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LEONARDO DO NASCIMENTO ROLIM
ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ISOLADOS
DE Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. CULTIVADOS PELA TÉCNICA “JUN-CAO”
Recife – 2009
II
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS
LEONARDO DO NASCIMENTO ROLIM
ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ISOLADOS
DE Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. CULTIVADOS PELA TÉCNICA “JUN-CAO”
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia de
Fungos da Universidade Federal de
Pernambuco, como requisito para
obtenção do título de Doutor em
Biologia de Fungos.
Orientadora: Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti (UFPE)
Coorientadora: Dra. Arailde Fontes Urben (Embrapa – Cenargen)
Recife – 2009
III
Rolim, Leonardo do Nascimento
Estudos fisiológicos, bioquímicos e molecular es de isolados de Ganoderma lucidum (Fr.) karst. cultivados pela técnica “Jun-C ao” / Leonardo do Nascimento Rolim. – Recife: O Autor, 2009. 114 folhas: il., fig., tab. Orientadores: Maria Auxiliadora de Queiroz Cav alcanti e Arailde Fontes Urben.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de
Ciências Biológicas. 2009.
Inclui bibliografia e anexo.
1. Cultivo de cogumelos 2. Cogumelo Rei 3. Ganoderma lucidum 4.
Jun-Cao I Título.
635.8 CDD (22.ed.) UFPE
CCB – 2009- 097
IV
ESTUDOS FISIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E MOLECULARES DE ISOLADOS
DE Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. CULTIVADOS PELA TÉCNICA “JUN-CAO”
LEONARDO DO NASCIMENTO ROLIM
Tese apresentada em: ___ / ___ / ___
Banca Examinadora da Tese:
_____________________________________ Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti
(Dept. Micologia / UFPE)
_____________________________________ Dr. José Luiz Bezerra
(Dept. Micologia / UFPE)
_____________________________________ Dra. Laíse de Holanda Cavalcanti Andrade
(Dept. Micologia / UFPE)
_____________________________________ Dr. Bartolomeu Acioli dos Santos
(CPqAM / Fiocruz)
_____________________________________ Dr. José Ferreira dos Santos
(Dept. Genética / UFPE)
_____________________________________ Dra. Uided Maaze Tiburcio Cavalcante
(Dept. Micologia / UFPE) (Suplente)
_____________________________________ Dra. Kátia Cavalcanti Pôrto
(Dept. Botânica / UFPE) (Suplente)
V
VI
"Influenciar uma pessoa é emprestar-lhe a nossa alma. Essa pessoa deixa de ter idéias próprias, de vibrar com as suas paixões naturais. As suas qualidades não são verdadeiras. Os seus pecados, se é que existe o que se pode chamar de pecado, vêm-lhe de outrem. Essa pessoa se torna o eco da música de outra pessoa, intérprete de um papel que não foi escrito para ela. A finalidade da vida é, para cada um de nós, o aperfeiçoamento, a realização plena da nossa personalidade. Hoje, porém, cada qual tem medo de sí próprio; esquece o maior dos deveres: o dever que tem consigo mesmo."
(Oscar Wilde, 'O Retrato de Dorian Gray')
VII
Dedico este trabalho
à minha família.
VIII
Agradecimentos
A Deus, o Grande Arquiteto do Universo, por todos os momentos bons de minha
vida e também pelos momentos ruins, que me fizeram mais forte.
À minha família, por sempre estar ao meu lado, ajudando direta ou indiretamente a
prosseguir na caminhada.
À Cíntia, minha eterna menininha linda, por estar ao meu lado e por me fazer
entender alguns aspectos da vida.
À Universidade Federal de Pernambuco pela oportunidade da realização do Curso
de Pós-Graduação em Biologia de Fungos e pelo suporte financeiro na concessão da bolsa.
À Embrapa Cenargen por ter dado todo o suporte para a realização deste trabalho.
À minha orientadora, Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti e à minha co-
orientadora, Dra. Arailde Fontes Urben, pelo convívio e por todos os ensinamentos teóricos
e práticos dos quais certamente jamais esquecerei.
À Dra. Erna Bach, da Universidade Nove de Julho, por ter ajudado na realização das
análises bioquímicas.
À minha colega Walkíria pelo auxílio nas análises estatísticas, me fazendo entender
os “comos” e os “por quês” de todos aqueles números.
Aos colegas da Embrapa, em especial Vicentina, Brunno, Fernanda, Vanessa Alves,
Vanessa Wetzel, Giselle, Lydia e Arlysson, pela ajuda e pelos momentos divertidos que me
proporcionam tantas boas lembranças.
IX
À dona Vera e seu filho Marcos Rui, pela acolhida e por terem me ajudado tanto
quando estive em Brasília.
À Giovanna Guterres, pela ajuda que me deu lá no Departamento de Micologia.
Ao pessoal de Lineage II, pelos divertidos momentos que me ajudaram a aliviar o
estresse.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho,
pelas muitas alegrias, companheirismo, solidariedade e por todos os ótimos momentos que
passamos juntos e que deixarão saudades.
Sumário
RESUMO ........................................................................................................................................................ 11
ABSTRACT .................................................................................................................................................... 12
INTRODUÇÃO .............................................................................................................................................. 13
REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................................................... 15
1. OS COGUMELOS ..................................................................................................................................... 15
2. O CULTIVO DE COGUMELOS ............................................................................................................. 17
3. O COGUMELO REI ( GANODERMA LUCIDUM)................................................................................. 20
4. TAXONOMIA E CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE G. LUCIDUM ...................................... 23
5. MORFOLOGIA DE GANODERMA ........................................................................................................ 25
6. BIOQUÍMICA E FARMACOLOGIA DO G. LUCIDUM ...................................................................... 27
6.1. ESTUDOS CLÍNICOS .............................................................................................................................. 30
7. CULTIVO DE GANODERMA LUCIDUM .............................................................................................. 32
7.1. SUBSTRATO........................................................................................................................................... 33 7.1.1. Necessidades nutricionais............................................................................................................. 34 7.1.1.1. Carbono ..................................................................................................................................... 35 7.1.1.2. Nitrogênio .................................................................................................................................. 36 7.1.1.3. Vitaminas e sais minerais .......................................................................................................... 37 7.1.1.4. Substrato residual ...................................................................................................................... 37
7.2. FATORES FÍSICOS E BIOLÓGICOS QUE INFLUENCIAM O CRESC IMENTO E PRODUÇÃO DE GANODERMA LUCIDUM ..................................................................................................................................................... 38
7.2.1. Fatores físicos............................................................................................................................... 38 7.2.1.1 Temperatura e umidade relativa................................................................................................. 39 7.2.1.2. Granulometria do substrato....................................................................................................... 39 7.2.1.3. Troca gasosa.............................................................................................................................. 40 7.2.1.4. Luz.............................................................................................................................................. 41 7.2.1.5 Potencial hidrogeniônico............................................................................................................ 41 7.2.2. Fatores biológicos ........................................................................................................................ 42
8. MARCADORES MOLECULARES......................................................................................................... 43
8.1. A TÉCNICA RAPD ................................................................................................................................ 46
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................................... 50
PRODUÇÃO DE LINHAGENS BRASILEIRAS DE GANODERMA LUCIDUM PELA TÉCNICA CHINESA JUN-CAO..................................................................................................................................... 67
ANÁLISE BIOQUÍMICA DE LINHAGENS BRASILEIRAS E CHINE SAS DE GANODERMA LUCIDUM CULTIVADAS PELA TÉCNICA CHINESA JUN-CAO........... ............................................ 79
USO DE MARCADORES MOLECULARES RAPD NA DIFERENCIAÇÃO DE LINHAGENS BRASILEIRAS E CHINESAS DE GANODERMA LUCIDUM ................................................................ 88
CONCLUSÕES .............................................................................................................................................. 98
ANEXO 1: A TÉCNICA JUN-CAO ............................................................................................................. 99
ANEXO 2: GÉIS OBTIDOS NA ANÁLISE GENÉTICA DAS LINHA GENS ...................................... 109
11
Resumo
Ganoderma lucidum é um basidiomiceto muito popular na medicina tradicional
chinesa, sendo chamado de “Lingzhi” ou “cogumelo da imortalidade”. Estudos revelaram
diversas propriedades farmacológicas benéficas deste fungo, sugerindo sua utilização como
auxiliar em diversos tratamentos contra doenças humanas. Por não ser muito comum na
natureza, o cultivo é a melhor maneira de suprir um mercado cada vez mais amplo. Dentre
os vários métodos de cultivo existentes para a fungicultura, a técnica Jun-Cao é considerada
a mais promissora para a produção de cogumelos em escala que atenda à demanda
crescente. Sabendo que a bioquímica de um organismo pode variar entre diferentes
linhagens, e entendendo a necessidade de descobrir novas variedades de G. lucidum, para
ampliar as opções de cultivo deste fungo, este trabalho buscou comparar linhagens
comerciais chinesas com linhagens brasileiras inexploradas de G. lucidum, para avaliar o
valor bioquimico destas. Os resultados mostram que o cultivo combinado de madeira com
gramínea, na técnica Jun-Cao, foi mais promissor no desenvolvimento das linhagens tanto
em redução no tempo de cultivo quanto na qualidade e quantidade dos cogumelos. A
linhagem brasileira (CC-144) destacou-se tanto na velocidade de crescimento, quanto na
produtividade de basidiomas e na concentração bioquímica de proteínas, carboidratos, β-
glucanas e fenóis, superando as chinesas e se mostrando uma opção para a fungicultura. A
análise RAPD mostrou distinção genética entre as linhagens, descartando a possibilidade de
ocorrência de clones.
Palavras-chave: Cogumelos, Ganoderma lucidum, Jun-Cao, análises bioquímicas, RAPD.
12
Abstract
The basidiomycete Ganoderma lucidum is a very popular mushroom in traditional
Chinese medicine, called "Lingzhi" or "mushroom of immortality". Studies have shown
several beneficial pharmacological properties of this fungus, suggesting its use as an aid in
treatments against various human diseases. It is not very common in nature. Thus,
cultivation is the best way to address an increasingly wide market. Among the several
existing methods of cultivation for fungiculture, the Jun-Cao technique is considered the
most promising for the production of mushrooms in scale that meets the growing demand.
Knowing that the biochemistry of an organism can vary between different strains and
understand the need to find new varieties of G. lucidum, to expand the options for growing
the fungi, this study sought to compare Chinese strains and unexplored Brazilian strains of
G. lucidum, to assess the value of these biochemical. The results show that the cultivation
of wood combined with grass was more promising in the development of strains in both
reduction in duration of cultivation on the quality and quantity of mushrooms. The
Brazilian strain (CC-144) is highlighted in both the speed of growth, as productivity and the
concentration of basidiomes biochemistry of proteins, carbohydrates, phenols and β-
glucans, surpassing the Chinese and showing an option for fungiculture. The RAPD
analysis showed genetic distinction between the lines, discarding the possibility of clones.
Key-words: Mushrooms, Ganoderma lucidum, Jun-Cao, biochemical analysis, RAPD.
13
INTRODUÇÃO
Os cogumelos sempre foram apreciados e temidos desde o inicio da civilização
humana. A maior importância está no seu valor gastronômico, nutricional e medicinal. Ao
longo dos anos, esta importância vem crescendo em função do mercado e de avanços
tecnológicos, melhorando a qualidade, a produtividade e diminuindo o custo de produção
(Eira, 2003; Urben et al., 2004).
Dentre os diferentes tipos de cogumelos comercializados nos dias de hoje, o
Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (Ganodermataceae) é um basidiomiceto comumente
utilizado na medicina tradicional chinesa por mais de 2000 anos, sendo chamado de
“Lingzhi” ou “cogumelo da imortalidade”, mas sendo conhecido no Brasil pelo nome
Cogumelo Rei (Mau et al., 2001).
Estudos feitos com linhagens de G. lucidum revelaram propriedades farmacológicas
cujos efeitos têm sido verificados no combate a diversos tipos de doenças humanas, tais
como hepatite, hipertensão, distúrbios cardíacos, artrite, bronquite, tumores e diabetes,
dentre outras (Russell & Paterson, 2006).
Os cogumelos de interesse comercial, como o G. lucidum, podem ser uma
alternativa para produtores dispostos a realizar cultivos recicláveis, para os quais a matéria-
prima para uso de substrato pode ser obtida de materiais mais facilmente encontrados como
capim, bagaço de cana, borra de café, gesso e açúcar, entre outros. Além disso, o substrato
esgotado pode ser aproveitado como ração para animais ou fertilizante (Urben et al., 2004).
Em vista do crescente aumento no comércio de cogumelos, surge também a preocupação
com as linhagens que são disponíveis no mercado, pois a eficiência nutricional e medicinal
varia conforme o isolado em uso (Ro et al., 2007).
14
Embora os métodos clássicos de taxonomia sejam viáveis para separação de grupos,
não são eficientes para análise e distinção entre linhagens de uma mesma espécie (Hseu et
al., 1996). Em vista disso, a utilização de ferramentas para análise genética têm-se
mostrado uma poderosa ajuda na diferenciação de níveis taxonômicos específicos. Colauto
et al (2002) sugeriram que, dentre as várias ferramentas genéticas atualmente disponíveis, a
técnica RAPD possui a vantagem de detectar polimorfismos de forma rápida, simples,
direta e de baixo custo.
Devido ao fato de existir uma considerável variação nutricional entre diferentes
linhagens de uma mesma espécie de cogumelo como, por exemplo, a concentração de
moléculas bioativas (Wang e Ng, 2001, 2004; Choi et al., 2005) e enzimas de interesse
industrial (Ruiz-Duenas et al., 2001) torna-se extremamente importante, principalmente do
ponto de vista comercial, que isolados possam ser diferenciados facilmente, sem a
necessidade de exames bioquímicos. Embora as linhagens chinesas de Ganoderma lucidum
sejam as mais conhecidas e comercializadas, existem muitas linhagens deste cogumelo
espalhadas pelo mundo, com potencial inexplorado e características bioquímicas e
genéticas desconhecidas.
Este trabalho teve como objetivo estudar aspectos fisiológicos, bioquímicos e
moleculares de isolados do Cogumelo Rei (Ganoderma lucidum) coletados no Brasil,
comparando-as com linhagens comerciais chinesas aplicando variações da técnica chinesa
“Jun-Cao” visando o estabelecimento de protocolo para produção em larga escala.
15
REVISÃO DA LITERATURA
1. Os cogumelos
Cogumelos são fungos da Divisão Basidiomycota (Kirk et al., 2001), conhecidos
pela civilização desde os primórdios da sua história, devido às suas características tóxicas
(gerando acidentes por vezes fatais) ou por suas características nutritivas e medicinais, que
os tornaram importante fonte de estudos por parte de pesquisadores no mundo inteiro.
Como exemplo disso, podemos citar que os astecas ingeriam cogumelos como alimento ou
como alucinógenos em rituais religiosos. Outro exemplo são estátuas com formato de
cogumelo que teriam sido esculpidas no século 15 A.C. encontradas na Guatemala. Na
natureza, a maioria destes fungos é constituída de espécies saprófitas, sendo muitas delas
benéficas às plantas. Eles constituem um grupo de organismos amplo e heterogêneo, que
pode ser encontrado praticamente em qualquer nicho ecológico (Urben et al., 2004).
Durante muitos anos, esses macromicetos foram descritos como pertencente ao
Reino Vegetal. Posteriormente, com os avanços da ciência, os métodos de análise
microscópica foram se aperfeiçoando de modo a contribuírem nos estudos referentes à
morfologia e reprodução desses organismos. Tais contribuições levaram os pesquisadores a
enquadrá-los no Reino Fungi. Acredita-se que existem cerca de 250.000 espécies diferentes
de fungos na natureza e, até onde se sabe, cerca de 2000 espécies de cogumelos são
potencialmente comestíveis. Destas, cerca de 22 são intensivamente cultivadas. O cultivo
dos cogumelos geralmente é feito no solo ou em troncos de madeira ou em substrato de
serragem, e sempre são utilizadas condições ambientais e nutricionais específicas. O
micélio (fase vegetativa) do cogumelo é importante constituinte do ecossistema por
16
degradar o substrato de folhas e troncos mortos, sendo o corpo de frutificação (basidioma)
apreciado pelo seu aroma, sabor e princípios medicinais (Manzi et al., 2001).
Estudos revelam que as propriedades farmacológicas destes fungos podem retardar
o envelhecimento e combater doenças tais como hipertensão, colesterol e câncer, dentre
outras (Bobek et al., 1995; Bobek e Gabovy, 1999; Zhang et al., 2001; Chen et al., 2004;
Cheung e Cheung, 2005) (Tabela 1). Os principais agentes destes efeitos farmacológicos
são polissacarídeos existentes em sua parede celular, vários beta-glucanos, diversos ácidos
orgânicos e compostos protéicos (Kalac e Svoboda, 2000; Manzi e Pizzoferatto, 2000; Kim
et al., 2004; Agrahar-Murugkar e Subbulakshmi, 2005).
Tabela 1 - Utilização de cogumelos na medicina popular
Espécies Utilização
Claviceps purpurea Alivia as dores nos partos
Polyporus suaveolena Tuberculose, sudorese noturna
P. coccineus Hemorragia, distúrbios uterinos
Fomes officinalis Purgante, tuberculose, sudorese noturna, diurético
F. fomentarius Hemorragia
Pycnoporus sanguineus Hemoptise, verrugas
Geastrum saccatum Hemorragia, distúrbios uterinos
Trametes cupreorosea Doenças próprias do sexo feminino
Ustilago maydis Espinhas, escorioses, queimaduras, ajuda em partos
Calvatia cyathiformis Cicatrizante, coagulante
C. gigantea Inflamação, sangramentos, limpeza dos pulmões e garganta
Citocybe gibba Febre
Fomitopsis pinicola Hemorragia
Auricularia fuscosuccinea Fortificante da circulação sangüínea
Ganoderma lucidum Tônico, inflamações, diurético, combate o câncer
G. applanatum Câncer esofágico
Lentinula edodes Evita doenças causadas pela falta de vitamina D
Coprinus comatus Hemorróidas
FONTE: Bononi et al., 1995.
17
Alguns basidiomicetos, como já foi dito, são altamente tóxicos, causando distúrbios
mentais, alucinações, diarréias e até mesmo morte quando ingeridos. Neste último caso
estão várias espécies do gênero Amanita, como A. muscaria, e do gênero Psilocybe (P.
mexicana) (Menezes e Oliveira, 1993).
Morfologicamente, o basidioma (também conhecido como corpo de frutificação) é
composto pelo estipe (talo) e píleo (chapéu), sendo este último conhecido por possuir uma
ampla variedade de formas e colorações, conforme a espécie de cogumelo. A parte fértil do
cogumelo (himênio) localiza-se no himenóforo (parte inferior do píleo), podendo este ter
disposição variável entre as espécies, indo do lamelar (composto por lamelas) até o tubular
(superfície poróide). No himênio são produzidos os basídios e basidiósporos (estruturas
férteis), bem como as estruturas estéreis (Alexopoulos et al., 1996).
A reprodução dos basidiomicetos pode ocorrer assexuadamente e sexuadamente. O
primeiro caso se dá na fase vegetativa, pela fragmentação do micélio (artrósporos),
produção de conídios, oídios e clamidósporos. Na reprodução sexuada, denominada
somatogamia, é onde ocorrem plasmogamia, dicariofase, cariogamia e meiose, culminando
com a formação dos basídios e basidiósporos haplóides (Alexopoulos et al., 1996).
2. O cultivo de cogumelos
A indústria dos cogumelos comestíveis produz atualmente cerca de dois milhões de
toneladas por ano. As três variedades mais cultivadas são o champignon de Paris (Agaricus
bisporus), o cogumelo ostra (Pleurotus ostreatus) e o Shiitake (Lentinus edodes), sendo
produzidos amplamente no leste asiático (Chang e Miles, 1991). Os cogumelos comestíveis
são conhecidos por terem curto período de vida (Geralmente 1 – 3 dias em temperatura
ambiente), vindo a se decompor rapidamente. Este fato se deve à alta atividade de enzimas
18
proteases e polifenol oxidases, responsáveis pelo decréscimo dos níveis protéicos e de
carboidratos, além de promover escurecimento da superfície do cogumelo (Czapski e
Szudyga, 2000). Para evitar perda do produto existem atualmente várias técnicas de
desidratação, conservação e refrigeração, que mantêm as propriedades nutritivas destes
fungos (Manzi et al, 2004).
Nos séculos passados, os japoneses cultivavam os cogumelos sob troncos em
decomposição; os chineses, em madeira e palhas decompostas; os europeus, em bosques, ao
ar livre ou em cavernas. Entretanto, esses processos eram lentos, pois era necessário muito
tempo para o desenvolvimento do fungo e frutificação. Atualmente, a pesquisa científica
modificou todo o contexto de cultivo, tornando a produção comercial destes fungos cada
vez maior (Urben et al., 2004). Principalmente na China a produção e o ensino das técnicas
de cultivo de fungos têm se desenvolvido extensivamente, de modo que por 10 anos (1985
– 1995) a produção destes fungos foi listada como o item mais importante no programa de
desenvolvimento daquele país (Zhanxi e Zhanhua, 1997).
Embora seja o mais cultivado no mundo, o champignon (Agaricus bisporus) tem
perdido espaço para as outras variedades devido ao seu complicado processo de cultivo e
baixa eficiência biológica, enquanto os outros cogumelos possuem maior facilidade de
crescimento (Banik e Nandi, 2004). Por sua facilidade no cultivo e baixo custo de
produção, o cogumelo ostra (Pleurotus ostreatus) ocupa o segundo lugar em produção
mundial. Por sua capacidade em desenvolver-se com sucesso à temperatura ambiente, P.
ostreatus dispensa o rigoroso controle climático e de umidade que o champignon necessita.
A produção anual do cogumelo ostra aumenta a cada ano, de 880 toneladas no ano de 1996
a 1.940 toneladas em 2002, sendo a China o maior produtor (Royse et al, 2004). O Shiitake
(Lentinula edodes) ocupa a terceira posição de mercado quando comparado ao champignon
19
e ostra, mas sua demanda vem crescendo significativamente (207 toneladas em 1993 e
1.573 toneladas em 1999), sendo a China novamente seu maior produtor e consumidor
(Chang, 1999).
Em 1983 uma técnica de cultivo utilizando gramíneas como substrato para o maior
desenvolvimento de corpos de frutificação foi elaborada na China pelo professor Dr. Lin
Zhanxi e Dr. Lin Zhanhua. Batizada de “Jun-Cao” (Jun= cogumelo; Cao= gramíneas) essa
técnica revolucionou o sistema de produção de cogumelos, elevando a quantidade destes
fungos e diminuindo substancialmente o tempo de frutificação. O Shittake, por exemplo,
teve sua produção aumentada de 1200 toneladas (no ano 1977) para 40000 toneladas (em
1993) (Zhanxi e Zhanhua, 1997). Esta técnica dispensa completamente o uso de toras e
serragem, utilizando gramíneas e outros compostos para gerar o substrato. O refinamento
do método levou à seleção de várias espécies de gramíneas adequadas ao processo. Entre
elas estão a cana-do-reino (Arundo donax), campim-cidró (Cymbopogon citratus), capim-
elefante (Pennisetum purpureum), sorgo (Sorghum vulgare) e milho (Zea mays) entre
outras (Urben et al., 2004).
A produtividade na fungicultura em geral depende das propriedades genéticas da
espécie fúngica, qualidade e estrutura do substrato, e das condições de cultivo, sendo
expressa em Produtividade (embora Urben et al., 2004, usem o termo Eficiência Biológica),
dada pela fórmula P= (peso fresco de cogumelos/ peso seco do substrato inicial) X 100
(Zhanxi e Zhanhua, 1997). Em Pleurotus ostreatus a técnica “Jun-Cao” gerou significantes
resultados, que variavam conforme o substrato utilizado. Substrato contendo Cana-de-
açúcar moída na hora gerou P= 35,17, ao passo que palha de arroz gerou P= 81,25, resíduo
algodão (75%) com palha (23%) e cal (2%) obteve P= 104,90. A palha de melão-são-
20
caetano utilizada no substrato resultou em P= 139,66 e a polpa de café fresca produziu P=
159,68 (Urben et al., 2004).
A qualidade nutritiva dos cogumelos cultivados em Jun-Cao supera o valor
nutricional de cogumelos cultivados em toras e serragens, conforme pode ser visto na
Tabela 2, onde se compara a composição nutritiva de Shiitake (Lentinus edodes) nos três
tipos de cultivo (Urben et al., 2004).
Tabela 2 – Comparação nutricional de Shiitake (Lentinus edodes) entre três métodos de cultivo
(%) Jun-Cao Serragem Tora
Proteína 32,836 28,787 19,65
Fibra 20,4 17,12 29,81
Gordura 2,31 2,61 1,71
Cinza 9,42 8,02 9,55
N 5,254 4,606 3,145
P 0,965 0,855 0,378
K 1,944 1,447 1,372
Ca 0,013 0,033 0,023
Mg 0,143 0,132 0,137
Cu (ppm) 15,79 7,1 9,45
Zn (ppm) 119,57 74,66 133,2
Mn (ppm) 26,88 13,45 16,25
Fe (ppm) 101,95 75,12 78,6
Fonte: Urben et al., 2004
3. O Cogumelo Rei (Ganoderma lucidum)
Ganoderma lucidum (Fr.) Karst (Ganodermataceae) é um basidiomiceto comumente
utilizado na medicina tradicional chinesa há mais de 2000 anos. O nome “Ganoderma” tem
sua origem no grego (ganos = brilho; derma = pele), devido ao fato de que os
21
representantes típicos desse gênero apresentam superfície brilhante, com aspecto
envernizado. Tradicionalmente, são produzidos e consumidos nos países asiáticos
(principalmente na China, Japão e Coréia), mas atualmente diversos países da Europa e
América já os produzem e consomem em escalas cada vez maiores (Urben et al., 2004).
Na China, G. lucidum é conhecido como “Lingzhi”, ou “Cogumelo da
Imortalidade” e no Japão ele é conhecido por “Mannentake” ou "Reishi”, sendo tratados
como “ervas da longevidade e da boa fortuna”. No Brasil esse fungo é conhecido como
“Cogumelo Rei”, “Cogumelo Brilhante” ou “Cogumelo do Imperador” (Mau et al., 2001).
A produção de G. lucidum vem crescendo ao longo dos anos. O Japão, por exemplo,
teve uma produção estimada de 500 toneladas de matéria seca em 1995, comercializando-o
principalmente como suplemento alimentar. Em outros países como China, Taiwan, Coréia,
Tailândia e Vietnã, o comércio deste fungo também segue uma curva ascendente. Para se
ter uma idéia, em 1997 a produção mundial de Ganoderma foi de aproximadamente 4.300
toneladas, sendo que a China contribuiu com 3.000 toneladas. Acompanhando esse
próspero negócio, as pesquisas em G. lucidum se intensificaram, na busca por condições
ideais para o seu cultivo tanto in natura quanto in vitro (Wasser, 2002).
As diversas variedades deste cogumelo são identificadas pelas características
morfológicas do corpo de frutificação, sendo que os antigos textos chineses já descreviam o
processo de diferenciação desse cogumelo por meio de sua coloração. Segundo crenças
antigas, difundidas entre chineses, cada cor confere uma qualidade única ao tipo de
Ganoderma observado. O “Lingzhi” vermelho é o mais conhecido, apresentando haste de
sustentação, píleo reniforme e coloração marrom-avermelhada com aspecto lacado, como
se realmente tivesse sido pintado com verniz. Outras variações envolvem coloração branca,
22
violeta, amarela e preta, sendo esta última associada às espécies G. neo-japonicum ou G.
formosanum (Seo e Kirk, 2000).
O cogumelo rei contém uma série de substâncias químicas, sendo os polissacarídeos
sua maior fonte de atividades biológicas e uso terapêutico (Kim et al., 2004; Cao e Lin,
2006). A presença dessas substâncias confere ao fungo propriedades biológicas, como
atividade antitumoral (Ooi et al., 2002), anti-inflamatória (Ukai et al., 1983), antiviral (anti-
HIV) (El-Mekkawy et al., 1998), antibacteriana (Smania et al., 1999) e antiparasítica (Kim,
1987). Seus efeitos farmacêuticos sugerem aplicações no combate a diversos tipos de
problemas de saúde, tais como alergias (Nogami, 1987), hepatite (Lakshmi et al., 2006),
debilitação do sistema imune (Ji et al., 2007; Zhu et al., 2007), hipertensão (Eo et al.,
1999), distúrbios cardíacos (Kim et al., 1995), inflamações em geral (Wasser & Weis,
1999), tumores (Lakshmi et al., 2006; Tang et al., 2006), diabetes (Zhang & Lin, 2002),
insônia (Chu et al., 2007), dentre outras (Russell & Paterson, 2006; Li et al., 2007).
Compostos de alto poder farmacológico isolados de G. lucidum incluem
triterpenóides, proteínas, esteróides, alcalóides, enzimas, ácidos orgânicos, lactonas, sais
minerais e ácidos graxos (Urben et al., 2004). Polissacarídeos (especialmente β–D-
glucanos) são reconhecidamente agentes anticancerígenos (Kim et al., 1999; Mizushina et
al., 1999; Vetter, 2003; Mdachi et al., 2004; Stanley et al., 2005; Muller et al., 2006; Sliva,
2006; Wu et al., 2006; Xie et al., 2006; Liu et al., 2007).
Na culinária oriental, o micélio do G. lucidum é usado como ingrediente em
diversas receitas, ditas como saudáveis e terapêuticas. O recente aumento no consumo
humano de G. lucidum é devido ao fato deste fungo possuir baixas calorias e ser rico em
proteínas, quitina, vitaminas e sais minerais (Urben et al., 2004). Segundo Ha (2003), o
23
Cogumelo Rei é um excelente suplemento alimentar, muito utilizado na Ásia para melhorar
o sistema imune e promover longevidade.
Como G. lucidum encontrado na natureza não é suficiente para atender ao crescente
mercado de consumo, o cultivo é a melhor forma de obter esse fungo. Assim, é importante
que novos e mais eficientes métodos de cultivo sejam desenvolvidos com intuito de elevar a
produção e estimular maior síntese de seus compostos terapêuticos. Com esse foco em
mente, diversos pesquisadores vêm estudando o comportamento fisiológico de G. lucidum
em diversos tipos de substratos sólidos e líquidos, para que este cogumelo possa ser obtido
em escala que atenda ao mercado (Straatsma et al., 2000; Bao et al., 2002; Berovic et al.,
2003, Tang e Zhong, 2003; Hsieh et al., 2005).
Em geral os métodos de cultivo deste cogumelo medicinal são semelhantes aos
utilizados para produção clássica de Shiitake (Lentinus edodes), utilizando toras de madeira
ou substratos contendo serragem (Mau et al., 2001). Entretanto, tais procedimentos fazem
com que o Cogumelo Rei leve geralmente vários meses para completar seu ciclo,
dificultando o controle de qualidade do produto final, que deve possuir altos índices de
componentes medicinais, baixos índices de fenóis e ausência de contaminantes (Lee et al.,
2003).
4. Taxonomia e características fenotípicas de G. lucidum
Ganoderma é um dos maiores gêneros dentre os fungos poliporóides e foi
estabelecido em 1881 por Peter Adolf Karsten, um renomado micologista finlandês. Na
época, ele incluiu apenas uma espécie Polyporus lucidus, que havia sido descrita no século
XVI pelo botânico inglês William Curtis (Karsten, 1881). Após essas primeiras descrições,
dezenas de espécies pertencentes a esse gênero foram apresentadas por diversos
24
taxonomistas. Na época, a identificação de Ganoderma se dava principalmente por sua
especificidade com o hospedeiro, pela sua distribuição geográfica e por características
morfológicas do basidioma, tais como a cor, forma da margem do píleo e a presença do
estipe, além de características dos esporos e morfologia das hifas (Seo e Kirk, 2000).
A classificação de espécies deste gênero é confusa, gerando a inclusão de centenas
de espécies inadequadamente nesse taxon (Buchanan, 2001). Com a evolução das pesquisas
e do interesse comercial que esta espécie vem despertando, há uma tentativa de identificá-lo
mais acuradamente, principalmente com o propósito de proteção de patentes. A família
Ganodermataceae foi criada por Donk em 1933 para agrupar fungos poliporóides
caracterizados por basidiósporos com dupla parede. Mais tarde, Julich (1981) introduziu o
nome ordinal Ganodermatales. Embora características fenotípicas sejam fundamentais para
a triagem inicial de espécies desta família, uma classificação biológica baseada unicamente
em dados morfológicos e fisiológicos gera dúvidas em muitos casos.
Classificar Ganoderma diante de critérios taxonômicos cuja abordagem varia de
pesquisador para pesquisador levanta problemas na interpretação da literatura. Moncalvo e
Ryvarden (1997), por exemplo, relacionam 387 espécies fazendo parte da família
Ganodermataceae, sugerindo que G. lucidum, na verdade, tornou-se um complexo onde
estão incluidos G. tsugae Murr., G. valesiacum Boud., G. oregonense Murr., G. resinaceum
Boud., G. pfeifferi Bres., G. oerstedii (Fr.) Torr. G. ahmadii Stey.
A distribuição geográfica de G. lucidum também é assunto para discussão, visto que
autores como Moncalvo et al. (1995) defendem que esta espécie é restrita à Europa, mas
outros autores, como Herrera & Ulloa (1998), afirmam que a distribuição deste fungo é
bem mais ampla, abrangendo diversas regiões do planeta. Estudos mostram que G. lucidum
pode ser encontrado tanto na Europa (Ryvarden e Gilbertson, 1993), como na África
25
(Ryvarden e Johansen, 1980), América do Norte (Gilbertson e Ryvarden, 1986) e Ásia
(Nunez e Ryvarden, 2000). Hobbs (1995) e Hseu et al (1996), também afirmam que G.
lucidum pode ser encontrado na América do Norte, Europa, Índia, América do Sul e Ásia,
enquanto Gottlieg & Wright (1999) apontam sua presença na América do Sul,
particularmente na Argentina e no Brasil. Reforçando a opinião destes autores, Loguercio-
Leite (2005) detalha a descrição de G. lucidum encontrado no Brasil, sugerindo que a
distribuição geográfica deste fungo ainda carece de consenso.
5. Morfologia de Ganoderma
Segundo Urben et al. (2004) o basidiocarpo de G. lucidum se desenvolve
lentamente, permitindo apenas colheitas anuais. Embora possa existir diferença de
crescimento em relação à linhagem utilizada, o tempo médio de crescimento fica em torno
de seis meses. Shin et al. (1986) relatam amplas variações no basidiocarpo, que pode ser
sustentado por um estipe ou não cujo comprimento também pode oscilar bastante.
Ryvarden (1991) descreve que o píleo pode se apresentar diferenciado em relação à
sua inserção no estipe. O mais comum é encontrá-lo inserido lateralmente, embora sejam
encontradas ligações do tipo excêntrica, central e séssil. Segundo o autor, o tipo de ligação
do píleo, diâmetro e comprimento podem ser utilizados para realizar diferenciações entre
espécies do gênero.
Outra característica morfológica que tem sido empregada na taxonomia de
Ganoderma é o aspecto lacado do píleo e do estipe, sendo esta a principal observação que o
diferencia do gênero Amauroderma. Apesar disso, existem exceções à regra, como no caso
de A. austrofujianense e A. leptopus, que possuem aspecto lacado, e de G. mongolicum, que
não apresenta laca. Mesmo assim, os taxonomistas preferem manter a característica lacada
26
em suas chaves de classificação, afirmando ser um auxílio viável na identificação da
família Ganodermataceae (Seo e Kirk, 2000). Zhao (1989) informa que o tamanho e o
formato dos poros são características complementares muito úteis para se definir as
espécies de Ganoderma.
Urben et al. (2004) descreve as hifas do gênero como sendo geralmente hialinas,
com paredes finas, ramificadas, podendo ser septadas ou não, formando alças entrelaçadas,
enquanto que as hifas esqueléticas sempre se apresentam pigmentadas, ramificadas e
possuindo paredes grossas em sua estrutura. O basídio apresenta formato em forma de clava
a piriforme, com quatro esterigmas e um a dois vacúolos. Os basidiósporos possuem dupla
parede, sendo ovóide-elipsóides, e ocasionalmente ovóide-cilíndricos sempre truncados no
ápice, de coloração acastanhada, apresentando vacúolos. A espessura da parede não
apresenta uniformidade, pois a região do ápice é mais espessa que a base. A dupla parede é
muito distinta, com a parte externa hialina e mais fina e a interna usualmente avermelhada e
grossa. Além disso, os basidiósporos têm um apêndice “hilar” excêntrico sobre uma base
circular, a superfície é lisa ou enrugada, sendo que na grande maioria ocorrem pequenas
depressões superficiais. Os basidiósporos, de espécimes crescidos naturalmente no Japão,
medem 8,5-11x 6,5 x 8,5 µm (média 10,1 x 7,5 µm).
Em relação ao crescimento, diversos são os fatores ambientais que podem
influenciar o desenvolvimento de Ganoderma em cultivo. Como exemplo, pode-se citar
luminosidade, temperatura, umidade e aeração, entre outros. A luminosidade é importante
para a diferenciação do píleo, afetando-o de forma positiva, enquanto o micélio, ao
contrário, tem seu crescimento inibido pela presença de luz. A temperatura ótima para
crescimento de Ganoderma é em torno de 28 ºC, com umidade relativa (UR) de 80%
(Urben et al., 2004).
27
6. Bioquímica e Farmacologia do G. lucidum
As concentrações de substâncias bioquímicas de G. lucidum podem variar entres as
linhagens da espécie. Além disso, a nutrição fornecida e nas condições ambientais de uma
forma geral podem promover uma oscilação nutricional por parte do fungo (Wasser e Weis,
1999; Zhu et al., 2007). Dentre as várias biomoléculas existentes, os polissacarídeos são
aqueles que mais despertam interesse por parte de pesquisadores, porém existem diversos
outros componentes de interesse biotecnológico em G. lucidum, tais como proteínas,
triterpenóides, oligossacarídeos, ácidos orgânicos, lipídios, alcalóides e
proteopolissacarídeos, dentre outros (Mizushina et al., 1999; Wasser, 2002; Chang &
Buswell, 2003; Packer et al., 2003; Paterson, 2006; Akihisa et al., 2007). Existe ainda um
alto teor de fibras em G. lucidum, que possuem em sua composição principalmente
heteropolissacarídeos como hemicelulose, pectinas e quitina. Alguns pesquisadores
atribuem a estas fibras a capacidade de reduzir a absorção de substâncias tóxicas pelo trato
digestivo, o que confere ao fungo atividade anticarcinogênica (Kim et al., 1999b; Sliva,
2002).
A glicose e a manose são os principais componentes dos carboidratos presentes em
G. lucidum, havendo outros açúcares (fucose, N-acetilglucosamina e xilose) em menores
concentrações. Em relação à concentração de lipídeos, G. lucidum contém em média de 4 a
4,5%, dependendo do substrato disponível. Os ácidos graxos insaturados são os principais
componentes lipídicos encontrados, chegando a 80% do total. A quantidade de cinzas pode
variar entre 1 e 5% do peso seco (Gao et al., 2000; Paterson, 2006).
Em relação aos sais minerais contidos em G. lucidum, o potássio é o que pode ser
encontrado em maior quantidade, representando cerca de 83% do total de sais, seguido por
28
cálcio (9%), magnésio (4%) e sódio (1%). Sais como zinco, ferro, manganês, níquel, cobre,
entre outros, não chegam ao somatório de 3% do total. Alguns estudos revelaram a
presença de metais pesados, como chumbo, cobalto, berílio, bismuto e cromo, mas as
concentrações, quando presentes, são mínimas, dependendo do substrato utilizado. Não há
registros de alumínio fazendo parte da composição mineral de G. lucidum (Chiu et al.,
2000).
Quanto às glucanas (polissacarídeos), nos últimos 30 anos, pesquisas
farmacológicas demonstraram sua atividade antitumoral e imunoreguladora, promovendo a
imunidade humoral e celular (Lin, 2005; Paterson, 2006) demonstrando potente ação contra
o sarcoma 180 (Willard, 1990). Em outros trabalhos há informações de como essas
glucanas colaboram na indução da produção de citocina e na diferenciação de linfócitos
(Wang et al., 1997; Hsu et al., 2004). Segundo Wasser (2002) as glucanas presentes em G.
lucidum apresentam variados tipos de ligações glicosídicas, tais como β-glucanas (1→3),
(1→6) e as α-glucanas (1→3). Sua estrutura é composta por uma unidade central contendo
moléculas de glicose, de onde partem ramificações, podendo ser estas formadas por ácido
glucurônico, xilose, galactose, manose, arabinose ou ribose. É importante mencionar que a
atividade antitumoral se deve em maior parte às glucanas que apresentam ligações β-(1→3)
na cadeia principal e pontos de ramificação β-(1→6). As glucanas agem sobre o sistema
imunológico do hospedeiro induzindo a maturação, diferenciação e proliferação de células
imunocompetentes, através do incremento na produção de citocinas (Wasser, 2002).
Alguns experimentos, entretanto, evidenciam a perda do efeito antitumoral de
polissacarídeos administrados em camundongos timectomizados ou após a administração
de soro antilinfócito, sugerindo um mecanismo de ação timo-dependente (Ooi e Liu, 1999).
Vale ressaltar que produtos de consumo que contenham β-D-glucanas são considerados
29
seguros pela Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos, sendo
comercializados em forma de pó, cápsulas ou tabletes (Bobek et al., 1997).
Os esteróis encontrados em G. lucidum atuam como precursores hormonais,
promovendo inibição da agregação plaquetátia, enquanto ácidos específicos deste cogumelo
(chamados ácidos ganodéricos) e glicanas reduzem significativamente a concentração de
açúcar no plasma sanguíneo de ratos acometidos por hiperglicemia (Tomoda et al, 1986,
Hobbs, 1995). Os ácidos ganodéricos são também descritos como eficientes anti-
hipertensivos e anti-alérgicos, além de demonstrarem atividade antitumoral especificamente
contra hepatomas (Hobbs, 1995). Um resumo das principais propriedades de G. lucidum,
estudadas em animais, pode ser visto na Tabela 3.
30
Tabela 3 – Principais atividades farmacológicas de G. lucidum
Componente Tipo Ação
Desconhecido Alcalóide Cardiotônico
Desconhecido Glicoproteina Inibidor tumoral
Adenosina Nucleotídeo Inibe a agregação plaquetária, relaxante
muscular, analgésico.
Ganoderans A,B,C Polissacarídeos Hipoglicemia
Desconhecido Polissacarídeos Cardiotônico
Desconhecido Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante
Beta-D-glucan Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante
GL-1 Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante
FA,FI,FI-1a Polissacarídeos Antitumor, imunoestimulante
D-6 Polissacarídeos Aumenta síntese protéica e metabolismo do
acido nucléico
Ling Zhi 8 Proteína Anti-alérgico de largo espectro,
imunomodulador
Ganodesterona Esteróide Anti-hepatóxico
Ácido ganodérico A, B,
C, D.
Triterpeno Inibe liberação histamínica
Ácido ganodérico R, S Triterpeno Anti-hepatotóxico
Ácido ganodérico B, D,
F, H, K, S, Y
Triterpeno Anti-hipertensivo.
Ácido ganodérico B Triterpeno Inibe síntese de colesterol
Ácido ganodérico Mf Triterpeno Inibe síntese de colesterol
Ácido ganodérico T, Z Triterpeno Antitumor
Ganodermadiol Triterpeno Anti-hipertensivo.
Acido Óleico Acido lipídio Insaturado Inibe liberação de histamina
Fonte: Hobbs, 1995
6.1. Estudos Clínicos
Nos últimos 20 anos, G. lucidum tem sido relatado em numerosos estudos clínicos,
como benéfico contra uma variedade de doenças, incluindo neurastenias, insônia, alergias e
31
úlceras, anorexia, leucopenia, distrofia muscular, distúrbios nervosos, hiperplasia
osteogênica, estresse, doença de Alzheimer, hiperlipidemia e diabetes, entre outras, sendo
utilizado em clínicas médicas e testado extensivamente na Ásia e em outras partes do
mundo (Hobbs, 1995). G. lucidum também tem mostrado resultados favoráveis em
tratamentos contra hepatites. Yan et al. (1987) descrevem o estudo de 355 casos de hepatite
B tratados com o extrato de G. lucidum, onde em 92,4% deles a melhora foi mais rápida.
Na China, na década de 70, estudos clínicos avaliaram a resposta do consumo de G.
lucidum nos tratamentos de bronquite crônica. Cerca de 2000 pacientes foram tratados com
o extrato do cogumelo, ingerindo-o em forma de tablete e com duas semanas cerca de 90%
dos pacientes mostraram melhora, incluindo aumento no apetite. Tratamento de asma em
pacientes idosos também mostrou excelentes resultados. A ação de G. lucidum no
tratamento de problemas cardíacos também já foi registrada, onde sua administração
beneficiou pacientes com doença coronariana, hipertensão e palpitações, entre outros
(Chang e But, 1986).
Outros estudos, realizados em pacientes HIV positivos, demonstraram como este
cogumelo estimula o sistema imune, mesmo quando este se encontra altamente debilitado
(El-Mekkawy et al., 1998). Seu uso também resulta em melhora quando adicionado à dieta
de pacientes com mononucleose (Dharmananda, 1988).
O governo japonês lista G. lucidum como um tratamento adjunto efetivo contra o
câncer (Willard, 1990) e pesquisadores do Moscow Cancer Research Center afirmaram
encontrar resultados positivos e estimulantes quando o extrato deste cogumelo foi utilizado
no tratamento de pacientes com câncer (Chilton, 1994).
32
7. Cultivo de Ganoderma lucidum
A produção de matriz ou micélio para cultivo de G. lucidum em alguns pontos se
assemelha ao cultivo de Agaricus, Pleurotus, Lentinus e Auricularia, mas algumas
particularidades devem ser levadas em consideração para o correto desenvolvimento deste
cogumelo (Zhanxi e Zhanhua, 1997).
O meio de cultura mais indicado para multiplicação de Ganoderma, em condições
de laboratório, é batata-dextrose-ágar (BDA) ou malte-dextrose-ágar (MEA). Estes meios
respondem satisfatoriamente também para outros gêneros de fungos como, por exemplo,
Pleurotus e Lentinula (Chang, 1999).
De acordo com Zhanxi e Zhanhua (1997), a “semente” ou “spawn” é o veículo de
dispersão do micélio no substrato, sendo que sua preparação é a fase mais crítica do cultivo
e deve ser realizada sob rigorosa assepsia. Esta semente constitui-se, na maioria dos casos,
de grãos de cereais cozidos (trigo, arroz, sorgo, cevada, entre outros) que após esterilização
são inoculados. Após a colonização total, os grãos servirão de inóculo para a colonização
do substrato, composto por uma gramínea (Arundo donax, Cymbopogon citratus,
Pennisetum purpureum, Sorghum vulgare, Zea mays entre outros) associada à outras fontes
de nutrientes (farelo de trigo, açúcar, carbonato de cálcio, entre outros). Os grãos são os
mais utilizados porque proporcionam excelente superfície semeada, quando comparados
com a de outros substratos, tais como palhas e serragens.
Urben et al (2004), explicam que geralmente os grãos de cereais apresentam
conteúdo de umidade em torno de 11%, sendo a umidade ótima para a produção do
“Spawn” entre 49 e 54%. Para umedecer o grão, recomenda-se ferver em água durante 15
minutos ou conforme recomendam Madan et al. (1987), umedecer em água na proporção
3:1 durante 12 horas. Segundo Bononi e Trufem (1986), após drenagem do excesso de água
33
são incorporados carbonato de cálcio e sulfato de cálcio na proporção de 1 a 3% do peso da
matéria seca do grão, mantendo a relação de 4 partes de carbonato de cálcio para uma parte
de sulfato de cálcio. Em seguida, os grãos são acondicionados em frascos de vidro ou sacos
de polipropileno, ocupando aproximadamente 75% do espaço do recipiente para facilitar as
trocas gasosas. Zadrazil e Grabbe (1983) e Elliott (1985), acreditam que o carbonato de
cálcio e o sulfato de cálcio, além de alterar o pH evitam que os grãos se unam uns aos
outros, facilitando o manuseio das “sementes”. O pH deve ser neutro ou ligeiramente
alcalino (Molena, 1986) ou entre 6,5 e 7,5 (Zadrazil e Grabbe, 1983).
Após semivedados, os frascos ou sacos de polipropileno contendo os grãos são
esterilizados em autoclave a 121 ºC por 2 horas. Depois de esterilizado e resfriado à
temperatura ambiente, os grãos contidos em cada frasco são inoculados em 1 cm2 do meio
de cultura colonizado pelo micélio, em câmara de fluxo laminar. Os frascos inoculados são
incubados a 25 ºC durante 11 a 14 dias, tempo necessário para que o micélio possa
colonizar toda a superfície dos grãos (Stamets e Chilton, 1983).
7.1. Substrato
Para o desenvolvimento do micélio e produção do basidioma, é indispensável um
meio ou substrato com condições físicas e químicas adequadas (Lajolo, 1970). Os
produtores de substratos para cultivo de cogumelos no Brasil ainda são escassos em nossas
condições, o que ocasiona preços exorbitantes do produto final. Desta forma, recomenda-se
buscar substitutos para os substratos tradicionais e nesse ponto a técnica Jun-Cao tem
destaque, pois a partir dela é possível utilizar praticamente quaisquer matérias-primas como
substrato para crescimento dos cogumelos, desde que sejam respeitadas algumas condições
nutricionais e a relação carbono-nitrogênio (Zhanxi e Zhanhua, 1997).
34
De acordo com Chang e Quimio (1984), antes da inoculação o substrato deve ser
fragmentado em partículas de aproximadamente 5 cm e umedecido com água para
apresentar umidade inicial próxima de 70%. Segundo os autores, o excesso de água no
substrato dificulta as trocas gasosas, além de afetar a degradação de lignina e causar o
aumento da contaminação por bactérias e fungos oportunistas. Bizaria et al. (1987)
descrevem o modo como diferentes resíduos misturados promovem um suprimento mais
balanceado de nutrientes do que resíduos utilizados separadamente ou utilizados em
conjunto, mas não misturados. Isto confere maior consistência e aglutinação, melhorando o
contato entre o substrato e o micélio. Estes autores estudaram a eficiência biológica do
cultivo de Pleurotus sajor-caju em diferentes resíduos agrícolas. Os resultados da técnica
foram adaptados por Urben et al (2004) e utilizados com extrema eficiência para G.
lucidum.
7.1.1. Necessidades nutricionais
Ganoderma são decompositores primários, degradadores de madeira e degradam
tanto a lignina quanto a celulose presentes no substrato (Urben et al., 2004). A madeira
apresenta aproximadamente 50 a 60% de celulose, 10% a 30% de hemicelulose e 20 a 30%
de lignina. A celulose é constituída de moléculas de glicose, enquanto as hemiceluloses são
constituídas de moléculas de arabinose, galactose, manose, xilose e ácidos urônicos. A
lignina, por sua vez, possui estrutura mais complexa, constituída basicamente de unidades
de fenil-propano com um anel de benzeno ligado a um grupo hidroxila e um ou dois grupos
metoxílicos. Poucos são os microrganismos que conseguem utilizar essa substância para a
sua nutrição, devido ao fato dessas ligações presentes nesta molécula serem altamente
resistentes à degradação química. O ataque inicial da lignina é feito pelos fungos,
35
geralmente através da enzima lacase (p-difenil-oxigênio-oxido-redutase) resultando na
perda de grupos metoxílicos e ruptura de ligações éter causando uma degradação parcial
das substâncias mais solúveis (Mason, 1980).
Segundo Lin e Lin (1998), a produção de lacase e conseqüente degradação de
lignina é maior durante a fase de colonização do substrato pelo micélio, sendo que durante
a produção dos corpos de frutificação este processo diminui, chegando a ser praticamente
nula.
7.1.1.1. Carbono
A principal fonte de carbono e, consequentemente, de energia de um substrato
vegetal são os polissacarídeos e a lignina, constituintes da parede celular, embora existam
outros componentes poliméricos como lipídeos e proteínas que também podem ser
utilizados como fonte de energia pelo Ganoderma. Urben et al. (2004) afirmam que este
fungo inicia seu crescimento imediatamente após a inoculação, utilizando primeiro os
açúcares disponíveis do substrato, que geralmente compreendem de 1 a 2% do peso de
matéria seca, e depois passam a utilizar o carbono dos polissacarídeos.
Kaiben (2000) verificou que durante o crescimento do micélio há aumento do
conteúdo de monossacarídeos redutores e após a frutificação há redução destes índices. A
perda destes açúcares redutores provavelmente está associada à necessidade de energia para
a formação dos corpos de frutificação. Outras fontes de carbono, como os óleos, ceras e
ácidos orgânicos também presentes no substrato poderiam ser utilizadas por Ganoderma.
Mas de acordo com resultados obtidos por Kaiben (2000), os óleos são estimulantes em
concentrações baixas. Para os autores, muitos ácidos orgânicos reduzem o crescimento do
micélio.
36
7.1.1.2. Nitrogênio
Teoricamente, a necessidade do nitrogênio por parte do Ganoderma não deveria ser
muito grande já que a madeira, que é o substrato natural deste fungo, não possui teor alto de
nitrogênio. Trabalhos de diversos autores foram discutidos por Miles e Chang (1997) tendo
os autores concluído que não existe consenso entre os pesquisadores sobre a influência do
nitrogênio no crescimento e frutificação do Ganoderma.
Segundo Zhanxi e Zhanhua (1997), quando se utilizam sais de amônia, nitratos e
uréia, há liberação do íon que integrava a molécula, que se não for metabolizado na mesma
taxa que o nitrogênio, esta pode mudar o pH do meio devido ao acúmulo deste íon.
Consideram ainda os autores a peptona como a melhor fonte de nitrogênio orgânico,
proporcionando melhor crescimento, sendo os aminoácidos asparagina, serina, ácido
aspártico e alanina os que proporcionam crescimento melhor que os demais aminoácidos
testados.
Outro fator que influencia o crescimento do micélio é a relação carbono-nitrogênio
(C:N) que deve ser alta. Urben et al. (2004) verificaram a potencialidade de diversos
resíduos agrícolas e concluíram que a baixa produtividade de alguns substratos estava
relacionada à relação C:N menor ou igual a 29:1. Isto se explica pelo fato de que a presença
de quantidades elevadas de nitrogênio reprime a degradação de lignina e conseqüentemente
retarda ou até mesmo interrompe o crescimento do micélio. Recomenda-se uma relação
C:N próxima a 50:1.
37
7.1.1.3. Vitaminas e sais minerais
Lin e Lin (1999) verificaram que todas as vitaminas testadas (ácido ascórbico,
biotina, ácido fólico, inositol, niacina, piridoxina, riboflavina e tiamina) proporcionam um
maior crescimento do micélio no substrato de cultivo, mas a tiamina foi a que apresentou o
melhor resultado.
Em relação aos sais minerais, o sulfato de magnésio e o fosfato de potássio
desidrogenado foram os que apresentaram maior efeito no crescimento de linhagens de
Ganoderma. Além do crescimento do micélio, estes e outros sais minerais, como o cloreto
de sódio, de magnésio e de cálcio também estimulam o início da formação dos corpos de
frutificação. Os autores ainda mencionam que sulfato de magnésio, sulfato de zinco e
cloreto férrico são necessários para máxima produção de proteína bruta nos corpos de
frutificação.
7.1.1.4. Substrato residual
Durante o cultivo de Ganoderma, o substrato sofre modificações na composição,
resultando em um substrato residual diferente do inicial. O grau de degradação varia de
acordo com as espécies de Ganoderma e com fatores físico-ambientais, químicos e
biológicos.
De acordo com Britto (2000) o substrato sofre diminuição na matéria orgânica
devido a dois processos: a conversão de seus componentes em CO2 e H2O durante o
metabolismo do fungo e também devido à remoção dos materiais do substrato para a
construção dos corpos de frutificação. Estas perdas em geral são maiores durante a
frutificação do que durante o desenvolvimento do micélio. Ainda de acordo com o autor, há
uma tendência de aumento no teor de nitrogênio no substrato residual devido à atividade de
38
proteases, causada pela conversão progressiva de CO2. O pH, de um modo geral, diminui
durante a degradação devido à secreção de ácido oxálico pelo Ganoderma.
A diminuição do teor de lignina do substrato pode ser de 40 a 50% durante a fase de
crescimento micelial. A quebra de lignina permite a liberação de celulose, facilitando o
acesso para a degradação enzimática da mesma. O substrato residual, de forma geral
apresenta-se mais solúvel, possuindo altas quantidades de açúcares, aminoácidos livres e
cinzas, tendo progressivamente menor quantidade de lignina e celulose. Dependendo do
substrato utilizado, das condições de cultivo e da produtividade, o substrato residual pode
ter diversas aplicações como, por exemplo, alimento para animais ruminantes, fertilizante
para solo, geração de biogás e composto para cultivo de outros cogumelos, como o
Agaricus (Urben et al., 2004).
7.2. Fatores físicos e biológicos que influenciam o crescimento e produção de
Ganoderma lucidum
No cultivo de Ganoderma, vários fatores devem ser levados em consideração para
atingir uma boa produtividade, tais como físicos (temperatura, umidade, granulometria do
substrato, trocas gasosas, luz e potencial hidrogeniônico) e biológicos (Zhanxi e Zhanhua,
1997).
7.2.1. Fatores físicos
Os fatores físicos têm influência direta no crescimento do micélio e na formação dos
corpos de frutificação. É importante manter as condições favoráveis para o cultivo de
determinada espécie, no intuito de aproveitar o máximo do potencial que ela pode expressar
(Urben et al., 2004).
39
7.2.1.1 Temperatura e umidade relativa
Ganoderma geralmente é cultivado em temperaturas entre 20 e 30 ºC. O espectro
entre 24 e 28 ºC, contudo, é apontado como o mais favorável ao crescimento micelial e
frutificação. Em temperaturas abaixo de 20 ºC o crescimento ocorre, mas torna-se
progressivamente mais lento à medida que a temperatura diminui. Entre 20 e 24 ºC o
desenvolvimento é um pouco maior e acima de 30 ºC parece haver um efeito nocivo sobre
o crescimento do micélio. Temperaturas superiores a 40 ºC podem ser letais para este fungo
(Hobbs, 1995).
A umidade relativa (UR) necessária durante o período de crescimento micelial é de
80%, mas na frutificação esse valor pode ser diminuído levemente, para algo não inferior a
60%. Enquanto outros cogumelos são constituídos de água em quase 90% de sua estrutura,
Ganoderma é uma exceção, atingindo algo em torno de 50% de água em sua estrutura.
Prova disso são seus corpos de frutificação, muito mais rígidos e coriáceos do que os de
outros cogumelos (Lin e Lin, 1998).
7.2.1.2. Granulometria do substrato
Apesar do habitat natural do Ganoderma ser a madeira e o fungo crescer por entre
as fibras em ambiente compactado, o tamanho das partículas do material usado como
substrato tem sido analisado por alguns pesquisadores, principalmente quanto ao teor de
umidade e trocas gasosas. Substratos de cultivo para cogumelos, na técnica Jun-Cao, são
compostos basicamente de uma ou mais gramíneas trituradas e de insumos (farelos,
açúcares e/ou gesso, por exemplo). O sucesso da colonização micelial dependerá
unicamente da granulometria da gramínea, uma vez que os insumos geralmente são
40
adicionados em pó, no substrato. Em termos simples, se a granulometria da gramínea for
inferior a 1 cm, a compactação tornará o desenvolvimento mais lento, ao passo que se for
maior que 3 cm o substrato não terá consistência e se tornará muito frágil para
manipulação, além de favorecer a desidratação e a entrada de bactérias competidoras. O
ideal é que a granulação esteja em torno de 2 a 3 cm (Zhanxi e Zhanhua, 1997).
7.2.1.3. Troca gasosa
Observando o habitat natural desse fungo podemos deduzir que durante a fase de
crescimento do micélio no interior de troncos, possivelmente altas taxas de CO2 estão
presentes e não causam danos ao crescimento. Miles e Chang (1997) verificaram o efeito
do CO2 no crescimento do micélio de Ganoderma lucidum e notaram que este se
desenvolve mais rapidamente em concentrações mais altas de CO2, apresentando como
limite 22% do volume de ar. Para os autores, a alta taxa de CO2 significa vantagem
competitiva, principalmente quando o substrato não é esterilizado, em relação aos
microrganismos que não resistem às condições semi-anaeróbicas.
A importância de O2 e CO2 no ar durante o cultivo de cogumelos varia conforme o
estágio do cultivo. Segundo Kaiben (2000), ao contrário das condições semi-aeróbicas que
favorecem o crescimento do micélio, a fase de produção dos primórdios necessita de
condições definitivamente aeróbicas. Na fase de frutificação, uma alta taxa de CO2 leva à
formação de basidiomas deformados. O autor sugere que 28.000 ppm de CO2 estimula o
crescimento micelial e recomenda até 600 ppm para a formação dos primórdios.
As trocas gasosas podem ser afetadas pela espessura dos sacos de polipropileno
utilizados. Urben et al. (2004), recomendam sacos de polipropileno de 50 µm de espessura
para o cultivo. Quando foram usados sacos com espessura maior que 50 µm, houve
41
fermentação seguida de ramificação pobre de micélio na parte central do substrato. Afirma
ainda que na fase de formação dos primórdios, orifícios de 1 cm de diâmetro em intervalos
de 7 cm em ambos os lados apresentam ótimos resultados.
7.2.1.4. Luz
O efeito da luz no crescimento dos basiomas de Ganoderma é controverso, onde os
valores sugeridos variam de 40 a 2000 lux. Esse fungo desenvolve-se bem em escuridão,
em sombra ou em iluminação difusa, sendo a escuridão o ponto indicado para germinação
do esporo e desenvolvimento do micélio. Para a produção do corpo de frutificação,
entretanto, a luz é indispensável para garantir a qualidade do produto. A luz direta em
momento algum é recomendada, pois causa aborto dos primórdios. O ideal para a
frutificação é que a luz ambiente esteja em 30%, com 70% de sombra (Willard, 1990).
7.2.1.5 Potencial hidrogeniônico
O valor do pH da madeira, habitat natural do Ganoderma, está por volta de 5,0 a 6,0
e espera-se que este seja o ideal para o fungo. Para Lin e Lin (1998), o intervalo
aparentemente melhor é 4,0 a 6,0. Este fungo apresenta tendência para acidificar o substrato
que está colonizando, mesmo que esta mudança, em um primeiro momento, não seja a ideal
para o seu rápido crescimento, pois pH ácido tende a reduzir a velocidade de colonização
do micélio nos primeiros momentos de estabelecimento por parte do fungo. Mas uma vez
que o fungo tenha se estabelecido no substrato a acidificação deixa de ser um problema. No
final da colonização, há um equilíbrio e o pH permanece constante. Essa acidificação,
segundo os autores, se dá pela liberação do ácido oxálico, que serve para eliminar alguns
contaminantes naturais. Na natureza o fungo tende a se proteger antes de crescer, de modo
42
que a acidificação torna-se uma estratégia viável para evitar competidores. No cultivo,
contudo, essa característica natural é desnecessária e deve ser contornada para evitar
retardo no desenvolvimento e colonização do micélio. O carbonato de cálcio pode ser
utilizado para corrigir o pH em casos necessários.
7.2.2. Fatores biológicos
O efeito dos microrganismos competidores sobre o cultivo de Ganoderma é visto
como um fator biológico capaz de provocar perdas na produtividade. Os contaminantes
mais comuns, segundo Lin e Lin (1999), que aparecem nos substratos são os relacionados a
seguir:
• Sclerotium rolfsii: é um competidor de coloração marrom bastante conhecido em palha
de arroz, que tem a habilidade de produzir grandes quantidades de ácidos orgânicos
que acidificam o substrato. Pode reduzir a produtividade em até 60% dependendo do
período em que aparece e intensidade da contaminação. O tratamento térmico, com
imersão do substrato em água quente, pode controlar esse microrganismo, mas em
casos onde são utilizadas grandes quantidades de substrato é recomendável a adição de
solução de amônia (1000 ppm) antes da inoculação.
• Coprinus fimetarius: freqüentemente observado nas áreas mais secas e não colonizadas
do substrato, é um dos mais destrutivos. Seu controle resulta de cuidado intensivo
durante o manuseio do substrato. A ameaça cessa no momento em que Ganoderma
coloniza totalmente o substrato de cultivo.
• Penicillium digitatum: pode aparecer em qualquer momento do cultivo,
independentemente do substrato estar ou não colonizado. Este fungo compete
43
diretamente com Ganoderma e chega a crescer por cima do cogumelo (em particular,
no himenóforo), comprometendo totalmente a qualidade do produto. Pode-se utilizar
fungicida benomyl na concentração de 25 ppm em água onde a palha do substrato deve
ser imersa por 18 horas. Concentrações maiores do que a citada não são recomendáveis
por provocarem anormalidades nos corpos de frutificação.
• Trichoderma spp.: Não apresentam muito destaque, mas podem comprometer a
produção se houver total disseminação no substrato. Seu controle se dá por adição de
carbonato de sódio no substrato, mas deve ser utilizado de forma controlada, pois eleva
o valor do pH.
Segundo Bononi e Trufem (1986), a higienização antes e depois de exaurida a
produção é obrigatória. A desinfestação pode ser feita por vapor d’água por um período de
3 a 4 horas e depois, pelo emprego de melchol, formol, lysoforme ou outros produtos
similares. É importante que o ambiente seja adequadamente telado para evitar a entrada de
insetos e ratos.
8. Marcadores moleculares
Nos últimos anos, a filogenética e a taxonomia molecular têm mostrado grandes
avanços devido ao desenvolvimento de novos métodos de análise feitos com uso de
marcadores moleculares. Esses métodos permitem estimar a variabilidade genética de uma
biota, e, quando somados, levar a uma estimativa muito próxima da realidade na
biodiversidade de um ecossistema, bem como na relação entre os taxons (Grechko, 2002).
A taxonomia molecular pode ser definida como um conjunto de técnicas baseadas
na análise de DNA, que permite, de maneira precisa e rápida, distinguir espécies, por meio
das variações que podem ser observadas no material genético. Esse sistema possui várias
44
vantagens, como por exemplo, o fato dos dados necessários para a tomada de decisões
serem obtidos com um mínimo de material do organismo em estudo. Além disso, com a
taxonomia molecular, é possível separar taxons morfologicamente indistinguíveis, bem
como agrupar indivíduos que aparentem divergências morfológicas por se tratar de estágios
diferentes em um mesmo ciclo de vida (Blaxter e Floyd, 2003).
O diagnóstico utilizando marcadores moleculares foi inicialmente elaborado para
complementar informações sobre taxonomia de microrganismos, mas logo foi intensamente
aplicado em programas de melhoramento genético (Marques et al., 2002).
Em meio aos estudos que se desenvolviam sobre o assunto, foi o surgimento da
técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) na década de 80, elaborada por Mullis e
Faloona (1987), que provocou uma verdadeira revolução nas técnicas de biologia
molecular, facilitando em muito o trabalho de laboratório. A técnica de PCR consiste na
síntese enzimática de milhões de cópias de um segmento de DNA, por meio de uma
polimerase termoestável. Nesse procedimento utiliza primers (seqüências curtas de DNA)
que pareiam com o DNA-molde, servindo como iniciadores para a síntese de uma nova fita.
As reações ocorrem em ciclos alternados de temperatura, e cada ciclo se repete várias
vezes, amplificando em proporção geométrica a seqüência de interesse (Ferreira e
Grattapaglia, 1996). Por ser uma técnica simples, pouco tempo após sua descrição, diversos
pesquisadores começaram a desenvolver experimentos utilizando-se variações do princípio
original, de modo a expandir consideravelmente a aplicação da PCR (Foster et al., 1993).
Diversos trabalhos científicos que utilizam essa técnica (ou que dela derivaram) têm
sido publicados desde sua descrição. Estes trabalhos têm permitido avanços significativos
tanto em áreas básicas (como aquelas que buscam entender processos biológicos
fundamentais), como em áreas avançadas, dentre as quais a identificação de genótipos, o
45
diagnóstico de doenças, estudos filogenéticos e no melhoramento genético de plantas,
animais e microrganismos (Anderson e Stasovski, 1992; Ouellet e Seifert, 1993; Ferreira e
Grattapaglia, 1996).
Atualmente, existem diversas técnicas moleculares que detectam polimorfismos de
DNA, tais como RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism), RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorfism), ARDRA
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), DGGE (Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), seqüências de subunidades de rDNA, SSR (Simple Sequence Repeats) e
RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) (Litt e Luty, 1989; McDonald, 1997; Taylor
et al., 2001; Fagbola e Abang, 2004).
No estudo e comércio de cogumelos, a utilização de marcadores moleculares têm se
mostrado uma importante ferramenta na distinção de grupos taxonômicos, principalmente à
nível de linhagem (Gonzalez e Labarere, 2000; Joh et al., 2004; Park et al., 2004; Miyazaki
et al., 2005; Maruyama et al., 2006; Larsson, 2007; Phosri et al., 2007; Ro et al., 2007). A
razão para a necessidade de distinguir grupos taxonômicos, principalmente infra-
específicos, está no fato de que existe considerável variação nutricional entre diferentes
linhagens de uma mesma espécie de cogumelo, como na concentração de moléculas
bioativas (Wang e Ng, 2001, 2004; Choi et al., 2005) e de enzimas de interesse (Ruiz-
Duenas et al., 2001).
Desta forma, é de interesse industrial e comercial que linhagens comercializadas que
possuam alta qualidade nutricional e princípios medicinais possam ser identificadas de
forma rápida, sem a necessidade de longas análises bioquímicas. Neste contexto, os
marcadores moleculares podem fornecer o auxilio tão desejado ao comparar geneticamente
linhagens em uso com matrizes já conhecidas por seu potencial bioquímico (Ro et al.,
46
2007). Dentre as diversas técnicas atualmente conhecidas, a RAPD possui vantagens em
detectar polimorfismos de forma rápida, simples, direta e de baixo custo (Colauto et al.,
2002; Largeteau et al., 2006).
8.1. A técnica RAPD
Dentre os vários tipos de marcadores moleculares disponíveis atualmente, o RAPD
(Williams et al., 1990; Welsh e McClelland, 1990) destaca-se pelas vantagens que
apresenta em termos de simplicidade, pelo fato de ser aplicável a qualquer espécie e por
permitir a análise do genoma como um todo (Michelmore et al., 1991; Lopes et al., 2002).
Além disso, o marcador RAPD possui outras qualidades, tais como não utilizar
radioatividade, não requerer o conhecimento prévio da seqüência alvo a ser amplificada e
necessitar de pequenas quantidades de DNA (Ferreira e Grattapaglia, 1996).
A técnica tem como base a amplificação simultânea de vários locos anônimos
dispersos no genoma, utilizando um único primer de seqüência arbitrária de bases, que se
anelam em vários pontos do DNA genômico. Considerando-se um determinado primer, os
produtos de amplificação por RAPD podem ser classificados em dois grupos: variáveis
(polimórficos) e constantes (não-polimorficos) (Ferreira e Grattapaglia, 1996).
Perfis de RAPD podem conter bandas que são exclusivas para indivíduos,
linhagens, espécies ou mesmo gêneros. Da mesma forma, outras bandas podem ser
compartilhadas, de modo a se repetirem entre os grupos taxonômicos, estabelecendo
ligações em vários graus. Se, por exemplo, várias espécies forem analisadas e um grupo de
bandas estiver presente em todas as amostras de um mesmo gênero, pode-se concluir que
estas bandas são marcadores específicos para gênero. Por meio de observações nas bandas
geradas pela técnica, é possível separar grupos taxonômicos, pois até populações diferentes
47
de uma mesma espécie podem conter bandas exclusivas, que as separa dos demais
indivíduos daquela espécie (Ferreira e Grattapaglia, 1996; Fungaro e Vieira, 1998).
Pelo exposto, os marcadores moleculares RAPD têm sido empregados em diversos
estudos, como na avaliação da variabilidade genética entre espécies (Molnar et al., 1996;
Lacava et al., 2001; Iram e Ahmad, 2005; Shnyreva e Shtaer, 2006), nos estudos de
populações (Uijthof et al., 1994; Jamil et al., 2000; Ro et al., 2007), na taxonomia
(Strongman e Mackay, 1993; Guzman et al., 1999), caracterização de isolados fúngicos
(Fungaro, 2000; Zervaki et al., 2001; Colauto et al., 2002; Almeida et al., 2003) e produção
de fingerprints genômicos para muitas espécies de microrganismos (Welsh e McClelland,
1990; Murtagh et al., 1999; Boucias et al., 2000).
Entretanto, RAPD também tem limitações significantes quando comparada com
marcadores dominantes. A dominância limita as inferências feitas com RAPD, em estudos
com organismos diplóides, e pode fornecer algum conflito nos parâmetros genéticos
quando comparados com marcadores multialélicos (Lynch e Milligan, 1994). Estudos com
tecidos diplóides resultam em superestimativas de diferenciação entre populações, quando
comparadas com outros marcadores (Isabel et al., 1995). Além disso, a técnica às vezes
apresenta problemas de reprodutibilidade (Penner et al., 1993; Wang et al., 1993; Karp et
al., 1996). Por outro lado, Carvalho e Vieira (2001) afirmam que a técnica pode ser
empregada com bons resultados desde que sejam utilizados muitos primers e que sejam
seguidos critérios mais rígidos, como repetições múltiplas até o estabelecimento de um
padrão, no momento da interpretação dos resultados.
Diferente de outras técnicas, RAPD não cai em desuso, sendo aplicada aos mais
diversos organismos e nas mais diferentes condições, podendo ser empregada sem o auxílio
de outra técnica de identificação (Brault et al., 2007; Cai et al., 2007; Callanan et al., 2007;
48
Devrim et al., 2007; Ercisli et al., 2007; Li et al., 2007b; Tang et al., 2007; Cabanas et al.,
2008; Felix et al., 2008; Gomes et al., 2008; Hadian et al., 2008; Jones et al., 2008; Kiane
et al., 2008; Kim et al., 2008; Li et al., 2008; Rajwara et al., 2008; Solouki et al., 2008), ou
tendo outras técnicas para complementação das observações obtidas (Chen et al., 2007;
Chaves et al., 2008; Das et al., 2008; Lai et al., 2008; Ruiz et al., 2008; Venkatachalam et
al., 2008).
49
Objetivo Geral:
Neste trabalho, buscou-se avaliar o potencial de cultivo de linhagens brasileiras de
Ganoderma lucidum, comparando-as com linhagens comerciais chinesas, aplicando-se
variações da técnica “Jun-Cao” para desenvolver um protocolo cujos resultados reflitam em
maior produção de basidiomas, além de mensurar a concentração de proteínas, β-glucanas,
carboidratos e fenóis existentes entre as linhagens.
Objetivos específicos:
1. Utilizar a técnica “Jun-Cao” em diferentes linhagens de G. lucidum para determinar qual
isolado responde melhor à tecnica;
2. Avaliar qual formulação de substrato obterá melhor rendimento dentre as linhagens
estudadas;
3. Monitorar prováveis variações na composição bioquímica das linhagens estudadas,
dando-se ênfase a compostos já conhecidos na literatura como, por exemplo, os β-glucanas,
a fim de verificar qual possui melhor potencial bioquímico;
4. Avaliar o tempo de produção do cogumelo rei utilizando-se a técnica Jun-Cao, para que
sua utilização seja incrementada no país;
5. Obter uma variação de técnica Jun-Cao que possibilite produção de G. lucidum a baixo
custo sem que suas qualidades farmacológicas sejam prejudicadas.
6. Aplicar a análise genética RAPD para comprovar diferenças genotípicas em relação às
linhagens brasileiras e chinesas observadas no presente estudo.
50
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGRAHAR-MURUGKAR, D.; SUBBULAKSHMI, G. Nutritional value of edible wild
mushrooms collected from the Khasi hills of Meghalaya. Food Chem., v. 89, p. 599 –603,
2005.
AKIHISA, T. et al. Anti-inflammatory and anti-tumor-promoting effects of triterpene acids
and sterols from the fungus Ganoderma lucidum. Chem. Biodiv., v. 4, p. 224–231. 2007.
ALEXOPOULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory mycology. 4th ed.
New York: John Wiley and Sons, 1996. 874p.
ALMEIDA, A. M. R. et al. Genotypic diversity among Brazilian isolates of Macrophomina
phaseolina revealed by RAPD. Fitopatol. Bras., v. 28, p. 279-285, 2003.
ANDERSON, J. B.; STASOVSKI, E. Molecular phylogeny of northern hemisphere species of
Armillaria. Mycologia, v. 84, n. 4, p. 505-516, 1992.
BANIK, S.; NANDI, R. Effect of supplementation of rice straw with biogas residual slurry
manure on the yield, protein and mineral contents of oyster mushroom. Ind. Crops Prod,
v. 20, p. 311–319, 2004.
BAO, X. F. et al. Structural features of immunological active polysaccharides from
Ganoderma lucidum. Phytochemistry, v. 59, p. 175-181, 2002.
BEROVIC, M. et al. Submerged cultivation of Ganoderma lucidum biomass and immuno-
stimulatory effects of fungal polysaccharides. J. Biotechnol., v. 103, p. 77-86, 2003.
BIZARIA, R. MADAN, M. BIZARIA, V. S. Biological efficiency and nutritive value of
Pleurotus sajor-caju cultivated on different agro wastes. Biological Wastes, v. 19, n. 4, p.
55-239, 1987.
51
BLAXTER, M.; FLOYD, R. Molecular taxonomics for biodiversity surveys: already and
reality. Trends Ecol. Evol., v. 18, n. 6, p. 268-269, 2003.
BOBEK, P.; OZDYN, L.; KUNIAK, L. The effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus)
its ethanolic extract and extraction residues on cholesterol levels in serum lipoproteins and
liver of rat. Nahrung., v. 39, p. 98-99, 1995.
BOBEK, P.; OZDIN, L.; KUNIAK, L. Effect of oyster mushroom and isolated ß-glucan on
lipid peroxidation and on the activities of antioxidative enzymes in rats fed the cholesterol
diet. Nutr. Biochem., v. 8, p. 469-471, 1997.
BOBEK, P.; GABOVY, S. Hypocholesterolemic and antiatherogenic effect of oyster
mushroom (Pleurotus ostreatus) in rabbit. Nahrung., v. 43, p. 339-342, 1999.
BONONI, V. L. R.; TRUFEN, S. F. B. Cogumelos Comestíveis. São Paulo, 83p, 1986.
BONONI, V.L.R., et al. Cultivo de cogumelos comestíveis. São Paulo. Icone, 206p, 1995.
BOUCIAS, D. G. et al. Genotipic properties of the entomopathogenic fungus Nomuraea rileyi.
Biol. Control. , v. 19, p. 124-138, 2000.
BRAULT, M.; et al. Variability of Orobanche ramosa populations in France as revealed by
cross infestations and molecular markers. Env. Exp. Botany, v. 61, p. 272–280, 2007.
BUCHANAN, P. K. A taxonomic overview of the genus Ganoderma with special reference to
species of medicinal and nutriceutical importance. Proc. Int. Symposium Ganoderma Sci,
Auchland, 27-29 April, 2001. Disponível em: http://www.ganopoly.com.
CABANAS, R. et al. Occurrence of Penicillium verrucosum in retail wheat flours from the
Spanish market. Food Microbiol., v. 25, p. 642– 647, 2008.
CAI, Y. L.; CAO, D. W.; ZHAO, G. F. Studies on genetic variation in cherry germplasm using
RAPD analysis. Scientia Horticulturae, v. 111 p. 248–254, 2007.
52
CALLANAN, M. J.; ROSS, R. P.; BERESFORD, T. P. Insertion sequence elements as
mediators of strain diversity in Lactobacillus helveticus. Int. J. Food Microbiol. , v. 120, p.
120–123, 2007.
CAO, Q. Z. e LIN, Z. B. Ganoderma lucidum polysaccharides peptide inhibits the growth of
vascular endothelial cell and the induction of VEGF in human lung cancer cell. Life Sci., v.
78, p. 1457 -1463, 2006.
CARVALHO, A. O. R.; VIEIRA, L. G. E. Determinação das Condições Ótimas para Análises
de PCR-RAPD em Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae). Neotrop.
Entomol., v. 30, n. 4, p. 593-600, 2001.
CHANG, S. T. Production of cultivated edible mushrooms in China with emphasis on
Lentinula edodes. ISMS Newslett, v. 78, p. 3-6, 1999.
CHANG, S. T., BUSWELL, J.A. Medicinal mushrooms — A prominent source of
nutriceuticals for the 21st century. Curr. Top. Nutr. Res. 1, 257–280. 2003.
CHANG, H.M.; P. BUT, P. P. Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica.
Vol. 2. Singapore: World Scientific. 1987.
CHANG S. T.; MILES, P. G. Recent trends in world production of cultivated mushrooms.
Mush. J., v. 503, p. 15-18, 1991.
CHANG, S. T.; QUIMIO, T. H. Tropical Mushrooms. New York: Academic Press, 493p.
1984.
CHAVES, J. Q. et al. Phenotypic and genotypic features of new autoagglutinating Bacillus
thuringiensis strains. J. Invert. Pathol., v. 98, p. 85–92, 2008.
CHEN, H. et al. Studies on the immuno-modulating and anti-tumor activities of Ganoderma
lucidum (Reishi) polysaccharides. Bioorg. Med. Chem., v. 12, p. 5595 –5601, 2004.
53
CHEN, H.; YANG, B.; CHEN, X. Identification and characterization of four strains of
Acidithiobacillus ferrooxidans isolated from different sites in China, Microbiol. Res.,
doi:10.1016/j.micres.2007.09.002
CHEN, K.; ZHANG, W. Advances on anti-aging herbal medicinals in China. Abstracts of
Chinese Medicines v. 1, p. 309 – 330, 1987
CHEUNG, L. M.; CHEUNG, P. C. K. Mushroom extracts with antioxidant activity against
lipid peroxidation. Food Chem., v. 89, p. 403 – 409, 2005.
CHILTON, J.S. The first international conference on mushroom biology and mushroom
products. Herbalgram, v. 31, p. 57, 1994.
CHIU, S.W.; WANG, Z.M.; LEUNG, T.M.; MOORE, D. Nutritional value of Ganoderma
extract and assessment of its genotoxicity and antigenotoxicity using comet assays of
mouse lymphocytes. Food Chem. Toxicol., v. 38, p.173-178, 2000.
CHOI, D. et al. Exopolysaccharide production in liquid culture of Pleurotus ferulae. J.
Microbiol. Biotechnol., v. 15, p. 368-375, 2005.
CHU, Q. P. et al. Extract of Ganoderma lucidum potentiates pentobarbital-induced sleep via a
GABAergic mechanism. Pharmacol. Biochem. Behav., v. 86, p. 693 - 698, 2007.
COLAUTO, N. B.; DIAS, E. S.; GIMENES, M. A.; EIRA, A. F. Genetic characterization of
isolates of the basidiomycetes Agaricus blazei by RAPD. Braz. J. Microbiol., v. 33, p.
131-133, 2002.
CZAPSKI, J.; SZUDYGA, K. Frozen mushorroms quality as affected by strain, flush,
treatment before freezing and time of storage. J. Food Sci., v. 65, p. 722-725, 2000.
DAS, I. K. et al. RAPD cluster analysis and chlorate sensitivity of some Indian isolates of
Macrophomina phaseolina from sorghum and their relationships with pathogenicity.
Microbiol. Res., v. 163, p. 215-224, 2008.
54
DEVRIM, A. K. et al. A study of genomic polymorphism and diversity in sheep breeds in
northeastern Anatolia. Small Ruminant Research, v. 73, p. 291–295, 2007.
DHARMANANDA, S. Chinese Herbal Therapies for Immune Disorders, Portland,
Institute of Traditional Medicine, 1988.
EIRA, A. F. Cultivo do cogumelo medicinal Agaricus blazei (Murrill) ss. Heinemann ou
Agaricus brasiliensis (Wasser et al.). Viçosa: Editora Aprenda Fácil, 2003.
EL-MEKKAWY, S. et al. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease substances from Ganoderma
lucidum, Phytochemistry, v. 49, p. 1651 - 1657, 1998.
EO, S.K.; KIM, Y. S.; LEE, C. K.; HAN, S. S. Antiherpect activities of various protein bound
polysaccarides isolated from Ganoderma lucidum. J. Ethnopharmacol., v. 68, p. 129–136,
1999.
ERCISLI, S. et al. Interspecific variability of RAPD and fatty acid composition of some
pomegranate cultivars (Punica granatum L.) growing in Southern Anatolia Region in
Turkey. Biochem. System Ecol., v. 35, p. 764-769, 2007.
FAGBOLA, O.; ABANG, M. M. Colletotrichum circinans and Colletotrichum coccodes can
be distinguished by DGGE analysis of PCR – amplified 18s rDNA fragments. Afr. J.
Biotechnol., v. 3, p. 195-198, 2004.
FELIX, P. C. et al. Genetic relationships among Mexican white pines (Pinus, Pinaceae) based
on RAPD markers. Biochem. System Ecol., v. 36, p. 523–530, 2008.
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares
em Análise Genética. Brasília: Embrapa Cenargen, 220p, 1996.
FOSTER, L. M. et al. The polymerase chain reaction and ITS application to filamentous fungi.
Mycol. Res., v. 97, n. 7, p. 769-781, 1993.
55
FUNGARO, M. H. P.; VIEIRA, M. L. C. Aplicações da PCR em ecologia molecular. In:
MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. Ecologia Microbiana. Embrapa – CNPMA, 205-227,
1998.
FUNGARO, M. H. P. PCR na micologia. Biotecnol. Cienc. Desenv., v. 14, p. 12-16, 2000.
GAO, Y.; LAN, J.; GAO, H.; LIU, Z. Extraction and determination of Ganoderma
polysaccharides. Int. J. Med. Complement. Med., v. 1, n. 1, 2000.
GILBERTSON, R. L.; RYVARDEN, L. North American Polypores. Fungiflora: Oslo,
Norway, 1986.
GOMES, B. C. et al. Prevalence and characterization of Enterococcus spp. isolated from
Brazilian foods. Food Microbiol., v. 25, p. 668– 675, 2008.
GONZALEZ, P.; LABARERE, J. Phylogenetic relationships of Pleurotus species according to
the sequence and secondary structure of the mitochondrial small-subunit rRNA V4, V6, and
V9 domains. Microbiology , v. 146, p. 209-221, 2000.
GOTTLIEB, A. M. e WRIGHT, J. E. Taxonomy of Ganoderma from southern South America:
subgenus Ganoderma. Mycol. Res. v. 103, n. 6, p. 661 – 673, 1999.
GRECHKO, V. V. Molecular DNA markers in phylogeny and systematics. Russ. J. Genet., v.
38, n. 8, p. 851-868, 2002.
GUZMAN, P. et al. Detection and differentiation of Phaeoisariopsis griseola isolates with the
polymerase chain reaction and group-specific primers. Plant Dis., v. 83, p. 37-42, 1999.
HA, C. The inhibitory effect of the Chinese herb Ganoderma lucidum mycelium on gut
immunoglobulin a responses to cholera toxin in mice. Nutr. Res., v. 23, p. 691–701, 2003.
HADIAN, J. et al. Genetic diversity of Iranian accessions of Satureja hortensis L. based on
horticultural traits and RAPD markers. Scientia Horticulturae, v. 115 p. 196–202, 2008.
56
HERRERA, T.; ULLOA, M. El Reino de los Hongos: Micologia Básica e Aplicada.
Universidad Nacional Autônoma de México, Ciudad Universitária, México. 552 p, 1998.
HOBBS, C. Medicinal Mushrooms: An Exploration of Tradition, H ealing and Culture.
CA: Botanic press, 251p, 1995.
HSEU, R. S.; WANG, H. H.; WANG, H. F.; MONCALVO, J. M. Differentiation and grouping
of isolates of the Ganoderma lucidum complex by Random Amplified Polymorphic DNA-
PCR compared with grouping on the basis of internal transcribed spacer sequences. Appl.
Environ. Microbiol. , v. 62, n. 4, p. 1354-1363, 1996.
HSIEH, C.; HSU, T.; YANG, F. Production of polysaccharides of Ganoderma lucidum
(CCRC36021) by reusing thin stillage. Process Biochem., v. 40, p. 909–916, 2005.
HSU, H. Y. et al. Chromatographic and electrophoretic methods for Lingzhi pharmacologically
active components. J. Chromatogr., v. 812, p. 241-257, 2004.
IRAM, S.; AHMAD, I. Analysis of variation in Alternaria alternata by pathogenicity and
RAPD study. Pol. J. Microbiol., v. 54, p. 13-19, 2005.
ISABEL, N.; BEAULIEU, J.; BOUSQUET, J. Complete congruence between gene diversity
estimatives derived from genotypic data at enzyme and random amplified polymorphic
DNA loci in black spruce. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 92, p. 6369-6373, 1995.
JAMIL, F. F. et al. Genetic and pathogenic diversity with in Ascochyta rabiei (Pass.) Lab.
populations in Pakistan causing blight of chickpea (Cicer arientinum L.). Physiol. Mol.
Plant Pathol., v. 57, p. 243-254, 2000.
JI, Z. et al. Immunomodulation of RAW264.7 macrophages by GLIS, a proteopolysaccharide
from Ganoderma lucidum. J. Ethnopharmacol., v. 112, p. 445 - 450, 2007.
57
JOH, J. H. et al. Cloning and developmental expression of a metzincin family metalloprotease
cDNA from oyster mushroom Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiol. Lett. , v. 239, p. 57-
62, 2004.
JONES, T. C. et al. Genetic variability of New Zealand seagrass (Zostera muelleri) assessed at
multiple spatial scales. Aquatic Botany, v. 88, p. 39–46, 2008.
KAIBEN, L. Cultivation and process of medicinal fungus Ganoderma lucidum. In: WANG, Z.
S.; WANG, H. C. Progress in Cultivation Techniques for Agaricus bisporus in China.
China: Asia Pacific Edible Mushroom Training Center, 2000.
KALAC, P.; SVOBODA, L. A review of trace element concentrations in edible mushrooms.
Food Chem., v. 69, p. 273-281, 2000.
KARP, A.; SEBERG, O.; BUIATTI, M. Molecular techniques in the assessment of botanical
diversity. Annu. Bot., v. 78, n. 2, p. 143-149, 1996.
KARSTEN, P. A. Enumeration Boletinearum et Polyporearum Fennicarum, Systemate novo
Dispositarum. Revue Mycol., Toulouse, 3: 16-19, 1881.
KIANE, M. et al. Wide genetic diversity of Rosa damascena Mill. germplasm in Iran as
revealed by RAPD analysis. Scientia Horticulturae, v. 115, p. 386–392, 2008.
KIM, B. K. Pharmacological efficacy of G. lucidum. Korean J. Pharmacogn., 18: 58-60,
1987.
KIM, S. W.; KIM, E. S.; KIM, Y. S. Studies on the polysaccaride extract from G. lucidum. J.
Korean Soc. Food Nutr., v. 24, p. 147-153, 1995.
KIM, H. S.; KACEW, S.; LEE, M. B. In vitro chemo preventive effect of plant polysaccharides
Aloe barbadensis Miller, Lentinus edodes, Ganoderma lucidum and Coriolus versicolor.
Carcinogenesis, v. 20, p. 1637-1640, 1999.
58
KIM, D.H.; SHIM, S.B.; KIM, N.J.; JANG, I.S. Beta-glucoronidase-inhibitory activity and
hepatoprotective effect of Ganoderma lucidum. Biol. Pharm. Bull., v. 22, n. 2, p. 162-164,
1999b.
KIM, J. H. et al. Effect of Ganoderma lucidum on the quality and functionality of Korean
traditional rice wine, Yakju. J. Biosci. Bioeng., v. 97, p. 24–28, 2004.
KIM, C. et al. Genetic diversity and population structure of endangered Isoetes coreana in
South Korea based on RAPD analysis. Aquatic Botany, v. 89, p. 43–49, 2008.
KIRK, P. M., P. F. CANNON, J. C. DAVID, AND J. A. STALPERS. Ainsworth & Bisby’s
dictionary of the fungi. Cabi Publishing, Wallingford, United Kingdom. 2001.
LACAVA, P. T.; ARAUJO, W. L.; MACCHERONI Jr, W.; AZEVEDO, J. L. RAPD profile
and antibiotic susceptibility of Xylella fastidiosa, causal agent of citrus variegated
chlorosis. Lett. Appl. Microbiol. , v. 33, p. 302-306, 2001.
LAI, D. et al. Molecular genetics profiles among individual Clonorchis sinensis adults
collected from cats in two geographic regions of China revealed by RAPD and MGE-PCR
methods. Acta Tropica, doi:10.1016/j.actatropica.2008.05.003
LAJOLO, F. Fungos como alimento. In: LACAZ, C. S. et al. O Grande Mundo dos Fungos.
São Paulo: Polígono, 248p, 1970.
LAKSHMI, B.; AJITH, T. A.; NAYANA, J.; JANARDHANAN, K. K. Antimutagenic activity
of methanolic extract of Ganoderma lucidum and its effect on hepatic damage caused by
benzo[a]pyrene. J. Ethnopharmacol., v. 107, p. 297 - 303, 2006.
LARGETEAU, M. L.; BAARS, J. P. P.O.; REGNAULT-ROGER, C.O.; SAVOIE, J. M.
Molecular and physiological diversity among Verticillum fungicola var. fungicola. Mycol.
Res., v. 110, p. 431-440, 2006.
59
LARSSON, K. H. Re-thinking the classification of corticoid fungi. Mycol. Res., v. 111, p.
1040-1063, 2007.
LEE, H.; SONG, M.; YU, Y.; HWANG, S. Production of Ganoderma lucidum mycelium using
cheese whey as an alternative substrate: response surface analysis and biokinetics.
Biochem. Eng. J., v. 15, p. 93–99, 2003.
LI, X. L.; ZHOU, A. G.; LI, X. M. Inhibition of Lycium barbarum polysaccharides and
Ganoderma lucidum polysaccharides against oxidative injury induced by c-irradiation in rat
liver mitochondria. Carbohydr. Polym., v. 69, p. 172 - 178, 2007.
LI, D.; YE, Q.; ZHU, G. Analysis of the germ plasm resources and genetic relationships among
hybrid Cymbidium cultivars and native species with RAPD markers. Agricultural Sciences
in China, v. 6, n. 8, p. 922-929, 2007b.
LI, F. et al. RAPD and morphological diversity among four populations of the tropical tree
species Paramichelia baillonii (Pierre) Hu in China. Forest Ecol. Manag., v. 255, p. 1793–
1801, 2008.
LIN, Z. B. Cellular and molecular mechanisms of immuno-modulation by Ganoderma
lucidum. J. Pharmacol. Sci., v. 99, p. 144 – 153, 2003.
LIN, Z.; LIN, Z. Jun-Cao Technology. Fujian: Institute of Jun-Cao: Fujian Agricultural
University, 142p, 1998.
LIN, Z.; LIN, Z. Fungi Cultivation with Jun-Cao. Fujian: Institute of Jun-Cao: Fujian
Agricultural University, 110p, 1999.
LITT, M.; LUTY, J. A. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet., v. 44, p.
398-401, 1989.
60
LIU, J. et al. The anti-androgen effect of ganoderol B isolated from the fruiting body of
Ganoderma lucidum. Bioorg. Med. Chem., v. 15, p. 4966 - 4972, 2007.
LOGUERCIO-LEITE, C.; GROPOSO, C.; HALMENSCHLAGER, M. A. Species of Ganoderma
Karsten in a subtropical area (Santa Catarina State, Southern Brazil). Iheringia , v. 60, n. 2, p. 135-
139, 2005.
LOPES, R. et al. Marcadores moleculares dominantes (RAPD e AFLP). Biotecnol. Cienc.
Desenv., v. 29, p. 56-60, 2002.
LYNCH, M.; MILLIGAN, B. G. Analysis of population genetic structure with RAPD markers.
Mol. Ecol., v. 3, p. 91-99, 1994.
MA, C. et al. Differential protein expression in mouse splenic mononuclear cells treated with
polysaccharides from spores of Ganoderma lucidum. Phytomedicine, doi:
10.1016/j.phymed.2007.11.015. 2008.
MADAN, M.; VASUDEVAN, P.; SHARMA, S. Cultivation of Pleurotus sajor-caju on
different wastes. Biological Wastes, v. 22, n. 4, p. 241-250, 1987.
MANZI, P.; PIZZOFERRATO, L. Beta glucans in edible mushrooms. Food Chem., v. 68, p.
315-318, 2000.
MANZI, P.; AGUZZI, A., PIZZOFERRATO, L. Nutritional value of mushrooms widely
consumed in Italy. Food Chem., v. 73, p. 321-325, 2001.
MANZI, P.; MARCONI, S.; AGUZZI, A.; PIZZOFERRATO, L. Commercial
mushrooms:nutritional quality and cooking. Food Chem., v. 84, p. 201 - 206, 2004.
MARQUES, E. K.; IKUTA, N.; LUNGE, V. R.; FONSECA, A. S. K. Diagnóstico molecular e
biotecnologia. In: SERAFINI, A. M.; BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L. Biotecnologia:
Avanços na Agricultura e na Agropecuária. EDUCS. p. 101-130, 2002.
61
MARUYAMA, T. et al. Phylogenetic relationship of psychoactive fungi based on rRNA gene
for a large subunit and their identification using the TaqMan assay (II). Forensic Sci. Int.,
v. 163, p. 51-58, 2006.
MASON, C. F. Decomposição. São Paulo: EPU/EDUSP, 63p, 1980.
MAU, J.; LIN, H.; CHEN, C. Non-volatile components of several medicinal mushrooms. Food
Res. Int., v. 34, p. 521 –526, 2001.
McDONALD, B. A. The population genetics of fungi: tools and techniques. Phytopathology,
v. 87, p. 448-453, 1997.
MDACHI, S. J. M.; NKUNYA, M. H. H.; NYIGO, V. A.; URASA, I. T. Amino acid
composition of some Tanzanian wild mushrooms. Food Chem., v. 86, p. 179 –182, 2004.
MENEZES, M.; OLIVEIRA, S. M. Fungos Fitopatogênicos. Recife: UFRPE, 1993. 277p.
MICHELMORE, R. W.; PARAN, I.; KESSELI, R. V. Identification of markers linked to
disease-resistence genes by bulked segregant analysis: a rapid method to detect markers in
specific genomic regions by using segreganting populations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
v. 88, p. 828-982, 1991.
MILLES, P. G.; CHANG, S. T. Mushorrom Biology. Singapore: World Scientific Publishing,
194p, 1997.
MIYAZAKI, Y.; NAKAMURA, M.; BABASAKI, K. Molecular cloning of developmentally
specific genes by representational difference analysis during the fruiting body formation in
the basidiomycete Lentinula edodes. Fungal Genet. Biol., v. 42, p. 493-505, 2005.
MIZUNO, T. Development of antitumor polysaccharides from mushroom fungi. Food Ingred.
J. Jpn. v. 167, p. 69-85, 1996.
62
MIZUSHINA, Y. et al. Lucidenic acid O and lactone, new terpentene inhibitors of eukaryotic
DNA polymerases from basidiomycete Ganoderma lucidum, Bioorg. Med. Chem., v. 7, p.
2047-2052, 1999.
MOLNAR, O. et al. Analysis of Coenzyme Q systems, monosaccharide patters of purified cell
walls, and RAPD-PCR patterns in the genus Kluyveromyces. Antonie Leeuwenhoek, v.
70, n. 1, p. 67-78, 1996.
MONCALVO, J. M. & RYVARDEN, L. A nomenclatural study of the Ganodermataceae
Donk. Synopsis Fungorum 11. Fungiflora : Oslo, Norway. 1997.
MONCALVO, J. M.; WANG, H. F.; HSEU, R. S. Gene phylogeny of the Ganoderma lucidum
complex. Comparison with traditional taxonomic characters. Mycol. Res., v. 99, p. 1489-
1499, 1995.
MULLER, C. I. et al. Ganoderma lucidum causes apoptosis in leukemia, lymphoma and
multiple myeloma cells. Leuk. Res., v. 30, p. 841 - 848, 2006.
MULLIS, K.; FALOONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalysed
chain reaction. Methods Enzymol., v. 55, p. 335-350, 1987.
MURTAGH, G. I.; DYER, P. S.; MCCLURE, P. C.; CRITTENDEN P. D. Use of Randomly
Amplified Polymorpfic DNA markers as a tool to study variation in lichen-forming fungi.
Lichenologist, v. 31, n. 3, p. 257-267, 1999.
NOGAMI, M. Anti-allergy activity of Ganoderma lucidum. Korean J. Pharmacogn., v. 18, p.
56-58, 1987.
NUNEZ, M.; RYVARDEN, L. East Asian Polypores, volume 1: Ganodermataceae e
Hymenochaetaceae. Synopsis Fungorum 13. Fungiflora:Oslo, Norway, 2000.
OOI, V.; LIU, F. A review of pharmacological activities of mushroom polysaccharides. Int. J.
Med. Mushrooms, v.1, p. 195-206, 1999.
63
OUELLET, T.; SEIFERT, K. A. Genetic characterization of Fusarium graminearum strais
using RAPD and PCR amplification. Phytopathology, v. 83, n. 9, p. 1003-1007, 1993.
PACKER, L., HALLIWELL, B., ONG, C.N. Lingzhi (Ganoderma lucidum). Herbal
Medicines, Marcel Dekker, New York. 2003.
PARK, H. G.; KO, H. G.; KIM, S. H.; PARK, W. O. Molecular identification of asian isolates
by nuclear ITS rDNA. J. Microbiol. Biotechnol., v. 14, p. 816-821, 2004.
PATERSON, R. R. Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory. Phytochemistry, v. 67, p.
1985 – 2001, 2006.
PENNER, G. A. et al. Reproducibility of random amplified polymorphic DNA (RAPD)
analysis among laboratories. PCR: Methods and Applications. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 341-345, 1993.
PHOSRI, C. et al. Molecular study of the genus Astraeus. Mycol. Res., v. 111, p. 275-286,
2007.
RAJWANA, I. A. et al. Assessment of genetic diversity among mango (Mangifera indica L.)
genotypes using RAPD markers. Scientia Horticulturae, v. 117, p. 297–301, 2008.
RO, H. et al. Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eringii:
ITS sequence analysis, RAPD fingerprinting, and physiological characteristics. Mycol.
Res., v. 111, p. 710-715, 2007.
ROYSE, D. J.; RHODES, T. W.; OHGA, S.; SANCHEZ, J. E. Yield, mushroom size and time
to production of Pleurotus cornucopiae (oyster mushroom) grown on switch grass substrate
spawned and supplemented at various rates. Biores. Technol., v. 91, p. 85 - 91, 2004.
RUIZ, P. et al. Intraspecific genetic diversity of lactic acid bacteria from malolactic
fermentation of Cencibel wines as derived from combined analysis of RAPD-PCR and
PFGE patterns. Food Microbiol., doi:10.1016/j.fm.2008.06.007
64
RUIZ-DUENAS, F. J. et al. A new versatile peroxidase from Pleurotus. Biochem. Soc.
Trans., v. 29, p. 116-122, 2001.
RUSSELL, R.; PATERSON, M. Ganoderma – a therapeutic fungal biofactory.
Phytochemistry, v. 67, p. 1985 - 2001, 2006.
RYVARDEN, L. Genera of polypores, nomenclature and taxonomy. Synopsis fungorum 5.
Fungiflora: Oslo, Norway, 1991.
RYVARDEN, L. GILBERTSON,R. L. European Polypores. Synopsis Fungorum 6.
Fungiflora: Oslo, Norway, 1993.
RYVARDEN, L.; JOHANSEN, I. A preliminary polypore flora of east Africa . Fungiflora:
Oslo, Norway, 1980.
SEO, G. S.; KIRK, P. M. Ganoderma: nomenclature and classification. In: Ganoderma
diseases of perennial crops. Royal Garden Academy: CABI Bioscience, 2000.
SHIN, G.C.; PARK, Y.H.; SEO, G.S.; CHA, D.Y. Morphological characters of Ganoderma
lucidum (Fr) Karsten grown naturally in Korea. Res. Rep. Inst. Agric. Sci. Technol., v. 13,
p. 44-51, 1986.
SHNYREVA, A. V.; SHTAER, O. V. Differentiation of closely related Oyster fungi Pleurotus
pulmonarius and P. ostreatus by mating and molecular markers. Russ. J. Genet., v. 42, n.
5, p. 539-545, 2006.
SLIVA, D. et al. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and
prostate cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 298, p. 603-612, 2002.
SLIVA, D. Ganoderma lucidum in cancer research. Leuk. Res., v. 30, p. 767 - 768, 2006.
SMANIA, A.J. et al. Antibacterial activity of steroidal compounds isolated from Ganoderma
(aphyllophoromycetideae) fruit body. Int. J. Med. Mush. v. 1, p. 325–330, 1999.
65
SOLOUKI, M. et al. Study of genetic diversity in Chamomile (Matricaria chamomilla) based
on morphological traits and molecular markers. Scientia Horticulturae, v. 117, p. 281–
287, 2008.
STAMETS, P. CHILTON, J. S. The Mushroom Cultivator . Washington: Agarikon press,
415p, 1983.
STANLEY, G. et al. Ganoderma lucidum suppresses angiogenesis through the inhibition of
secretion of VEGF and TGF-ß1 from prostate cancer cells. Biochem. Biophys. Res.
Commun., v. 330, p. 46 - 52, 2005.
STRAATSMA, G. et al. Adjustment of the composting process for mushroom cultivation
based on initial substrate composition. Bioresour. Technol., v. 72, p. 67-74, 2000.
STRONGMAN, D. B.; MACKAY, R. M. Discrimination between Hirsutella longicolla var.
Longicolla and Hirsutella longicolla var. cornuta using random amplified polymorphic
DNA fingerprinting. Mycologia, v. 85, p. 65-70, 1993.
TANG, Y.; ZHONG, J. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma
lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid. Enzyme
Microb. Technol., v. 32, p. 478–484, 2003.
TANG, W. et al. Ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia induces mitochondria
mediated apoptosis in lung cancer cells. Life Sci., v. 80, p. 205 - 211, 2006.
TANG, S. et al. Clonal and spatial genetic structure in natural populations of Luohanguo
(Siraitia grosvenorii), an economic species endemic to South China, as revealed by RAPD
markers. Biochem. System Ecol., v. 35, p. 557-565, 2007.
TAYLOR, E. et al. Modern molecular methods for characterization and diagnosis of seed-
borne fungal pathogens. J. Plant Pathol., v. 83, p. 75-81, 2001.
66
TOMODA, M.; GONDA, R.; KASAHARA, Y.; HIKINO, H. Glycan structures of ganoderans
B and C, hypoglycemic glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies. Phytochemistry, v.
25, n. 12, p. 2817-2820, 1986.
UIJTHOF, J. M. J. et al. Patogenicity of strains of the black yeast Exophiala (Wangiella)
dermatitidis: an evolution based on polymerase chain reaction. Mycoses, v. 37, p. 235-242,
1994.
UKAI, S. et al. Polysaccharides in fungi. XIV. Anti-inflammatory effect of the polysaccharides
from the fruit bodies of several fungi. J. Pharmacobiodyn. v. 6, p. 983–990, 1983.
URBEN, A. F. et al. Produção de cogumelos por meio de tecnologia chinesa modificada.
Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e Desenvolvimento, 2004.
VENKATACHALAM, L. et al. The use of genetic markers for detecting DNA polymorphism,
genotype identification and phylogenetic relationships among banana cultivars. Mol. Phyl.
Evol., v. 47, p. 974–985, 2008.
VETTER, J. Data on sodium content of common edible mushrooms. Food Chem., v. 81, p.
589–593, 2003.
WAGNER, R.; MITCHELL, D. A.; SASSAKI, G. L.; AMAZONAS, M. A. L. A. Links
between morphology and physiology of Ganoderma lucidum in submerged culture for the
production of exopolysaccharide. J. Biotechnol., v. 114, p. 153–164, 2004.
WANG, H.; QI, M. Q.; CUTLER, A. J. A simple method of preparing plant samples for PCR.
Nucleic Acids Res., v. 21, p. 4153-4154, 1993.
WANG, S. Y. et al. The anti-tumor effect of Ganoderma lucidum is mediated by cytokines
released from activated macrophages and T lymphocytes. Int. J. Cancer, v. 70, p. 699 –
705, 1997.
67
WANG, H.; NG, T. B. Pleueryn, a novel protease from fresh fruiting bodies of the edible
mushroom Pleurotus eryngii. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 289, p. 750-755,
2001.
WANG, H.; NG, T. B. Eryngin, a novel antifungal peptide from fruiting bodies of edible
mushroom Pleurotus eryngii. Peptides, v. 25, p. 1-5, 2004.
WASSER, S. P.; WEIS, A. L. Therapeutic effects of substances occurring in higher
Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective. Crit. Rev. Immunol., v. 19, p. 65-96,
1999.
WASSER S. P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating
polysaccharides. Appl. Microbiol. Biotechnol., v. 60, p. 258-274, 2002.
WELSH, J.; McCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.
Nucleic Acids Res., v. 18, p. 7213-7218, 1990.
WILLARD, T. Reishi Mushroom: Herb of Spiritual Potency and Medicinal Wonder.
Washington: sylan press, 167p, 1990.
WILLIAMS, J. G. K. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are usefull as
genetic markers. Nucleic Acids Res., v. 18, p. 6531-6535, 1990.
WU, Q. P. et al. Tumour cell adhesion and integrin expression affected by Ganoderma
lucidum. Enzyme Microb. Technol., v. 40, p. 32 - 41, 2006.
XIE, Y. Z. et al. Ganoderma lucidum inhibits tumour cell proliferation and induces tumour cell
death. Enzyme Microb. Technol., v. 40, p. 177 - 185, 2006.
YAN, R. et al. Treatment of chronic hepatitis B with Wulingdan Pill. Chinese Medicine v. 2,
p. 188, 1987.
ZADRAZIL, F. GRABBE, K. Edible Mushrooms. Biotechnology, v. 3, p. 145-187, 1983.
68
ZERVAKIS, G. I.; VENTURELLA, G.; PAPADOPOULOU, K. Genetic polymorphism and
taxonomic infrastructure of the Pleurotus eryngii species-complex as determined by RAPD
analysis, isozyme profiles and ecomorphological characters. Microbiology , v. 147, p.
3183-3194, 2001.
ZHAO, J. D. The Ganodermataceae in China. Bibliotheca Mycologica, v. 132, p. 1-176, 1989.
ZHANG, M.; CHEUNG, P. C. K.; ZHANG, L. Evaluation of mushroom dietary fibre
(nonstarch polysaccharides) from sclerotia of Pleurotus tuber-regium (Fries) singer as a
potental antitumor agent. J. Agric. Food Chem., v. 49, p. 5059-5062, 2001.
ZHANG, H.; LIN, Z. Hypoglycemic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides. Acta
Pharmacol. Sin., v. 25, p. 191-195, 2004.
ZHANXI, L.; ZHANHUA, L. Jun-Cao Technology. Fuzhou: Asia-Pacific Fungi Cultivation
training Center. 1997.
ZHU, X. L.; CHEN, A. F.; LIN, Z. B. Ganoderma lucidum polysaccharides enhance the
function of immunological effector cells in immunosuppressed mice. J. Ethnopharmacol.,
v. 111, p. 219 - 226, 2007.
ARTIGO 1
(A ser encaminhado para a revista Journal of the Science of Food and Agriculture,
classificada como Qualis A pela CAPES e cujo fator de impacto é de 1,026)
67
Produção de linhagens brasileiras de Ganoderma lucidum pela
técnica chinesa Jun-Cao
Leonardo Rolim a,*, Arailde Urben b, Maria Auxiliadora Cavalcanti a a Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil. CEP: 50670-420. b Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Prédio de Quarentena e Germoplasma, Parque Estação Biológica, W5 Norte Final, Brasília, Distrito Federal, Brasil. CEP: 70770-900. * contato: [email protected]
Resumo
Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal tradicionalmente usado na China no
combate e prevenção a diversos tipos de enfermidades, dentre as quais pode ser citado o
câncer. O interesse mundial neste basidiomiceto vem crescendo tanto no comércio como na
pesquisa, de modo que se torna necessário o desenvolvimento de métodos de cultivo cada
vez mais eficientes. A técnica Jun-Cao foi desenvolvida na China e revolucionou a
fungicultura do país. Neste trabalho, linhagens comerciais chinesas de G. lucidum foram
comparadas com linhagens brasileiras não exploradas a fim de determinar o potencial de
cultivo utilizando Jun-Cao. Seis formulações foram testadas e a linhagem brasileira CC-144
apresentou melhor resultado ao método aplicado.
Palavras-chave: cogumelos, Ganoderma lucidum, Técnica Jun-Cao.
INTRODUÇÃO
Ganoderma lucidum (Fr.) Karst
(Ganodermataceae), é um cogumelo
medicinal chamado de “Lingzhi” na
China, sendo amplamente utilizado na
medicina tradicional do país. O basidioma
é usado popularmente na prevenção e
tratamento de diversas doenças tais como
câncer, problemas hepáticos, cardiopatias,
inflamações, hipertensão e alguns
problemas neuronais, entre outros (Lee &
Rhee, 1990; Gao & Zhou, 2004; Lin &
Zhang, 2004; Tang & Zhong, 2004;
Petrova et al., 2005; Yuen, 2005; Xie et
al., 2006). Ganoderma lucidum é muito
raro na natureza, de forma que a coleta de
cogumelos selvagens não seria suficiente
para atender a exploração comercial. A
68
fim de equilibrar a oferta com o mercado
internacional crescente, estudos sobre o
cultivo deste basidiomiceto vêm sendo
realizados (Triratana et al., 1991;
Pokorny & Musar, 1995; Berovic et al.,
2003).
Os métodos de cultivo desse fungo
têm sido desenvolvidos tanto para
substratos sólidos, utilizando toras de
madeira ou serragem, como para culturas
líquidas, sendo estas últimas significantes
apenas para desenvolvimento de micélio
livre. A qualidade e concentração dos
princípios ativos de G. lucidum, que lhe
conferem o status de “cogumelo da
imortalidade” variam com a linhagem e
também depende do ambiente e substrato
onde o cogumelo é produzido (Mizuno et
al., 1995; Bojana et al., 2000).
Dentre os vários métodos de
cultivo que vêem sendo desenvolvidos,
destaca-se a técnica chinesa Jun-Cao
(Jun= cogumelo; Cao= gramíneas).
Desenvolvida na década de 1980 por
pesquisadores chineses, a técnica
revolucionou o sistema de produção de
cogumelos, elevando a quantidade destes
fungos e diminuindo substancialmente o
tempo de frutificação (Zhanxi &
Zhanhua, 1997). A principal característica
de Jun-Cao é a substituição das
tradicionais toras de madeira ou substrato
de serragem por gramíneas e resíduos
agrícolas. A qualidade nutritiva dos
cogumelos cultivados em Jun-Cao supera
o valor nutricional de cogumelos
cultivados com os métodos clássicos
(Urben et al., 2004).
Assim como outros cogumelos de
interesse comercial, o cultivo de G.
lucidum por Jun-Cao pode ser uma
alternativa para produtores dispostos a
realizar cultivos recicláveis, para os quais
a matéria-prima pode ser obtida de
materiais mais facilmente encontrados
como capim, bagaço de cana, borra de
café, gesso e açúcar, entre outros. Além
disso, após a utilização pelo cogumelo, o
substrato esgotado pode ser aproveitado
como ração para animais ou como
fertilizante (Urben et al., 2004).
Nesse contexto, a técnica Jun-Cao
surge como uma importante ferramenta
também em pesquisas científicas, onde
novas e inexploradas linhagens podem ter
seu potencial fisiológico avaliado. Assim,
este trabalho buscou comparar o
desenvolvimento de linhagens brasileiras
e chinesas de G. lucidum, avaliando o
melhor substrato e as melhores condições
abióticas para seu cultivo, buscando
determinar qual linhagem obterá melhor
69
resposta às diferentes condições de
crescimento.
MATERIAIS E MÉTODO
Linhagens de Ganoderma lucidum
Foram utilizadas quatro linhagens de
G. lucidum: duas de origem brasileira (CC-
144 e CC-157) e duas chinesas (CC-22 e CC-
63) (Tabela 1), que se encontram depositadas
no Banco de Germoplasma de Cogumelos
para Uso Humano, da Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia (Brasília, DF,
Brasil, 15º46'47"S 47º55'47"W).
Tabela 1: Procedência das linhagens de
Ganoderma lucidum utilizadas
Isolado Local Data da coleta
CC-22 China 19/02/2004
CC-63 China 10/02/2006
CC-144 Brasília, Brasil 10/02/2006
CC-157 São Paulo, Brasil 25/01/2006
Cultivo das linhagens
As amostras foram semeadas em
placas de Petri contendo meio BDA (Batata-
Dextrose-Agar) e incubadas entre 28° a 30°C
até o crescimento micelial recobrir a
superfície do ágar, aproximadamente de sete
a dez dias. Nesse período, o desenvolvimento
das linhagens foi avaliado em diferentes
condições de temperatura (20 ºC – 35 ºC), pH
(4 – 8) e luminosidade (claro e escuro).
Em seguida, as linhagens foram
transferidas para sacos de polipropileno
de alta densidade contendo 300 gramas de
grão de sorgo (Sorghum bicolor)
esterilizados onde permaneceram no
escuro a 28 ºC e UR 80% por 15 dias, até
completa colonização pelas linhagens.
Essa etapa é importante para
multiplicação e obtenção de micélio das
linhagens a serem inoculadas no substrato
de Jun-Cao.
Foram utilizadas seis formulações
diferentes de substrato:
Formulação 1:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum)
70%, farelo de trigo 17%, farelo de arroz
10%, gesso agrícola 2% e açúcar mascavo
1%.
Formulação 2:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum)
25%, bagaço de cana-de-açúcar 53%,
farelo de trigo 20%, gesso agrícola 2%.
Formulação 3:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum)
73%, farelo de trigo 15%, farelo de arroz
10%, gesso agrícola 1% e açúcar mascavo
1%.
Formulação 4:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum)
77,6%, farelo de trigo 20%, gesso
agrícola 1%, superfosfato de cálcio 0,1%,
açúcar mascavo 0,2% e uréia 0,1%.
70
Formulação 5:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum)
39%, serragem 39%, farelo de trigo 10%,
bagaço de cana-de-açúcar 10% e gesso
agrícola 2%.
Formulação 6:
Serragem 78%, farelo de trigo 20% e
gesso agrícola 2%.
As gramíneas e/ou resíduos
orgânicos vegetais foram triturados com o
auxílio de um triturador de gramíneas.
Em seguida adicionou-se ao triturado de
cada formulação os respectivos insumos.
O substrato foi umedecido e colocado em
sacos de polipropileno, resistentes a altas
temperaturas. Cada saco recebeu 700
gramas de substrato.
Os substratos ensacados foram
autoclavados a 121 ºC por 90 min e
resfriados (temperatura ambiente) quando
foram inoculados com os grãos de sorgo
miceliados.
O substrato miceliado foi mantido
no escuro a 28 ºC, UR 80%, até ser
totalmente colonizado. Após isso, os
substratos foram levados para casa de
vegetação (26±4 ºC e UR 80%) onde,
após remoção dos sacos, foram cobertos
com solo esterilizado. Essa etapa é vital
para que o micélio não receba luz ou água
diretamente. A luz deve ser utilizada
apenas no momento do crescimento do
basidioma. O contato direto da água de
irrigação provoca atrofia dos basidiomas.
Para garantir a umidade necessária sem
comprometer a produtividade, o solo deve
permanecer apenas úmido, pois é essa
umidade que garantirá o satisfatório
desenvolvimento do cogumelo.
A Produtividade do cultivo foi
calculada pela fórmula P = (peso fresco
do cogumelo) x 100 / (peso seco do
substrato).
O experimento foi conduzido em
delineamento inteiramente casualisado
em arranjo fatorial de 4 x 6 sendo 4
linhagens de cogumelos e 6 formulações
como substrato e 5 repetições.
Ao final do processo, foi avaliado
o sustrato que gerou maior quantidade de
cogumelos e a linhagem que apresentou
desenvolvimento mais rápido. Os dados
foram analisados estatísticamente usando
o ANOVA de Medidas Repetidas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Condições abióticas
A variação de pH não afetou as
linhagens desenvolvidas em placas
contendo o meio BDA. A ausência de luz,
contudo, foi importante para o rápido
71
crescimento micelial. A melhor
temperatura registrada foi 28 ºC,
conforme proposto por Urben et al.
(2004). Abaixo de 20 ºC e acima de 35 ºC
o desenvolvimento do fungo se torna
comprometido. A linhagem comercial
chinesa CC-22 e a brasileira CC-144
apresentaram melhor desenvolvimento ao
longo dessa etapa, exibindo rápido
crescimento e amplo espectro de
tolerância às variações de temperatura.
Cultivo
No cultivo em sementes de sorgo,
novamente foi possível observar o rápido
desenvolvimento de CC-22 e CC-144,
enquanto CC-63 e CC-157 tiveram
crescimento lento.
Em relação aos diferentes
substratos empregados, a linhagem CC-22
desenvolveu bem suas frutificações nas
formulações 2, 3, 4, 5 e 6, sem resultado
na formulação 1. A CC-63 mostrou
crescimento nos substratos 1, 2 e 5, com
resultado tardio na formulação 3 e sem
resultado nas 4 e 6. CC-144 respondeu
bem a todas as formulações, com
destaque para as formulações 5 e 6. Já a
linhagem CC-157 produziu cogumelos
apenas nos substratos 5 e 6 (Figuras 1 a
4).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tempo (dias)
Des
envo
lvim
ento
da
frut
ifica
ção
(%)
Formulação 1
Formulação 2
Formulação 3
Formulação 4
Formulação 5
Formulação 6
Figura 1 – Percentual de desenvolvimento médio da fase reprodutiva (cogumelo) de G.
lucidum (linhagem CC-22) em diferentes formulações de substrato, ao longo de 150 dias,
onde 100% de desenvolvimento significa ponto propício para colher o cogumelo.
72
0
10
20
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60
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Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tempo (dias)
Des
envo
lvim
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da
Fru
tific
ação
(%
)
Formulação 1
Formulação 2
Formulação 3
Formulação 4
Formulação 5
Formulação 6
Figura 2 – Percentual de desenvolvimento médio da fase reprodutiva (cogumelo) de G.
lucidum (linhagem CC-63) em diferentes formulações de substrato, ao longo de 150 dias,
onde 100% de desenvolvimento significa ponto propício para colher o cogumelo.
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Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tempo (dias)
Des
envo
lvim
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ção
(%)
Formulação 1
Formulação 2
Formulação 3
Formulação 4
Formulação 5
Formulação 6
Figura 3 – Percentual de desenvolvimento médio da fase reprodutiva (cogumelo) de G.
lucidum (linhagem CC-144) em diferentes formulações de substrato, ao longo de 150 dias,
onde 100% de desenvolvimento significa ponto propício para colher o cogumelo.
73
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Inicio 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150
Tempo (dias)
Des
envo
lvim
ento
da
frut
ifica
ção
(%)
Formulação 1
Formulação 2
Formulação 3
Formulação 4
Formulação 5
Formulação 6
Figura 4 – Percentual de desenvolvimento médio da fase reprodutiva (cogumelo) de G.
lucidum (linhagem CC-157) em diferentes formulações de substrato, ao longo de 150 dias,
onde 100% de desenvolvimento significa ponto propício para colher o cogumelo.
A formulação 5 foi a que
apresentou melhores resultados. A
linhagem brasileira CC-144 foi a que
produziu a maioria das frutificações em
menor tempo. A linhagem CC-63 cresceu
bem na formulação 5, mas levou mais de
100 dias para o desenvolvimento
completo nas demais. A linhagem chinesa
CC-22 produziu cogumelos em todos os
substratos (exceção a formulação 1), mas
levou mais tempo que as outras linhagens.
A CC-157 foi pouco eficiente de uma
forma geral, com pouca resposta às
formulações e crescimento na formulação
5 quase tão lento quanto a CC-22 (Tabela
1).
Tabela 1: Média de peso fresco de cogumelos
obtida pelas linhagens de G. lucidum dentre as
seis diferentes formulações. Resultados medidos
em g/kg de substrato (“F” designa a formulação
empregada)
F1 F2 F3 F4 F5 F6
CC-22 0 180 98 108 320 200
CC-63 60 130 90 110 204 0
CC-144 102 200 115 150 360 212
CC-157 0 0 0 0 160 122
A análise estatística mostrou que
houve diferença significativa entre as
linhagens no tempo de desenvolvimento
(F= 27/180, p= 0,044178). A Produti-
vidade do cultivo pode ser observada na
Tabela 2.
74
Tabela 2: Produtividade das linhagens de G.
lucidum crescidas em seis diferentes substratos.
Resultados medidos em % (“F” designa a
formulação empregada)
F1 F2 F3 F4 F5 F6
CC-22 0 36 19,6 21,6 64 40
CC-63 12 26 18 22 40,8 0
CC-144 20,4 40 23 30 72 42,4
CC-157 0 0 0 0 32 24,4
Nos tratamentos com adição de
farelo de arroz (formulações 1 e 3), houve
redução de produção, quando comparados
aos sem adição deste farelo. Isso ocorreu
porque a adição do farelo de arroz pode
ter elevado a concentração de Nitrogênio
(N), como no caso do farelo de soja, que
contém até 7,38% de N (Eira & Minhoni,
1997). O excesso de N tende a reprimir a
degradação da lignina, retardando ou até
inibindo o aparecimento do micélio e,
consequentemente, reduzindo a produção
dos basidiomas (Zanetti & Ranal, 1997;
Urben et al., 2004). De acordo com
Regina (2001), em alguns casos, as fontes
de N mais simples aumentam a
concentração de proteínas das culturas,
diminuem o crescimento miceliano e a
degradação da lignina. Este também pode
ter sido o problema da formulação 4, que
continha uréia na composição.
O farelo de trigo aparentemente
foi bem aceito por G. lucidum. Aveia
poderia ter sido testada, mas Soto-Cruz et
al. (1999), ao avaliar diferentes substratos
no cultivo de Pleurotus ostreatus,
verificaram que a utilização de
concentrações altas de farelo de aveia
proporcionou maior perda de matéria seca
e redução indesejável da taxa de
crescimento do cogumelo.
No cultivo de Lentinula edodes,
Rossi et al. (2003) observaram que a
miceliação diminuiu significativamente
com a utilização de proporções crescentes
de farelo de arroz. A adição desse
suplemento promoveu declínio gradual na
relação C:N do substrato. Ainda segundo
os autores, no tratamento com adição de
20% de farelo de trigo, foram obtidas as
maiores médias de velocidade de
crescimento, comparado aos demais
farelos (arroz, milho, aveia e soja), na
mesma concentração. Dias et al. (2003),
entretanto, verificaram efeito negativo,
quando o farelo de trigo foi adicionado à
palha de feijão, no cultivo de Pleurotus
sajor-caju. Neste caso, o farelo dificultou
a colonização do substrato, porém a
adição do mesmo farelo à palha de milho
não afetou o crescimento do micélio,
possibilitando aumento da eficiência
biológica. Provavelmente o motivo esteja
75
na palha do feijão (alto N) e não no farelo
de trigo propriamente dito.
Segundo Donini et al. (2006), a
adição de farelos de soja e arroz ocasiona
redução da velocidade de crescimento de
Agaricus brasiliensis. Para eles, o meio
de cultura que proporcionou maior
velocidade de crescimento foi o
suplementado com 20% de farelo de
trigo. Moda et al. (2005), com o cultivo
de P. sajor-caju em bagaço de cana-de-
açúcar suplementado com farelo de milho
e solução mineral, observaram menor
eficiência biológica. Neste trabalho,
contudo, o bagaço-de-cana possibilitou
aumento de produção para G. lucidum
(Formulações 2 e 5). A Formulação 5
apresentou melhor resposta ainda
provavelmente pelo acréscimo de
serragem ao substrato. A hipótese para
isso é de que G. lucidum consome
rapidamente os nutrientes dos compostos
mais leves (farelos) e do capim. A
serragem poderia atuar como uma reserva
tardia de nutrientes, que poderia ser
utilizada pelo cogumelo após seu
estabelecimento no substrato.
Apesar do exposto, a escolha de
substratos para o cultivo de cogumelos,
não depende somente da composição e
relação C/N, mas também do grau de
compactação e hidratação, já que
substratos que se compactam com
facilidade ou excessivamente
higroscópicos dificultam a aeração.
Também é necessário observar a natureza
do substrato utilizado na correção da
relação C/N, pois este pode “cimentar” o
substrato, resultando também na perda de
eficiência da aeração. Neste estudo a
aeração demonstrou ser determinante no
desenvolvimento do micélio, visto que,
sem a devida aeração, o desenvolvimento
cessa no meio do substrato. Isso também
foi observado por Dias et al. (2003)
quando trabalhou com Pleurotus usando
casca de café, pois esta se compactava,
impedindo a aeração do substrato.
Os resultados permitem concluir
que CC-144 responde melhor ao cultivo e
que a CC-63 pode ser bem empregada
desde que apenas quando desenvolvida
em substratos cuja elaboração seja similar
à formulação 5. De uma forma geral, a
mistura entre gramínea e madeira foi bem
aceita pelas linhagens, contribuindo para
a elaboração de substratos que gerem
melhor resultado na técnica Jun-Cao.
REFERÊNCIAS
Berovic, M. et al. Submerged cultivation of
Ganoderma lucidum biomass and
76
immunostimulatory effects of fungal
polysaccharides. J. Biotechnol. 103, 77-
86, 2003.
Bojana, B. et al. Triterpenoid Acids from
Ganoderma, Food Technol. Biotechnol.
38, 11-18, 2000.
Dias, E.S.; et al. Cultivo do cogumelo
Pleurotus sajor-caju em diferentes
resíduos agrícolas. Cienc. Agrotec., 27,
1363-1369. 2003.
Donini, L. P. et al. Desenvolvimento in vitro
de Agaricus brasiliensis em meios
suplementados com diferentes farelos.
Pesq. Agropec. Bras., 41, 995-999,
2006.
Eira, A.F.; Minhoni, M.T.A. Manual teórico-
prático do cultivo de cogumelos
comestíveis. 2.ed. Botucatu: Fundação de
Estudos e Pesquisas Agrícolas e
Florestais, 115p. 1997.
Gao YH et al. Chemopreventive and
tumoricidal properties of Ling Zhi
mushroom Ganoderma lucidum (Fr.)
Lioyd (Aphyllophoromycetideae). Part II.
Mechanism considerations. Int. J. Med.
Mushr. 6, 219-230, 2004.
Lee, S.Y.; Rhee, H.M. Cardiovascular effects
of mycelium extract of Ganoderma
lucidum: inhibition of sympathetic
outflow as a mechanism of its
hypotensive action. Chem. Pharm. Bull.
38, 1359-1364, 1990.
Lin, Z.B.; Zhang, H.N. Anti-tumor and
immunoregulatory activities of
Ganoderma lucidum and its possible
mechanisms Acta Pharmacol. Sin. 25,
1387-1395, 2004.
Mizuno, T. et al. Reishi, Ganoderma lucidum
and Ganoderma tsugae: bioactive
substances and medicinal effects. Food
Rev. Int. 11,151-166, 1995.
Moda, E.M.; et al. Edible mushroom
Pleurotus sajor-caju production on
washed and supplemented sugarcane
bagasse. Scientia Agricola, 62, 127-132,
2005.
Petrova, R.D. et al. Potential role of
medicinal mushrooms in breast cancer
treatment: current knowledge and future
perspectives. Int. J. Med. Mushr . 7, 141-
155, 2005.
Pokorny, J.; Musar, A. in: A. Kjøller (Ed.),
Abstracts of the 10th International
Conference on Global Impacts of Applied
Microbiology Biotechnology, University
of Copenhagen, Copenhagen, p. 141,
1995.
Regina, M. Cinética do crescimento
miceliano de Lentinula edodes (Berk.)
Pegler em bagaço de cana-de-açúcar e
serragem de eucalipto. Dissertação -
77
Universidade Estadual Paulista, Botucatu.
87p. 2001.
Rossi, I.H. et al. Supplementation of
sugarcane bagasse with rice bran and
sugarcane molasses for Shiitke (Lentinula
edodes) spawn production. Braz. J.
Microbiol. , 34, 61-65, 2003.
Soto-Cruz, O. et al. Effect of substrate
composition on the mycelial growth of
Pleurotus ostreatus. An analysis by
mixture and response surface
methodologies. Proc. Biochem., 35, 127-
133, 1999.
Tang, Y.J.; Zhong, J.J. Modeling the kinetics
of cell growth and ganoderic acid
production in liquid static cultures of the
medicinal mushroom Ganoderma
lucidum Biochem. Eng. J. 21, 259-264,
2004.
Triratana, S. et al. in: M.J. Maher (Ed.),
Proceedings of the 13th International
Congress on the Science Cultivation of
Edible Fungi, A.A. Balkema, Rotterdam,
p. 567. 1991.
Urben, A. F. Produção de cogumelos por
meio de tecnologia chinesa modificada.
Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Desenvolvimento, 2004.
Xie, J.T. et al. Ganoderma lucidum extract
inhibits proliferation of SW 480 human
colorectal cancer cells. Exp. Oncol. 28,
25-29, 2006.
Yuen, J.W.M.; Gohel, M.D.I. Anticancer
effects of Ganoderma lucidum: a review
of scientific evidence. Nutr. Cancer 53,
11-17, 2005.
Zanetti, A.L.; Ranal, M.A. Suplementação da
cana-de-açúcar com guandu no cultivo de
Pleurotus sp. ‘Florida’. Pesq. Agropec.
Bras., 32, 959-964, 1997.
Zhanxi, L.; Zhanhua, L. Jun-Cao
Technology. Fuzhou: Asia-Pacific Fungi
Cultivation training Center. 1997.
ARTIGO 2
(A ser encaminhado para a revista Food Chemistry, classificada como Qualis A pela
CAPES e cujo fator de impacto é de 2,433)
79
Análise bioquímica de linhagens brasileiras e chinesas de
Ganoderma lucidum cultivadas pela técnica chinesa Jun-Cao
Leonardo Rolim a,*, Erna Bach b, Arailde Urben c, Maria Auxiliadora Cavalcanti a a Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil. CEP: 50670-420. b. Faculdade Nove de Julho, rua Doutor Adolfo Pinto, 109, Barra Funda, São Paulo, Brasil, CEP: 01156-050. c Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Prédio de Quarentena e Germoplasma, Parque Estação Biológica, W5 Norte Final, Brasília, Distrito Federal, Brasil. CEP: 70770-900. * contato: [email protected]
RESUMO
Ganoderma lucidum é um cogumelo utilizado na medicina tradicional chinesa há
milhares de anos para prevenção de diversas doenças, tais como inflamações, problemas
cardíacos, diabetes e, em pesquisas recentes, câncer. Assim como outros organismos, a
concentração nutricional e medicinal de G. lucidum varia entre linhagens. Com a finalidade
de determinar o potencial de linhagens não exploradas deste fungo, duas linhagens
brasileiras tiveram suas proteínas, açúcares totais, fenóis e β-glucanas comparadas com
duas linhagens comerciais chinesas. Os resultados mostram que a linhagem brasileira CC-
144 possui um potencial bioquímico maior do que as chinesas, podendo ser estudada e
utilizada com eficiência por fungicultores.
Palavras-chave: cogumelos, Ganoderma lucidum, bioquímica.
INTRODUÇÃO
Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. é um
basidiomiceto pertecente à Família
Ganodermataceae, da Ordem Aphyllophorales
(Kirk et al., 2001). Seu corpo de frutificação
é chamado de “Lingzhi” na China e “Reishi”
no Japão. Por milhares de anos esse fungo tem
sido utilizado na medicina tradicional chinesa,
atraindo a atenção de pesquisadores curiosos
por entender suas propriedades
farmacológicas. O “Lingzhi” tem sido
utilizado tradicionalmente como um
revitalizador (Lu et al., 2004) e sendo
utilizado na prevenção e tratamento de
diversas doenças humanas, tanto na China
como em outros países do mundo. Há registros
de sua utilização no tratamento de asma,
diabetes, problemas cardíacos, colesterol,
inflamações, AIDS e câncer (Wasser & Weis,
1999; Lin, 2001; Shiao, 2003). Sengundo Eo
80
et al. (1999a, 1999b), G. lucidum é
administrado por via oral, sendo seguro e não
demonstrando nenhum tipo de toxicidade.
Análises bioquímicas identificaram
importantes componentes como parte da
estrutura deste fungo. Estes componentes de
alto poder farmacológico incluem
triterpenóides, proteínas, esteróides,
alcalóides, enzimas, ácidos orgânicos,
lactonas, sais minerais e ácidos graxos.
Polissacarídeos (especialmente β–D-glucanos)
são reconhecidamente agentes
anticancerígenos (Kim et al., 1999; Mizushina
et al., 1999; Vetter, 2003; Mdachi et al., 2004;
Stanley et al., 2005; Muller et al., 2006; Sliva,
2006; Wu et al., 2006; Xie et al., 2006; Liu et
al., 2007).
A qualidade e quantidade destes
princípios farmacológicos de G. lucidum
podem variar dependendo da linhagem, do
substrato ou da localização geográfica. Os
motivos para isso podem estar na nutrição
fornecida e nas condições ambientais de uma
forma geral (Wasser e Weis, 1999; Zhu et al.,
2007). Embora seja muito consumido e
cultivado na China, G. lucidum é encontrado
em praticamente todo o planeta. No Brasil,
este fungo é pouco conhecido, não fazendo
parte da cultura alimentar nacional. Apesar
disso, o constante crecimento do mercado
mundial para G. lucidum está atraindo cada
vez mais a atenção de fungicultores que estão
dispostos a investir em linhagens nativas, que
possuam potencial farmacológico tão rico
quanto às conhecidas linhagens chinesas
(Urben et al., 2004).
A técnica de cultivo Jun-Cao (Jun=
cogumelo; Cao= gramíneas) surgiu na década
de 1980, na China, e revolucionou o sistema
de produção de cogumelos desse país,
aumentando a quantidade destes fungos e
diminuindo substancialmente seu tempo de
frutificação. Essa técnica utiliza gramíneas
como base para o substrato, tornando o cultivo
mais simples e barato do que os métodos
tradicionais, que utilizam toras de madeira e
serragem. Ainda pouco conhecida no ocidente,
Jun-Cao vem despertando cada vez mais o
interesse de fungicultores, dispostos a investir
em novas tecnologias que atendam ao mercado
com mais rapidez e produtividade (Zhanxi &
Zhanhua, 1997; Urben et al., 2004). O
objetivo deste estudo foi comparar a
concentração dos principais componentes
bioquímicos (açúcares, proteínas, b-glucanas e
fenóis) de linhagens brasileiras não exploradas
com linhagens comerciais chinesas de G.
lucidum desenvolvidos pela técnica de cultivo
Jun-Cao.
MATERIAIS E MÉTODOS
Linhagens de Ganoderma lucidum
Foram utilizadas quatro linhagens de
G. lucidum: duas de origem brasileira (CC-144
e CC-157) e duas chinesas (CC-22 e CC-63)
(Tabela 1), que se encontram depositadas no
Banco de Germoplasma de Cogumelos para
Uso Humano, da Embrapa Recursos Genéticos
81
e Biotecnologia (Brasília, DF, Brasil,
15º46'47"S 47º55'47"W).
Tabela 1: Procedência das linhagens de
Ganoderma lucidum utilizadas
Isolado Local Data da coleta
CC-22 China 19/02/2004
CC-63 China 10/02/2006
CC-144 Brasília, Brasil 10/02/2006
CC-157 São Paulo, Brasil 25/01/2006
O cultivo por Jun-Cao
As culturas foram semeadas em placas
de Petri contendo meio BDA (Batata-
Dextrose-Agar) e incubadas entre 28° e 30°C
até o crescimento micelial recobrir a superfície
do meio de cultivo, em aproximadamente sete
a dez dias. Em seguida, o micélio de cada
linhagem foi transferido para substrato
contendo gramínea na seguinte proporção:
capim-elefante (Pennisetum purpureum) 39%,
serragem de mangueira (Mangifera indica)
39%, farelo de arroz (Oryza sativa) 10%,
bagaço de cana-de-açúcar (Saccharum
officinarum) 10% e gesso agrícola 2%. Após
três meses de cultivo, os cogumelos
produzidos foram colhidos, desidratados,
macerados e encaminhados para análise
bioquímica.
Açúcares totais
Os açúcares foram extraídos e
analisados segundo descrito por Ajlouni et al
(1995). O pó triturado seco de G. lucidum (300
mg) foi misturado a 50ml de etanol 80% e a
suspensão foi agitada em shaker por 45
minutos na temperatura ambiente e filtrada em
papel filtro Whatman no 4. O resíduo foi
lavado cinco vezes com 5ml etanol 80% e
filtrado novamente, sendo colocado para secar
e depois redissolvido em água deionizada para
um volume final de 10ml. O extrato aquoso foi
agitado e filtrado usando um filtro Acrodisc-
CR 0.45µm para ser utilizado em
cromatografia HPLC (High performance
liquid chromatography).
Proteínas solúveis
A análise das proteínas foi feita
utilizando o teste de Lowry (Lowry et al.,
1951). Inicialmente, 10g do pó triturado de G.
lucidum foram misturados a 400ml de água
aquecida a 100ºC por 10 minutos. A mistura
foi filtrada e 1ml do sobrenadante foi
misturado com 5ml do Reagente C. Este
reagente é obtido misturando-se 0,5ml de
solução B1 com 0,5ml de solução B2 e 49ml
de solução A. A solução A é obtida diluindo-
se 20g de Na2CO3 em 1 L de NaOH 0,1 N. A
solução B1 utiliza 10g CuSO4 . 5H2O diluídos
em 1 L de água. Para a solução B2 são
necessários 20g de tartarato de sódio (ou
potássio) em 1 L de água.
A mistura de 1ml do sobrenadante
com o Reagente C foi agitada e em seguida
deixada em repouso por 10 minutos.
Adicionou-se 0,5ml de Folin Ciocalteau
(diluído 1:2 em água) e agitou-se novamente.
82
Após 30 minutos, a solução foi levada para
espectrofotômetro para leitura em 500 nm.
Fenol
O fenol foi medido pelo teste do Fenol
(Swain & Hillis, 1959). Assim como na
anaílse das proteínas, 10g do pó triturado de
G. lucidum foram misturados a 400ml de água
aquecida a 100ºC por 10 minutos. Em seguida,
1ml do sobrenadante foi misturado em 0,5ml
de Folin Ciocalteau (diluído 1:2 em água) e
agitado. Após 30 minutos de repouso
adicionou-se 1ml carbonato de sódio saturado,
completando o volume de 10ml com água. A
solução é deixada em descanso por uma hora e
avaliada em espectrofotômetro a 500 nm.
β-Glucanas
Para avaliar as β–glucanas foi adotado
o método de Mizuno et al (1999), onde o pó
do cogumelo seco foi aquecido em etanol 80%
e o resíduo foi reextraído com água, tratado
com oxalato de amônia e depois com
hidróxido de sódio 5%. O sobrenadante final
foi precipitado novamente com etanol, sendo
submetido à análise cromatográfica à 500 nm
de comprimento de onda.
Análise estatística
O experimento foi conduzido em
delineamento inteiramente casualizado com
quatro tratamentos e cinco repetições. Os
dados foram submetidos à análise de variância
(ANOVA) e as médias comparadas pelo
Tukey (α = 0,05) utilizando o programa
Statistica versão 5.1. A referência para todas
as análises será CC-22, por se tratar de uma
linhagem comercial já conhecida e utilizada na
China.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação aos açúcares totais, as
linhagens chinesas mostraram maior
concentração do que as brasileiras. A CC-22
apresentou maior concentração de açúcares do
que as demais (média de 583,6 mg/g). A
linhagem CC-63 apresentou valor médio de
421,74mg/g, enquanto CC-144 e CC-157
revelaram teor médio de açúcares totais de
290,16 mg/g e 304,62 mg/g, respectivamente
(Figura 1).
0
100
200
300
400
500
600
700
CC22 CC63 CC144 CC157
Linhagens de G. lucidum
Con
cent
raçã
o to
tal d
e aç
úcar
(m
g)
Figura 1. Concentração total de açúcar entre as
linhagens chinesas (CC-22 e CC-63) e brasileiras
(CC-144 e CC-157) de Ganoderma lucidum.
Foram observadas diferenças entre
CC-22 e as linhagens brasileiras (CC-144 e
CC-157). A linhagem CC-63 revelou um
caráter intermediário, não apresentando
83
diferença significativa quando comparada às
demais linhagens.
As quatro linhagens de G. lucidum
apresentaram concentração de açúcares totais
similar a de outros cogumelos comestíveis
(Longvah & Deosthale, 1998; Diez & Alvarez,
2001; Manzi et al., 2001; Manzi et al., 2004;
Agahar-Murugkar & Subbulakshmi, 2005).
Kim et al. (2009) tentam estabelecer uma
relação entre o conteúdo total de carboidratos
entre cogumelos comestíveis e cogumelos
medicinais, comentando que cogumelos
medicinais tendem a ter metade da
concentração de carboidratos em comparação
aos comestíveis, que não foi observado nas
linhagens de G. lucidum analisadas neste
trabalho. Deste total de carboidratos há uma
pequena parte (10 – 15%) que compõe os
açúcares solúveis e a outra está dividida em
carboidratos estruturais (quitina, por exemplo),
glicogênio e outros polissacarídeos, como as
β–glucanas.
Em relação à concentração de β-
glucanas, a linhagem brasileira CC-144 se
destacou das demais, apresentando
concentração de 93,16mg/g. As linhagens
chinesas CC-22 e CC-63, e a brasileira CC-
157 apresentaram, respectiva-mente, 48,12
mg/g, 40,52mg/g e 56,54 mg/g, não havendo
diferença estatística significativa (Figura 2).
0
20
40
60
80
100
120
CC-22 CC-63 CC-144 CC-157
Linhagens de G. lucidum
Con
cent
raçã
o de
b-g
luca
nas
(mg
/ g
cogu
mel
o)
Figura 2. Concentração de β-glucanas totais nas
linhagens chinesas (CC-22, CC-63) e brasileiras (CC-
144, CC-157) de Ganoderma lucidum.
Em CC-22 é possível observar que, do
total de carboidratos, 8,24% são compostos
por β–glucanas. CC-63 possui 9,6% de β–
glucanas, enquanto CC-144 contém 32,1% e
CC-157, 18,56% (Tabela 2).
Tabela 2: Concentração de carboidratos totais e β–
glucanas (mg/g de cogumelo) nos isolados de G.
lucidum
Isolado Carboidratos β-Glucanas
CC-22 583,6 48,12
CC-63 421,74 40,52
CC-144 290,16 93,16
CC-157 304,62 56,54
A concentração de proteínas solúveis
foi mais elevada em CC-144 (média 1,86
mg/g), enquanto CC-63 apresentou o resultado
mais baixo (1,28 mg/g). CC-22 e CC-157
apresentaram, respecti-vamente, 1,64 mg/g e
1,70 mg/g de proteínas. (Figura 3).
84
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
CC-22 CC-63 CC-144 CC-157
Linhagens de G. lucidum
Pro
teín
as to
tais
(m
g /
g de
cog
umel
o)
Figura 3. Concentração de proteínas totais nas
linhagens chinesas (CC-22, CC-63) e brasileiras
(CC-144, CC-157) de Ganoderma lucidum, obtidas
pelo Teste de Lowry.
Geralmente cogumelos comestíveis
possuem altos teores de proteínas, em torno de
19 a 35% do peso seco, mas Ganoderma
lucidum possui teores menores, entre 7 e 8%
(Crisan & Sands, 1978). Cogumelos
medicinais, contudo, geralmente possuem
baixas concentrações protéicas, não sendo boa
fonte protéica (Mau et al, 2001). Carboidratos,
pelo contrário, estão presentes em níveis
elevados nos cogumelos medicinais, bem
como fibras e sais minerais (Kalac, 2009).
CC-157 foi a linhagem que apresentou
maior concentração média de fenóis (0,513
mg/g), sendo seguida de CC-22 (0,473 mg/g),
CC-157 (0,457 mg/g) e CC-144 (0,451 mg/g).
(Figura 4).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
CC-22 CC-63 CC-144 CC-157
Linhagens de Ganoderma lucidum
Con
cent
raçã
o de
Fen
ol (
mg
/ g
de c
ogum
elo)
Figura 4. Concentração de Fenol nas linhagens
chinesas (CC-22, CC-63) e brasileiras (CC-144,
CC-157) de Ganoderma lucidum, obtidas pelo teste
de Swain e Hillis (1959).
Tsai et al (2007) mencionam que a
concentração total de fenóis encontradas em
cogumelos comestíveis é em torno de 5 mg/g.
Os resultados obtidos correspondem a uma
quantidade cem vezes menor nas linhagens de
G. lucidum desenvolvidas com a técnica Jun-
Cao.
Os resultados apontam a linhagem
CC-144 como uma boa escolha para a
fungicultura mesmo não sendo uma linhagem
conhecida comercialmente. Além disso, estas
análises contribuem de uma maneira geral para
se ter uma idéia do perfil das linhagens
brasileiras deste basidiomiceto, servindo de
estímulo para estudos posteriores.
REFERÊNCIAS
Agahar-Murugkar, D., & Subbulakshmi, G.
Nutritional value of edible wild
mushrooms collected from the Khasi hills
85
of Meghalaya. Food Chem, 89, 599–603,
2005.
Crisan, E. V., & Sands, A. Nutritional value.
In: S. T. Chang, & W. A. Hayes, The
biology and cultivation of edible
mushrooms (pp. 137–165). New York:
Academic Press. 1978.
Diez, V. A., & Alvarez, A. Compositional and
nutritional studies on two wild edible
mushrooms from northwest Spain. Food
Chem, 75, 417–422, 2001.
Eo, S. K. et al. Antiviral activities of various
water and methanol soluble substances
isolated from Ganoderma lucidum. J
Ethnopharmacol, 68, 129–136. 1999a.
Eo, S. K. et al. Antiherpetic activities of
various protein bound polysaccharides
isolated from Ganoderma lucidum. J
Ethnopharmacol, 68, 175–181. 1999b.
Kalac, P. Chemical composition and
nutritional value of European species of
wild growing mushrooms: A review. Food
Chem. 113, 9–16, 2009.
Kim, H. S.; Kacew, S.; Lee, M. B. In vitro
chemo preventive effect of plant
polysaccharides Aloe barbadensis Miller,
Lentinus edodes, Ganoderma lucidum and
Coriolus versicolor. Carcinogenesis, 20,
1637-1640, 1999.
Kim et al. Comparison of free amino acid,
carbohydrates concentrations in Korean
edible and medicinal mushrooms. Food
Chem, 113, 386–393, 2009.
Kirk, P. M., P. F. Cannon, J. C. David, and J.
A. Stalpers. Ainsworth & Bisby’s
dictionary of the fungi. Cabi Publishing,
Wallingford, United Kingdom. 2001.
Liu, J. et al. The anti-androgen effect of
ganoderol B isolated from the fruiting
body of Ganoderma lucidum. Bioorg Med
Chem, 15, 4966 - 4972, 2007.
Longvah, T., & Deosthale, Y. G..
Compositional and nutritional studies on
edible wild mushroom from northeast
India. Food Chem, 63, 331–334, 1998.
Lu, Q. Y. et al. Ganoderma lucidum extracts
inhibit growth and induce actin
polymerization in bladder cancer cells in
vitro. Cancer Lett, 216, 9–20. 2004.
Manzi, P., Aguzzi, A. & Pizzoferrato, L.
Nutritional value of mushrooms widely
consumed in Italy. Food Chem, 73, 321–
325, 2001.
Manzi, P., Marconi, S., Aguzzi, A., &
Pizzoferrato, L. Commercial mushrooms:
Nutritional quality and effect of cooking.
Food Chem, 84, 201–206, 2004.
Mau, J. L. et al. Non-volatile components of
several medicinal mushrooms. Food Res
Int . 34 521–526, 2001.
Mdachi, S. J. M. et al. Amino acid
composition of some Tanzanian wild
mushrooms. Food Chem, 86, 179 –182,
2004.
Mizushina, Y. et al. Lucidenic acid O and
lactone, new terpentene inhibitors of
eukaryotic DNA polymerases from
86
basidiomycete Ganoderma lucidum,
Bioorg Med Chem, 7, 2047-2052, 1999.
Muller, C. I. et al. Ganoderma lucidum causes
apoptosis in leukemia, lymphoma and
multiple myeloma cells. Leuk Res, 30,
841 - 848, 2006.
Shiao, M. S. Natural products of the medicinal
fungus Ganoderma lucidum: Occurrence,
biological activities, and pharmacological
functions. The Chemical Record, 3, 172–
180. 2003.
Sliva, D. Ganoderma lucidum in cancer
research. Leuk Res, 30, 767 - 768, 2006.
Stanley, G. et al. Ganoderma lucidum
suppresses angiogenesis through the
inhibition of secretion of VEGF and TGF-
ß1 from prostate cancer cells. Biochem
Biophys Res Commun, 330, 46 - 52,
2005.
Tsai, S. Y. et al. Antioxidant properties of
Agaricus blazei, Agrocybe cylindracea and
Boletus edulis. LWT - Food Sci Technol,
40, 1392–1402, 2007.
Urben, A. F. Produção de cogumelos por
meio de tecnologia chinesa modificada.
Brasília: Embrapa Recursos Genéticos e
Desenvolvimento, 2004.
Vetter, J. Data on sodium content of common
edible mushrooms. Food Chem, 81, 589–
593, 2003.
Wasser, S. P., & Weis, A. L. Medicinal
properties of substances occurring in
higher basidiomycetes mushrooms. Int J
Med Mush, 1, 31–62. 1999.
Wu, Q. P. et al. Tumour cell adhesion and
integrin expression affected by
Ganoderma lucidum. Enzyme Microb
Technol, 40, 32 - 41, 2006.
Xie, Y. Z. et al. Ganoderma lucidum inhibits
tumour cell proliferation and induces
tumour cell death. Enzyme Microb
Technol, 40, 177 - 185, 2006.
Zhanxi, L.; Zhanhua, L. Jun-Cao
Technology. Fuzhou: Asia-Pacific
Fungi Cultivation training Center.
1997.
Zhu, X. L.; Chen, A. F.; Lin, Z. B.
Ganoderma lucidum polysaccharides
enhance the function of immunological
effector cells in immunosuppressed
mice. J Ethnopharmacol, 111, 219 -
226, 2007.
ARTIGO 3
(A ser encaminhado para a revista Microbiological Research, classificada como Qualis A
pela CAPES e cujo fator de impacto é de 0,798)
* Autor para correspondência: [email protected] 88
Uso de Marcadores Moleculares RAPD na Diferenciação de
Linhagens Brasileiras e Chinesas de Ganoderma lucidum Leonardo do Nascimento Rolim 1,*, Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcante 1, Arailde Fontes Urben 2, Glaucia Salles Cortopassi Buso 2. 1 Universidade Federal de Pernambuco, Centro de Ciências Biológicas, Departamento de Micologia, Cidade Universitária, Recife, Pernambuco, Brasil. CEP: 50670-420. 2 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Prédio de Quarentena e Germoplasma, Parque Estação Biológica, W5 Norte Final, Brasília, Distrito Federal, Brasil. CEP: 70770-900. RESUMO Ganoderma lucidum é um cogumelo medicinal que tem sido utilizado no combate a diversas doenças humanas, como câncer e outras. Várias técnicas moleculares têm sido utilizadas para analisar a diversidade genética em Ganoderma, sendo o RAPD ainda uma das opções mais baratas e rápidas, especialmente em análises intraespecíficas. Com o objetivo de selecionar marcadores moleculares RAPD para Ganoderma lucidum, linhagens brasileiras e comerciais chinesas foram analisadas. Uma matriz de similaridade foi elaborada e os perfis RAPD das linhagens G. lucidum também foram comparados com outras duas espécies de Ganoderma: G. applanatum e G. lipsiense para estabelecer a similaridade genética entre as espécies. Com base nos primers utilizados foi possível determinar que as linhagens brasileiras CC-144 e CC-157 assemelham-se à chinesa CC-22. O método e a seleção de primers mostraram-se pertinentes para a identificação genética entre linhagens de G. lucidum, podendo ser aperfeiçoada e utilizada em pesquisas e comércio. Palavras-chave: Ganoderma lucidum, diversidade genética, RAPD
INTRODUÇÃO Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. (Ganodermataceae) é um basidiomiceto popular na medicina tradicional chinesa, também utilizado em outros países, como Japão e Estados Unidos, como suplemento alimentar. No Brasil, embora pouco explorado, este fungo é conhecido como Cogumelo Rei, sendo consumido como suplemento alimentar (Mau et al., 2001). Estudos feitos em G. lucidum revelaram diversas propriedades biológicas como atividade antitumoral, antiinflamatória, antiviral (anti-HIV) e antibacteriana. Seus efeitos farmacêuticos têm sido estudados
no combate a diversos tipos de doenças humanas tais como hepatite, hipertensão, distúrbios cardíacos, artrite, bronquite, tumores, diabetes e insônia, dentre outras (Kim, 1987; Nogami, 1987; Kim et al., 1995; El-Mekkawy et al., 1998; Eo et al., 1999; Wasser e Weis, 1999; Hsieh et al., 2005; Lakshmi et al., 2006; Tang et al., 2006; Chu et al., 2007; Li et al., 2007; Zhu et al., 2007). Tradicionalmente, a taxonomia do gênero Ganoderma é baseada em características morfológicas. Embora sejam úteis na diferenciação entre espécies, existem dificuldades para distinguir grupos muito próximos, tais como populações ou linhagens de uma espécie. Segundo Zheng
89
et al. (2007), fatores ambientais, variabilidade, inter-hibridização e propensões morfológicas individuais dificultam identificações precisas para espécies de Ganoderma. Contudo o surgimento de técnicas utilizando marcadores moleculares facilitou a identificação não apenas de espécies de Ganoderma como dos demais organismos, cuja taxonomia encontrava-se nas mesmas dificuldades. Atualmente, a utilização do DNA como uma ferramenta de identificação permitiu diferenciar subgrupos, tais como as diversas linhagens de G. lucidum, facilitando a distinção principalmente entre linhagens comerciais e de interesse industrial (Zheng et al., 2007). Várias técnicas de estudos moleculares têm sido utilizadas para analisar a diversidade genética em basidiomicetos, como isoenzimas (Lan et al., 1998), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorfism, Qi et al., 2003), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism, Park et al., 1996), ITS (Internal Transcribed Spacers, Kindermann et al., 1998) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA, Wang et al., 2003). Dentre essas técnicas, o RAPD é ainda uma das opções mais baratas e rápidas para acessar a variabilidade no nível do DNA, sendo especialmente útil em análises intraespecíficas. Estes marcadores têm a vantagem de amplificar tanto regiões do genoma que podem ser transcritas e/ou traduzidas, como regiões não codificantes. Isto é importante quando o objetivo é avaliar a variação ao longo da maior parte do genoma da espécie (Williams et al., 1990; Ferreira & Grattapaglia, 1996; Ro et al., 2007). Por outro lado, o RAPD é criticado pela baixa repetibilidade experimental, embora esse problema possa ser contornado com a utilização de muitos primers e de critérios mais rígidos (repetições múltiplas em busca de um padrão, por exemplo) no momento da interpretação dos resultados (Carvalho e Vieira, 2001). Este trabalho teve como objetivo selecionar marcadores moleculares do tipo
RAPD para Ganoderma lucidum, avaliando o padrão de similaridade genética entre linhagens brasileiras e linhagens comerciais chinesas. MATERIAIS E MÉTODOS Linhagens de Ganoderma lucidum Foram utilizadas quatro linhagens de G. lucidum: duas de origem brasileira (identificadas como CC-144 e CC-157) e duas chinesas (CC-22 e CC-63) (Tabela 1), que se encontram depositadas no Banco de Germoplasma de Cogumelos para Uso Humano, da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília – DF, Brasil, 15º46'47"S 47º55'47"W). Além destas foram utilizadas amostras de duas outras espécies de Ganoderma: G. applanatum e G. lipsiense (procedentes da China) para se estabelecer comparações genéticas à nível de espécie. Tabela 1: Procedência das linhagens de Ganoderma lucidum utilizadas Isolado Local Data da
coleta CC-22 China 19/02/2004 CC-63 China 10/02/2006
CC-144 Brasília, Brasil 10/02/2006 CC-157 São Paulo, Brasil 25/01/2006
Extração do DNA
Os fungos foram retirados dos tubos-matriz e crescidos em placas de Petri contendo BDA (20% Batata, 2% Dextrose, 1,5% Agar), por um período de sete dias, em plena escuridão, com temperatura média 28 ºC e UR 82%. Cada isolado foi transferido para meio liquido BD a 28 ºC por duas semanas. O micélio foi centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos, lavado com água esterilizada e levemente pressionados em filtro de papel. As linhagens foram transferidas para tubos Eppendorf (1,5ml) onde foram maceradas em nitrogênio liquido e tratadas com 1ml de tampão de extração (1M Tris-HCl pH 8, 0,5M EDTA pH 8, 10% SDS, 5M NaCl) (Raeder e Broda, 1985) e incubadas por 1 hora a 65 ºC. Em seguida, foi adicionado um volume de
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solução fenol, misturando suavemente as fases e centrifugando logo em seguida a 10.000 rpm por 15 minutos. A fase aquosa foi recuperada e transferida para novos tubos, sendo adicionado um volume de solução clorofórmio e álcool isoamílico v/v 24:1. Em seguida houve nova mistura de fases e nova centrifugação a 10.000 rpm por 15 minutos, no qual o sobrenadante foi recuperado e transferido para novos tubos, nos quais foram adicionados um volume de NaCl 1M e dois volumes de etanol resfriado a -20 ºC. Após nova centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado com etanol 70%. Os microtubos foram secos e o material foi ressuspendido em 20 µl de tampão TE (1M Tris-HCl pH 8, 0,5M EDTA pH 8). As amostras tiveram a concentração de DNA avaliada em gel de agarose 1,5% e estocadas a -80 ºC. Análise RAPD O DNA das linhagens foi amplificado por RAPD conforme Williams et al. (1990), utilizando 48 primers de seqüência arbitrária da Operon Technologies Inc. (Alameda, CA, EUA), com tamanho médio de 10 bases: OPAB-02, OPAB-14, OPAB-18, OPAB-19, OPA-02, OPA-05, OPA-07, OPA-11, OPA-12, OPA-17, OPA-18, OPB-02, OPB-05, OPB-06, OPB-09, OPB-10, OPB-11, OPC-02, OPC-18, OPC-19, OPD-02, OPD-04, OPD-07, OPD-20, OPE-04, OPE-06, OPE-08, OPF-01, OPF-02, OPF-06, OPF-08, OPF-12, OPG-04, OPG-15, OPH-12, OPO-15, OPO-19, OPR-02, OPR-08, OPR-09, OPR-10, OPR-12, OPR-19, OPR-20, OPU-01, OPV-08, OPW-18 e OPX-20. As reações foram conduzidas em termociclador PTC-100 (MJ Research Thermal cycler) utilizando-se um programa com os seguintes passos: (1º) desnaturação do DNA a 96ºC por 3 minutos e (2º) a 92ºC por 1 minuto; (3º) anelamento do primer a 35ºC por 1 minuto; (4º) extensão da molécula pela enzima Taq polimerase (Amersham Pharmacia Biotech) a 72ºC por 2 minutos; (5º) 40 ciclos seguindo do 2º ao 4º passos; (6º) passo final de extensão de 5 minutos a 72ºC para finalizar os produtos
amplificados. Para a amplificação das amostras foram utilizados os seguintes componentes, em um volume final de 13 µl: 3,0 µl de DNA genômico a 3,00 ng/µl; 4,92 µl de água milli-Q autoclavada; 1,30 µl Tampão 10X para Taq DNA Polimerase; 1,04 µl de dNTP 2,5 mM; 1,04 µl de BSA 2,5 mM; 1,5 µl de primer 10ng/µl e 0,2 µl de enzima Taq DNA Polimerase. As amostras de DNA amplificado foram separadas em gel agarose 1,5% (120 volts por 4 horas), em tampão TAE 1x, utilizando-se o marcador de peso molecular o 1 kb DNA ladder (Life Technologies, Cergy-Pontoise, France) como referência. O gel foi corado com brometo de etídio, observado em transluminador sob luz UV e fotografado em foto-documentador modelo Eagle Eye II (Stratagene). Foram feitas três repetições da RAPD, sendo uma apenas com as linhagens de G. lucidum, outra idêntica à primeira com a adição da espécie G. applanatum, e ainda uma terceira, onde se usou G. lipsienses. Análise pós-RAPD
Os primers selecionados que apresentaram um melhor padrão de bandas foram utilizados para a construção de uma matriz de similaridade entre os pares de isolados, com base no cálculo do coeficiente de similaridade de Jaccard (Si,j) (Dias, 1998), codificando a presença da banda no gel como 1 e a sua ausência como 0. O coeficiente de Jaccard (Sij) entre pares de linhagens é dado por Sij = a / (a +b + c), onde “a” é o número de marcas positivas concordantes entre isolados i e j, enquanto que “b” e “c” são os números de loci presentes apenas em cada um dos isolados. Valores de Sij próximos a 1,0 indicam elevada semelhança genética entre as linhagens. A fim de representar graficamente o padrão de divergência genética, a matriz de similaridade foi submetida a uma análise de agrupamento do tipo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average), utilizando o programa NTSYS (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System) versão 2.1. Neste método, o
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critério utilizado para a formação dos grupos é a média das distâncias entre todos os pares de itens que formam cada grupo primer. A distância intergrupo é a média das distâncias pareadas dos membros dos dois grupos (Dias, 1998).
Os dados binários gerados a partir da observação em gel foram utilizados em procedimento computacional de reamostragem sobre os loci (bootstrap). Tal procedimento consiste em reamostrar os loci da matriz de dados, com reposição, recalculando as estatísticas desejadas diversas vezes, testando, desta forma, a estabilidade das distâncias genéticas obtidas por RAPD. Para isso, foram realizadas 4.000 replicações a partir do método de permutação Monte Carlo. As permutações pelo método Monte Carlo produzem valores de dissimilaridade simulados, obtidos a partir de matrizes de dados geradas por meio da relocação dos valores originais das amostras (Manly 1997). Apenas quando o índice de similaridade dos dados originais (i.e., sem
simulação) é significativamente mais alto do que o índice obtido depois das permutações, a similaridade genética é considerada significativa (nível de significância adotado, α = 0,05). As permutações foram realizadas com o uso do software RandMat versão 1.0 para Windows. RESULTADOS E DISCUSSÃO Todas as linhagens mostraram resultado positivo na formação de bandas em gel de agarose, segundo a técnica utilizada para a análise RAPD. Dos 48 primers testados, 20 não amplificaram ou não mostraram um bom padrão de amplificação. Os 28 primers restantes mostraram um bom padrão de amplificação e apresentaram um total de 512 loci, sendo 323 polimórficos. O número médio de loci encontrado foi de 18,28, sendo o mínimo de 11 e o máximo de 26 loci por analisado (Tabela 2).
Tabela 2. Relação do número de loci e do número de loci polimórficos por primer eficiente na análise RAPD das linhagens de Ganoderma lucidum
Primers Seqüência 5’ – 3’ No de loci No de loci polimórficos OPAB-14 AAGTGCGACC 17 14 OPA-05 AGGGGTCTTG 17 11 OPA-07 GAAACGGGTG 24 20 OPA-11 CAATCGCCGT 18 10 OPA-12 TCGGCGATAG 24 14 OPB-05 TGCGCCCTTC 26 24 OPB-06 TGCTCTGCCC 16 12 OPC-18 TGAGTGGGTG 21 16 OPC-19 GTTGCCAGCC 16 13 OPD-04 TCTGGTGAGG 11 06 OPD-20 ACCCGGTCAC 19 17 OPE-06 AAGACCCCTC 19 10 OPE-08 TCACCACGGT 16 10 OPF-01 ACGGATCCTG 17 04 OPF-02 GAGGATCCCT 12 05 OPF-08 GGGATATCGG 17 09 OPF-12 ACGGTACCAG 20 09 OPG-15 ACTGGGACTC 22 10 OPH-12 ACGCGCATGT 17 10 OPO-15 TGGCGTCCTT 18 04 OPO-19 GGTGCACGTT 17 10 OPR-08 CCCGTTGCCT 15 08 OPR-09 TGAGCACGAG 19 10 OPR-12 ACAGGTGCGT 16 04 OPR-19 CCTCCTCATC 14 13 OPR-20 ACGGCAAGGA 17 12 OPV-08 GGACGGCGTT 24 17 OPW-18 TTCAGGGCAC 23 21 TOTAL 512 323
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A presença e ausência de bandas foi registrada em planilha e utilizadas para a montagem de uma matriz de similaridade. Ocorreram eventuais bandas cuja nitidez foi menor que as demais, porém não comprometendo a estrutura do dendrograma gerado, pois apenas as bandas que permaneceram após repetição foram consideradas para o estudo. As primeiras comparações feitas com base nos 28 primers indicaram que as linhagens brasileiras CC-144 e CC-157 são as mais próximas entre si, com valor de similaridade de Jaccard de 0,798. Em comparação com as linhagens chinesas, o grupo formado pelas brasileiras se aproximou mais da linhagem CC-22 (SiJ = 0,721), mantendo uma semelhança genética menor em relação à CC-63 (SiJ = 0,52).
A análise bootstrap, que tem sido utilizada em genética de populações para avaliar a estabilidade dos agrupamentos obtidos a partir de distâncias genéticas e para estabelecer intervalos de confiança em modelos de desdobramento de variância e estrutura populacional (Weir, 1990; Meyer, 1995; Hillis et al., 1996; Manly, 1997), revelou que CC-63 é a única linhagem cuja RAPD mostrou-se imprecisa para a determinação da similaridade genética entre as linhagens estudadas. Pelo dendrograma é possível verificar que a divergência genética de CC-63 com as demais está dentro da área de imprecisão gerada pela análise de reamostragens simuladas (Jaccard 0,43 a 0,6). Tal resultado implica dizer que o ponto de divergência genética de CC-63 com as demais linhagens pode oscilar dentro da área informada. Nas outras linhagens a similaridade genética e os pontos de divergência foram estatisticamente significativos, demonstrando um resultado estável entre CC-22, CC-144 e CC-157.
Esses resultados mostram que as linhagens CC-22, CC-144 e CC-157 de G. lucidum podem ser diferenciadas por RAPD com os primers listados na Tabela 2. Hseu et al. (1996) reforçam a eficácia do processo, submetendo também linhagens
de G. lucidum a RAPD e observando a solidez de seus marcadores. Segundo o autor, a técnica pode ser aplicada na diferenciação de linhagens e populações de uma mesma espécie, mas sendo de pouca precisão quando se trabalha com grandes grupos taxonômicos.
RAPD pode não ser de muita utilidade quando aplicada com objetivo de tentar definir filogenias muito elaboradas, envolvendo grandes grupos taxonômicos, mas seus resultados são reconhecidos quando grupos específicos são estudados (Welsh et al., 1992; Duncan et al., 1993; Hamelin et al., 1993; Kazan et al., 1993; Van der Vlugt-Bergmans et al., 1993; Liew et al., 1994; Manulis et al., 1994; Laroche et al., 1995).
Ro et al. (2007) também encontraram bons resultados quando recorreram a RAPD para diferenciar linhagens de Pleurotus eryngii. A técnica já foi utilizada para estudos com Verticillium fungicola, com excelentes resultados (Del Carmen et al., 2002; Largeteau et al., 2006) e por outros pesquisadores para trabalhos com diversos outros organismos, sempre diferenciando grupos taxonômicos muito próximos (Muok et al., 2007; Tang et al., 2007; Rajwana et al., 2008; Shah et al., 2008; Solouki et al., 2008; Venkatachalam et al., 2008). Os primers usados neste estudo, entretanto, não foram suficientes para dar precisão na distância genética da CC-63 (linhagem chinesa) e neste caso se sugere outro conjunto de primers para analisar ou completar a diferenciação.
Os perfis RAPD das linhagens G. lucidum também foram comparados com G. applanatum e G. lipsiense. A análise, com os 28 primers utilizados, resultou em 590 loci para G. applanatum, dos quais 440 foram polimórficos em relação às linhagens de G. lucidum, enquanto que G. lipsienses revelou 597 loci, onde 446 foram polimórficos quando comparados com os loci das linhagens de Ganoderma lucidum utilizadas. Esses resultados foram confrontados para se estabelecer uma similaridade genética à nível de gênero entre os isolados estudados (Figura 1).
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Figura 1 – Dendrograma mostrando a similaridade genética entre linhagens chinesas (CC-22 e CC-63), brasileiras (CC-144 e CC-157) de G. lucidum, G. applanatum (G.a.) e G. lipsienses (G.l.) após análise RAPD. A área compreendida entre as colunas A e B determina um espaço de imprecisão na análise genética, informando que a distância genética entre CC-63 e as demais linhagens pode oscilar dentro dos limites observados.
Estes resultados mostram que tanto G. applanatum quanto G. lipsiense mostraram-se mais distantes geneticamente em relação às linhagens de G. lucidum (Jaccard 0,371), como esperado, por se tratarem de espécies diferentes. As demais linhagens de G. lucidum mantiveram-se estáveis, e CC-63 continuou dentro da área de imprecisão. Desta forma é possível observar que as análises RAPD utilizadas mantêm evidente divergência de espécies e pode ser aplicada na diferenciação de linhagens dentro de uma mesma espécie.
Estudos como este, que buscam desenvolver padrões a partir de perfis genéticos obtidos por meio de técnicas RAPD são elaborados com pouca freqüência quando se trata de G. lucidum (Hseu et al., 1996; Hseu et al., 1996b; Tang et al., 2005; Singh et al., 2005; Ro et al., 2007). A maior dificuldade na aplicação da técnica em estudos com sistemática está na extrema sensibilidade e na mecânica da RAPD. Perfis genéticos podem sofrer variações dependendo do modo como a
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análise é realizada, mas apesar disso é possível obter resultados reprodutíveis por meio de repetições, uma vez que padrões começam a ser desenhados por meio desse processo. Diversos trabalhos estudam as oscilações em RAPD, mas são unânimes no fato de que ela pode ser utilizada desde que o pesquisador encontre um padrão por meio de repetições (Ellsworth et al., 1993; Muralidharan & Wakeland, 1993; Leal et al., 1994; Tommerup et al., 1995; Hseu et al., 1996; Moore et al., 2001; Utomo et al., 2005; Ercisli et al., 2007; Jones et al., 2008; Kim et al., 2008). No caso deste estudo, a análise foi repetida três vezes de modo a obter um padrão no comportamento das bandas. As observações sobre similaridade genética entre linhagens brasileiras e chinesas, realizadas neste estudo, contribuem para o quadro molecular do gênero Ganoderma, sugerindo relações genéticas entre espécies e linhagens, independentemente da distância geográfica e permitindo que a utilização da RAPD por parte de pesquisadores e indústria possa estimar comparações com custos reduzidos. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) e à Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Embrapa – Cenargen) pelo suporte financeiro, aquisição de conhecimento e suporte técnico. ABSTRACT Ganoderma lucidum is a medicinal mushroom that has been used against various types of human diseases such as cancer. Several molecular techniques have been used to analyze genetic diversity in Ganoderma, however, RAPD is still one of the cheapest and quickest options and is particularly useful in intraspecific analyses. To select RAPD markers for G. lucidum, native Brazilian and commercial Chinese strains were analyzed. A similarity matrix
was elaborated and the RAPD profiles of G. lucidum strains were also compared with two other species of Ganoderma: G. applanatum and G. lipsiense, to evaluate genetic similarity among species. Based on the primers used in these studies, was determined that Brazilian CC-144 and CC-157 strains are similar to the Chinese CC-22 strains. The method and selection of primers have proved relevant to the genetic identification between strains of G. lucidum and can be refined and used in research and market. REFERENCIAS Carvalho, A. O. R.; Vieira, L. G. E. (2001),
Determinação das Condições Ótimas para Análises de PCR-RAPD em Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae). Neotrop Entomol., 30(4), 593-600.
Chu, Q. P.; Wang, L. E.; Cui, X. Y.; Fu, H. Z.; Lin, Z. B.; Lin, S. Q.; Zhang, Y. H. (2007), Extract of Ganoderma lucidum Potentiates Pentobarbital-Induced Sleep via a GABAergic Mechanism. Pharmacol Biochem Behav., 86, 693-698.
Colauto, N. B.; Dias, E. S.; Gimenes, M. A.; Eira, A. F. (2002), Genetic Characterization of Isolates of the Basidiomycetes Agaricus blazei by RAPD. Braz J Microbiol., 33, 131-133.
Del Carmen, S. J.; Largeteau-Mamoun, M. L.; Rousseau, T.; Regnault-Roger, C.; Savoie, J. M. (2002), Genetic and physiological variation in isolates of Verticillium fungicola causing dry bubble disease of the cultivated button mushroom, Agaricus bisporus, Mycol Res., 106, 1163-1170.
Dias, L. A. S. (1998), Análises Multidimensionais. In: Alfenas, A. C. Eletroforese de Isoenzimas e Proteínas Afins: Fundamentos e Aplicações em Plantas e Microrganismos. Viçosa, UFV.
Duncan, S., J. E. Barton, and P. O’Brien. (1993), Analysis of variation in isolates of Rhizoctonia solani by random amplified polymorphic DNA assay. Mycol Res., 97, 1075–1082.
95
El-Mekkawy, S.; Meselhy, M. R.; Nakamura, N.; Tezuka, Y.; Hattori, M.; Kakiuchi, N.; Shimotohno, K.; Kawahata, T.; Otake, T. (1998), Anti-HIV-1 and anti-HIV-1-protease Substances from Ganoderma lucidum, Phytochemistry, 49, 1651-1657.
Ellsworth, D. L., K. D. Rittenhouse, and R. L. Honeycutt. (1993), Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns. Bio Techniques, 14, 214–216.
Eo, S.K.; Kim, Y. S.; Lee, C. K.; Han, S. S. (1999), Antiherpect Activities of Various Protein Bound Polysaccarides Isolated from Ganoderma lucidum. J Ethnopharmacol., 68, 129-136.
Ercisli, S.; Agar, G.; Orhan, E.; Yildirim, N.; Hizarci, Y. Interspecific variability of RAPD and fatty acid composition of some pomegranate cultivars (Punica granatum L.) growing in Southern Anatolia Region in Turkey. Biochem System Ecol., 35, 764-769.
Ferreira, M. E.; Grattapaglia, D. (1996), Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares em Análise Genética. Brasília: Embrapa Cenargen, 220p.
Hamelin, R. C., G. B. Ouellette, and L. Bernier. (1993), Identification of Gremmeniella abietina races with random amplified polymorphic DNA markers. Appl Environ Microbiol., 59, 1752–1755.
Hillis, D. M.; Moritz, C.; Mable, B. K. (1996), Molecular Systematics. Massachusetts: Sinauer Associates.
Hseu, R. S.; Wang, H. H.; Wang, H. F.; Moncalvo, J. M. (1996), Differentiation and Grouping of Isolates of the Ganoderma lucidum Complex by Random Amplified Polymorphic DNA-PCR Compared with Grouping on the Basis of Internal Transcribed Spacer Sequences. Appl Environ Microbiol., 62(4), 1354-1363.
Hse, R. S.; Moncalvo, J. M.; Wang, H. F.; Wang, H. H. (1996), Application of PCR-Amplified DNA differentiate the Ganoderma isolates. J Chin Agric Chem Soc., 34(2), 129-143.
Hsieh, C.; Hsu, T.; Yang, F. (2005), Production of Polysaccharides of Ganoderma lucidum (CCRC36021) by Reusing thin Stillage. Process Biochem., 40, 909-916.
Jones, T. C.; Gemmill, C. E. C.; Pilditch, C. A. (2008), Genetic variability of New Zealand seagrass (Zostera muelleri) assessed at multiple spatial scales. Aquatic Botany, 88, 39–46.
Kazan, K., J. M. Manners, and D. F. Cameron. (1993), Genetic relationships and variation in the Stylosanthes guianensis species complex assessed by random amplified polymorphic DNA. Genome, 36, 43–49.
Kim, B. K. (1987), Pharmacological Efficacy of G. lucidum. Korean J Pharmacogn., 18, 58-60.
Kim, S. W.; Kim, E. S.; Kim, Y. S. (1995), Studies on the Polysaccaride Extract from Ganoderma lucidum. J Korean Soc Food Nutr., 24, 147-153.
Kim, C.; Na, H. R.; Choi, H. (2008), Genetic diversity and population structure of endangered Isoetes coreana in South Korea based on RAPD analysis. Aquatic Botany, 89, 43–49.
Largeteau, M. L.; Baars, J. P. P.; Regnault-Roger, C.; Savoie, J. M. (2006), Molecular and physiological diversity among Verticillium fungicola var. fungicola. Mycol Res., 110, 431-440
Lakshmi, B.; Ajith, T. A.; Nayana, J.; Janardhanan, K. K. (2006), Antimutagenic Activity of Methanolic Extract of Ganoderma lucidum and its Effect on Hepatic Damage caused by Benzo[a]pyrene. J Ethnopharmacol., 107, 297-303.
Lan, J.; Xu, J. T.; Wang, Q. Y. (1998), Electrophoretic Studies on Esterase and Peroxidase Isozymes in Ganoderma sp. Chin Pharm J., 33, 12-14.
Largeteau, M. L.; Baars, J. P. P.; Regnault-Roger, C.; Savoie, J. M. (2006), Molecular and Physiological Diversity among Verticillium fungicola var. fungicola. Mycol Res., 110, 431-440.
Laroche, A., D. A. Gaudet, G. B. Schaalje, R. S. Erickson, and J. Ginns. (1995),
96
Grouping and identification of low temperature basidiomycetes using mating, RAPD and RFLP analyses. Mycol Res., 99, 297–310.
Leal, S. C. M., D. J. Bertioli, T. M. Butt, and J. F. Pederby. (1994), Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae by RAPD-PCR. Mycol Res., 98, 1077–1081.
Li, X. L.; Zhou, A. G.; Li, X. M. (2007), Inhibition of Lycium barbarum Polysaccharides and Ganoderma lucidum Polysaccharides against Oxidative Injury Induced by c-irradiation in Rat Liver Mitochondria. Carbohydr Polym., 69, 172-178.
Liew, E. C. Y., and J. A. G. Irwin. (1994), Comparative studies on Phytophthora megasperma isolates from chickpea collected in Australia and in Spain. Mycol Res., 98, 1284–1290.
Manly, B.F.J. (1997), Randomization, bootstrap and Monte Carlo methods in biology. Chapman & Hall, London.
Manulis, S., L. Valinsky, A. Lichter, and D. W. Gabriel. (1994), Sensitive and specific detection of Xanthomonas campestris pv. pelargonii with DNA primers and probes identified by random amplified polymorphic DNA analysis. Appl Environ Microbiol., 60, 4094–4099.
Mau, J.; Lin, H.; Chen, C. (2001), Non-volatile Components of Several Medicinal Mushrooms. Food Res Int., 34, 521-526.
Meyer, D. (1995), Árvores Evolutivas Humanas: Uma Discussão sobre Inferência Filogenética. Série Monografias, v. 3. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética.
Kindermann, J.; El-Ayouti, Y.; Samuels, G. J. Kubicek, C. P. (1998), Phylogeny of the Genus Trichoderma Based on Sequence Analysis of the Internal Transcribed Spacer Region 1 of the rDNA Cluster. Fungal Genet Biol, 24, 298-309.
Moore, A. J.; Challen, M. P.; Warner, P. J.; Elliott, T. J. RAPD discrimination of
Agaricus bisporus mushroom cultivars. Appl Microbiol Biotechnol., 55, 742–749.
Muok, B. O.; Matsumura, A.; Ishii, T.; Odee, D. W. (2007), Genetic diversity within Sclerocarya birrea populations in Kenya. J Arid Env., 71, 1–11.
Muralidharan, K., and E. K. Wakeland. (1993), Concentration of primer and template qualitatively affects products in random-amplified polymorphic DNA PCR. BioTechniques, 14, 362–363.
Nogami, M. (1987), Anti-allergy Activity of Ganoderma lucidum. Korean J Pharmacogn., 18, 56-58.
Park, D. S.; Ryu, Y. J. (1996), The Genetic Relationship Analysis of Ganoderma spp. Using the PCR-RFLP and RAPD. RDA J Agric Sci Biotechnol., 38, 251-260.
Qi, J. J.; Ma, R. C.; Chen, X. D.; Lan, J. (2003), Analysis of Genetic Variation in Ganoderma lucidum after Space Flight. Adv Space Res., 31, 1617-1622.
Raeder, U.; Broda, P. (1985), Rapid Preparation of DNA from Filamentous Fungi. Lett Appl Microbiol.. 1, 17-20.
Rajwana, I. A,; Tabbasam, N.; Malik, A. U.; Malik, S. A.; Rahman, M.; Zafar, Y. (2008), Assessment of genetic diversity among mango (Mangifera indica L.) genotypes using RAPD markers. Sci Hort., 117, 297–301.
Ro, H.; Kim, S. S.; Ryu, J. S.; Jeon, C.; Lee, T. S.; Lee, H. (2007), Comparative Studies on the Diversity of the Edible Mushroom Pleurotus eringii: ITS Sequence Analysis, RAPD Fingerprinting, and Physiological Characteristics. Mycol Res., 111, 710-715.
Shah, A.; Li, D. Gao, L.; Li, H.; Moller, M. (2008), Genetic diversity within and among populations of the endangered species Taxus fauna (Taxaceae) from Pakistan and implications for its conservation. Biochem System Ecol., 36, 183-193.
Singh, S. K.; Rai, R. D.; Kamal, S. (2005), Molecular Identification of Some Medicinally Important Aphyllophorales Mushrooms Based on ITS rDNA
97
Sequences and RAPD data. Int J Med Mushr., 7(4), 565-572.
Solouki, M.; Mehdikhani, H.; Zeinali, H.; Emamjomeh, A. A. (2008), Study of genetic diversity in Chamomile (Matricaria chamomilla) based on morphological traits and molecular markers. Sci Hort., 117, 281–287.
Tang, C. H.; Zhang, J. S.; Chen, M. J.; Tan, Q.; Cao, H.; Xu, W.; Pan, Y. J. (2005), Preliminary Study on Genetic Diversity among Ten Strains of Ganoderma. J Nanjing Agric Univ., 28(2), 133-136.
Tang, W.; Liu, J. W.; Zhao, W. M.; Wei, D. Z.; Zhong, J. J. (2006), Ganoderic Acid T from Ganoderma lucidum Mycelia Induces Mitochondria Mediated Apoptosis in Lung Cancer Cells. Life Sci., 80, 205-211.
Tang, S.; Li, Y.; Geng, Y.; Zhang, G.; Wang, L.; Zhong, Y. (2007), Clonal and spatial genetic structure in natural populations of Luohanguo (Siraitia grosvenorii), an economic species endemic to South China, as revealed by RAPD markers. Biochem System Ecol., 35, 557-565.
Tommerup, I. C., J. E. Barton, and P. A. O’Brien. (1995), Reliability of RAPD fingerprinting of three basidiomycete fungi, Laccaria, Hydnangium and Rhizoctonia. Mycol Res., 99, 179–186.
Utomo, C.; Werner, S.; Niepold, F.; Deising, H. B. Identification of Ganoderma, the causal agent of basal stem rot disease in oil palm using a molecular method. Mycopathologia, 159, 159–170.
Van der Vlugt-Bergmans, C. J. B., B. F. Brandwagt, J. W. Van’t Klooster, C. A. M. Wagemakers, and J. A. L. Van Kan. (1993), Genetic variation and segregation of DNA polymorphisms in Botrytis cinerea. Mycol Res., 97, 1193–1200.
Venkatachalam, L.; Sreedhar, R. V.; Bhagyalakshmi, N. (2008), The use of genetic markers for detecting DNA polymorphism, genotype identification and phylogenetic relationships among banana cultivars. Mol Phyl Evo., 47, 974–985.
Wang, S. Z.; Bai, C.; Fan, J.; Gao, Y.; Yang, J. F.; Yang, Y. J. (2003), A Study on the RAPD Analysis of Ganoderma lucidum and Pleurotus ostreatus Protoplast Fusant Genome. Acta Edulis Fungi, 10,1-5.
Wasser, S. P.; Weis, A. L. (1999), Therapeutic Effects of Substances Occurring in Higher Basidiomycetes Mushrooms: A Modern Perspective. Crit Rev Immunol., 19, 65-96.
Weir, B. W. (1990), Genetic Data Analysis: Methods for Discrete Population Genetic Data. Sunderland: Sinauer.
Welsh, J., C. Pretzman, D. Postic, I. Saint Girons, G. Baranton, and M. McClelland. (1992), Genomic fingerprinting by arbitrarily primed polymerase chain reaction resolves Borrelia burgdorferi into three distinct phyletic groups. Int J Syst Bacteriol., 42, 370–377.
Williams, J. G. K.; Kubelic, A. R.; Livak, K. J.; Rafalski, J. A.; Tingey, S. V. (1990), DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Usefull as Genetic Markers. Nucleic Acids Res., 18, 6531-6535.
Zakaria, L.; Kulaveraasingham, H.; Guan, T. S.; Abdullah, F.; Wan, H. Y. (2005), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and Random Amplified Microsatellite (RAMS) of Ganoderma from Infected Oil Palm and Coconut Stumps in Malaysia. Asia Pac J Mol Biol Biotechnol., 13(1), 23-24.
Zheng L, Jia, D.; Fei, X.; Luo, X.; Yang, Z. (2007), An Assessment of the Genetic Diversity within Ganoderma Strains with AFLP and ITS PCR-RFLP. Microbiol Res., doi:10.1016/j.micres.2007.02.002
Zhu, X. L.; Chen, A. F.; Lin, Z. B. (2007), Ganoderma lucidum Polysaccharides Enhance the Function of Immunological Effector Cells in Immunosuppressed Mice. J Ethnopharmacol., 111, 219-226.
98
CONCLUSÕES
1. Jun-Cao é uma eficiente técnica para ser utilizada para estudos e produção de cogumelos
Ganoderma lucidum, por ser flexível e permitir a utilização de diferentes formulações de
substratos;
2. A técnica Jun-Cao reduziu substancialmente o tempo de desenvolvimento dos basidiomas
de G. lucidum;
3. A linhagem brasileira CC-144 de G. lucidum é a mais promissora para desenvolver
estudos relativos à fungicultura no Brasil;
4. A combinação de capim-elefante (Pennisetum purpureum) e serragem promove excelente
balanço nutricional para o desenvolvimento de G. lucidum;
5. Variações leves de pH (de 4 a 8) não afetam o crescimento de linhagens chinesas e
brasileiras de G. lucidum, tolerantes a acidificação e alcalinização que ocorrem
naturalmente em substratos durante o crescimento micelial;
6. As linhagens brasileiras aparentam maior tolerância a variações de temperatura ambiental
do que as chinesas;
7. Os primers utilizados na análise RAPD permitem determinar distância genética segura
entre as diferentes linhagens de G. lucidum.
99
ANEXO 1: A Técnica Jun-Cao
100
Preparo das linhagens
O inóculo de cada linhagem foi obtido de colônias desenvolvidas em placas de Petri
contendo meio de cultivo batata-dextrose-agar (BDA), após 4 a 5 dias de incubação a 28ºC.
Com o auxílio de um furador de rolhas retirou-se discos de micélio com 5 mm de diâmetro,
que foram transferidos para os centros das placas de Petri (9 cm de diâmetro), contendo o
meio de cultivo (Fig. 1).
Preparo da matriz ou “semente”
Foram utilizados grãos de sorgo como substrato. O sorgo foi escolhido, porque é o
grão mais adequado para o crescimento vegetativo das espécies de cogumelos pesquisados
pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia desde 1996. Os grãos foram lavados em
água corrente e deixados imersos dentro de um recipiente contendo água durante 12 horas (A
imersão é importante para hidratar os grãos, quebrando a resistência da casca, de modo a
favorecer a colonização do fungo a ser testado). Em seguida escorreu-se o excesso de água e
os grãos umedecidos foram transferidos para um saco de polipropileno de alta densidade (15
x 35 x 0,010 cm). O material foi esterilizado a 121 ºC durante 30 minutos em autoclave.
Cada saco contendo 300 gramas de grãos de sorgo recebeu discos de inóculo
colonizados pelo micélio do fungo. Os sacos foram fechados com espuma esterilizada e
arame encapado. Em seguida, os sacos foram incubados sob ausência de luz, a temperatura
de 25 ºC durante 10 dias (Figs. 2 e 3).
Figura 1 – Placa contendo disco miceliado ao centro do meio de cultura no primeiro dia (A) e com três dias de cultivo (B).
B
101
Figura 2 – Preparo da matriz ou “semente” de G. lucidum em laboratório. Transferência de
linhagens das placas para sacos contendo sementes de sorgo.
102
Figura 3 – “Sementes” que serão utilizadas como inóculo para cultivo de G. lucidum.
Finda esta etapa, as sementes estavam prontas para serem transferidas para substratos
contendo diferentes formulações. Foram seis tipos de formulações testados, a saber:
Formulação 1:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 70%, farelo de trigo 17%, farelo de arroz 10%,
gesso agrícola 2% e açúcar mascavo 1%.
Formulação 2:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 25%, bagaço de cana-de-açúcar 53%, farelo de
trigo 20%, gesso agrícola 2%.
Formulação 3:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 73%, farelo de trigo 15%, farelo de arroz 10%,
gesso agrícola 1% e açúcar mascavo 1%.
Formulação 4:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 77,6%, farelo de trigo 20%, gesso agrícola 2%,
superfosfato de cálcio 0,1%, açúcar mascavo 0,2% e uréia 0,1%.
Formulação 5:
Capim-elefante (Pennisetum purpureum) 39%, Serragem 39%, farelo de arroz 10%, bagaço
de cana-de-açúcar 10% e gesso agrícola 2%.
Formulação 6:
Serragem 78%, farelo de trigo 20% e gesso agrícola 2%.
103
As gramíneas e/ou resíduos orgânicos vegetais foram triturados com o auxílio de um
triturador de gramíneas. Em seguida adicionou-se ao triturado de cada formulação os
respectivos insumos. O substrato então foi umedecido e colocado em sacos de polipropileno,
resistentes a altas temperaturas. Cada saco recebeu 700 gramas de substrato.
Os substratos ensacados foram autoclavados a 121 ºC por 90 min e depois de
voltarem a atingir temperatura ambiente, foram inoculados com os grãos de sorgo
miceliados.
A inoculação se deu da seguinte maneira:
Em uma câmara de fluxo laminar, cada saco de substrato recebeu furos laterais,
realizados com auxílio de um furador de rolhas, por onde foram introduzidas as “sementes”.
Os furos foram então, fechados com fita adesiva para impedir o contato com o ambiente
externo. A extremidade do saco foi aberta para receber “sementes” na sua parte superior.
Finalmente, o saco foi fechado com arame encapado, mantendo-se uma espuma esterilizada
na extremidade deste, com o objetivo de promover aeração no substrato de cultivo (ver
seqüência nas Figs. 4 e 5).
104
Figura 4 – Etapas do processo de inoculação de “sementes” de Ganoderma lucidum em substratos
de cultivo sob condições assépticas (A – F).
B A
D
F E
C
105
Figura 5 – Inoculação de “sementes” de Ganoderma lucidum a partir de extremidade do saco de
polipropileno (A – D).
B A
D C
106
Posteriormente, os sacos contendo os substratos inoculados foram transferidos para
uma sala escura, com temperatura ambiente em torno de 25 – 28 ºC e 70 – 80% UR. Nestas
condições iniciou-se o processo de desenvolvimento vegetativo do fungo (Fig. 6).
Figura 6 – Substratos sendo mantidos em sala escura para o desenvolvimento vegetativo das
linhagens de Ganoderma lucidum.
Após, o completo desenvolvimento dos micélios nos substratos, os sacos foram
levados à casa de vegetação, para a formação da fase reprodutiva. A umidade do local é
mantida por meio de irrigação periódica e o ar é renovado por exaustores. Uma vez que o
contato direto com a água de irrigação inibe a formação do cogumelo, em Ganoderma
lucidum, estes são enterrados em calhas. Este método os mantém abrigados da luz e do
excesso de umidade que possa ocorrer em alguns horários do dia.
O processo de enterrar o substrato colonizado é uma variação da técnica Jun-Cao que
pode ser utilizada tanto no G. lucidum, quanto em outros cogumelos de uso humano, como,
por exemplo, Pleurotus spp., Lentinula edodes, Grifola frondosa, dentre outros. A água,
nesse caso, é espalhada na terra de cobertura, umedecendo-a. Esta umidade é suficiente para
garantir o desenvolvimento das frutificações.
Para cada linhagem foi separada uma calha, sendo que as calhas foram divididas em
compartimentos, os quais foram preenchidos cada um com uma formulação (Fig. 7).
107
Figura 7 – Processo de cobertura dos substratos miceliados com terra em calhas. As calhas vazias (A) recebem
uma camada de terra (B) e, em seguida, o substrato é deitado paralelamente (C, D, E e F) para ser enterrado (G, H
e I ).
A temperatura da casa de vegetação ficou em torno de 25 ºC, com umidade média de
80%. A terra de cobertura foi umedecida sempre que se mostrou ressecada.
A Figura 8 ilustra o crescimento das linhagens de G. lucidum ao longo do período de
desenvolvimento do corpo de frutificação. Após a frutificação, sucederam-se as análises que
culminaram nos artigos presentes neste trabalho.
A C
D E
B
F
H I
G
108
Figura 11 – Diferentes fases de desenvolvimento do cogumelo: A) Local de cultivo; B e C)
Surgimento dos primórdios de frutificação; D) Desenvolvimento dicotômico do
basidiocarpo; E) Píleo em forma semicircular, ou forma de rins com dobras anelares e faixa
branca ao redor das bordas do chapéu. G) Fase adulta do cogumelo: píleo e haste com
coloração marrom-avermelhada.
A B
C D
E F
109
ANEXO 2: Géis obtidos na análise genética das linhagens
110
A análise de variabilidade genética entre as linhagens G. lucidum chinesas (CC-22 e
CC-63) e as brasileiras (CC-144 e CC-157) foi realizada por meio de utilização de
marcadores moleculares RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). A linha 5 de cada
gel possui uma linhagem (CC-229) que foi testada inicialmente, mas descartada ao longo do
tempo devido à contaminação. Os fragmentos de DNA amplificados foram visualizados por
meio de eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com brometo de etídio (Figs. 1 a 4).
Figura 1 – Análise genética das linhagens CC-22 (Linha 1), CC-63 (Linha 2), CC-144 (Linha 3), CC-157
(Linha 4) e CC-229 (Linha 5) de G. lucidum por meio de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados o
peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers E 4, E 6, E 8, F 1 e F 2.
1 2 3 4 5
Primer E 4 Primer E 6
0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4
Primer E 8
1 2 3 4 5
Primer F 2 Primer F 1
5 12.216____
1.018____
506,517____
2.036_____
1.636_____
3.054_____
bp
396_____
111
Figura 2 – Análise genética das linhagens CC-22 (Linha 1), CC-63 (Linha 2), CC-144 (Linha 3), CC-157
(Linha 4) e CC-229 (Linha 5) de G. lucidum por meio de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados o
peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers F 6, F 8, F 12, G 4 e G 5.
1 2 4 5
Primer F 6
0 3 1 2 4 5
Primer F 8
3 _____12.216
____1.018
____506,517
_____2.036
_____1.636
_____3.054
bp
1 2 4 5 3
Primer F 12
1 2 4 5 3
Primer G 4
1 2 3
Primer G 5
____396
112
Figura 3 – Análise genética das linhagens CC-22 (Linha 1), CC-63 (Linha 2), CC-144 (Linha 3), CC-157
(Linha 4) e CC-229 (Linha 5) de G. lucidum por meio de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados o
peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers G 5, G 15, H 12, O 19, R 12 e R 19.
12.216____
1.018____
506,517____
2.036_____
1.636_____
3.054_____
bp
396_____
1 2 4 5
Primer R 12
3 4 5
Primer G 5
0 1 2 4 5
Primer G 15
3 1 2 4 5
Primer H 12
3 1 2 4 5
Primer O 19
3 1 2
Primer R 19
113
Figura 4 – Análise genética das linhagens CC-22 (Linha 1), CC-63 (Linha 2), CC-144 (Linha 3), CC-157
(Linha 4) e CC-229 (Linha 5) de G. lucidum por meio de marcadores moleculares RAPD. Foram utilizados
o peso molecular 1kb DNA Ladder (Linha 0 = modelo padrão) e os primers R 19, R 10, X 20, O 15 e W 18.
Além dos primers já citados, foram utilizados também AB 1, AB 2, AB 10, AB 13,
AB 14, AB 18, AB 19, A 2, A 5, A 6, A 7, A 11, A 12, A 17, A 18, B 1, B 2, B 5, B 6, B 9, B
10, B 11, B 13, B 16, B 18, C 1, C 2, C 3, C 5, C 7, C 8, C 10, C 18, C 19, D 2, D 4, D 6, D
7, D 10, D 18, D 20, J 5, J 7, J 8, J 13, K 12, P 2, R 2, R 8, R 9, R 20, S 5, S 16, U 1, U 20, V
8, W 6, W 13, W 17, X 4, Y 1, Y 17 e Y 20. Todo o material foi fornecido pelo Laboratório
de Genética Vegetal do Prédio de Coleta e Caracterização, da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia.
_____12.216
____1.018
____506,517
_____2.036
_____1.636
_____3.054
bp
____396
3 2 4 5
Primer R 19
1 2 4 5
Primer R 10
3 1 2 4 5
Primer X 20
3 1 2 4 5
Primer O 15
3 1 2 4 5
Primer W 18
3 0
114
Os primers efetivos para distinguir as linhagens de Ganoderma lucidum, bem como
suas respectivas seqüências, estão listados na tabela a seguir (Tabela 1):
Tabela 1. Relação do número de loci e do número de loci polimórficos por primer eficiente na análise RAPD das linhagens de Ganoderma lucidum
Primers Seqüência 5’ – 3’ No de loci No de loci polimórficos OPAB-14 AAGTGCGACC 17 14 OPA-05 AGGGGTCTTG 17 11 OPA-07 GAAACGGGTG 24 20 OPA-11 CAATCGCCGT 18 10 OPA-12 TCGGCGATAG 24 14 OPB-05 TGCGCCCTTC 26 24 OPB-06 TGCTCTGCCC 16 12 OPC-18 TGAGTGGGTG 21 16 OPC-19 GTTGCCAGCC 16 13 OPD-04 TCTGGTGAGG 11 06 OPD-20 ACCCGGTCAC 19 17 OPE-06 AAGACCCCTC 19 10 OPE-08 TCACCACGGT 16 10 OPF-01 ACGGATCCTG 17 04 OPF-02 GAGGATCCCT 12 05 OPF-08 GGGATATCGG 17 09 OPF-12 ACGGTACCAG 20 09 OPG-15 ACTGGGACTC 22 10 OPH-12 ACGCGCATGT 17 10 OPO-15 TGGCGTCCTT 18 04 OPO-19 GGTGCACGTT 17 10 OPR-08 CCCGTTGCCT 15 08 OPR-09 TGAGCACGAG 19 10 OPR-12 ACAGGTGCGT 16 04 OPR-19 CCTCCTCATC 14 13 OPR-20 ACGGCAAGGA 17 12 OPV-08 GGACGGCGTT 24 17 OPW-18 TTCAGGGCAC 23 21 TOTAL 512 323