Bernadete de Lourdes Liphaus
Expresso das protenas Fas e Bcl-2 em clulas mononucleares de crianas e adolescentes com lpus
eritematoso sistmico
Tese apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Cincias rea de concentrao: Pediatria
Orientadora: Profa. Dra. Maria Helena Bittencourt Kiss
Co-orientadora: Dra. Claudia Goldenstein-Schainberg
So Paulo
2005
DEDICATRIA
minha famlia pela presena e estmulos constantes.
Ao Jorge por seu amor, compreenso e pacincia.
Profa. Dra. Maria Helena Bittencourt Kiss pela paciente orientao, por
sua contribuio minha formao profissional e pessoal e por sua
excepcional capacidade cientfica.
Dra. Claudia Goldenstein-Schainberg pelo apoio na realizao desta tese.
AGRADECIMENTOS
s crianas e adolescentes e seus pais pela colaborao na
realizao desta tese.
Aos Prof. Dr. Flvio Adolfo Costa Vaz, Prof. Dr. Yassuhiko Okay e Profa.
Dra. Madga M. Sales Carneiro Sampaio pelo apoio na realizao desta tese.
Profa. Dra. Elosa Silva Dutra de Oliveira Bonf pela oportunidade
de integrao entre os Departamentos de Reumatologia e de Pediatria.
Ao Dr. Clovis Artur Almeida Silva, por sua dedicao a Reumatologia
Peditrica. Aos demais colegas da Unidade de Reumatologia do Instituto da
Criana: Adriana Maluf Elias Sallum, Lucia Maria M. de Arruda Campos, Ana
Paola Navarrete Lotito, aos ps-graduandos e residentes, pelo apoio e
colaborao durante a realizao deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Claudio Leone por seu auxlio na realizao da anlise
estatstica.
Dra. Beatriz Beitler e Dra. Juliana Pereira pela oportunidade e
orientao durante meu aprendizado das tcnicas laboratoriais empregadas
no estudo da apoptose.
s colegas do Laboratrio de Imunopatologia do HCFMUSP, Sueli
Satiko Iogery, Maristela Tsujita, Graciella Aparecida Brocardo Lima, Nadia
Shigueoka e Lucilla Gonalves Viana pelo inestimvel auxlio durante o
aprendizado dos testes laboratoriais deste estudo e por sua dedicao e
capacidade tcnica na realizao das imunofenotipagens.
biloga Solange Carrasco por seu auxlio na realizao das
marcaes celulares realizadas neste estudo.
Aos colegas da Vigilncia Epidemiolgica, Arlete, Mari, Adalgiza,
Farida, Dona Odete, Toninho e Sr. Augusto por sua colaborao e
compreenso durante a realizao desta tese.
Aos amigos Leonardo, Jos Luiz, Fbio, Paulo, Patrcia e Letcia, pelo
apoio e amizade ao longo destes anos.
NORMATIZAO ADOTADA
Esta tese est de acordo com:
Referncias: Adaptado de International Committee of Medical Journals
Editors (Vancouver).
Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Servio de Biblioteca e
Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi,
Maria F. Crestana, Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso,
Valria Vilhena. So Paulo: Servio de Biblioteca e Documentao; 2004.
Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com o List of Journals
Indexed in Index Medicus.
SUMRIO
Lista de abreviaturas e siglas
Lista de figuras
Lista de tabelas
Resumo
Summary
1. INTRODUO..............................................................................................0
1.1. Lpus eritematoso sistmico................................................................2
1.2. Etiopatogenia do lpus.........................................................................5
1.3. Apoptose e LES .................................................................................21
1.4. Protenas Fas e Bcl-2 e LES ..............................................................28
2. OBJETIVOS................................................................................................35
3. REVISO DA LITERATURA.......................................................................37
3.1. Apoptose ............................................................................................38
3.2. A Protena Fas ...................................................................................47
3.3. A Protena Bcl-2 .................................................................................49
4. MTODOS..................................................................................................53
4.1. Pacientes e Controles ........................................................................54
4.2. Informaes clnicas e laboratoriais ...................................................55
4.3. Pesquisa da expresso do Fas e Bcl-2 em clulas mononucleares ..57
4.4. Citometria de fluxo .............................................................................61
4.5. Anlise estatstica ..............................................................................67
5. RESULTADOS............................................................................................68
5.1. Casustica ..........................................................................................69
5.2. Estudo da protena Fas ......................................................................74
5.3. Estudo da protena Bcl-2....................................................................78
5.4. Correlao entre as protenas Fas e Bcl-2 e o SLEDAI .....................82
6. DISCUSSO...............................................................................................87
7. CONCLUSES.........................................................................................103
8. ANEXOS...................................................................................................105
9. REFERNCIAS ........................................................................................119
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACR Colgio Americano de Reumatologia
AICD Morte celular induzida
APAF-1 Apoptotic protease-activating factor-1 ou protease ativadora
do fator 1 da apoptose
APC Clula apresentadora de antgeno
ARJ Artrite reumatide juvenil / Artrite idioptica juvenil
ATP Adenosina trifosfato
Blebs Vesculas citoplasmticas envoltas por membrana celular e
desprovidas de organelas
Bcl-2 Protena intra-citoplasmtica que inibe a apoptose
CARD Caspase recruitment domain ou domnio de recrutamente das
caspases
CD Cluster of differentiation ou agrupamento de diferenciao
CD3+ Linfcitos T
CD4+ Linfcitos T auxiliares
CD8+ Linfcitos T citotxicos
CD19+ Linfcitos B
Corpsculos apoptticos Vesculas citoplasmticas envoltas por
membrana celular e repleta de organelas
Cy5 Fluorocromo de cor vermelha
DM Dermatomiosite juvenil
DNA cido desoxiribonucleico
Dot-plot Grfico de disperso de pontos
DP Desvio padro
EDTA cido etilenodiamino-tetractico
ELISA Ensaio imunenzimtico
FACS Fluorescence-activated cell sorting
FADD Fas-associated death domain ou domnio de morte associado
ao Fas
FAN Anticorpos antinucleares
Fas ou CD95 ou APO-1 Receptor ou protena de membrana pr-
apoptose
Fas ligante ou CD95L Protena de membrana que se liga ao Fas
FITC Fluorocromo isotiocianato de fluorescena cor verde
FSC Fotodetector frontal do citmetro, corresponde ao tamanho da
clula
HLA Human leukocyte antigen ou antgenos leucocitrios humanos
ou antgenos de histocompatibilidade
IF Imunofluorescncia
IMF Intensidade mdia de fluorescncia
IL-1 Interleucina 1
IL-2 Interleucina 2
IL-4 Interleucina 4
IL-6 Interleucina 6
IL-10 Interleucina 10
IL-12 Interleucina 12
LES Lpus eritematoso sistmico
mRNA cido ribonucleico mensageiro
PBS Soluo tampo fosfato salino
PE Fluorocromo de ficoeritrina cor laranja
SDA Controles sem doena autoinune
SLEDAI Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index ou
ndice de atividade do lpus eritematoso sistmico
SLICC ndice de dano no lpus eritematoso sistmico
SSC Fotodetector lateral do citmetro, corresponde complexidade
ou granularidade da clula
TGF-1 Fator de crescimento transformador 1
Th1 Linfcito T auxiliar 1
Th2 Linfcito T auxiliar 2
TNF Fator de necrose tumoral
TNFR Receptor do TNF
TRADD TNFR-associated death domain ou domnio de morte
associado ao receptor de TNF
TRAIL TNF-related apoptosis inducing ligand ou ligante indutor de
apoptose associado ao TNF
TWEAK TNF-like weakindicer of apoptosis ou indutor fraco de
apoptose semelhante ao TNF
VCAM-1 Molcula de adeso vascular 1
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Seqncia de mudanas ultra-estruturais durante o processo de apoptose (2-4) e durante a necrose (5-6) de uma clula normal. (Adaptado
de Pereira, 2000). .........................................................................................41
Figura 2 - Esquema da partcula passando atravs do raio laser e a luz que se dispersa sendo captada pelos fotodetectores frontal e lateral (Adaptado
de Bacal et al., 2003). ...................................................................................65
Figura 3 - Grfico de disperso de p
