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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE M ESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARM ACÊUTICAS
CAM PUS DE ARARAQUARA
LATENCIAÇÃO DE CLOREXIDINA PARA USO POTENCIAL EM
PERIODONTITES
RENATO FARINA M ENEGON
ORIENTADORA: Profa. Dra. Chung M an Chin
ARARAQUARA – SP
2005
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE M ESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARM ACÊUTICAS
CAM PUS DE ARARAQUARA
LATENCIAÇÃO DE CLOREXIDINA PARA USO POTENCIAL EM
PERIODONTITES
RENATO FARINA M ENEGON
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área dePesquisa e Desenvolvimento de Fármacos eM edicamentos, da Faculdade de CiênciasFarmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de M estre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Chung M an Chin
ARARAQUARA – SP
2005
Ficha CatalográficaElaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências FarmacêuticasUNESP – Campus de Araraquara
M enegon, Renato Farina
M 541L Latenciação de clorexidina para uso potencial em periodontites. / Renato Farina M enegon .– Araraquara, 2005.
140 f.
Dissertação (M estrado) –Universidade Estadual Paulista. “Júlio deM esquita Filho”. Faculdade de CiênciasFarmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Chung M an Chin
. 1.Clorexidina. 2. Periodontite. I.Chung M an Chin, orient.II. Título.
CDD: 615.4
CAPES:40300005
DEDICATÓRIA
À memória de meu irmão Ricardo Farina M enegon
À minha namorada Lorena, pela compreensão, amor e paciência demonstrado
em todos os momentos
Aos meus pais, à minha avó e à minha irmã, por terem sempre confiado e
acreditado em mim e nas minhas escolhas
AGRADECIM ENTOS
À Profa. Dra. Chung Man Chin, pela confiança depositada em mim e no meu
trabalho, e por ter tantas vezes extrapolado os limites da simples orientação,
demonstrando profunda amizade e companheirismo, contribuindo para o meu
crescimento profissional e pessoal. A todos estes anos de convivência, meu muito
obrigado.
Aos Professores Doutores Horácio Faig Leite, Leoberto Costa Tavares e Ivone de
Carvalho, pelas inestimáveis contribuições dadas a este trabalho.
Ao Prof. Dr. Antonio Gilberto Ferreira e às pós-graduandas Elisangela Fabiana
Boffo e Leila Aley Tavares, pela realização das análises de RMN e interpretação dos
espectros obtidos.
Ao Prof. Dr. José Carlos Nassute e às Professoras Doutoras Márcia da Silva e
Adélia Emília de Almeida, pela amizade e incentivo à realização deste trabalho.
Aos funcionários Luiz Eduardo dos Santos (Dudu) e Osmar Redondo, que além de
muito facilitarem a realização do meu trabalho, sempre demonstraram amizade e
bom humor nos momentos mais difíceis.
Aos amigos de pós-graduação Antonio, Lúcia, Eduardo, Eliana, Jean, Thaís, Ednir,
Vanessa e Mara, e aos estagiários Rodolfo, Ricardo e Paulo pelo companheirismo
e pelos bons momentos vivenciados.
Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pelo suporte financeiro para a execução deste trabalho.
À Galena Química e Farmacêutica Ltda, pelo apoio e fornecimento de matéria-prima a este trabalho.
E a todos aqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho.
Sumário e Índices
iR.F.Menegon
SUM ÁRIO
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO ................................................................pg. 03
1.1. INTRODUÇÃO...........................................................................pg. 03
1.2. OBJETIVO................................................................................pg. 10
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................pg. 11
2.1. PERIODONTITE........................................................................pg. 11
2.2. TRATAMENTO...........................................................................pg. 17
2.2.1. Enzimas.......................................................................pg. 18
2.2.2. Antibióticos..................................................................pg. 18
2.2.3. Antissépticos................................................................pg. 20
2.2.4. Antiinflamatórios Não Esteroidais (AINEs) ......................pg. 27
2.2.5. Doses sub-antimicrobianas de doxiciclina.......................pg. 28
2.2.6. Bifosfonatos e Tetraciclinas Quimicamente Modificadas...pg. 29
2.3. PLANEJAMENTO DE PRÓ-FÁRMACOS..........................................pg. 40
2.3.1. Definição.....................................................................pg. 40
2.3.2. Solução de Problemas...................................................pg. 43
2.3.2.1. Correção de sabor............................................pg. 44
2.3.2.2. Correção de solubilidade...................................pg. 52
3. M ATERIAL E M ÉTODOS......................................................................pg. 56
3.1. MATERIAL................................................................................pg. 56
3.2. MÉTODOS DE SÍNTESE.............................................................pg. 56
3.3. MÉTODOS DE ANÁLISE.............................................................pg. 59
Sumário e Índices
iiR.F.Menegon
3.3.1. Cromatografia em Camada Delgada (CCD).....................pg. 59
3.3.2. Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear..........pg. 59
3.3.3. Espectrometria no Infravermelho (IV)............................pg. 60
3.3.4. Faixa de Fusão.............................................................pg. 60
3.4. MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICO E FARMACOCINÉTICO.....................pg. 60
3.4.1. Coeficiente de partição (Log P)......................................pg. 60
3.4.2. Determinação do tempo de retenção do pró-fármaco na
cavidade bucal.......................................................................pg. 61
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................pg. 62
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS......................................................pg. 108
5.1. Conclusões ............................................................................pg. 108
5.2. Perspectivas............................................................................pg. 109
6. PROCEDIM ENTO EXPERIM ENTAL...................................................pg. 110
6.1. SÍNTESE DO PRÓ-FÁRMACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DA ROTA A..
....................................................................................................pg. 110
6.1.1. Rota A1..................................................................... pg. 111
6.1.2. Rota A2.1.................................................................. pg. 111
6.1.3. Rota A2.2.................................................................. pg. 112
6.1.4. Rota A3..................................................................... pg. 112
6.1.5. Rota A4.1.................................................................. pg. 113
6.1.6. Rota A4.2.................................................................. pg. 113
6.1.7. Rota A4.3.................................................................. pg. 114
Sumário e Índices
iiiR.F.Menegon
6.1.8. Rota A4.4.................................................................. pg. 114
6.1.9. Rota A4.5.................................................................. pg. 115
6.2. SÍNTESE DO PRÓFÁRMACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DA ROTA
B................................................................................................. pg. 116
6.2.1. Rota B1..................................................................... pg. 117
6.2.2. Rota B2..................................................................... pg. 118
6.3. ENSAIOS FÍSICO-QUÍMICO E FARMACOCINÉTICO.....................pg. 119
6.3.1. Coeficiente de partição (Log P).....................................pg.119
6.3.1.1. Curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina
(TPCHD)....................................................................pg. 119
6.3.1.2. Estimativa preliminar do coeficiente de partição.pg.120
6.3.1.3. Determinação do Coeficiente de Partição.........pg. 121
6.3.2. Determinação do tempo de retenção do pró-fármaco na
cavidade bucal.....................................................................pg. 123
6.3.2.1. Cromatografia................................................pg. 123
6.3.2.2. Procedimento de extração...............................pg. 124
6.3.2.3. Curva de calibração........................................pg. 124
6.3.2.4. Taxa de recuperação......................................pg. 125
6.3.2.5. Estudo farmacocinético...................................pg. 127
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................pg. 128
Sumário e Índices
ivR.F.Menegon
ÍN DICE DE ESPECTROS
1: Espectro de infravermelho da clorexidina base........................................pg. 64
2: Espectro de infravermelho do diacetato de clorexidina............................ pg. 65
3: Espectro de infravermelho do produto obtido a partir da rota A1............. pg. 71
4: Espectro de infravermelho do precipitado obtido durante a reação da rota
A2........................................................................................................... pg. 74
5: Espectro de infravermelho do precipitado obtido pela neutralização do filtrado
da reação da rota A2................................................................................ pg. 75
6: Espectro de infravermelho do precipitado obtido na rota A3.................... pg. 77
7: Espectro de infravermelho do produto obtido através da rota A4.1.......... pg. 79
8: Espectro de infravermelho do precipitado da reação da rota A4.2............ pg. 81
9: Espectro de RMN 1H do precipitado da reação pela rota A4.2.................. pg. 82
10: Espectro de infravermelho do produto amarelado da rota A4.2.............. pg. 84
11: Espectro de infravermelho do precipitado da rota A4.2, após lavagem com
ácido acético a quente.............................................................................. pg. 86
12: Espectro de RMN 1H do precipitado da rota A4.2, após lavagem com ácido
acético a quente....................................................................................... pg. 87
13: RMN 1H do produto purificado por CCD na rota A4.3............................. pg. 89
14: Espectro de infravermelho do produto obtido ao final da purificação da rota
A4.5........................................................................................................ pg. 91
15: Espectro de infravermelho do produto precipitado em isopropanol da rota B1...
................................................................................................................pg. 93
Sumário e Índices
vR.F.Menegon
16: Espectro de RMN 1H do produto oleoso amarelo obtido na rota B1........ pg. 96
17: Espectro de infravermelho do sal tetrapalmitato de clorexidina.............. pg. 97
18: Espectro de RMN 1H do sal tetrapalmitado de clorexidina...................... pg. 99
ÍNDICE DE FIGURAS
1.1: Mapa das Américas Central e do sul indicando a prevalência de periodontites
severas entre indivíduos jovens por país..................................................... pg. 04
1.2: Mapa das Américas Central e do sul indicando a prevalência de periodontites
severas entre indivíduos adultos por país................................................... pg. 05
1.3: Mapa das Américas Central e do sul indicando a prevalência de periodontites
severas entre indivíduos idosos por país..................................................... pg. 05
1.4: Inflamação do tecido gengival (gengivite)........................................... pg. 06
1.5: Perda severa de dentes..................................................................... pg. 07
1.6: Reabsorção óssea............................................................................. pg. 07
1.7: Manchas nos dentes provocadas pelo uso de clorexidina...................... pg. 08
2.1: Representação esquemática do conceito de pró-fármacos.................... pg. 41
2.2: Exemplos de pró-fármacos no mercado.............................................. pg. 42
2.3: Pró-fármacos de opióides ................................................................. pg. 48
2.4: Estrutura química do paracetamol e seu profármaco N-[(acetiloxi)-
fenil]acetamida........................................................................................ pg. 49
2.5: Estrutura química da norfloxacina e seus pró-fármacos........................ pg. 50
Sumário e Índices
viR.F.Menegon
2.6: Estrutura química do cloranfenicol e do palmitato de cloranfenicol........ pg. 51
2.7: Exemplos de formação de sais para correção de sabor......................... pg. 52
2.8: Estrutura química do paclitaxel e seu pró-fármaco solúvel protaxel....... pg. 53
2.9: Estrutura da buparvaquona e seu pró-fármaco fosfonoximetil-buparvaquona-
oxima...................................................................................................... pg. 54
2.10: Estrutura química da fenitoína e da fosfenitoína................................ pg. 55
4.1: Fórmula estrutural da clorexidina base................................................ pg. 62
4.2: Mecanismo de reação para a obtenção do pró-fármaco........................ pg. 66
4.3: Mecanismo da ação catalítica da piridina e da 4-DMAP......................... pg. 67
4.4: Possíveis produtos formados na reação............................................... pg. 68
4.5: Formação de sal com o ácido palmítico (palmitato de clorexidina)..........pg. 69
4.6: Metanólise do cloreto de palmitoíla, com liberação de ácido clorídrico... pg. 72
ÍNDICE DE QUADROS
2.1: Estruturas química dos compostos pesquisados para o tratamento da
periodontite............................................................................................. pg. 33
2.2: Relações empíricas e qualitativas de estrutura-sabor........................... pg. 46
ÍN DICE DE TABELAS
4.1: Condições reacionais e produtos obtidos............................................ pg. 96
4.2: Concentração das soluções saturadas de TPCHD em água e em n-
octanol.................................................................................................. pg. 101
Sumário e Índices
viiR.F.Menegon
4.3: Concentração de TPCHD nas fases n-octanol e aquosa, e valor do coeficiente
de partição P e log P.............................................................................. pg. 102
4.4: Taxa de recuperação da extração..................................................... pg. 104
ÍNDICE DE GRÁFICOS
4.1: Curva de calibração UV (258nm) do tetrapalmitato de clorexidina....... pg. 100
4.2: Curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina.......................... pg. 104
4.3: Concentração de TPCHD em função do tempo transcorrido ao enxágüe bucal
com suspensão 0,35%........................................................................... pg. 106
ÍNDICE DE ESQUEM AS
3.1: Obtenção do pró-fármaco a partir do cloreto de palmitoíla....................pg. 57
3.2: Obtenção do pró-fármaco a partir do ácido palmítico............................pg. 58
6.1: Síntese do pró-fármaco(3) a partir do cloreto de palmitoíla(2) e clorexidina
base(1)...................................................................................................pg. 110
6.2: Síntese do pró-fármaco(3) a partir do ácido palmítico(4) e clorexidina
base(1)...................................................................................................pg. 116
Resumo
1_____________________________________________________________________________________________________
R.F.Menegon
RESUM O
A Saúde bucal da população mundial apresentou grandes melhoras nos
últimos anos, mas certas doenças como as cáries e as periodontopatias ainda
consistem em sérios problemas, apresentando altas incidências em muitos países,
levando à perda prematura de dentes.
A Organização Mundial de Saúde considera a Saúde bucal como parte
integrante da Saúde geral, apresentando um forte impacto psicossocial, afetando a
qualidade de vida dos pacientes.
O controle da placa bacteriana é o ponto principal da prevenção das
doenças periodontais, no entanto, uma eficaz remoção mecânica da placa exige
certa habilidade, e nem sempre é feita corretamente. Daí a importância do
desenvolvimento de agentes químicos para o tratamento e a profilaxia destas
doenças.
O digluconato de clorexidina é o agente mais amplamente utilizado e de boa
eficácia, mas que apresenta dificuldades na aceitação pelos pacientes dado seu
sabor desagradável de difícil mascaramento farmacotécnico.
Quando esta tentativa não é eficiente, a modificação química, através de
técnicas de latenciação, pode suprimir esta propriedade organoléptica indesejável,
aumentando a adesão dos pacientes ao tratamento.
O presente trabalho propõe a diminuição do sabor amargo da clorexidina
através da síntese de pró-fármaco, obtendo um derivado palmítico.
Abstract
2R.F.Menegon
ABSTRACT
Despite great improvements in the oral health of populations across the
world, problems still persist. Some diseases like caries and periodontitis have high
incidence in most countries, causing premature lost of teeth.
The World Health Organization (WHO) consider the oral health integral to
general health and essential to well-being, moreover, the psychosocial impact of
these diseases often significantly diminishes quality of life.
The control of bacterial plaque is the key of periodontal diseases prevention,
but the degree of motivation and skill required for an effective mechanical remove
of the plaque may be beyond the ability of the majority of patients. By this way,
the development of chemical agents for the treatment and prophylaxis of these
diseases makes important.
The most widely used chemical agent to control of plaque is chlorhexidine
digluconate, but the patients compliance is very hard because of its bitter taste
that is not easily to be masked by the use of flavours and flavour modifiers.
When this approach is ineffective, chemical modifications, like latentiation
process, have to be consider to suppress this undesirable organoleptic property,
increasing the patients’ compliance.
With this aim, the purpose of this work was to suppress the bitter taste of
the chlorhexidine by the means of prodrug synthesis, to give a palmitic derivative.
1– Introdução e Objetivo
Introdução e Objetivo
3R.F.Menegon
1. INTRODUÇÃO E OBJETIVO
1.1. INTRODUÇÃO
Apesar das grandes melhorias na Saúde bucal das diversas comunidades ao
redor do mundo, alguns problemas ainda persistem, principalmente entre grupos
desfavorecidos em ambos países desenvolvidos e em desenvolvimento. A
Organização Mundial de Saúde (OMS) considera a Saúde bucal como parte integral
da Saúde geral, apresentando grande impacto sobre o bem–estar (PETERSEN;
LENNON, 2004), visto as doenças orais restringirem atividades na escola, no
trabalho e em casa. O impacto psicossocial destas doenças freqüentemente
diminui a qualidade de vida dos pacientes.
A cárie dental é ainda o principal problema de Saúde bucal em muitos
países industrializados, afetando entre 60 e 90% das crianças em idade escolar e a
grande maioria dos adultos. É também a doença bucal de maior prevalência em
muitos países asiáticos e latino americanos (WHO, 2002).
Em todo o mundo, muitas crianças apresentam sinais de gengivite e, entre
os adultos, os estágios iniciais de doenças periodontais são ainda mais comuns. 5
a 15% da população de muitas comunidades apresentam periodontite severa e
cerca de 2% dos jovens estão acometidos por periodontite juvenil agressiva, uma
Introdução e Objetivo
4R.F.Menegon
condição grave que afeta indivíduos durante a puberdade levando a perda
prematura de dentes (ALBANDER; BROWN; LÖE, 1997; WHO, 2004). As figuras de
1.1 a 1.3 demonstram a prevalência das formas mais severas de periodontite nas
Américas Central e do Sul, de acordo com a faixa etária. O tabagismo é
considerado o principal fator de risco para doença periodontal em adultos,
responsável por mais que a metade dos casos de periodontite nesta faixa etária
em países industrializados (TOMAR; ASMA, 2000).
Figura 1.1: Mapa das Américas Central e do Sul indicando a prevalência de periodontites severas
entre indivíduos jovens por país (GJERMO; RÖSING; SUSIN, et al, 2002)
Introdução e Objetivo
5R.F.Menegon
Figura 1.2: Mapa das Américas Central e do Sul indicando a prevalência de periodontites severas
entre indivíduos adultos por país (GJERMO; RÖSING; SUSIN, et al, 2002)
Figura 1.3: Mapa das Américas Central e do Sul indicando a prevalência de periodontites severas
entre indivíduos idosos por país (GJERMO; RÖSING; SUSIN, et al, 2002).
Introdução e Objetivo
6R.F.Menegon
As doenças periodontais são caracterizadas por uma reação inflamatória do
tecido gengival, em resposta a biofilmes bacterianos que se acumulam na
superfície da raiz dos dentes, resultando na perda de osso alveolar e do ligamento
periodontal (JIN; ANUSAKSATHIEN; WEBB; et al, 2003). A periodontite crônica é a
principal causa de perda de dentes na população adulta em todo o mundo
(PAPAPANOU, 1996).
Figura 1.4: Inflamação do tecido gengival (gengivite): <http://WWW.eduardorubio.odo.br>
Introdução e Objetivo
7R.F.Menegon
Figura 1.5: Perda severa de dentes. Extraído da internet em: <http://WWW.eduardorubio.odo.br>
Figura 1.6: Reabsorção óssea. Extraído da internet em: <http://WWW.eduardorubio.odo.br>
A placa bacteriana é sabidamente o fator iniciante do desenvolvimento de
gengivites, sendo o seu controle, portanto, o ponto principal de uma boa prática
de higiene bucal (LÖE; THEILADE; JENSEN, 1965). No entanto, para muitos
pacientes, a habilidade necessária e a motivação pessoal para uma eficaz remoção
Introdução e Objetivo
8R.F.Menegon
mecânica da placa, estão além de suas capacidades, sobretudo para aqueles que
estão impossibilitados de movimentar seus membros superiores, ou apresentam
movimento limitado (HULL, 1980).
Neste sentido, dá-se a importância do desenvolvimento de fármacos
eficazes na profilaxia e tratamento destas doenças. Entre os agentes mais
amplamente utilizados no controle da gengivite e periodontite está o digluconato
de clorexidina, um antisséptico de amplo espectro e de eficácia comprovada (LÖE;
SCHIOTT, 1970). No entanto, tem sido demonstrado alguns efeitos adversos
devido ao seu uso por períodos prolongados, os quais limitam sua aceitação
pública, como amarelamento dos dentes e de restaurações dentárias (figura 1.7),
aumento na deposição de cálculo salivar, sabor desagradável de difícil
mascaramento farmacotécnico e lesão descamativa superficial (LÖE; SCHIOTT;
KARRING, 1976; ZANINI; BASILE; FOLLADOR; et al, 1997; TILLIS, 1999).
Figura 1.7: Manchas nos dentes provocadas pelo uso de clorexidina (TILLIS, 1999)
Introdução e Objetivo
9R.F.Menegon
Nestas situações, onde o desenvolvimento farmacotécnico é insuficiente
para corrigir ou mascarar problemas organolépticos relacionados ao fármaco,
modificações químicas podem ser consideradas. Através de técnicas de obtenção
de pro-fármacos, termo primeiramente utilizado por Albert, em 1958, para
descrever compostos que necessitavam de biotransformação prévia para promover
efeito farmacológico (BUNDGAARD, 1991), é possível a supressão de propriedades
indesejáveis como sabor ou odor desagradável, estabilidade insuficiente, estado de
agregação inapropriado e outros problemas de natureza físico-química
(WERMUTH, 1996).
Introdução e Objetivo
10R.F.Menegon
1.2. OBJETIVO
O objetivo deste trabalho consiste no estudo da obtenção de pró-fármaco
derivado de clorexidina utilizando o ácido palmítico como transportador, o qual
apresente uma remoção mais lenta nas cavidades orais e maior penetração nos
tecidos subgengivais, aumentando desta forma sua atividade nas doenças bucais,
além de minimizar a percepção de seu sabor desagradável, melhorando sua
aceitação pelos pacientes.
Objetivos específicos:
1. Síntese e caracterização do pró-fármaco derivado de clorexidina;
2. Determinação do coeficiente de partição (P) e Log P do pró-fármaco;
3. Determinação do tempo de retenção do pró-fármaco na cavidade bucal,
através de estudo cinético em saliva.
2– Revisão Bibliográfica
Revisão Bibliográfica
11R.F.Menegon
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. PERIODONTITE
As doenças periodontais são caracterizadas por uma reação inflamatória do
tecido gengival, em resposta a biofilmes bacterianos que se acumulam na
superfície da raiz dos dentes, resultando na perda de osso alveolar e do ligamento
periodontal. Periodontite crônica é a principal causa de perda de dentes na
população adulta em todo o mundo (PAPAPANOU, 1996). Essas doenças são
infecciosas, crônicas e freqüentemente assintomáticas, ocorrendo como resultado
da exposição do periodonto à ação das bactérias aderidas à superfície dentária, de
natureza não descamativa (AXELSSON; LINDHE, 1981).
A placa bacteriana é sabidamente o fator iniciante do desenvolvimento de
gengivites, sendo o seu controle, portanto, o ponto principal de uma boa prática
de higiene bucal (MOORE; HOLDEMAN; SMIBERT, 1984). A formação da placa dá-
se inicialmente com a adesão de uma película de constituintes salivares à
superfície dental, a qual é composta por material acelular derivado de
componentes salivares específicos, que compreendem proteínas altamente
carregadas e glicoproteínas. Acredita-se que esta película salivar seja a
responsável direta pela subseqüente aderência das bactérias orais. Esta aderência
ocorre provavelmente devido à interações entre receptores específicos na
Revisão Bibliográfica
12R.F.Menegon
superfície bacteriana com glicoproteínas da película. Uma vez ocorrida a adesão e
a colonização, dá-se início aos processos de aderência secundários. Nesta etapa, a
formação de produtos bacterianos extracelulares (levanos e glucanos) podem agir
aumentando a adesão entre as células e as protegendo. Se não houver nenhum
distúrbio dentro de 2 a 3 dias, a placa começa a mudar. O ambiente mais interno
da placa torna-se anaeróbio e outras formas de bactérias aparecem. A massa da
placa cresce até 200% de seu tamanho inicial, tornando-se uma grossa massa
gelatinosa sobre a superfície do esmalte. Se deixada permanecer na superfície do
dente, pode ocorrer deposição de fosfato de cálcio, levando à transformação da
placa em cálculo (NISENGARD; NEWMAN, 1997).
Apesar da impossibilidade da ausência total de placa bacteriana, a gengiva e
demais estruturas periodontais podem ser mantidas sadias se a quantidade da
placa for pequena, se a microbiota for pouco virulenta e ainda se os mecanismos
de defesa orgânica forem eficazes (PAGE; KORNMAM, 1997).
As bactérias formadoras do biofilme são habitantes normais da cavidade
bucal que recobre a superfície dos dentes. A colonização bacteriana se dá
normalmente e em poucas horas. Não havendo interferência no processo, o
biofilme dental se modificará quantitativa e qualitativamente, tornando-se mais
propício ao aparecimento da doença periodontal inflamatória (LISTGARTEN, 1987;
CHRISTERSSON; ZAMBON; DUNFORD; et al, 1989).
A doença periodontal é uma mistura específica de bactérias que causam
destruição periodontal nos indivíduos susceptíveis (OFFENBACHER, 1996).
Revisão Bibliográfica
13R.F.Menegon
Bactérias periodontopáticas específicas, com seus fatores peculiares de virulência
provocarão aumento da agressão que dificulta o processo de defesa do
hospedeiro. Quando o organismo não consegue suplantar a agressão, ocorre
migração apical do epitélio juncional e perda de inserção conjuntiva. O padrão de
progressão está diretamente relacionado ao binômio agressão e defesa (MOORE;
MOORE, 1994).
A microbiota na placa dental humana é diversa e muito complexa,
consistindo em mais de 300 tipos de bactérias diferentes (MOORE, 1987), mas
somente um pequeno grupo delas, denominadas microrganismos
periodontopáticos, são considerados agentes etiológicos primários na doença
periodontal humana (VAN WINKELHOFF, 1991).
Os principais microrganismos associados à doença periodontal são
Porphyrom onas gingivalis, Bacterioides forsythus, Prevotella interm edia,
Cam pylobacter rectus, Eikenella corrodens,Actinobacillus actinom ycetem com itans,
Capnocytophaga sp, Treponem a denticola, Eubacterium nodatum , Streptococcus
interm edia, Prevotella nigrescens, Peptostreptococcus m icros e Fusobacterium
nucleatum (HAFFAJEE; SOCRANSKY; DZINK; et al, 1988; TANNER; BOUDIN,
1989). Embora não seja certo quais microrganismos, ou combinação deles,
estejam envolvidos na indução da doença periodontal, estudos clínicos sugerem
que Porphyrom onas gingivalis, Bacterioides forsythus, Actinobacillus
actinom ycetem com itans,e Treponem a denticola estejam presentes na maioria dos
Revisão Bibliográfica
14R.F.Menegon
casos nos sítios de progressão da doença (SLOTS; LISTGARTEN, 1988;
SIMONSON; ROBINSON; PRANGER; et al, 1992).
As doenças periodontais são o resultado da destruição dos tecidos
periodontais pela ação dos produtos tóxicos liberados na área subgengival pelos
periodontopatógenos específicos, como também pela resposta inflamatória
desencadeada pela presença de microrganismos e seus sub-produtos tóxicos. A
inflamação leva à produção local de citocinas e mediadores biológicos
(interleucinas e prostaglandinas). Estão, portanto, associadas com a colonização
da área subgengival por bactérias patogênicas específicas, algumas destas com
capacidade de invadir os tecidos periodontais provocando danos. As bolsas
profundas, observadas nas formas graves de doença periodontal, oferecerão um
microambiente mais propício ao crescimento microbiano anaeróbio (BARILI, 2003).
Tüter e colaboradores (2001) mostraram que o estado clínico da
periodontite está intimamente relacionado com os níveis de interleucina -1? (IL-
1? ) no fluido crevicular gengival. A IL-1? é uma citocina inflamatória produzida
predominantemente por macrófagos em resposta a produtos bacterianos
(MASADA; PERSSON; KENNEY; et al, 1990; KJELDSEN; HOLMSTRUP; BENDTZEN,
1993; GORE; SANDERS; PANDEY; et al, 1998), sendo estes produtos, ou
endotoxinas, constituídos principalmente por lipopolissacarídeos (LPS), que são
componentes estruturais da parede celular de bactérias gram-negativas
(RAMAMURTHY; RIFKIN; et al, 2002).
Revisão Bibliográfica
15R.F.Menegon
Os LPS podem ativar as células hospedeiras no periodonto, incluindo
leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos e o epitélio sulcular,
mediante sua ligação aos receptores de superfície celular, neste caso, o receptor
CD14 de LPS (DING; UITTO; HAAPASALO; et al, 1996; MALHOTRA; BIRD, 1997).
Esta ativação celular pode induzir macrófagos da medula óssea a expressarem um
produto proto-oncogene, um provável marcador específico do fenotipo de
osteoclasto (ABU-AMER; ROSS; EDWARDS; et al, 1997), e vários tipos celulares,
como fibroblastos e macrófagos, a secretarem citocinas pró-inflamatórias e
metaloproteinases (WILSON, 1995).
A atividade da colagenase, uma dentre uma série de proteinases
degradantes da matriz óssea, chamadas de metaloproteinases, é um passo
limitante da colagenólise patológica na periodontite (HARRIS; WELGUS; KRANE,
1984).
A liberação dos fragmentos de degradação do colágeno, assim como a
exposição e/ou liberação de mediadores biológicos (ex. osteocalcinas e citocinas),
atrai osteoclastos para os ossos mineralizados, e assim iniciam o processo de
reabsorção óssea (HOLLIDAY; WELGUS; FLISZAR; et al, 1997). Os osteoblastos,
células cuja principal função é a síntese de nova matriz óssea (a qual é composta
por 90% de colágeno tipo I) (PLOSKER; GOA, 1994), também é capaz de iniciar a
reabsorção óssea através da síntese de proteinases neutras, incluindo
metaloproteinases (ex. colagenase) a qual podem degradar o tecido osteóide
(HOLLIDAY; WELGUS; FLISZAR; et al, 1997).
Revisão Bibliográfica
16R.F.Menegon
Tai e colaboradores, em 1997, demonstraram que a adição de IL-1? , IL-6, e
receptor solúvel de IL-6, sobre cultura de osteoblastos induziram
cooperativamente a estimulação de cox-2, aumentando a produção de
prostaglandina E2 (PGE2), que é um potente estimulador da reabsorção óssea. Este
aumento de PGE2 parece ser o responsável pela osteoclastogênese a partir dos
osteoblastos (RAMAMURTHY; RIFKIN; et al, 2002).
PGE2 é o principal metabólito do ácido araquidônico, o qual pode ser
produzido por muitas células. Macrófagos estimulados por LPS podem ser um
importante produtor desta prostaglandina na doença periodontal (ALEXANDER;
EVANS, 1971; LINDEMANN; ECONOMOU; ROTHERMEL, 1988). Além disso, esses
macrófagos estimulados secretam IL-1 e TNF? (fator de necrose tumoral) que
estimulam fibroblastos a secretarem PGE2 (NEWTON; COVINGTON, 1987;
MOLVIG; BAEK; CHRISTENSEN; et al, 1988; RICHARDS; RUTHERFORD, 1988). As
prostaglandinas têm sido relacionadas por diversos autores com a perda óssea
(OFFENBACHER; ODLE; van DYKE 1986, OFFENBACHER; ODLE; BRASWELL; et al
1989; SALVI; SPETS-HAPPONEN; SINGER; et al, 2005).
A evolução da doença, assim como seu início, é modificada por condições
locais e sistêmicas, denominados fatores de risco. Desta forma, as doenças
periodontais são associadas aos microrganismos periodontopatógenos do biofilme
dental, e aos fatores de riscos, que incluem o tabagismo, o estresse emocional, o
diabetes, HIV entre outros, capazes de alterar a resposta à ação dos
microrganismos. Medidas preventivas e terapêuticas devem reconhecer, identificar
Revisão Bibliográfica
17R.F.Menegon
e eliminar ou controlar o fator etiológico primário (biofilme dental) como também
os fatores de risco associados ao processo da doença (VAN DIKE, 1993; GENCO,
1996; SAKKI; KNUUTTILA; ANTTILA, 1998).
2.2. TRATAM EN TO
O controle da formação da placa bacteriana é o ponto principal para a
prevenção de gengivites e de outras doenças periodontais. Uma boa prática de
higiene bucal consiste em sua remoção mecânica, através da escovação dental
(LÖE; THEILADE; JENSEN, 1965; MOORE; HOLDEMAN; SMIBERT; et al, 1982,
1984).
No entanto, tendo em vista a necessidade de motivação pessoal e uma
habilidade manual para uma correta escovação dental, muitos pesquisadores vêm
estudando a etiologia e o desenvolvimento dessa patologia, de maneira a
encontrar alternativas terapêuticas cada vez mais eficazes (HULL, 1980).
Até a década de 1980, os principais grupos de substâncias utilizadas para o
controle da placa bacteriana e da cárie eram: 1) enzimas; 2) antibióticos, e 3) anti-
sépticos. Mais recentemente, têm se estudado agentes inibidores da colagenase,
antiinflamatórios não esteroidais e inibidores na reabsorção óssea, como forma de
modular a resposta do hospedeiro aos patógenos quando a doença já está
instalada.
Revisão Bibliográfica
18R.F.Menegon
2.2.1.Enzim as
Preparações com enzimas foram estudadas numa tentativa de romper a
matriz da placa bacteriana, causando uma dispersão desta (HULL, 1980).
Deste modo, muitas enzimas foram testadas, dentre elas destacam-se a
mucinase, enzimas do pâncreas desidratado (tripsina, quimotripsina,
carboxipeptidase, amilase, lipase e nucleases), enzimas originárias de fungos,
dextranase e mutanase (HULL, 1980).
Apesar de algumas delas terem apresentado uma significativa redução na
formação dos cálculos salivares, alguns efeitos indesejáveis, como feridas na
língua, ulcerações localizadas e perturbações no paladar foram observados, o que
levou ao quase abandono desta terapia (HULL, 1980).
2.2.2. Antibióticos
Dado o fato de a placa ser constituída por microrganismos, a terapia
antibiótica visa à prevenção e ao controle da formação delas.
A introdução da antibioticoterapia no controle da placa se deu com a
observação de que pacientes que faziam uso de penicilinas por longos períodos
como profilaxia da febre reumática apresentavam uma significante redução nas
cáries dentárias e na inflamação da gengiva (ZANDER, 1950).
Revisão Bibliográfica
19R.F.Menegon
Os efeitos da eritromicina (estrutura 1, quadro 2.1, página 33) foram
reportados por Lobene e colaboradores, em 1969, quando se observou redução de
35% na formação das placas (LOBENE; BRIAN; SOCRANSKY, 1969).
Enxaguatórios bucais contendo 0,01% de nidamicina (estrutura 2, quadro
2.1, página 33) produziram redução substancial na placa, cálculo e gengivite,
quando usada duas vezes ao dia (VOLPE; KULPLZAK; BRANT; et al, 1969).
Aplicações tópicas de sulfato de canamicina (estrutura 3, quadro 2.1, página
33) a 5% em Orabase foram estudadas por Loesche e colaboradores em 1977,
produzindo redução na gengivite, a qual foi atribuída ao decréscimo da população
de streptococci na placa (LOESCHE; HOCKETT; SYED, 1977).
Löe e colaboradores, em 1967, compararam os efeitos de 3 enxaguatórios
bucais contendo tetraciclina, vancomicina e polimixina B (estruturas 4, 5 e 6
quadro 2.1, página 33). Destas, a tetraciclina foi a mais efetiva dos três
antibióticos investigados, sendo que somente no grupo das tetraciclinas houve
redução na inflamação da gengiva. Listgarten e colaboradores, em 1978,
observaram marcante melhora nas condições gengivais de pacientes tratados
sistemicamente com tetraciclina. Houve também diminuição na microbiota
subgengival dos pacientes estudados.
Uma importante observação foi feita por Williams e colaboradores, em 1979,
ao notificar diminuição na perda de osso alveolar em cães da raça beagle tratados
com tetraciclina.
Revisão Bibliográfica
20R.F.Menegon
A espiramicina (estrutura 7, quadro 2.1, página 33) é efetiva principalmente
contra organismos Gram-positivos, sendo interessante o fato dela ser mantida em
seu estado ativo por prolongados períodos nas glândulas salivares, saliva e ossos.
Winer e colaboradores (1966) mostraram ser a espiramicina a mais efetiva dentre
nove agentes antimicrobianos testados em hamisters para o controle de placa,
caries e lesões periodontais.
De maneira geral, antibióticos, particularmente os de amplo espectro,
demonstraram-se capazes de prevenir a colonização bacteriana reduzindo, desta
forma, a severidade da gengivite. No entanto, existem muitos problemas
associados a antibioticoterapia prolongada, os quais usualmente limitam sua
aplicabilidade no controle da doença periodontal. Estes problemas incluem: 1) o
desenvolvimento de cepas resistentes de microrganismos, tornando o antibiótico
ineficiente tanto para a prevenção do acúmulo da placa quanto no controle de
infecções sistêmicas; 2) o aumento de outros microrganismos da microbiota bucal,
ex., Candida albicans, contra os quais, o antibiótico é ineficiente, e 3) ocorrência
de reações de hipersensibilidade ao medicamento.
2.2.3. Anti-sépticos
Muitos agentes anti-sépticos foram investigados na tentativa de suprimir a
microbiota bucal e inibir a formação de cáries. O principal grupo anti-séptico é o
das biguanidas, na qual se inclui o mais bem sucedido agente antiplaca, a
Revisão Bibliográfica
21R.F.Menegon
clorexidina (estrutura 8, quadro 2.1, página 33). Outras biguanidas, como a
hexetidina e alexidina, também são eficazes, sem que tenham qualquer vantagem
sobre a clorexidina, a qual já foi extensivamente estudada (HULL, 1980).
Um importante experimento foi realizado por Löe e Schiott (1970). Estes
pesquisadores demonstraram que, na ausência de limpeza mecânica dos dentes, a
formação de placa e o desenvolvimento de gengivites foram prevenidas pelo
enxágüe com solução de gluconato de clorexidina a 0,2% duas vezes ao dia
durante de 21 dias. A única desvantagem notificada foi o aparecimento de
manchas nos dentes e na língua, além do sabor desagradável da clorexidina.
O aparecimento destas manchas se devem, aparentemente, a reações de
precipitação entre os cromóforos encontrados nos alimentos e à clorexidina
aderida aos dentes (TILLIS, 1999).
Foi demonstrado também, que a clorexidina apresenta afinidade por regiões
da superfície bucal, sendo gradualmente liberada exercendo sua ação anti-séptica
(RÖLLA; LÖE; SCHIOTT, 1976). Esta ligação reversível exerce importante papel no
mecanismo de ação da clorexidina.
A ação da clorexidina depende da adsorsão do composto na parede celular
das bactérias. Os grupos lipofílicos da molécula causam desorientação das
lipoproteínas da membrana celular, alterando sua permeabilidade,
consequentemente o equilíbrio osmótico. (HUGO; LONGWORTH, 1964, 1965). Em
baixas concentrações, a clorexidina causa lise em microrganismos osmoticamente
Revisão Bibliográfica
22R.F.Menegon
sensíveis e em altas concentrações leva a um violento choque osmótico (HUGO;
LONGWORTH, 1964).
Davies e colaboradores (1954) demonstraram que na concentração de
1:2.000.000 a clorexidina previne o crescimento de Estafilococcus aureous e
Estreptococcus lactis (entre outros), e que diluições de 1:50.000 impedem o
crescimento de Pseudom onas aeruginosa. Resultados semelhantes foram
encontrados por Lawrence (1960), que demonstrou também ser necessária apenas
uma pequena diferença nas concentrações para produzir efeitos bacteriostático ou
bactericida.
Outro importante grupo de anti-sépticos é o dos compostos de amônio
quaternário, no qual estão incluídos o cloreto de benzetônio e cloreto de
cetilpiridínio (estruturas 9 e 10, quadro 2.1, página 33). Apesar destas substâncias
apresentarem certa similaridade com as propriedades químicas e antibacterianas
da clorexidina (VOLPE; KULPLZAK; BRANT; et al, 1969), esta última apresenta
maior efetividade no controle da placa in vivo do que os compostos quaternários
investigados por Gjermo (1970).
As diferenças clínicas entre estes dois grupos de anti-sépticos podem ser
explicadas pelas taxas de remoção destas substâncias pela saliva. Os compostos
quaternários são claramente mais rapidamente removidos da boca que a
clorexidina. Isto explica a observação de que quando se enxágua a boca com
amônio quaternário 4 vezes ao dia, ao invés de 2 vezes, o efeito inibitório sobre as
placas também aumenta (BONESVOLL; GJERMO, 1978). Os efeitos colaterais
Revisão Bibliográfica
23R.F.Menegon
destas substâncias são similares aos encontrados com as biguanidas, ou seja,
sabor desagradável e aparecimento de manchas nos dentes (CIANCIO; MATHER;
BUNNEL, 1975).
Até o presente, o enxágüe bucal com clorexidina é o método mais utilizado
e investigado para o controle químico da placa, demonstrando alta efici ência na
inibição quase completa da formação da placa. A clorexidina tem se mostrado
muito segura e com poucos efeitos adversos registrados. Flötra e colaboradores
(1972), demonstraram que, embora a clorexidina seja muito eficiente no controle
da placa supragengival, ela não é efetiva contra a placa subgengival. O controle da
placa supragengival não necessariamente produz mudanças na microbiota
subgengival, a qual está mais relacionada às características destrutivas da
periodontite crônica. Sugere-se que a melhor utilização da clorexidina seja como
auxiliar no tratamento da periodontite ou profilática na prevenção da formação da
placa supragengival (FLÖTRA; GJERMO; RÖLLA; et al, 1972).
As mesmas observações podem ser válidas para os compostos de amônio
quaternário, os quais, a despeito de necessitarem de mais enxágües diários,
possivelmente apresentam mais efeitos adversos com seu uso prolongado, sem
que apresente, no entanto, qualquer vantagem sobre as biguanidas (FLÖTRA;
GJERMO; RÖLLA; et al, 1972).
Mais recentemente, tem sido pesquisada a atividade de agentes inibidores
da colagenase, tanto às de origem mamífera quanto às provindas de
microrganismos periodontopáticos, como as Porphyrom onas gingivales,
Revisão Bibliográfica
24R.F.Menegon
Actinobacillus actinom ycetem com itans, espécies de Espiroquetas e de Bacilos
(MOOKHTIAR; MARLOWE; BARLETT; et al, 1987; MAKINEN; SYED; LOESCH; et al,
1988). Nesse sentido, foram estudados alguns inibidores da colagenase mamífera,
como o ácido retinóico (BRINKERHOFF; MCMILLAN; DAYER; et al, 1980), fenitoína
(MAKINEN; SYED; LOESCH; et al, 1988), negro de eriocromo T (MAKINEN; SYED;
LOESCH; et al, 1988) e fosfonamidas (MOOKHTIAR; MARLOWE; BARLETT; et al,
1987) (estruturas 11 a 14 respectivamente, quadro 2.1, página 33).
O cloranil (estrutura 15, quadro 2.1, página 33) e a fosfonamida têm sido
investigados como inibidores da colagenase bacteriana também (GREENWALD;
GOLUB; LAVIETES; et al, 1987; GREENWALD; SIMONSON; MOAK; et al, 1988).
Diversos estudos têm notificado que os antibióticos da classe das
tetraciclinas podem inibir colagenases mamíferas por mecanismo independente de
sua atividade antibacteriana (LEE; GOLUB; GWINNETT; et al, 1985; GOLUB;
McNAMARRA; D’ANGELO; et al, 1987; GREENWALD; GOLUB; LAVIETES; et al,
1987 ; GREENWALD; SIMONSON; MOAK; et al, 1988). Elas podem, também, inibir
outras metaloproteinases (gelatinases, colagenases tipo IV/V e elastases)
envolvidas no tecido conectivo (LEE; GOLUB; GWINNETT; et al, 1985; CHANG;
RAMAMURTHY; GOLUB, 1989). Desde a descoberta da ação anticolagenase deste
grupo de fármacos, o potencial terapêutico de suas propriedades não
antimicrobianas vem sendo considerado (GOLUB; RAMAMURTH; McNAMARA; et al,
1991; GOLUB; SUOMALAINEN; SORSA, 1992).
Revisão Bibliográfica
25R.F.Menegon
Posteriormente, 10 tetraciclinas quimicamente modificadas (CMTs)
(estrutura 16 – CMT-8, quadro 2.1, página 33), desprovidas de ação
antimicrobianas, foram sintetizadas, dentre as quais 9 mostram propriedades
anticolagenase (GOLUB; RAMAMURTH; McNAMARA; et al, 1991; GOLUB;
SUOMALAINEN; SORSA, 1992; SORSA; RAMAMURTHY; VERNILLO; et al, 1998).
Ramamurthy e colaboradores (2002), compararam a doxiciclina (estrutura 17,
quadro 2.1, página 33) com as CMTs, quanto à ação inibitória das
metaloproteinases, em modelo animal (usando ratos) de inflamação periodontal
com perda óssea induzida por endotoxinas. Neste trabalho, foi demonstrado que
estas CMTs podem ser capazes de inibir a reabsorção óssea através de ação sobre
a ativação oxidativa de metaloproteinases latentes, cuja síntese é regulada através
da ação de citocinas pró inflamatórias, as quais as CMTs também são capazes de
reduzir seus níveis no tecido periodontal; a doxiciclina, por outro lado, não é capaz
de inibir a atividade das metaloproteinases latentes (LEE; GOLUB; GWINNETT; et
al, 1985; SOBRIN; LIU; MONROY; et al, 2000).
Um estimulador da síntese de muitas citocinas pró-inflamatórias é o óxido
nítrico (NO), o qual aumenta a quantidade destas citocinas através do aumento da
expressão das isoformas da ciclooxigenase (cox-1 e cox-2) (SALVEMINI, 1997). A
produção de NO é aumentada na presença de LPS, estando, portanto, envolvida
no processo patológico da periodontite crônica. No entanto, um inibidor da óxido
nítrico sintase (iNOS), a aminoguanidina (estrutura 18, quadro 2.1, página 33),
aumenta notavelmente a reabsorção óssea in vitro (KASTEN; COLLIN-OSDOBY;
Revisão Bibliográfica
26R.F.Menegon
PATEL; et al, 1994), não apresentando, até o momento, utilidade terapêutica na
periodontite. Este fato aparentemente ambíguo se deve não à ação regulatória
sobre a expressão de isoformas da ciclooxigenase, mas sim à uma regulação
bidirecional da função osteoclástica pelo óxido nítrico. Por um lado, o NO
produzido por osteoblastos inibe a função de osteoclastos maduros, diminuindo a
reabsorção óssea, por outro lado, os próprios osteoclastos, assim como seus
precursores, também são capazes de produzir NO, e que mínimas quantidades do
radical livre são necessárias para o funcionamento normal destas células. A
inibição da síntese de NO leva notoriamente ao aumento da atividade
osteoclástica sobre a reabsorção óssea (BRANDI; HUKKANEN; UMEDA; et al,
1995).
Atualmente, para a modulação da resposta do hospedeiro, estudos
apontam: 1) o uso de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs) para reduzir os
metabólitos do ácido araquidônico, como a PGE2, reduzindo, então, a cascata
inflamatória, e também a osteoclastogênese a partir dos osteoblastos (JEFFCOAT;
REDDY; HAIGH; et al, 1995; WILLIAMS; JEFFCOAT; HOWELL; et al, 1989); 2) O
uso de doses sub-antimicrobianas de doxiciclina ou CMTs para reduzir a
quantidade de derivados metaloproteinase (como a colagenase), e 3) O uso de
substâncias capazes de reduzirem o recrutamento, a fixação e a atividade dos
osteoclastos (inibindo também as metaloproteinases), reduzindo então a
reabsorção óssea, como os bifosfonatos (BFs) por exemplo (PLOSKER; GOA, 1994;
Revisão Bibliográfica
27R.F.Menegon
TAI; MIYAURA; PULBEAM; et al, 1997; TERONEN; KONTTINEN; LINDQVIST; et al,
1997).
2.2.4. Antiinflam atórios Não Esteroidais (AINEs)
PGE2 é o principal metabólito do ácido araquidônico, o qual pode ser
produzido por muitas células. Macrófagos estimulados por LPS podem ser
importantes produtores desta prostaglandina na doença periodontal (ALEXANDER;
EVANS, 1971; LINDEMANN; ECONOMOU; ROTHERMEL, 1988). Além disso, esses
macrófagos estimulados secretam IL-1 e TNF? (fator de necrose tumoral) que
estimulam fibroblastos a também secretarem PGE2 (NEWTON; COVINGTON, 1987;
MOLVIG; BAEK; CHRISTENSEN; et al, 1988; RICHARDS; RUTHERFORD, 1988).
As prostaglandinas têm sido relacionadas com a perda óssea por diversos
pesquisadores (OFFENBACHER; ODLE; BRASWELL; et al, 1989; JOHNSON; WOOD;
SERIO, 2004; SALVI; SPETS-HAPPONEN; SINGER; et al, 2005). Neste sentido, os
antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), que inibem a produção de
prostaglandinas, tem reduzido significativamente a taxa de perda óssea
(WILLIAMS; JEFFCOAT; KAPLAN; et al, 1985; WILLIAMS; JEFFCOAT; HOWELL; et
al, 1987, 1989; TIPTON; FLYNN; STEIN; et al, 2003).
Williams e colaboradores (1989) foram capazes de demonstrar a diminuição
na perda óssea, através de método radiográfico, em pacientes tratados com
flurbiprofeno (estrutura 19, quadro 2.1, página 33). Outros AINEs, como
Revisão Bibliográfica
28R.F.Menegon
naproxeno (estrutura 20, quadro 2.1, página 33), têm reduzido a perda óssea
alveolar em periodontite crônica e em pacientes com forma mais agressiva da
doença através de sua ação inibitória na formação de prostaglandinas
(OFFENBACHER, 1996), e mais recentemente inibidores específicos da
ciclooxigenase-2 têm se mostrado eficazes também no controle da produção de
interleucinas por fibroblastos (TIPTON; FLYNN; STEIN; et al, 2003).
2.2.5. Doses sub-antim icrobianas de doxiciclina
Um estudo pioneiro realizado por Golub e colaboradores demonstrou o
efeito anti-proteinase de tetraciclina no tecido gengival humano e a redução da
atividade colagenolítica de uma metaloproteinase específica degradante da matriz,
derivada do hospedeiro (colagenase mamífera) (GOLUB; CIANCIO; RAMAMURTHY;
et al, 1990). Neste estudo, um regime de baixa dosagem de doxiciclina reduziu
substancialmente a atividade colagenolítica no fluido da bolsa periodontal e
também na gengiva de humanos com periodontite.
O benefício potencial do emprego de dose sub-antimicrobiana de doxiciclina
como auxiliar na remoção mecânica da placa e na higiene bucal para prevenção do
rápido progresso da periodontite crônica foi testada pela primeira vez por Novak e
colaboradores, em 2002. Uma vez que a rápida destruição do tecido periodontal
envolve a destruição da matriz colagenase, incluindo o tecido conectivo gengival,
ligamento periodontal, e osso alveolar, é possível pressupor que inibidores de
Revisão Bibliográfica
29R.F.Menegon
colagenase, como doses sub-antimicrobianas de doxiciclina, deve ter efeito
benéfico como auxiliar na terapia tradicional. De fato, os resultados encontrados
permitem especular que a combinação de baixas doses de doxiciclina com um
agente suplementar antimicrobiano, como a clorexidina ou um antibiótico tópico ou
sistêmico, pode agir sinergicamente produzindo uma melhora clínica não alcançada
pelo uso individual dessas substâncias.
2.2.6. Bifosfonatos e Tetraciclinas Quim icam ente M odificadas
Tetraciclinas quimicamente modificadas (CMTs), desprovidas de ação
antimicrobiana, podem apresentar ação similar aos bifosfonatos como inibidores da
reabsorção óssea, perturbando a função osteoclástica. Assim, como os
osteoclastos degradam os ossos, doses de CMTs ou de bifosfonatos, que são
direcionados aos ossos, serão absorvidas pelos osteoclastos, cuja função será
subseqüentemente inibida (HUGHES; WRIGHT; UY; et al, 1995).
A manutenção da massa normal e saudável dos ossos depende da interação
entre osteoblastos, osteoclastos e constituintes da matriz óssea para balancear a
reabsorção óssea e a sua formação. O desbalanceamento desse equilíbrio acarreta
em perda patológica de massa óssea, como é observado em periodontites,
osteoporose e tumores osteolíticos (FLEISCH, 1997).
O osteoclasto apresenta um sensor de cálcio sobre sua membrana em
contato com o plasma (ZAIDI; SHANKER; TUNWELL; et al, 1995). Uma mudança
Revisão Bibliográfica
30R.F.Menegon
na concentração extracelular de cálcio é monitorada por essas células e
internalizada em um sinal citosólico de cálcio, resultando em marcada inibição da
função osteoclástica. Então, quando CMTs ligam-se ao sensor do osteoclasto,
muitas funções celulares correlacionadas são reduzidas. Isto inclui a adesão à
matriz, secreção enzimática e reabsorção óssea (ZAIDI; MOONGA; HUANG; et al,
1993; ZAIDI; SHANKER; TUNWELL; et al, 1995).
Receptores de cálcio são expressos também na membrana nuclear dessas
células (ZAIDI; MOONGA; ADEBANJO, 1999), onde tais receptores provavelmente
controlam o influxo de cálcio para o nucleoplasma. Então, o cálcio
nucleoplasmático regula os processos críticos nucleares, incluindo a expressão de
genes e a apoptose. É sabido que CMTs podem também se ligar aos receptores de
cálcio na membrana nuclear, alterar o influxo nucleoplasmático de cálcio e,
conseqüentemente, afetar a expressão de genes osteoclásticos e a apoptose.
Um estudo realizado por Ramamurthy e Rifkin (2002) sugeriram que
mecanismos moleculares, múltiplos, adicionais, podem ser regulados com estas
substâncias. Tais mecanismos incluem, mas não se limitam necessariamente, 1) a
redução nos níveis de citocinas pró-inflamatórias, após injeções de endotoxinas
bacterianas; 2) a redução na atividade de metaloproteinases degradantes da
matriz, e 3) o aumento dos níveis de IL-10, uma citocina (interleucina)
antiinflamatória, resultando na redução da osteoclastogênese e reabsorção óssea.
O efeito da associação de um bifosfonato, o clodronato (estrutura 21,
quadro 2.1, página 33), um potente inibidor da reabsorção óssea, com um análogo
Revisão Bibliográfica
31R.F.Menegon
não antimicrobiano quimicamente modificado da doxiciclina (CMT-8),
administrados em ratos com periodontite induzida por LPS, foi estudado por
Llavaneras (2001). Cada substância foi administrada em doses tais que, baseado
em experimentos de dose-resposta preliminares, são consideradas muito baixas
para produzirem efeitos terapêuticos ótimos em regime de monoterapia, uma
estratégia desenvolvida para definir a eficácia do tratamento combinado.
A combinação de CMT-8 e clodronato em doses sub-terapêuticas reduziu
significativamente a reabsorção óssea alveolar e os níveis de metaloproteinases
degradantes do tecido, em extratos de gengiva obtidos de ratos tratados com LPS,
enquanto cada um dos medicamentos, por si só, nas mesmas dosagens,
apresentaram apenas pequeno e estatisticamente insignificante efeito. Estes
resultados sugerem que estas substâncias atuam sinergicamente na redução dos
níveis de metaloproteinases gengivais e na reabsorção óssea.
Como pode ser observado, as estratégias para o tratamento das
periodontites crônicas com perda óssea evoluíram de tal forma, que o controle da
microbiota bucal aparentemente deixou de apresentar um papel principal no
tratamento para ocupar, de certa forma, um lugar secundário, onde se prestigia o
controle da perda óssea através da inibição da atividade dos mediadores químicos
responsáveis pela patologia. É claro que um controle sobre os principais
microrganismos envolvidos com a indução da resposta inflamatória, sobretudo de
bactérias gram-negativas como as Porphyrom onas gingivales e Actinobacillus
actinom ycetem com itans, é sempre desejável; assim, com a diminuição do
Revisão Bibliográfica
32R.F.Menegon
emprego de antibióticos, principalmente os de amplo espectro, contribui-se para o
uso racional destes medicamentos, evitando seu abuso e , consequentemente, o
aparecimento de resistência por parte dos microrganismos.
Modernas abordagens terapêuticas têm sido estudadas empregando-se
proteínas morfogenéticas ósseas para a remodelagem do tecido periodontal. No
entanto, apesar do sucesso de ensaios in vitro, parece que certas dificuldades,
como a atividade biológica excessivamente curta destas proteínas, vêm
comprometendo os resultados in vivo. Jin e colaboradores, em 2003, parecem ter
conseguido resultados animadores utilizando modernas técnicas de transferência
de genes.
A seguir está apresentado o quadro 2.1 das estruturas dos compostos
mencionados, utilizados e/ou estudados para o tratamento da periodontite.
Revisão Bibliográfica
33R.F.Menegon
Quadro 2.1: Estruturas química dos compostos pesquisados para o tratamento da periodontite .
AN TIBIÓTICOS REFERÊN CIAS ESTRUTURA
01 eritromicina
LOBENE; BRIAN;
SOCRANSKY, 1969
02 nidamicina
VOLPE; KULPLZAK;
BRANT; et al, 1969
03 canamicina
LOESCHE;
HOCKETT; SYED,
1977
O
O
O
O
NH2
O H
OH
OHOH
NH2
NH2
OH
OHNH2
O H
CH 3 O
O
CH3
O
O H
O
CH3
O
O
O
CH3
O
N C H3
CH3OH
O
O H
CH3
O
CH 3
O
CH3
CH3
O O O
O
O
N
O
O
O H
OH
O H
OH
O
O H
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
C H3
CH 3
CH3CH3
CH3
CH3
CH3
Revisão Bibliográfica
34R.F.Menegon
04 tetraciclina
LÖE; THEILADE;
JENSEN; et al, 1967
05 vancomicina
LÖE; THEILADE;
JENSEN; et al, 1967
06
polimixina B
(mistura das polimixinas B1
e B2)
LÖE; THEILADE;
JENSEN; et al, 1967
OO
N
OHOO H
O H
OH
NH2
CH3
O H
CH3 CH3
H
NH
NH
NH
NH
NH
N H
O
O
OO
O O
O
OO
O
O O
O
O
NH2
OH
OH
OH
NH
NH 2
OH
Cl
OHCl
O H
OH
O HOH
CH 3
O H
CH 3
CH3
CH3
CH 3
H
H
H
H H
HH
H
R-L-DAB-
L-Thr
L-DAB-
L-DAB
L-DAB-
D-Phe-
L-Leu
L-Thr-
L-DAB-
L-DAB
Polimixina B 1: R= (+)-6-metioctanoil
Polimixina B 2: R= 6-metilheptanoil
DAB= ácido ??? -diaminobutírico
Revisão Bibliográfica
35R.F.Menegon
07espiramicina
WINER; COHEN;
CHAUNCEY, 1966
AN TISSÉPTICO S REFERÊN CIAS ESTRUTURAS
08clorexidina
DAVIES; FRANCIS;
MARTIN; et al, 1954
09
cloreto de
benzetônio
VOLPE; KULPLZAK;
BRANT; et al, 1969
OO
O
O
O
O
O
N
O
O
O
OH
O
O H
O
CH 3
OH
CH 3
CH 3
CH3 CH3
CH3
CH 3
CH 3
CH 3
CH 3
N HNHNH
N H
N H
NH
NH
NH
N HNH
C l
Cl
N+
O
CH 3
CH3
CH 3
CH 3
O
CH 3 CH 3
CH 3
Cl-
Revisão Bibliográfica
36R.F.Menegon
10
cloreto de
cetilpiridínio
VOLPE; KULPLZAK;
BRANT; et al, 1969
DIVERSO S REFERÊN CIAS ESTRUTURAS
11ácido
retinóico
BRINKERHOFF;
MCMILLAN; DAYER;
et al, 1980
12 fenitoína
MAKINEN; SYED;
LOESCH; et al, 1988
N+
CH3
Cl-
O
O H
CH3
CH3CH3
CH3C H3
NHNH
O
O
Revisão Bibliográfica
37R.F.Menegon
13negro de
eriocromo T
MAKINEN;
MAKINEN, 1988
14 fosfonamida
MOOKHTIAR;
MARLOWE;
BARLETT; et al,
1987
15 cloranil
GREENWALD;
SIMONSON; MOAK;
et al, 1988
O
O
Cl
Cl
Cl
Cl
S
O
O
O-
N
N
OH
N+
O-
O
Na+
N
O
O
CH 3
P
O
O-
O
NH
CH 3CH3
O
NH
CH 3
O
NH 2
Revisão Bibliográfica
38R.F.Menegon
16 CMT-8
PATEL; ATTUR;
DAVE; et al, 1999
17 doxiciclina
GOLUB; CIANCIO;
RAMAMURTHY; et
al, 1990
INIBIDORES DA N O SIN TASE
REFERÊN CIAS ESTRUTURAS
18 aminoguanidina
BRANDI;
HUKKANEN;
UMEDA; et al, 1995
OO OH
OH
OH
NH2
O H
O H
N
OOO H
OO H
O H
O H
NH2
CH3
OH
CH3CH3
H H
O
H
H
NH
NHNH2
NH2
Revisão Bibliográfica
39R.F.Menegon
AINEs REFERÊN CIAS ESTRUTURAS
19 flurbiprofeno
WILLIAMS;
JEFFCOAT; KAPLAN;
et al, 1985
20 naproxeno
OFFENBACHER,
1996
BIFOSFONATOS REFERÊN CIAS ESTRUTURAS
21ácido
clodrônico
LLAVANERAS;
RAMAMURTHY;
HEIKKILÄ; et al,
2001
O
F
O H
CH3
O O H
O
CH3
CH3
P P
O
O
Cl
ClO H
O H
O H
OH
Revisão Bibliográfica
40R.F.Menegon
2.3. PLANEJAM ENTO DE PRÓ-FÁRM ACOS
2.3.1. Definição
Pró-fármaco (ou pró-agente) é um termo utilizado para descrever
compostos que necessitam de biotransformação prévia para promover efeito
farmacológico (BUNDGAARD, 1991), sendo primeiramente introduzido em 1958,
por Adrien Albert, que o definiu como “agentes terapêuticos que são inativos per
se mas são transformados em um ou mais metabólitos ativos”. O termo
latenciação foi proposto por Harper, em 1988, para designar o processo de
obtenção de pró-fármacos.
A latenciação, transformação do fármaco em forma de transporte inativo
que, in vivo, mediante reação química ou enzimática, libera a porção ativa no local
de ação ou próximo dele (figura 2.1), destaca-se entre os processos de
modificação molecular quanto à introdução de novos fármacos no mercado
(BUNDGAARD, 1991; CHUNG; FERREIRA, 1999).
Revisão Bibliográfica
41R.F.Menegon
Figura 2.1: Representação esquemática do conceito de pró-fármacos (BUNDGAARD, 1991).
Sinvastatina, omeprazol, aciclovir, lovastatina e enalapril são alguns
exemplos bem conhecidos de pró-fármacos (figura 2.2) (ETTMAYER; AMIDON;
CLEMENT; et al, 2004).
FÁRM ACO
PRÓ -FÁRM ACO
FÁRM ACO + TRANSPORTADOR
Biotransform açãoenzim ática ou quím ica
Barreira
Revisão Bibliográfica
42R.F.Menegon
Figura 2.2: Exemplos de pró-fármacos no mercado (ETTMAYER; AMIDON; CLEMENT; et al, 2004).
Entre os diversos métodos de preparação de pró-fármacos, a esterificação é
o mais empregado, seguido da formação de amidas, imidas e carbamatos
(KOROLKOVAS, 1988; BUNDGAARD, 1991). Outras ligações vêm merecendo
atenção na obtenção de pró-fármacos nos quais a biotransformação não seja
enzimática, como as iminas, bases de Mannich e enaminas. A formação de sais,
complexos e acetais também são possíveis (CRUZ, 1995).
O
O
O
O
OH
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
HH
H
N
NH
S
N
O
O
CH3O
CH3 CH3
CH3
NNH
NH2
O
N
N
OOH
O
OO
OOH
CH3
CH3
CH3
CH3
H
H H
N
NH
O
O
O
OH
OCH3
CH3
H H
sinvastatina omeprazol
aciclovir lovastatina
enalapril
Revisão Bibliográfica
43R.F.Menegon
Os pró-fármacos podem ser classificados de acordo com dois critérios
principais (ETTMAYER; AMIDON; CLEMENT; et al, 2004).
1º) Pela classe química:
- pró-fármacos ligados a um transportador;
- bioprecursores;
- sistemas de liberação química em local específico (pró-
fármacos dirigidos);
- pró-fármacos macromoleculares;
- conjugados fármaco-anticorpo.
2º) Pelo mecanismo de ativação:
- por meio enzimático versus não enzimático;
- por reações catabólicas versus anabólicas;
- por oxidação, redução ou hidrólise.
2.3.2. Solução de Problem as
Os pró-fármacos podem ser planejados para superar barreiras
farmacocinéticas, farmacodinâmicas ou farmacotécnicas, como estabilidade
química insuficiente, baixa solubilidade, sabor ou odor indesejável, dor ou irritação,
absorção bucal insuficiente, permeabilidade inadequada à barreira hemato-
encefálica e acentuada toxicidade e metabolismo pré-sistêmico (STELLA;
CHARMAN; NARINGREKAR, 1985). Nesta revisão será dado maior enfoque aos
Revisão Bibliográfica
44R.F.Menegon
problemas farmacotécnicos, sobretudo os relacionados à solubilidade e às
características organolépticas.
2.3.2.1. Correção de sabor
Sabor é uma complexa combinação de sensações incluindo gustação,
olfação, textura e resposta ao calor e ao frio. A sensação de sabor nos seres
humanos é confinada primariamente à face dorsal da língua, ao palato mole, à
epiglote e partes do esôfago. Em crianças, no entanto, os receptores do sabor são
distribuídos sobre amplas áreas da boca (SINKULA; YALKOWSKY, 1975).
A olfação exerce um papel fundamental na percepção do sabor, assim ao se
impedir o acesso ao epitélio olfatório de uma substância aromática colocada na
boca pelo fechamento do nariz, o sabor desaparece completamente, retornando
quando o nariz é aberto novamente. O mesmo ocorre num resfriado comum,
quando o aumento da secreção mucosa impede que o ar inspirado leve o material
volátil ao epitélio olfatório pelas cóanas, resultando em grande diminuição da
apreciação e detecção do sabor (DE SÁ FILHO, 2004).
Basicamente, existem 4 sabores primários: azedo, salgado, doce e amargo.
O principal problema farmacotécnico consiste em mascarar o sabor amargo.
Gowthamarajan e colaboradores (2004) relacionaram algumas características
químicas dos compostos com a percepção de seus sabores primários:
Revisão Bibliográfica
45R.F.Menegon
Azedo. O sabor azedo é geralmente atribuído a substâncias que contém
grupos ácidos ionizáveis em soluções aquosas. E ainda, quanto maior a
concentração de íons hidrogênios, maior é a sensação do azedo.
Salgado. Espécies catiônicas são parcialmente responsáveis por soluções
salgadas. O cloreto de sódio apresenta um típico sabor salgado. Cloretos de
potássio, amônio e cálcio apresentam sabor salgado similar, mas ligeiramente
diferente. Muitos sais de haletos apresentam predominância no sabor salgado, mas
com o aumento em seu peso molecular, como nos sais brometo de potássio e
iodeto de amônio, o sabor torna-se amargo além de salgado, ficando
completamente amargo no caso do iodeto de potássio, indicando a influência do
peso molecular do sal na sensação do sabor.
Doce.Este sabor é produzido por uma grande variedade de substâncias,
muitas das quais não apresentam similaridades estruturais. As duas substâncias
doces mais comuns, açúcar e glicerina, são álcoois polihidroxilados. No entanto, a
sacarina, que não apresenta grupos hidroxilas, é intensamente doce, mas
apresenta um sabor residual amargo.
Am argo. Assim como no caso do sabor doce, a sensação de amargura é
encontrada em muitas substâncias, muitas das quais são sais de compostos
orgânicos e inorgânicos. A amargura é freqüentemente associada com grupos
nitros, e a presença de dois ou mais destes grupos resultam em forte sabor
amargo.
O quadro 2.2 fornece relações empíricas e qualitativas de estrutura química-sabor.
Revisão Bibliográfica
46R.F.Menegon
Quadro 2.2: Relações empíricas e qualitativas de estrutura-sabor (McEVOY, 1974)
?? Compostos contendo muitos grupos hidroxilas são usualmente doces (glicois, açúcares e outros
carboidratos);
?? Um aumento no peso molecular, i.e. estendendo-se uma série homóloga, freqüentemente
muda de doce para amargo. Continuando-se este aumento, reduz-se a solubilidade da
substância para valores abaixo do limiar de percepção dos receptores de sabor;
?? Grupos nitros presentes em uma molécula são freqüentemente indicativos de sabor amargo
(cloranfenicol e ácido pícrico);
?? A alquilação de uma amina ou amida usualmente produz uma substância de sabor doce;
?? A alquilação de um grupo hidroxila (eterificação) diminui o sabor doce;
?? A alquilação de uma imida diminui o sabor doce, N-alquil sacarinas são sem sabor;
?? A adição de um grupo fenila em um composto causa ou aumenta o sabor amargo, e pode ser
devido ao aumento da lipofilicidade e/ou ligação preferencial com receptores de sabor amargo;
?? Um aumento em uma cadeia lateral diminui o sabor doce e aumenta o sabor amargo;
?? Esterificação aumenta o sabor doce ex.: etilbutirato;
?? Introdução de insaturação em uma molécula aumenta o sabor amargo e pungência;
?? Aminas primárias aumentam o sabor doce, especialmente se na proximidade houver um grupo
eletronegativo (-COOH), ex.: em certos D e L aminoácidos;
?? Aminas secundárias e terciárias e sais de amônio quaternários são amargos, especialmente
alcalóides, antibióticos e fármacos de amônio quaternário;
?? Uréias monossubstituídas são usualmente doces, embora algumas são sem sabor, a própria
uréia é amarga. Moléculas simétricas são freqüentemente amargas;
?? Compostos polihalogenados alifáticos são doces (clorofórmio, 1,2-dicloroetano e
diclorometano);
?? Substituição de halogênios aromáticos aumenta o sabor amargo e é uma função do peso
atômico do halogênio (ex.: sacarinas halogenadas);
?? A presença de enxofre em uma molécula alifática é usualmente associada com sabor amargo
(-SH, -S-, -S-S-, C=S );
?? Ácidos sulfônicos são usualmente amargos;
?? Aldeídos são doces. Aldeído semicarbazonas não são tão doces quanto aldeídos. Aldeído
fenilhidrazonas não são doces;
?? Oximas são usualmente doces ou sem sabores.
Revisão Bibliográfica
47R.F.Menegon
Duas estratégias são possíveis para a correção do sabor: a modificação da
forma e do potencial eletrônico da molécula, e a diminuição da solubilidade para
abaixo do valor limite de ativação dos receptores de sabor.
A)M odificação da Form a e do Potencial Eletrônico da M olécula
A liberação local de opióides analgésicos e de antagonista na boca é uma
maneira útil de melhorar sua biodisponibilidade relativa pela via oral. No entanto,
estes compostos são amargos. Hussain e colaboradores (1988) desenvolveram
vários pró-fármacos de nalbufina, naloxona, naltrexona, oximorfona, butorfanol e
levalorfano através da esterificação de suas hidroxilas fenólicas, gerando
compostos não mais amargos e preservando a hidrossolubilidade dos compostos
matrizes, sugerindo uma importante interação entre o grupamento fenólico e os
receptores de sabor na boca (figura 2.3).
Revisão Bibliográfica
48R.F.Menegon
Figura 2.3: Pró-fármacos de opióides (HUSSAIN; AUNGST; KOVAL; et al, 1988).
O
N
O H
OOH R
nalbufina
O
N
O H
O
CH2
O R
naloxone
O
N
O H
O O
H
R
naltrexona
O
N
OH
O O
CH3
R
oxim orfona
N
O H
O R
butorfanol
N
CH2
O R
levalorfano
R= (CH3)3CCO-
(CH3CH 2)3CCO-
CH 3(CH 2)10CO -
C 6H 5CO -
2-CH3C 6H 4CO -
2-NH3C 6H 4CO -
2-O HC6H4CO-
2-CH3CO O C6H 4CO -
CH 3SO 2-
CH 3O CO-
4-CH3O CO C6H 4NHCO -
Revisão Bibliográfica
49R.F.Menegon
Outro exemplo de esterificação da hidroxila fenólica é a formação de um
pró-fármaco do paracetamol. Caira e colaboradores (1999) sintetizaram o
composto N-[4-(acetiloxi)-fenil]acetamida (figura 2.4), que apresentou melhora no
sabor, mantendo biodisponibilidade similar à do paracetamol, apesar da diminuição
em sua solubilidade.
FIGURA 2.4: Estrutura química do paracetamol e seu pró-fármaco N-[(acetiloxi)-fenil]acetamida
(CAIRA; WET; GERBER, 1999).
Algumas modificações, porém, podem levar à diminuição da solubilidade e
também da biodisponibilidade do fármaco matriz. Pró-fármacos da norfloxacina,
antibiótico quinolônico de segunda geração, foram sintetizados para mascarar seu
sabor desagradável (ALEXANDER; FROMTLING; BLAND; et al, 1991), realizando
para isto uma acilação no nitrogênio secundário piperazínico, o que eliminou seu
sabor amargo, porém reduziu sua solubilidade e biodisponibilidade (figura 2.5).
NH
OOH
CH3NH
OO
CH3
CH3
O
paracetamol N-[4-(acetiloxi)-fenil]acetamida
Revisão Bibliográfica
50R.F.Menegon
Figura 2.5: Estrutura química da norfloxacina e seus pró-fármacos (ALEXANDER; FROMTLING;
BLAND; et al, 1991).
B) Dim inuição da Solubilidade em Água
Como exemplo da diminuição da hidrossolubilidade para a melhora do sabor
temos o palmitato de cloranfenicol. Pesquisadores da Parke-Davis (PARKE, DAVIS
& COMPANY, 1953), descobriram que este éster tornava o fármaco matriz insípido,
e ainda que esterases intestinais eram responsáveis pela liberação da porção ativa
no organismo, permitindo sua absorção (figura 2.6). De maneira semelhante, foi
sintetizado o éster palmitato de clindamicina (KOROLKOVAS, 1988).
NN
O
NH
OF
O H
CH3
NN
O
N
OF
O H
CH3
O
O
RCl
NN
O
N
OF
O H
CH3
O
O
RO
OCH3
R= H ou M e
Revisão Bibliográfica
51R.F.Menegon
Figura 2.6: Estrutura química do cloranfenicol e do palmitato de cloranfenicol (PARKE, DAVIS &
COMPANY, 1953).
Outros exemplos são citados por Gowthamarajan e colaboradores (2004),
que incluem o maleato de D-clorfeniramina, um sal insípido da clorfeniramina e o
sal magnésico do ácido acetilsalicílico (figura 2.7). A formação de sal também foi
utilizada para o mascaramento do sabor do dextropropoxifeno, através de seu sal
napsilato (GRUBER; STEPHENS; TERRILL, 1971).
N+
NH
O-
O
O Cl
Cl
OH
O H
N+
NH
O-
O
O
O
O
Cl
Cl
OH
CH3
cloranfenicol palmitato de cloranfenicol
Revisão Bibliográfica
52R.F.Menegon
Figura 2.7: Exemplos de formação de sais para correção de sabor (GRUBER; STEPHENS; TERRILL,
1971; GOWTHAMARAJAN; KULKARNI; KUMAR, 2004).
2.3.2.2. Correção de solubilidade
Uma inadequada solubilidade em água de alguns fármacos é um importante
fator limitante ao uso das vias parenteral, percutânia e oral por exemplo. Em
alguns casos, a estratégia de pró-fármaco pode trazer grandes benefícios
farmacotécnicos e farmacocinéticos.
Paclitaxel é um quimioterápico muito utilizado para vários tipos de tumores
assim como para malária e esclerose múltipla. No entanto, apresenta baixa
margem de segurança, que possivelmente é reflexo tanto da sua alta
O
O
N
CH3
CH 3 CH3
CH3
S
O
OO
OH
OH 2. .
napsilato de dextropropoxifeno
Cl
N
N+
CH 3
CH 3 H
O
O O-
O-
HH
O
O
O
O-
CH3
2
Mg2+
sal magnésico do ácido acetil salicílico
maleato de D-clorfeniramina
2
Revisão Bibliográfica
53R.F.Menegon
hidrofobicidade e toxicidade quanto do uso de Cremophor EL ®, um óleo de
considerável toxicidade, necessário para a solubilização desta substância. Seligson
e colaboradores (2001), sintetizaram o protaxel, um carbonato derivado do
paclitaxel passível de ser formulado em meio aquoso, diminuindo
consideravelmente sua toxicidade (figura 2.8).
FIGURA 2.8: Estrutura química do paclitaxel e seu pró-fármaco solúvel protaxel (SELIGSON;
TERRY; BRESSI; et al, 2001).
Buparvaquona, assim como outras hidroxinaftoquinonas, apresenta alta
atividade in vitro contra leishmaniose (MÄNTYLÄ; RUTIO; NEVALAINEN; et al,
2004). A baixa atividade in vivo destes compostos é conseqüência de sua baixa
hidrossolubilidade, o que compromete a biodisponibilidade pelas vias oral,
subcutânea e tópica. A síntese do derivado fosfonooximetil-buparvaquona-oxima
levou a um composto com alta solubilidade em água e boa estabilidade química
Revisão Bibliográfica
54R.F.Menegon
para formulação, sendo rapidamente hidrolisado enzimaticamente in vivo,
tornando este pró-fármaco promissor para uso oral (figura 2.9).
Figura 2.9: Estrutura da buparvaquona e seu pró-fármaco fosfonoximetil-buparvaquona-oxima
(MÄNTYLÄ; RUTIO; NEVALAINEN; et al, 2004).
O grupamento fosfato é muito utilizado para a melhoria da
hidrossolubilidade de muitos compostos, tendo sido utilizado também para
melhorar a solubilidade da fenitoína, através da formação da fosfenitoína (figura
2.10), a qual melhorou consideravelmente problemas com a utilização da via
parenteral (GERBER; MAYS; DONN; et al, 1988).
O
O
OH
CH3
CH3CH3
O
N
O H
CH3
CH3CH3
O
O
P
O
OHOH
buparvaquonafosfonooximetil-buparvaquona-oxima
Revisão Bibliográfica
55R.F.Menegon
Figura 2.10: Estrutura química da fenitoína e da fosfenitoína (GERBER; MAYS; DONN; et al,
1988).
NHNH
O
O
NNH
O
O
P
O
O
O-
O-
fenitoína fosfenitoína
3– M aterial e M étodos
Material e Métodos
56R.F.Menegon
3. M ATERIAL E M ÉTODOS
3.1. M ATERIAL
Clorexidina base (Aldrich), cloreto de palmitoíla (Aldrich), ácido palmítico
(Sigma), piridina (Merck), 4-dimetilaminopiridina (Fluka), trietilamina (Merck),
metanol (Synth), etanol absoluto (Merck), clorofórmio (Synth), éter etílico (Synth),
dimetilformamida (Mallinckodt), tetrahidrofurano (Synth), n-octanol (Merck),
metanol grau HPLC (J. T. Baker) e ácido p-tolueno sulfônico (Merck)
3.2. M ÉTODOS DE SÍNTESE
Os métodos gerais para a obtenção do pró-fármaco proposto dividem-se em
duas preparações principais: Preparação A, reagindo-se a clorexidina com o cloreto
de palmitoíla (esquema 3.1), e Preparação B, reagindo-se a clorexidina com o
ácido palmítico (esquema 3.2).
Material e Métodos
57R.F.Menegon
Esquema 3.1: Obtenção do pró-fárm aco a partir do cloreto de palm itoíla.
NH
NHNHN H
NH
N H
NH
N H
NHN H
Cl
Cl
O
Cl
CH 3
Procedim entoA1
Procedim entoA2
Procedim entoA3
Procedim entoA4
Solvente
Prótico
Solvente
Éter/Metanol
(2/1)
Solvente
Aprótico Polar
Solvente
Aprótico Apolar
Com
Piridina
CHCl3
Piridina
THF
Refluxo
DMAP
THF
Refluxo
DMAP
pH=10
THF
Refluxo
THF
Refluxo
pH=10
Sem
Piridina
A2.1 A2.2 A4.1 A4.2 A4.3 A4.4 A4.5
clorexidina base
cloreto de palmitoíla
Material e Métodos
58R.F.Menegon
Esquem a 3.2: Obtenção do pró-fármaco a partir do ácido palmítico.
Estas preparações foram realizadas sob refluxo e sem a utilização de
catalisadores.
O
OH
CH3
NH
NHN H
N H
NH
NH
NH
NH
NH
NH
Cl
Cl
Procedim ento B1 Procedim ento B2
Meio THF Meiotrietilamina
clorexidina base
ácido palmítico
Material e Métodos
59R.F.Menegon
3.3. M ÉTODOS DE ANÁLISE
3.3.1. Crom atografia em Cam ada Delgada (CCD)
Foram utilizadas placas de sílica gel G-60, com 0,25 mm de espessura (para
cromatografia preparativa), e placas Alugram Nano-Sil G/UV 254 (Merck) para o
acompanhamento das reações. Os sistemas eluentes empregados foram
butanol/ácido acético/água (4:1:5); diclorometano/acetato de etila (8:2), e
metanol/ácido acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81).
3.3.2. Espectrom etria de Ressonância M agnética Nuclear
(RM N)
Os espectros de RMN 1H foram realizados no Departamento de Química,
Laboratório de RMN da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), utilizando
espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Brucker 9.4 T, modelo DRX-400
a 400 MHz. Os solventes utilizados foram clorofórmio (CDCl3) e DMSO-d6.
Material e Métodos
60R.F.Menegon
3.3.3. Espectrom etria no Infraverm elho (IV)
Os espectros de infravermelho foram realizados em Espectrofotômetro de
Infravermelho Schimadzu, modelo FTIR-8300.
3.3.4. Faixa de Fusão
As faixas de fusão aparente foram obtidas em aparelhos para determinação
de ponto de fusão Electrothermal 9200.
3.4. M ÉTODOS FÍSICO-QUÍM ICO E FARM ACOCINÉTICO
3.4.1. Coeficiente de partição (P) e Log P
Para a determinação do coeficiente de partição e do Log P, foi utilizado o
método shake-flask, o qual baseia-se na partição da substância analisada entre
duas fases imiscíveis, n-octanol e água (OJEC, 1992).
Volumes diferentes de uma solução estoque da amostra em n-octanol foram
misturados em volumes pré determinados de água, e então agitados. As
concentrações da amostra nas duas fases foram quantificadas por método
espectrofotométrico no ultravioleta.
Material e Métodos
61R.F.Menegon
3.4.2. Determ inação do tem po de retenção do pró-fárm aco
na cavidade bucal
O estudo farmacocinético preliminar foi realizado em um voluntário do sexo
masculino.
Amostras de salivas (200 ?L) foram coletadas e extraídas em acetonitrila em
meio básico. A quantidade do pró-fármaco recuperado foi medida por CLAE
(cromatografia líquida de alta eficiência) após 1, 15, 60, 120, 240, 480, 720 e 1440
minutos ao enxágüe bucal com 30 mL de suspensão aquosa a 0,35% do pró-
fármaco de clorexidina.
Método analítico adaptado do desenvolvido por Pesonen, Holmalahti e
Pohjola (1995).
4– Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
62R.F.Menegon
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A clorexidina é o mais eficaz agente anti-placa usado em odontologia, e sua
eficácia está baseada em seus potentes efeitos bactericida e também
bacteriostático, quando lentamente liberada na cavidade bucal.
Com o emprego da modificação molecular, a obtenção de formas latentes
ou de sais pode possibilitar aumento no tempo de permanência da clorexidina nas
cavidades bucais e ainda minimizar a percepção de sabor desagradável.
A molécula da clorexidina é simétrica, com uma porção hexametilênica
unindo dois grupos biguanidas, nos quais está ligado um radical p-clorofenil (figura
4.1).
Figura 4.1: Fórmula estrutural da clorexidina base. Desenho mostrando a densidade eletrônica da
molécula (regiões em vermelho = alta densidade, regiões em azul = baixa densidade; cálculo da
geometria no equilíbrio com método semi-empírico AM-1, utilizando software PC Spartan Pro 1,0,5).
NHNH NH
NH
NH
NH
NH
NH
NHNH
Cl
Cl
Resultados e Discussão
63R.F.Menegon
Esta molécula contém quatro grupos iminos (=NH), que apresentam
propriedades fortemente básicas, estando carregada com 4 cargas positivas
deslocalisadas sobre seus 10 átomos de nitrogênio, em presença de ácidos fortes
(CHRISTENSEN; JENSEN, 1982). No entanto, apenas dois valores de pKa tem sido
relatados em 2,2 e 10,3 (HUGO; LONGWORTH, 1964). A figura 4.2 apresenta o
espectro de infravermelho da clorexidina base; o espectro de um de seus sais, o
diacetato, é demonstrado na figura 4.3.
A clorexidina e seus sais apresentam grandes diferenças em seus pontos de
fusão e solubilidade; a clorexidina base apresenta faixa de fusão entre 134 e 136
ºC e solubilidade em água a 20 ºC de 0,08%, seu sal diacetato apresenta faixa de
fusão entre 154 e 155 ºC e solubilidade em água de 1,9% e o sal dicloridrato
apresenta faixa de fusão entre 260 e 262 ºC e solubilidade em água de 0,06%, por
fim o digluconato de clorexidina, disponível comercialmente, apresenta solubilidade
em água maior que 50% (THE MERCK INDEX, 1996).
Resultados e Discussão
64R.F.Menegon
Grupo de átomos ? (cm-1)
A N-H 3475,5 – 3382,9
B C-H alifático 2933,5 – 2860,2
C C=N imina 1662,5
D =N-H 1606,6
E -N-H 1544,9
F C-N 1373,2 – 1406,0
Figura 4.2: Espectro de infravermelho da clorexidina base. Realizado em pastilha de KBr.
NH
NHNHNH
NH
NH
NH
NH
NHNH
Cl
Cl
clorexidina base
Resultados e Discussão
65R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3390,6 – 3178,5
B C-H alifático 2933,5 – 2862,2
C C=N imina 1645,2
D N-H (sal) 1554,1
E C=C aromático 1487,0
F C-N 1415,7
Figura 4.3: Espectro de infravermelho do diacetato de clorexidina. Realizado em pastilha de KBr.
NH
N HNH
N H
NH
NH
N+
N+
N H
NH
C l
Cl
H H
H H
O
O-
C H3
O
O-
CH3
diacetato de clorexidina
Resultados e Discussão
66R.F.Menegon
Dada a basicidade destes grupamentos guanidinas, o mecanismo pelo qual
espera-se obter o pró-fármaco envolve um ataque nucleofílico sobre a carbonila do
ácido palmítico, ou de seu cloreto ácido derivado (figura 4.4).
Figura 4.4: Mecanismo de reação para a obtenção do pró-fármaco palmitoil clorexidina.
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
Cl
O
R CH3..
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N+
NH
Cl
H
O-
R
CH3
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N
NH
Cl
O
CH 3
pró-fárm aco m onossubistituído
clorexidina
R = -OH ácido palmítico
R = -Cl cloreto de palmitoíla
Resultados e Discussão
67R.F.Menegon
A velocidade desta reação pode ser aumentada com a adição de
catalisadores, como a piridina e seu derivado 4-dimetilaminopiridina, os quais são
capazes de reagirem com ácidos e cloretos ácidos gerando um forte agente
acilante, e ainda neutralizando o ácido clorídrico liberado durante a reação com
cloretos de acila. Seu mecanismo está demonstrado na figura 4.5.
Figura 4.5: Mecanismo da ação catalítica da piridina e da 4-DMAP.
Dada a presença de quatro grupos guanidinas em sua molécula, é possível
prever a formação de isômeros estruturais entre os possíveis produtos desta
reação, em sua totalidade, são 9 as possibilidades de produtos esperados nesta
reação (figura 4.6), sendo dois isômeros monossubstituídos, quatro formas
dissubstituídas, duas trissubstituídas, e mais uma forma tetrassubstituída.
O
RCH3
N
R'
R = -OH ácido palmítico
R = -Cl cloreto de palmitoíla
..
R' = -H piridina
R' = -N(CH3)2 4-DMAP
N+
R'
CH3
O -
RN+
R'
CH3
O
R-
agente acilante
Resultados e Discussão
68R.F.Menegon
Figura 4.6: Possíveis produtos formados na reação.
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N
Cl
R
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N
NH
Cl
R
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N
N
Cl
R
R
C l NH
NH
NH
N
N H
NH
NH
NH
NH
N
Cl
R
R
Cl NH
NH
N
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N
Cl
R
R
Cl NH
NH
NH
N
NH
NH
NH
NH
N
NH
Cl
R
R
Cl NH
NH
N
NH
NH
NH
NH
NH
N
N
Cl
R
R
R
Cl NH
NH
NH
N
NH
NH
NH
NH
N
N
Cl
R
R
R
Cl NH
NH
N
N
NH
NH
N H
NH
N
N
Cl
R
R
R
R
Produtos monossubstituídos
Produtos dissubstituídos
Produtos trissubstituídos
Produto tetrassubstituído
R =
O
CH3
Resultados e Discussão
69R.F.Menegon
No entanto, dependendo das condições reacionais, é possível ocorrer a
formação de sais, como a do sal palmítico da clorexidina, representado na figura
4.7.
Figura 4.7: Formação de sal com o ácido palmítico (palmitato de clorexidina).
Assim como nos derivados amídicos, estes sais também podem existir em
várias formas, podendo ser mono, di, tri ou tetravalente.
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
Cl
O
O CH3H
clorexidina
..
Cl NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
NH
N+
NH
Cl
H
H
O
O
CH3-
sal palmítico de clorexidina
Resultados e Discussão
70R.F.Menegon
Desta forma, visando a solubilização da clorexidina no meio reacional,
evitando o emprego de calor, para minimizar a degradação da clorexidina, que
pode ser favorecida pelo aumento da temperatura (HOANG; MOELLMER; KHAN,
1990), a primeira reação realizada foi em meio alcoólico (metanol), como descrito
no Procedim ento A1. A adição do ácido nítrico tem como objetivo promover a
total solubilização dos materiais de partida e ainda servir como catalisador. Com o
pH da solução em torno de 4,0, a molécula de clorexidina está preferencialmente
em sua forma dicátion, restando, portanto mais dois grupamentos guanidínicos
não protonados e nucleófilos, capazes de atacar nucleofilicamente a carbonila do
cloreto de palmitoíla, a qual está ainda mais ativada dada a protonação de seu
átomo de oxigênio. Ao se adicionar água no final da reação, ocorre a separação de
uma fase não miscível com água, de coloração amarela, a qual é constituída em
parte por produtos de degradação da clorexidina e também por alguma matéria
graxa, como será comprovado mais adiante (procedimento B1). Apesar de não se
ter utilizado aquecimento, o meio ácido e altamente polar pode também promover
sua degradação (GOODALL; GOLDMAN; WOODS, 1968). Ao neutralizar a solução,
promoveu a precipitação de um pó branco, identificado como uma mistura
contendo principalmente cloridrato de clorexidina, apresentando faixa de fusão em
212 ºC, e absorção no infravermelho em 3452,3 a 3222,8 cm-1 (relativo aos
grupamentos guanidínidos protonados) e pequena absorção entre 2927,7 e
2856,4cm-1, sugerindo a ausência da longa cadeia alifática do ácido palmítico
(figura4.8).
Resultados e Discussão
71R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3452,3 – 3222,8
B C-H alifático 2927,7 – 2856,4
C C=N imina 1635,5
D N-H (sal) 1531,4
E C-N 1413,7 – 1340,4
Figura 4.8: Espectro de infravermelho do produto obtido a partir do procedimento A1, realizado
em pastilha de KBr.
NHNHNH
NH
NH
NH
N+
N+
NHNH
Cl
Cl
H H
H H
Cl-
Cl-
dicloridrato de clorexidina
Resultados e Discussão
72R.F.Menegon
A formação deste sal é resultado da liberação de HCl como resultado da
metanólise do cloreto de palmitoíla (figura 4.9) ou após sua hidrólise pela presença
de água no solvente ou da umidade do ar.
Figura 4.9: Metanólise do cloreto de palmitoíla, com liberação de ácido clorídrico.
O
Cl CH3CH3 O
H
CH3O+
H
O-
Cl CH3
CH3 O+
H
O
CH3
Cl-
O
CH3OCH3
+ ClH
Resultados e Discussão
73R.F.Menegon
Com base nestas informações, tentou-se realizar a reação em meio
totalmente aprótico, no entanto, dada a total insolubilidade da clorexidina, foi
necessário adicionar um pouco de metanol ao éter para melhorar sua solubilidade,
como descrito no Procedim ento A2. Nestas reações, pelas mesmas razões
explicadas no procedimento A1, não se observou a formação do produto proposto,
apenas a formação majoritária de cloridrato de clorexidina.
Os resultados mostrados a seguir são relativos ao Procedim ento A2.1,
pois os obtidos através do Procedim ento A2.2, utilizando piridina como
catalisador, foram essencialmente os mesmos. A faixa de fusão encontrado para o
precipitado branco obtido durante a reação foi de 268 a 270 ºC, e o espectro de
infravermelho (figura 4.10) confirma a formação cloridrato, dada a presença de
intensa absorção entre 3390,6 e 3122,5 cm–1, indicando a protonação de grupos
guanidínicos. O produto branco obtido após neutralização do líquido filtrado foi
identificado como clorexidina base, apresentando faixa de fusão em 132 ºC e
espectro de infravermelho característico da clorexidina base (figura 4.11).
Resultados e Discussão
74R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3390,6 – 3122,5
B C-H alifático 2937,4 – 2856,4
C C=N imina 1635,5
D N-H (sal) 1533,3
E C-N 1413,7 – 1353,9
Figura 4.10: Espectro de infravermelho do precipitado obtido durante a reação do procedimento
A2, realizado em pastilha de KBr.
NHNHNH
NH
NH
NH
N+
N+
NHNH
Cl
Cl
H H
H H
Cl-
Cl-
dicloridrato de clorexidina
Resultados e Discussão
75R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3475,5 e 3408,0
B C-H alifático 2933,5 e 2860,2
C C=N imina 1670,2
D N-H imina 1606,6
E N-H amina 1544,9
F C-N 1406,0 e 1377,1
Figura 4.11: Espectro de infravermelho do precipitado obtido pela neutralização do filtrado da
reação do procedimento A2. Realizado em pastilha de KBr.
NHNHNH
NH
NH
NH
NH
NH
NHNH
Cl
C l
clorexidina base
Resultados e Discussão
76R.F.Menegon
O próximo passo foi realizar a reação em meio polar e aprótico, utilizando
dimetilformamida como solvente e piridina como catalisador, o procedimento está
descrito no Procedim ento A3. Nesta reação ocorre rapidamente a formação de
um precipitado, com faixa de fusão ampla, cerca de 40 a 60 ºC. O espectro de
infravermelho ( figura 4.12) revela a presença do reagente cloreto de palmitoíla no
precipitado formado através da absorção em 1803,3 cm-1, relativo à carbonila de
um cloreto de acila e da intensa absorção em 2918,1 e 2850,6 cm–1, relativo a
uma longa cadeia alifática; é possível perceber absorções características da
formação de sais de clorexidina em 1539,1 cm–1, absorções muito próximas às
encontradas no cloridrato de clorexidina (1531,4 cm–1) o que pode indicar a
formação de um sal de palmitato, dada a baixa faixa de fusão da mistura. A
análise por cromatografia em camada delgada da DMF restante não indica a
presença de nenhuma outra substancia a não ser clorexidina, desta forma, não se
tentou realizar uma extração deste solvente. Esta reação foi repetida várias vezes
obtendo-se sempre aos mesmos resultados negativos. Este fato deveu-se,
provavelmente, à formação de subprodutos de clorexidina, indisponibilizando-a
para a reação propriamente dita.
Resultados e Discussão
77R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3438,8
B C-H alifático 2918,1 – 2850,6
C C=O cloreto de acila 1803,3
D C=N imina 1645,2
E N-H (sal) 1539,1
Figura 4.12: Espectro de infravermelho do precipitado obtido no procedimento A3, realizado em
pastilha de KBr.
NH
NHNHNH
NH
NH
N+
N+
NHNH
Cl
Cl
H H
H H
Cl-
Cl-
dicloridrato de clorexidina
O
Cl CH3
cloreto de palm itoíla
Resultados e Discussão
78R.F.Menegon
As próximas tentativas formam realizadas em meios totalmente apróticos e
de baixa polaridade, a primeira tentativa, Procedim ento A4.1, foi utilizando
clorofórmio como solvente. Mesmo sem a solubilização da clorexidina foi
adicionado o catalisador e o cloreto de palmitoíla, no entanto, neste momento
forma-se um gel espesso, que impede a agitação da reação. Ao se lavar este gel
com água, rapidamente se converte em um pó branco, que após secagem
apresentou faixa de fusão em 260 ºC e espectro de infravermelho com absorção
entre 3390,6 e 3122,5 cm-1 (relativo aos grupamentos guanidínidos protonados) e
pequena absorção entre 2925,8 – 2854,4 cm-1 , sugerindo a ausência de longa
cadeia alifática proveniente do ácido palmítico (figura 4.13), sugerindo a formação
de cloridrato de clorexidina.
Resultados e Discussão
79R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3390,6 – 3122,5
B C-H alifático 2925,8 – 2854,4
C C=N imina 1635,5
D N-H (sal) 1533,3
E C-N 1411,8 – 1348,2
Figura 4.13: Espectro de infravermelho do produto obtido através do procedimento A4.1,
realizado em KBr.
NHNHNH
NH
NH
NH
N+
N+
NHNH
Cl
Cl
H H
H H
Cl-
Cl-
dicloridrato de clorexidina
Resultados e Discussão
80R.F.Menegon
Assim sendo, foram realizadas novas reações, agora com o emprego de
temperatura para promover uma solubilização dos reagentes, mesmo correndo-se
o risco de degradar a clorexidina. No Procedim ento A4.2, foi utilizado o
tetrahidrofurano como solvente e 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalisador.
Mais uma vez, o precipitado branco formado durante a reação foi identificado
como sendo cloridrato de clorexidina, porém misturado a um derivado do ácido
palmítico, possivelmente o pró fármaco desejado, visto o espectro de
infravermelho não acusar a presença de ácido palmítico livre ou na forma de
carboxilato formando um sal com a clorexidina (figura 4.14).
É possível observar, ainda, absorção entre 1693,4 e 16981,8 cm–1, que pode
ser atribuído à carbonila relativa a uma amida, intensa absorção em 2931,6 cm–1,
própria de cadeia alifática e outras absorções relativas à clorexidina.
A análise de RMN 1H (figura 4.15) realizada neste composto, contudo, não é
conclusiva com relação à obtenção do produto desejado, no entanto, comprova a
presença da molécula de clorexidina e a presença de uma longa cadeia alifática.
A proporção molecular destas substâncias é de 6 moléculas de clorexidina
para uma de palmitato, esta proporção pode ser calculada com base nos valores
das integrais destes dois grupos, a porção relativa aos hidrogênios metílicos da
cadeia palmítica (? 0,84 ppm) apresenta valor igual a 3,00 enquanto que para
quatro dos hidrogênios aromáticos da molécula da clorexidina (? 7,40 ppm) o valor
de integral é igual a 23,91, ao invés de 4,00, como seria o esperado para uma
proporção molecular de 1:1 (palmitato/clorexidina). Esta observação está em
Resultados e Discussão
81R.F.Menegon
acordo com a medida da faixa de fusão, que variou de 180 a 250 ºC
aproximadamente, evidenciando uma mistura de produtos.
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3234,4
B C-H alifático 2931,6
C C=O amida 1693,4 – 1681,8
D N-H imina 1614,3
Figura 4.14: Espectro de infravermelho do precipitado da reação do procedimento A4.2. Realizado
em pastilha de KBr.
NHNHNH
NH
NH
NH
N
NH
NHNH
Cl
Cl
O
CH3 NHNHNH
N H
NH
NH
NH
NH
NHNH
Cl
Cl
pró-fárm aco de clorexidna clorexidina
Resultados e Discussão
82R.F.Menegon
Próton Deslocam entoquím ico (ppm )
Integral
A CH3 0,84 3,00
B (CH ar)4 7,40 23,91
Figura 4.15: Espectro de RMN 1H do precipitado da reação pelo procedimento A4.2.
DMSO-d6, 400 MHz.
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
DMSO-d6
7.40
7.31
3.56
3.33
3.08
2.49
2.26
2.07
1.45 1.27
1.22
0.84
7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7
23.91
7.40
7.31
1.5 1.0
3.00
1.45 1.27
1.22
0.84
NH
NHNHNH
NH
NH
N
NH
NHNH
Cl
Cl
OCH3NH
NHNHNH
NH
NH
NH
N H
NHNH
Cl
Cl
H
H
H
H
pró-fárm aco de clorexidnaclorexidina
A
B
B
B
B
Resultados e Discussão
83R.F.Menegon
Ainda na reação do procedimento A4.2, a evaporação do solvente levou à
obtenção de um produto amarelado, de aparência pastosa. O espectro de
infravermelho (figura 4.16), realizado em clorofórmio, demonstra a presença de
ácido palmítico, com absorção em 1706,9 cm-1, relativo à carbonila, além de outras
absorções em 1647,1 e 1620,1 cm-1, sugerindo a presença de clorexidina ou de
seus produtos de degradação. A análise por CCD, utilizando como fase móvel
metanol/ácido acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81) revelou a presença de
cerca de 10 substâncias, no entanto, dada a quantidade muito reduzida de cada
uma delas isoladamente, e o fato de se utilizar uma fase móvel quaternária e com
grande diferença de polaridade entre seus constituintes, uma separação por coluna
de sílica gel seria muito difícil.
Resultados e Discussão
84R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A C-H alifático 2927,7 – 2860,2
B C=O ácido 1706,9
C C=N imina 1647,1 - 1620,1
D N-H 1550,3
Figura 4.16: Espectro de infravermelho do produto amarelado do procedimento A4.2. Realizado
em clorofórmio.
NH NH
NH
R R
O
OHCH3
ácido palm ítico derivados de clorexidina
Resultados e Discussão
85R.F.Menegon
Como uma tentativa de purificação do precipitado branco anterior, tentou-se
remover a clorexidina através de sua conversão em um sal mais hidrossolúvel,
como o diacetato de clorexidina, cuja solubilidade em água é de 1,9%, contra
0,06% do dicloridrato e 0,08% da clorexidina base. Para isto, misturou-se o
produto com grande volume de ácido acético diluído em pH 4,0, com aquecimento
durante uma hora, o produto insolúvel foi novamente analisado por infravermelho
(figura 4.17) e RMN 1H (figura 4.18).
Resultados e Discussão
86R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3390,6 – 3120,6
B C-H alifático 2939,3 – 2854,4
C C=N imina 1635,5
D N-H (sal) 1533,3
E C-N 1415,7
Figura 4.17: Espectro de infravermelho do precipitado do procedimento A4.2, após lavagem com
ácido acético a quente. Realizado em pastilha de KBr.
NH
NHNH
NH
NH
NH
N+
N+
NH
NH
Cl
Cl
H H
H H
Cl-
Cl-
dicloridrato de clorexidina
Resultados e Discussão
87R.F.Menegon
Próton Deslocam entoquím ico (ppm )
A CH2 1,26
B (CH ar)4 7,32
C (CH ar)4 7,38
Figura 4.18: Espectro de RMN 1H do precipitado do procedimento A4.2, após lavagem com ácido
acético a quente. DMSO-d6, 400 MHz.
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
DMSO-d6
8.04
7.70
7.38
7.32
7.10
6.77
3.42
3.06
2.53
2.49
2.07
1.44 1.26
NHNHNH
NH
N H
N H
NH
N H
N HNH
Cl
C l
H
H
H
H
H
H
H
Hclorexidina base
AC
C
C
C
B
B
B
B
Resultados e Discussão
88R.F.Menegon
Com base neste espectro de RMN, é possível perceber o desaparecimento
da metila em 0,84 ppm, o que indica uma possível hidrólise do pró fármaco devido
ao meio ácido. O espectro refere-se ao cloridrato de clorexidina, que se manteve
insolúvel durante a lavagem.
Tentou-se então, a realização de uma nova reação, Procedim ento A4.3,
agora com o pH ajustado em torno de 10 com trietilamina. Esta reação levou à
formação de resultados semelhantes à anterior, no entanto, decidiu-se prosseguir
com uma purificação por cromatografia em camada delgada preparativa do
produto amarelado, utilizando como fase móvel metanol/ácido
acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81). Ao final desta separação, somente a
fração superior pode ser isolada e então analisada por RMN 1H (figura 4.19),
revelando ser, ainda, uma mistura de substâncias, porém com aparente presença
de um material graxo e com fracos sinais relativos à clorexidina.
Resultados e Discussão
89R.F.Menegon
Próton Deslocam entoquím ico (ppm )
A CH3 0,87
B CH2 1,25
Figura 4.19: RMN 1H do produto purificado por CCD no procedimento A4.3. CDCl3, 400 MHz.
Como não foi possível a identificação das últimas dez substâncias, realizou-
se duas novas reações, sem a utilização de DMAP, visto a possibilidade destas
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0
Chloroform-d
0.87
1.25
7.25
C H 3
H HA
B
Resultados e Discussão
90R.F.Menegon
substâncias serem resultado, pelo menos em parte, de múltiplas acilações na
molécula de clorexidina. Desta forma, a remoção do catalisador poderia diminuir o
número de subprodutos, aumentando a concentração relativa dos produtos
formados possibilitando um isolamento dessas substâncias.
Na primeira delas, de acordo com o Procedim ento A4.4, os resultados
foram semelhantes aos anteriores, a análise por CCD revela ainda a presença de
inúmeros subprodutos; já na segunda, de acordo com o Procedim ento A4.5,
houve o desenvolvimento de uma coloração amarela mais intensa durante a
reação, e uma maior quantidade do produto amarelado.
Decidiu-se, então, prosseguir com uma purificação por filtração em gel,
utilizando coluna de 40cm de comprimento empacotada com Sephadex LH-20®,
no entanto, não houve separação das substâncias, indicando uma semelhança nos
pesos moleculares delas, o que pode ser indicativo da existência de isômeros
estruturais entre os derivados acilados da clorexidina, visto sua molécula
apresentar quatro grupos passíveis de sofrerem substituições.
Desta forma, as frações foram reagrupadas e eluídas coluna de sílica gel,
usando como fase móvel apenas o diclorometano. Nesta condição, somente uma
mancha é observada ao eluir da coluna, porém, é importante salientar que o ácido
palmítico não é visualizado pela luz u.v e muito fracamente revelado com iodo
ressublimado. Mas, através do espectro de infravermelho, sua presença é
facilmente constatada na amostra através da absorção em 1701,1 cm-1, relativo à
carbonila de ácido carboxílico (figura 4.20). A faixa de fusão observado foi de 53 a
Resultados e Discussão
91R.F.Menegon
55 ºC próximo ao do ácido palmítico (63 a 64 ºC), que certamente está em
excesso.
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3477,4 – 3406,1
B C-H alifático 2918,1 – 2848,7
C C=O ácido 1701,1
D C=O amida 1685,7
Figura 4.20: Espectro de infravermelho do produto obtido ao final da purificação do procedimento
A4.5. Realizado em pastilha de KBr.
N H
N HNH
NH
N H
N H
N
NH
NH
NH
Cl
Cl
O
C H3
pró-fárm aco de clorexidna ácido palm ítico
O
O H CH 3
Resultados e Discussão
92R.F.Menegon
Como tentativa de se reduzir a formação de inúmeros produtos, realizou-se
a reação a partir do ácido palmítico, e ainda sem a utilização de catalisadores.
Através do Procedim ento B1, a precipitação proporcionada pela adição de
isopropanol levou à formação de um sal com o ácido palmítico, o qual é
evidenciado pelo espectro de infravermelho (figura 4.21), onde pode ser
visualizado forte absorção entre 3398,8 a 3193,9 cm–1, relativos à protonação dos
grupos guanidina, e em 2916,2 e 2848,7 cm–1, relativos à cadeia palmítica alifática,
a qual não se deve à presença de ácido livre, pois não há absorção na região de
1700 cm–1, relativa à carbonila de ácido carboxílico, e sim em 1577,7 cm–1,
proveniente da formação do ânion carboxilato. A análise por CCD, utilizando como
fase móvel butanol/água/ácido acético (5:4:1) revela a presença de uma única
mancha, de Rf=0,44, enquanto que o Rf do padrão clorexidina é de 0,53. O
rendimento deste produto foi de 63%.
O produto oleoso, de coloração amarela foi analisado por RMN 1H, porém
trata-se de mistura com grande quantidade de grupos metilas e metilenos,
evidenciado pelas absorções em 0,81 e 1,18 ppm (figura 4.22).
Resultados e Discussão
93R.F.Menegon
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3398,8 – 3193,9
B C-H alifático 2918,2 – 2848,7
C C=N imina 1629,7
D C=O carboxilato 1577,7
E N-H (sal) 1541,0
F C-N 1419,5
Figura 4.21: Espectro de infravermelho do produto precipitado em isopropanol do procedimento
B1. Realizado em pastilha de KBr.
HH
NH
NHNH
NH
N+
N+
N+
N+
NH
NH
Cl
Cl
H H H H
H H
O
O-
CH3
4salpalm itato de clorexidina
Resultados e Discussão
94R.F.Menegon
Próton Deslocam entoquím ico (ppm )
CH3 0,81
CH2 1,18
Figura 4.22: Espectro de RMN 1H do produto oleoso amarelo obtido no procedimento B1. CDCl3,
400MHz.
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
Chloroform-d
TM S
2.10
1.36
1.18
0.81
0.78
0.00
Resultados e Discussão
95R.F.Menegon
A última tentativa de obtenção do produto foi a realização da reação em
meio trietilamina. Nesta condição, o ácido está totalmente ionizado e um ataque
nucleófilo em sua carbonila é muito dificultado. Assim a reação deverá ocorrer
muito mais lentamente e resultando na formação de um número menor de
produtos. No entanto, após 7 dias de reação, somente uma coloração amarelada
pode ser observada na reação, e o óleo obtido revelou conter uma mistura com
muitos produtos, possivelmente provindos da degradação da clorexidina.
Como pode ser observado, a obtenção do pró-fármaco é possível, porém
com rendimentos muito insatisfatórios, por outro lado, temos que o sal do ácido
palmítico é facilmente formado e com bom rendimento. A tabela 4.1 faz um
resumo das condições reacionais e os principais produtos obtidos.
Resultados e Discussão
96R.F.Menegon
Tabela 4.1: Condições reacionais e produtos obtidos
Proced. Condições Reacionais Resultados
A1 Metanol, temperatura ambiente,
catálise ácida, pH = 4
Cloridrato de Clorexidina
A2.1 Éter etílico/metanol (2:1), temperatura
ambiente, sem catalise
Cloridrato de Clorexidina
A2.2 Éter etílico/metanol (2:1), temperatura
ambiente, com piridina
Cloridrato de Clorexidina
A3 DMF, temperatura ambiente, com
piridina
Sais da clorexidina
(cloridrato e palmitato)
A4.1 Clorofórmio, temperatura ambiente,
com piridina
Cloridrato de clorexidina
A4.2 THF, refluxo (65 ºC), com DMAP Possível derivado amídico
A4.3 THF, refluxo (65 ºC), com DMAP e
pH=10
Possível derivado amídico
A4.4 THF, refluxo (65 ºC), sem catálise Possível derivado amídico
A4.5 THF, refluxo (65 ºC), com DMAP Possível derivado amídico
B1 THF, refluxo (65 ºC), sem catálise Sal tetrapalmitato de
clorexidina
B2 Trietilamina, 65 ºC, sem catálise Não há reação
Resultados e Discussão
97R.F.Menegon
Desta forma, o sal palmitato de clorexidina foi eleito para a continuidade do
estudo. O sal foi ressintetizado e identificado por infravermelho e 1H RMN.
O espectro no infravermelho demonstra mais uma vez a obtenção de um sal
(figura 4.23).
Grupo de átom os ?? (cm -1)
A N-H 3340,5 – 3192,0
B C-H alifático 2918,1 – 2848,7
C C=N imina 1623,9
D C=O carboxilato 1577,7
E N-H (sal) 1533,3
F C-N 1419,5
Figura 4.23: Espectro de infravermelho do sal tetrapalmitato de clorexidina. Realizado em pastilha
de KBr.
Resultados e Discussão
98R.F.Menegon
A análise de RMN sugere a formação do tetrapalmitato de clorexidina
(TPCHD) (figura 4.24). Neste espectro os valores das integrais calculados para o
grupo metila da cadeia palmítica e de quatro dos oitos hidrogênios aromáticos da
molécula da clorexidina são respectivamente 3,00 e 0,91, ou seja, existem 3
prótons metílicos para cada próton aromático, logo quatro vezes mais ácido
palmítico que clorexidina. É importante notar que existe duas absorções atribuídas
para este grupo metila (0,78 e 0,85 ppm), o que sugere que estas 4 cadeias não
estão no mesmo ambiente eletrônico, apresentando duas absorções diferenciadas.
Para assegurar a reprodutibilidade da reação, sobretudo com relação ao
número ânions carboxilatos, obteve-se soluções a 0,030 mg/mL (1,96 x 10-5 M) e a
0,004 mg/mL (2,6 x 10-6 M) em etanol, sendo a absorbância foi medida em 258
nm. A absortividade molar calculada foi de 46000, a comparação destes resultados
com os obtidos de reações subseqüentes garante a formação do mesmo sal.
Resultados e Discussão
99R.F.Menegon
Próton Deslocam entoquím ico (ppm )
Integral
A CH3 0,85 3,00
B (CH ar)4 7,28 0,91
Figura 4.24: Espectro de RMN 1H do sal tetrapalmitado de clorexidina. DMSO-d6, 400MHz.
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
3.000.91
TM S
7.43
7.41
7.28
7.26 2.05
1.45
1.23
1.17
0.85
0.78
0.00
HH
NH
NHNHNH
N+
N+
N+
N+
NHNH
Cl
Cl
H H H H
H H
H
H
H
H
O
O-
CH3
4salpalm itato de clorexidina
A
B
B
B
B
Resultados e Discussão
100R.F.Menegon
Para analisar sua solubilidade, realizou-se um estudo do coeficiente de
partição n-octanol/água. As medidas foram realizadas com auxílio de
espectrofotômetro no ultravioleta a 258 nm. A curva de calibração e a tabela das
absorções dos padrões são mostradas a seguir (gráfico 4.1).
Gráfico 4.1: Curva de calibração UV (258nm) do tetrapalmitato de clorexidina
y = 30,281x - 0,0035
R2 = 1,0000
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0,000 0,010 0,020 0,030 0,040
m g/m L
Abs 258 nm
m g/m L Abs 2580,030 0,9040,020 0,6050,010 0,2960,004 0,1190,002 0,0570,001 0,027
Resultados e Discussão
101R.F.Menegon
O coeficiente de partição estimado encontrado foi de 8500, visto a
solubilidade máxima do TPCHD em n-octanol ser de 85 mg/mL e em água ser de
0,010 mg/mL (Log P estimado = 3,9) (tabela 4.2).
Tabela 4.2: Concentração das soluções saturadas de TPCHD em água e em n-octanol.
Am ostra Abs Diluída (m g/m L) Concent. (m g/m L)
Água 0,017 0,001 0,010
n-octanol 0,503 0,017 85,000
Diluída = concentração na amostra analisada, e Concent. = concentração na solução do ensaio.
Esta estimativa preliminar faz-se necessária para prevermos a partição real
e assim evitar que se obtenha uma solução muito concentrada em algumas das
duas fases (C>0,01M), onde não mais se aplicaria a lei de partição de Nernst,
tornando o ensaio não confiável (OJEC, 1992).
Com base neste resultado, foi obtido solução estoque na concentração de
11mg/mL (0,007M) em n-octanol e calculou-se as proporções entre as duas fases
de maneira a se possibilitar detectar a substância na fase mais diluída, a aquosa.
Os resultados das determinações estão listados na tabela 4.3.
Resultados e Discussão
102R.F.Menegon
Tabela 4.3: Concentração de TPCHD nas fases n-octanol e aquosa, e valor do coeficiente de
partição P e Log P.
Concentração (m g/m L)Am ostra Réplica Abs
Diluída concentradaP Log P
Estoque octanol --- 0,335 0,011 11 --- ---
10:05 (O /A)- octanol 0,331 0,011 11
10:05 (O /A) – água1
0,014 0,001 0,00111000 4,0
10:05 (O /A)- octanol 0,326 0,011 11
10:05 (O /A) – água2
0,017 0,001 0,00111000 4,0
05:05 (O /A)- octanol 0,323 0,011 11
05:05 (O /A) – água1
0,017 0,001 0,00111000 4,0
05:05 (O /A)- octanol 0,323 0,011 11
05:05 (O /A) – água2
0,015 0,001 0,00111000 4,0
05:10 (O /A)- octanol 0,328 0,011 11
05:10 (O /A) – água1
0,015 0,001 0,00111000 4,0
05:10 (O /A)- octanol 0,333 0,011 11
05:10 (O /A) – água2
0,015 0,001 0,00111000 4,0
O valor de Log P encontrado (4,0) indica um grande aumento na
lipofilicidade do sal tetrapalmitato da clorexidina com relação aos seus outros sais
(clorexidina base = -0,1, diacetato = -1,3, e digluconato = -1,4) (Farkas, Zelkó,
Török, et al, 2001). Este valor de Log P mais elevado pode resultar em melhora na
atividade biológica deste agente antimicrobiano visto que, segundo Warner e
Resultados e Discussão
103R.F.Menegon
Lynch (1979), o caráter hidrofóbico dos compostos guanidínicos parece ser o
parâmetro físico-químico mais intimamente associado à ação antimicrobiana,
sendo que os valores ótimos para Log P estão dentro do limite de 5,6 a 6,6.
De maneira a verificar a velocidade de remoção deste sal da cavidade bucal
pela ação da saliva, realizou-se estudo farmacocinético baseado no trabalho
realizado por Pesonen e colaboradores (1995).
Primeiramente, foi testada a eficiência da extração pela comparação da área
do pico da injeção direta de um padrão com a área da injeção a partir do
procedimento de extração. Neste ensaio duas observações fazem-se necessárias:
1) A acetonitrila, solvente de escolha utilizado no referido trabalho, não se separa
completamente da fase aquosa, ou seja, após a adição de 400?L de acetonitrila
somente 375?L são separados, e 2) Na etapa final do procedimento de extração,
verificou-se que a solubilização do resíduo da evaporação da acetonitrila com um
volume muito reduzido de fase móvel (117?L) era insuficiente, resultando em
baixas e irregulares taxas de recuperação, assim sendo, resolveu-se utilizar o
dobro do volume de fase móvel (234?L), ficando por esta razão com a
concentração igual à metade da concentração do padrão de injeção direta. A
tabela 4.4 mostra as áreas dos picos de cada padrão e a taxa de recuperação já
com as concentrações corrigidas.
Resultados e Discussão
104R.F.Menegon
Tabela 4.4: Taxa de recuperação da extração.
Padrões Área do pico Recuperação
PE 7??g/m L 139266
PID 14??g/m L 360944,377,17%
PE 3,5 ??g/m L 62952,7
PID 7??g/m L 169361,374,34%
PE = padrão de extração; PID = padrão para injeção direta; recuperação = [ (área do pico do
PE)x2/área do pico do PID]x100.
A curva de calibração foi linear dentro do limite 6,75 a 135?g/mL
apresentando bom coeficiente de correlação (R2=0,9999), como mostrado na
gráfico 4.2.
Gráfico 4.2: Curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina
y = 6878,5x + 3376,3
R2 = 0,9999
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
0 50 100 150
?g/m L
área
?g/m l área135 931713,327 192285,713,5 91529,36,75 51577,7
Resultados e Discussão
105R.F.Menegon
A concentração do sal na suspensão aquosa usada para o enxágüe bucal foi
calculada mantendo-se a mesma concentração molar, em termos de clorexidina
base, que os enxaguatórios disponíveis no mercado; a suspensão a 0,35% contém
2,28mM de tetrapalmitato de clorexidina, o qual corresponde a 0,75mM de
clorexidina base, já os enxaguatórios comerciais contém 0,12% de digluconato de
clorexidina, o que eqüivale a 1,34mM do sal ou 0,75mM de clorexidina base.
Schiött e Löe (1972) determinaram em 4?g/mL a concentração mínima de
digluconato de clorexidina na cavidade bucal capaz de inibir cepas de
Streptococos, o que equivale a cerca de 11?g/mL de tetrapalmitato de clorexidina.
Com base nesta informação, podemos observar através do gráfico 4.3, que mesmo
após 12 horas à administração da suspensão a concentração do sal está bem
acima deste valor (28?g/mL), mesmo após a realização de uma refeição e da
escovação dental.
Resultados e Discussão
106R.F.Menegon
Gráfico 4.3: Concentração de TPCHD em função do tempo transcorrido ao enxágüe bucal com
suspensão 0,35%
Pesonem e colaboradores (1985) verificaram que em cerca de 10 horas
após a administração de diacetato de clorexidina (cerca 0,75mM de clorexidina
base), a concentração desta estava no limite mínimo para se ter uma atividade
inibitória, e após 12 horas estava abaixo de 50% deste limite.
Assim sendo, é possível observar aumento na retenção do sal tetrapalmitato
na cavidade bucal, o que pode permitir que a dosagem de clorexidina empregada
no enxágüe bucal seja diminuída sem haver prejuízo de sua atividade
antimicrobiana, resultando na minimização de seus efeitos indesejáveis (manchas
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 250 500 750 1000 1250 1500tem po (m inutos)
ug/mL
tem po área ?g/m l1 3037248 44115 770014,7 11160 469107,3 68120 450565,7 65240 366787,3 53480 327998 47720 195606,7 281440 32152,7 4
Resultados e Discussão
107R.F.Menegon
nos dentes e sabor desagradável), o que pode resultar em maior adesão dos
pacientes ao tratamento.
Estes resultados sugerem o tetrapalmitato de clorexidina como potencial
antimicrobiano para uso em odontologia com eficácia superior ao utilizado
comercialmente. Neste sentido, é possível a continuação do trabalho, envolvendo
ensaios clínicos de análise sensorial, para a observação do sabor e amarelamento
dos dentes.
5- Conclusões e Perspectivas
Conclusão e perspectivas
108 R.F.Menegon
5. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
5.1. CONCLUSÕES
?? O pró-fármaco amídico derivado da clorexidina foi obtido com rendimentos
muitos baixos, devido à possibilidade de formação de muitos produtos, além da
própria degradação da molécula de clorexidina.
?? O sal tetrapalmitato de clorexidina é obtido facilmente, com 63% de
rendimento.
?? O coeficiente de partição n-octanol/água do sal tetrapalmitato de clorexidina
é 11.000 (Log P = 4,0), demonstrando alta lipossolubilidade e baixa
hidrossolubilidade.
?? O estudo farmacocinético realizado na saliva demonstrou menor remoção do
sal tetrapalmitato de clorexidina pela saliva e elevada concentração do mesmo nas
primeiras 12 horas após enxágüe bucal mantida a concentração usual dos
enxagüatórios disponíveis no mercado.
Conclusão e perspectivas
109 R.F.Menegon
5.2. PERSPECTIVAS
?? Realizar estudo sobre a permeação do sal obtido nos tecidos subgengivais.
?? Realizar ensaio clínico para a observação de alteração de sabor e
amarelamento dos dentes.
6– Procedimento Experimental
Procedimentos Experimentais
110R.F.Menegon
6. PROCEDIM ENTO EXPERIM ENTAL
6.1. OBTENÇÃO DO PRÓ-FÁRM ACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DO PROCEDIM ENTO A
Esquem a 6.1: Obtenção do pró-fármaco(3) a partir do cloreto de palmitoíla(2) e clorexidina
base(1).
Procedimentos Experimentais
111R.F.Menegon
6.1.1. Procedim ento A1
Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de metanol e
algumas gotas de ácido nítrico até total solubilização, com pH da solução em torno
de 4,0. Sobre esta solução, adicionou-se 0,6 ml (2 mmol) de cloreto de palmitoíla.
A reação foi mantida em agitação à temperatura ambiente por 24 horas. Após este
período, adicionou-se 10 ml de água, formando duas fases, uma superior amarela
e uma inferior incolor. Sobre a fase incolor adicionou-se hidróxido de sódio a 1 M
até precipitação de um pó branco. A reação foi acompanhada por CCD e o produto
final analisado por ponto de fusão e infravermelho.
6.1.2. Procedim ento A2.1
Sobre 50 ml de uma mistura 2:1 de éter etílico/metanol adicionou-se 0,505
g (1mmol) de clorexidina. Ocorre uma leve solubilização. Adicionou-se 0,6 ml (2
mmol) de cloreto de palmitoíla, favorecendo a solubilização de toda a reação. A
reação foi mantida sob agitação a temperatura ambiente por 24 horas, formando
uma grande massa de precipitado branco. Filtrou-se a solução e lavou-se o
precipitado com água gelada. Parte do solvente do líquido filtrado foi extraído com
rota-vapor e neutralizado com hidróxido de sódio 0,2N, obtendo-se um produto
também branco. A reação foi acompanhada por CCD, o precipitado e o produto
brancos foram analisados por infravermelho e ponto de fusão.
Procedimentos Experimentais
112R.F.Menegon
6.1.3. Procedim ento A2.2
Sobre 50 ml de uma mistura 2:1 de éter etílico/metanol adicionou-se 0,505
g (1mmol) de clorexidina, 0,6 ml (2 mmol) de cloreto de palmitoíla, e 0,16 ml (2
mmol) de piridina. A solução foi mantida sob agitação, a temperatura ambiente por
24 horas, formando uma grande massa de precipitado branco. Filtrou-se a solução
e lavou-se o precipitado com água gelada. Parte do solvente do líquido filtrado foi
extraído com rota-vapor e neutralizado com hidróxido de sódio 0,2N, obtendo-se
um produto também branco. A reação foi acompanhada por CCD e os produtos
analisados por ponto de fusão e infravermelho.
6.1.4. Procedim ento A3
Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 10 ml de DMF. Sobre a
suspensão formada adicionou-se 0,16 ml (2 mmol) de piridina e então 0,6 ml (2
mmol) de cloreto de palmitoíla, com subseqüente solubilização da reação. Após 1
hora a temperatura ambiente, o precipitado branco formado foi filtrado da reação
e lavado com água gelada. A reação foi acompanhada por CCD e o produto obtido
analisado por infravermelho e ponto de fusão.
Procedimentos Experimentais
113R.F.Menegon
6.1.5. Procedim ento A4.1
Em 50 ml de clorofórmio, adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina
formando uma suspensão. Adicionou-se 0,16 ml (2 mmol) de piridina e 0,6 ml (2
mmol) de cloreto de palmitoíla. Instantaneamente formou-se um gel, o qual foi
colocado em um funil revestido com papel de filtro e lavado com metanol e água
gelada, formando um pó branco. O produto obtido foi analisado por ponto de
fusão e infravermelho.
6.1.6. Procedim ento A4.2
Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de THF. Aqueceu-se
a mistura até temperatura de refluxo (aproximadamente 65 ºC) ocorrendo
solubilização. Sob esta solução, adicionou-se 20 mg (0,16 mmol) de DMAP e 0,32
ml (4 mmol) de cloreto de palmitoíla. A reação foi mantida sob refluxo durante
uma noite, e então removeu-se o precipitado branco formado por filtração e
extraiu-se o solvente do líquido filtrado em rota-vapor, obtendo-se uma pasta de
coloração levemente amarelada. O produto branco precipitado foi analisado por
ponto de fusão, infravermelho e RMN 1H, e a pasta amarelada analisada por CCD e
infravermelho.
Procedimentos Experimentais
114R.F.Menegon
6.1.7. Procedim ento A4.3
Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de THF e aqueceu-
se até refluxo com subseqüente solubilização. Adicionou-se 20 mg (0,16 mmol) de
DMAP e 0,32 ml (4 mmol) de cloreto de palmitoíla. O pH foi ajustado para 10 com
Et3N. Após 24 horas de reação removeu-se o precipitado da reação e extraiu-se o
solvente do líquido filtrado com rota-evaporador. O resíduo foi solubilizado em
clorofórmio e lavado com 2 frações de 20 ml de HCl 0,2 N. A fração orgânica foi
concentrada pela evaporação do solvente e o resíduo amarelo purificado por
cromatografia em camada delgada preparativa usando como fase móvel
metanol/ácido acético/hexano/clorofórmio (4,5:4,5:10:81). A fração superior foi
analisada por RMN 1H.
6.1.8. Procedim ento A4.4
Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de THF. Aqueceu-se
a mistura até temperatura de refluxo (aproximadamente 65 ºC) ocorrendo
solubilização. Sob esta solução, adicionou-se 0,32 ml (4 mmol) de cloreto de
palmitoíla e manteve-se a reação sob refluxo por 24 horas. Após este período,
filtrou-se o precipitado da reação e extraiu-se o solvente do líquido filtrado com
rota-vapor obtendo-se um produto levemente amarelado. A reação foi
acompanhada por CCD e os produtos analisados por infravermelho.
Procedimentos Experimentais
115R.F.Menegon
6.1.9. Procedim ento A4.5
Adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina em 50 ml de THF. Aqueceu-se
a mistura até temperatura de refluxo (aproximadamente 65 ºC) ocorrendo
solubilização. Sob esta solução, adicionou-se 0,32 ml (4 mmol) de cloreto de
palmitoíla e ajustou-se o pH as reação para cerca de 10 com Et3N. A reação foi
mantida sob refluxo por 24 horas. Após este período, filtrou-se o precipitado da
reação e extraiu-se o solvente do líquido filtrado com rota-vapor obtendo-se um
produto levemente amarelado. Este produto foi solubilizado em diclorometano e
aplicado em uma coluna de 40 cm x 2,6 cm de filtração em gel (Sephadex LH-20
®), utilizando diclorometano como fase móvel, e depois purificado novamente em
coluna de sílica gel de 10 cm x 2,5 cm usando como fase móvel 100 % de
diclorometano. Obteu-se um produto branco, o qual foi analisado por ponto de
fusão, infravermelho e RMN 1H
Procedimentos Experimentais
116R.F.Menegon
6.2. OBTENÇÃO DO PRÓ-FÁRM ACO DE CLOREXIDINA ATRAVÉS DO PROCEDIM ENTO B
Esquem a 6.2: Obtenção do pró-fármaco (3) a partir do ácido palmítico (4) e clorexidina base (1).
Procedimentos Experimentais
117R.F.Menegon
6.2.1. Procedim ento B1
1,024 g (4 mmol) de ácido palmítico foi solubilizado em 30 ml de THF. A
dicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina e aqueceu-se a reação até refluxo do
solvente (aproximadamente 65 ºC). Após 24 horas de reação, extraiu-se parte do
solvente da reação com auxílio do rota-vapor e adicionou-se cerca de 20 ml de
isopropanol e guardou-se a solução na geladeira (a aproximadamente 4 ºC). Após
24 horas, removeu-se o precipitado formado, e o produto foi analisado por ponto
de fusão, infravermelho e análise elementar. O solvente restante foi rota-
evaporado fornecendo um produto amarelado, o qual foi dissolvido em
clorofórmio, removido algum produto insolúvel branco, e aplicado em coluna de
sílica gel de 5 cm x 2,5 cm , utilizando mistura 2:8 de acetato de etila/clorofórmio
como fase móvel. O óleo amarelo obtido foi analisado por RMN 1H.
Procedimentos Experimentais
118R.F.Menegon
6.2.2. Procedim ento B2
Em 30 ml de Et3N adicionou-se 0,505 g (1 mmol) de clorexidina e aqueceu-
se a reação para 65ºC, a solubilização só ocorreu após a adição de 1,024 g (4
mmol) de ácido palmítico. O sistema foi mantido a 65 ºC por 7 dias, sendo
acompanhado por CCD. Após este período, a reação foi vertida para um funil de
separação e então adicionou-se 30 ml de água gelada formando duas fases, a fase
inferior (incolor) foi descartada e à superior (amarela) foi adicionado 30 ml de
diclorometano. A fase orgânica foi separada, seca com sulfato de sódio anidro e
rotaevaporada, produzindo uma pasta amarelada que foi analisada por CCD.
Procedimentos Experimentais
119R.F.Menegon
6.3. ENSAIOS FÍSICO-QUÍM ICO E FARM ACOCINÉTICO
6.3.1. Coeficiente de partição (Log P)
6.3.1.1. Curva de calibração do tetrapalm itato declorexidina (TPCHD)
Para a medida das absorbâncias das soluções foi utilizado espectrofotômetro
UV-VIS da marca Hitachi, modelo U-2001, e cubeta de quartzo de 1cm.
Solução estoque (10 m g/m L): Pesou-se exatamente 0,0100g de TPCHD
em um balão volumétrico de 100 mL e dissolveu-se em cerca de 80 mL de etanol
absoluto, agitou-se por 20 minutos a 250 rpm e manteve-se por mais 10 minutos
em banho ultrassônico e então completou-se o volume com etanol absoluto.
Diluições:
D1 (0,030 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 3 mL da solução
estoque para um balão volumétrico de 10 ml, completou-se o volume com etanol
absoluto.
D2 (0,020 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 2 mL da solução
estoque para um balão volumétrico de 10 ml, completou-se o volume com etanol
absoluto.
Procedimentos Experimentais
120R.F.Menegon
D3 (0,010 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 1 mL da solução
estoque para um balão volumétrico de 10 ml, completou-se o volume com etanol
absoluto.
D4 (0,004 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 2 mL da solução
estoque para um balão volumétrico de 50 ml, completou-se o volume com etanol
absoluto.
D5 (0,002 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 1 mL da solução
estoque para um balão volumétrico de 50 ml, completou-se o volume com etanol
absoluto.
D6 (0,001 mg/mL) - Transferiu-se volumetricamente 1 mL da solução
estoque para um balão volumétrico de 100 ml, completou-se o volume com etanol
absoluto.
As soluções foram medidas em espectrofotômetro a 258 nm, e suas
absorbâncias plotadas em gráfico versus a concentração. A reta final foi obtida
pela regressão linear dos pontos obtidos.
6.3.1.2. Estim ativa prelim inar do coeficiente de
partição
Misturou-se um excesso da amostra com 5 mL de água e manteve-se sob
agitação a 250 rpm por 24 horas. Ao final deste período, filtrou-se a mistura e
transferiu-se volumetricamente 1 mL da água saturada em balão volumétrico de
Procedimentos Experimentais
121R.F.Menegon
10 mL, completou-se o volume com etanol absoluto. A concentração desta solução
foi medida no espectrofotômetro a 258nm, usando como branco solução de 1 mL
de água em 10 mL de etanol.
De maneira similar, misturou-se um excesso da amostra com 5 mL de n-
octanol e manteve-se sob agitação a 250 rpm por 24 horas. Ao final deste período,
filtrou-se a mistura e transferiu-se exatamente 20 ?L de n-octanol para um balão
volumétrico de 100 mL e completou-se o volume com etanol absoluto. A
concentração desta solução foi medida no espectrofotômetro a 258nm, usando
como branco solução de 20 ?L de n-octanol em 100 mL de etanol.
6.3.1.3. Determ inação do Coeficiente de Partição
Para a determinação do coeficiente de partição é necessário que se faça
uma pré saturação das fases, para isto, agitou-se durante 24 horas n-octanol com
um pouco de água e água com um pouco de n-octanol, após este período, as
misturas foram mantidas em repouso por mais 24 horas e então separou-se os
solventes saturados.
Solução estoque de TPCHD (11 m g/m L): Pesou-se exatamente
0,5500g de TPCHD em balão volumétrico de 50 mL e completou-se o volume com
n-octanol.
Uma alíquota de 10?L da solução estoque foi transferida para um balão
volumétrico de 10 mL e completou-se o volume com etanol absoluto, esta diluição
Procedimentos Experimentais
122R.F.Menegon
foi analisada no espectrofotômetro a 258 nm de maneira a confirmar a
concentração da solução.
Condições do ensaio: De maneira a garantir a reprodutibilidade do
ensaio, este deve ser feito em duplicata e em três condições diferentes, variando-
se a massa da amostra e as proporções dos solventes.
Condição 1 – Transferiu-se volumetricamente 10 mL da solução estoque de
TCPHD para um tubo de ensaio de 20 mL e adicionou-se exatamente 5 mL de
água. Massa de TPCHD empregada = 110 mg.
Condição 2 – Transferiu-se volumetricamente 5 mL da solução estoque de
TPCHD para um tubo de ensaio de 20 mL e adicionou-se exatamente 5 mL de
água. Massa de TPCHD empregada = 55 mg.
Condição 3 – Transferiu-se volumetricamente 5 mL da solução estoque de
TPCHD para um tubo de ensaio de 20 mL e adicionou-se exatamente 10 mL de
água. Massa de TPCHD empregada = 55 mg.
Os seis tubos de ensaio foram submetidos a agitação manual, realizando-se
em 5 minutos 100 rotações de 180 º no seu eixo transversal. Os tubos
permaneceram então descansando por 1 hora na temperatura do ensaio (20 ºC) e
então mediu-se a concentração em cada uma das fases no espectrofotômetro a
258 nm. Para a fase n-octanol foi necessário diluir 10?L da solução para 10mL com
etanol absoluto de maneira à absorção se enquadrar dentro da curva de
calibração, já a fase aquosa foi medida diretamente sem diluição, dada à sua baixa
concentração, utilizando água saturada com n-octanol como branco.
Procedimentos Experimentais
123R.F.Menegon
O coeficiente de partição “P” foi calculado dividindo-se a concentração na
fase oleosa pela concentração na fase aquosa. O valor do Log P é obtido
calculando-se o logaritmo na base 10 do valor de “P”.
6.3.2. Determ inação do tem po de retenção do pró-fárm aco
na cavidade bucal
6.3.2.1. Crom atografia
Para a análise por CLAE (cromatografia líquida de alta eficiência) foi
utilizado um sistema cromatográfico da Shimadzu SCL-10A, detector UV-VIS SPD-
10A, sistema de bombeamento de fase móvel quaternário LC-10AD, degaseificador
DGU-14A (à vácuo), e loop do injetor de 20?L.
A CLAE em fase reversa foi realizada a temperatura ambiente, a coluna
utilizada foi a shim-pack CLC-ODS (M), de 25 cm de comprimento, 4,6 mm de
diâmetro interno 5?m de diâmetro de partícula. A fase móvel empregada foi 1000
?g/mL de ácido p-tolueno sulfônico em metanol-água (65:35, v/v)
Procedimentos Experimentais
124R.F.Menegon
6.3.2.2. Procedim ento de extração
200 ?L de saliva foram introduzidos em um tubo de ensaio e adicionou-se
400 ?L de NaOH 4,5 N e 400 ?L de acetonitrila. O tubo foi agitado em vórtex por
um minuto e centrifugado a 1610 g por 15 minutos, após a separação das fases,
175 ?L da fase orgânica foi coletada em outro tubo de ensaio e o solvente
evaporado. O resíduo foi ressolubilizado em 250 ?L de fase móvel, e injetado no
sistema de CLAE.
6.3.2.3. Curva de calibração
A curva de calibração do tetrapalmitato de clorexidina (TPCHD) foi feita
utilizando quatro concentrações (6,75, 13,5, 27 e 135 ?g/mL) e em triplicata. A
curva de calibração foi gerada pela regressão linear da área do pico do TPCHD
versus a concentração.
Preparação dos padrões:
Preparou-se uma solução padrão de trabalho de concentração 10 ?g/mL,
para isto, pesou-se exatamente 0,0100 g de TPCHD em um balão volumétrico de
100 ml e adicionou-se cerca de 80 mL de metanol, agitou-se por 20 minutos a 250
rpm e manteve-se por 10 minutos em banho ultrassônico, e então completou-se o
volume com metanol. Transferiu-se volumetricamente 10 mL desta solução para
Procedimentos Experimentais
125R.F.Menegon
um novo balão volumétrico de 100 mL e completou-se o volume com metanol
obtendo a solução padrão de trabalho (SPT).
Padrão 6,75 ?g/mL – Transferiu-se 135 ?L da SPT para um tubo de ensaio e
evaporou-se o metanol.
Padrão 13,5 ?g/mL – Transferiu-se 270 ?L da SPT para um tubo de ensaio e
evaporou-se o metanol.
Padrão 27 ?g/mL – Transferiu-se 540 ?L da SPT para um tubo de ensaio e
evaporou-se o metanol.
Padrão 135 ?g/mL – Transferiu-se 2700 ?L da SPT para um tubo de ensaio
e evaporou-se o metanol.
A cada um dos tubos, foi adicionado 200 ?L de saliva e prosseguiu-se com a
extração como descrita anteriormente.
6.3.2.4. Taxa de recuperação
A taxa de recuperação do TPCHD a partir da saliva foi determinada em
triplicata em duas concentrações diferentes dentro dos limites da curva de
calibração.
Padrões para Injeção Direta (PID):
PID 14 ?g/mL: Transferiu-se 350 ?L da SPT para um tubo de ensaio
e evaporou-se o metanol, o resíduo foi misturado com 250 ?L de fase móvel,
agitado em vórtex por um minuto e injetado no sistema cromatográfico.
Procedimentos Experimentais
126R.F.Menegon
PID 7 ?g/mL: Transferiu-se 175 ?L da SPT para um tubo de ensaio e
evaporou-se o metanol, o resíduo foi misturado com 250 ?L de fase móvel, agitado
em vórtex por um minuto e injetado no sistema cromatográfico.
Padrões de Extração (PE):
PE 7 ?g/mL: Transferiu-se 370 ?L da SPT para um tubo de ensaio e
evaporou-se o metanol, ao resíduo foi adicionado 200?L de saliva, 400?L de NaOH
4,5 N e 400?L de acetonitrila. A mistura foi agitada por um minuto em vórtex e
então centrifugada a 1610g por 15 minutos. 175 ?L da fase orgânica foi separada
e evaporada para ser posteriormente solubilizada em 234 ?L de fase móvel,
agitada em vórtex por um minuto aplicada no sistema cromatográfico.
PE 3,5 ?g/mL: Transferiu-se 175 ?L da SPT para um tubo de ensaio e
evaporou-se o metanol, ao resíduo foi adicionado 200?L de saliva, 400?L de NaOH
4,5 N e 400 ?L de acetonitrila. A mistura foi agitada por um minuto em vórtex e
então centrifugada a 1610g por 15 minutos. 175 ?L da fase orgânica foi separada
e evaporada para ser posteriormente solubilizada em 234 ?L de fase móvel,
agitada em vórtex por um minuto aplicada no sistema cromatográfico.
Procedimentos Experimentais
127R.F.Menegon
6.3.2.5. Estudo farm acocinético
Realizou-se um enxágüe bucal com 30 mL de uma suspensão aquosa a
0,35% de TPCHD durante um minuto. Alíquotas de saliva foram coletadas nos
tempos 1, 15, 60, 120, 240, 480, 720 e 1440 minutos após o enxágüe. Uma
amostra branco da saliva foi coletada antes da administração da suspensão.
Durante as oito primeiras horas não foi permitido nenhuma bebida (exceto água),
comida ou fumo.
7– Referências Bibliográficas
Referências Bibliográficas
128_____________________________________________________________________________________________________
R.F.Menegon
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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