

7. Referências Bibliográficas

86

1. SILVA, C.F.; SILVA, M.V.; OSORIO-DE-CASTRO, C.G.S. Os ensaios clínicos e o registro de anticorpos monoclonais e biomedicamentos oncológicos no Brasil. Rev Panam Salud Pública. Washington, 2016;39:149-56.

2. VIDAL, T.J.; FIGUEIREDO, T.A.; PEPE, V.L.E. O mercado brasileiro de anticorpos monoclonais utilizados para o tratamento de câncer. Cad. Saúde Pública. Rio de Janeiro, 2018; 34(12)

3. Diário Oficial da União 17 dezembro de 2010. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução RDC nº. 55, de 16 de dezembro de 2010. Dispõe sobre o registro de produtos biológicos novos e produtos biológicos e dá outras providências. Brasil.

4. REICHERT, J.M.; DHIMOLEA, E. The future of antibodies as cancer drugs. Drug Discov Today. Kidlington, 2012; 17:954-63

5. BILCHIK, A.J.; HECHT, J.R.; Perioperative risks of bevacizumab and other biologic agents for hepatectomy: theoretical or evidence based? J. Clin. Oncol. New York, v.26, n.11, p.1786-8, 2008.

6. FOLKMAN, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. New York, v.1, n.1, p.27-31, 1995.

7. PAVLIDIS, E.T.; BALLAS, K.D.; SYMEONIDIS, N.G.; PSARRAS, K.; RAFAILIDIS, S.F.; PAVLIDIS, T.E.; MARAKIS, G.N.; SAKANTAMIS, A.K. The effect of bevacizumab on colon anastomotic healing in rats. Int J Colorectal Dis. Berlin, v.25, p.1465–147, 2010.

8. HURWITZ, H.; FEHRENBACHER, L.; NOVOTNY, W.; CARTWRIGHT, T; HAINSWORTH, J.; HEIM, W.; BERLIN, J.; BARON, A.; GRIFFING, S.; HOLMGREN, E.; FERRARA, N.; FYFE, G.; ROGERS, B.; ROSS, R.; KABBINAVAR, F. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal câncer. N Engl J Med. Boston, v.350, n.23, p.2335-42, 2004.

9. FUH, G.; WU, P.; LIANG, W.; ULTSCH, M.; LEE, C.V.; MOFFAT, B.; WIESMANN, C. Structure-function studies of two synthetic anti-vascular endothelial growth factor fabs and comparison with the AvastinTM

Fab*S, J. Biol. Chem. Baltimore, v.281, n.10, p. 6625-31, 2006.

10. MILLET, G.; TRUANT, S.; LETEURTRE, E.; HEBBAR, M.; ZERBIB, P.; HUET, G.; BOLESLAWSKI, E.; PRUVOT, F.R. Volumetric analysis of remnant liver regeneration after major hepatectomy in bevacizumab-treated patients: a case-matched study in 82 patients. Ann Surg. Philadelphia, v.256, n.5, p.755-61, 2012.

11. AUSSILHOU, B.; DOKMAK, S.; FAIVRE, S.; PARADIS, V.; VILGRAIN, V.; BELGHITI, J. Preoperative liver hypertrophy induced by portal flow occlusion before major hepatic resection for colorectal metastases can be impaired by bevacizumab. Ann. Surg. Oncol. New York, v.16. p.1553–1559, 2009.

12. ZORZI, D., CHUN, Y.S., MADOFF, D.C., ABDALLA, E.K., VAUTHEY, J.N. Chemotherapy with bevacizumab does not affect liver regeneration after portal vein embolization in the treatment of colorectal liver metastases. Ann. Surg. Oncol. New York, v.15, n.10, p.2765-72, 2008.

13. DUPRE A, PARADISI A, LANGONNET S, GANDINI A, MEHLEN P, RIVOIRE M. Bevacizumab impairs hepatocyte proliferation after partial hepatectomy in a rabbit model. Anticancer Res. Athens, v.32, n.12, p.5193-200, 2012.

14. MICHALOPOULOS, G.K. Liver regeneration. J. Cell. Physiol. Philadelphia, v.213, p.286–300, 2007.

15. PISTOI, S.; MORELLO, D. Prometheus’ myth revisited: transgenic as a powerful tool to study liver regeneration. FASEB J, Bathesda, v. 10, n. 8, p. 819-828, 1996.


87

16. BARETTA, G.A.P.; GAMA FILHO, O.; TODERKE, E.L.; TOLAZZI, A.R.D.; MATIAS, J.E.F. Effect of cyclosporine on liver regeneration in partial hepatectomized rats, Acta Cir Bras, São Paulo, v.30, n.1, 2015.

17. BIONDO-SIMÕES, M.L.P.; MATIAS, J.E.F.; MONTIBELLER, G.R.; SIQUEIRA, L.C.D.; NUNES, E.S.; GRASSI, C.A. Effect of aging on liver regeneration in rats. Acta Cir. Bras. São Paulo, v.21, n.4, 2006.

18. GODOY, J.L.; MATIAS, J.E.F.; COELHO, J.C.U. Regeneraçao hepática: O mito de Prometeu revisado. J Bras Transpl. São Paulo, v.9, p.535-539, 2006.

19. MAO, S. A.; GLORIOSO, J.M.; SCOTT, L.N. Liver regeneration, Transl. Res. New York, v. 163. n.4, p. 352-362, 2014.

20. GREENE, A. K.; WIENER, S.; PUDER, M.; YOSHIDA, A.; SHI, B.; PEREZ-ATAYDE, A.R.; EFSTATHIOU, J.A.; HOLMGREN, L.; ADAMIS, A.P.; RUPNICK, M.; FOLKMAN, J.; O’REILLY, M.S. Endothelial-directed hepatic regeneration after partial hepatectomy. Ann. Surg. Philadelphia, v.237, p.530–535, 2003.

21. RIEHLE, K.J.; DAN, Y.Y.; CAMPBELL, J.S.; FAUSTO, F. New Concepts in Liver Regeneration, J Gastroenterol. Hepatol. Melbourne, v.26, n.1, p. 203–212, 2011.

22. FAUSTO, N.; CAMPBELL, J.S.; RIEHLE, K.J. Liver regeneration. Hepatology, Baltimore, v.43, n.2, Suppl. 1, 2006.

23. KARADENIZ, E.; OZBILGINA, M.; EGELIA, T.; AGALARA, C.; CEVLIKA, A.D.; AYSALB, A.; ELLIDOKUZC, H.; UNEKA, T.; ASTARCIOGLU, I. Assessment of Effect of Intraperitoneal Tacrolimus on Liver Regeneration in Major (70%) Hepatectomy Model After Experimental Pringle Maneuver in Rats. Transplant Proc, New York, v.51, p.1172-1179, 2019.

24. JESUS, R.P.; WAITZBERG, D.L.; CAMPO, F.G. Regeneração hepática: papel dos fatores de crescimento e nutrientes, Rev. Assoc. Med. Bras, São Paulo, v.46, n.3, 2000.

25. VAUTHEY, J.N.; ZORZI, M.D. In Search of the Black Sheep: Is It Bevacizumab or Extended Chemotherapy? Ann. Surg. Oncol, New York, v.16, p.1463-1464, 2009.

26. ASSY, N.; MINUK, G.Y. Liver regeneration: methods for monitoring and their applications. J Hepatol, Amsterdam, v.26, n.4, p.945-952, 1997.

27. BERTICELLI, J. Estimativa do volume hepático e sua correlação com o peso corpóreo durante a regeneração hepática após hepatectomia parcial em suínos. Curitiba, 2005. 90 f. Dissertação (Mestrado) - Setor de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Paraná.

28. KUWASHIMA, Y.; AOKI, K.; KOHYAMA, K.; ISHIKAWA, T. Hepatocyte regeneration after partial hepatectomy occurs even under severely thrombocytopenic conditions in rat. Jpn. J. Cancer Res. Tokio, v.81, p.607-612, 1990.

29. SOBRAL, F.A.; DAGA, H.; RASERA, H.N.; PINHEIRO, M.R.; CELLA, I.F.; MORAIS, I.H.; MARQUES, L.O.; Luiz Martins COLLAÇO, L.M. Ação do ácido tranexâmico na regeneração hepática após hepatectomia parcial: modelo experimental em ratos. Arq Bras Cir Dig. São Paulo, v.29, n.2, p.102–104, 2016.

30. AGUIAR, L.R.F.; NASSIF, P.A.N.; RIBAS, C.A.P.M.; CZECZKO, N.G., RIBAS, M.M.; MARINHO JÚNIOR, C.H.; WENDLER, E. Regeneração do fígado após hepatectomia parcial em ratos submetidos à hipertensão portal pós-hepática. ABCD, São Paulo, v.24, n.2, p.144-51, 2011.


88

31. ANTONELLO, V.S.; TOVO,C.V.; KLIEMANN, D.A.; SANTOS, B.R.; ZALTRON, V.F. Uso do score APRI na avaliação de doença hepática, após início de terapia antirretroviral, em pacientes portadores do HIV co-infectados com HCV versus monoinfectado por HIV. Rev Soc Bras Med. Trop, Brasilia, n.43, v.6, p.678-681, 2010.

32. SILVA, R.M.; MALAFAIA, O.; TORRES, O.J.M.; CZECZKO, N.G.; MARINHO JUNIOR; C.H.; KOZLOWSKI, R.K. Evaluation of liver regeneration diet supplemented with omega-3 fatty acids: experimental study in rats. Rev. Col. Bras. Cir. Rio de Janeiro, v.42, n.6, p.393-398, 2015.

33. WU, X.; CAI, B.; SU, Z.; LI, Y.; XU, J.; DENG, R.; WANG, L. Aspartate transaminase to platelet ratio index and gamma- glutamyl transpeptidase- to- platelet ratio outweigh fibrosis index based on four factors and red cell distribution width- platelet ratio in diagnosing liver fibrosis and inflammation in chronic hepatitis B. J. Clin. Lab. Anal. New York, v.32, p.1-8, 2018.

34. ZHANG, Z.; WANG, G.; KANG, K.; WU, G.; WANG, P. The Diagnostic Accuracy and Clinical Utility of Three Noninvasive Models for Predicting Liver Fibrosis in Patients with HBV Infection. PLoS ONE. San Francisco, v.11, n.4, p.1-12, 2016.

35. WAI, C.; GREENSON,J.K.; FONTANA, R.J.; KALBFLEISCH, J.D; MARRERO, J.A.; CONJEEVARAM,H.S.; LOK, A.S.F. A simple noninvasive index can predict both significant fibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C. Hepatology. Baltimore, v.38, n.2, p.518-526, 2003.

36. ANDIRAN, F.; AYHAN, A.; TANEYL, F.; ABBASOGLU, O.; SAYEK, I. Regenerative capacities of normal and cirrhotic livers following 70% hepatectomy in rats and the effect of alpha-tocopherol on cirrhotic regeneration. J Surg Res, New York, v. 89, n.2, p.184-8, 2000.

37. SELZNER, M. & CLAVIEN, P.A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology, Baltimore, v. 31, n. 1, p. 35-42, 2000.

38. THEOCHARIS, S.E.; AGAPITOS, E.B.; MARGELI, A.P.; GOUTAS, N.D.; KITTAS, C.N.; DAVARIS, P.S. Effect of two forms of granulocyte-colony-stimulating factor on hepatic regeneration after 70% partial hepatectomy in rats. Clin Sci (1979), London, v. 92, n. 3, p. 315-320, 1997.

39. ASSY, N.; SPIRA, G.; PAIZI, M. Effect of vascular endothelial growth factor on hepatic regenerative activity following partial hepatectomy in rats. J Hepatol, Amsterdam, n.30, p.911-915, 1999.

40. GAGLIO, P.J.; LIU, H.; DASH, S.; CHENG, S.; DUNNE, B.; RATTERREE, M.; BASKIN, G.; BLANCHARD, J.; BOHM JR, R.; THEISE, N.D.; LaBRECQUE, D. Liver regeneration investigated in a non-human primate model (Macaca mulatta). J Hepatol, Amsterdam, v. 37, n. 5, p. 625- 632, 2002.

41. CORBIN, I.R.; BUIST, R.; VOLOTOVSKYY, V.; PEELING, J.; ZHANG, M.; MINUK, G.Y. Regenerative activity and liver function folowing partial hepatectomy in the rat using 31 p-mr spectroscopy. Hepatology, Baltimore, v. 36, n. 2, p.345-353, 2002.

42. GUIMARÃES, M.V.T.N.; MOREIRA, G.H.G.; ROCHA, L.P.; NICOLUZZI, J.E.L.; SOUZA, C.J.F.; REPKA, J.C.D. L-arginine action in cutaneous flap evolution under nicotine exposure in rats. Rev. Col. Bras. Cir. Rio de Janeiro, v.40, n.1, p.49-54, 2013.

43. HASAN, J.; BYERS, R.; JAYSON, G.C. Intra-tumoral microvessel density in human solid tumors. Br. J. Cancer. London, v.86, n.10, p.15661577, 2002.


89

44. SIEMERINK, M.J; KLAASSEN,I.; VOGELS, I.M.C.; GRIFFIOEN, A.W.; VAN NOORDEN, C.J.; SCHLINGEMANN, R.O. CD34 marks angiogenic tip cells in human vascular endothelial cell cultures. Angiogenesis. London, v.15, p.151–163, 2012.

45. NAKAMURA, T.; HIRONORI, K.; IWAMOTO, H.; TSUTSUMI, V.; IMAMURA, Y.; NAITOU, M.; MASUDA, A.; IKEZONO, Y.; ABE, M.; WADA, F.; SAKAUE, T.; UENO, T.; II, M.; ALEV, C.; KAWAMOTO, A.; ASAHARA, A.; TORIMURA, T. Ex vivo expansion of circulating CD34+ cells enhances the regenerative effect on rat liver cirrhosis. Mol Ther Methods Clin Dev, New York, v.3, n.16025, 2016.

46. YOSHIDA, W.B. Angiogenesis, arteriogenesis and vasculogenesis: treatment of the future for lower limb critical ischemia? J. Vasc. Br. Rio de Janeiro. V.4, n.4, p.316-318, 2005.

47. CONWAY, E.M.; COLLEN, D.; CARMELIET, P. Molecular mechanisms of blood vessel growth. Cardiovasc. Res. London, v.49, n3, p.507-521, 2001.

48. CARMELIET, P. Manipulating angiogenesis in medicine. J. Intern. Med. Oxford, v.255, n.5, p.538-561, 2004.

49. CARMELIET, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. London, v.438, n.70, p.932-936, 2006.

50. ADAMS, R.H.; ALITALO, K. Molecular regulation of angiogenesis and lynphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol, London, v. 8, n.6, p.464-478, 2007.

51. KERBEL, R.S. Antiangiogenic therapy: a universal chemosensitization strategy for câncer? Science. New York, v.312, n.5777, p.1171-1175, 2006.

52. ROLAND, C.R.; DINEEN, S.P.; LYNN, K.D.; SULLIVAN, L.A.; DELLINGER, M.T.; SADEGH, L.; SULLIVAN, J.P.; SHAMES, D.S.; BREKKEN, R.A. Inhibition of vascular endothelial growth factor reduces angiogenesis and modulates immune cell infiltration of orthotopic breast cancer xenografts. Mol Cancer Ther, Dallas, v.8, p. 1761-1771, 2009.

53. SOYSAL S.; KOYUNCUOğLU M.; DOğAN Ö.E. A novel angiogenesis inhibitor bevacizumab induces apoptosis in the rat endometriosis model. Balkan J. Med. Genet. Sofia, v. 17, n. 2, p. 73-80, 2014.

54. ELPEK, G.Ö. Cellular and molecular mechanisms in the pathogenesis of liver fibrosis: An update. World. J. Gastroenterol. Beijing, v.20, N.23, p.7260-76, 2014.

55. FOLKMAN J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr. Mol. Med. Boca Raton, v.3, p.643–51, 2003.

56. OH, J.; SEO, D-W.; DIAZ, T.; WEI, B.; WARD, Y.; RAY, J.M.; MORIOKA, Y.; SHI, S.; KITAYAMA, H.; TAKAHASHI, C.; NODA, M.; STETLER-STEVENSON, W.G. Tissue inhibitors of metalloproteinase 2 inhibits endothelial cell migration through increased expression of RECK. Cancer Res. Baltimore, v.64, p.9062-69, 2004.

57. RUNDHAUG, J.E. Matrix metalloproteinases and angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. Bucharest, v.9, n.2, p.267-285, 2005.

58. CLAVIEN, P. Liver regeneration: a spotlight on the novel role of platelets and serotonin, Swiss Med. Wkly. Basel, v.138, n.25-26, p.361-70, 2008.

59. IBRAHIN, H.; WEISS, T.S. AUGMENTER OF LIVER REGENERATION: ESSENTIAL FOR GROWTH AND BEYOND. Cytokine and Growth Factor Reviews. Oxford, v.45, p. 65-80, 2019.


90

60. LAMBERTUCCI, J.R.; SILVA, L.C.S.; ANTUNES, C.M. Aspartate aminotransferase to platelet ratio index and blood platelet count are good markers for fibrosis evaluation in schistosomiasis mansoni. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. Brasilia, v.40, n.5, p. 599, 2007.

61. AMARAL, I.S.A.; DIAS, M.P.F.; FERNANDES, C.C.R.; MOIA, L.J.M.P.; MIRANDA, E.C.B.M.; DEMACHKI, S. Evaluation of APRI test as a liver fibrosis marker. Rev. Para. Med. Belém, v.21, n.4, 2007.

62. DERBALA, M.; ELBADRI, M.E.; AMER, A.M.; ALKAABI, S.; SULTAN, .H.; KAMEL, Y.M.; ELSAYED, E.H.S.; AVADES, T.Y.; CHANDRA, P.; SHEBL, F.M. Aspartate transaminase to platelet ratio index in hepatitis C virus and Schistosomiasis coinfection. World. J. Gastroenterol. Beijing, v.21, n.46, p.13132-13139, 2015.

63. ROZMAN, P.; BOLTA, Z.; Use of platelet growth factors in treating wounds and soft tissue injuries. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. Ljubljana, v.16, p.156-65, 2007.

64. PIETRAMAGGIORI, G.; SCHERER, S.S.; MATHEWS, J.C.; GENNAOUI, T.; LANCEROTTO, L.; RAGNO, G. et al. Quiescent platelets stimulate angiogenesis and diabetic wound repair. J Surg Res. New York, v.1, n.160, p.169–177, 2010.

65. LESURTEL, M.; GRAF, R.; ALEIL, B.; WALTHER, D.J.; TIAN, Y.; JOCHUM, W.; GACHET, C.; BADER, M.; CLAVIEN, P. Platelet-derived serotonin mediates liver regeneration. Science. New York, n.312, p.104-107, 2006.

66. MURATA, S.; OHKOHCHI, N.; MATSUO, R.; IKEDA, O.; MYRONOVYCH, A.; HOSHI, R. Platelets promote liver regeneration in early period after hepatectomy in mice. World J Surg. New York, v.31, p.808-816, 2007.

67. MATSUO, R.; OHKOHCHI, N.; MURATA, S.; IKEDA, O.; NAKANO, Y.; WATANABE, M.; HISAKURA, K.; MYRONOVYCH, A.; KUBOTA, T.; NARIMATSU, H.; OZAKI, M. Platelets strongly induce hepatocyte proliferation with IGF-1 and HGH in vitro. J Surg Res. New York, v.145, p.279–286, 2008.

68. RUDDELL, R.G.; MANN, D.A.; RAMM, G.A. The function of serotonin within the liver, Journal of Hepatology. Baltimore, v.4, p.666–675, 2008.

69. BONHAUS, D.W.; BACH, C.; DESOUZA, A.; SALAZAR, F.H.; MATSUOKA, B.D.; ZUPPAN, P.; CHAN, H.W.; EGLEN, R.M. The pharmacology and distribution of human 5-hydroxytryptamine2B (5-HT2B) receptor gene products: comparison with 5-HT2A and 5-HT2C receptors. Br. J. Pharmacol. London, v.115, p.622–628, 1995.

70. BARNES, N.M.; SHARP, T. A review of central 5-HT receptors and their function. Neuropharmacology, Oxford, n.38, p.1083-1152, 1999.

71. SINGER, A.J.; CLARK, R.A. Cutaneous wound healing. N Engl J Med. Boston, v.341, p.738-46, 1999.

72. FERRARA, N.; HILLAN,K.J.; NOVOTNY. Bevacizumab (Avastin), a humanized anti-VEGF monoclonal antibody for cancer therapy. Biochem. biophys. res. commun. New York, v.333, p. 328-335, 2005.

73. FOLKMAN, J. Tumor angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discov, London, v.6, n.4, p.273-286, 2007.

74. TADO, M.; MORI, T.; FUKUSHIMA, M.; OSHIMA, H.; MAEDA, T.; YOSHINO, A.; AIZAWA, S.; KATAYAMA, Y. Increased expression of vascular endothelial growth factor attenuates contusion necrosis without influencing contusion edema after traumatic brain injury in rats, J. Neurotrauma. New York, v.31, p.691–698, 2014.


91

75. SHANG, L.; XU, Y.; SHAO, C.; MA, C.; FENG,Y. Anti-Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Antibody Ameliorates Cartilage Degradation in a Rat Model of Chronic Sports Arthritic Injury. Med. Sci. Monit. Warsaw, v.24, p.4073-4079, 2018.

76. BÖNNINGHOFF, R.; SCHENKE, K.; KEESE, M.; MAGDEBURG, R.; BITTER-SUERMANN, H.; OTTO, M.; HASENBERG, T.; POST, S.; STURM, J. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. Otawa, v. 55, n.6, 2012.

77. CLAVIEN, P.A.; PETROWSKY H.; DEOLIVEIRA, M.L.; GRAF, R. Strategies for safer liver surgery and partial liver transplantation. N. Engl. J. Med. Boston, n.356, p.1545-59, 2007.

78. PEDIADITAKIS, P.; LOPEZ-TALAVERA, J.C.; PETERSEN, B.; MONGA, S.P.; MICHALOPOULOS, G.K. The processing and utilization of hepatocyte growth factor/scatter factor following partial hepatectomy in the rat. Hepatology. Baltimore, v.34, p.688–693, 2001.

79. BLOCK, G.D.; LOCKER, J.; BOWEN, W.C.; PETERSEN, B.E.; KATYAL, S.; STROM, S.C.; RILEY, T.; HOWARD, T.A.; MICHALOPOULOS, G.K. Population expansion, clonal growth, and specific differentiation patterns in primary cultures of hepatocytes induced by HGF/SF, EGF and TGF alpha in a chemically defined (HGM) medium. J. Cell. Biol. New York, v.132, p.1133–1149, 1996.

80. PATIJN, G.A.; LIEBER, A.; SCHOWALTER, D.B; SCHWALL, R.; KAY, M.A. Hepatocyte growth factor induces hepatocyte proliferation in vivo and allows for efficient retroviral-mediated gene transfer in mice. Hepatology. Baltimore, v.28, p.707–716, 1998.

81. STOLZ, D.B.; MARS, W.M.; PETERSEN, B.E.; KIM, T.H; MICHALOPOULOS, G.K. Growth factor signal transduction immediately after two-thirds partial hepatectomy in the rat. Cancer Res. Baltimore, v.59, p.3954–3960, 1999.

82. MONGA, S.P.; MARS, W.M.; PEDIADITAKIS, P.; BELL, A.; MULE, K.; BOWEN, W.C.; WANG, X.; ZARNEGAR, R.; MICHALOPOULOS, G.K. Hepatocyte growth factor induces Wnt-independent nuclear translocation of beta-catenin after Met-beta-catenin dissociation in hepatocytes. Cancer Res. Baltimore, n.62, p.2064–2071, 2002.

83. BOROWIAK, M.; GARRATT, A.N; WUSTEFELD, T.; STREHLE, M.; TRAUTWEIN, C.; BIRCHMEIER, C. Met provides essential signals for liver regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci U S A. Washington, v.101, p.10608– 10613, 2004.

84. KIRILLOVA, I.; CHAISSON, M.; FAUSTO, N. Tumor necrosis factor induces DNA replication in hepatic cells through nuclear factor kappa B activation. Cell Growth Differ. Philadelphia, n.10, p.819–828, 1999.

85. SAKAMOTO, T.; LIU, Z.; MURASE, N.; EZURE, T.; YOKOMURO, S.; POLI, V.; DEMETRIS, A.J. Mitosis and apoptosis in the liver of interleukin-6-deficient mice after partial hepatectomy. Hepatology. Baltimore, n.29, p.403–411,1999.

86. LIU, Z.; SAKAMOTO, T.; EZURE, T.; YOKOMURO, S.; MURASE, N.; MICHALOPOULOS, G.; DEMETRIS, A.J. Interleukin-6, hepatocyte growth factor, and their receptors in biliary epithelial cells during a type I ductular reaction in mice: Interactions between the periductal inflammatory and stromal cells and the biliary epithelium. Hepatology. Baltimore, n.28, p.1260–1268, 1998.

87. NOZAKI, I.; LUNZ, J.G.; SPECHT, S.; STOLZ, D.B.; TAGUCHI, K.; SUBBOTIN, V.M.; MURASE, N.; DEMETRIS, A.J. Small proline-rich proteins 2 are noncoordinately upregulated by IL-6/STAT3 signaling after bile duct ligation. Lab. Invest. Baltimore, v.85, p.109–123, 2005.


92

88. DEMETRIS, A.J.; LUNZ, J.G.; SPECHT, S.; NOZAKI, I. Biliary wound healing, ductular reactions, and IL-6/gp130 signaling in the development of liver disease. World. J. Gastroenterol. Beijing, v.12, p.3512–3522, 2006.

89. FAGUNDES, D.J.; TAHA, M.O. Modelo animal de doença: critérios de escolha e espécies de animais de uso corrente. Acta Cirúrgica Brasileira, São Paulo, v. 19, p. 59-65, 2004.

90. MARTINS, P.N.A.; THERUVATH, T.P.; NEUHAUS, P. Rodent models of partial hepatectomies. Liver Int. Oxford, v.28, n.1, p.3-11, 2008.

91. MADRAHIMOV, N.; DIRSCH, O.; BROELCH, C.; DAHMEN, U. Marginal Hepatectomy in the Rat – from anatomy to surgery, Annals of Surgery. Philadelphia, v.12, n.1, p.89-98, 2006.

92. MELO, J.U.S; CAMPOS JÚNIOR, M.M.; SANTOS, J.M.V.; BARRETO, M.V.A.; KIMURA, O.S. O estresse oxidativo na regeneração hepática em ratos. Rev. Col. Bras. Cir. Rio de Janeiro, v. 35, n.6, p.: 411-415, 2008.

93. EULÁLIO, J.M.R; FERREIRA, M.L.; SILVA, P.C.; MANSO, J.E.F.; NICOLAU, A.F.C.; CARVALHO, T.P.; SILVA, J.R.S.P; FERNANDES, A.R.; Schanaider, A. A technical note on low cost rat laparoscopy an initial experience. Acta Cir. Bras. São Paulo, v.33, n.9, p.853-861, 2018.

94. NEVZOROVA, Y.A.;TOLBA, R.;TRAUTWEIN, C.; LIEDTKE, C. Partial hepatectomy in mice. Lab. Anim. London, v.49(S1), p.81-89, 2015.

95. KUBOTA, T.; TAKABE, K.; YANG, M. Minimum sizes for remnant and transplanted livers in rats. J Hepatobiliary. Pancreat. Surg. Tokyo, v.4, p.398–403, 1997.

96. GRUENBERGER, B.; TAMANDL, D,; SCHUELLER, J.; SCHEITHAUER, W.; ZIELINSKI, C.; HERBST, F.; GRUENBERGER, T. Bevacizumab, Capecitabine, and Oxaliplatin As Neoadjuvant Therapy for Patients With Potentially Curable Metastatic Colorectal Cancer. J Clin Oncol. New York, v.26, n.11, p.1830-1835, 2008.

97. BASBUG, M.; BULBULLER, N.; CAMCI, C.; AYTEN, R.; AYGEN, E.; OZERCAN, I.H.; ARIKANOGLU, Z.; AKBULUT, S. The Effect of Antivascular Endothelial Growth Factor onthe Development of Adhesion Formation in Laparotomized Rats: Experimental Study, Gastroenterology Research and Practice, Cairo, v.1, 2006.

98. MACHADO, D.E.; PERINI, J.A.; ORLANDO, M.M.C.; SANTOS-OLIVEIRA, R. Developing a Noninvasive Procedure Using Labeled Monoclonal Antibody Anti-VEGF (Bevacizumabe) for Detection of Endometriosis. Biomed. Res. Int. New York, v. 2015, 4 pages, 2015.

99. NAKAMURA, H.; YOKOYAMA Y.; UEHARA, K.; KOKURYO , T.; YAMAGUCHI, J.; TSUZUKI, T.; NAGINO, M. The effects of bevacizumab on intestinal anastomotic healing in rabbits, Surgery Today, Nagoya, v.46, n.12, p.1-8, 2016.

100. DECKER, W.K.; SILVA, R.F.; SANABRIA, M.H.; ANGELO, L.S.; GUIMARÃES, F.; BURT, B.M.; KHERADMAND, F.; PAUST, S. Cancer immunotherapy: Historical Perspective of a Clinical Revolution and emerging Preclinical Animal Models. Front immunol. Switzerland, v.8, n.829, p.1-13, 2017.

101. LINDLAY, R.A.; STEELE, E. Deaminases and Why Mice Sometimes Lie in Immuno-Oncology Pre- Clinical Trials?, Ann. Clin. Oncol. New York, v.2, n.1, p.1-5, 2019.


93

102. MICHA, A.; PSARRAS, K.; OUROUMIDIS, O.; SISKA, E.; VLACHAKI, E.; LYMPEROPOULOS, A.; SYMEONIDIS, N.; NIKOLAIDOU, C.; VENIZELOS, I.; KOLIAKOS, G.; PAVLIDIS, T.E. A time course of bevacizumab (anti-vegf) effect on rat peritoneum: relations between antiadhesive action and fibrin regulation enzymes. Surgical Innovation, Glen Head, v.24, n.6, p543-551, 2017.

103. IDE, A.G.; BAKER, N.H..; WARREN, S.L. Vascularization of the Brown Pearce rabbit epithelioma transplant as seen in the transparent ear chamber. Am. J. Roentgenol. Leesburg, v.42 p.891–899, 1939.

104. FOLKMAN, j. Tumor angiogenesis: therapeutic implications, N. Engl. J. Med. Boston, v.285, p.1182–1186, 1971.

105. ZUCKER, S., MIRZA, H., CONNER, C.E., LORENZ, A.F.; DREWS, M.H.; BAHOU, W.F.; JESTY,J. Vascular endothelial growth factor induces tissue factor and matrix metalloproteinase production in endothelial cells: conversion of prothrombin to thrombin results in progelatinase A activation and cell proliferation. Int J Cancer, New York, n.75, p.780–86, 1998.

106. JAIN, R.K.; DUDA, D.G.; CLARK, J.W.; LOEFFLER, J.S. Lessons fron phase III clinical trials on anti-VGEF therapy for cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. London, v.3, n.1, p.24-40, 2006.

107. KERBEL, R.S. Tumor angiogenesis. N Engl J Med. Boston v.358, n.19, p.2039-2049, 2008.

108. BOCKHORN, M.; GORALSKI, M.; PROKOFIEV, D.; DAMMANN, P.; GRÜNEWALD,P.; TRIPPLER, M.; BIGLARNIA, A.; KAMLER, M.; NIEHUES, E.; FRILLING, A.; BROELSCH, C.E.; SCHLAAK, J.F. Vegf is important for early liver regeneration after partial hepatectomy, J. Surg. Res. New York, v.138, p. 291–299, 2007.

109. TANIGUCHI E, SAKISAKA S, MATSUO K, TANIKAWA K, SATA M. Expression and role of vascular endothelial growth factor in liver regeneration after partial hepatectomy in rats. J Histochem Cytochem, Baltimore, v.49, n.1, p.121–30, 2001.

110. HUBERT, C.; DAHRENMOLLER, C.; MARIQUE, L.; JABBOUR, N.; GIANELLO, P.; LECLERCQ, I. Hepatic regeneration in a rat model is impaired by chemotherapy agents used in metastatic colorectal cancer. EJSO, London, v.41, p.1471-1478, 2015.

111. WILETT, C.G,; BOUCHER, Y.; DI TOMASO, E.; DUDA, D.G.; MUNN, L.L.; TONG, R.T.; CHUNG, D.C.; SAHANI, D.V.; KALVA, S.P.; KOZIN, S.V.; MINO, M.; COHEN, K.S.; SCADDEN, D.T.; HARTFORD, A.C.; FISCHMAN, A.J.; CLARK, J.W.; RYAN, D.P.; ZHU, A.X.; BLASZ- KOWSKY, L.S.; CHEN, H.X.; SHELLITO, P.C.; LAUWERS, G.Y.; JAIN, R.K. Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevacizumab has antivascular effects in human rectal cancer, Nat. Med. New York, v.10, p.145–147, 2004.

112. ZAKARIJA, A.; SOFF, G. Update on angiogenesis inhibitors. Curr Opin Oncol. Philadelphia, v.17, n.6, p.578 -583.

113. ELLIS, A.M.; CURLEY, S.A.; GROTHEY, A. Surgical resection after downsizing of colorectal liver metastasis in the era of bevacizumab. J Clin Oncol. v.23, n.22, p.4853-4855, 2005.

114. GENENTECH. February 22, 2017. Bevacizumab home page. Available at: http://www.bevacizumab.com/bevacizumab/index.jsp. Accessed February 22, 2017.


94

115. KABBINAVAR, F.; HURWITZ, H.I., FEHRENBACHER, L.; MEREPOL, N.J.; NOVOTNY, W.F.; LIEBERMAN, G.; GRIFFING, S.; BERGSLAND, E. Phase II, randomized trial comparing bevacizumab plus flurouracil (FU)/leucovorin(LV) with FU/LV alone in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. New York, v.21, n.1, p.60-65, 2003.

116. SCAPPATICCI, F.A.; FEHRENBACHER, L.; CARTWRIGHT, T.; HAINSWORTH, J.D.; HEIM, W.; BERLIN, J. KABBINAVAR, F.; NOVOTONY, W.; SARKAR, S.; HURWITZ, H. Surgical wound healing complications in metastatic colorectal cancer patients treated with bevacizumab. J. Surg. Oncol. New York, v.91, n.3, p.173-180, 2005.

117. GORDON, C.R.; ROJAVIN, Y.; PATEL, M.; ZINS, J.E; GRANA, G.; KANN, B.; SIMONS, R.; Atabek, U. A review on bevacizumab and surgical wound healing - an important warning to all surgeons. Ann Plast Surg. Boston, v.62, n.6, p.707-709, 2009.

118. D’ANGELICA, M.; KORNPRAT, P.; GONEN, M.; CHUNG, K.Y.; JARNAGIN, W.R.; DEMATTEO, R.P.; FONG, Y.; BLUNGART, L.H.; SALTZ, L.B. Lack of evidence for increased operative morbidity after hepatectomy with perioperative use of Bevacizumab: a matched case-control study. Ann. Surg. Oncol. New York, v.4. n.2, p.759-765, 2007.

119. LIN, Y.S.; NGUYEN, C.; MENDOZA, J.L.; ESCANDON, E.; FEI, D.; MENG, Y.G.; MODI, N.B. Preclinical pharmacokinetics, interspecies scaling, and tissue distribution of a humanized monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor, J. Pharma. Col. Exp. Ther. Baltimore, v.288, p.371–378, 1999.

120. VALVERDE, A.; CIRIA, R.; CABALLERO-VILLARRAS, J.; AGUILAR-MELERO, P.; FERRÍN, G.; RANCHAL, I.; LINARES, C.; HERENCIA, C.; GONZÁLEZ-RUBIO, S.; DE LA MATA, E.; NARANJO, Á.; BRICEÑO, J. Bevacizumab allows preservation of liver function and its regenerative capacity after major hepatectomy. Anti-Cancer Agents Med Chem. Amsterdam, v.19, n.1, 2019.

121. COLÉGIO BRASILEIRO DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL - COBEA. Princípios éticos e práticos do uso de animais de experimentação. São Paulo: UNIFESP-EPM / AFIP / FAPES 2000. Disponível em: http://www;cobea;org/principios;htm; Acessado em: fevereiro de 2016.

122. BRANCO, Alessandra Borges. Regeneração hepática em ratos submetidos à hepatectomia parcial: efeito da desnutrição proteica e da renutrição pré-operatória. 2006. Dissertação (Mestrado em Clínica Cirúrgica) – Departamento de Clínica Cirúrgica. Setor de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 2006.

123. IGNJATOVIC, D.; AASLANDB. K.; PETTERSENA, M.; SUNDC, S.; CHEND, Y.; SPASOJEVICE, M.; NESGAARDA, J.M. Intra-abdominal administration of bevacizumab diminishes intra-peritoneal adhesions. Am J Surg, Maryland, 200(2): 270–275, 2010

124. MELO, M.G.D.; DÓRIA G.A.A.; SERAFINI, M.R.; ARAÚJO, A.A.S. Valores de referência Hematológicos e Bioquímicos de Ratos (Rattus novergicus linhagem Wistar) provenientes do biotério central da Universidade Federal de Sergipe. Scientia Plena. Aracaju, v.8, n.4, p.1-6, 2012.

125. WOJCIECH, S.; ZIEMIENOWICZ, A. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a key factor in DNA replication and cell cycle regulation. Annals of Botany, London, v.107, p. 1127– 1140, 2011.

126. KASUYA, K.; SUZUKI, M.; NAGAKAWA, Y.; SUZUKI, Y.; KIKUCHI, S.; KYO, B.; MATSUDO, T.; ITOI, T.; TSUCHIDA, A.; AOKI, T. Administration of antivascular endothelial growth factor antibody following hepatectomy does not inhibit remnant liver regeneration or growth of remnant metastases. Exp Ther Med, Athens, v.3, n.2, p.347–50, 2012.


95

127. THEOCHARIS, S.E.; SKOPELITOU, A.S.; MARGELI, A.P.; PAVLAKI, K.J.; KITTAS, C. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in regenerating rat liver after partial hepatectomy. Dig. Dis. Sci. New York, v. 39, n. 2, p. 245-252, 1994.

128. PAULO, M.S.L; SANTOS, F.T.B.; ROCHA, P.G.; SILVA, M.B.S.; CINTRA L.C.; MOTTA, L.L.; ERRERA, F.I.V; PAULO, D.N.S.; NUNES, T.A. Immunoexpression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in spleen of splenectomized rats with preservation of inferior pole, submitted to hyperbaric oxygenation. Acta Cirúrgica Brasileira. São Paulo, v.28, n.10, p.691-695, 2013.

129. MOLGAARD, H.V.; SPURR, N.K.; GREAVES, M.F. The hemopoietic stem cell antigen CD34 is encoded by a gene located on chromosome 1. Leukemia. New Jersey, v.3, n.11, p.773-776, 1989.

130. HSU, S.M.; RAINE, L.; FANGER, H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. J. Histochem. Cytochem, Baltimore, v.29, n.4, p.577-580, 1981.

131. QUARESMA, A.B.; D'ACAMPORA, A.J.;TRAMONTE, R.; FARIAS, D.C,; SLOMSKY, J.F.; Histological study of the liver and biochemistry of the blood of Wistar rats following ligature of right hepatic duct. Acta Cir Bras, São Paulo , n. 1,v. 22, p.68-78, 2007.

132. RHODEN, E.L.; PEREIRA-LIMA, L.; RHODEN, C.R.; LUCAS, M.L.; MAURI, M.; ZETTLER, C.G. Análise das alterações histopatológicas dos fígados de ratos pré-tratados com alopurinol e submetidos à isquemia: reperfusão hepática. Rev. CBC. Rio de Janeiro, v.27, n6, p.373, 2000.

133. DOGRUL, A.B.; COLAKOGLU, T.; KOSEMEHMETOGLU, K.; BIRBEN, E.; YAMAN, E.; GEDIKOGLU, G.; ABBASOGLU, O. Antiangiogenic response after 70% hepatectomy and its relationship with hepatic regeneration and angiogenesis in rats. Surgery. Oxford. v.147, n.2, p.288-94, 2010.

134. AMARAPURKAR, A.D.; VIBHAV, K.V. Angiogenesis in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Indian J Pathol Microbiol. Chandigarh. v.51, n.3, p.323-8. 2008.

135. SCHANAIDER, A.; SILVA, P.C. Uso de animais em cirurgia experimental. Acta cir. bras. São Paulo. v.19, n.4, p.441-447, 2004.

136. DRIXLER, T.A.; VOGTEN, M.J.; RITCHIE, E.D.; VAN VROONHOVEN, T.J.; GEBBINK, M.F.; VOEST, E.E.; BOREL-RINKES, I.H. Liver regeneration is an angiogenesis- associated phenomenon. Ann Surg. Philadelphia. v.236,n.6, p.703-11,2002.

137. VERMEULEN, P.B.; GASPARINI, G.; FOX, S.B.; COLPAERT, C.; MARSON, L.P.; GION, M.; BELIËN, J.A.; DE WAAL, R.M.; VAN MARCK, E.; MAGNANI, E.; WEIDNER, N.; HARRIS, A.L.; DIRIX, L.Y. Second international consensus on the methodology and criteria of evaluation of angiogenesis quantification in solid human tumours. Eur J Cancer. Oxford. v.38, n.12, p.1564-79. 2002.

138. DING, B.S.; NOLAN, D.J.; BUTLER, J.M.; JAMES, D.; BABAZADEH, A.O.; ROSENWAKS, Z.; MITTAL, V.; KOBAYASHI, H.; SHIDO, K.; LYDEN, D.; SATO, T.N.; RABBANY, S.Y.; RAFII, S. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. London. v.11, n.468(7321), p.310-5. 2010.

139. HASHIMOTO, M.; SANJO, K. Functional capacity of the liver after two-thirds partial hepatectomy in the rat. Surgery. Oxford. v.121, n.6, p.690-697, 1997.

140. PETROIANU, A.; ESQUERDO, C.R.M.; BARBOSA, A.J.A.; ALBERTI, L.R. Regeneração hepática induzida por ressecção segmentar do fígado, em rato. Rev. Col. Bras. Cir . Rio de Janeiro. v.31, n.1, p. 10-14, 2004.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Drixler%20TA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vogten%20MJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ritchie%20ED%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=van%20Vroonhoven%20TJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gebbink%20MF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gebbink%20MF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Voest%20EE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Borel%20Rinkes%20IH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=12454508

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12454508


96

141. MOREIRA, M.C.; AZEVEDO, I.M.; OLIVEIRA, C.N.; MEDEIROS, A.C. Influência do cólon na regeneração do fígado de ratos submetidos à hepatectomia e colectomia. Rev Col Bras Cir. Rio de Janeiro, v.44, n.5, p.476-481, 2017.

142. MURATA, S.; MATSUO, R.; IKEDA, O.; MYRONOVYCH, A.; WATANABE, M. HISAKURA, K.; NAKANO, Y.; HASHIMOTOI.; OHKOHCHI, N. Platelets promote liver regeneration under conditions of kupffer cell depletion after hepatectomy in mice. World J Surg. New York, n.32,p.1088-10096, 2008.

Documento de consulta:

MINISTÉRIO DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E INOVAÇÃO. CONSELHO NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL – CONCEA. Diretriz da prática de eutanásia do CONCEA. Brasília/DF – 2015.

Anexo

96

ANEXO 1 PARECER DA COMISSÃO DE ÉTICA EM PESQUISAS EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO

Anexo

97

Apêndices

98

APÊNDICE 1

Protocolo para pesagens de ratos

1. Antecedentes

A pesagem correta dos animais de experimentação é um dos elementos imprescindíveis

para que os resultados obtidos sejam confiáveis. Os preceitos básicos a serem

respeitados é utilizar um local específico para pesagem, sem corrente de ventos, rede

elétrica estável ou utilizar um estabilizador, utilizar balança digital analítica, calibrada e

de boa marca disponibilizada sobre uma bancada estável e nivelada e em relação ao

animal este deve ser sedado para que não se movimente durante a leitura da pesagem.

2. Método

2.1. Material

• Balança analítica (Coleman® modelo SK280251)

• Cuba plástica

• Algodão

• Isoflurano (Isothane-Baxter®)

• Sacos plásticos identificados com o símbolo de biossegurança.

• EPIs.

2.2. Técnica

• Preparar o protocolo para registro dos pesos

• Embeber algodão no isoflurano

• Colocar o algodão dentro da cuba plástica

• Colocar o rato a ser pesado e tampar a cuba plástica, observar até a perda de

movimentos do animal.

• Retirar o rato imediatamente da cuba, evitando a evaporação do anestésico

• Trocar a cuba conforme o depósito de resíduos fecais e urina dos ratos

• Trocar o algodão com Isoflurano a cada quatro ratos.

Apêndices

99

3. Resultados

As pesagens foram feitas no T0 (início do experimento), no T48 (48 horas de evolução)

e no T15 (quinze dias de evolução).

Os resultados encontram-se na tabela 2.

TABELA 10 – PESAGENS DOS RATOS

Identificação T0 T48 T15 C

ontro

le (C

)

C48

13

SM 206,8 214,0 --- pescoço 190,3 197,0 ---

dorso 189,6 196,2 --- cauda 212,4 219,8 ---

14

SM 201,7 208,8 --- pescoço 211,2 218,6 ---

dorso 189,9 188,7 --- cauda 215,2 220,1 ---

C15

15

SM 192,8 202,4 204,4 pescoço 212,3 222,9 225,0

dorso 207,6 218,0 220,1 cauda 199,4 209,4 211,4

16

SM 196,7 206,5 208,5 pescoço 196,2 206,0 208,0

dorso 195,9 205,7 207,7 cauda 202,2 212,3 214,3

Beva

cizu

mab

e (B

V) BV48

18

SM 187,5 191,3 --- pescoço 196,4 200,3 ---

dorso 211,8 216,0 --- cauda 212,4 216,6 ---

19

SM 201,7 205,7 --- pescoço 198,3 202,3 ---

dorso 213,4 217,7 --- cauda 218,1 225,7 ---

BV15

20

SM 187,5 190,3 192,2 pescoço 196,4 199,3 201,3

dorso 211,8 215,0 217,1 cauda 212,4 215,6 217,7

21

SM 201,7 204,7 206,7 pescoço 198,3 201,3 203,3

dorso 213,4 216,6 218,7 cauda 218,1 221,4 223,6

TABELA 11 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS PESAGENS DOS RATOS NOS TEMPOS 0, 48HORAS E 15 DIAS.

C48 C15 BV48 BV15 Avaliações T0 T48 T0 T48 T15 T0 T48 T0 T48 T15 Desvio padrão (dp) 10,87 12,07 6,62 6,52 5,95 10,55 11,39 12,59 12,78 12,91 Limite inferior (li 95%) 193,1 194,5 194,9 195,5 210,2 196,1 198,2 196,1 192,7 205,8 Média (mx) 10,87 12,05 6,62 6,51 5,94 10,55 9,80 10,55 13,46 7,74 Limite superior (ls 95%) 211,2 214,7 205,9 206,4 220,2 213,8 214,5 213,8 215,2 218,8

Apêndices

100

APÊNDICE 2 Protocolo para Anestesia em Ratos

TABELA 12 – ORGANIZAÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO E AVALIAÇÃO ESTATÍSTICA DAS MÉDIAS DE PESOS

Caixa Ratos Pesos (g) KETAMINA

(ml) XILAZINA

(ml) Dimorf®

(ml) BV (ml)

80mg/kg 10mg/kg 2mg/kg 5mg/kg

Con

trole

(C)

13

SM 206,8 0,3 0,1 0,1 0,21 pescoço 190,3 0,3 0,1 0,1 0,19 dorso 189,6 0,3 0,1 0,1 0,19 cauda 212,4 0,3 0,1 0,1 0,21

14


15


16


Beva

cizu

mab

e (B

V)

18


19


20


21


Legenda:

BV= Bevacizumabe (Avastin® -Pffizer)

Ao serem comparadas estatisticamente, pelo método t Student, as médias e os desvios

padrões entre as pesagens em T0 dos grupos controle e bevacizumabe (tabela 5) obteve-se

o valor de p = 0,7941, considerado não significante.

Apêndices

101

APÊNDICE 3

Procedimentos para cirurgias experimentais do laboratório da coordenação de ensino e

pesquisa do Hospital Angelina Caron - Hepatectomia parcial a 70% em ratos:

1. Antecedentes:

As hepatectomias em roedores são bastante facilitadas, haja vista a lobulação

individualizada do fígado. Em ratos o procedimento é facilitado pela presença de quatro

lóbulos hepáticos independentes. Descrita originalmente em 1931 por Higgins e

Anderson, a ressecção do lobo mediano e do lobo esquerdo correspondem a uma

hepatectomia a 70% e são utilizadas frequentemente como modelo experimental.

Representa um modelo simples de ser realizado devido ao uso de uma única e simples

ligadura de pedículo (MARTINS, THERUVATH e NEUHAUS, 2008; BRANCO 2006).

2. Aspectos anatômicos do fígado de ratos.

De acordo com a ilustração abaixo demonstrada de Kongure, o fígado de rato é dividido

em quatro lobos principais: lobo caudado (CL), lobo hepático direito (RLL), lobo mediano

(ML) e lobo lateral esquerdo (LLL). O CL é dividido em três partes: processo caudado,

lobo anterior (CA) e posterior do caudado (PC). O RLL é dividido em lobo superior direito

(SRL) e lobo inferior direito (IRL). O ML é dividido em duas partes: o lobo mediano direito

(RML) e o lobo mediano esquerdo (LML). Em ratos não existe vesícula biliar e a veia

cava inferior é intra-hepática.

Referência: MARTINS et al., 2005.

Apêndices

102

3. Procedimentos

3.1. Pré-operatório

• 24 horas antes do início do experimento cirúrgico os ratos devem ser

inspecionados individualmente verificando a ocorrência de alopecia,

ectoparasitas, lesões cutâneas, diarréia e conjuntivites.

• Identificar as caixas e cada um dos quatro ratos através da marcação com

solução alcóolica de ácido pícrico a 20% nas posições: cabeça, dorso, cauda

e sem marca.

• Pesagem balança analítica (Coleman® modelo SK280251) e registros em

planilha.

• Calcular as doses dos anestésicos cloridrato de cetamina (Ketamina-Agner®)

80mg/kg e cloridrato de xilazina (Sedanil a 2%®) 10mg/kg.

3.2. Anestesia:

3.2.1. Materiais

• Seringas descartáveis de 1ml tipo insulina.

• Agulhas descartáveis hipodérmicas 26g/½

• Suporte para seringas

• Álcool 70º

• Álcool iodado

• Solução fisiológica

• Compressas

• Gaze cortada

• Cuba para inalação anestésica.

• Isofluorano (Cristália®)

• Ketamina: Ketamino Agner® solução a 10% - 50ml.

• Xilçazina= Sedanil ® solução a 2% - 100ml

• Sulfato de morfina = Dimorf® 02,mg/ml – 1ml

Apêndices

103

3.2.2. Procedimento

• Colocar o rato dentro da cuba com gaze embebida em isofluorano e

aguardar a perda dos reflexos.

• Inocular cada um dos anestésicos previamente aliquotados nas

seringas para cada um dos ratos, nas panturrilhas.

• Aguardar a indução anestésica.

• Proceder a tricotomia ampla do abdômen e tórax com aparelho

cortador de pelos.

• Degermar a área tricotomizada com álcool-iodado

• Colocar os campos cirúrgicos fenestrados esterilizados e gazes

esterilizadas.

3.3. Per-operatório

• O procedimento per-operatório foi realizado conforme descrito por BRITO,

BRITO e MANESCHY ( 2005).

• Proceder incisão abdominal sub-costal por planos, de cerca de três

centímetros de extensão.

• Acessar a cavidade abdominal.

• Localizar o fígado e liberar os ligamentos hepáticos.

• Rebater cranialmente os lobos lateral esquerdo e mediano.

• Proceder ligadura do pedículo hepático com fio poliglactina 3.0 (Vicryl®).

• Ressecar os lobos lateral esquerdo e mediano.

• Proceder inventário da cavidade e hemostasia.

• Fechar a ferida cirúrgica por sutura contínua com fio monofilamentar prolene

4.0 (Ethicon®) nos planos músculo-aponeurótico e cutâneo.

• Limpar a ferida cirúrgica com solução fisiológica e álcool iodado.

• Descartar os materiais perfurocortantes sujos e os fragmentos ressecados de

fígado conforme as normas institucionais de biossegurança.

• Dispensar o instrumental cirúrgico para limpeza e esterilização.

Apêndices

104

3.4. Pós-operatório

• Administrar dipirona por via oral (gavagem), na dose de 20mg/kg e 10ml de

solução fisiológica por via subcutânea na região dorsal e eram mantidos sob

aquecimento até a recuperação anestésica.

• Recolocar os ratos em caixas devidamente identificadas e oferecer ração e

água ad libitum até o sétimo dia de evolução pós-cirúrgica.

Apêndices

105

APÊNDICE 4

Procedimentos para interrupção de experimentos e eutanásia

1. Antecedentes:

Considerar que a eutanásia é uma das práticas mais difíceis e delicadas no contexto de

um experimento in vivo.

Eutanásia, do grego “eu” (bom) e “thanatos” (morte), constitui-se no modo humanitário

de matar o animal, sem dor e com mínimo estresse. É a prática de causar a morte de um

animal de maneira controlada e assistida para alívio da dor ou do sofrimento. Neste

caso, a eutanásia se justifica, para o bem do próprio indivíduo, em casos de dor ou

sofrimento, a partir de um determinado nível, que não podem ser mitigados de imediato,

com analgésicos, sedativos ou outros métodos ou quando o estado de saúde ou bem-

estar do animal impossibilite o tratamento ou socorro (de acordo com o § 1º do art. 14 da

Lei nº 11.794, de 2008).

Um método adequado de eutanásia deve garantir a perda da consciência de forma

rápida, irreversível e desprovida de experiência emocional ou física desagradável, ou

seja, o animal não deve apresentar dor, estresse, apreensão ou ansiedade.

Independente do método de eleição, a inconsciência deve anteceder a parada

cardiorrespiratória, seguida da perda da função cerebral.

Um protocolo adequado de eutanásia deve:

1.1. Tratar o animal com o máximo de respeito;

1.2. Considerar o manejo pré-eutanásia baseado nas características

comportamentais de cada espécie, para minimizar o risco de ansiedade, dor ou

lesões, antes da perda da consciência;

1.3. Prover a morte sem dor e sofrimento físico e mental;

1.4. Produzir imediata perda da consciência, seguido de parada respiratória e

cardíaca e perda da função cerebral;

1.5. Ser apropriado para a espécie, idade e estado de saúde do animal;

1.6. Confirmar a morte após a eutanásia e antes do descarte do cadáver;

Apêndices

106

1.7. Envolver pessoas qualificadas e competentes para realizar o método de forma

efetiva e humanitária, reconhecer a dor e o sofrimento nas espécies em que atua,

reconhecer e confirmar a inconsciência e morte do animal;

1.8. Levar em consideração o impacto psicológico do pessoal envolvido, mas a

prioridade é sempre o bem-estar do animal;

1.9. Ser aprovado pela CEUA da instituição;

1.10. Basear-se na consulta de profissional (is) com experiência na área e nos grupos

taxonômicos em questão, para selecionar o melhor método de eutanásia,

particularmente, se houver pouca informação para a espécie animal envolvida;

ou no caso de instalações animais, de acordo com a resolução normativa no 6, de

10 de julho de 2012, os procedimentos de eutanásia devem ser supervisionados

pelo responsável técnico da instalação animal da instituição.

1.11. Quando do uso de anestésicos inalatórios, garantir a manutenção e calibração

regulares dos equipamentos;

1.12. Realizar um rodízio entre profissionais treinados para este fim para assegurar

que o procedimento seja realizado de forma eficiente e humanitária.

1.13. Atender ao Guia Brasileiro de Boas Práticas para Eutanásia do CFMV (Conselho

Federal de Medicina Veterinária) e a resolução Nº 1.000/2012.

2. Método

Os procedimentos de eutanásias foram realizados conforme “Diretriz da prática de

eutanásia do CONCEA” (Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação. Conselho

Nacional de Controle de Experimentação Animal)

2.1. Material

• Cuba hermética devidamente limpa.

• Anestésicos inalatórios: Halotano ou Sevofluorano (aliquotados em frascos de

vidro com 15 a 20 ml).

• Frasco de vidro com solução de paraformaldeído 4%, em PBS pH 7,4.

• Algodão.

• Seringas de 10 ou 20 ml.

Apêndices

107

• Agulhas 40 x 1,20 (18G 1½).

• Tubos de ensaio com tampa rosca sem anticoagulante

• Sacos plásticos identificados com o símbolo de biossegurança.

• EPIs.

2.2. Técnica

• Embeber algodão com 5ml aproximadamente de um dos anestésicos

inalatórios e colocar no frasco de vidro.

• Colocar o frasco de vidro dentro da cuba e fechá-la por um a dois minutos até

saturar o microambiente.

• Colocar delicadamente um rato de cada vez na cuba e trocar o frasco com

anestésico inalatório a cada procedimentos.

• Fechar a cuba e aguardar o rato perder os reflexos.

• Proceder a punção cardíaca e aspirar o maior volume de sangue rapidamente

até a indução da parada cárdio-respiratória.

• Colocar o sangue em tubos de ensaio com tampa rosca sem anticoagulante

para a obtenção de soro após a retração do coágulo, centrifugação e

separação do sobrenadante.

• Identificar os tubos com o número da caixa seguido da identificação do rato:

13-SM

• Confirmar a morte do rato.

• Transferir o rato morto para mesa cirúrgica e proceder laparotomia mediana

xifo-púbica, inventariar a cavidade abdominal, e ressecar o fígado.

• Retirar rapidamente o excesso de sangue da amostra por lavagem em

solução fisiológica e em seguida colocar cada amostra em um frasco de

vidro, devidamente identificado, com solução de paraformaldeído 4%, em

PBS pH 7,4.

• Identificar os frascos com o número da caixa seguido da identificação do rato:

13-SM

Apêndices

108

• Dispensar as carcaças individualmente em sacos plásticos identificados com

o símbolo de risco biológico e encaminhar em seguida para o setor

responsável por resíduos biológicos.

Apêndices

109

APÊNDICE 5

Dosagem de Albumina

1. Antecedentes

A albumina é a proteína mais abundante no plasma. Sintetizada pelas células do

parênquima hepático, tem meia vida de 15 a 19 dias. Sua função primária é manter a

pressão coloidosmótica do plasma. O fígado é o único órgão capaz de sintetizar albumina.

Cerca de 12% a 20% da capacidade de síntese hepática é disponibilizada para a síntese

desta proteína.

2. Método

Empregou-se o método espectrofotométrico automatizado, que utiliza uma solução de

púrpura de bromocresol (PCG) como corante de ligação. A albumina do soro reage

quantitativamente com a solução formando um complexo albumina–PCG em pH 4,2.

Este complexo é medido como uma reação de ponto final empregando comprimento de

onda de 596/694 nm (SIEMENS, 2008).

2.1. Material

• Amostras de soro de ratos.

• Equipamento Dimension RxL/ExL (Siemens®)

• Reativos específicos para a dosagem automatizada de albumina (Siemens®)

2.2. Técnica

• Registrar a identificação de cada amostra no sistema computadorizado do

equipamento e colocar o tubo com plasma no equipamento e dar início na

opção albumina.

• Programar a leitura espectrofotométrica das amostras e do padrão de

albumina.

• Aguardar a impressão dos resultados.

Apêndices

110

3. Resultados

TABELA 13 – RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA (MG/DL)

Identificação Albumina (mg/dl)

C

13

SM 2,98 pescoço 3,01 dorso 3,06 cauda 2,94

14


15


16


BV

17


18


19


20


TABELA 14 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE ALBUMINA DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15

Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 3,04 3,11 3,05 3,00 Limite Inferior (LI 95%) 2,96 2,72 2,99 2,61 Média (Mx) 0,10 0,46 0,07 0,47 Limite Superior (LS 95%) 3,12 3,49 3,11 3,39

Apêndices

111

APÊNDICE 6

Dosagem de Bilirrubinas

1. Antecedentes

A bilirrubina é o resultado do metabolismo da porção heme da hemoglobina (80%) e de

outras hemoproteínas como mioglobina, citocromos e catalase (20%). A ruptura das

hemácias senescentes pelo sistema retículo endotelial, que é fagocitada de imediato

pelos macrófagos em muitas partes do organismo, especialmente pelas células de

Kupffer, no fígado, e pelos macrófagos no baço e na medula óssea libera a

hemoglobina, que se decompõem em globina (porção proteica) e heme (complexo

protoporfirina IX e ferro). É então transformada a sua hemoglobina pela heme-oxigenase

em biliverdina, monóxido de carbono e ferro. A biliverdina-redutase converte a biliverdina

em bilirrubina livre, sendo gradualmente liberada dos macrófagos para o plasma. A

bilirrubina livre atravessa facilmente a barreira hematoencefálica, sendo potencialmente

tóxica para o tecido nervoso. O aumento das bilirrubinas, denominado hiperbilirrubinemia

e manifestado clinicamente como icterícia. Nestes últimos, a mensuração da bilirrubina

total e suas frações, direta e indireta são essenciais para o diagnóstico de disfunções

hepáticas. Os métodos existentes determinam a fração que produz cor com a reação de

Van den Bergh em solução aquosa (bilirrubina direta), enquanto a fração que

desenvolve cor com o álcool é chamada bilirrubina indireta. A reação direta ocorre com a

bilirrubina conjugada (diglicuronídeo) solúvel em água. A bilirrubina total compreende a

soma das frações conjugada e não-conjugada.

2. Método

2.1. Material

• Amostras de sangue de ratos colhidos por punção cardíaca em tubos com

anticoagulante


• Reativos específicos para a dosagem automatizada de bilirrubinas

(Siemens®)

Apêndices

112

2.2. Técnica


equipamento.

• Colocar o tubo com soro no equipamento e dar início na opção bilirrubinas

total e direta.

• A diferença entre os valores obtidos das dosagens de bilirrubina total

menos os valores das dosagens de bilirrubina direta constitui os valores

de bilirrubina indireta.

• Programar a leitura espectrofotométrica das amostras e do padrão de

bilirrubina.

3. Resultados

TABELA 15 – RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS (MG/DL)

Bilirrubinas Identificação C48 C15 BV48 BV15

BT

SM 0,19 0,12 0,14 0,07 pescoço 0,15 0,15 0,17 0,09 dorso 0,09 0,46 0,14 0,27 cauda 0,20 0,13 0,11 0,30 SM 0,15 0,20 0,08 0,17 pescoço 0,41 0,58 0,20 0,07 dorso 0,09 0,42 0,10 0,13 cauda 0,09 0,42 0,10 0,13

BD


BI


Apêndices

113

TABELA 16 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS DOSAGENS SÉRICAS DE BILIRRUBINAS DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15

Avaliações C48 C15 BV48 BV15

Tota

l Desvio Padrão (DP) 0,11 0,18 0,04 0,09 Limite Inferior (LI 95%) 0,08 0,16 0,10 0,08 Média (Mx) 0,17 0,31 0,13 0,15 Limite Superior (LS 95%) 0,26 0,46 0,16 0,23

Dire

ta Desvio Padrão (DP) 0,02 0,03 0,03 0,02

Limite Inferior (LI 95%) 0,04 0,04 0,07 0,10 Média (Mx) 0,06 0,06 0,10 0,12 Limite Superior (LS 95%) 0,07 0,08 0,12 0,13

Indi

reta

Desvio Padrão (DP) 0,05 0,07 0,04 0,09 Limite Inferior (LI 95%) 0,02 0,03 0,03 0,06 Média (Mx) 0,06 0,09 0,07 0,14 Limite Superior (LS 95%) 0,11 0,14 0,10 0,21

Apêndices

114

APÊNDICE 7

Dosagem de amino-transaminases glutâmico-oxalacética (AST/TGO) e glutâmico-pirúvica

(ALT/TGP)

1. Antecedentes

No fígado, em circunstâncias normais, estas enzimas residem dentro das células do

fígado, mas em condições patológicas estas enzimas são liberadas no fluxo sanguíneo.

Elas catalisam a transferência de um grupo alfa-amino de um aminoácido para um alfa-

cetoácido, com a formação de novos alfa-amino e alfa-cetoácido. O fígado produz mais

de 60 destas enzimas e entre as mais sensíveis destas enzimas e as mais

representativas estão as transaminases. Elas incluem a aspartato-aminotransferase

(AST ou TGO) e a alanine-aminotransferase (ALT ou TGP). Estas enzimas normalmente

são contidas dentro das células do fígado. As transaminases catalisam reações

químicas nas células nas quais um grupo de amino é transferido de uma molécula

doadora a uma molécula recipiente.

2. Método

2.1. Material

• Amostras de sangue de ratos colhidos por punção cardíaca em tubos com

anticoagulante


• Reativos específicos para a dosagem automatizada de transaminases

(Siemens®)

2.2. Técnica


equipamento.

• Colocar o tubo com plasma no equipamento e dar início na opção

transaminases.

Apêndices

115

• Programar a leitura espectrofotométrica das amostras e do padrão de TGO e

TGP.

3. Resultados TABELA 17 – RESULTADOS DAS DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES (MG/DL)

Identificação Aspartato-aminotransferase

(AST ou TGO) Alanine-aminotransferase

(ALT ou TGP) C48 C15 C15 BV15 C48 C15 BV48 BV15

SM 105,10 68,20 90,50 90,10 154,90 325,20 315,60 210,00 pescoço 98,30 62,90 88,70 59,70 161,90 367,00 242,80 187,90 dorso 161,60 78,80 95,20 89,20 222,50 244,10 436,70 292,70 cauda 107,60 70,00 72,40 53,70 175,60 180,60 262,90 332,80 SM 92,30 53,90 98,20 68,00 127,70 300,10 307,30 400,50 pescoço 100,40 50,60 154,40 41,30 134,00 476,80 296,30 154,00 dorso 98,40 52,00 107,80 63,80 303,20 347,60 142,10 192,50 cauda 99,30 78,32 104,70 96,20 358,60 327,30 96,21 145,60

TABELA 18 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS

DOSAGENS SÉRICAS DE TRANSAMINASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15


AST


ALT


Apêndices

116

APÊNDICE 8

Determinação do Índice da relação aspartato aminotransferase / plaquetas (APRI)

1. Antecedentes

O índice da relação aspartato-aminotransferase sobre plaquetas (APRI) é um marcador

de fibrose hepática o qual considera o resultado do nível da transaminases TGO (ou

AST) e o número de plaqueta e o valor de referência (máximo)* para a faixa etária do

rato (MELO, 2012). O resultado da divisão é então dividido pelo número de plaquetas e

depois esse novo resultado é multiplicado por 100, conforme fórmula abaixo.

2. Método

2.1. Material

• Dosagens de tranasminsase glutâmica oxalacética

• Contagens de plaquetas

2.2. Técnica

• Proceder aos cálculos conforme a fórmula abaixo:

Determinação do Índice da relação aspartato-aminotransferase/plaquetas

(APRI)

=

[(Dosagem de TGO ÷

LSNTGO*)

X 100]

Contagem de plaquetas x 10-3/mm3

3. Resultados

TABELA 19 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DOS

ÍNDICES ASPARTATO-AMINOTRANSFERASES DOS RATOS DOS SUB-GRUPOS C48, C15, BV 48 E BV 15



Apêndices

117

TABELA 20 – RESULTADOS DAS DETERMINAÇÕES DOS ÍNDICES DA RELAÇÃO ASPARTATO AMINOTRANSFERASE / PLAQUETAS (APRI) CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Identificação TGO LS TGO* Plaquetas APRI

C48


C15


BV48


BV15


Apêndices

118

APÊNDICE 9

Determinação do Índice Mitótico

1. Antecedentes:

A determinação do índice mitótico foi empregada com o objetivo de quantificar a

replicação celular no parênquima hepático, como indicativo da regeneração hepática

após hepatectomias parciais. Foi obtida através da contagem de figuras de mitoses em

duas lâminas com cortes histológicos de amostras de fígado de ratos coradas pela

Hematoxilina & Eosina de Harris (HE) e contadas em microscopia ótica (ASSY e MINUK,

1997; BIONDO-SIMÕES et al.,2000).

2. Método

2.1. Material

• Corante Hematoxilina de Harris

• Corante Eosina

• Soluções de álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.

2.2. Técnica

• Armazenar em cápsulas histológicas e progressivamente desidratadas, em

banhos de uma hora em cada uma das quatro crescentes concentrações de

álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.

• Diafanizar através de dois banhos de uma hora de duração em xilol.

• Submeter a dois banhos de parafina a 58-60°C e incluir em formas de blocos.

• Cortar em micrótomo para a obter de cortes de 5 µm de espessura e montá-

los em lâminas previamente limpas, desengorduradas e banhadas em

solução fixadora de albumina.

• Remover a parafina seguida da hidratação dos cortes de tecido por 24 horas

em estufa a 56ºC e submeter a uma sequência de banhos em xilol por 10

minutos, álcool absoluto por 10 minutos, álcool 90% por cinco minutos, 80%

por cinco minutos, 70% por cinco minutos e água por cinco minutos.

Apêndices

119

• Corar em Hematoxilina de Harris por um minuto e meio, lavar em água

corrente por 30 minutos, corar em eosina por 30 segundos, lavar rapidamente

em água e desidratadas em série crescente de álcoois a 70%, 80%, 90% e

100%.

• Diafanizar as lâminas em xilol e montá-las com bálsamo sintético e lamínula.

• Identificar as lâminas com o número da caixa seguido da identificação do rato

e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.

2.3. Leituras

• As contagens das lâminas foram executadas em triplicatas por dois leitores

independentes, em microscópio óptico Nikon (Eclipse E 200®) sob

magnificação de 40x, para a contagem do número de figuras de mitoses em

dez campos aleatórios.

3. Resultados

Os resultados foram obtidos após a validação dos resultados das três contagens que

não demonstrassem diferenças estatísticas (p>0,05) para os sub-grupos. Era então

calculada a média das contagens para cada rato (M) e a média final (MF) entre as três

lâminas. A seguir eram calculadas as médias e os intervalos e confiança 95% e comparados

os resultados dos sub-grupos pelo teste t-Student.

TABELA 21 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS

CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 2,37 1,23 1,69 0,44 Limite Inferior (LI 95%) 2,69 -0,07 3,55 -0,09 Média (Mx) 4,68 0,96 4,96 0,27 Limite Superior (LS 95%) 6,66 1,98 6,37 0,64

Apêndices

120

TABELA 22 – RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE FIGURAS DE MITOSES EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA E EOSINA EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Grupos Identificação Figuras de mitoses em 10 campos aleatórios

Lâmina 1 Lâmina 2 Lâmina 3 MF L1 L2 M L1 L2 M L1 L2 M

Con

trole

(C)

13

SM 3 4 3,5 4 4 4 4 6 5 4,2 pescoço 2 5 3,5 2 5 3,5 3 4 3,5 3,5 dorso 0 3 1,5 1 4 2,5 0 2 1 1,7 cauda 4 3 3,5 3 2 2,5 2 1 1,5 2,5

14

SM 6 5 5,5 7 3 5 5 4 4,5 5,0 pescoço 11 9 10 9 10 9,5 8 7 7,5 9,0 dorso 6 5 5,5 4 4 4 3 5 4 4,5 cauda 5 9 7 6 8 7 5 9 7 7,0

Validação (p) 0,6101 0,7139 0,4358 ---

15

SM 0 0 0 0 0 0 2 3 2,5 0,83 pescoço 0 2 1 2 1 1,5 1 0 0,5 1,00 dorso 5 0 2,5 5 4 4,5 5 4 4,5 3,83 cauda 0 3 1,5 1 2 1,5 0 0 0 1,00

16

SM 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,00 pescoço 0 0 0 0 0 0 1 0 0,5 0,17 dorso 0 0 0 0 0 0 1 0 0,5 0,17 cauda 2 1 1,5 1 0 0,5 0 0 0 0,67

Beva

cizu

mab

e (B

V)

Validação (p) 0,8718 0,7590 0,6575 ---

17

SM 7 3 5 6 2 4 8 8 8 5,7 pescoço 3 5 4 2 5 3,5 0 0 0 2,5 dorso 5 2 3,5 6 1 3,5 5 6 5,5 4,2 cauda 3 0 1,5 5 1 3 7 6 6,5 3,7

18

SM 8 3 5,5 6 2 4 4 4 4 4,5 pescoço 7 9 8 8 10 9 7 8 7,5 8,2 dorso 8 5 6,5 6 4 5 6 5 5,5 5,7 cauda 7 4 5,5 6 2 4 5 8 6,5 5,3

Validação (p) 0,0950 0,0871 0,7781 ---

19

SM 1 3 2 0 0 0 0 0 0 0,7 pescoço 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 dorso 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 cauda 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0

20

SM 4 3 3,5 0 0 0 0 0 0 1,2 pescoço 1 0 0,5 1 0 0,5 0 0 0 0,3 dorso 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 cauda 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0

Validação (p) 1,0000 0,3343 --- --- Legenda: L1= leitor 1, L2= Leitor 2, M= média das contagens entre leitores. MF= Média das contagens das três lâminas

Apêndices

121

APÊNDICE 10

Avaliação da viabilidade celular pelo antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)

1. Antecedentes

Para a avaliação da viabilidade celular no parênquima hepático de ratos submetidos à

hepatectomia parcial foi empregada técnica imunohistoquímica pela marcação do antígeno

nuclear de proliferação celular (PCNA), o qual é um marcador de atividade proliferativa

(THEOCHARIS et al.,1994).

O anticorpo monoclonal reage com um gene nuclear de célula em proliferação e também

conhecido como PCNA ou DNA polimerase. O PCNA é um anel trimérico de 36 kD que atua

como um grampo deslizante de ADN-polimerase expresso no núcleo de todas as células em

proliferação.

Uma função primordial do PCNA é estimular o aumento da capacidade de

processamento da polimerase do DNA durante o alongamento da fita principal. O PCNA é

um marcador da síntese de DNA e é altamente conservado na maioria das espécies,

destacando a reatividade muito ampla desse anticorpo (WOJCIECH e ZIEMIENOWICZ,

2013; PAULO et al.; 2013). As lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido

da identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3 (KASUYA et al., 2012,

PAULO et al., 2013).

2. Método:

2.1. Material

• Foi empregado o marcador Biotin anti-PCNA antibody clone PC10 (DAKO®).

2.2. Técnica

• As amostras foram fixadas em paraformaldeído 4%, em PBS, pH 7,4, por 24

horas.

• Posteriormente, as amostras foram desidratadas em concentrações

crescentes de etanol, diafanizadas em Xilol e incluídas em parafina. Cortes

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Theocharis%20SE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7906221

Apêndices

122

de 3µm das amostras foram depositados em lâminas carregadas

positivamente.

• Posteriormente, as lâminas foram processadas no “Autostainer de

imunohistoquímica” (Leica Bond Max®), onde os cortes foram

desparafinizados em xilol, reidratados em concentrações decrescentes de

etanol para a imunohistoquímica, os cortes histológicos reidratados foram

incubados com 3% H2O2 em metanol para o bloqueio da peroxidase

endógena.

• A recuperação antigênica foi realizada em tampão Citrato de Sódio 10mM, pH

6,0, à 95ºC, por 20 minutos.

• Possíveis ligações não específicas, bem como radicais aldeídicos livres foram

bloqueados pela incubação de cinco minutos com PBS contendo 1% de BSA

e por PBS contendo 0,1M de Glicina, respectivamente.

• Posteriormente, os cortes foram incubados por 12 horas à 8ºC com o

anticorpo primário a 1:100 (marca AbCam, monoclonal de coelho clone

ab18197®) e anticorpo anti-PCNA 1:400 (marca Dako, monoclonal de

camundongo, clone QBEnd10®).

• Após a incubação do anticorpo primário as lâminas foram lavadas em três

banhos de PBS por 5 minutos cada banho, e a após isto foi incubado o

polímero Refine Polymer (Leica®) por 30 minutos.

• Posteriormente, foi realizada a revelação da ligação dos anticorpos primários

foram realizadas com DAB (tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina) (DAB

substrate Kit, Leica), com posterior contra-coloração com o corante de

Hematoxilina.

• A seguir, os cortes foram desidratados em bateria crescente de etanol e

depois xilol, com isso as lâminas permanentes foram montadas com Entellan

(Merck®).

• Identificar as lâminas com o número da caixa seguido da identificação do rato

e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.

Apêndices

123

3. Leituras:

As reações foram consideradas positivas, quando se detectava reação marrom,

excluindo-se as prováveis áreas de coloração de fundo, independentemente do tamanho

e mesmo separadas dos vasos adjacentes ou de outros elementos imunocorados e

foram desconsideradas as prováveis áreas de coloração de fundo.

A avaliação da imunomarcação foi baseada na porcentagem de núcleos positivos dos

hepatócitos. As seções foram contadas em alta potência (400x) aleatoriamente em 100

células em cada sub-grupo. Todos os sub-grupos foram examinados cegamente por dois

observadores independentes.

Apêndices

124

4. Resultados

TABELA 23 – RESULTADOS DAS CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Grupos Identificação

Contagem de células marcadas pelo anticorpo monoclonal anti-PCNA em 100 campos aleatórios

Lâmina 1 Lâmina 2 Lâmina 3 MF L1 L2 M L1 L2 M L1 L2 M

Con

trole

(C)

13

SM 32 42 37,0 30 25 27,5 45 44 44,5 36,33 pescoço 46 36 41,0 48 39 43,5 33 28 30,5 38,33 dorso 33 25 29,0 29 34 31,5 36 29 32,5 31,00 cauda 30 28 29,0 19 22 20,5 25 15 20 23,17

14

SM 27 25 26,0 28 25 26,5 18 26 22 24,83 pescoço 34 32 33,0 31 27 29,0 33 32 32,5 31,50 dorso 57 48 52,5 62 59 60,5 52 49 50,5 54,50 cauda 44 52 48,0 34 28 31,0 39 31 35 38,00

Validação 0,7208 0,6744 0,5362 ---

15

SM 84 78 39,0 45 63 54,0 62 59 60,5 51,17 pescoço 25 66 33,0 56 54 55,0 54 49 51,5 46,50 dorso 27 58 29,0 82 72 77,0 45 62 53,5 53,17 cauda 59 49 24,5 65 56 60,5 54 52 53 46,00

16

SM 63 62 31,0 63 48 55,5 71 69 70 52,17 pescoço 56 62 31,0 47 49 48,0 64 58 61 46,67 dorso 74 59 29,5 52 52 52,0 63 64 63,5 48,33 cauda 67 71 35,5 48 53 50,5 60 73 66,5 50,83

Validação 0,4499 0,7958 0,6908 ---

Beva

cizu

mab

e (B

V)

18

SM 34 44 22,0 41 53 47,0 39 44 41,5 36,83 pescoço 22 32 16,0 36 48 42,0 28 39 33,5 30,50 dorso 17 15 7,5 37 49 43,0 41 55 48 32,83 cauda 63 59 29,5 52 36 44,0 61 43 52 41,83

19

SM 47 53 26,5 28 25 26,5 32 44 38 30,33 pescoço 39 28 14,0 39 35 37,0 59 63 61 37,33 dorso 40 33 16,5 42 45 43,5 50 39 44,5 34,83 cauda 23 32 16,0 36 25 30,5 36 44 40 28,83

Validação 0,8543 0,8924 0,5597 ---

20

SM 55 62 31,0 41 56 48,5 58 66 62 47,17 pescoço 63 52 26,0 61 48 54,5 49 53 51 43,83 dorso 46 69 34,5 32 49 40,5 69 55 62 45,67 cauda 33 58 29,0 59 52 55,5 58 62 60 48,17

21

SM 34 64 32,0 50 53 51,5 64 69 66,5 50,00 pescoço 41 28 14,0 36 33 34,5 73 81 77 41,83 dorso 29 33 16,5 59 62 60,5 44 53 48,5 41,83 cauda 33 32 16,0 44 57 50,5 56 49 52,5 39,67

Validação 0,284 0,4958 0,6831 --- Legenda: L1= leitor 1, L2= Leitor 2, M= média das contagens entre leitores. MF= Média das contagens das três lâminas

Apêndices

125

TABELA 24 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO CONTAGENS MICROSCÓPICAS DE CÉLULAS MARCADAS PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-PCNA, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS


Apêndices

126

APÊNDICE 11

Avaliação da densidade microvascular pelo CD34

1. Antecedentes

Para a avaliação da densidade microvascular do parênquima hepático de ratos

submetidos à hepatectomia parcial foi empregada técnica imunohistoquímica pela

marcação do receptor CD34, o qual é expresso difusamente nos microvasos cicatriciais,

com um anticorpo monoclonal específico, o anti-CD34 e seus níveis de expressão se

permitem a quantificação da densidade microvascular cicatricial (MOLGAARD, SPURR e

GREAVES, 1989; HSU, RAINE e FANGER, 1981). As lâminas eram identificadas com o

número da caixa seguido da identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-

SM-L3.

2. Método:

2.1. Material

• Foi empregado o marcador Biotin anti-CD34 antibody clone PC10 (DAKO®)

conforme técnica descrita por HSU, RAINE e FANGER (1981).

2.2. Técnica

• As amostras foram fixadas em paraformaldeído 4%, em PBS, pH 7,4, por 24

horas.

• Posteriormente, as amostras foram desidratadas em concentrações

crescentes de etanol, diafanizadas em Xilol e incluídas em parafina. Cortes

de 3µm das amostras foram depositados em lâminas carregadas

positivamente.

• Posteriormente, as lâminas foram processadas no “Autostainer de

imunohistoquímica” (Leica Bond Max®), onde os cortes foram

desparafinizados em xilol, reidratados em concentrações decrescentes de

etanol para a imunohistoquímica, os cortes histológicos reidratados foram

Apêndices

127

incubados com 3% H2O2 em metanol para o bloqueio da peroxidase

endógena.

• A recuperação antigênica foi realizada em tampão citrato de sódio 10mM, pH

6,0, à 95ºC, por 20 minutos.

• Possíveis ligações não específicas, bem como radicais aldeídicos livres foram

bloqueados pela incubação de cinco minutos com PBS contendo 1% de BSA

e por PBS contendo 0,1M de glicina, respectivamente.

• Posteriormente, os cortes foram incubados por 12 horas à 8ºC com o

anticorpo primário anti-PCNA1:100 (marca AbCam, monoclonal de coelho

clone ab18197®) e anticorpo anti CD34 1:300 (marca Dako, monoclonal de

camundongo, clone QBEnd10®).

• Após a incubação do anticorpo primário as lâminas foram lavadas em três

banhos de PBS por 5 minutos cada banho, e a após isto foi incubado o

polímero Refine Polymer (Leica®) por 30 minutos.

• Posteriormente, foi realizada a revelação da ligação dos anticorpos primários

foram realizadas com DAB (tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina) (DAB

substrate Kit, Leica), com posterior contra-coloração com o corante de

Hematoxilina.

• A seguir, os cortes foram desidratados em bateria crescente de etanol e

depois xilol, com isso as lâminas permanentes foram montadas com Entellan

(Merck®).

• Avaliação por histometria computadorizada

Apêndices

128

3. Resultados

TABELA 25 – RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Grupos Identificação Lâmina 1 Lâmina 2 MF

Con

trole

(C)

13 SM 322,71 323,58 323,15 pescoço 460,59 461,84 461,22 dorso 334,36 335,27 334,82 cauda 300,60 301,41 301,01


Validação (p) 0,9980 --- 15 SM 574,63 572,11 573,37

pescoço 444,40 444,93 444,67 dorso 522,90 523,53 523,22 cauda 427,93 428,44 428,19


Validação (p) 0,9684 ---

Beva

cizu

mab

e (B

V)



Validação (p) 0,9702 --- 19 SM 321,16 322,96 158,45

pescoço 458,38 460,95 234,17 dorso 332,76 334,62 333,69 cauda 299,15 300,83 299,99


Validação (p) 0,9665 --- Legenda: L1= leitor 1, L2= Leitor 2, M= média das contagens entre leitores. MF= Média das contagens das três lâminas

Apêndices

129

TABELA 26 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES HISTOMÉTRICAS DAS MARCAÇÕES PELO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD34, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 100 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS


Apêndices

130

APÊNDICE 12

Avaliação da ocorrência de fibrose no parênquima hepático.

1. Antecedentes:

Para a avaliação de ocorrência de áreas fibróticas nas amostras de fígados dos ratos foi

empregada a coloração tricrômica de Gomori para diferenciar o colágeno em verde

azulado dos demais componentes tecidual em tonalidade vermelho a laranjada. As

lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido da identificação do rato e da

lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.

2. Método

2.1. Material

• Cromotrope 2R 0,6g

• Fast Green 0,3g

• Ácido acético 1ml

• Ácido fosfotúngstico 0,8g

• Água destilada q.s.p. 100ml

2.2. Técnica

• Desparafinar e hidratar;

• Corar em hematoxilina por tempo normal;

• Lavar em água;

• Solução de Gomori por uma hora;

• Lavar rapidamente em água de torneira

• Desidratar, clarear e montar.

3. Leituras

• As análises das lâminas foram feitas em microscópio ótico convencional com

objetivas de 10x e 40x, por avaliadores treinados, não sendo informados dos

critérios para as identificações das lâminas.

Apêndices

131

• Para as avaliações das áreas fibróticas foram procedidas avaliações em 10

campos aleatórios de cada uma das três lâminas coradas pelo método de

tricrômico de Gomori.

• O número de áreas fibróticas era anotado em protocolo de 0 (ausência) e o

número de áreas pesquisadas em 10 campos.

• Para a conclusão era considerado negativo para fibrose a ausência nas três

lâminas avaliadas e positivo para uma ou mais ocorrências em cada uma das

três lâminas.

4. Resultados

TABELA 27 – MÉDIAS, LIMITES DE CONFIANÇA SUPERIOR E INFERIOR 95% E DESVIO PADRÃO DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Avaliações C48 C15 BV48 BV15 Desvio Padrão (DP) 0 0 0 0,16 Limite Inferior (LI 95%) 0 0 0 0,29 Média (Mx) 0 0 0 0,43 Limite Superior (LS 95%) 0 0 0 0,57

Apêndices

132

TABELA 28 – RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES DE ÁREAS FIBRÓTICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELO TRICRÔMICO DE GOMORI, EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS, EM 10 CAMPOS ALEATÓRIOS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

Grupos Identificação L1 L2 L3 Conclusão

Con

trole

13

SM 0 0 0 N pescoço 0 0 0 N dorso 0 0 0 N cauda 0 0 0 N

14


15


16


Beva

cizu

mab

e

17


18


19

SM 6 8 5 P pescoço 5 5 5 P dorso 2 4 3 P cauda 4 1 0 P

20

SM 6 5 7 P pescoço 5 4 5 P dorso 2 3 3 P cauda 4 5 6 P

Legenda: N: negativo para pesquisa de fibrose; P: positivo para fibrose

Apêndices

133

APÊNDICE 13

Avaliação histopatológica do parênquima hepático

1. Antecedentes:

Para a avaliação histopatológica do parênquima hepático de ratos submetidos à

hepatectomia parcial foi empregada a coloração de Hematoxilina e Eosina de Harris

para avaliar presença de edema, hemorragia, congestão, proliferação ductal (ROHDEN

et al., 2000). As lâminas eram identificadas com o número da caixa seguido da

identificação do rato e da lâmina: 13-SM-L1, 13-SM-L2, 13-SM-L3.

2. Método

2.1. Material

• Corante Hematoxilina de Harris

• Corante Eosina

• Soluções de álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.

2.2. Técnica

• Após a fixação em formol 4% tamponado por no mínimo 24 horas, as

amostras foram processadas por técnicas histológicas de rotina e coradas

pela HE.

• Armazenar em cápsulas histológicas e progressivamente desidratadas, em

banhos de uma hora em cada uma das quatro crescentes concentrações de

álcool etílico a 70%, 80%, 90% e 100%.

• Diafanizar através de dois banhos de uma hora de duração em xilol.

• Submeter a dois banhos de parafina a 58-60°C e incluir em formas de blocos.

• Cortar em micrótomo para a obter de cortes de 5 µm de espessura e montá-

los em lâminas previamente limpas, desengorduradas e banhadas em

solução fixadora de albumina.

• Remover a parafina seguida da hidratação dos cortes de tecido por 24 horas

em estufa a 56ºC e submeter a uma sequência de banhos em xilol por 10

Apêndices

134

minutos, álcool absoluto por 10 minutos, álcool 90% por cinco minutos, 80%

por cinco minutos, 70% por cinco minutos e água por cinco minutos.

• Corar em Hematoxilina de Harris por um minuto e meio, lavar em água

corrente por 30 minutos, corar em eosina por 30 segundos, lavar rapidamente

em água e desidratadas em série crescente de álcoois a 70%, 80%, 90% e

100%.

• Diafanizar as lâminas em xilol e montá-las com bálsamo sintético e lamínula.

2.3. Leituras

• As análises das lâminas foram executadas em triplicatas por avaliadores

independentes, em microscópio óptico Nikon (Eclipse E 200®) sob

magnificação de 10 e 40x.

3. Leituras

• As análises das lâminas foram feitas por dois avaliadores treinados, não

sendo informados dos critérios para as identificações das lâminas.

• Para as avaliações histopatológicas foram avaliadas as seguintes

características histológicas:

• Ausência de alterações.

• Edema, hemorragia, congestão, proliferação ductal e inflamação.

• Para a obtenção dos resultados os valores individuais das três leituras

para cada critério foram avaliados.

4. Resultados

TABELA 29 – DEMONSTRATIVO DAS PORCENTAGENS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS, CONFORME OS SUB-GRUPOS DE RATOS

• Grupos C48 C15 BV48 BV15 Achados E C PD E C PD E C PD E C PD Porcentagens 37,5 25 12,5 0 12,5 37,5 62,5 100 12,5 87,5 100 37,5

• Legenda:

E: edema / C: congestão / PD: proliferação ductal

Apêndices

135

TABELA 30 – RESULTADOS DAS AVALIAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS EM LÂMINAS DE FÍGADOS DE RATOS CORADAS PELA HEMATOXILINA & EOSINA DE HARRIS

Ratos Edema Congestão Proliferação ductal L1 L2 L3 C T L1 L2 L3 C T L1 L2 L3 C T

Con

trole

(C)

SM + - - P

3

- + + N

2

- - - N

1

pescoço - - - N + + + P - - - N dorso - - - N - - - N - - - N cauda - + + P - - - N - - - N SM - - - N - - - N - - P pescoço - - - N - - - N - - - N dorso - - - N - + + P - - - N cauda + - + P - - - N - - - N

0

0

pescoço - - - N - - + P - + - P dorso - - - N - - - N - - N cauda - - - N - - - N - + + P SM - - - N - - - N - - - P pescoço - - - N - - - N - - - N dorso - - - N - - - N - - + N cauda - - - N - - - N - - - N

Beva

cizu

mab

e (B

V)

SM - - - N

5

+ + + P

8

- - - N

1

pescoço - - - N + + + P - - - N dorso + + + P + + + P - - - N cauda + + + P + + + P - - - N SM + - - N + + + P + - + P pescoço + + + P + + + P - - - N dorso + + + P + + + P - - - N cauda + + + P + + + P - - - P SM - - - N

7

+ + + P

8

- - - N

3

pescoço + + + P + + + P - - - N dorso - + + P + + + P + + + P cauda + + + P + + + P - - - N SM - + + P + + + P - - - N pescoço + - + P + + + P - - - N dorso + + + P + + + P + - + P cauda + + + P + + + P - + + P

Legenda:

N: negativo, P: positivo, T: totais, L1= leitor 1, L2= Leitor 2, L3= Leitor 3 C= Conclusão., T=

totais de positividades para fibrose hepática.

Documents

ESTUDO EXPERIMENTAL DA INIBIÇÃO DO VEGF NA …