INSTITUTO FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE FURGCURSO DE ENGENHARIA BIOQUMICADISCIPLINA DE BIOQUMICA I

EXTRAO E CARACTERIZAO DE CIDOS NUCLICOS

Andressa Pivato - 76289Daniel Souza 69164Las Reginatto -56687Larissa Quadros - 71768

Rio Grande, 2015.LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 - Dupla hlice do DNA3

Sumrio1INTRODUO32OBJETIVO53MATERIAL E MTODOS53.1Materias53.2Reagentes e solues53.3Procedimento Experimental54Resultados e Discusses64.1EXTRAO64.2CARACTERIZAO75Concluses9REFERNCIAS10

INTRODUOOs nucleotdeos so molculas das quais possuem uma base nitrogenada, um grupo fosfato e uma ribose ou desoxirribose. As bases nitrogenadas so compostas por dois grupos: pirimidinas, nesse grupo entra a citosina (C), timina (T) e uracila (U), e as pricas, as quais so denominadas guanina (G) e adenina (A), esses grupos so encontrados nas estruturas tanto do DNA, como no RNA, se diferenciando, apenas, pelo fato de que a ocorrncia de timina maior no cido desoxirribonucleico bem como a uracila tem maior frenquncia no cido ribonucleico (Embrapa, 2014).Os nucleotdeos podem desempenhar funes tais como: armazenar informaes genticas, pois eles servem como blocos para a posterior construo dos cidos nucleicos, os quais as subunidades de nucleotdeos esto ligados de forma covalente pela formao de um grupo ster fosfato entre o grupo 3-hidroxila em um nucleotdeo com o grupo 5 do nucleotdeo adjacente. Bem como, ser utilizado como carregador de energia qumica (HARVEY, Richard, 1997).A descoberta das estruturas do DNA, e subsequentemente do RNA, realizada pelos cientistas Watson e Crick em 1953, indispensvel para qualquer discusso na rea da bioqumica por tamanha importncia de tal fato. Esses cientistas postularam a forma tridimensional do cido desoxirribonucleico (DNA), a qual consiste em uma dupla hlice que gira em torno da mo direita, sendo essas antiparalelas, pois suas ligaes fosfodiester 5,3 correm em direes opostas, alm disso elas so complementares entre si, ou seja, onde se encontra uma guanina na cadeia em uma fita haver uma citosina ligada, atravs das pontes de hidrognio. (LEHNINGER, Albert, 1995)

Figura 1: Dupla hlice do DNA Fonte: http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/do/p_do44.pdf

H tambm a formao de sulcos, denominados sulco secundrio e sulco principal, como mostra a Figura 1. Watson e Crick usaram modelos moleculares para demonstrar que dentro da dupla hlice as bases nitrogenadas estariam empilhadas verticalmente, separadas por aproximadamente 0,34 nm e na essa distncia seria cerca de 3,4 nm na repetio secundria, devido presena de 10 nucleotdeos em cada volta da dupla hlice. (LEHNINGER, Albert, 1995)Um experimento realizado por Oswald T. Avery, Colin MacLeod e Maclyn McCarty, o qual se baseava em transformar geneticamente uma cepa no-virulenta, da bactria Streptococus pneumonise, em uma forma virulenta, foi uma das primeiras evincias que o DNA responsvel pelo armazenamento da informao gentica. Avery e os demais cientistas, concluiram que o DNA extrado da cepa virulenta transportava informaes genticas herdadas da virulncia. Houve contradies pois se notou a existncia de protenas, as quais podiam ter sido o real transportador das informaes genticas, todavia, o experiemento com enzimas proteolticas e desoxirribonucleases, mostrou que o DNA definitivamente o componente o qual possu informaes geneticas das clulas vivas (LEHNINGER, Albert, 1995).

OBJETIVOO objetivo do experimento foi extrair e caracterizar o DNA da cebola.MTODOS E MATERIAIS3.1 Materiais Tecido vegetal; Bquer; Proveta; Detergente; Cloreto de Sdio (NaCl); Recipiente para banho de gelo; Erlenmeyer; Funil; Algodo; Tubos de ensaio; Pipetas; lcool etlico 95% (gelado-4 a 8C); Reagente de Molish; Soluo de glicose 0,1%; gua destiladaSoluo de Lise: Dodecilsulfato de sdio 1% (100 mL), 15 g de Na Cl (completar com gua destilada at um volume de 500 mL); Reagente de Molish3.3 Procedimento ExperimentalPrimeiramente houve a escolha da amostra, a qual seria utilizada na prtica para fins qualitativos, e ento se optou pela cebola. Posteriormente cortou-se em pedaos pequenos o material a ser trabalhado. Com o auxlio de uma proveta, depositou-se 60 mL da soluo lise (detergente) no bquer, no qual havia sido colocada a cebola previamente cortada. Macerou-se a amostra perto de seu ponto de homogeneizao, com um basto de vidro. Colocou-se o bquer no banho-maria 60C durante 30 minutos, e o deixou em um recipiente com gelo por 5 minutos, agitando vagarosamente a amostra com basto de vidro. Com auxlio de um pedao de algodo (a fim de passar apenas o caldo da amostra para o recipiente), preparou-se o funil para a filtrao em suspenso no erlenmeyer. Enumeraram-se os tubos de ensaio, para que fosse possvel a identificao. Pipetou-se 5 mL do filtrado ao tubo 1, adicionou-se, delicadamente, 5 mL de lcool etlico 95% gelado pela parede do tubo, procurando no misturar as solues. Posteriormente a observao da formao de um material esbranquiado (DNA) sob o caldo de cebola no tubo 1, o mesmo material foi transferido ao tubo 2 com o auxlio de um palito de madeira (DNA gruda-se no mesmo por interaes eletrostticas). Adicionou-se 2 mL de gua destilada no tubo de ensaio 2, a fim de dissolver o material gentico da cebola. Pipetou-se 2 mL de soluo de glicose 0,1% no tubo 3. Adicionou-se 0.5 mL de reagente de Molisch nos tubos 2 e 3 respectivamente. Colocou-se, cuidadosamente, sem agitao e com os tubos inclinado pelas paredes do mesmo, 1 mL de cido sulfrico no tubo 2 e 3. Esperaram-se aproximadamente 5 minutos para a possvel observao da formao de anel de furfural e derivados nos tubos, sendo identificados pela mudana de colorao e posterior discusso de resultados. Resultados e Discusses4.1 ExtraoA extrao de DNA de plantas envolve a lise das clulas vegetais por meio do tratamento com detergente e posterior separao e precipitao do DNA. A etapa de extrao do DNA crucial para que a caracterizao e a determinao do mesmo sejam precisas e corretas. Como mencionado na metodologia, as amostras foram cortadas em pequenos pedaos de 0,5cm, e em um bquer foi adicionado soluo de lise. A Soluo de Lise serve para o rompimento da parede celular, por ser uma soluo constituda de Dodecilsulfato de Sdio(SDS) e Cloreto de Sdio. Este sal contribui com ons positivos e negativos. Os positivos neutralizam a carga negativa do DNA, e os negativos as histonas, permitindo que o complexo DNA e Histonas no se repila mais e ento se enovele. Se no fosse a presena do sal, ele poderia desintegra-se. Um outro fato, que o sal aumenta a densidade do meio, o que facilita a migrao do DNA para o lcool. Odetergente (SDS)afeta a permeabilidade das membranas, que so constitudas, em parte, por lipdeos. Com a ruptura das membranas os contedos celulares, incluindo as protenas e o DNA, so liberados e dispersam-se na soluo (MARCHAN, S/d).A funo de algumas dessas protenas manter o DNA enrolado numa espiral muito apertada, assim com a adio de sal e o banho-maria de 60C faz com que tenhamos a lise da membrana, fazendo o DNA perder a forma espiral, e consequentemente as fitas duplas se desenrolem. O sal contribui com os ons positivos Na+ que neutralizam a carga negativa do DNA. Esse processo a desnaturao do DNA, que ocorre quando as pontes de hidrognio entre as cadeias complementares do DNA se rompam e as fitas se separem.Mesmo quando as fitas do DNA esto completamente separadas (o DNA ento est desnaturado), o processo pode ser revertido fazendo a renaturao do DNA. Assim, aps o tempo no banho-maria de 60C, o bquer contendo a soluo foi rapidamente colocado em banho de gelo. O banho de gelo utilizado para ajudar o DNA a renaturar, mexendo a soluo com o basto de vidro auxiliando o processo renaturao. Depois que ocorre a etapa de filtrao da suspenso, transferido 5mL do filtrado para dois tubos respectivamente, onde foram adicionados 5mL de lcool etlico 95% gelado. O etanol gelado adicionado no processo para a precipitao do DNA, visto que o DNA possui baixa solubilidade nesse solvente, com isso aumenta a capacidade de compactao do DNA que tende a formar fibras. Aps a adio do lcool etlico amostra, o DNA contido na soluo precipitou. O que pde ser observado na forma de um material esbranquiado, porm para a observao das hlices s possvel atravs do uso de aparelhos especficos.Segundo GOUVEIA, o EDTA (cido etilenodiaminotetractico) utilizado em algumas tcnicas de extrao pois inibe a atividade de desoxirribonucleases, atuando como agente quelante de ons essenciais para a atividade destas enzimas (Mg+2 e Ca+2).

4.2 CaracterizaoEm testes e anlises realizados em laboratrios, algumas vezes necessrio a identificao de substncias desconhecidas pra melhores estudos. Para tanto, existem vrias tcnicas laboratoriais baseadas em reagentes, que so utilizados para a identificao dessas substncias. Segundo VILELLA (1973), o teste deMolish considerado uma reao global para glicdios, podendo estar isolados ou associados, entretanto sem muita especificidade, pois h outras substncias envolvidas no procedimento. Os monossacardeos podem ser facilmente desidratados por ao de cidos fortes concentrados, como o cido sulfrico (H2SO4). O cido sulfrico concentrado presente no mtodo rompe facilmente as ligaes glicosdicas presentes em molculas de polissacardeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacardeos. Esses, por sua vez, so desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o monossacardeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose (SANTOS, A. P. S. A).Tanto o furfural quanto o HMF so substncias incolores, impedindo que a reao seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenlico ao meio (alfa-naftol, conhecido como reagente de Molisch). O reagente de Molisch tem como funo reconhecer carboidratos atravs da pesquisa das funes orgnicas e das caractersticas por ela proporcionadas. Este fenol reage com os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de colorao lils (SANTOS, A. P. S. A).A caracterizao do DNA no obteve sucesso nos resultados. No tubo de ensaio contendo o DNA e no tudo comparativo contendo glicose, no foi observado a formao de anis de cor roxa. Porem ocorreu a formao de anis de cor verde, um resultado inesperado. Considerando que o mtodo foi elaborado com a necessria preciso pelos estudantes componentes do grupo. possvel a hiptese de que foram utilizados reagentes com datas antigas.A concentrao e a pureza de amostras de DNA podem ser medidas por meio de anlise da densidade optica, a partir de um espectrofotmetro e este realizado com as leituras nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. O DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm e as protenas no comprimento de onda de 280 nm. Para determinar a pureza, as amostras so lidas em ambos comprimentos de onda. A qualidade do DNA extrado presente na amostra, determinada a partir da relao entre a concentrao de DNA e protena. A amostra de DNA obtida a partir da extrao, determinada contaminada por protenas, se a concentrao desta for elevada.Em alguns mtodos, aps a digesto da amostra, utilizada uma mistura de clorofrmio e lcool isoamlico para a extrao do DNA. O clorofrmio atua como agente desnaturante das protenas presentes na amostra. O lcool isoamlico evita a formao de espuma quando a mistura agitada. Isso facilita a visualizao para a realizar a retirada do DNA do meio de reao.

ConclusesCom o procedimento feito, foi possvel extrair uma grande quantidade de DNA da cebola atravs de um mtodo simples, para isso, duas etapas contriburam na extrao dessa molcula. Na primeira, foi possvel destruir a parede celulsica que envolve a clula vegetal. Na segunda etapa, o detergente foi responsvel pelo rompimento da membrana citoplasmtica e da liberao do DNA.

REFERNCIASCHAMPE, Pamela C. & HARVEY, Richard A. - Bioqumica Ilustrada. Artes Mdicas. Porto Alegre, 1997.JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO J. Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: 8 ed. Guanabara. 2005.LEHNINGER, A. L. & NELSON, D. L. & COX, M. M. - Princpios de Bioqumica. So Paulo, Sarvier, 1995.VILELLA, BACILA, TASTALDI.Tecnicas e experimentos de bioqumica,1973. VOET, D.; VOET, J. Bioqumica. Artmed, 3 ed. Porto Alegre, 2006.Embrapa. Disponvel em: . Acesso em: 27 de junho de 2015GOUVEIA, J. J. S. Protocolo de Biologia Molecular Aplicadas Produo Animal. Disponvel em: . Acesso em: 27 de junho de 2015.Fundamentos terico-prticos e protocolos de extrao e de amplificao de DNA por meio da tcnica de reao em cadeia da polimerase. Disponvel em: . Acesso em: 27 de junho de 2015.MARCHAN, G. Extraindo o DNA do Morango. Disponvel em: . Acesso em: 27 de junho de 2015.ROMANO, E. Extrao de DNA de plantas. Disponvel em: . Acesso em: 27 de junho de 2015.SANTOS, A. P. S. A. Bioqumica prtica, protocolos para anlise de biomolculas e exerccios complementares. Disponvel em: . Acesso em: 27 de junho de 2015.

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