UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA

Estudos sobre o processo de cristalização de

heme em Rhodnius prolixus

Renata Stiebler

Rio de Janeiro

2008

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II

LOMBADA

Renata S

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UFRJ

V.I

III

Renata Stiebler

Estudos sobre o processo de cristalização de heme em Rhodnius prolixus

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Química Biológica.

Orientador: Marcus Fernandes de Oliveira

Rio de Janeiro

2008

IV

FICHA CATALOGRÁFICA

STIEBLER, RENATA

Estudos sobre o processo de cristalização de heme em Rhodnius

prolixus / Renata Stiebler Rio de Janeiro, 2008.

xiv, 82 f .: il

Dissertação (Mestrado em Química Biológica) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, 2008.

Orientador: Marcus Fernandes de Oliveira

1. Hemozoína. 2. Heme.

3. Rhodnius prolixus - Teses. I. Oliveira, Marcus Fernandes.

II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica.

III. Estudos sobre o processo de cristalização de heme.

V

FOLHA DE APROVAÇÃO

Renata Stiebler

Estudos sobre o processo de cristalização de heme em Rhodnius prolixus

Rio de Janeiro, 01 de abril de 2008. (Marcus Fernandes de Oliveira, Professor adjunto do Instituto de Bioquímica Médica – Centro de

Ciências da Saúde (CCS)- Universidade Federal do Rio de Janeiro).

(Mário Alberto Cardoso da Silva Neto, Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica Centro de Ciências da Saúde (CCS)- Universidade Federal do Rio de Janeiro).

(Patrícia de Azambuja Penna, Pesquisadora da Fundação Oswaldo Cruz - Fundação Oswaldo

Cruz). (Márcia Cristina Paes, Professora Adjunta do Departamento de Bioquímica Médica, Universidade

Estadual do Rio de Janeiro). (Marcos Henrique Ferreira Sorgine, Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica -

Centro de Ciências da Saúde (CCS) - Universidade Federal do Rio de Janeiro).

(Ednildo de Alcântara Machado, Professor Adjunto do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Centro de Ciências da Saúde (CCS) – Universidade Federal do Rio de Janeiro).

VI

AGRADECIMENTOS

Primeiramente ao Marcus, pela orientação, carinho, paciência e amizade ao longo de

todos estes anos. Obrigada por tudo, obrigada pela confiança, por acreditar em mim!

A Lili, pelo começo de tudo! Obrigada por, indiretamente, me mostrar um outro

caminho ali na Nutrição... Dizem que um bom filho a casa torna, será?? Obrigada também

pelas tantas conversas e incentivos!

A Angelica, pela paciência, por toda ajuda e amizade em todos esses anos!

A Helena e ao Hector, por todo carinho apoio e incentivo.

Ao Pedro, pelo espaço, pela competência.

A todos do Laboratório de Artrópodes Hematófagos e do LBM! Em especial ao Zé e

Tiago, por serem tão organizados! Por se preocuparem com todos e por tornarem nosso

ambiente de trabalho um pouco menos caótico. Um obrigada especial também a Renata,

Juliana, Clarinha, Elen, Liliane, Luiza, Joana, Kethleen, Chis, Milane, Ana Caroline, Donato,

aos professores Marcos (obrigada pela revisão e conselhos nesta tese) e Gabriela e a todos os

outros membros do laboratório! Obrigada pelo acolhimento em especial nestes últimos anos e

por tornarem o dia a dia de trabalho uma grande diversão, é muito bom trabalhar com vocês!

Obrigada pelas conversas na hora do almoço, pelas discussões sempre muito proveitosas,

pelos lanches no Bloco A entre um experimento e outro!

Ao Laboratório do Masuda e a todos do antigo GKM! Obrigada ao Masuda, por

permitir que eu ficasse em seu laboratório tanto tempo. Obrigada a Lílian, Helo, Lize, Denise,

Maya, Alan Brito, Alan Barbosa, Rachel, Raquelzinha, Petter e os professores Kátia, Geórgia

e Mário pelo companheirismo, discussões e festas de todos estes anos. Ta, obrigada a você

também David, por todo carinho e amizade.

A todos os membros da banca: Patrícia Azambuja, Márcia Paes, Mario Alberto e

Ednildo Machado.

VII

Aos “irmãos” da Nutrição: Fabi e Vagner! Meus grandes companheiros das primeiras

SBBqs da vida!

Aos eternos amigos do São Vicente: Lorenzo, Babu, Bruno, Palombo, e a tantos

outros. Um agradecimento especial a Fernanda, Vivian, Letícia e Júlia, por provarem que a

amizade é imutável ao tempo! Obrigada pelo carinho, conselhos e puxões de orelha! Vocês

são todos muito especiais.

Ao melhor que a Nutrição me deu: “o grupo do Mal”. Minhas queridas amigas Elisa,

Ellen, Marcela, Patty, Ana Paty e Júlia. Obrigada pelo convívio, brincadeiras e por segurarem

as pontas na época de faculdade enquanto eu matava aula no Laboratório! Obrigada pela

força, o resultado está aqui!

Obrigada a toda a minha querida família e agregados! Ao meu pai, mãe e Nanda por

todo amor, apoio e compreensão. As minhas avós Mary e Gilda, Vovô Ivan e Célia, meus tios

Bia, Chico, Meg e Cacá, minha prima Luiza, e a Marianne pelo carinho. Obrigada também ao

vovô Dino, vovô Nando e Magali, que de alguma maneira sei que olham por mim! Muito

obrigada por tudo!

Finalmente ao Daniel, por todo amor, carinho e companheirismo ao longo de todos

estes anos. Obrigada por todos os momentos que passamos juntos e pelo apoio incondicional.

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ÍNDICE

ABREVIATURAS

LISTA DE FIGURAS

RESUMO

ABSTRACT

1) INTRODUÇÃO

1.1) O modelo de estudo: o inseto Rhodnius prolixus

1.2) A molécula de heme e a hematofagia

1.3) A formação do cristal de Hemozoína em organismos hematófagos

1.4) As drogas quinolínicas

2) OBJETIVOS

3) MATERIAIS E MÉTODOS

3.1) Animais

3.2) Obtenção de intestino total de R. Prolixus

3.3) Fracionamento do intestino total

3.4) Dosagem de proteína

3.5) Extração lipídica

3.6) Síntese de hemozoína in vitro

3.7) Extração de Hemozoína

3.8) Dosagem de Hemozoína

3.9) Dosagem de heme total

3.10) Análise por espectrofotometria das frações do gradiente de sacarose

3.11) Cinética da cristalização espontânea de heme in vitro catalisada por DMSO

3.12) Solubilização do heme em DMSO

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3.13) Ensaio in vivo com Azadiractina

3.14) Síntese de hemozoína in vitro em placa – método para o teste das drogas quinolínicas

3.15) Tratamento do intestino total de R. prolixus com condroitinase

4) RESULTADOS

4.1) A cristalização espontânea de heme in vitro é regulada pela polaridade do meio de reação

4.2) Quantificação de algun componentes do homogeneizado total do intestino de R. prolixus

4.3) A formação de Hz é induzida por diferentes componentes do intestino de R. prolixus

4.4) O tratamento com azadiractina diminui os níveis de heme intestinais e o eleva na

hemolinfa

4.5) Glicosaminoglicanos sulfatados presentes no intestino de Rhodnius prolixus estão

envolvidos no processo de cristalização de heme

4.6) O grau de solubilidade do heme depende da densidade das frações do homogeneizado

total do intestino de Rhodnius prolixus

4.7) As frações de baixa densidade do gradiente de sacarose são menos eficientes na

cristalização de heme de que nas frações de maior densidade

4.8) Drogas quinolínicas inibem a cristalização de heme em R. prolixus

5) DISCUSSÃO

6) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

X

Abreviaturas

CS – Condroitin Sulfato

DMSO – dimetilsulfóxido

GAGs – Glicosaminoglicanos

Hb – Hemoglobina

HRPs – proteínas ricas em histidina

Hz – Hemozoína

MM – membranas microvilares

MPMV – membranas perimicrovilares

nm – nanômetros

OH• – radical hidroxil

PBS – tampão fosfato em solução salina

PEG – polietilenoglicol

R• – radical alquil

RH – ácido graxo insaturado

RHBP – Rhodnius Heme Binding Protein

RO• – radical alcoxil

ROO• – radical peroxil

ROOH – hidroperóxido orgânico

ROS – espécies reativas de oxigênio

SDS – dodecil sulfato de sódio

TLC – cromatografia de camada fina

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Lista de Figuras

Introdução

Figura 1: Rhodnius prolixus adulto.

Figura 2: Os diferentes estágios de desenvolvimento do R. prolixus.

Figura 3: R. prolixus antes e após alimentação.

Figura 4: Sistema digestivo do R. prolixus.

Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão do intestino de R. prolixus.

Figura 6: Representação esquemática da estrutura da molécula de heme.

Figura 7: Mecanismos pró-oxidantes do heme e do ferro.

Figura 8: Representação esquemática da estrutura dos cristais de β-hematina e Hz.

Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão de corte transversal do intestino de fêmeas

adultas de S. mansoni.

Figura 10: Porcentagem de conversão do heme em Hz na presença de uma camada

aquosa/lipídica.

Figura 11: Microscopia eletrônica de varredura dos cristais de heme.

Figura 12: Padrões de Difração de raios-X dos cristais de heme isolados de S. mansoni, R.

prolixus e β-hematina.

Figura 13: Algumas das drogas quinolínicas utilizadas como antimaláricos e inibidoras da

formação de Hz.

Figura 14: Modelo proposto para ilustrar o mecanismo pelo qual a cloroquina interage com o

heme e inibe a formação de Hz

Figura 15: Inibição da formação de Hz por cloroquina in vivo.

Resultados

Figura 16: Efeito temporal do DMSO e PEG 6000 sobre a cristalização espontânea de heme.

Figura 17: A redução da polaridade do meio com diferentes concentrações de DMSO

aumenta a solubilização do heme em meio ácido.

Figura 18: A redução da polaridade do meio acelera a cristalização espontânea do heme in

vitro.

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Figura 19: Lipídeos isolados do intestino de R. prolixus são capazes de promover a

cristalização do heme in vitro de forma termo-sensível.

Figura 20: Cristais de Hz são capazes de induzir a cristalização de heme por autocatálise.

Figura 21: A Hz é capaz de reduzir a solubilidade do heme in vitro.

Figura 22: A azadiractina interfere na cristalização de heme no inseto R. prolixus.

Figura 23: Condroitin sulfato desempenha um papel importante sobre a formação de Hz

induzida pelo homogeneizado total de intestino do R. prolixus.

Figura 24: As frações de menor densidade obtidas no gradiente de sacarose do fracionamento

do homogeneizado intestinal do R. prolixus possuem espectro típico de heme enquanto que as

frações mais densas apresentam características típicas de Hz.

Figura 25: As frações de maior densidade do intestino de R. prolixus apresentam maior

capacidade de formação de Hz.

Figura 26: Efeito de drogas quinolínicas na formação de Hz in vitro induzida pelos lipídeos

intestinais de R. prolixus.

Figura 27: Efeito da quinidina na formação de Hz in vivo em R. prolixus.

Figura 28: Novas drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente são eficientes na inibição da

formação de Hz in vitro induzida pelo homogeneizado total do intestino de R. prolixus.

Lista de Tabelas

Resultados

Tabela 1: Dosagem de componentes do intestino de Rhodnius prolixus.

XIII

Resumo

STIEBLER, Renata. Estudos sobre o processo de cristalização de heme. Rio de Janeiro, 2008.

Dissertação (Mestrado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

O inseto hematófago Rhodnius prolixus, um vetor da Doença de Chagas, ao ingerir

sangue e digerir a hemoglobina libera em seu trato digestivo grandes quantidades de heme.

Esta molécula quando livre, é extremamente tóxica pois gera espécies reativas de oxigênio,

leva a peroxidação lipídica e promove a lise celular. Assim, os organismos hematófagos

necessitam de mecanismos protetores para evitar sua toxicidade. A hemozoína (Hz) é um

cristal de heme produzido pelo parasito da malária, o Plasmodium falciparum, pelo inseto R.

prolixus e outros triatomineos e pelo helminto Schistosoma mansoni como um eficiente

mecanismo para a detoxificação do heme livre. A inibição da formação de Hz leva a

condições de estresse oxidativo e o uso de drogas quinolínicas, muito utilizadas ainda hoje no

tratamento da Malária, apresenta este fim. Estas drogas ligam-se à molécula de heme livre,

impedindo sua cristalização. No R. prolixus a cristalização de Hz ocorre por intermédio das

membranas perimicrovilares (MPMV) que recobrem as células intestinais. O objetivo da

presente tese foi investigar os mecanismos de cristalização de heme, química e

biologicamente, mais especificamente no intestino do R. prolixus. Em condições ácidas, a

redução da polaridade do meio com o uso de DMSO ou PEG promoveu uma aceleração da

cristalização do heme e o DMSO aumentou a solubilidade do heme, observada através do

incremento na absorção da relação das bandas de Soret/Q. Lipídeos totais e cristais de Hz

purificados do conteúdo intestinal do R. prolixus foram capazes de induzir a formação de Hz.

O fracionamento do conteúdo intestinal de fêmeas adultas em gradiente de sacarose resultou

no aparecimento de cinco frações, com diferentes espectros de absorção de luz. As frações de

menor densidade apresentaram um espectro similar ao heme e as frações mais densas tiveram

espectro característico de Hz. A solubilidade do heme presente nestas últimas frações era

menor do que nas primeiras, entretanto, as menos densas foram as mais eficientes em

cristalizar o heme, mesmo com uma menor capacidade em solubiliza-lo. Diversas quinolinas

comerciais e novas drogas sintéticas inibem a formação de Hz in vitro e in vivo. Podemos

concluir então que, apesar da solubilização do heme ser importante para a formação

espontânea de Hz, a MPMV do R. prolixus aparentemente utiliza mecanismos diferentes para

cristalização de Hz no processo de detoxificação do heme.

XIV

Abstract

STIEBLER, Renata. Studies on the heme crystallization process. Rio de Janeiro, 2008.

Dissertação (Mestrado em Química Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica.

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.

The blood-sucking bug Rhodnius prolixus, a vector of Chagas Disease, during the

process of blood and hemoglobin digestion releases huge amounts of heme in the midgut.

Once in a free state, this molecule is very toxic because it is able to generate free radicals,

induce lipid peroxidation and cellular damage. Therefore, the hematophagous organisms

developed protective mechanisms to avoid heme toxicity. Hemozoin (Hz) is a heme crystal

produced by the malaria parasite, Plasmodium falciparum, the insect R. prolixus and others

triatomines and the helminth Schistosoma mansoni as a mechanism of free heme

detoxification. The inhibition of Hz formation leads to oxidative stress, and the use of

quinolines drugs, still used in the Malaria treatment, has this purpose. This drug acts by

binding to free heme, preventing its crystallization. In R. prolixus, Hz crystallization occurs in

the midgut and involves the perimicrovilar membranes (MPMV) that cover the midgut cells.

In the present work we aimed to investigate the mechanisms involved in chemical and

biological heme crystallization, specially in R. prolixus midgut. In acidic conditions, the

reduction of medium polarity, by the use of DMSO or PEG accelerated heme crystallization.

Moreover, DMSO increased heme solubilization in acidic milieu, assessed by the increment

of Soret/Q bands absorption ratio. Total lipids and Hz purified from the R. prolixus midgut

were able to induce Hz formation. The fractionation of midgut contents from adult females in

a sucrose gradient resulted in five fractions with distinct absorption spectra. The fractions that

showed the lower density presented a spectra more similar to heme, while the fractions with

higher density exhibited spectra typical of Hz. In addition, heme solubility on higher density

fractions was lower than in lower ones. Curiously, the lower density fractions revealed to be

more efficient in promoting heme crystallization, despite its lower capacity to solubilize heme

in acidic milieu. Several commercial quinolines and some new synthetic quinolines inhibited

Hz formation in vitro and in vivo. We can conclude that, although heme solubilization is

important to spontaneous Hz formation, the MPMV of R. prolixus midgut uses distinct

mechanisms to crystallize Hz and detoxification heme in this bug midgut.

1

1) Introdução:

1.1) O modelo de estudo: o inseto Rhodnius prolixus

A classe Insecta constitui aproximadamente 70% das espécies animais conhecidas e o

enorme sucesso evolutivo desse grupo deve-se a presença de asas e a possibilidade do vôo, que

permitiram não só a conquista dos mais variados ambientes mas também uma grande capacidade

de dispersão (Maranhão, 1977). A enorme diversidade deste grupo é resultado não só da

colonização bem sucedida, mas também da adaptação desses organismos aos mais diferentes

ecossistemas. Das mais de 1 milhão de espécies descritas de insetos, estima-se que

aproximadamente 14.000 sejam hematófagas (Lehane, 1991). O fato destes insetos hematófagos

serem vetores de diversos agentes etiológicos causadores de doenças como a malária, dengue,

leishmaniose, febre amarela e Doença de Chagas, torna este grupo extremamente importante

sobre o ponto de vista médico.

Assim como os outros insetos hematófagos, os insetos pertencentes à sub-família

Triatominae têm grande relevância do ponto de vista médico, uma vez que estes são vetores do

agente etiológico da Doença da Chagas, o protozoário Trypanosoma cruzi. O Rhodnius prolixus é

apontando como principal vetor dessa doença no norte da América do Sul e na América Central

(Lehane, 1991; Lent, 1999). No Brasil, esta espécie tem papel secundário como vetor, visto que o

Triatoma infestans é o principal responsável pela transmissão do Trypanosoma cruzi no país.

Quase um século após a descoberta da doença, que ocorreu em 1909 pelo pesquisador brasileiro

Carlos Chagas, a Doença de Chagas, que também é conhecida como Tripanosomiase Americana,

ainda representa um desafio internacional à saúde pública (WHO, 2006). Esta doença é

encontrada principalmente na América Latina, presente em 18 países, mas também já foi

2

detectada em paises não endêmicos como no Canadá, Estados Unidos e alguns paises da Europa.

Durante a década de 1980, a prevalência da doença estava em torno de 20 milhões de casos dos

quais 4,8 a 5,4 milhões exibiram sintomas clínicos (WHO, 2003). No momento, estima-se que a

prevalência de infecção seja de 13 milhões, com 3 a 3,3 milhões de casos sintomáticos e uma

incidência anual de 700 a 800 mil casos e 45 mil mortes em decorrência da doença (WHO,

2007b). Entretanto, apesar de ser altamente endêmica, a doença de Chagas permanece no grupo

das doenças negligenciadas.

Figura 1: Rhodnius prolixus adulto. (Obtido de www.jyi.org, 2007).

O Rhodnius prolixus (Figura 1) é um inseto hematófago obrigatório da ordem Hemiptera,

família Reduviidae, e sub-família Triatominae, cujos representantes são popularmente conhecidos

como “barbeiros”. Esse inseto não tem hospedeiro preferencial, alimentando-se em qualquer

vertebrado de sangue quente. Assim como todos os outros hemípteros, o barbeiro é

hemimetábolo, ou seja, sofre metamorfose incompleta e durante o seu desenvolvimento passa por

cinco estágios de ninfa até atingir a fase adulta. Somente na fase adulta o inseto desenvolve as

asas propriamente ditas e está pronto para a reprodução (Figura 2). Cada muda é sincronizada por

uma alimentação hematófaga realizada tanto por machos quanto por fêmeas (Aldana et al., 2001),

3

na qual o inseto pode ingerir até 10 vezes o seu peso em sangue (Friend et al., 1965) (Figura 3).

A qualidade e quantidade de sangue que o inseto ingere na alimentação interferem diretamente no

desenvolvimento e produção de ovos do Rhodnius prolixus (Friend et al., 1965). Após a

alimentação, o animal segue um período de jejum prolongado, que pode chegar a alguns meses.

Por volta do terceiro dia após a alimentação, os ovários de fêmeas de Rhodnius prolixus já se

encontram repletos de ovócitos, e por volta do sexto dia após a alimentação, estes insetos iniciam

a postura. As ninfas eclodem cerca de 15 dias após a postura, e estas também se alimentam de

sangue.

Figura 2: Os diferentes estágios de desenvolvimento do R. prolixus. Ovo; 1 – ninfa de 1o estágio;

2 – ninfa de 2o estágio; 3 – ninfa de 3o estágio; 4 – ninfa de 4o estágio; 5 – ninfa de 5o estágio; 6 –

individuo adulto fêmea; 7 – individuo adulto macho. (Eizemberg, 2007).

5

4 3 2 1 ovo

6 7

4

Figura 3: R. prolixus antes (1) e após alimentação (2). (Franco, 2006).

O sistema digestivo do Rhodnius prolixus é dividido em duas partes principais: o

estômago e o intestino (Lehane et al., 1991). No caso do barbeiro e de todos os Hemípteros, a

função desses dois compartimentos é bem diferenciada, como mostrado na figura 4A. O sangue

ingerido a cada alimentação é armazenado no estômago e posteriormente digerido e absorvido

pelo intestino. Na parte anterior do tubo digestivo (estômago) ocorre uma grande absorção de

água seguida de uma grande diurese apresentada por esses insetos já nos primeiros momentos

após a alimentação. Com isso, há uma conseqüente concentração do bolo alimentar que é então

lentamente liberado para a parte posterior do tubo digestivo (intestino médio). Só então começa o

processo de digestão do sangue ingerido, que ocorre através da atividade de uma série de enzimas

digestivas secretadas pelo intestino, como as amilopeptidases, carboxipeptidases, aspartico-

proteinases, cisteino-proteinases alem de glicosidades e lipases, todas essas já caracterizadas no

Rhodnius prolixus (Ferreira et al., 1988; Terra et al., 1988).O processo de absorção dos produtos

de digestão começa logo em seguida à digestão e os nutrientes absorvidos principalmente no

intestino médio são transportados para a hemolinfa e dela para os demais tecidos do inseto.

1 2

5

(A) (B)

Figura 4: Sistema digestivo do R. prolixus. (A) Representação esquemática do sistema digestivo

do R. prolixus. a – glândulas salivares; b – estômago; c – intestino anterior; d – intestino médio; e

– intestino posterior; f – túbulo de Malpighian. (Obtido de Wigglesworth, 1943). (B) Diagrama

de célula epitelial do intestino de R. prolixus. MM – Membrana Microvilar; PMM – Membrana

Perimicrovilar; PMS – Espaço Perimicrovilar. (Obtido de Billingsley et al., 1999 Apud Biology

of the Insect Midgut).

O intestino dos insetos pertencentes à ordem hemíptera, como é o caso dos barbeiros,

diferem dos Dípteras (ordem esta que inclui por exemplo o mosquito Aedes Aegypti) por não

possuírem uma camada composta por mucopolissacarídeos chamado de matriz peritrófica, que

recobre o epitélio intestinal destes insetos. Os Hemípteras possuem ao invés de

mucopolissacarídeos, uma estrutura composta de bicamadas fosfolipídicas com poucas proteínas

integrais denominada de membrana perimicrovilar (MPMV), que é secretada pelas células

intestinais, conforme ilustrado na figura 4B. Esta membrana é produzida em conseqüência da

distensão do tubo digestivo, que ocorre ao longo do processo de repasto sanguíneo e digestão do

bolo alimentar. O processo de alimentação leva a alterações hormonais e a liberação de

6

hormônios como a ecdisona na hemolinfa do inseto estimulam o crescimento da MPMV

(Gonzáles et al., 1998). Esta membrana consiste na primeira barreira de proteção presente no

intestino dos Triatominae, e uma das primeiras funções propostas para esta estrutura foi a de

proteção das células epiteliais, em função da sua localização envolvendo estas células. (Figura 5).

No entanto, outras funções vem sendo descritas para as MPMV como a compartimentalização da

digestão e a detoxificação das moléculas de heme gerada através da hidrólise de Hb na luz

intestinal deste inseto (Oliveira et al., 1999; Billingslry et al., 2000).

Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão do intestino de R. prolixus. A seta aponta para

as MPMV que recobrem as células epiteliais do intestino. ag - lúmen intestinal; ec - células

epiteliais. (Obtido de Oliveira et al., 1999).

7

1.2) A molécula de heme e a hematofagia

Figura 6: Representação esquemática da estrutura da molécula de heme. (Obtido de

www.scientificpsychic.com).

A utilização do sangue como alimento é extremamente vantajosa nutricionalmente, uma

vez que o mesmo é composto de proteínas, lipídeos e poucos carboidratos, o que sob o ponto de

vista energético permite que processos anabólicos como a ovogênese, crescimento e

desenvolvimento possam acontecer (Lehane, 1991; Romoser, 1996). Entretanto, a degradação da

hemoglobina (Hb) no sistema digestivo desses animais hematófagos resulta na liberação de algo

em torno de 10 mM de heme, o grupo prostético da Hb (Graça-Souza et al., 2006). A molécula de

heme, ou Ferriprotoporfirina –IX (Figura 6), consiste em quatro anéis pirrólicos ligados por

grupos (-CH) com um átomo de ferro central.

O heme é uma molécula de vital importância para manter diversas funções celulares e a

homeostase do corpo, sendo sintetizado em eucariotos por uma via que utiliza enzimas presentes

tanto no citossol quanto na mitocôndria (Ponka, 1999). Como exemplo da importância central do

heme na fisiologia celular, pode-se destacar seu papel como grupamento prostético de diversas

8

proteínas envolvidas na respiração celular (citocromos), no transporte de oxigênio

(hemoglobina), na detoxificação de drogas (citocromo P450), nas defesas antioxidantes (catalase)

e na transdução de sinal (guanilato ciclase) (Ignarro et al., 1984; White et al., 1992; Ponka,

1999).

Entretanto, o heme, por ser uma molécula anfifílica e de baixo peso molecular pode

exercer uma série de efeitos deletérios para as células (Ryter e Tyrrell, 2000). Foi demonstrado

que, em concentrações milimolares, o heme tem a capacidade de associar-se às membranas

fosfolipídicas e alterar sua permeabilidade e seletividade, podendo culminar em lise celular

(Schmitt et al., 1993). Foi mostrado também que o heme é uma molécula pró-oxidante que pode

causar dano molecular como peroxidação lipídica, além de gerar radicais livres, particularmente

através da decomposição de peróxidos orgânicos gerando espécies altamente reativas como os

radicais alcoxil (RO•) e peroxil (ROO•) (Kalyanaraman et al., 1983; Van der zee et al., 1996). O

ferro livre ao reagir com H2O2 pode contribuir para a geração de espécies radicalares como os

radicais hidroxil (OH•) através da reação de Fenton (Figura 7), onde o peróxido de hidrogênio

(H2O2) reage com um metal de transição qualquer (no caso o ferro). A partir desta reação, pode-

se iniciar a cadeia de peroxidação lipídica pela captação de elétrons de outras moléculas, como

ácidos graxos insaturados (RH), gerando radicais alquil (R•) (Graça-Souza et al., 2006). Embora

o heme seja capaz de decompor o H2O2, a caracterização destes produtos de reação ainda é pouco

conhecida e não se sabe, por exemplo, se o radical OH• representa uma destas espécies.

(Kalyanaraman et al., 1983; Van der Zee et al., 1996; Graça-Souza et al., 2006). Todas essas

reações são demonstradas na figura 7.

9

Figura 7: Mecanismos pró-oxidantes do heme e do ferro. (Obtido de Graça-Souza et al., 2006).

Os radicais livres são espécies reativas caracterizadas por apresentarem um ou mais

elétrons desemparelhados e estáveis por um curto período de tempo. Esses elétrons

desemparelhados conferem a essas espécies químicas alta reatividade e por isso são

potencialmente tóxicas (Halliwell, 1993). Espécies reativas de oxigênio (ROS) abrangem todas as

formas reativas do oxigênio. Na realidade, o termo ROS compreende radicais livres onde os

elétrons desemparelhados localizam-se nos átomos de oxigênio e também moléculas não

radicalares dotadas também de alta reatividade como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e

peróxidos orgânicos (ROOH) (Halliwell e Gutteridge, 2000; Halliwell, 1993). Entretanto, a

reação de oxigênio com íons de metais de transição e radicais livres resultam em uma variedade

de ROS, que podem efetivamente iniciar reações em cadeia e atacar biomoléculas. Estima-se que

cerca de 0,1% do oxigênio utilizado durante a respiração mitocondrial forma ROS, devido ao

“escape” dos elétrons dos complexos que compõem a cadeia respiratória. Várias biomoléculas

como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos podem sofrer oxidação promovida por radicais livres

(Fridovich, 1978; Mannervick, 1985; Richter et al., 1988; Dean, 1991). A reatividade das ROS

difere de espécie para espécie e depende do tipo de radical produzido e da molécula envolvida na

10

interação (Halliwell, 1993). O radical hidroxil (OH•) é considerado uma das espécies mais

reativas, sendo capaz de atacar rapidamente (em cerca de 10-9 segundos) qualquer biomolécula

disponível (Halliwell e Gutteridge, 2000). Por este motivo acredita-se que a reação de Fenton seja

tão deletéria.

Sendo assim, diversos mecanismos de proteção contra os efeitos deletérios do heme livre

tornam-se necessários para os organismos hematófagos, pois a utilização do sangue como

nutriente representa um grande desafio oxidativo, uma vez que produtos gerados na digestão do

sangue, como o heme e ferro, são liberados no trato digestivo desses organismos.

Nesse contexto, organismos hematófagos como protozoários, helmintos, artrópodes e até

mamíferos representam um grupo altamente especializado. Com relação aos artrópodes, sabe-se

que a hematofagia surgiu independentemente ao longo de sua evolução (Ribeiro, 1995) e com

isso diferentes espécies desenvolveram uma série de mecanismos de defesa antioxidantes (Graça-

Souza et al., 2006), preventivas e supressoras. O intestino dos insetos que se alimentam de

sangue é o primeiro local destes animais a enfrentar um desafio oxidativo, já que a hidrolise da

Hemoglobina (Hb) libera grandes quantidades de moléculas de heme no interior de seu trato

digestivo. Sendo assim, diversos mecanismos adaptativos de defesa e detoxificação do heme

livre, decorrente da digestão de grande quantidade de sangue ingerida por diversos organismos

hematófagos, têm sido propostos. Em mamíferos, a maior parte da detoxificação do heme ocorre

através da reação catalisada pela enzima heme oxigenase, pela qual o heme sofre uma degradação

oxidativa gerando biliverdina, monóxido de carbono e íon ferroso (Tenhunen, 1969; Ryter et al.,

2000). Essa enzima também já foi descrita no barbeiro Rhodnius prolixus por Paiva-Silva et al.,

2006 e no mosquito Aedes aegypti por Pereira et al., 2007. Uma lipoproteína denominada Help

foi identificada no carrapato bovino Boophilus microplus como um mecanismo de detoxificação

do heme. A Help é capaz de ligar o heme na hemolinfa desses animais, diminuindo seus efeitos

11

pro-oxidantes (Maya-Monteiro et al., 2000; Maya-Monteiro et al., 2004). No caso do inseto

Rhodnius prolixus, outros mecanismos de detoxificação já foram descritos além da enzima heme

oxigenase. Assim como o carrapato Boophilus microplus, este inseto possui uma proteína

presente em sua hemolinfa e em seus ovos que é capaz de ligar o heme evitando assim com que

esta molécula exerça seus efeitos deletérios. No caso do Rhodnius prolixus, esta proteína é

denominada de Rhodnius Heme Binding Protein (RHBP) (Oliveira et al., 1995; Dansa-Petretski

et al., 1995). No entanto, no carrapato bovino Boophilus microplus, a maior parte do heme,

derivado da digestão da Hb, é detoxificado através da sua agregação em uma organela

especializada chamada de hemossomo (Lara et al., 2003). O Rhodnius prolixus, além destes

mecanismos já descritos, possui ainda uma outra adaptação bastante peculiar que visa minimizar

os efeitos tóxicos do heme. Assim como no carrapato, este inseto apresenta um mecanismo de

precipitação do heme, que consiste na cristalização desta molécula num pigmento conhecido

como Hemozoína (Hz), que é posteriormente eliminado nas fezes deste inseto (Oliveira et al.,

1999). No ano de 1849 este cristal de heme foi pela primeira vez associado ao pigmento da

malária no Plasmodium (Rudzinska et al., 1965; Sullivan, 2002). Por muito tempo, a Hz foi

considerada característica deste parasito, estando presente em seu vacúolo digestivo (Rudzinska

et al., 1965; Slater et al., 1991; Francis et al., 1997). No entanto, a partir de 1999, a Hz começou

a ser descrita em outros organismos hematófagos, como no inseto R. prolixus (Oliveira et al.,

1999) e outros triatomíneos (Oliveira et al., 2007) e no helminto Schistosoma mansoni, este

ultimo o causador da esquistossomose humana (Oliveira et al., 2000b), ambos pelo nosso grupo

de pesquisa. Além destes, ao menos outros dois organismos, o trematódeo Echinostoma trivolvis

e o protozoário Haemoproteus columbae também são capazes de produzir este cristal de heme.

Assim, o fenômeno de cristalização de heme na forma de Hz é recorrente na natureza, uma vez

12

que diversos organismos hematófagos fazem uso dessa estratégia como um mecanismo eficiente

de proteção contra a toxicidade do heme (Graça-Souza et al., 2006).

1.3) A formação do cristal de Hemozoína em organismos hematófagos

A Hemozoína (Hz), também conhecida como o pigmento da malária, foi descrita pela

primeira vez no começo do século XVIII por Lancisi. Em 1911 Brown observou que o heme

representava um componente dominante da Hz (Brown, 1911, Apud Egan, 2008), mas a forma

como as moléculas de heme interagiriam para formar a Hz ficou desconhecida por mais 80 anos.

Os estudos de Fitch e Kanjananggulpan publicados em 1987 mostraram que a Hz é formada

unicamente pelo heme (ferriprotoporfirina-IX), descartando a presença de qualquer componente

protéico ou lipídico no cristal (Fitch e Kanjananggulpan, 1987). Eles foram os primeiros a sugerir

que este pigmento era idêntico a β-hematina, até então um agregado insolúvel de heme produzido

sinteticamente em laboratório (1936). Em 1991 Slater e colaboradores demonstraram, por

experimentos de difração de raios-X, que, de fato, ocorre uma interação entre o ferro de uma

molécula de heme e o carboxilato de outra e que a Hz apresenta um caráter insolúvel,

características estas que a diferem do heme (Slater et al., 1991). Este estudo foi o primeiro a

caracterizar detalhadamente a estrutura da β-hematina e, através de diversas ferramentas

espectroscópicas, demonstraram que o grupo propionato de uma molécula de heme liga-se ao

átomo de ferro central da outra molécula de heme (Slater et al., 1991). Assim, foi proposto que a

β-hematina era na verdade um polímero formado por longas cadeias de heme unidas por

interações eletrostáticas do tipo ferro-carboxilato (Slater et al., 1991). No ano de 1997, Bohle e

13

colaboradores mostraram definitivamente que a estrutura sintética da β-hematina era idêntica ao

cristal de Hz presente no Plasmodium (Bohle et al., 1997). Por aproximadamente uma década

este conceito foi aceito. Entretanto, em 2000 a estrutura da β-hematina foi definitivamente

elucidada, com a utilização de espectroscopia de difração de raios-X gerado por radiação

Síncrotron (Pagola et al., 2000). Assim foi proposto que a β-hematina, e por conseguinte a Hz,

não se trata na verdade de um polímero, mas sim de um cristal formado por dímeros de heme que

interagem por ligações iônicas do tipo ferro-carboxilato e que esses dímeros ligam-se por pontes

de hidrogênio dos grupos carboxilato não-dissociados conforme mostrado na Figura 8 (Pagola et

al., 2000; Oliveira et al., 2005). Considerando que a Hz apresenta uma estrutura cristalina de

faces bem definidas, esta descoberta não foi exatamente uma surpresa (Egan, 2008).

(A) (B)

Figura 8: Representação esquemática da estrutura dos cristais de β-hematina e Hz. (A)

Representação esquemática da estrutura do cristal de β-hematina proposta por Pagola et al., 2000.

(B) Representação esquemática da estrutura da Hz isolada de R. prolixus e S. mansoni proposta

por Oliveira et al., 2005.

14

Em paralelo à descoberta da Hz em diferentes organismos, foram realizados diversos

estudos a fim de esclarecer quais os mecanismos estariam envolvidos na formação deste cristal. A

formação de Hz é favorecida por pH ácidos, próximos ao pKa do heme, medido entre 4,8 e 5,0, o

que condiz com as estimativas de pH encontradas tanto no vacúolo digestivo do Plasmodium

quanto no intestino do R. prolixus e do Schistosoma mansoni (Slater e Cerami, 1992; Terra et al.,

1988; Bogitsh e Davenport, 1991). Aparentemente, a estrutura do cristal de Hz parece ser a

mesma nesses três organismos, semelhante a mostrada na figura 5 (Oliveira et al., 2005). Outras

características do cristal são comuns, como a insolubilidade em meios levemente alcalinos e a sua

solubilização em pHs acima de 11, o que leva ao rompimento das ligações ferro-carboxilato e a

conseqüente geração de monômeros de heme. O espectro de absorção de luz na região do UV e

visível da Hz desses três organismos também é comum, com absorção característica em torno de

450 nm e outro pico em torno de 655 nm (Slater et al., 1991; Oliveira et al., 1999; Oliveira et al,

2000b). Em todos estes casos, a formação da Hz resulta na diminuição dos efeitos deletérios do

heme descritos acima (Oliveira et al., 2002). Entretanto, apesar desses pontos em comum entre os

organismos produtores de Hz, o mecanismo preciso pelo qual as moléculas de heme são

organizadas na forma de Hz in vivo ainda não é entendido sendo ainda um ponto controverso na

literatura (Ridley, 1996).

No Plasmodium, a formação de Hz ocorre dentro de uma organela intracelular chamada

vacúolo digestivo e postulou-se que uma proteína denominada ‘heme polimerase’ estivesse

envolvida na cristalização de heme neste organismo (Slater e Cerami, 1992). Esta hipótese foi

sustentada após a demonstração que proteínas ricas em histidina (HRPs) obtidas de Plasmodium

eram capazes de induzir a síntese de Hz in vitro, sugerindo que esta proteína fosse responsável

pelo processo de formação de Hz (Sullivan et al., 1996). A HRP II é uma proteína de 30KDa e

cerca de 85 % da sua estrutura consiste em repetições de domínios His-His-Ala-Ala-Asp e His-

15

His-Ala-His-His-Ala-Ala-Asp-Ala (Wellems e Howard, 1986; Panton et al., 1989). Já foi descrito

que esta proteína é capaz de ligar heme e promover a formação de Hz (Sullivan et al., 1996;

Ziegler et al., 1999). Subseqüentemente, Dorn e colaboradores mostraram que extratos lipídicos

de formas trofosoitas do Plasmodium promovem a formação de Hz da mesma forma que a β-

hematina purificada (Dorn et al., 1995). Portanto, duas hipóteses principais foram primeiramente

levantadas: a primeira considerou que a formação de Hz era dependente de HRPs e a segunda que

ela é dependente de lipídeos. Entretanto, diversas evidências começaram a questionar o

envolvimento das HRPs na formação de Hz (Egan, 2008). Utilizando técnicas de

imunofluorescência, mostrou-se que 97% da HRPII localiza-se nas hemácias, enquanto apenas

3% é localizado no vacúolo digestivo onde ocorre a formação de Hz (Papalexis et al., 2001;

Akompong et al., 2002). Alem disso, Pandey e colaboradores mostraram que a formação de Hz

na presença unicamente de HRPII, não era rápida o suficiente para a detoxificação do heme na

forma de Hz no parasito da malária, sugerindo que a presença de lipídeos é realmente

fundamental neste processo (Pandey et al., 2003). Entretanto, o argumento mais convincente

contra o papel de HRPs no processo de formação de Hz foi obtido com parasitos suprimidos para

os genes que codificam a HRPII e a HRPIII (Noland et al., 2003). Os parasitos cuja expressão

dos genes HRP foi suprimida são ainda assim capazes de produzir Hz (Apud Egan, 2008). Em

1999, Lynn e colaboradores mostraram que não as histidinas, mas sim os resíduos de ácido

aspártico das HRPs estão envolvidos na ligação de heme em pHs próximos aos do vacúolo

digestivo do Plasmodium, o que torna estes aminoácidos e não as histidinas importantes para a

formação de Hz (Lynn et al., 1999). Dorn e colaboradores também mostraram que a atividade de

formação de Hz presente no vacúolo digestivo do Plasmodium falciparum era resistente a

aquecimento e a tratamentos com proteinases (Dorn et al., 1995, Dorn et al., 1998) indicando que

16

mecanismos de autocatálise poderiam ser responsáveis pela produção dos cristais de Hz não

sendo necessário então a participação de nenhuma enzima neste processo (Dorn et al., 1995).

Com relação aos lipídeos, os estudos de Fitch e de Dorn mostraram que a cristalização do heme

estimulada por uma série de lipídeos, ácidos graxos e detergentes resultou na rápida formação de

Hz (Dorn et al., 1998; Fitch et al., 1999). A partir destes estudos, o papel dos lipídeos no

processo de formação de Hz passou a ser considerado com maior ênfase. Bendrat e colaboradores

descobriram que frações lipídicas purificadas do conteúdo do vacúolo digestivo do Plasmodium

também eram capazes de promover a cristalização de heme sob a forma de Hz (Bendrat et al.,

1995).

Em outros organismos hematófagos, tais como o inseto Rhodnius prolixus e o helminto

Schistosoma mansoni os lipídeos parecem estar de alguma forma envolvidos no processo de

cristalização de heme. Neste contesto, os dados do nosso laboratório demonstraram o

envolvimento das MPMV na cristalização de heme em R. prolixus (Oliveira et al., 2000a).

Curiosamente, foi observado a intima associação entre os cristais de Hz nascentes e as MPMV,

sugerindo que estas estruturas poderiam de alguma forma mediar a cristalização de heme

(Oliveira et al., 2005; Oliveira et al., 2007; Silva et al., 2007). Aparentemente, o componente

responsável pela formação de Hz no intestino de R. prolixus encontra-se na MPMV, é termo-

sensível (Oliveira et al., 2000a) e correlaciona-se com a atividade de alfa-glicosidade, uma

enzima marcadora das MPMV (Silva et al., 2007). No caso do S. mansoni, também foi

demonstrado pelo nosso grupo que a formação de Hz pode ser mediada por extratos totais de

parasitos, pela própria Hz isolada dos vermes e ainda por extratos lipídicos totais (Olliveira et al.,

2004). Estudos mais detalhados acerca do processo de formação de Hz em S. mansoni mostraram

a participação de gotículas lipídicas presentes no lúmen intestinal deste parasito (Soares et al.,

2007) (Figura 9). Curiosamente, a iniciação do processo de cristalização parece ocorrer na

17

superfície das gotículas lipídicas, indicando que a presença de interfaces hidrofílico-hidrofóbicas

parece ser determinante para a formação de Hz neste parasito.

Figura 9: Microscopia eletrônica de transmissão de corte transversal do intestino de fêmeas

adultas de S. mansoni. Gotículas lipídicas associadas aos cristais de Hz em diferentes etapas do

processo de cristalização, indicado pelos números. 1- gotícula lipídica com poucos cristais até 5 –

gotícula lipídica preenchida de cristais de Hz. (Obtido de Soares et al., 2007).

Recentemente Egan e colaboradores demonstraram que a água e o heme formam

espontaneamente um complexo em meio aquoso que depende da interação do grupamento

carboxila com o átomo central de ferro do heme (de Villiers et al., 2007). Eles demonstraram que

a formação de Hz ocorre através da solubilização do heme, onde a interação de dois dímeros de

heme rapidamente forma Hz pela interação da carga negativa do grupo propionato de uma

molécula de heme com a carga positiva do ferro central de outro heme e vice versa. Entretanto,

esses dímeros requerem o deslocamento da molécula de água axial da fase oposta da porfirina, e

concomitantemente ocorre a formação de uma ligação ferro - propionato para o aparecimento de

um dímero de Hz. Na presença de água este dímero precursor torna-se instável, já que o grupo

propionato desloca-se rapidamente e se afasta do ferro central, permitindo então a sua interação

18

com as moléculas de água. A remoção das moléculas de água axiais é facilitada pela presença de

outros ligantes como o acetato no meio da reação, permitindo o aumento da solubilidade do heme

em condições ácidas (Ncozaki e Egan, 2001).

Figura 10: Porcentagem de conversão do heme em Hz na presença de uma camada

aquosa/lipídica. Após 5 minutos de incubação da amostra com heme em pH 4,8 a 370C na

presença desta camada aquosa/lipídica formada por diferentes lipídeos a porcentagem de

conversão foi mensurada. Siglas: MMG - monomiristoilglicerol; MOG - monooleilglicerol;

DMG - 1,3- dimiristoilglicerol; DOG - 1,3-dioleoilglicerol; TOG - triglicerideo trioleilglicerol;

DOPE – Fosfoglicerídeo 1,2-dioleil-glicerol-3-fosfoetanolamina; DMPC - 1,2-dimiristoil-glicerol

- 3-fosfocolina; DOPC - 1,2-dioleoil-glicerol-3-fosfocolina; DPPC - 1,2-dipalmitoil-glicerol-3-

fosfocolina; OGP - n-octil-b-D-glucopiranoside e CHL - colesterol (Obtido de Egan et al., 2006).

Neste sentido, partindo-se das observações da íntima relação entre os cristais de Hz e

estruturas com ambientes hidrofóbicos e de que os lipídeos são catalisadores da formação de Hz,

vários trabalhos in vitro vêm sendo realizados no intuito de se estudar a interface água-lipídeo. Já

é bem conhecido que a formação espontânea de Hz é favorecida em temperatura fisiológica

(280C em R. prolixus e 370C em S. mansoni) e baixa força iônica, obtida na ausência de altas

19

concentrações de acetato (4,5M) (Dorn et al., 1998). No ano de 2007, Pisciotta e colaboradores

publicaram um trabalho mostrando pela primeira vez que a Hz localizada dentro da vacúolo

digestivo do P. falciparum é completamente encapsulada por corpúsculos lipídicos compostos

tanto por lipídeos neutros como por monoacilglicerois (Pisciotta et al., 2007). Os primeiros

estudos sobre esses lipídeos revelaram que monopalmitoilglicerol é um catalisador expressivo da

formação de Hz in vitro (Dorn et al., 1998; Fitch et al., 1999). Em paralelo aos trabalhos de

formação de Hz nos organismos hematófagos, um estudo biomimético de formação de β-

hematina demonstrou de que forma os lipídeos poderiam promover a cristalização de heme,

dando suporte aos estudos realizados com os animais (Egan et al., 2006; Pisciotta et al., 2007;

Soares et al., 2007). Estes estudos biomiméticos envolveram a presença de solventes orgânicos

(octanol ou pentanol) de forma a simular um ambiente lipídico e soluções aquosas ácidas de

modo a tentar gerar uma interface hidrofílico-hidrofóbico com características similares a uma

bicamada fosfolipídica ou a uma gota lipídica. (Egan et al., 2006) (Figura 10). O sistema

montado para observar a cristalização de heme na interface álcool-água em meio aquoso foi

capaz de formar Hz, mas sem a presença dos solventes orgânicos ela não foi observada (Egan et

al., 2006). Uma outra maneira mais fiel de mimetizar um sistema biológico foi realizada por este

mesmo grupo utilizando lipídeos dissolvidos em metanol/acetona na superfície da solução

aquosa. Este sistema foi capaz de produzir Hz rapidamente após a aplicação de heme nesta

interface (Egan et al., 2006).

20

Figura 11: Microscopia eletrônica de varredura dos cristais de heme. Os materiais isolados de S.

mansoni (A), β-hematina (B), R. prolixus (C) e Plasmodium falciparum (D). (Obtidos de

Sullivan et al., 2002; Oliveira et al., 2005).

Apesar de todas estas semelhanças observadas no processo de formação de Hz, a

localização e morfologia do cristal de heme exibem grandes diferenças entre os diversos

organismos hematófagos, como o P. falciparum, o R. prolixus e o S. mansoni. No parasito da

malaria, a digestão da Hb e a formação de Hz ocorrem intracelularmente, no interior do vacúolo

digestivo (Goldberg et al., 1990). Já no inseto e no helminto, esses processos ocorrem

extracelularmente na luz do intestino destes organismos. Existem também diferenças quanto à

morfologia dos cristais formados nesses organismos: no Plasmodium eles apresentam superfícies

lisas idênticas aos de β-hematina (Bohle et al., 1997). Já no R. prolixus e no S. mansoni, os

cristais são esféricos e ovais, compostos de unidades regulares (Oliveira et al., 2005) (Figura 11).

Entretanto, a estrutura molecular dos cristais em todos estes organismos é idêntica e apresentam a

D

B

C

A

100 nm

21

mesma estrutura, exibindo padrões idênticos (Oliveira et al., 2005) (Figura 12). Especula-se que

as diferenças morfológicas destes cristais podem ser resultado de distintas condições de

crescimento (Oliveira et al., 2005), já que, diferentemente dos outros organismos, no Plasmodium

ela ocorre intracelularmente. Entretanto, sabe-se que as menores faces do cristal apresentam

sempre um processo de crescimento mais rápido do que as faces maiores (Buller et al., 2002).

Figura 12: Padrões de Difração de raios-X dos cristais de heme isolados de S. mansoni, R.

prolixus e β-hematina. (Obtido de Oliveira et al., 2005).

1.4) As drogas quinolínicas

A malária é a doença parasitária tropical que mais mata no mundo, afetando entre 300 e

500 milhões de pessoas ao ano, sendo responsável por aproximadamente 1 milhão de óbitos,

sendo metade destes ocorridos com crianças de até 5 anos (WHO, 2007a). Embora quase um

terço da população mundial esteja sob risco de exposição à doença, cerca de 90% das infecções e

22

mortes ocorrem na África sub-saariana (Trigg e Wemsdorfer, 1999), onde, segundo dados da

Organização Mundial da Saúde, uma criança morre de malária a cada 30 segundos (WHO, 2007).

Entretanto, mesmo sendo um dos maiores problemas de saúde pública nos países tropicais, por

ser uma doença que atinge as populações mais pobres e em áreas igualmente pobres, a malária é

uma doença negligenciada, seja pela ausência de políticas publicas de saúde seja por desinteresse

econômico das indústrias farmacêuticas em pesquisar novos medicamentos.

A malária, que é causada por protozoários do gênero Plasmodium é transmitida pela

picada de fêmeas do mosquito do gênero Anopheles e atinge os seres humanos desde a

antiguidade. A primeira droga antimalárica utilizada para o tratamento desta doença foi a quinina,

descoberta nas florestas úmidas do Peru e do Equador e extraída da casca de uma planta chamada

Cinchona. Os missionários Jesuítas da América do Sul estudaram as propriedades terapêuticas

dessa planta e no século XVII a quinina foi levada para a Europa e Índia, onde foi amplamente

usada no tratamento da malária (Egan et al., 1999). Inúmeras outras drogas antimaláricas foram

desde então descobertas e utilizadas, e estas podem ser divididas em três grupos: as derivadas de

enxofre, representadas pela dapsona e sulfadiazina; as derivadas de endoperóxidos, representadas

pela artemisinina e a artemether e o terceiro grupo que inclui as drogas quinolinicas (Figura 13)

(O’ Neill et al., 1998). Este último, sub-grupo divide-se ainda em três outros grupos: (i) as 4-

aminoquinolinas e acridinas, como a cloroquina, amodiaquina e quinacrina; (ii) os derivados de

metanóis de quinolina que incluem a quinina, quinidina e mefloquina e por último (iii) as 8-

aminoquinolinas representadas pela primaquina e pamaquina (Egan, 2001). O grupo das drogas

quinolínicas tem sido o mais utilizado como antimaláricos, tanto no tratamento quanto na

profilaxia. Entretanto, ao longo dos anos diversas espécies de Plasmodium adquiriram grande

resistência a algumas dessas drogas, como é o caso da cloroquina e da quinina (Figura 13), que

apesar disto ainda estão em uso (O´Neill et al., 1998). Por esse motivo, é freqüente o uso de

23

coquetéis de vários destes fármacos, pois há parasitos resistentes a qualquer uma destas drogas

quando usadas isoladamente. A resistência torna a cura difícil e cara e por isso, existe uma grande

demanda para a descoberta de novas drogas antimaláricas, que substituam aquelas que

selecionaram cepas de Plasmodium já resistentes.

Cloroquina Quinina

Figura 13: Algumas das drogas quinolínicas utilizadas como antimaláricos e inibidoras da

formação de Hz. (Obtidas de O´Neill et al., 1998).

Apesar dos efeitos terapêuticos destas drogas sobre o Plasmodium já serem bastante

conhecidas (O’ Neill et al., 1998), o seu mecanismo exato de ação ainda é bastante controverso

na literatura. As hipóteses mais aceitas podem ser divididas em duas vertentes: os efeitos no

vacúolo digestivo do parasito e os que ocorrem fora desta organela (Egan, 2001). As hipóteses

extra-vacuolares incluem a ligação de quinolinas ao DNA do Plasmodium (Parker e Irving,

1952), a inibição do metabolismo de poliaminas (Konigk et al., 1981) e a inibição da síntese

protéica desse parasito (Suriola e Padmanaban, 1991). Com relação aos efeitos intra-vacuolares

as 4-aminoquinolinas, pelo fato de serem bases fracas, podem acumular-se em compartimentos

ácidos, como é o caso do vacúolo digestivo do Plasmodium (Egan, 2003). Este acúmulo gera

diversas conseqüências ao parasito, como o aumento do pH no vacúolo (Homewood et al., 1972),

24

inibição da atividade de proteases (Gyang et al., 1982) e lípases (Ginsburg e krugliak, 1992)

nesta organela, ocorrendo ainda a interação das drogas com o heme, tanto na forma dimérica

quanto com o cristal de Hz, levando a inibição do crescimento deste (Sullivan et al., 2006; Egan,

2006). Entretanto, a hipótese mais bem aceita e estudada na literatura propõe que as drogas

quinolínicas, interagem com o heme no vacúolo digestivo formando um complexo que inibe a

formação de Hz (Egan, 2008) (Figura 14). Essa hipótese foi levantada pela primeira vez na

década de 60 por Cohen e colaboradores (Cohen et al., 1964). Hoje já é bem estabelecido na

literatura que o heme é o alvo molecular da cloroquina e de outras 4-aminoquinolinas (Chou,

1980; Dorn et al., 1998; Vippagunta et al., 2000), mas como esta associação exerce seus efeitos

antimaláricos é ainda controverso (Egan, 2001). Evidências que suportam esta hipótese mostram

que existe uma forte correlação entre a capacidade das 4-aminoquinolinas inibirem a formação de

Hz e a atividade antimalárica dos mesmos (Egan e Ncozaki., 2005). O primeiro mecanismo de

ação proposto para as 4-aminoquinolinas sobre a formação de Hz sugeriu que estas drogas

inibiriam uma possível ‘heme polimerase’ responsável pela formação de Hz (Slater e Cerami,

1992). Entretanto, diversos trabalhos posteriores mostraram que várias 4-aminoquinolinas eram

capazes de inibir o processo de formação de Hz na ausência de qualquer tipo de proteína do

parasito (Dorn et al., 1995; Dorn et al., 1998; Egan et al., 1994; Egan et al., 1999; Sullivan et al.,

1996b; Sullivan et al., 1998). Atualmente postula-se que formação de um complexo entre as 4-

aminoquinolinas e o heme previne a incorporação deste ultimo ao cristal de Hz (Figura 14). Em

virtude disto, acredita-se que ocorra um aumento dos níveis de heme livre ou de heme associado

a 4-aminoquinolinas no interior do vacúolo digestivo, que leva o parasito a morte, seja pela

geração de radicais livres (Sugioka e Suzuki, 1991) seja pela interação do heme com membranas

biológicas, potencializando dessa forma os efeitos tóxicos desta porfirina (Orjih et al., 1981).

Evidências experimentais abtidas pelo grupo de Egan demontram o aumento dos níveis de ferro

25

no cristal de parasitos tratados com cloroquina (dados não publicados). Uma outra hipótese

também considerada propõe que as 4-aminoquinolinas interagem com a superfície das faces do

cristal (Sullivan et al., 1996; Dorn et al., 1998), influenciando sua morfologia e impedindo seu

crescimento (Egan e Ncokazi, 2005). Por fim, estudos sobre o mecanismo de inibição da síntese

de Hz pelas 4-aminoquinolinas sugerem que os complexos formados por essas drogas e o heme

bloqueiam a extensão do cristal de Hz através da captação das moléculas de heme, evitando desta

forma a cristalização de novas moléculas, resultando num aumento dos níveis de heme livre e por

conseguinte resultando num severo dano celular (Ridley, 1996; Sullivan et al., 1998; Graça-

Souza et al., 2006). Sendo assim, as 4-aminoquinolinas podem ser consideradas como inibidores

da cristalização de heme (Egan, 2001). No entanto, a participação de ROS no processo de morte

dos parasitos tratados com cloroquina parece ser mínima ou até mesmo ausente, uma vez que

mesmo em baixas concentrações de oxigênio (menos de 1%) estas drogas ainda assim são

efetivas contra o Plasmodium (Monti et al., 2002).

Figura 14: Modelo proposto para ilustrar o mecanismo pelo qual a cloroquina interage com o

heme e inibe a formação de Hz (Obtido de Dorn et al., 1998).

26

Como observado no Plasmodium, a formação de Hz em Rhodnius e Schistosoma também

é inibida por cloroquina, tanto in vitro como in vivo (Oliveira et al., 2000a, Oliveira et al., 2004).

No caso do Schistosoma mansoni, as drogas não só causam uma drástica redução da viabilidade

dos parasitos mas também uma redução do conteúdo de Hz nos vermes, bem como uma forte

redução do número de ovos do parasito depositados no fígado (Oliveira et al., 2004). No caso do

Rhodnius prolixus, a alimentação com sangue enriquecido com cloroquina resultou numa drástica

redução da formação de Hz no intestino (Figura 15), resultando num grande aumento dos níveis

de heme na hemolinfa e por fim numa elevada peroxidação lipídica neste fluido (Oliveira et al.,

2000a).

Figura 15: Inibição da formação de Hz por cloroquina in vivo. Fêmeas adultas de R. prolixus

foram alimentadas com sangue suplementado com diferentes concentrações de cloroquina. Após

4 dias a quantidade de Hz presente no intestino foi medida. (Obtido de Oliveira et al., 2000a).

27

2) objetivos:

Objetivo geral:

Esta tese teve como objetivo investigar os mecanismos envolvidos na cristalização de

heme química e biologicamente, utilizando o inseto Rhodnius prolixus como modelo de estudo.

Objetivos específicos:

• Observar a cristalização espontânea de heme influenciada pela polaridade do meio de reação.

• Estudar componentes do intestino de R. Prolixus envolvidos na cristalização de heme.

• Analisar a inibição da formação de Hemozoína no intestino de R. prolixus por diferentes

drogas quinolínicas.

28

3) Material e métodos:

3.1) Animais

Para a realização deste trabalho, foram utilizadas fêmeas adultas de Rhodnius prolixus de

primeira ou terceira alimentação, 4 ou 10 dias após o repasto sanguíneo. Estes insetos foram

mantidos em uma colônia a 280C e 80 % de umidade relativa, no Laboratório de Bioquímica de

Insetos coordenado pelo Professor Hatisaburo Masuda no Instituto de Bioquímica Médica

(IBqM) da UFRJ. Os insetos foram alimentados com sangue de coelho mantidos no biotério do

IBqM da UFRJ.

3.2) Obtenção de intestino total de R. Prolixus

Dez dias após alimentação, fêmeas adultas de primeira alimentação foram dissecadas para

a remoção do intestino total, o que compreende o intestino e o conteúdo intestinal. Os órgãos

coletados foram mantidos a 40C em um tubo Falcon com PBS, pH 7,4 e Coquetel Inibidor de

Protease de uso geral (Sigma P 2714), composto de AEBSF 2 mM, EDTA 1 mM, Bestatina 130

µM, E-64 14 µM, leupeptina 1 mM e Aprotinina 0,3 µM diluído 30X. As amostras foram

mantidas no gelo durante todo o processo de dissecção, sendo então estocadas a -800C para

análises posteriores.

3.3) Dosagem de proteína

A concentração de proteína das amostras de intestino de R. prolixus, assim como das

frações obtidas através do gradiente de sacarose, foi determinada pelo método de Lowry (Lowry

et al., 1951), sendo utilizado como padrão albumina sérica bovina.

29

3.4) Fracionamento do intestino total

Cerca de 600 µL de intestino total de fêmeas adultas de R. prolixus foi aplicado no topo

de um gradiente descontínuo de sacarose formado pelas concentrações de 20 % (p/v), 40 % (p/v)

e 60 % (p/v) diluídos em PBS pH 7,4 utilizando 3,6 mL de cada concentração. Em seguida, as

amostras foram centrifugadas a 16,000 x g (Optimo LE 80K, Beckman) no rotor SW40 por 1

hora a 40C. As cinco frações produzidas (Topo, 1, 2, 3 e 4) foram coletadas e guardadas a –800C

para análises futuras.

3.5) Extração de lipídeos totais

O método utilizado para extração e quantificação de lipídeos foi baseado no artigo de

Bligh & Dyer, 1959. Ao volume de cerca de 1 mL de conteúdo intestinal de fêmeas adultas de R.

prolixus foi acrescentado 2,5 mL de metanol e 1,25 mL de clorofórmio. O tubo de extração

lipídica foi agitado a cada 5 minutos durante 2 horas e em seguida centrifugado a 1000 x g por 20

minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e mantido a 40C. Ao precipitado,

foi adicionado mais 2,5 mL de metanol, 1,25 mL de clorofórmio e 1 mL de água Mili Q. Esta

preparação foi novamente agitada a cada 5 minutos por 1 hora e posteriormente centrifugada a

1000 x g por 20 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi coletado e armazenado

junto com a alíquota anterior. A este sobrenadante foi então adicionado 1,25 mL de clorofórmio e

1,25 mL de água Mili Q, agitado e então centrifugado a 1000 x g por 20 minutos em temperatura

ambiente. A fase orgânica foi coletada, seca em N2 e a quantidade de lipídeos foi medida

gravimetricamente (Bligh & Dyer, 1959). Os lipídeos secos foram então mantidos a –800C para

futura utilização, quando eram ressuspendidos em clorofórmio:metanol (1:1).

30

3.6) Síntese de hemozoína in vitro

Quantidades conhecidas de proteína (50 a 100 µg), lipídeos (20 a 100 µg) ou ainda Hz

(equivalentes a 20 nmoles de heme) foram incubados com tampão acetato de sódio 0,5 M pH 4,8

e hemina (Sigma) (diluída em NaOH 0,1 N) nas concentrações de 50 ou 100 µM, obtendo um

volume final de 1 mL de reação. Os tubos foram então agitados e mantidos por até 24 horas em

um banho a 280C (Oliveira et al., 2000). Após a incubação foi realizado o processo de extração

da Hz produzida na reação.

3.7) Extração de Hemozoína

A hemozoína obtida das incubações in vitro ou isolada do intestino total de R. prolixus foi

extraída através de um processo de solubilização diferencial baseado no método de purificação de

Hz descrito por Sulivan et al. (1996). A amostra foi inicialmente centrifugada a 15000 x g por 10

minutos a 250C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi então lavado três vezes com 1

mL de tampão bicarbonato de sódio 0,1 M + SDS 2,5 % (p/v) pH 9,1 para retirada de heme livre

não cristalizado, lipídeos e proteínas solúveis da amostra. Na presença deste tampão, a amostra

foi agitada por 10 minutos e centrifugada como descrito anteriormente. Após cada centrifugação

o tampão era trocado. Posteriormente à última lavagem, foi adicionado 1 mL de água Mili Q ao

precipitado que então foi novamente agitado e centrifugado por duas vezes.

3.8) Dosagem de Hemozoína

Para a dosagem de Hz do intestino de R. prolixus ou de suas frações, uma pequena

quantidade de amostra equivalente a 1mg de proteína foi solubilizada em 1 mL de NaOH 0,1 N,

condição na qual o cristal de Hz é completamente dissociado produzindo moléculas de heme no

31

estado monomérico (Fitch e Kanjanagulpa, 1987). No caso da Hz obtida através de síntese in

vitro, todo o precipitado de Hz obtido foi solubilizado em NaOH 0,1 N. A quantificação de heme

(derivado da Hz) nas amostras foi então determinada por leitura da absorção de luz a 400 nm em

um espectrofotômetro GBC UV-920. Foi utilizado como referência uma curva padrão de hemina

(sigma) produzida em NaOH 0,1 N.

3.9) Dosagem de heme total

Para a dosagem de heme total do intestino de R. prolixus ou de suas frações, uma pequena

quantidade de amostra equivalente a 100 µg de proteína foi solubilizada em 1 mL de NaOH 0,1

N. A quantificação de heme nas amostras foi então determinada por leitura da absorção de luz a

400 nm em um espectrofotômetro GBC UV-920. Foi utilizado como referência uma curva padrão

de hemina (sigma) produzida em NaOH 0,1 N.

3.10) Análise por espectrofotometria das frações do gradiente de sacarose

Cerca de 100 µg de proteína das frações obtidas do gradiente em sacarose foram diluídas

em aproximadamente 1 mL de tampão acetato de sódio 0,5 M pH 4,8. A concentração de

sacarose foi normalizada em todas as frações e a amostra foi agitada por 10 minutos. Em seguida,

o espectro de absorção de luz entre os comprimentos de onda de 300 e 800 nm foram analisadas

no espectrofotômetro GBC UV-920 para a obtenção do espectro de absorção nessas condições.

3.11) Cinética da cristalização espontânea de heme in vitro catalisada por DMSO

A cinética de cristalização de heme na qual utilizou-se como catalisador o DMSO foi

realizada nos tempos de 0, 3, 7, 10, 12, 15, 18, 20, e 24 horas. Para tal, foram utilizadas cinco

32

concentrações distintas de DMSO (0 %, 4,6 %, 8,3 %, 15,1 % ou 27,7 %) (v/v) em tampão

acetato de sódio 0,5 M, com pH ajustado em todas as amostras para 4,8 com ácido acético 0,5 M.

As amostras foram incubadas com hemina 100 µM no banho a 280C e nas horas determinadas

eram retiradas e congeladas para posterior extração e dosagem de Hz, como descrito previamente.

3.12) Solubilização do heme em DMSO

Cinco concentrações de DMSO (0%, 4,6%, 8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v) foram

incubadas com hemina em tampão acetato de sódio 0,5 M, pH 4,8, com pH ajustado com ácido

acético 0,5 M. As amostras foram agitadas por 10 minutos e centrifugadas a 10000 x g, ou não,

por mais 10 minutos. A concentração de hemina utilizada foi de 10 µM para as amostras não

centrifugadas e de 100 µM para as que foram centrifugadas. O espectro de absorção de luz entre

300 a 800 nm foi então obtido para estas amostras através da análise no espectrofotômetro GBC

UV-920. O grau de solubilização de cada amostra foi estimado através da razão entre a absorção

da banda de Soret (em torno de 400 nm) e a banda Q (em torno de 600 nm), onde valores desta

razão próximos de 1.0 inferem uma baixa solubilidade do heme. (Huy et al., 2007).

3.13) Ensaio in vivo com Azadiractina

Fêmeas adultas de 3ª alimentação de R. prolixus foram alimentadas com sangue contendo

1 µg/mL de Azadiractina diluída em etanol. Um controle foi realizado alimentando os insetos

com sangue acrescentado de etanol na concentração final de 0.02% (v/v). Quatro dias após a

alimentação, os insetos foram dissecados e os seguintes parâmetros foram analisados: níveis de

Hz e heme total no intestino e níveis de heme na hemolinfa do inseto.

33

3.14) Síntese de hemozoína in vitro em placa – método para o teste das drogas quinolínicas

O efeito de novas drogas quinolínicas antimaláricas sobre a formação de Hz in vitro foi

avaliado de acordo com o protocolo de Ncokazi e Egan, 2005, especialmente descrito para a

varredura de compostos num ensaio de placa de 96 poços. O ensaio utilizou o tampão acetato de

sódio 0,5 M pH 4,8, 50 µg de proteína de intestino total de R. prolixus, 100 µM de heme e 10 µM

de diferentes drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente pelo Professor Timothy J. Egan na

Universidade da Cidade do Cabo, África do Sul, com o qual nosso grupo mantem colaboração.

As amostras foram incubadas em uma placa de fundo cônico num volume final de 170 µL por 24

horas a 280C em uma estufa com umidade controlada. Após as 24 horas de incubação, foi

adicionado ao meio um volume de piridina para a concentração final de 30 % (v/v) em Hepes 20

mM pH 7,5. Em seguida, a placa foi incubada por mais 30 minutos e 38 µL do sobrenadante foi

transferido para uma outra placa de fundo reto com mais 250 µL de piridina 30 % (v/v). A

quantificação de heme nas amostras foi então determinada por leitura da absorção de luz a 400

nm em um espectrofotômetro GBC UV-920 utilizando-se como referência uma curva padrão de

hemina (sigma) preparada em NaOH 0,1 N.

3.15) Tratamento do intestino total de R. prolixus com condroitinase

Previamente à incubação do intestino total de R. prolixus com heme para avaliar a

formação de Hz, uma alíquota correspondente à 100 µg de proteína deste material foi incubada

por 8 horas a 280C com 100 µL da enzima condroitinase ABC liase 1 UI/mL diluída no tampão

Etilenodiamino 50 mM e Ácido Acético 82 mM pH 4,8. Após este pré-tratamento, a amostra foi

centrifugada e o pellet ressuspendido em acetato de sódio 0,5 M, pH 4,8. Em seguida, realizamos

34

a incubação em placa de 96 poços, com 50 µM de heme de acordo com o método descrito no

item anterior.

35

4) Resultados:

4.1) A cristalização espontânea de heme in vitro é regulada pela polaridade do meio de

reação

Trabalhos anteriores da literatura levantaram a hipótese de que a etapa limitante do

processo de cristalização de heme, sob o ponto de vista termodinâmico, é a solubilização do heme

em meio ácido (Egan e Ncozaki, 2001; Huy et al., 2007). Sendo assim, catalisadores deste

processo devem ser capazes de aumentar a solubilidade do heme em condições ácidas. Alguns

solventes como o etanol e o ácido benzóico aumentam a velocidade de formação de β-hematina e

essa formação se assemelha a vários processo de biomineralização como ocorre na formação de

hidroxiapatita nos ossos de organismos vertebrados (Egan et al., 2001; Bauer e Akkami, 2002).

Neste sentido, os trabalhos de Egan e colaboradores também indicam que a lenta conversão de

precipitados amorfos de heme em meio ácido em β-hematina ocorre graças a solubilização do

heme supostamente através da remoção da molécula de água axial ligada ao átomo de ferro

central do heme pelo acetato presente no meio de reação (Egan et al., 2001).

No intuito de entender melhor o processo de associação de heme e levando em

consideração as informações da literatura, investigamos se a diminuição da polaridade do meio

de reação, pela adição de compostos como DMSO ou polietilenoglicol (PEG) 6000 poderia afetar

a cristalização espontânea de heme (Figura 16). Podemos observar que os dois grupos

experimentais (DMSO e PEG 6000) foram bastante eficientes em estimular a cristalização

espontânea de heme in vitro. No caso das reações induzidas por DMSO, observamos o perfil

sigmóide da curva. Esta é característica do processo de formação de Hz com duas faces bem

36

discriminadas, sendo uma de indução em que ocorre o processo de nucleação seguida de uma

rápida fase de reação em que ocorre o crescimento do cristal. Após esta fase, o processo torna-se

constante, como já demonstrado por Egan et al., 2001. O aumento da velocidade do crescimento

do cristal ocorre provavelmente pela diminuição da quantidade de moléculas de água disponíveis

no meio reacional capazes de se associarem ao heme através de uma das valências axiais do

átomo de ferro central e também pela reação autocatalítica promovida pelos cristais de heme

nascentes.

Figura 16: Efeito temporal do DMSO e PEG 6000 sobre a cristalização espontânea de heme. As

amostras continham 100 µM de hemina na presença de PEG 1% (azul) ou DMSO 5% (vermelho)

em tampão acetato de sódio 0,5 M pH 4,8 e foram incubados à 280C por até 24 dias. A curva

induzida por heme (em preto) representa o controle da reação.

Baseado nestes resultados, nossa próxima abordagem foi investigar o efeito da redução da

polaridade do meio de reação sobre a solubilidade do heme in vitro em condições ácidas. Para

isso, cinco concentrações distintas de DMSO (0%, 4,6%, 8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v) foram

incubadas na presença de 10 µM ou 100 µM de hemina em tampão acetato de sódio 0,5 M de

modo a avaliarmos se a redução da polaridade do meio de reação favoreceria a solubilização do

0 2 4 6 80

10

20

30

40

50

heme+NaAc

heme+NaAc+DMSO 5%

heme+NaAc+PEG 1%

Tempo (dias)

Hz

(n

mo

les

de

he

me

)

37

heme em meio ácido. O pH das soluções foi corrigido para 4,8, pH ótimo para a formação de Hz

e próximo aos valores de pH encontrados no intestino de R. prolixus, de modo a evitar-se

qualquer efeito do pH sobre a reação de cristalização. Nas figuras 17A e 17B podemos observar

os espectros de absorção de luz do heme entre 300 nm e 800 nm nas amostras não centrifugadas

(figura 17A) e centrifugadas (figura 17B).Observa-se claramente na figura 17A um aumento da

absorção de luz próximo a 400 nm (banda de Soret) com o aumento da concentração de DMSO.

Este dado sugere por si só um aumento da solubilidade do heme em condições de menor

polaridade do meio. No entanto, de modo a confirmarmos se de fato a presença de DMSO

promoveu a solubilização do heme em condições ácidas, incubamos heme (100 µM) em

diferentes concentrações de DMSO por 10 minutos e posteriormente centrifugamos estas

amostras por 10 minutos, coletando o sobrenadante que foi posteriormente analisado por

espectrofotometria de absorção de luz. Podemos observar na figura 17B que, de fato, o aumento

da concentração de DMSO da mesma forma que as amostras não centrifugadas na figura 17A,

resultou num aumento da absorção da banda de Soret (em torno de 400 nm), indicando

fortemente o aumento da solubilidade do heme em condições ácidas. Uma outra forma de avaliar

a solubilidade do heme consiste na medida da razão da absorção de luz da banda de Soret (em

torno de 400 nm) e a banda Q (em torno de 640 nm). A razão dos valores de absorção destas duas

bandas fornece indiretamente o grau de solubilidade de cada amostra. Quanto maior for esta

razão mais solúvel o heme está no meio de reação da amostra analisada. Sendo assim, as figuras

17C e 17D mostram que o aumento da concentração de DMSO leva a um aumento dos valores da

razão Soret/Q, tanto nas amostras não centrifugadas (figura 17C) e centrifugadas (figura 17D). As

linhas em vermelho representam uma regressão linear. Portanto, observando-se a figura 17, pode-

38

se concluir que o aumento da concentração de DMSO em meio ácido proporciona uma maior

solubilidade do heme.

(A) (B)

(C) (D)

Figura 17: A redução da polaridade do meio com diferentes concentrações de DMSO aumenta a

solubilização do heme em meio ácido. (A e B) espectros de absorção do heme entre 300 nm e 800

nm obtidos em tampão acetato de sódio 0,5 M e concentrações distintas de DMSO (0%, 4,6%,

8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v). A e C – amostras contendo 10 µM de hemina e não centrifugadas;

B e D – amostras contendo 100 µM de hemina e centrifugadas por 10 minutos a 10000 x g. (C e

D) Grau de solubilização do heme nas amostras medidas indiretamente através da razão de

absorção entre as bandas de Soret e a banda Q. A banda de Soret foi medida a 400 nm e a banda

Q em torno de 640 nm. As linhas em vermelho representam uma regressão linear.

DMSO 0%

DMSO 4,6%

DMSO 8,3%

DMSO 15,1%

DMSO 27,7%

0 5 10 15 20 25 300

5

10

15

20

Concentração de DMSO (%) (v/v)

Razão

So

ret/

Q

0 5 10 15 20 25 300

5

10

15

20

Concentração de DMSO (%) (v/v)

Razão

So

ret/

Q

0 5 10 15 20 25 304

6

8

10

12

Concentração de DMSO (%) (v/v)

Ra

zão

So

ret/

Q

0 5 10 15 20 25 304

6

8

10

12

Concentração de DMSO (%) (v/v)

Ra

zão

So

ret/

Q

300 400 500 600 700 8000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

nm

Ab

s.

360 380 400 4200.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

nm

Abs

.

300 400 500 600 700 8000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

nm

Ab

s.

360 380 400 4200.18

0.20

0.22

0.24

0.26

0.28

nm

Abs

.

300 400 500 600 700 8000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

nmA

bs.

360 380 400 4200.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15

0.18

nm

Abs

.

300 400 500 600 700 8000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

nmA

bs.

360 380 400 4200.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15

0.18

nm

Abs

.

39

De modo a verificar se o aumento da solubilidade do heme de fato promoveria a

cristalização espontânea do heme, incubamos heme (100 µM) em tampão acetato de sódio 0,5 M

nas mesmas concentrações de DMSO utilizadas nos experimentos da figura 17. Como podemos

observar na figura 18A, a dosagem de Hz de cada reação revelou que o aumento da concentração

de DMSO no meio de reação acelerou o processo de cristalização espontânea de heme. De modo

a tentarmos estabelecer uma relação entre a solubilização inicial e a posterior cristalização do

heme realizamos uma regressão linear entre os valores da razão da banda de Soret/banda Q das

amostras obtidas na figura 17A e a quantidade de Hz produzida em 24 horas de incubação nas 5

diferentes concentrações de DMSO, obtida da figura 18A. A figura 18B mostra que de fato a

cristalização espontânea do heme in vitro, depende fortemente da solubilização prévia desta

molécula em meio ácido (R2 = 0,9121).

40

(A)

(B)

Figura 18: A redução da polaridade do meio acelera a cristalização espontânea do heme in vitro.

(A) Cinética de cristalização espontânea de heme com 100 µM de hemina em tampão acetato de

sódio 0,5 M e concentrações distintas de DMSO (0%, 4,6%, 8,3%, 15,1% ou 27,7%) (v/v). Os

tempos de incubação a 280C utilizados na cinética foram de zero hora, 3 horas, 7 horas, 12 horas,

15 horas, 18 horas, 20 horas e 24 horas. (B) Correlação da quantidade de Hz produzida em 24

horas na cinética de cristalização espontânea de heme nas cinco concentrações de DMSO com a

razão entre as bandas de Soret e da banda Q obtida pela análise da figura 17A. A regressão linear

do gráfico fornece um valor de R2 = 0,9121 e P<0,0001. Esta medida nos fornece uma estimativa

da solubilidade do heme nas distintas concentrações de DMSO.

0 4 8 12 16 20 240

2

4

6

0%DMSO

4.6% DMSO

8.3% DMSO

15.1% DMSO

27.7% DMSO

10

30

50

70

Tempo (horas)

Hz

(n

mo

les

he

me

)

0 10 20 30 40 50 604

6

8

10

12

R2=0,9121P<0,0001

Hz (nmoles Heme)

Ra

zã

o S

ore

t/Q

41

4.2) Quantificação de alguns componentes do homogeneizado total do intestino de R.

prolixus

Já é conhecido na literatura que tanto as MPMV presentes no intestino de R. prolixus

(Oliveira et al., 1999; Oliveira et al 2000; Silva et al., 2007) quanto as gotículas lipídicas

presentes no intestino do S. mansoni desempenham um papel central no processo de cristalização

de heme (Soares et al., 2007). Sendo assim, é possível imaginar que os lipídeos presentes na

membrana intestinal do inseto R. prolixus devam exercer um papel catalítico importante no

processo de cristalização de heme neste organismo. Com o intuito de se identificar qual ou quais

substâncias presentes no intestino de R. prolixus estão envolvidos no processo de cristalização de

heme, determinamos os níveis de heme, Hz, proteínas totais e lipídeos no homogenato total do

intestino deste inseto. Estes valores são mostrados na tabela 1, com os respectivos valores de

média, desvio padrão e número de repetições (N) de cada dosagem.

Média Desvio Padrão N

Heme (nmoles/intestino) 638,37 123,72 6

Hemozoina (nmoles/intestino) 196,53 14,67 6

Proteína (mg/intestino) 1,44 0,20 7

Lipídeo (µµµµg/intestino) 204,03 34,63 3

Tabela 1: Dosagem de componentes do intestino de Rhodnius prolixus. Valores de média, desvio

padrão e número de repetição (N) de diversos componentes do intestino de fêmeas adultas de R.

prolixus de 1ª alimentação, 10 dias após alimentação.

42

4.3) A formação de Hz é induzida por diferentes componentes do intestino de R. prolixus

Fêmeas adultas de Rhodnius prolixus de 1ª alimentação, 10 dias após alimentação, foram

dissecadas, e o intestino total retirado. De modo a investigarmos a contribuição de alguns destes

componentes envolvidos na cristalização de heme no intestino de R. prolixus, realizamos ensaios

de formação de Hz in vitro induzido por lipídeos totais e Hz isolados do intestino de R. prolixus.

Podemos observar na figura 19, que a incubação de 40 µg de lipídeos com heme é capaz de

formar Hz de maneira bastante eficiente. Inesperadamente, constatamos que a capacidade destes

lipídeos em catalizar a formação de Hz é termo-sensível, uma vez que o aquecimento por 30

minutos a 1000C destas amostras levou a uma redução significativa da atividade responsável pela

cristalização de heme (teste t P<0,001).

Figura 19: Lipídeos isolados do intestino de R. prolixus são capazes de promover a cristalização

do heme in vitro de forma termo-sensível. 40 µg de lipídeos totais isolados do homogeneizado

total do intestino de R. prolixus foram previamente fervidos ou não por 30 minutos a 1000C e

incubados em tampão acetato de sódio 0,5 M na presença de 100 µM de heme por 24 horas a

280C. O resultado do experimento acima segue uma distribuição normal e assim significância

estatística foi avaliada pelo Teste T obtendo-se valores de P<0,001#. (n = 10).

Lipídeo 40 µµµµg Lipídeo 40 µµµµg fervido 0

4

8

12

16

20

24

28

Hz (n

mo

les

de

he

me

)

#

43

Uma outra abordagem foi realizada para estudar o processo de autocatálise já conhecido

na literatura, onde cristais de β-hematina são capazes de aumentar de tamanho na presença

unicamente de hemina. Para isto, dois experimentos foram realizados: no primeiro, diferentes

concentrações de cristais de Hz sintética (β-hematina) foram incubadas unicamente na presença

de hemina. Da mesma forma, diferentes concentrações de cristais de Hz previamente purificados

do intestino de R. prolixus foram incubadas com hemina. Como esperado, na figura 20 podemos

observar que ambos foram capazes de induzir significativamente (ANOVA e Tukey P<0,01# e

P<0,05*) a formação de cristais de heme por autocatálise. Portanto, pode-se concluir que a Hz

isolada de R. prolixus é capaz de estender os cristais por autocatálise a partir de um pequeno

cristal já formado.

44

(A) (B)

Figura 20: Cristais de Hz são capazes de induzir a cristalização de heme por autocatálise. (A)

Diferentes concentrações (1, 2, 5, 10 e 20 µM) de cristais de Hz sintética (β-hematina) foram

incubadas na presença de hemina. (B) Diferentes concentrações (1, 2, 5, 10 e 50 µM) de Hz

previamente isolada do intestino de R. prolixus foram incubadas com hemina. A quantidade de β-

hematina ou Hz adicionadas ao meio de reação foi subtraída do valor total medido. A

significância estatística dos experimentos acima foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a

posteriori obtendo-se valores de P<0,05* (na figura A 1 vs 20 e na figura B 10 vs 50) e valores

de P<0,01# (na figura B 50 vs 1 ou 2 ou 5). (n=4).

Como observado nos primeiros resultados apresentados nesta tese, a cristalização

espontânea do heme in vitro depende fortemente da solubilização prévia desta molécula em meio

ácido. Para testarmos a solubilização do heme nas estruturas presentes no intestino do R. prolixus,

realizamos um experimento no intuito de se observar a capacidade de Hz previamente extraída do

conteúdo intestinal deste inseto em interferir com a solubilidade do heme em meio ácido. Para

isto, incubamos diferentes quantidades de Hz (50, 100 e 200 µmoles) com 50 µM de heme em

tampão acetato de sódio 0,5 M e avaliamos a razão entre as absorções das bandas de Soret e da

banda Q já descrita anteriormente. Podemos observar na figura 21 que na presença de Hz ocorre

uma redução da razão Soret/Q nas amostras de heme incubadas com Hz, que nos leva a sugestão

# # #

*

1 2 5 10 500

3

6

9

12

Hz (µµµµM)

Hz (

nm

ole

sd

e h

em

e)

1 2 5 10 200.0

0.5

1.0

1.5

2.0

ββββ-hematina (µµµµM)

Hz (

nm

ole

sd

e h

em

e)

*

45

de que a presença de cristais de heme promovem a redução da solubilidade desta molécula em

condições ácidas. Sendo assim, o cristal de heme previamente formado no intestino parece

desempenhar uma função importante neste processo.

Figura 21: A Hz é capaz de reduzir a solubilidade do heme in vitro. Quantidades diferentes de

Hz (50, 100 e 200 nmoles) foram incubadas com 50 µM de heme em tampão acetato de sódio 0,5

M e por espectrofotometria foi medida a razão banda de Soret / Q. A significância estatística do

experimento acima foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valores de

P<0,001# (D vs A ou B ou C) e valores de P<0,01* (A vs C). (n = 6).

4.4) O tratamento com azadiractina diminui os níveis de heme intestinais e o eleva na

hemolinfa

A azadiractina é uma droga conhecida por causar a desorganização da ultraestrutura das

células do epitélio intestinal e inibir a formação da MPMV no intestino de R. prolixus (Garcia et

al., 1991; Nogueira et al., 1997; Gonzales et al., 1998). Sendo assim, nossa próxima abordagem

foi estudar o efeito desta droga na cristalização de heme no intestino de R. prolixus, pois,

A B C D

Hemozoína nmoles 50 100 200 ----Heme nmoles 50 50 50 50

0

1

2

3

4

5

Razão

So

ret/

Q

# # #

*

46

partindo-se do princípio que esta droga inibe a formação de MPMV e esta é importante no

processo de cristalização de heme, talvez esta droga conseqüentemente poderia inibir a formação

de Hz no intestino deste inseto. Para isso, fêmeas adultas de 3ª alimentação foram alimentadas

com sangue suplementado com azadiractina na concentração final de 1 µg/mL. Quatro dias após

a alimentação três parâmetros foram analisados: a quantidade de Hz no intestino do inseto

(Figura 22A), a quantidade de heme total neste mesmo tecido (figura 22B) e a quantidade de

heme circulante na hemolinfa (figura 22C). Analisado-se a figura 22 podemos constatar que esta

droga tende a diminuir a quantidade de Hz presente no intestino do inseto, diminui

significativamente (P<0,0019#) a quantidade de heme total nesse tecido e por sua vez aumenta

significativamente (P<0,0118*) a quantidade de heme circulante na hemolinfa, provavelmente

causada pela diminuição deste no intestino.

47

(A) (B)

(C)

Figura 22: A azadiractina interfere na cristalização de heme no inseto R. prolixus. Fêmeas

adultas de 3ª alimentação foram alimentadas com sangue suplementado com azadiractina na

concentração final de 1 µg / mL. Quatro dias após a alimentação os insetos foram dissecados. (A)

Dosagem da quantidade de Hz no intestino do inseto. (B) Dosagem da quantidade de heme total

no mesmo tecido. O resultado deste experimento segue uma distribuição normal e assim a

significância estatística foi avaliada pelo Teste T obtendo-se valores de P<0,0019#. (C) Dosagem

da quantidade de heme circulante na hemolinfa. Dosagem da quantidade de heme total no mesmo

tecido. O resultado deste experimento segue uma distribuição normal e assim significância

estatística foi avaliada pelo Teste T obtendo-se valores de P<0,0118*.

Controle Azadiractina0

100

200

300

Hz

(n

mo

les

de

he

me

)

0

250

500

750

1000

He

me

(n

mo

les

)Controle Azadiractina

#

0

20

40

60

80

He

me

(µµ µµ

M)

Controle Azadiractina

*

48

4.5) Glicosaminoglicanos sulfatados presentes no intestino de Rhodnius prolixus estão

envolvidos no processo de cristalização de heme

Entre os anos de 2001 e 2004, um grupo de pesquisadores do Instituto de Bioquímica

Médica da UFRJ liderado pelo professor Luiz Cláudio observou a presença de

Glicosaminoglicanos (GAGs), um açúcar sulfatado, em vários tecidos do Rhodnius prolixus

(Costa-Filho, et al., 2001; Costa-Filho, et al., 2004). Especificamente no intestino deste inseto,

foi detectada a presença de grandes quantidades do GAG condroitin sulfato (CS) (Costa-Filho, et

al., 2004). A função biológica deste GAG ainda é desconhecida neste tecido. Sendo assim,

testamos se o CS poderia de alguma forma estar envolvido no processo de formação de Hz no

intestino de R. prolixus. Para isto, realizamos um experimento em colaboração com o grupo do

Professor Luiz Cláudio que consistiu na incubação do homogeneizado total do intestino de R.

prolixus com a enzima condroitinase de modo a remover os resíduos de CS desta amostra.

Posteriormente, incubamos por 24 horas este mesmo material na presença de 50 µM de heme

para observar a atividade de cristalização de heme. Podemos observar na figura 23 que o

tratamento com condroitinase diminuiu significativamente a capacidade do intestino em

cristalizar o heme (ANOVA e Tukey P<0,001#). Sendo assim, podemos dizer que a presença de

CS no intestino de R. prolixus parece desempenhar um papel na cristalização de heme no

intestino de Rhodnius prolixus pois, apesar de haver a formação de Hz mesmo na ausência deste

GAG, esta ocorre em menores quantidades.

49

Figura 23: Condroitin sulfato desempenha um papel importante sobre a formação de Hz induzida

pelo homogeneizado total de intestino do R. prolixus. Foi realizado um pré-tratamento do

intestino com esta enzima e em seguida uma incubação de 24 horas deste mesmo material na

presença de 50 µM de heme. Como controle, realizamos um pré-tratamento do intestino apenas

com o tampão da condroitinase e um outro controle que não foi pré-tratado. A significância

estatística do experimento acima foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-

se valor de P<0,001# (controles vs condroitinase). (n = 8).

4.6) O grau de solubilidade do heme depende da densidade das frações do homogeneizado

total do intestino de Rhodnius prolixus

Como observamos que diferentes estruturas do intestino de Rhodnius prolixus eram

capazes de cristalizar o heme de maneiras distintas, nosso próximo passo foi realizar o

fracionamento do homogeneizado total do intestino deste inseto, de modo a determinar os níveis

de heme total, Hz e proteína em cada fração do gradiente. Este fracionamento foi realizado com a

aplicação deste homogeneizado em um gradiente descontinuo de sacarose nas concentrações de

20%, 40% e 60 % (v/v) diluídos em PBS pH 7,4. Na figura 24A podemos observar que após a

centrifugação do gradiente, o homogeneizado do intestino total foi separado em cinco frações

distintas (Topo, 1, 2, 3 e 4). Estas cinco frações foram coletadas e a concentração de proteína

Controle Condroitinase Controle0

1

2

3

4

5

Branco: pre-tratadosCinza: não pre-tratado

Hz (

nm

ole

sd

e h

em

e)

#

50

aferida apresentando valores semelhantes nas frações de 1 a 4 e uma concentração um pouco

maior na fração de topo.

Uma vez de posse das frações isoladas, buscamos identificar se as moléculas de heme

presentes nestas frações poderiam se encontrar em distintos estados de cristalização. A figura

24B mostra o espectro de absorção de luz visível entre os comprimentos de onda de 300 a 800

nm das cinco frações do gradiente de sacarose e, de maneira geral, todas elas possuem um

espectro muito semelhante ao do heme exibindo uma banda de Soret entre 390 nm e 450 nm. Na

figura 24C podemos observar espectros típicos de heme e o cristal de heme sintético β-hematina,

obtido de Oliveira et al., 2007. Comparando-se estas duas figuras, podemos constatar que os

espectros de absorção de luz visível das frações de menor densidade (topo e 1) são mais

semelhantes ao espectro de heme, com banda de Soret em torno de 390 nm, enquanto as frações

mais densas (2, 3 e 4) apresentam um espectro típico de Hz, com picos de absorção

característicos em 450 nm e 660 nm. Assim, concluímos que as frações de maior densidade

(frações 2, 3 e 4) possuem a maior parte do heme sob a forma de Hz. De fato, dados preliminares

mostram que o conteúdo de Hz é maior quanto maior forem as densidades das frações (dado não

mostrado). Com estas mesmas frações, buscamos entender o grau de solubilidade das moléculas

de heme presentes em cada fração. Como demonstrado na figura 24D, as moléculas de heme

presentes nas frações de menor densidade (Topo e 1) encontram-se significativamente (ANOVA

e Tukey P<0,001#) num maior grau de solubilidade comparado com as frações de maior

densidade.

51

(A) (B)

(C) (D)

Figura 24: As frações de menor densidade obtidas no gradiente de sacarose do fracionamento do

homogeneizado intestinal do R. prolixus possuem espectro típico de heme enquanto que as

frações mais densas apresentam características típicas de Hz. (A) Fracionamento do

homogeneizado de intestinal do R. prolixus em um gradiente descontínuo de sacarose nas

concentrações de 20%, 40% e 60 % (v/v) diluídos em PBS pH 7,4. (B) Espectro de absorção das

cinco frações do gradiente de sacarose. (C) Espectros de heme (cinza) e de b-hematina (preto)

obtido de Oliveira et al., 2006. (D) Solubilidade do heme em cada uma das cinco frações do

gradiente. A significância estatística deste último experimento foi avaliada pelos testes ANOVA

e Tukey a posteriori obtendo-se valor de P<0,001# (Topo ou Fração 1 vs Fração 2 ou 3 ou 4) e

P<0,05* (Fração 2 vs Fração 3). (n = 4).

300 400 500 600 700 8000.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Fração 1

Fração 2

Fração 3

Fração 4

Topo

nm

Ab

s.

Topo

Fraçã

o 1

Fraçã

o 2

Fraçã

o 3

Fraçã

o 4

0

1

2

3

Ra

zã

o S

ore

t/Q

# # #

#*

Topo Fração 1

Fração 2

Fração 3

Fração 4

52

4.7) As frações de baixa densidade do gradiente de sacarose são menos eficientes na

cristalização de heme do que as frações de maior densidade

Após o estudo detalhado de cada fração formada no gradiente descontinuo de sacarose

realizado com o homogeneizado total do intestino de R. prolixus, fomos observar a atividade de

cada uma dessas frações em formar Hz. Para isto, inicialmente realizamos uma cinética de

formação de Hz nos tempos de zero, 12, 18 e 24 horas. A figura 25A mostra esta cinética na

presença de 50 µg de proteína de cada fração com 100 µM de heme a 280C. Nela podemos

observar que todas as frações são capazes de promover a cristalização do heme com diferentes

eficiências. Na figura 25B temos o resultado dessa incubação no período de 24 horas, onde

observamos que as frações de maior densidade (2, 3 e 4), frações estas que apresentam menor

capacidade em solubilizar o heme, são as frações que, curiosamente, cristalizaram uma maior

quantidade de heme. Houve um aumento significativo (ANOVA e Tukey P<0,001#, P<0,01*, e

P<0,05+) das frações 2, 3 e 4 (em torno de 7 a 13 vezes) em produzir Hz quando comparado com

as frações de topo e 1. Ao realizarmos uma correlação entre o estudo de solubilização do heme

nestas frações (razão soret/Q mostrada na figura 24D) com os valores da quantidade de Hz

absoluta formada por cada uma das cinco frações em 24 horas de incubação (figura 25B),

observamos, na figura 25C que esta correlação é negativa, ou seja, quanto maior o estado de

solubilização do heme, menor é a quantidade de heme cristalizado (R = 0,95836, P < 0,0037).

Sendo assim, ao contrário do que ocorre in vitro com o uso de DMSO, estes experimentos

mostraram que, aparentemente, o maior grau de solubilização do heme em meio ácido parece ser

menos relevante para a eficiência catalítica do processo de cristalização de heme no inseto

Rhodnius prolixus. Sabendo que os cristais de heme são capazes de promover a extensão dos

53

mesmos através de autocatálise, podemos sugerir que a maior quantidade de Hz produzida pelas

frações de maior densidade possa ser gerada essencialmente por autocatálise induzida pela Hz

pré-existente nestas frações, como mostrado na figura 24 B.

54

(A)

(B)

(C)

Figura 25: As frações de maior densidade do intestino de R. prolixus apresentam maior

capacidade de formação de Hz. (A) Cinética de formação de Hz na presença de 50 µg de proteína

de cada fração incubada em tampão acetato de sódio 0,5 M com 100 µM de heme a 280C. (B)

Incubação no período de 24 horas. A significância estatística deste experimento foi avaliada pelos

0 4 8 12 16 20 240

5

10

15

20

25 Topo

Fração 1

Fração 2

Fração 3

Fração 4

Intestino Total

Tempo (horas)

Hz (

nm

ole

sd

e h

em

e)

Topo

Fraçã

o 1

Fraçã

o 2

Fraçã

o 3

Fraçã

o 4

0

3

6

9

12

15

Hz (n

mo

les

de

he

me

)

#

*

+#

0 4 8 12 160

1

2

3

4

R = 0,9583

P = 0,0037

Hz (nmoles de Heme)

Raz

ão

So

ret/

Q

0 4 8 12 160

1

2

3

4

R = 0,9583

P = 0,0037

Hz (nmoles de Heme)

Raz

ão

So

ret/

Q

55

testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valor de P<0,001# (Topo ou Fração 1 vs Fração 3

ou 4) P<0,01* (Topo ou Fração 1 vs Fração 2) e P<0,05+ (Fração 2 vs Fração 4). (C) Correlação

da quantidade de Hz formada pelas frações em 24 horas de incubação (figura 25B) com o poder

de solubilização do heme presente nas mesmas, obtido através da razão da banda de Soret / banda

Q, da figura 24D.

4.8) Drogas quinolínicas inibem a cristalização de heme em R. prolixus

Já é bem conhecido na literatura o papel de drogas quinolínicas como inibidoras do

processo de cristalização de heme (Cohen et al., 1964; Chau, 1980; Dorn et al., 1998; Vippagunta

et al., 2000). Nosso grupo já demonstrou que a formação de Hz no intestino de R. prolixus

também é inibida por cloroquina em experimentos realizados in vivo (Oliveira et al., 2000a).

Levando em consideração estas informações, decidimos investigar se a cristalização de heme no

intestino de R. prolixus pode ser inibida por outras drogas antimaláricas. Nossa primeira

abordagem foi investigar se a cristalização de heme induzida por lipídeos intestinais de R.

prolixus também seria afetada por duas diferentes drogas quinolinicas: a Cloroquina e a Quinina.

Para isto, incubamos 40 µg de lipídeos totais extraídos do intestino de R. Prolixus por 24 horas a

280C na presença de 100 µM de hemina comercial e testamos o poder de inibição destas duas

drogas nas concentrações de 50 µM, 100 µM e 300 µM. A figura 26 mostra que a Cloroquina foi

capaz de inibir significativamente (ANOVA e Tukey P<0,001#) a cristalização de heme já na

menor concentração testada, de 50 µM, mas o composto Quinina foi capaz de abolir

completamente (ANOVA e Tukey P<0,001#) a formação de Hz. Portanto, podemos concluir que

a capacidade de cristalização do heme apresentada pelos lipídeos intestinais de R. prolixus é

56

sensível a drogas quinolínicas, sendo que a quinina exerce um efeito mais potente do que a

cloroquina.

Figura 26: Efeito de drogas quinolínicas na formação de Hz in vitro induzida pelos lipídeos

intestinais de R. prolixus. 40 µg de lipídeos foram incubadas por 24 horas a 280C na presença de

100 µM de heme e 50 µM, 100 µM ou 300 µM de Cloroquina (CLO) ou Quinina (QUI). A

significância estatística deste experimento foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori

obtendo-se valor de P<0,001# (Lipídeo 40 µg vs CLO 50 µM ou CLO 100 µM ou CLO 300 µM

ou QUI 50 µM ou QUI 100 µM ou QUI 300 µM). (n = 6).

Paralelo ao estudo in vitro, realizamos também testes in vivo no barbeiro com algumas

drogas quinolínicas. Para tal, fêmeas adultas de 2ª alimentação foram alimentadas com sangue

suplementado com sete concentrações diferentes de quinidina: 50 µM, 70 µM, 100 µM, 150 µM,

200 µM, 250 µM e 500 µM. Observando-se a figura 27 vemos que a suplementação da droga em

concentrações a partir de 100 µM da droga é capaz de inibir significativamente (ANOVA e

Tukey P<0,001#) a formação de Hz no intestino deste inseto. Outras drogas antimaláricas como a

Lipíd

eo 4

0 µµµµg Mµµµµ

50

Mµµµµ

100

Mµµµµ

300

Mµµµµ50

Mµµµµ

100

Mµµµµ

300

0

4

8

12

16

20

24

28H

z (

nm

ole

sd

e h

em

e)

CLO QUI

# # #

# # #

57

quinina e clotrimazol também foram testados e ambos apresentaram um potente efeito inibitório

sobre a cristalização de heme in vivo (dados não mostrados).

Figura 27: Efeito da quinidina na formação de Hz in vivo em R. prolixus. Fêmeas adultas de 2ª

alimentação foram alimentadas com sangue suplementado com 50 µM, 70 µM, 100 µM, 150 µM,

200 µM, 250 µM e 500 µM da droga. Quatro dias após a alimentação os insetos foram dissecados

e foi realizada dosagem da quantidade de Hz no intestino do inseto. A significância estatística

deste experimento foi avaliada pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valor de

P<0,001# (Controle ou 50 µM ou 70 µM ou 100 µM vs 150 µM ou 200 µM ou 250 µM ou 500

µM). (n = 8).

Em colaboração com o grupo do Professor Timothy Egan do Departamento de Química

da Universidade da Cidade do Cabo (África do Sul) avaliamos o efeito de novas drogas

quinolínicas sintetizadas quimicamente por este grupo na formação de Hz induzida por

homogeneizados de intestino de R. prolixus. Este mesmo grupo na África do Sul também

desenvolveu uma nova metodologia para o teste da atividade de inibição da formação de Hz in

vitro destas drogas (Ncokazi e Egan, 2005). Este método tornou o teste de potenciais drogas

cont

role

50µµµµM

70µµµµM

100µµµµM

150µµµµM

200µµµµM

250µµµµM

500µµµµM

0

25

50

75

100

125H

z (

nm

ole

sd

e h

em

e/

inte

sti

no

)

# # # # #

58

antimaláricas bem mais rápido, podendo ser realizado em série, como descrito no item 3.14 do

materiais e métodos desta tese. Sendo assim, testamos o poder de inibição da cristalização de

heme de quatro destes novos compostos sintéticos: compostos 1, 3, 7 e 10 (Figura 28A). Todos

os compostos foram utilizados na concentração de 10 µM e a Quinina 10 µM foi utilizada como

controle do novo método, pois já é bem conhecida a capacidade desta droga em inibir a formação

de Hz. Assim, utilizamos 50 µg de proteína do homogeneizado total do intestino de R. prolixus

que foi incubado por 24 horas a 280C na presença de 100 µM de heme e de diferentes drogas.

Podemos observar na figura 28B que os compostos 1 e 10 foram significativamente (ANOVA e

Tukey P<0,001#) tão eficazes quanto a quinina, inibindo 100% a cristalização de heme. A droga 7

apresentou menor inibição sobre a cristalização do heme. Entretanto, a droga 3 não foi capaz de

diminuir a formação de Hz induzida pelo intestino do inseto. Pretendemos dar continuidade a

caracterização da relação estrutura-função destas drogas sobre a cristalização de heme em

Rhodnius prolixus. Tais estudos serão desenvolvidos em colaboração com o grupo de Professor

Egan.

59

(A) (B)

Figura 28: Novas drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente são eficientes na inibição da

formação de Hz in vitro induzida pelo homogeneizado total do intestino de R. prolixus. (A)

Estrutura molecular dos quatro novos compostos quinolínicos (compostos 1, 3, 7 e 10). (B)

Inibição da formação de Hz pelas novas drogas quinolínicas. Homogeneizado total do intestino

de R. prolixus (50 µg de proteína) foi incubado por 24 horas a 280C na presença de 100 µM de

heme e 10 µM de diferentes drogas. A significância estatística deste experimento foi avaliada

pelos testes ANOVA e Tukey a posteriori obtendo-se valor de P<0,001# (Intestino + heme vs

Quinina ou Composto 1 ou Composto 10). (n = 6).

Composto 1N

NH2

ClN

NH

Cl

OH

Composto 3

N

NH

Cl

N

CH3

CH3

Composto 7

N

NH

Cl

N

CH3

CH3

N

NH

Cl

N

CH3

CH3

N

NH

Cl

N

CH3

CH3

N

NH

Cl

N

CH3

CH3

Composto 10

Inte

stin

o + H

eme

Quin

ina

Com

post

o 1

Com

post

o 3

Com

post

o 7

Com

post

o 10

0

1

2

3

4

5

6

Hz (

nm

ole

sd

e h

em

e)

# # #

60

5) Discussão:

Os organismos hematófagos, ao ingerirem a cada alimentação grandes quantidades de

sangue e ao digerirem especialmente a hemoglobina liberam em seu trato digestivo grandes

quantidades de heme, que, na forma livre, é extremamente tóxico e danoso aos sistemas

biológicos (Schmitt et al., 1993, Ryter et al., 2000). Por este motivo, ao longo da evolução estes

organismos desenvolveram uma série de mecanismos de defesa para a detoxificação do heme. No

inseto Rhodnius prolixus, já foi demonstrado que a detoxificação do heme ocorre basicamente

por três mecanismos distintos: através de uma proteína capaz de ligar o heme denominada RHBP

(Oliveira et al., 1995; Dansa-Petretski et al., 1995), através de uma enzima que degrada o heme,

denominada heme oxigenase (Paiva-Silva et al., 2006) e principalmente através de um agregado

cristalino de heme conhecido como Hemozoína (Oliveira et al., 1999). A formação deste cristal

de heme representa a primeira defesa antioxidante preventiva para este organismo (Oliveira et al.,

2002), sendo posteriormente liberado nas fezes do barbeiro. Este cristal de heme antes de ser

descoberto no Rhodnius prolixus foi descrito no parasito da Malária, o Plasmodium falciparum

(Slater et al., 1991). Posteriormente, nosso grupo demonstrou a presença deste mesmo cristal no

helminto Schistosoma mansoni (Oliveira et al., 2000b).

Já é bem conhecido o fato do heme ser extremamente insolúvel em meio ácido.

Entretanto, trabalhos mais recentes na literatura sugerem que a etapa limitante do processo de

cristalização do heme, sob o ponto de vista termodinâmico, é a solubilização desta molécula em

meio ácido (Egan e Ncozaki, 2001; Huy et al., 2007). Sendo assim, imaginamos que substâncias

capazes de solubilizar o heme em condições ácidas sejam potenciais catalisadores do processo de

formação de Hz. Egan e colaboradores acreditam que esta solubilização possa ser facilitada pela

61

remoção das moléculas de água axiais que encontram-se ligadas ao átomo de ferro central do

heme. Esta remoção ocorre na presença de outros ligantes como o acetato no meio de reação

(Egan et al., 2001; Ncozaki e Egan, 2001). Alguns trabalhos demonstram que determinados

solventes como o etanol e o ácido benzóico aumentam a velocidade de formação de Hz (Blauer e

Akkami, 2002; Huy et al., 2007), assim como diversos lipídeos (Egan et al., 2006). Portanto, a

cristalização de heme parece estar associada a ambientes hidrofóbicos. Sendo assim, decidimos

investigar se a diminuição da polaridade do meio reacional através do uso de solventes como o

DMSO ou polietilenoglicol (PEG) 6000 poderia afetar a cristalização espontânea de heme. De

fato, estes dois solventes aumentaram a velocidade de cristalização espontânea de heme na

ausência de qualquer catalisador (Figura 16). Este resultado sugere que a presença de um

ambiente de menor polaridade seja um pré-requisito importante para a formação de um cristal

sintético de Hz (β-hematina). Os resultados mostrados nas figuras 17 suportam as evidências

neste sentido. A análise desta figura indica que a redução da polaridade do meio pelo uso de

diferentes concentrações de DMSO proporciona um aumento da solubilidade do heme em

condições ácidas. Esses resultados corroboram os dados já mencionados de Egan e colaboradores

que mostraram que altas concentrações de acetato de sódio são também capazes de estimular a

formação de Hz (Egan et al., 2001). Ainda neste contexto, analisamos se este aumento da

solubilidade do heme em ambiente ácido e hidrofóbico estaria relacionado com a cristalização

desta molécula. Nós observamos que a redução da polaridade do meio de fato acelerou a

cristalização espontânea do heme in vitro (figura 18). Estes resultados estão de acordo com dados

da literatura, em que se sabe que a formação de Hz é estimulada na presença de álcool e lipídeos

(Huy et al., 2007; Egan et al., 2006), compostos estes que diminuem a polaridade do meio.

62

O intestino do inseto Rhodnius prolixus contém uma membrana que envolve todo o

epitélio intestinal. Esta membrana, chamada de Membrana Perimicrovilar (MPMV), rica em

lipídeos, está envolvida no processo de cristalização de heme (Oliveira et al., 1999; Oliveira et

al., 2000a; Oliveira et al., 2005). Trabalhos prévios da literatura têm demonstrado que o processo

de cristalização de heme em Plasmodium está associado a membranas do vacúolo digestivo deste

parasito (Hempelmann et al., 2003). Nosso grupo também já demonstrou que no lúmen intestinal

do helminto Shistosoma mansoni existem gotículas lipídicas (Oliveira et al., 2005) e que a

formação de Hz neste organismo ocorre na superfície destas gotículas (Soares et al., 2007).

Discute-se que, in vivo, a formação de Hz possa ocorrer por três maneiras distintas: por

autocatálise, induzida por lipídeos ou induzida por proteínas. Entretanto, não se sabe ainda qual o

principal mecanismo indutor para a formação de Hz no intestino de R. prolixus. O que já se sabe

é que um importante componente responsável pela formação de Hz neste inseto encontra-se na

MPMV (Oliveira et al., 2000a). Esta membrana apresenta seu desenvolvimento regulado pela

alimentação do inseto, e o seu pico de formação, medido através da atividade de uma enzima

marcadora da MPMV chamada alfa-glicosidade, correlaciona-se com o pico de formação do

cristal de Hz (Silva et al., 2007). Acreditamos que, assim como no Plasmodium e no Schistosoma

mansoni, os lipídeos presentes na MPMV do intestino deste inseto, estão intimamente

relacionados com a cristalização do heme. Nossos resultados mostram que, de fato, os lipídeos

isolados do intestino total de R. prolixus são capazes de promover a formação de Hz, de maneira

muito eficaz (figura 19). Entretanto, e de maneira inesperada, esta atividade de formação de Hz

demonstrada por estes lipídeos mostrou-se muito termo-sensível (figura 19). Dansa-Petretski e

colaboradores sugerem que proteínas isoladas da MPMV estejam envolvidas no processo de

formação de Hz no intestino deste inseto (Silva et al., 2007). Sendo assim, especulamos que o

fato de os lipídeos terem se mostrado termo-sensíveis se deva ou a contaminantes protéicos na

63

amostra ou que estes lipídeos envolvidos na cristalização de heme sejam lipoproteínas, sensíveis

a altas temperaturas. Pretendemos em breve elucidar esta dúvida através de quantificação de

proteínas totais nas frações de lipídeos para detectarmos possíveis contaminantes protéicos e

realizaremos também cromatografias de camada fina para analisarmos mais detalhadamente quais

os tipos de lipídeos presentes na MPMV deste inseto.

Como mencionado, um dos mecanismos que promovem a cristalização de heme é a

autocatálise, onde cristais de β-hematina (Hz sintética) são capazes de aumentar de tamanho na

presença unicamente de heme. Este mecanismo está presente no vacúolo digestivo do

Plasmodium falciparum (Dorn et al., 1995). No intuito de elucidarmos este conceito, estudamos

se este processo autocatalítico de formação de Hz estava presente no intestino de R. prolixus.

Nossos resultados indicam que, assim como a autocatálise que ocorre in vitro com a incubação de

β-hematina e heme (figura 20A), os cristais de Hz isolados do conteúdo intestinal de R. prolixus

são capazes de induzir a cristalização de heme por autocatálise (figura 20B). Portanto, nossos

resultados mostram que, no intestino deste inseto, ao menos dois processos distintos estão

envolvidos na cristalização de heme: a catálise induzida por lipídeos e a autocatálise.

Demonstramos no começo desta tese e já discutimos anteriormente, a importância da

solubilização do heme em meio ácido no processo de formação de Hz. Entretanto, este fato ainda

não havia sido estudado no intestino de Rhodnius prolixus. Com este intuito, observamos se a

presença de cristais de Hz previamente isolados do intestino deste inseto seriam capazes de

alterar as propriedades de solubilidade do heme in vitro. Na figura 21 podemos observar que

aparentemente os cristais de heme presentes no intestino do inseto promovem a redução da

solubilidade desta molécula em condições ácidas.

64

Como já mencionado, a MPMV está intimamente relacionada com a formação de Hz

(Oliveira et al., 2000a). De acordo com a literatura, o desenvolvimento completo desta membrana

no epitélio intestinal depende da distensão abdominal, de componentes do sangue, em especial a

hemoglobina, e de fatores humorais. Este último, ativa o sistema neuroendócrino, levando a

liberação dos hormônios protoracicotrópicos (PTTH) pelas células neurosecretoras do cérebro.

Estes hormônios por sua vez induzem a secreção de Ecdisona (Hormônio da muda) pelas

glândulas protorácicas, o que aumenta o crescimento do epitélio e conseqüentemente o

desenvolvimento da MPMV (Albuquerque-Cunha et al., 2005). O desenvolvimento desta

membrana pode ser inibido por um composto chamado de Azadiractina, o que leva inclusive a

alterações na capacidade de adesão do Tripanosoma cruzi ao intestino do inseto tratado com este

composto (Garcia, et al. 1989; Garcia et al., 1991; Nogueira et al., 1997; Gonzales et al., 1998).

Ao observarmos a figura 22, na qual os animais foram alimentados com sangue enriquecido com

Azadiractina, concluímos que a inibição da formação da MPMV tende a: diminuir a quantidade

de Hz presente no intestino deste inseto, diminui significativamente a quantidade de heme neste

mesmo tecido e aumenta a quantidade de heme presente na hemolinfa. Portanto, uma formação

deficiente da MPMV resulta em um aumento de heme circulante e é possível que este composto

afete também a digestão do sangue, talvez pela ausência da MPMV. Este dado indica que, de

fato, a formação de Hz no intestino de Rhodnius prolixus é dependente da presença das MPMV e

representa uma importante defesa antioxidante para este inseto, uma vez que a inibição deste

processo pode levar a um aumento dos níveis de heme circulante, e pode resultar em estresse

oxidativo para o animal (Oliveira et al., 2000a). Este resultado está de acordo com outros dados

do nosso grupo no qual insetos tratados com cloroquina, inibidora da cristalização de heme,

apresentaram uma forte inibição da formação de Hz no intestino e um maior grau de peroxidação

lipídica na hemolinfa (Oliveira et al., 2000a).

65

Em uma outra abordagem, estudamos se um composto presente no intestino do inseto

Rhodnius prolixus poderia estar envolvido na cristalização de heme. Estes compostos,

identificados como Glicosaminoglicanos (GAGs), foram identificados no R. prolixus, e mais

especificamente o GAG sulfatado condroitin sulfato (CS), foi localizado na MPMV do intestino

do inseto (Costa-Filho, et al., 2004). Entretanto, a função deste CS neste tecido ainda é

desconhecida. Neste sentido, tentamos observar se estes (GAGs), poderiam estar envolvidos no

processo de cristalização de heme. Nossos resultados demonstram que a ausência de CS, retirado

através do tratamento do intestino com a enzima condroitinase ABC, resultou em uma inibição na

formação de Hz neste tecido (figura 23). Portanto, podemos concluir que, aparentemente, o CS

presente no intestino de R. prolixus, GAG cujo papel fisiológico neste tecido é ainda

desconhecida (Costa-Filho, et al., 2004), pode estar envolvido de alguma maneira no processo de

cristalização de heme.

Após a observação de que diversos componentes do intestino de R. prolixus são capazes

de cristalizar o heme, realizamos, para uma melhor análise da natureza do conteúdo intestinal

deste inseto, um gradiente descontínuo de sacarose (figura 24A). Este gradiente resultou em cinco

frações distintas, assim como observado no gradiente do regurgitado total de fêmeas de

Shistosoma mansoni (Soares et al., 2007). O espectro de absorção de luz visível de todas as cinco

frações revelou que todas elas continham heme, já que apresentavam absorções características

entre 390 e 450 nm (banda de Soret) (figura 24B). Entretanto, as frações de menor densidade,

representadas pelas frações de topo e fração 1 exibiram um espectro similar ao do heme livre,

com banda de Soret próxima a 400 nm, enquanto as frações com maiores densidades,

representadas pelas frações 2, 3 e 4 exibiram um espectro típico de Hz, com banda de Soret em

torno de 450 nm além de um pico de absorção em torno de 650 nm. Estes espectros estão de

acordo com os espectros de heme e β-hematina (Hz sintética) observados em Oliveira et al., 2007

66

e representados na figura 24C. Este resultado também está de acordo com os espectros das

frações do gradiente do regurgitado total de fêmeas de Schistosoma mansoni (Soares et al., 2007).

Estas análises nos levam a concluir que, no intestino de R. prolixus, o heme encontra-se em

diferentes estágios de cristalização. Assim como realizado nos primeiros resultados desta tese,

estudamos também o grau de solubilidade do heme presente em cada uma das frações do

gradiente de sacarose. Ao observarmos a figura 24D podemos concluir que a solubilidade do

heme nas frações de maior densidade (frações 2, 3 e 4) é significativamente menor que nas

frações menos densas (frações de Topo e fração 1). A análise da solubilidade do heme foi medida

de forma indireta, através da razão da banda de Soret e da banda Q, assim como nos primeiros

resultados desta tese com o uso do DMSO (figura 17). Este resultado está de acordo com Huy e

colaboradores, já que este grupo mostrou que valores da razão destas duas bandas próximos a 1

refletem uma baixa solubilidade do heme (Huy et al., 2007).

Para o estudo mais detalhado de cada uma das cinco frações produzidas neste gradiente

descontínuo de sacarose com o conteúdo intestinal de R. prolixus, partimos para a observação da

capacidade de cada uma destas frações de cristalizar o heme. A análise de nossos resultados

apresentados na figura 25 indica que, surpreendentemente, as frações mais densas que

apresentam um menor grau de solubilidade do heme (frações 2, 3 e 4) tiveram uma maior

capacidade de cristalizar heme. Esta observação foi bastante inesperada e contradiz alguns

resultados da literatura. Nosso grupo já mostrou que, em S. mansoni, as frações menos densas de

um gradiente similar com o regurgitado total deste verme são as mais eficientes em cristalizar o

heme (Soares et al., 2007). Entretanto, as nossas frações mais densas são capazes de produzir

grandes quantidades de Hz, como demonstrado na figura 24. Os experimentos foram realizados

normalizando-se a quantidade de proteína, mas as quantidades de Hz e lipídeos totais presentes

em cada grupo experimental não foram normalizadas de grupo para grupo. Portanto, podemos

67

especular que este aumento da quantidade de cristal formado pelas frações mais densas pode ter

ocorrido em decorrência da maior quantidade de Hz presente nestas frações, o que poderia nos

indicar que o processo autocatalítico predomina em relação aos outros processos, levando a uma

maior produção de Hz. Experimentos controlando estes parâmetros serão realizados em breve. A

figura 25C ainda mostra que, nestas condições, as frações com maior capacidade em solubilizar o

heme são as menos eficientes em cristalizar esta molécula.

Uma outra abordagem realizada nesta tese diz respeito a drogas quinolínicas. Este grupo

de drogas vem sendo usado há centenas de anos no tratamento e profilaxia da Malária (Egan et

al., 2003). Entretanto, muitas espécies de Plasmodium apresentam resistência a várias destas

drogas, diminuindo a eficácia do tratamento (Egan, 2001). Existem fortes evidências sugerindo

que o efeito antimalárico das drogas quinolínicas depende da interação destas com o heme ou

com o cristal de Hz (Cohen et al., 1964; Egan, 2008), conseqüentemente resultando na inibição

da formação de Hz no vacúolo digestivo deste parasito, levando-o a morte.

Após a descoberta deste cristal de heme no intestino de R. Prolixus (Oliveira et al., 1999)

e posteriormente no helminto S. mansoni (Oliveira et al., 2000b) nosso grupo começou a

investigar o efeito da inibição da formação de Hz nestes organismos pelo uso de drogas

quinolínicas. Foi demonstrado que a interferência deste processo in vivo em S. mansoni através

do uso de cloroquina resultou em uma grande redução das manifestações clínicas da

esquistossomose (Oliveira et al., 2004). Resultados ainda não publicados do nosso grupo

mostram que tanto a quinina quanto a amodiaquina, duas outras drogas quinolínicas, inibiram o

processo de cristalização de heme induzido tanto pelo regurgitado total de fêmeas de S. mansoni

quanto pelos lipídeos extraídos deste regurgitado. Outros resultados ainda mostram que o

tratamento com quinina de camundongos infectados com S. mansoni leva a uma inibição do

processo de cristalização de heme nos vermes e a uma diminuição da parasitemia, com

68

diminuição do número de ovos no fígado e intestino do hospedeiro (Soares et al., dados não

publicados). Em estudos realizados com R. prolixus, nosso grupo já demonstrou que a

alimentação destes insetos com sangue enriquecido com cloroquina resultou em uma grande

inibição da formação de Hz no intestino e um conseqüente aumento da peroxidação lipídica na

hemolinfa do mesmo, em decorrência do aumento dos níveis de heme livre neste fluido (Oliveira

et al., 2000a).

Levando em conta o mencionado acima, decidimos investigar nesta tese o efeito de duas

drogas quinolínicas (cloroquina e quinina) no processo de formação de Hz induzido pelos

lipídeos totais extraídos do inseto Rhodnius prolixus. Como podemos observar na figura 26, as

duas drogas foram capazes de inibir a cristalização de heme in vitro, sendo que a quinina

mostrou-se mais potente que a cloroquina. Também realizamos experimentos in vivo, através da

alimentação destes insetos com sangue enriquecido com uma outra droga quinolínica: a

quinidina. Este experimento mostrou que, assim como a cloroquina (Oliveira et al., 2000a), esta

droga também é capaz de inibir a formação de Hz no intestino de R. prolixus de forma dose-

dependente (figura 27). Outros dados não mostrados nesta tese, utilizando outras drogas

antimaláricas como a quinina e clotrimazol, indicam que estas também são potentes inibidoras da

cristalização de heme in vivo. Todos estes resultados apresentados estão perfeitamente de acordo

com os dados da literatura expostos acima e reforçam o conceito de que as drogas quinolínicas

afetam a cristalização de heme.

Por fim, através de uma colaboração firmada com o grupo do professor Timothy Egan do

Departamento de Química da Universidade da Cidade do Cabo, África do Sul, começamos os

testes de novas drogas quinolínicas sintetizadas quimicamente por este grupo. Estas drogas

visam, no futuro, a substituição do uso das drogas quinolínicas antimaláricas no qual diversas

espécies de Plasmodium já apresentam resistência (O´Neill et al., 1998). Nossos resultados in

69

vitro já indicam que algumas destas drogas (compostos 1 e 10) inibem a formação de Hz induzida

pelo intestino de R. prolixus com a mesma eficiência que a quinina (figura 28).

Pela sua fácil manutenção e principalmente pela grande eficiência no processo de

cristalização de heme, o inseto Rhodnius prolixus representa um excelente modelo de estudo para

entendermos não apenas quais as moléculas que estão envolvidas no processo de formação de Hz

mas também o impacto da inibição da cristalização do heme na fisiologia deste inseto, vetor da

Doença de Chagas, uma doença endêmica na América Latina.

Já é bem conhecido na literatura a importância da manutenção dos níveis de heme para a

sobrevivência e proliferação da forma epimastigota do Trypanosoma cruzi no intestino de R.

prolixus e que este parasito utiliza o heme oriundo da alimentação de seu vetor para o seu

desenvolvimento (Lara et al., 2007). Por isso, acreditamos que a formação de Hz neste vetor

também esteja intimamente ligada à sobrevivência deste parasito, já que por este mecanismo os

níveis de heme livre são bem controlados, mantendo-se assim concentrações de heme adequadas

para o parasito. Experimentos neste sentido já foram iniciados.

Portanto, a partir dos resultados expostos nesta tese, podemos concluir que a cristalização

espontânea do heme é estimulada pela redução da polaridade do meio. Outros resultados indicam

que a importância da solubilidade do heme em meio ácido parece ser diferente nos diferentes

organismos que sintetizam Hz, assim como para a Hz produzida sinteticamente (β-hematina).

Além disso, no intestino de Rhodnius prolixus, o heme encontra-se em diferentes estados de

cristalização e a formação de Hz neste inseto parece ser induzida por pelo menos dois

mecanismos distintos: por autocatálise ou por lipídeos presentes no intestino. A presença de

GAGs sulfatados localizados neste tecido parece também ser importante no processo de

cristalização de heme. Podemos concluir ainda que diferentes drogas quinolínicas (comerciais e

70

novas drogas sintéticas) são capazes de inibir a formação de Hz no intestino de Rhodnius

prolixus.

71

6) Referências Bibliográficas:

1. Aft, R.L., Mueller, G.C. (1983). Hemin - mediated DNA strand scission. J.Biol. Chem. 258, 12069-12072.

2. Aft, R.L., Mueller, G.C. (1984). Hemin - mediated oxidative degradation of proteins. J.Biol. Chem. 259, 301- 305.

3. Akompong T, Kadekoppala M, Harrison T, Oksman A, Goldberg DE, Fujioka H, Samuel BU, Sullivan D, Haldar K. (2002). Trans expression of a Plasmodium falciparum histidine-rich protein II (HRPII) reveals sorting of soluble proteins in the periphery of the host erythrocyte and disrupts transport to the malarial food vacuole. J Biol Chem. 277, 28923-33.

4. Albuquerque-Cunha, J.M., Mello, C.B., Garcia, E.S., Azambuja, P., Souza, W., Gonzalez, M.S., Nogueira, N.F. (2005). Effect of blood components, abdominal distension, and ecdysone therapy on the ultrastructural organization of posterior midgut epithelial cells and perimicrovillar membranes in Rhodnius prolixus. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 99, 815-22.

5. Aldana, E., Lizano, E., Valderrama, A. (2001). Effects of human blood feeding on the fecundity, fertility and biological cycle of Rhodnius prolixus (Hemiptera:Reduviidae). Rev. Biol. Trop. 49:689-691.

6. Bendrat, K., Berger, B.J., Cerami, A. (1995). Haem polymerization in malaria. Nature. 378, 138.

7. Blauer, G., Akkawi, M. (2002). Alcohol-water as a novel medium for beta-hematin preparation. Arch Biochem Biophys 398, 7-11.

8. Bligh, E.G., Dyer, W.J. (1959) A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-913.

9. Billingsley et al. (1999). Em: Biology of the insect midgut. Lehane, M.J. e Billingsley P.F.

72

10. Bogitsh BJ, Davenport GR. (1991). The in vitro effects of various lysosomotropic agents on the gut of Schistosoma mansoni. J Parasitol. 77, 187-93.

11. Bohle, D.S., Dinnebier, R.E., Madsen, S.K., Stephens, P.W. (1997). Characterization of the products of the heme detoxification pathway in malarial late trophozoites by X-ray diffraction. J Biol Chem. 272, 713-716.

12. Brown, W.H. (1911). Malarial pigment (so called melanin): its nature and mode of production. J. Exp. Med., 15, 579-597. Apud Egan, 2007.

13. Buller, R., Peterson, M.L., Almarsson, O., Leiserowitz, L. (2002). Quinoline binding site on malaria pigment crystl: va rational pathway for antimalaria drug design. Cryst.

Growth. 2, 553-562.

14. Chen, M.M., Shi, L., Sullivan, D.J. Jr. (2001). Haemoproteus and Schistosoma synthesize heme polymers similar to Plasmodium hemozoin and beta-hematin. Mol Biochem

Parasitol 113, 1-8.

15. Chou, A.C., Chevli, R., Fitch, C.D. (1980). Ferriprotoporphyrin IX fulfils the criteria for identification as the chloroquine receptor of malaria parasites. Biochemistry 19, 1543-1549.

16. Cohen, S.N., Phifer, K.O., Yielding, K.L. (1964). Complex formation between chloroquine and ferrihaemic acid in vitro, and its effect on the antimalarial action of. Nature 202, 805-806.

17. Costa-Filho A, Souza ML, Martins RC, dos Santos AV, Silva GV, Comaru MW, Moreira MF, Atella GC, Allodi S, Nasciutti LE, Masuda H, Silva LC. (2004). Identification and tissue-specific distribution of sulfated glycosaminoglycans in the blood-sucking bug Rhodnius prolixus (Linnaeus). Insect Biochem Mol Biol. 34, 251-60.

18. Costa-Filho A, Werneck CC, Nasciutti LE, Masuda H, Atella GC, Silva LF. (2001). Sulfated glycosaminoglycans from ovary of Rhodnius prolixus. Insect Biochem Mol Biol.

31, 31-40.

19. Dansa-Petretski, M., Ribeiro, J.M., Atella, G.C., Masuda, H., Oliveira, P.L. (1995). Antioxidant role of Rhodnius prolixus heme-binding protein. Protection against heme-induced lipid peroxidation. J. Biol. Chem. 270, 10893–10896.

73

20. de Villiers, K.A., Kaschula, C.H., Egan, T.J., Marques, H.M. (2007). Speciation and structure of ferriprotoporfphyrin IX in aqueous solution: spectroscopic and diffusion measurements demonstrate dimerization, but nor u-oxo dimer formation. J. Biol. Inorh.

Chem. 12, 101-117.

21. Dorn, A., Stoffel, R., Matile, H., Bubendorf, A., Ridley, R.G. (1995). Malarial haemozoin/beta-haematin supports haem polymerization in the absence of protein. Nature 374, 269–271.

22. Dorn, A., Vippagunta, S.R., Matile, H., Jaquet, C., Vennerstrom, J.L., Ridley, R.G. (1998). An assessment of drug-haematin binding as a mechanism for inhibition of haematin polymerisation by quinoline antimalarials. Biochemical Pharmacology. 55, 727-736.

23. Egan, T.J. (2001). Quinoline antimalarials. Exp. Ther. Patents 11, 185-209.

24. Egan, T.J. (2002) Physico-chemical aspects of hemozoin (malaria pigment) structure and formation. J. Inorg. Biochem 91, 19–26.

25. Egan, T.J. (2003). Haemozoin (malaria pigment): A unique crystalline drug target. Targets. 2, 115-124.

26. Egan, T.J. (2006). Interactions of quinoline antimalarials with hematin in solution. J

Inorganic Biochem 100, 916-926.

27. Egan, T.J. (2008). Haemozoin formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 157, 127-136.

28. Egan, T.J., Ncokazi, K.K. (2005). Quinoline antimalarials decrease the rate of beta-hematin formation. J Inorg Biochem. 99, 1532-1539.

29. Egan, T.J., Mavuso W.W., Ncokazi, K.K. (2001). The mechanism of β-hematin formation in acetate solution. Parallels between hemozoin formation and biomineralization processes. Biochemistry 40, 204-213.

30. Egan, T.J., Rossa, D.C.; Adamsb, P.A. (1994). Quinoline anti-malarial drugs inhibit spontaneous formation of p-haematin (malaria pigment). FEBS Letters 352, 54-57.

74

31. Egan, T.J., Hempelmann, E., Mavusso, W.W. (1999). Caracterisation of synthetic b-hematin and effects of the antimalarical drogs quinidine, halofantrine, desbutylhalofantrine and mefloquine on its formation. J. Inorg. Biochem. 73, 101-107.

32. Egan T.J., Chen, J.Y-J., de Villiers, K.A., Mabotha, T.E., Naidoo, K.J., Ncokazi, K.K., Langforf, J.S., MsNaughton, D., Pandiancherri, S., Wood, B.R. (2006). Haemozoin (b-hematin) biomineralization occurs by self-assembly near the lipid-water interface. J. Cell.

Sci. 119, 1019-1025.

33. Ferreira, C., Ribeiro, A.F., Garcia, E.S., Terra, W.R. (1988). Digestive enzimes trapped between and associated with the double plasma membranes of Rhodnius prolixus

posterior midgut cells. Insect Biochem. 18, 521-530.

34. Fitch, C.D., Cai, G.Z., Chen, Y.F., Shoemaker, J.D. (1999). Involvement of lipids in ferriprotoporphyrin IX polymerization in malaria. Biochim Biophys Acta. 1454, 31-37.

35. Francis, S.E., Sulliven, D.J., Goldberg, D.E. (1997). Hemoglobin metabolism in the malaria parasite Plasmodium falsiparum. Annu. Rev. Microbiol. 51, 97-121.

36. Fridovich, I. (1989). Superoxide dismutase: An adaptation to a paramagnetic gas. J. Biol.

Chem. 264, 7761-7764.

37. Friend, W.G. The gorging response in Rhodnius prolixus. Stal. Can. J. Zool. 43:125-132, 1965.

38. Garcia, E.S., Gonzales, M.S., Azambuja, P. (1991). Effects of azadirachtin in Rhodnius

prolixus: data and hypotheses. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 86, 107-11.

39. Garcia, E.S., Gonzales, M.S., Azambuja, P., Rembold, H. (1989). Chagas' disease and its insect vector. Effect of azadirachtin A on the interaction of a triatomine host (Rhodnius

prolixus) and its parasite (Trypanosoma cruzi). Z Naturforsch. 44, 317-22.

40. Ginsburg, H., krugliak, M. (1992). Quinoline-containing antimalarials-mode of action, drug resistance and its reversal. An update with unresolved puzzles. Biochem. Pharmacol. 43, 63-70.

75

41. Goldberg, D.E., Slater, A.F., Cerami, A., Henderson, G.B. (1990). Hemoglobin degradation in the malaria parasite Plasmodium falciparum: an ordered process in a unique organelle. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 2931-2935.

42. Gonzales, M.S., Nogueira, N.F.S., Feder, D., de Souza, W., Azanbuja, P., Garcia, E.S. (1998). Role of the head in the ultrastructural midgut organization in Rhodnius prolixus larvae: evidence from head transplantation experiments and ecdysone therapy. Journal of

Insect Physiology. 44, 553-560.

43. Graça-Souza, A.V., Maya-Monteiro, C., Paiva-Silva, G.O., Braz, G.R., Paes, M.C., Sorgine, M.H., Oliveira, M.F., Oliveira, P.L. (2006). Adaptations against heme toxicity in blood-feeding arthropods. Insect Biochem Mol Biol. 36, 322-335.

44. Gutteridge, J.M.C., Smith, A. (1988). Antioxidant protection by haemopexin of heam-stimulated lipid peroxidation. Biochem. J. 256, 861-865.

45. Gyang, F.N., Poole, B., Trager, W. (1982). Peptidases from Plasmodium falciparum cultured in vitro. Mol. Biochem. Parasitol. 5, 263-273.

46. Halliwell, B. (1993). The biochemistry of oxigen free radicals. Em: Free radicals in

tropical diseases, Harwood Academic Publishers, United Kingdom, 1-12.

47. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C. (2000). Oxigen is poisonous-an introduction to oxigen toxicity and free radicals. Em: free radicals in Biology and Medicine, 2ª Edição. Clarendon Press-Oxford, United Kingdom.

48. Hempelmann, E., Motta, C., Hughes, R., Ward, S.A., Bray, P.G. (2003). Plasmodium

falciparum: sacrificing membrane to grow crystals? Trends Parasitol. 19, 23–26.

49. Homewood, C.A., Warhurst, D.C., Peters, W., Baggaley, V.C. (1972). Lysosomes, pH and the anti-malarial action of chloroquine. Nature 235,50-52.

50. Huy, N.T., Maeda, A., Uyen, D.T., Trang, D.T.X., Shiono, M.T., Oida, T., Harada, S., Kamei, K. (2007). Alcohols induce beta-hematin formation via the dissociation of aggregated heme and reduction in interfacial tension of the solution. Acta Tropica. 101, 130–138.

76

51. Ignarro, L.J., Ballot, B., Wood, K.S. (1984). Regulation of soluble guanylate cyclase activity by porphyrins and metalloporphyrins. J. Biol. Chem. 259, 6201-6207.

52. Konigk. E., Mirtsch, S., Putfarken, B., Abdel-Rasoul, S. (1981). Plasmodium chabaudi-infection of mice: effects of chloroquine and mefloquine. Inhibition of ornithine decarboxilase activity. Tropenmed. Parasitol. 32, 73-76.

53. Lara, F.A., Lins, U., Paiva-Silva, G., Almeida, I.C., Braga, C.M., Miguens, F.C., Oliveira, P.L., Dansa-Petretski, M. (2003). A new intracellular pathway of haem detoxification in the midgut of the cattle tick Boophilus microplus: aggregation inside a specialized organelle, the hemosome. J. Exp. Biol. 206, 1707–1715.

54. Lara, F.A., Sant'anna, C., Lemos, D., Laranja, G.A., Coelho, M.G., Reis Salles, I., Michel, A., Oliveira, P.L., Cunha-E-Silva, N., Salmon, D., Paes, M,C. (2007). Heme requirement and intracellular trafficking in Trypanosoma cruzi epimastigotes. Biochem Biophys Res

Commun. 355, 16-22.

55. Lehane, M.L. (1991). Em: Biology of blood-sucking insect. Harper Collins. Academic, United Kindom.

56. Lent, H. (1999) Evolução dos conhecimentos sobre vetores da doença de Chagas 90 anos após sua descoberta. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94:89-92.

57. Lowry,O.H., Rosenbrough,M.J., Farr, A.R., Randall, R.J. (1951). Protein measurements with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 193, 265-275.

58. Lynn, A., Chandra, S., Malhorta, P., Chauhan, V.S. (1999). Heme binding and polymerization by Plasmodium falciparum histidine rich protein II: influence of pH on activity and conformation. FEBS Lett. 459, 267-271.

59. Maya-Monteiro, C.M., Alves, L.R., Pinhal, N., Abdalla, D.S., Oliveira, P.L. (2004). HeLp, a heme-transporting lipoprotein with an antioxidant role. Insect Biochem Mol Biol 34, 81-88.

60. Maya-Monteiro, C.M., Daffre, S., Logullo, C., Lara, F.A., Alves, E.W., Capurro, M.L., Zingali, R., Oliveira, P.L. (2000). HeLp, a heme lipoprotein from the hemolymph of the cattle tick, Boophilus microplus. J. Biol. Chem. 275, 36584–36589.

77

61. Maranhão, Z.G. (1977). Entomologia Geral. 2ª Edição, Nobel, São Paulo, 1977.

62. Monti, D., Basilico, N., Parapini, S., Pasini, E., Olliaro, P., Taramelli, D. (2002). Does chloroquine really act through oxidative stress? FEBS Letters. 522, 3-5.

63. Nicokazi, K.K., Egan, T.J. (2005). A colorimetric hith-throughput b-hematin inhibition screening assay for use in the search for antimalarial compounds. Anal. Biochem. 338, 309-319.

64. Nogueira, N.F., Gonzales, M., Garcia, E.M., de Souza, W. (1997). Effect of azadirachtin A on the fine structure of the midgut of Rhodnius prolixus. J Invertebr Pathol. 69, 58-63.

65. Noland, G.S., Briones, N., Sullivan, D.J. (2003). The shape and size of hemozoin crystals distinguishes diverse Plasmodium species. Mol. Biochem. Parasitol. 130, 91-99.

66. Oliveira, M.F., D’Avila, J.C.P., Tempone, A.J., Corrêa Soares, J.B.R., Rumjanek, F.D., Ferreira-Pereira, A., Ferreira, S.T., Oliveira, P.L. (2004) Inhibition of heme aggregation by chloroquine reduces Schistosoma mansoni infection, J. Infect. Dis. 190, 843–852.

67. Oliveira, M.F., D’Avila, J.C.P., Torres, C.R., Oliveira, P.L., Tempone, A.J., Rumjanek, F.D., Braga, C.M.S., Silva, J.R., Petretski, Oliveira, M.A., Souza, W., Ferreira, S.T. (2000b). Haemozoin in Schistosoma mansoni, Mol. Biochem. Parasitol. 111, 217–221.

68. Oliveira, M.F.,Kycia, S.W., Gómez, A., Kosar, A.J., Bohle, D.S., Hempelmann, E., Menezes, D., Vannier-Santos, M.A., Oliveira, P.L., Ferreira, S.T. (2005). Structural and morphological characterization of hemozoin produced by Schistosoma mansoni and Rhodnius prolixus. FEBS Lett. 579, 6010-6.

69. Oliveira, P.L., Kawooya, J.K., Ribeiro, J.M.C., Meyer, T., Poorman, R., Alves, E.W., Walker, F.A., Machado, E.A., Nussenzveig, R.H., Padovan, G.J., Masuda, H. (1995). A heme-binding protein from hemolymph and oocytes of the blood-sucking insect, Rhodnius prolixus. J. Biol. Chem. 270, 10897–10901.

70. Oliveira, M.F., Silva, J.R., Dansa-Petretski, M., De Souza, W., Lins, U., Braga, C.M., Masuda, H., Oliveira, P.L. (1999). Haem detoxification by an insect. Nature 400, 517–518.

78

71. Oliveira, M.F., Silva, J.R., Dansa-Petretski, M., De Souza, W., Lins, U., Braga, C.M., Masuda, H., Oliveira, P.L. (2000a). Haemozoin formation in the midgut of the blood-sucking insect Rhodnius prolixus. FEBS Lett. 477, 95-98.

72. Oliveira, M.F., Timm, B.L., Machado, E.A., Miranda, K., Attias, M., Silva, J.R., Dansa-Petretski, M., de Oliveira, M.A., de Souza, W., Pinhal, N.M., Sousa, J.J., Vugman, N.V., Oliveira, P.L.(2002). On the pro-oxidant effects of haemozoin. FEBS Lett 512, 139-144.

73. Oliveira, M.F.; Gandara, A.C.P.; Braga, C.M.S.; Silva, J.R.; Mury, F.B.; Dansa-Petretski, M.; Menezes, D.; Vannier-Santos, M.A.; Oliveira, P.L. (2007). Heme Crystalization in the midgut of triatomine insects., Comparative Biochemistry and Physiology. 146, 168-174.

74. O,Neil, P.M.,Bray, P.G., Hawley, S.R., Ward, S.A., Park B.K. (1998). 4-aminoquinolines-past, present and future: a chemical perspective. Pharmacol Ther 77, 29-58.

75. Orjih, A.U., Banyal, H.S., Chevli, R., Fitch, C.D. (1981) Hemin lyses malaria parasites. Science. 214, 667-669.

76. Pagola, S., Stephens, P.W., Bohle, D.S., Kosar, A.D., Madsen, S.K .(2000). The structure of malaria pigment b-haematin. Nature 404, 307–310.

77. Paiva-Silva, G.O., Cruz-Oliveira, C., Nakayasu, E.S., Maya-Monteiro, C.M., Dunkov,B.C., Masuda, H., Almeida, I.C., Oliveira, P.L. (2006). A heme-degradation pathway in a blood-sucking insect. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8030-8035.

78. Pandey, A.V., Babbarwal, V.K., Okoyeh, J.N., Joshi, R.M., Puri, S.K., Singh, R.L., Chauhan, V.S. (2003). Hemozoin formation in malaria: a two-step process involving histidine-rich proteins and lipids. Biochem Biophys Res Commun. 308, 736-743.

79. Panton, L.J., McPhie, P., Maloy, W.L., Wellems, T.E., Taylor, D.W., Howard, R.J. (1989). Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodiun

falciparum: histidine-rich protein II. Mol. Biochem. Parasitol. 35, 149-160.

80. Papalexis, V., Siomos, M-A., Campanele, H. (2001). Histidine-rich protein 2 of the malaria parasite, Plasmodium falciparum, is involved in detoxification of the by-products of haemoglobin degradation. Mol. Biochem. Parasitol. 115, 77-86.

79

81. Parker, F.S., Irvin, J.L. (1952). The interaction of chloroquine with nucleic acids and nucleoproteins. J.Biol. Chem. 199, 897-909.

82. Pereira, L.O.R.; Oliveira, P.L.; Almeida, I.C., Paiva-Silva, G.O. (2007). Biglutaminyl-Biliverdin IX Alpha as a Heme Degradation Product in the Dengue Fever Insect-Vector Aedes aegypti. Biochemistry. 46, 6822-6829.

83. Pisciotta, J.M., Coppens, I., Tripathi, A.K. (2007). The role of neutrl lipid nanospheres in Plasmodium falciparum heme crystalization. Biochem. J. 402, 197-204.

84. Ponka, P. (1999). Cell biology of haem. Am. J. Med. Sci. 318, 241-256.

85. Ribeiro, J.M. (1995). Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate pharmacologists? Infect. Agent. 4, 143-152.

86. Ridley, R.G. (1996). Haemozoin formation in malaria parasites: is there a heam polymerase? Trends Microbiol. 4, 253-254.

87. Romoser, W.S. (1996). The vector alimentary system. Em: The biology of Desease

Vectors. 1ª Edição. Editado por Beaty, B.J. e Marquardt, W.C. Colorado, University Press of Colorado.

88. Ryter, S.W., Tyrrell, R.M. (2000). The heme synthesis and degradation pathways: role in oxidant sensitivity. Heme oxygenase has both pro- and antioxidant properties. Free Radic

Biol Med. 28, 289-309.

89. Schaub, G.A., Eichler, S. (1998). The effects of aposymbiosis and of an infection with Blastocrithidia triatomae (Trypanosomatidae) on the tracheal system of the reduviid bugs Rhodnius prolixus and Triatoma infestans. J Insect Physiol. 44, 131-140.

90. Schmitt, T.H., Frezzatti Jr. Wa., and Schereier, S. (1993). Heme-induced lipid membrane disorder and increased permeability: a molecular model for the mechanism of cells lysis. Arch. Biochem. Biophys. 307, 96–103.

91. Silva, J.R.; Mury, F.B.; Marcus F. Oliveira, M.F.; Oliveira, P.L.; Silva, C.P.; Dansa-Petretski, M. (2007). Perimicrovillar membranes promote hemozoin formation into Rhodnius prolixus midgut. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37, 523-31.

80

92. Slater, A.F., Cerami, A. (1992). Inhibition by chloroquine of a novel haem polymerase enzyme activity in malaria trophozoites. Nature. 355, 167-169.

93. Slater, A.F., Swiggard, W.J., Orton, B.R., Flitter, W.D., Goldberg, D.E., Cerami, A., Henderson, G.B., (1991). An iron–carboxylate bond links the heme units of malaria pigment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 325–329.

94. Soares, J.B.R.C.; Maya-Monteiro, C.M.; Bittencourt-Cunha, P.R.B.; Atella, G.C.; Lara., F.A.; d’Avila, J.C.P.; Menezes, D.; Vannier-Santos, M.A.; Oliveira, P.L.; Egan, T.J.; Oliveira, M.F. (2007). Extracellular lipid droplets promote hemozoin crystallization in the gut of the blood fluke Schistosoma mansoni. FEBS Letters. 581, 1742–1750.

95. Sugioka, Y., Suzuki, M. (1991). The chemical basis for the ferriprotoporphyrin IX-chloroquine complex induced lipid peroxidation. Biochim. Biophys. Acta. 1074, 19-24.

96. Sullivan, D.J. (2002). Theories on malarial pigment formation and quinoline action. Int J

Parasitol. 32, 1645-1653.

97. Sullivan, D.J., Gluzman, I.Y., Russell, D.G., Goldberg, D.E. (1996b). On the molecular mechanism of chloroquine, antimalarial action . Proc Natl. Acad. Sci. USA. 93, 11865-11870.

98. Sullivan, D.J., Gluzman, I.Y., Goldberg, D.E. (1996a). Plasmodium hemozoin formation mediated by histidine-rich proteins. Science. 271, 219-222.

99. Sullivan, D.J., Matile, H., Ridley, R.G., Goldberg, D.E. (1998). A common mechanism for blockade of heme polymerization by antimalarial quinolines. J. Biol. Chem. 273, 31103-31107.

100. Surolia, N., Padmanaban, G. (1991). Chloroquine inhibits heme-dependent protein synthesis in Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 88, 4786-4790.

101. Tappel, A.L. (1955). Unsaturated lipid oxidation catalyzed by hematin compounds. J. Biol. Chem. 217, 721-733.

102. Tenhunen, R., Marver, H.S., Schmid, R. (1969). Microsomal heme oxygenase. Characterization of the enzyme. J. Biol. Chem. 244, 6388-6394.

81

103. Terra, W.R., FerreiraC., Garcia, E.S. (1988). Origen, distribution, properties and functions of the major Rhodnius prolixus midgut hydrolases. Insect. Biochem. 18, 423-434.

104. Terra e Ferreira (1994). Em: Biology of the insect midgut. 1ª Edição. Editado por Lehane, M.J. e Billingsley P.F.

105. Trigg, P.I., and Wernsdorfer, W.H. (1999). Malaria control priorities and constraints. Parassitologia 41, 329–332.

106. Valle, D., Lima Gomes, J.E.P., Goldemberg, S., Garcia, E.S. (1987). Rhodnius

prolixus vitellogenesis: Dependence upon the blood source. J. Insect Physiol. 33, 249-254.

107. Van der Zee, J., Barr, D.P., Mason, R.P. (1996). ESR spin trapping investigation of radical formation from the reaction between hematin and tert-butyl hydroperoxide. Free Radic Biol Med. 20,199-206.

108. Vippagunta, S.R., Dorn, A., Ridley, R.G., Cennerstrom, J.L. (2000). Characterization of chloroquine-hematin mu-oxo demer binding by isothermal titration calorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 1475, 133-140.

109. Wellems, T.E., Howard, R.J. (1986). Homologous genes encode two distinct histidine-rich proteins in a cloned isolate os Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 83, 6065-6069.

110. White, K.A., Marletta, M.A. (1992). Nitric oxide synthase is a cytochome p-450 type hemoprotein. Biochemistry. 31, 6627-6631.

111. WHO, 2007a. Disponível em: http://www.un.org/av/radio/portuguese/ .

112. WHO, 2007b. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/news/notes/2007/np16/en/.

113. WHO, 2003. Disponível em: http://www.who.int/tdr/dw/chagas2003.htm.

82

114. WHO, 2006. Disponível em: http://www.who.int/tdr/diseases/chagas/default.htm.

115. Wigglesworth, V.B. (1943). The fate of haemoglobin in Rhodnius prolixus (Hemiptera) and other blood-sucking arthropods. Proc. R. Soc. London. 131, 313-339.

116. www.jyi.org, 2007.

117. www.scientificpsychic.com.

118. Ziegler, J., Chang, R.T., Wright, D.W. (1999). Multiple-antigenic peptides of histidine-rich protein II of Plasmodium falciparum: dendrimeric biomineralization templates. J. Am. Chem. Soc. 121, 2394-2400.

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Curriculum Vitae

DADOS PESSOAIS

Nome: Renata Stiebler

Data de Nascimento: 13/06/1983

Naturalidade: Rio de Janeiro

FORMAÇÃO ACADÊMICA

♦ Ensino Superior:

Graduação em Nutrição na Universidade Federal do Rio de Janeiro

Período: primeiro semestre de 2002 a primeiro semestre de 2006

♦ Pós-Graduação:

Mestrado em Química Biológica na Universidade Federal do Rio de Janeiro

Período: Agosto de 2006 a março de 2008

Bolsista CNPq

PREMIAÇÕES:

� 2ª colocada no Prêmio Bioresearch de Iniciação Científica pelo trabalho

apresentado na XXXIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia

Molecular – SBBq.

ARTIGOS PUBLICADOS:

� Angelica Nakamura, Renata Stiebler, Marcelo R. Fantappié, Eliane Fialho,

Hatisaburo Masuda, Marcus F. Oliveira. Effects of retinoids and juvenoids on moult and

on phenoloxidase activity in the blood-sucking insect Rhodnius prolixus. Acta Tropica

2007; 103: 222–230.

* Obs.: Neste artigo a primeira autoria foi compartilhada entre Angelica Nakamura e

Renata Stiebler.

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