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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
EXTRATO DE BARBATIMÃO E CÉLULAS MONONUCLEARES
AUTÓLOGAS NO TRATAMENTO DE FERIDAS EXCISIONAIS DE
COELHOS
Danilo Ferreira Rodrigues
Orientador: Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva
GOIÂNIA
2015
ii
DANILO FERREIRA RODRIGUES
EXTRATO DE BARBATIMÃO E CÉLULAS MONONUCLEARES
AUTÓLOGAS NO TRATAMENTO DE FERIDAS EXCISIONAIS DE
COELHOS
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ciência Animal junto à Escola de
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal de Goiás.
Área de concentração:
Patologia, Clínica e Cirurgia Animal
Orientador:
Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva –
EVZ/UFG
Comitê de Orientação:
Prof.ª Dr.ª Maria Clorinda S.Fioravanti –
EVZ/UFG
Prof.ª Dr.ª Liliana Borges de Menezes –
IPTSP/UFG
GOIÂNIA
2015
iii
iv
Dedico este trabalho à minha eterna
companheira,Fernanda Figueiredo Mendes,
por seu amor e apoionos momentos fáceis e
difíceis deminha vida.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus, o maior responsável por todas as oportunidades que me fizeram chegar
até aqui.
Ao prof. Luiz Antônio Franco da Silva, primeiramente por me aceitar como
orientando e pela sua grande amizade, convívio harmonioso, paciência, ensinamentos e
imensa contribuição com o meu desenvolvimento profissional.
Ao meu amor, Fernanda Figueiredo Mendes, pelo imenso apoio pessoal e
profissional, sem os quais seria impossível a realização deste trabalho, pois quando tudo
parecia impossível, eu sempre podia contar com a sua ajuda para deixar a situação sob
controle.
A toda a minha família, especialmente aos meus pais, Geraldo Borges Rodrigues e
Rosilene Ferreira Rodrigues, e à minha avó Felícia dos Santos Ferreira, pelo amor e apoio
nesta minha jornada.
Às minhas co-orientadoras, Prof.ªDr.ª Maria Clorinda Soares Fioravanti e
Prof.ªDr.ª Liliana Borges de Menezes, pela amizade e imensa disposição em sempre ajudar no
desenvolvimento desta pesquisa.
Aos meus amigos de Pós-graduação pelos maravilhosos momentos de estudo e
lazer, além de contribuírem direta ou indiretamente com este trabalho, especialmente a Liliane
Tanus Benatti,Antônio Dionísio Feitosa Noronha Filho,Carlos Vinícius de Miranda Faria,
Taís Andrade Dias,Giselle Bonifácio Neves Mendonça, Marina Zimmermann, Saura Nayane
de Souza, Camila França de Paula Orlando, Daniel Silva Goulart, Júlia de Miranda Moraes,
Vanessa de Sousa Cruz Pimenta, Leandro Guimarães Franco, Ana Carolina Vasques Vilela,
Thamiza Carla Costa dos Santos, Léo Lindsay Sousa Galvão, Polyanna da Silva Ferreira
eBenito Juarez Nunes Alves de Oliveira.
Aos alunos que fizeram ou fazem parte do Grupo de Pesquisa do Prof. Dr. Luiz
Antônio Franco da Silva:Damila Batista Caetano, Brenda Lee Silva Buso, Arielly Rodrigues
de Lima, Ana PaulaNunes de Paiva,Joel Phillipe Costa e Souza, Jéssica Alves da Silva,
Sabrina Lucas Ribeiro de Freitas, Paulo José Bastos Queiroz, Josyanne Rodrigues de Freitas,
Lucas Alves Rodrigues Martins, Morgana Pontes Abreu, Lucas Andrade Mendes, Daniela
Ferreira Cordeiro Gomes, João Messias Carvalhares Filho, Maria Madalena Santos
Costa,Luíza Costa Barcellos eMarina Magalhães Rezendepela imensa ajuda durante o
manejo, procedimentos cirúrgicos dos animais e processamento das amostras deste trabalho.
vi
À pesquisadora MSc. Maria de Fátima Lima de Assis e sua equipe do Instituto
Evandro Chagas (PA) pelos ensinamentos nas técnicas de cultivo celular.
A Prof.ª Dr.ª Elisângela de Paula Silveira Lacerda e sua equipe do Laboratório de
Genética Molecular e Citogenética, do Instituto de Ciências Biológicas-UFG, por auxiliar no
desenvolvimento das etapas de isolamento celular.
Aos Pós-graduandos da Faculdade de Farmácia-UFG, Wannessa Lenyse Rocha de
Carvalho e Stone de Sá, pelo auxílio nos procedimentos de caracterização do extrato de
barbatimão.
Aos professores da EVZ/UFG pela amizade e ensinamentos, em especial àProf.ª
Neusa Margarida Paulo, Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno, Prof. Dr. Olízio Claudino da
Silva, Prof. Dr. Paulo Henrique Jorge da Cunha, Prof. Dr. Luiz Augusto de Souza,Prof.ª Dr.ª
Aline Maria Vasconcelos Lima,Prof. Dr. Eugênio Gonçalves de Araújo, Prof.ª Dr.ª Maria
Auxiliadora Andrade e Prof. Dr. Marcos Barcellos Café.
Aos funcionários do Hospital Veterinário, em especial às técnicas Vilda Maria dos
Reis, Maria do Carmo Marques, Sheila de Almeida Souza e ao Médico Veterinário Dr.
Apóstolo Ferreira Martins, por sempre estarem com muita disposição em me ajudar nas
atividades deste trabalho e da rotina do Hospital Veterinário.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e
Zootecnia/UFG que possibilitou o desenvolvimento deste estudo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e à
Fundação de Amparo à Pesquisa, pelo apoio financeiro. À Farmácia de Manipulação
Animalle (Goiânia – GO) e à empresa Guabi (Anápolis – GO), pelo provimento de insumos.
Aos brasileiros contribuintes que possibilitaram o financiamento desta pesquisa.
A todos os animais que possibilitaram o nosso aprendizado e crescimento pessoal.
vii
“Não entre em pânico.”
Douglas Adams
viii
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS .................................................................... 1
1.1. Introdução ....................................................................................................................... 1
1.2. Considerações gerais sobre a pele.................................................................................... 3
1.3. Aspectos relacionados a biologia da cicatrização cutânea ................................................ 4
1.4. Tratamento de feridas ...................................................................................................... 6
1.5. Parâmetros de avaliação da cicatrização de feridas ........................................................ 11
Referências .......................................................................................................................... 12
CAPÍTULO 2 –O EXTRATO DA CASCA DE BARBATIMÃO, Stryphnodendron
adstringens (Martius) Coville, NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM ANIMAIS .......... 22
Introdução ............................................................................................................................ 24
Considerações gerais acerca defitoterápicos ......................................................................... 25
Considerações Gerais sobre oBarbatimão ............................................................................. 25
Composição química do extrato da casca debarbatimão........................................................ 27
O barbatimão como auxiliar no processo cicatricial deferidas ............................................... 28
Toxicidade dobarbatimão ..................................................................................................... 34
Consideraçõesfinais ............................................................................................................. 35
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 36
CAPÍTULO 3 –TRATAMENTO DE FERIDAS EXCISIONAIS DE COELHOS COM
EXTRATO DE BARBATIMÃO (Stryphnodendron adstringens) ASSOCIADO A CÉLULAS
MONONUCLEARES AUTÓLOGAS DA MEDULA ÓSSEA ............................................ 42
Introdução ............................................................................................................................ 43
Material E Métodos.............................................................................................................. 44
Resultados ........................................................................................................................... 50
Discussão ............................................................................................................................. 59
Conclusão ............................................................................................................................ 63
Referências .......................................................................................................................... 63
CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ..................................................................... 67
ANEXOS ............................................................................................................................. 70
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Aspectos gerais do barbatimão (Stryphnodendron adstringens): A)
Árvore;B) Folha composta por folíolos e foliólulos (seta); C) Vagens (seta);
D) Exemplode um dos extratos da casca de barbatimão (Extrato glicólico)
(Animalle - Farmácia de Manipulação Veterinária,Goiânia-Goiás). ............... 26
FIGURA 1- Procedimento de colheita e isolamento de CMMO, promoção das feridas e
administração dos tratamentos em coelhos: A, punção da medula óssea do
úmero, com agulha 40x12mm acoplada a uma seringa de 10mL contendo
solução de NaCl a 0,9% heparinizada; B, nuvem celular composta por
CMMO após o procedimento de separação celular por gradiente de
densidade (seta vermelha); C, feridas cutâneas excisionais confeccionadas
com punch metálico de 8mm; D, feridas após a colocação da membrana de
poliuretano; E, Representação esquemática da técnica de aplicação da
solução terapêutica de acordo com o grupo (barbatimão, CMMO ou solução
de NaCl a 0,9%). ........................................................................................... 47
FIGURA2- Representação esquemática dos protocolos terapêuticos empregados nas
feridas excisionais cutâneas de coelhos tratados com extrato de barbatimão
(B), CMMO associadas ao extrato de barbatimão (CB), CMMO associadas
a solução de NaCl a 0,9% (CS) e solução de NaCl a 0,9% (S). ECB: extrato
da casca de barbatimão a 10%. CMMO: células mononucleares autólogas da
medula óssea. Solução salina: solução de NaCl a 0,9%. ................................. 48
FIGURA3 - Descrição do procedimento de mensuração da ferida de coelhos pelo
programa Image J: A, captura da imagem da ferida juntamente com uma
régua para ter a referência da escala; B, ajuste do contraste para favorecer a
delimitação da área da ferida; C, área da ferida completamente isolada pelo
plugin Threshold colour que permite a contagem total de pixels e conversão
em cm2 (representada em preto)..................................................................... 48
x
FIGURA4 - Mensuração da área ocupada por fibras colágenas em fotomicrografias de
feridas de coelhos pelo programa Image J: A, imagem original da ferida
capturada em microscópio de luz polarizada no aumento de 400x, as fibras
colágenas estão coradas nas graduações de laranja ao vermelho intenso; B,
área ocupada por fibras colágenas completamente isolada por meio do
plugin Threshold colour representada em preto, a área branca representa a
ausência de colágeno. .................................................................................... 49
FIGURA5- Aspectos macroscópicos das feridas cutâneas excisionais de coelhos tratadas
com barbatimão (B), CMMO com barbatimão (CB), CMMO com solução
de NaCl a 0,9% (CS) e solução de NaCl a 0,9% (S), no dia da cirurgia (dia
0) e no terceiro, sétimo, 14º e 21º dia pós-operatório. Em todos os grupos,
no dia do procedimento ciúrgico observam-se pequenos focos de
hemorragia na lesão. No terceiro dia pós-operatório não se observam
hemorragia ou hiperemia em todos os grupos. No sétimo dia pós-operatório,
evidencia-se a formação de crostas mais exuberantes nos grupos B e CB,
ultrapassando as bordas da ferida. No 14º dia, observa-se a reepitelização e
redução do tamanho das feridas, e presença da cicatriz no 21º dia pós-
operatório em todos os grupos. ...................................................................... 51
FIGURA6 - Representação gráfica da mensuração média da área e desvio padrão de
feridas cutâneas excisionais em cm2 no decorrer dos dias,pelo programa
Image J, de coelhos tratados com barbatimão (B), CMMO com barbatimão
com (CB), CMMO com solução de NaCl a 0,9% (CS) e solução de NaCl a
0,9% (S). Eixo X: dia da mensuração da ferida. Eixo Y: área da ferida em
cm2. ............................................................................................................... 51
FIGURA7 - Representação gráfica da avaliação histopatológica da presença de células
polimorfonucleares (A), células mononucleares (B), angiogênese (C),
fibroplasia (D) e reepitelização (E) em feridas cutâneas excisionais de
coelhos, em escores, tratadas com extrato da casca de barbatimão (B),
CMMO com extrato barbatimão (CB), CMMO com solução de NaCl a 0,9%
(CS) e solução de NaCl a 0,9% (S), na coloração de HE, no terceiro, sétimo,
xi
14º e 21º dia pós-operatório. * Para a variável reepitelização consideraram-
se os escores como ausente (0), parcial (1) e total (2). Eixo x=grupo/período
de avaliação e eixo y=nº de animais. .............................................................. 53
FIGURA 8 - Representações das fotomicrografias de feridas cutâneas excisionais de
coelhos, de acordo com o tratamento (linhas) e período de avaliação
(colunas), pela técnica de coloração hematoxilina e eosina, aumento de 100x
(retângulo maior) e 400x (retângulo menor), em microscopia de luz. Grupos:
B (extrato de barbatimão); CB (CMMO com extrato de barbatimão); CS
(CMMO com solução de NaCl 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%).
Evidencia-se a presença de infiltrado inflamatório no terceiro dia pós-
operatório em todos os grupos. Com sete dias, observa-se a presença de
células mononucleares e angiogênese de moderada a acentuada em todos os
grupos, além da presença de crosta mais espessa nos grupos B e CB
(estrela). No 14º dia, evidencia-se a fibroplasia e células mononucleares em
todos os grupos. No 21º dia pós-operatório, a fibroplasia apresentou
intensidade de moderada a acentuada em todos os grupos. ............................. 54
FIGURA9 - Representações das fotomicrografias de feridas cutâneas excisionais de
coelhos, de acordo com tratamento (linhas) e período de avaliação (colunas),
pela técnica de coloração picrosirius, aumento de 400x em microscopia de
luz polarizada, demonstrando áreas ocupadas por fibras colágenas
representadas pelas cores que variam do verde ao vermelho intenso. Grupos:
B (extrato de barbatimão); CB (extrato de barbatimão com CMMO); CS
(CMMO com solução de NaCl a 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%).
Evidencia-se maior quantidade de fibras colágenas nos grupos B e CB no
sétimo dia pós-operatório e organização do posicionamento das fibras
colágenas no 21º dia pós-operatório nesses grupos. ....................................... 56
FIGURA 10 - Representações gráficas da quantidade de células marcadas (%) pela técnica
de coloração AgNOR (A) e quantidade de grupamentos de proteínas
AgNOR (B) no terceiro, sétimo, 14º e 21º dia pós-operatório. Grupos: B
(extrato de barbatimão); CB (CMMO com extrato barbatimão); CS (CMMO
xii
com solução de NaCl a 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%). Eixo X:
período de avaliação. Eixo Y: porcentagem de células marcadas (A) e
quantidade de células marcadas (B). .............................................................. 57
FIGURA 11 - Representações das fotomicrografias de feridas cutâneas excisionais de
coelhos, de acordo com tratamento (linhas) e período de avaliação (colunas),
pela técnica de coloração AgNOR, aumento de 400x em microscopia de luz
(escala de cinza), demonstrando proteínas AgNOR representadas por pontos
escuros formando os nucléolos (seta vermelha). Grupos: B (extrato de
barbatimão); CB (CMMO com extrato barbatimão); CS (CMMO com
solução de NaCl a 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%). Observa-se a
presença de poucas células em proliferação no terceiro dia pós-operatório e
aumento significativo no sétimo e 14º dia. No 21º dia pós-operatório,
evidencia-se a redução da quantidade de células em proliferação. .................. 58
xiii
RESUMO
Na Medicina Veterinária, o tratamento de lesões cutâneas pode ser dispendioso, demorado ou
ineficaz em pacientes com fatores predisponentes que desfavoreçam a cicatrização, como os
idosos, diabéticos, obesos, comatosos, desnutridos, queimados e que apresentam processos
infecciosos. Pela importância do assunto, a busca por técnicas inovadoras e eficazes que
favoreçam o processo cicatricial, impulsiona uma série de estudos científicos em todo o
mundo. Dentre esses, resultados promissores foram obtidos pelo uso do fitoterápico
barbatimão (Stryphnodendron adstringens) e de células mononucleares da medula óssea.No
entanto, não há relatos que descrevam a associação dessas terapias em feridas. Objetivou-se,
neste estudo, determinar se o tratamento feridas cutâneas excisionais de coelhos (Oryctolagus
cuniculus) é otimizado pelo extrato de barbatimão associado a células mononucleares
autólogas da medula óssea em comparação a estas terapias empregadas
isoladamente.Inicialmente, avaliaram-se clinicamente as feridas por meio da classificação da
intensidade dos parâmetros de hiperemia, hemorragia, secreção, crostas, reepitelização, área
da ferida e tempo de cicatrização, acrescida da avaliação histológica, com observação de
células polimorfonucleares, células mononucleares, angiogênese e fibroplasia, além da
quantificação de fibras colágenos. Em seguida, verificou-se se as terapias do estudo auxiliam
na proliferação celular. Foram empregados métodos de avaliação clínica, morfométrica,
histológica e histoquímica das feridas. Conclui-se que, na fase inicial da cicatrização, o
barbatimão estimula a produção de fibras colágenas e promove a formação de crostas mais
exuberantes sobre a ferida e, na fase de remodelação, favorece a orientação das fibras
colágenas, mas a associação desse fitoterápico com CMMO não estimula a cicatrização de
feridas de coelhos.
Palavras-chave: cicatrização;colágeno;fitoterapia; medula óssea; proliferação celular.
xiv
ABSTRACT
In Veterinary Medicine treatment of skin wounds can be costly, slow and ineffective in
patients with disadvantageous factors such as the elderly, diabetics, obese, comatose,
malnourished, burned, and with infection process. The search for innovative and effective
techniques that favor the healing process, promotes a series of scientific studies around the
world. Promising results were obtained using the phytotherapy with barbatiman
(Stryphnodendron adstringens) and autologous bone marrow mononuclear cells. However,
there are no reports describing the association of these therapies in wounds. The aim of this
study was to determine if the treatment of excisional wounds in rabbits (Oryctolagus
cuniculus) is optimized by barbatiman extract associated with autologous bone marrow
mononuclear cells, and to compare these therapies used alone. Initially, the wounds were
evaluated clinically by the intensity of parameters such as hyperemia, bleeding, discharge,
crusting, epithelialization of the wound area and healing time, plus the histological evaluation,
with observation of polymorphonuclear cells, mononuclear cells, fibroplasia and
angiogenesis, in addition to quantitation of collagen fibers. Then, we evaluated whether the
therapies aided in the study of cell proliferation. This study employed clinical evaluation,
morphometric, histological and histochemical methods in the wounds. We observed that, in
the initial phase of the healing, barbatiman stimulates the production of collagen fibers and
promotes the formation of more exuberant crusts on the wounds and remodeling phase favors
the orientation of collagen fibers, but when combined with autologous bone marrow
mononuclear cells it does not stimulate the wound healing in rabbits.
Keywords:bone marrow, cell proliferation, collagen, phytotherapy, wound healing
CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1.1.Introdução
A pele, o maior órgão do organismo animal tem como principal função atuar
como barreira física contra agentes externos. Quando a integridade dessa barreira é perdida,
formando feridas, o local da injúria atua como porta de entrada para inúmeros agentes
patogênicos, que podem prejudicar o processo cicatricial e, até mesmo, levar o paciente à
morte. Na prática clínica e cirúrgica veterinária, a incidência de feridas é elevada,
dispensando significativos recursos financeiros no tratamento e comprometendo a reparação
tecidual. Outro fator que pode influenciar negativamente o processo cicatricial diz respeito à
condição clínica do paciente, pois a idade avançada, obesidade, desnutrição, diabetes,
localização e extensão da ferida podem retardar ou mesmo impedir que a cicatrização ocorra
adequadamente. Portanto, é fundamental que o restabelecimento da integridade cutânea
ocorra o mais brevemente possível.
Para auxiliar o processo de cicatrização, podem-se utilizar diferentes protocolos,
como: manobras cirúrgicas, administração de medicamentos alopáticos, laserterapia,
oxigenoterapia hiperbárica, terapia celular e fitoterapia. Dentre essas, o emprego do
fitoterápico barbatimão e da terapia com células mononucleares autólogas da medula óssea
(CMMO) apresentaram resultados promissores na reparação tecidual. O barbatimão
(Stryphnodendron adstringens) é tradicionalmente utilizado no tratamento de feridas, sendo a
casca dessa árvore a base para a formulação do fitoterápico. Esse fitoterápico foi empregado
sob diferentes apresentações, como: extratos fluidos, cremes e pomadas. O extrato do
barbatimão apresenta propriedades anti-inflamatória, antimicrobiana, adstringente,
antioxidante e cicatrizante, conferidas pelo seu principal composto terapêutico, conhecido
como tanino. Além disso, ele possui baixo custo e é de fácil aquisição, o que permitiu a sua
popularização.
Fazendo uma retrospectiva sobre os estudos realizados empregando o barbatimão,
verifica-se que na experiência do grupo de pesquisa Técnicas Cirúrgicas, Diagnósticas e
Anestésicas e Seus Impactos na Saúde e Bem-Estar Animal e no Ambiente da Escola de
Veterinária e Zootecnia (EVZ) da Universidade Federal de Goiás (UFG), o barbatimão (S.
adstringens) vem sendo objeto de pesquisa desde o ano de 1996. Na ocasião, resultante da
parceria entre a UFG e a Universidade Federal de Uberlândia (UFU), representada pelo grupo
de pesquisa em Cirurgia Experimental, foi publicado o primeiro artigo científico sobre a ação
do fitoterápico. A partir desse momento, outros trabalhos acerca da ação do barbatimão na
2
reparação tecidual foram desenvolvidos e publicados por essas instituições. Os dados foram
anunciados na forma de resumos em congressos e artigos científicos nacionais e
internacionais, além de servirem como tema de dissertações de mestrado e teses de doutorado.
Dentre os estudos desenvolvidos pelo grupo (envolvendo a reparação tecidual com o
barbatimão), destacam-se os de autoria de Eurides et al.1, Silva et al.
2, Rodrigues et al.
3,
Freitas et al.4 e Silva et al.
5.
No ano de 2010, esses dois grupos de pesquisa, publicaram o livro Manual do
barbatimão. A obra é uma boa referência para a inserção de pesquisadores no tema e
demonstra a importância do uso racional e sustentável dessa planta medicinal, que atualmente
está ameaçada de extinção. O livro fundamentou-se na experiência prática de pesquisadores e
na compilação de vários achados científicos que avaliaram o extrato de barbatimão na prática
em diferentes espécies animais. Dentre as avaliações, incluem o tratamento de feridas de
difícil cicatrização, contaminadas e extensas, diagnosticadas em animais atendidos no
Hospital Veterinário/EVZ/UFG, reforçando a importância do tema para as pesquisas
científicas. Esse conjunto de achados, decorrentes de pesquisas e fruto da experiência prática,
tem motivado estudos cada vez mais complexos, que objetivam esclarecer o mecanismo de
ação desse fitoterápico no processo de reparação tecidual.
Sob outra perspectiva, a terapia com CMMO é uma alternativa promissora no
auxílio à reparação tecidual, por ser descrita como liberadora de citocinas e de fatores de
crescimento necessários à cicatrização. Acrescente-se que sua fração composta por células-
tronco mesenquimais (CTM) possui a capacidade de diferenciação em diversas linhagens de
tecidos e foi empregada com sucesso em ensaios experimentais, pré-clínicos e clínicos.
Motivado pela importância do assunto, no ano de 2009, o mesmo grupo de pesquisa da
EVZ/UFG,em parceria com a UFU, iniciou estudos na área, apresentando projetos ao
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Os estudos foram direcionados para o uso
da terapia celular com CMMO e CTM na reparação tecidual de tendões e de nervos
periféricos, demonstrando o potencial dessas terapias para a Medicina Veterinária. A partir de
então, indagou-se sobre a aplicação da terapia celular em outros tipos de lesões, como nos
dígitos de bovinos e feridas em coelhos, ratos e camundongos, todas vislumbrando contribuir
para o esclarecimento de seus efeitos sobre a cicatrização.
Com base nessas informações, criou-se a hipótese de que a associação dessas
terapias possa favorecer ainda mais o processo de cicatrização de feridas, do que quando
empregadas isoladamente. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do extrato de
3
barbatimão associado àsCMMO sobre o processo de cicatrização de feridas cutâneas
excisionais de coelhos.
Primeiramente, realizou-se a revisão da literatura sobre o fitoterápico barbatimão
e a terapia celular com CMMO para servir de base teórica para o desenvolvimento do estudo
experimental com esses agentes, que representam os Capítulos 1 e 2 deste manuscrito. Na
sequência, realizou-se a descrição do processo de cicatrização de feridas cutâneas excisionais
de coelhos submetidas ao tratamento com CMMO, extrato da casca de barbatimão, com sua
caracterização físico-química, e a associação dessas terapias, por meio de avaliações clínicas,
morfométricas, histológicas e histoquímicas, apresentadas no Capítulo 3. Nas considerações
finais, que correspondem ao Capítulo 4, que apresenta perspectivas da pesquisa, podendo ser
analisadas por aqueles que pretendem desenvolver novos estudos sobre o fitoterápico
barbatimão e a terapia celular com CMMO.
1.2.Considerações gerais sobre a pele
A pele é o órgão que recobre o corpo, e sua principal função é atuar como barreira
física contra o meio externo6,7
. Nos animais, a espessura cutânea varia com a região corporal e
tende a diminuir no sentido dorso ventral do tronco e no sentido proximal-distal dos
membros. Assim, a pele que recobre o dorso do pescoço e da cabeça, fronte, região glútea e
base da cauda é mais espessa. Na região ventral, pavilhões auriculares, regiões axilar,
inguinal, perianal e escroto, a pele apresenta-se mais delgada8. Independentemente da
localização, a pele pode ser dividida em duas camadas: a epiderme e a derme. A epiderme
consiste na camada mais externa, composta por um epitélio estratificado, pavimentoso e
queratinizado que está sempre em renovação. Essa camada possui subcamadas conhecidas
como estratos basal, espinhoso, granuloso, lúcido e córneo7,9
.
O estrato basal é caracterizado por uma única fileira de células dispostas sobre a
membrana basal, que separa a epiderme da derme, onde se localizam os melanócitos, as
células de Merkel, os mecanorreceptores (de sensibilidade tátil e com evidências de atividade
neuroendócrina), e queratinócitos. Os queratinócitos proliferam de forma contínua para suprir
o restante dos estratos superiores. Já o estrato espinhoso possui camadas de queratinócitos
advindos do estrato basal e ligados por pontes intercelulares, que também possui as células de
Langerhans, captadoras e apresentadoras de antígenos, células especializadas de defesa da
pele. O estrato granuloso caracterizado por apresentar camadas de queratinócitos advindos do
estrato espinhoso e que apresentam grânulos de cerato-hialina. No estrato lúcido os
queratinócitos são anucleados e procedentes do estrato granuloso. O estrato córneo é
4
composto de queratinócitos também anucleados procedentes do estrato lúcido que sofrem
descamação gradual e equilibrada com a proliferação de queratinócitos no estrato basal2,8,10
.
A derme é composta de tecido conjuntivo, caracterizado por matriz extracelular de
mucopolissacarídeos, fibras elásticas, colágenas e reticulares entrelaçadas, e elementos
celulares como fibroblastos, histiócitos, mastócitos e células mesenquimais indiferenciadas.
Além disso, na derme também estão presentes os folículos pilosos, glândulas anexas, vasos
sanguíneos e linfáticos, nervos e musculatura lisa, como o músculo eretor do pelo10
.
1.3.Aspectos relacionados à biologia da cicatrização cutânea
A perda da continuidade da pele é definida como ferida cutânea e possui alta
incidência na clínica veterinária de animais de companhia e de produção. Imediatamente após
o trauma,inicia-se o processo de reparo tecidual, que apresenta algumas diferenças
fisiológicas entre as espécies animais, porém, os eventos celulares e bioquímicos envolvidos
são basicamente os mesmos para todos os mamíferos11
. A cicatrização consiste em um
processo fisiológico em resposta a uma lesão, relacionada a uma complexa cascata de reações
bioquímicas distribuídas em quatro fases, que ocorrem de forma dinâmica, interativa e
simultânea: fase hemostática, fase inflamatória, fase proliferativa e fase de remodelação12-14
.
A fase hemostática inicia-se imediatamente após o estabelecimento da lesão
primária na pele, quando ocorre a ruptura de vasos e extravasamento de sangue e linfa. Esse
evento desencadeia descargas adrenérgicas e promove vasoconstrição por contração da
musculatura lisa de vasos. Em seguida, inicia-se a ativação e deposição de plaquetas que
formam o tampão plaquetário,que associado à vasoconstrição impedem temporariamente a
hemorragia. O tampão plaquetário é infiltrado por fibrina e eritrócitos que o tornam mais
firme, resultando no tamponamento mais eficiente dos vasos. A exposição de elementos
sanguíneos à matriz extracelular (MEC) estimula a liberação de fatores de coagulação, como
o fibrinogênio solúvel, que é convertido em uma rede de fibrina insolúvel,iniciando a
formação do coágulo, responsável não só pela hemostasia, mas também no provimento de
uma matriz para a migração celular da fase inflamatória. A ativação das plaquetas também
promove a liberação de fatores quimiotáticos e de crescimento que estimulam a migração de
células de defesa e a reparação tecidual15-18
.
A fase inflamatória inicia-se de forma concomitante à fase hemostática a partir de
agentes quimiotáticos liberados por plaquetas ativadas que promovem a quimiotaxia de
leucócitos e de fibroblastos. Simultaneamente, ocorre a ativação do sistema de complemento
no momento da lesão, e os produtos da sua degradação atraem neutrófilos. Essas células são a
5
primeira linha de defesa celular e estão presentes em grande quantidade na ferida entre o
primeiro e terceiro dia,promovendo a eliminação por fagocitose de corpos estranhos, bactérias
e células mortas. Os neutrófilos também são fonte de mediadores pró-inflamatórios, como o
fator de necrose tumoral α (TFN- α) e interleucinas (IL-1β, IL-6 e IL-8) e estimulam a
produção de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Em seguida, os neutrófilos
sofrem apoptose ou são fagocitados por macrófagos17-19
.
Na fase secundária da inflamação, que ocorre entre 48 a 96 horas, os monócitos
do sangue são atraídos para a ferida. Fatores como o fator de transformação do crecimento β
(TGF-β), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e IL-1, provenientes das células
endoteliais, quimiocinas sintetizadas por neutrófilos e produtos da degradação e proteínas
inflamatórias da matriz extracelular (MEC) servem como fatores quimiotáticos para essas
células. No sítio da lesão, os monócitos se diferenciam em macrófagosque, quando ativados,
são responsáveis pela eliminação por fagocitose do restante de neutrófilos apoptóticos,
atuando também como células apresentadoras de antígeno, liberando proteases que degradam
a MEC desvitalizada e estimulam a fase proliferativa após a inflamação, mediadas por
quimiocinas e fatores de crescimento16,19,20
.
Dentre os fatores de crescimento sintetizados pelos macrófagos, destacam-se: o
fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que estimulaa angiogênese; o fator de
crescimento de fibroblastos (FGF), que estimula a fibroplasia e a formação do tecido
cicatricial; e o fator de crescimento epidermal (EGF), estimulador da reepitelização. Além
disso, os macrófagos ativados também produzem as quimiocinas IL-1 e o TFNα, importantes
para a migração de fibroblastos e de mais macrófagos16,19,20
. Mediadores quimiotáticos
liberados por plaquetas, macrófagos, mastócitos e neutrófilos, durante a fase inflamatória,
estimulam a vasodilatação, que promove o surgimento dos sinais clínicos da inflamação como
dor, rubor, calor e edema17
.
A fase proliferativa inicia-se normalmente após quatro dias da injúria tecidual e
caracteriza-se pelo aumento quantitativo de fibroblastos e neovasos, principais componentes
do tecido de granulação, e pelo processo de reepitelização de forma mais expressiva. Os
fatores de crescimento e as quimiocinas liberadas por macrófagos são os principais
estimulantes para a migração e proliferação de fibroblastos da zona periférica da ferida para o
centro da lesão. Esse processo também ocorre com células endoteliais para o desenvolvimento
da neovascularização. Além de fatores de crescimento, baixas taxas de oxigênio,
principalmente no centro da ferida, estimulam o processo de angiogênese. Os fibroblastos
ativados na ferida iniciam a produção e deposição de colágeno e a produção de fator de
6
crescimento de queratinócitos (KGF) que estimula a migração, proliferação e diferenciação de
células epidermais para o processo de reepitelização. O processo de angiogênese ocorre de
forma concomitante, utilizando a matriz colágena como base. Com isso, desenveolve-se o
aspecto granular e avermelhado do tecido de granulação que nada mais é que um tecido de
preenchimento da zona lesionada. Quando a quantidade de colágeno se torna muito
abundante, no sítio da lesão, os fibroblastos interrompem sua produção e sofrem apoptose,
que resulta em uma matriz cicatricial acelular. De forma similar, os neovasos também sofrem
apoptose nesta matriz rica em colágeno, caracterizando a fase de remodelação6,15,18
.
A quarta fase da cicatrização (remodelação) caracteriza-se pela produção e
degradação ordenada de fibras colágenas, estabelecidas pela ativação e inibição de proteases.
Isso ocorre para realizar a orientação e deposição satisfatória das fibras colágenas, podendo
durar de dias a anos. As fibras colágenas sofrem degradação enzimática principalmente por
metaloproteinases, e são ressintetizadas e reposicionadas inúmeras vezes sob estímulo dos
fibroblastos pelo TGF-β, conforme o posicionamento das fibras do tecido conjuntivo íntegro
adjacente. Essas repetições resultam no desenvolvimento de um tecido cicatricial mais regular
e de maior resistência. Ao final dessa etapa, a cicatriz se apresenta mais pálida, pois os
melanócitos apresentam capacidade regenerativa deficiente, além de esse tecido ser avascular
normalmente e desprovido de folículos pilosos, porém, o colágeno confere resistência tênsil
satisfatória a essa cicatriz15,21
.
1.4.Tratamento de feridas
Vários protocolos terapêuticos podem otimizar a cicatrização, como o
desbridamento cirúrgico ou químico, síntese, administração de medicamentos alopáticos,
implante de enxertos ou biomateriais, oxigenoterapia hiperbárica, terapia celular22,23
e a
fitoterapia 24,25
. A escolha de um tratamento irá depender da condição clínica do paciente, do
tipo de ferida e do custo financeiro. Independentemente do tratamento escolhido, o protocolo
terapêutico inicial deve adotar os seguintes princípios: controlar infecções, remover áreas
desvitalizadase evitar danos adicionais26
. A adoção de modalidades terapêuticas de feridas
visa complementar a reparação tecidual por estimular ou favorecer o desenvolvimento da
cicatrização27,28
.
Na abordagem primária de uma ferida, a lavagem empregando grande quantidade
de fluidos é o procedimento mais importante para conduzir àcicatrização adequada, pois
permite a reidratação de tecidos desvitalizados, reduz a contaminação bacteriana e remove
corpos estranhos, toxinas, citocinas e debris associados a bactérias26
. Primeiramente,
7
preconiza-se a realização da tricotomia para facilitar o procedimento29
. Os fluidos
empregados devem ser estéreis, isotônicos e não citotóxico, sendo a solução cristaloide de
ringer com lactato e a de NaCl a 0,9% as mais empregadas para a realização desse
procedimento14,26,30
.
Após a lavagem da ferida, deve-se inspecioná-la para a detecção de debris, avaliar
a contaminação e tecido necrótico. Com o objetivo de evitar a contaminação e favorecer a
cicatrização, esse material deve ser removido por meio do desbridamento cirúrgico ou não
cirúrgico26,29,31,32
. No desbridamento cirúrgico, considerada a técnica padrão, realiza-se a
excisão dos tecidos inviáveis ou desvitalizados, com bisturi, até alcançar tecidos viáveis.
Atenção deve ser dada aos pacientes com hipotensão e hipotermia periférica, visto que a
hemorragia, um dos principais indicadores de viabilidade tecidual, poderá estar ausente nessas
situações. No caso do desbridamento não cirúrgico, utilizam-se curativos aderentes na lesão
para removerem material necrótico, porém, em menor escala, quando comparado ao cirúrgico.
Outras soluções também podem ser empregadas para promover essa ação como hidrocoloide,
mel, açúcar, papaína, entre outros26,29
.
As medicações tópicas devem ser empregadas com cautela, visto que muitos
produtos ditos cicatrizantes ou quando utilizados em quantidades excessivas podem
desfavorecer o processo de reparação tecidual, por apresentarem citotoxicidade26,28
. O uso de
antissépticos ainda é comumente empregado no tratamento de feridas. No caso de feridas
limpas não contaminadas essa prática não apresenta benefícios à cicatrização, visto que esses
produtos podem até inibir a cicatrização devido à sua citotoxicidade26,28,29
. O uso de
antibióticos tópicos está contraindicado para o tratamento de infecção, visto que os níveis
terapêuticos não são mantidos, pois o medicamento será diluído pelo exsudato da ferida. Além
disso, existe a possibilidade do desenvolvimento de microrganismos resistentes33
. Dessa
forma, a infecção é melhor controlada por meio da lavagem e do desbridamento31
.
O curativo é o recurso que recobre a ferida objetivando protegê-la contra
agressões externas. Existe uma imensa variedade de produtos disponíveis no mercado, desde
gazes a membranas biologicamente ativas28
. Idealmente, os curativos devem possuir as
seguintes características: não ser tóxico, irritante ou alergênico; ser absorvente, estéril e de
baixo custo; permitir trocas gasosas; fornecer isolamento térmico; e manter o ambiente
úmido26,27
. Um tipo de curativo primário, que permite a troca de oxigênio, a perda controlada
de vapores e a proteção contra abrasões são as membranas adesivas semipermeáveis,
constituídas por material confortável e fino que adere às bordas da ferida22,26
. No entanto,
essas membranas são contraindicadas em feridas com alto nível de exsudação, visto que a
8
elevada umidade desfavorece a aderência desse material. Outra característica desfavorável é
seu custo relativamente elevado. As principais membranas disponíveis no mercado são as
compostas por poliuretano28
.
a)Fitoterápicos
A utilização de plantas com finalidades terapêuticas é defendida desde os
primórdios da humanidade34
. Inúmeras plantas e seus extratos possuem imenso potencial para
o tratamento de feridas24
. Dentre essas, uma planta de grande interesse para a Medicina
Veterinária, envolvendo a cicatrização é o barbatimão (S. adstringens)1,2,35,36
. A casca do
tronco é a principal matéria-prima para a formulação dos produtos terapêuticos37
. Os efeitos
medicinais do barbatimão são atribuídos ao elevado teor de taninos em sua composição
química, podendo alcançar níveis de 20% a 50%35
. Já a Farmacopeia Brasileira38
descreve que
a quantidade mínima de taninos para sua utilização medicinal é de 8%. Esses níveis podem
variar de acordo com a espécie, localização geográfica, período sazonal de colheita e parte da
planta39-43
.
No processo cicatricial de feridas cutâneas, os taninos têm a capacidade de formar
pontes de hidrogênio ou ligações hidrofóbicas com proteínas, polissacarídeos ou ambos, que
resultam na formação do complexo tanino-proteína ou tanino-polissacarídeo. Como essa
ligação é insolúvel em água, ocorrerá a formação de uma camada protetora (crosta) sobre a
lesão e, abaixo dessa camada, ocorrerá naturalmente o processo de cicatrização. Além desse
efeito, a precipitação de proteínas também favorece a hemostasia após a injúria35,42
. Os
taninos condensados facilitam a reepitelização da ferida por estimularem a proliferação de
queratinócitos circundantes da região lesionada42
. O processo cicatricial pode ser favorecido
secundariamente pelo efeito antimicrobiano dos taninos35,42
. O barbatimão também apresenta
ação anti-inflamatória por inibir a formação de mediadores químicos da inflamação, como a
histamina, bradicinina e prostaglandina35
, além de promover a redução da permeabilidade
vascular por vasoconstrição43
.
b)Terapia celular
O conhecimento científico acumulado e a inovação das técnicas nas áreas de
biologia celular, biotecnologia e médica resultaram na concepção de terapias promissoras para
a prevenção e tratamento de inúmeras enfermidades. Os produtos medicinais de terapia
avançada refletem uma classe complexa e inovadora de produtos biofarmacêuticos,
9
representados pela terapia gênica, terapia com células somáticas e produtos de engenharia de
tecidos44
.
A engenharia de tecidos consiste na área médica que emprega células ou tecidos
para a reparação, substituição ou regeneração, mas, em uma das seguintes condições: as
células ou tecidos foram substancialmente manipulados, resultando na alteração de suas
característicasbiológicas,funções fisiológicas oupropriedades estruturaispara alcançar
regeneração, reparação ou substituição orgânica desejada; as células ou tecidos não se
destinam à mesma função ou funções orgânicasem um mesmo sítio de aplicação45
. Dentre os
diversos tipos celulares empregados nos mais variados tratamentos, as células mononucleares
da medula óssea (CMMO) foram empregadas em vários estudos para promover a reparação
tecidual nos sistemas cardiovascular46,47
, nervoso48-50
, tegumentar51-53
, entre outros54-57
.
O termo CMMO é utilizado para denominar coletivamente as células presentes na
medula óssea com núcleos unilobulados ou arredondados e sem grânulos no citoplasma. Essas
características conferem às CMMO uma densidade e dimensões semelhantes, que as diferem
das células mieloides e progenitoras de células vermelhas, permitindo a sua fácil separação
das células mieloides por meios físicos. As CMMO podem ser divididas em duas frações: a
hematopoiética e a não-hematopoiética. A fração hematopoiética corresponde às progenitoras
dos elementos sanguíneos em diferentes estágios de maturação, incluindo linfócitos,
monócitos e macrófagos45
. Na fração não-hematopoiética existem células que apresentam
características fenotípicas e de funcionalidade de células-tronco multipotentes60
, uma pequena
quantidade de células-tronco pluripotentes59
, hemangioblastos60
, células progenitoras
endoteliais61
e células-tronco precursoras59
.
Propriedades das CMMO na reparação tecidual
Uma das propriedades das CMMO na reparação tecidual é a secreção de fatores
de crescimento62
, como fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), o fator de
crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento de queratinócitos (KGF). O
bFGF apresenta potencial mitogênico e quimiotático para fibroblastos e células endotelias,
possuindo dessa forma elevado efeito angiogênico61,63
, fundamental para a ocorrência da
cicatrização51
, além proporcionar o aumento da resistência da cicatriz63
. O VEGF também é
descrito como potente fator angiogênico64
e também exacerba a permeabilidade vascular65
,
que resulta na migração de células necessárias à reparação tecidual18
. Na cicatrização, o KGF
estimula a migração, proliferação e diferenciação de células epidermais18
.
10
Outra propriedade benéfica conferida às CMMO na reparação tecidual é o
potencial de diferenciação celular das células-tronco mesequimais (CTM) em diversas
linhagens celulares e teciduais, por exemplo, o epitélio hepático, pulmonar, gastrointestinal e
tegumentar66-68
. Porém, a quantidade de CTM é em torno de 0,0001-0,001% da fração de
CMMO, sendo considerada pequena69
. Em todas as fases da cicatrização as CTM
desempenham papel fundamental. Inicialmente, coordenam os efeitos de células
inflamatórias, inibem a ação de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF e interferon (IFN),
estimulam a fagocitose e favorecem a transição da fase inflamatória para a fase proliferativa,
pela liberação de VEGF, bFGF70
e KGF71
. Na fase de remodelação, influenciam na
composição da matriz extracelular71
.
Dentre os elementos que as CTM podem se diferenciar e favorecer a cicatrização
destacam-se os miofibroblastos, que participam ativamente do processo de granulação72
e
contração da ferida73
. Outro aspecto importante, conferido às CTMdiferenciadas em
fibroblastos, é que quando comparados aos fibroblastos nativos da pele, os originários de
CTM apresentam maior potencial na cicatrização por sintetizar maior quantidade de colágeno
e liberação de VEGF e bFGF70
.
Colheita, isolamento e aplicação de CMMO
A técnica de colheita e isolamento de CMMO é descrita como simples, e quando
comparada ao uso da fração de CTM,possui a vantagem de não necessitar ser submetida à
expansão da cultura, o que requer tempo, maior recurso financeiro53
, alémda predisposição à
contaminação da cultura74
. É imprescindível que toda a colheita de medula óssea seja
realizada em ambiente cirúrgico, seguindo os padrões de assepsia e antissepsia. No caso da
colheita de grandes volumes, propõe-se a transfusão sanguínea, em decorrência da redução
dos níveis de hemoglobina75
. Em coelhos, para a colheita de CMMO pode ser empregado o
protocolo descrito por Oliveira e colaboradores76
,adaptado de Böyum77
, que apresenta
rendimento celular médio superior a 6x106 CMMO/mL (±4,18) e viabilidade superior a 90%
(±4,35).
As vias de administração para a terapia celular dependem do órgão alvo, como a
tópica78
, a subcutânea51,52
, a intramuscular54
, a intra-arterial48
e a intravenosa49,50,56,72,79
. Com
relação à cicatrização de feridas, tanto CMMO ou CTM foram empregadas por via tópica, por
meio da instilação das células sobre seu leito, colocando-se um adesivo semipermeável para a
proteção contra sujidades e manutenção das células no sítio de lesão64,78
. Outros estudos
relatam o emprego de scaffolds como substrato para as células empregadas na reparação
11
tecidual53,67,80
. É importante ressaltar que, independentemente da via, os cuidados básicos com
assepsia e antissepsia devem ser rigorosamente seguidos, pois essas células não sobrevivem
em ambientes contaminados74
.
1.5.Parâmetros de avaliação da cicatrização de feridas
1.5.1. Avaliação clínica de feridas cutâneas
A avaliação clínica é um método subjetivo e qualitativo, que consiste na
observação direta e na descrição da aparência da lesão. Utilizam-se parâmetros para guiar o
avaliador na descrição, como a presença ou ausência de hemorragia, coágulos, hiperemia,
edema, exsudato, crosta, necrose, tecido de granulação e reepitelização81-83
. A avaliação
morfométrica por planimetria digital é um método quantitativo efetivo, realizado por meio da
aquisição de imagem da ferida no decorrer dos dias de avaliação, a uma distância
padronizada, empregando uma régua para servir de escala e com a vantagem de esse objeto
não necessitar entrar em contato com a ferida. Em seguida, a imagem é analisada em um
programa de computador, para a mensuração da área da ferida84,85
.
1.5.2. Indicadores microscópicos do processo de inflamação e reparo tecidual
A histopatologia consiste no estudo do comportamento tissular diante de alguma
lesão. Para isso, se utilizam principalmente corantes que estabelecem afinidades químicas por
tecidos e substâncias produzidas, em resposta a algum agente lesivo ou alteração celular86
. A
técnica de coloração histológica de hematoxilina e eosina (HE) é o método primário para a
avaliação e descrição morfológica e interpretação fisiopatológica do processo de cicatrização
de feridas87
, que permite avaliar e descrever tipos celulares e tissulares, respostas a diferentes
tratamentos e identificar as diferentes fases do processo de cicatrização, correlacionando-as
com tratamentos estipulados85,88
.
A quantificação da deposição colágena, pela mensuração da área ocupada por
fibras colágenas na zona de ferida, é uma técnica de interesse no estudo da cicatrização. Para
essa análise podem-se utilizar técnicas de coloração como o tricrômio de Masson88
e o
picrosirius89,90
. A técnica de coloração picrosirius é uma técnica de alta especificidade,
simples e reprodutível. Por sua alta sensibilidade, é possível captar fibras de colágeno
imaturo, além de possibilitar que o colágeno apareça com aspecto brilhante, em fundo escuro
sob a luz polarizada, impedindo qualquer possibilidade de conflito com outros elementos
presentes no tecido91
. Por meio da utilização de programas de análise de imagem, é possível a
12
mensuração da porcentagem da área ocupada por fibras colágenas em fotomicrografias
capturadas sob luz polarizada da zona da lesão92
.
Outra possibilidade de avaliação da cicatrização diz respeito ao indicador de
proliferação celular. As regiões organizadoras de nucléolo (NORs) são segmentos de DNA
responsáveis pela síntese de RNA ribossômico (RNAr) no núcleo da célula. Associado às
NORs, existe um grupo de proteínas denominadas argirofílicas, que possuem alta afinidade
com a prata. Com base nessas informações, desenvolveu-se o método de coloração
histoquímica denominada técnica de AgNOR. Por meio de uma solução de prata coloidal,
realiza-se a marcação das proteínas argirofílicas associadas às NORs (proteínas AgNOR),
tornando essas estruturas visíveis, mensuráveis e quantificáveis sob a microscopia de luz93
.
As proteínas AgNOR estão diretamente relacionadas com a proliferação celular,
especialmente durante a interfase (G1, S, G2) do ciclo celular, pois o número de proteínas
AgNOR está estritamente relacionado a síntese de RNAr. Portanto, quanto maior a síntese,
maior o número de AgNOR e mais acelerado é o processo de proliferação celular. Em células
normais, os pontos argirofílicos intranucleares visualizados aparecem de forma redonda, de
tamanho regular e como pontos escurecidos no núcleo celular94-96
. Os métodos de avaliação
da proliferação celular pela técnica de AgNOR consistem na contagem dos grupamentos de
proteínas AgNOR93,94,95,97
.
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CAPÍTULO 2 - O EXTRATO DA CASCA DE BARBATIMÃO, Stryphnodendron
adstringens (Martius) Coville, NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM
ANIMAIS
O EXTRATO DA CASCA DE BARBATIMÃO, Stryphnodendronadstringens (Martius) Coville, NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EMANIMAIS
Danilo Ferreira Rodrigues1*
, Fernanda Figueiredo Mendes1, Antônio DionísioFeitosa Noronha Filho
1,
Jéssica Alves da Silva2, Luiz Antônio Franco daSilva
3
1Doutorando(a) do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escolade Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Brasil(*Email:
[email protected]). 2Graduanda em Medicina Veterinária da Escola de Veterinária e Zootecniada Universidade
Federal de Goiás, Goiânia,Brasil. 3Professor Doutor da Escola de Veterinária e Zootecniada Universidade
Federal de Goiás, Goiânia,Brasil. Recebido em: 06/05/2013 – Aprovado em: 17/06/2013 – Publicado em:01/07/2013
RESUMO Ultimamente,empresas,pesquisadoresdediferentesáreasdoconhecimentoea população em geral têm demonstrado um crescente interesse no usode fitoterápicoscomoalternativaparaotratamentodediversasafecções.Estefato ocorre principalmente pelo menor custo e a possibilidade de menoresefeitos adversos dos fitoterápicos em comparação aos medicamentos alopáticos.Uma planta de grande interesse para a Medicina Veterinária, por suaspropriedades terapêuticascomdestaqueaoseupotencialcicatrizanteemferidascutâneas,éo barbatimão Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville. O presenteestudo objetivou realizar uma revisão da literatura sobre o emprego do extrato da cascado barbatimão, Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville, na cicatrizaçãode feridascutâneasemanimais.Aatividadecicatrizantedestefitoterápicoéconferida aos elevados níveis de taninos presentes na casca da árvore, matéria primautilizada naproduçãodoextrato.Apesardaexistênciadeváriosestudossobreoassunto, muitosdelesaindasãoconduzidoscompoucorigorcientífico,especialmentepor não caracterizarem adequadamente a substância utilizada. Portanto,recomenda-se nãoapenasprocederàcaracterizaçãodosconstituintesdoextratodobarbatimão, mas conduzir os estudos de maneira mais criteriosa, buscando estabeleceros mecanismosdeaçãoconsistentesparaavalidaçãodopotencialcicatrizantedeste fitoterápico. PALAVRAS-CHAVE:Fitoterapia, lesões de pele, Medicina Veterinária,plantas medicinais,taninos
THE BARK EXTRACT OF Stryphnodendron adstringens (MARTIUS)COVILLE IN SKIN
WOUND HEALING INANIMALS
ABSTRACT
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Thepresentstudyaimedtoreviewtheliteratureabouttheuseofthebarkextractof
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barbatimão, Stryphnodendron adstringens (Martius) Coville, on cutaneouswound healinginanimals.Currently,companiesandresearchersfromdifferentkindsof studies,andthegeneralpopulationhaveshownagrowinginterestintheuseof herbal medicine as an alternative for the treatment of various disorders. Thisoccurs mainly because of the lower cost and the possibility of minor adverse effectsof herbal medicines compared to allopathic medicine. A plant of great interestfor Veterinary Medicine, because of their therapeutic properties, especially theirpotential in healing skin wounds, is barbatimão. The wound healing activity of this herbal medicineisgiventohighlevelsoftanninsinthebark,therawmaterialusedto produce the extract. Despite of the existence of several studies on the subject,many of them still are conducted with little scientific accuracy, especially because of thenot adequately characterize the substance used. Therefore, it is recommended notonly tocharacterizetheconstituentsofthebarbatimãoextract,butconductstudieswith more discerning and accuracy, to establish the real mechanisms to validatethe therapeutic potential of this herbal in woundhealing. KEYWORDS:Herbal medicine,phytotherapy, skin lesions, tannins, VeterinaryMedicine
INTRODUÇÃO
Desde os primórdios da humanidade tem-se o conhecimento dautilização de plantas com finalidades terapêuticas (MACIEL et al., 2002). Apesarda importância dos fitoterápicos, o fato de sua utilização ser geralmente deforma empírica e as preparações, muitas vezes, não seguirem padrões rígidos decontrole de qualidade, alguns protocolos terapêuticos envolvendo plantas medicinaispodem resultar em efeitos adversos ao paciente (TUROLLA & NASCIMENTO,2006).
No entanto, independente dessas implicações, inúmeras plantascom poder medicinal são empregadas no tratamento de diferentes enfermidades.Dentre as plantas de interesse na Medicina Veterinária, o barbatimão ocupa posiçãode destaqueporsuaspropriedadesterapêuticas,comooefeitocicatrizantedeferidas cutâneas.Acascadessaárvoreéaprincipalmatéria-primaparaaformulaçãodo fitoterápicoeomedicamentojáfoiempregadoemváriosestudosnaapresentação farmacológica de extratos fluídos (EURIDES et al., 1996; SILVA et al.,2009; BARROSOetal.,2010),cremes(COELHOetal.,2010;LIMA,2010)epomadas (HERNANDES et al.,2010).
O barbatimão é representado por cinco espécies comdistribuição geográfica em todas as regiões do país, principalmente no Bioma doCerrado: Stryphnodendron adstringens, S. obovatum, S. polyphyllum, S. coriaceum eS. rotundifolium (OCCHIONI, 1990). Apenas a espécie S. adstringens (Martius)Coville é denominada de barbatimão verdadeiro, embora todas estas espéciessejam empregadas como fitoterápicos. Além de atuar como coadjuvante noprocesso cicatricial, o barbatimão também possui outras propriedades medicinais,como agente hemostático, anti-inflamatório (MELLO, 1997), antidiarreico,adstringente (BRANDÃO et al., 2008), antimicrobiano (BARDAL et al., 2011),estrogênico (GARCIA et al., 2010) e antiofídico (LUCENA et al.,2009).
Esse estudo objetivou descrever os aspectos gerais sobre obarbatimão verdadeiro, S. adstringens (Martius) Coville, com ênfase em seupotencial terapêutico na cicatrização de feridas cutâneas emanimais.
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CONSIDERAÇÕES GERAIS ACERCA DEFITOTERÁPICOS
O termo fitoterápico é definido como o produto obtido de umaplanta medicinal, ou de seus derivados, a exceção de substâncias isoladas, comfinalidade profilática, terapêutica ou paliativa (BRASIL, 2011). Apesar dos avanços damedicina modernanomundo,aOrganizaçãoMundialdaSaúdereconhecequeamaioriada populaçãodepaísesemdesenvolvimentodependedamedicinatradicional,jáque 80% desta população desenvolve práticas tradicionais em seus cuidados básicosna saúde,sendo85%dessaspráticasrepresentadaspelousodeplantasmedicinais (CARVALHO et al.,2007).
Devido ao fato de o Brasil ser detentor de uma vasta biodiversidadetanto faunística como florística, além de uma grande variedade étnica e cultural,a população brasileira, principalmente a residente em zonas rurais, utilizacomumente o seu conhecimento empírico acerca do potencial terapêutico de plantasmedicinais (CARVALHOetal.,2007;SILVAetal.,2010;CORRÊAetal.,2012).Ressalte-se que muitas vezes, o emprego das plantas é o único recurso terapêuticode comunidades tradicionais e grupos étnicos (SILVA et al., 2010). Entretanto,a eficiência da maioria dos tratamentos empregando fitoterápicos nãopossui comprovação científica, situação esta que pode colocar em risco a saúdeda população (CARVALHO et al., 2007; KLEIN et al.,2009).
Mesmo assim, o segmento industrial de fitoterápicos brasileirofaturou R$1.840.228.655,00 no período de novembro de 2003 a outubro de 2006(BRASIL, 2007).Muitaspesquisasqueenvolvemplantasmedicinaissãodesenvolvidasem decorrência de informações terapêuticas obtidas do conhecimento damedicina popular (MELLO, 1997). O estudo dos fitoterápicos é extremamente complexo,pois como existe uma grande variedade de plantas ditas com propriedadesterapêuticas, muito ainda se tem a descobrir sobre os seus princípios ativos, como asua determinação,oseuisolamento,seumecanismodeaçãoeseusefeitoscolaterais (MACIEL et al.,2002).
Portanto, a padronização da fabricação de produtos fitoterápicosé essencial para a garantia da qualidade e segurança ao paciente (KLEIN et al.,2009). Sobre esse assunto é importante ressaltar que a regulamentação deprodutos fitoterápicos para o uso humano é realizada pela ANVISA. Esse órgão avaliaos aspectos relacionados a qualidade, segurança e eficácia dos produtos(CARVALHO et al., 2007). Quanto a regulamentação de produtos fitoterápicos de usoveterinário nãoexisteumanormativaespecífica.Destaforma,oprodutodeveráserregistrado junto ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) deforma similar a um medicamento alopático (BRASIL,2009).
CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OBARBATIMÃO
O barbatimão (S. adstringens) pertence a família Leguminosae eestá presenteprincipalmentenoBiomadoCerradobrasileiro(OCCHIONI,1990).Esta árvore pode atingir de quatro a seis metros de altura quando adulta e o diâmetrodo troncovariaentre20a30cm(Figura1A).Aárvoreédecíduaeexigeintensaluz solar para sobreviver, suas folhas são bipinadas, com seis a oito folíoloscompostos (EURIDESetal.,2010)efoliólulosdetamanhoentre30a60mm,comamesma coloraçãoemambasasfaces(Figura2B).Nãopossuemtricomas,estruturasque atuam contra a perda de água decorrente do excesso de transpiração nas folhas.A
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peridermedaárvoreécompostaporumacascagrossaerugosa,comcoloração externa parda esverdeada e superfície interna pardo-avermelhada (SANCHES etal., 2007). É uma espécie perene e hermafrodita, que floresce de outubro a fevereiroe apresenta flores de coloração avermelhadas que são polinizadas por pequenos insetos, principalmente abelhas. Os frutos correspondem a vagens sésseise grossas, com tamanho médio de 10 cm produzido entre os meses de outubroa março (Figura 1C) (EURIDES et al.,2010).
Na medicina popular, o barbatimão, principalmente na forma de extratoda casca(Figura1D)éutilizadoparaotratamentodeleucorreia,diarreia,hemorragia, hemorroida, feridas, conjuntivite, inflamação da garganta, corrimento vaginal eúlcera gástrica (SILVA et al., 2010). Além do uso medicinal, esta espécie tambémé empregada no curtimento da pele, na fabricação de tintas, na indústria madeireirae comoplantaornamental(LIMAetal.,2010).Noentanto,entreosprincipaisefeitos medicinais atribuídos a esse fitoterápico destacam-se a sua propriedadecicatrizante (EURIDES et al., 1996; SILVA et al., 2009; HERNANDES et al., 2010; LIMA,2010),antimicrobiana(AUDIetal.,2004;COSTAetal.,2011),antiofídica(LUCENAetal., 2009; DE PAULA et al., 2010) e antioxidante (SOUZA et al.,2007).
FIGURA 1 - Aspectos gerais do barbatimão (Stryphnodendron adstringens): A)
Árvore;B) Folha composta por folíolos e foliólulos (seta); C) Vagens (seta); D) Exemplode um dos extratos da casca de barbatimão (Extrato glicólico) (Animalle- Farmácia de Manipulação Veterinária,Goiânia-Goiás).
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Oempregodepartesdaárvoredebarbatimãocomofolhas,cascase raízesparaaformulaçãodeextratosébastanteconhecidonamedicinapopular (SILVA et al., 2010). A casca do tronco é a principal matéria-prima parao desenvolvimento de produtos medicinais, porém a sua extração deforma desordenada, estimulada em grande parte por indústrias farmacêuticas, temlevado aoesgotamentodesterecurso,fatoragravadopeladegradaçãodomeioambiente, colocando esta espécie em risco de extinção. Como a colheita da casca do troncoé conduzida de forma prejudicial ao barbatimão, a árvore torna-se sensível a açãode microrganismos, insetos, clima e ao fogo. Além disso, a remoção da casca daárvore interferenalongevidadedoespécime,poisacascapossuitecidoscondutoresde seiva elaborada (GUEDES, 1993; BORGES FILHO & FELFELI,2003). COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO EXTRATO DA CASCA DEBARBATIMÃO
As árvores de barbatimão produzem metabólitos químicosprimários, responsáveis pela manutenção das funções orgânicas do vegetal emetabólitos secundários, que conferem proteção à planta contra herbívoros, microrganismose efeitos externos do ambiente. Dentre os metabólicos químicossecundários encontrados no barbatimão, citam-se os alcaloides, terpenos, estilibenos,esteroides, saponinas,inibidoresdeproteasesetaninos.Ostaninossãocompostosfenólicos solúveis em água e precipitadores de proteínas (SILVA & SILVA, 1999; LIMA etal., 2010). De acordo com a quantidade de taninos, o vegetal poderá adquirirodor desagradável, sabor adstringente, provocar intoxicações e promoverefeitos antinutricionais em predadores. Neste último, devido à ligação dos taninoscom proteínas, tornando-as insolúveis e indigestas (BATESTIN et al.,2004).
Os efeitos medicinais do barbatimão são atribuídos ao elevado teorde taninos em sua composição química, podendo atingir níveis de 20% a 50% (LIMAet al.,2010).AFarmacopeiaBrasileiradescrevequeaquantidademínimadetaninos para utilização medicinal é de 8% (BRASIL, 2010). Entretanto, estes níveisde taninospodemvariardeacordocomaespécie,localizaçãogeográficaeparteda planta empregada (BATTESTIN et al., 2004; MONTEIRO et al., 2005; LOPES etal., 2009). Os taninos possuem alto peso molecular, entre 500 e 3000 dáltons egrupos de hidroxila-fenólicos que promovem a formação de ligações cruzadascom proteínas. Quando estes compostos apresentam-se na forma não oxidada,ligam-se a proteínas por meio de pontes de hidrogênio ou ligações hidrofóbicas. Já ostaninos oxidados se transformam em quinonas e formam ligações covalentescom determinados grupos de proteínas, principalmente os grupos sulfídricos (LIMA etal., 2010).
Os taninos podem ser classificados em dois grandes grupos,taninos hidrolisáveisetaninoscondensados,tambémdenominadosdeproantocianidinas. Os taninos hidrolisáveis são constituídos por uma mistura de fenóissimples, galotaninos e elagitaninos, que após a hidrólise formam o ácido gálico eácido elágico, que possuem atividade anti-inflamatória e antioxidante. Ostaninos hidrolisáveissãoformadosporumnúcleodehidratodecarbono,geralmenteoD- glucose,cujogrupohidroxilapodeapresentarligaçõescomgruposéster,comoo ácido gálico (galotaninos) e grupos fenólicos, como ohexadihidroxifênico (elagitaninos) (BATTESTIN et al., 2004; LIMA et al.,2010).
Os taninos condensados são constituídos por unidades deflavonol: flavan-3-ols (catequina) ou flavan 3,4-diols (leucoantocianidinas). Este grupofenólicopodeconterdeduasa50unidadesflavonoidesepossuiestruturaçãocomplex
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a, com resistência a hidrólise, porém podem ser solúveis em solventesorgânicos aquosos de acordo com a estrutura química. A propriedade terapêuticado barbatimão na cicatrização é atribuída principalmente a este grupo de taninos(LIMA et al., 2010).
O BARBATIMÃO COMO AUXILIAR NO PROCESSO CICATRICIAL DEFERIDAS
FORMULAÇÕES FITOTERÁPICAS A BASE DO EXTRATO DA CASCADE BARBATIMÃO PARA ACICATRIZAÇÃO
A Farmacopeia Brasileira descreve um conjunto de análises padrõespara
assegurar a qualidade do extrato da casca de barbatimão. Asinformações estabelecemqueaquantidademínimadetaninostotaisdascascas,queserão matéria-primadoextratodeveserde8%,dosquais0,2mg/gdevemequivalerao ácido gálico e 0,3 mg/g de galocatequina, um dos monômeros dostaninos condensados.Paraaidentificaçãodapresençadetaninostotais,hidrolisáveise condensados, deve-se proceder a cromatografia líquida em camada delgada.Além desta análise também devem ser realizados ensaios de pureza doextrato pulverizado, obedecendo os seguintes limites: material estranho em até 2%;cinzas totais no máximo de 2%; água em até 14%;e cinzas sulfatadas limite máximo de3% (BRASIL,2010).
Adeterminaçãodaquantidadedetaninosefenóistotais,ácidogálicoe galocatecna é realizada por meio da cromatografia a líquido de altaeficiência (HPLC)(LOPESetal.,2009;BRASIL,2010).Outrométodoquetambémpodeser utilizado para a determinação de taninos condensados e seus constituintes éa espectometriademassa(ISHIDAetal.,2006;ISHIDAetal.,2009).Emensaiosin vitro, principalmente relacionados à atividade antimicrobiana do extrato da cascado barbatimão, a quantificação dos taninos totais são testes básicos paradeterminação de suas propriedades, como os estudos realizados por ISHIDA et al. (2006),ISHIDA et al. (2009) e BARDAL(2011).
A maioria dos estudos sobre cicatrização envolvendo obarbatimão utilizaram o fitoterápico na forma de extrato aquoso ou glicólico (SILVA et al.,2009; MOURA,2011),pomadas(MINATELetal.,2010)ecremesabasedoextratoseco (LIMA,2010).Paraapreparaçãodofitoterápicoacolheitadascascas(periderme) deve ser realizada em espécimes adultos e de preferência nas regiões mais altasda árvore, preservando o tronco principal, para melhor conservação daespécie (BORGES FILHO & FELFELI, 2003). Utiliza-se um objeto cortante para extraira casca da árvore, devendo a profundidade do corte ser suficiente para atingir olenho, região correspondente à madeira (COELHO et al.,2010).
Para fabricação do extrato aquoso, o processo de extraçãodos compostosbiologicamenteativosdacascadobarbatimãoinicia-sepelasecagem dascascasemtemperaturaambiente(LIMA,2010).Afabricaçãomaissimplesdo extratoaquosopodeserdesenvolvidapeladecocçãode20gdascascasem150 mL de água filtrada durante 50 minutos e, posterior filtração (EURIDES et al.,1996; COELHO et al., 2010). Em um processo mais elaborado, as cascas debarbatimão, previamente secas a temperatura ambiente, devem ser submetidas àdesidratação completaemestufaa70ºCpor24horasenasequênciaprocessadasemmoinho elétrico. Em seguida, 30 g do pó resultante devem ser homogeneizados em 900mLdeáguadestiladaemumbéquereposteriormenterealizadaadecocçãoporduas horas a 70 ºC (LIMA, 2010).
Paraaformulaçãodecremesepomadas,oextratoaquosodeveser filtrado e
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evaporado em pressão reduzida para ser posteriormenteliofilizado, obtendo-se o extrato seco (HERNANDES et al., 2010). Em seguida, mistura-seeste extratoaoveículodofitoterápiconaconcentraçãodesejada,nestecasoapomada oucremebase.Geralmenteaspesquisasutilizaramoextratodacascaextraídado tronco de barbatimão nas concentrações de 1%, 3%, 5% e 10%, associadoa pomadasecremes,comoosestudosrealizadosporHERNANDESetal.(2010), MINATEL et al. (2010), LIMA (2010), SILVA et al., (2009), respectivamente.A conservação do produto final deve ser realizada em recipiente fechado, ao abrigoda luz e calor (BRASIL,2010). O PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DAPELE
A pele é o órgão que recobre o corpo e sua principal função é servircomo barreira física para o organismo contra o contato direto com o meioexterno (SINGER et al., 1999). Nos animais a espessura cutânea depende daregião corporal, e tende a diminuir no sentido dorso ventral do tronco e no sentidoproximal- distaldosmembros,ouseja,apelequerecobreodorsodopescoçoedacabeça, fronte, região glútea e base da cauda é mais espessa. Porém, na regiãoventral, pavilhõesauriculares,regiõesaxilar,inguinal,perianaleescroto,apeleapresenta- se mais delgada (SOUZA et al.,2009).
Apelepodeserdivididaemduascamadas:aepidermeeaderme.A epiderme consiste na camada mais externa, composta por um epitélioestratificado, pavimentosoequeratinizadoqueestásempreemrenovação.Estacamadapossui subcamadas conhecidas como estrato basal, estrato espinhoso, estratogranuloso, estrato lúcido e estrato córneo. O estrato basal é caracterizado por uma únicafileira decélulassobreamembranabasal,queseparaaepidermedaderme,eondese localizam os melanócitos, células de Merkel, e queratinócitos, estesúltimos proliferam de forma contínua para suprir o restante dos estratos superiores. Jáo estrato espinhoso possui camadas de queratinócitos ligados porpontes intercelulares, e são advindos do estrato basal, neste estrato também seobservam as células de Langerhans. O estrato granuloso também apresenta camadasde queratinócitos advindos do estrato espinhoso, e que apresentam grânulos decerato- hialina. O estrato lúcido possui camadas de queratinócitos anucleados advindosdo estrato granuloso. O estrato córneo é compostoqueratinócitos queratinizados, anucleados procedentes do estrato lúcido que sofremdescamação gradualeequilibradacomaproliferaçãocelulardequeratinócitosnoestratobasal (SOUZA et al.,2009).
Adermeconsisteemumacamadamaisprofundacompostadetecido conjuntivo, caracterizado por fibras elásticas, colágenas e reticularesentrelaçadas, matriz extracelular e elementos celulares como fibroblastos, macrófagose mastócitos. Além disso, na derme também estão presentes os folículospilosos, glândulas anexas, vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e musculatura lisa, comoo músculo eretor do pêlo (SOUZA et al.,2009).
A perda da continuidade da pele é chamada de ferida cutânea, sendoum dos problemas mais comuns na clínica veterinária de animais de companhia ede produção. Após o estabelecimento da ferida cutânea inicia-se o processofisiológico
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de reparo tecidual da pele, a cicatrização. Esse processo apresenta algumas diferençasfisiológicasparacadaespécieanimal,porém,oseventoscelularese bioquímicos envolvidos são basicamente os mesmos para todos osmamíferos (BOHLING & HENDERSON,2006).
O processo de cicatrização apresenta quatro fases que ocorrem deforma simultânea, interativa e dinâmica: fase hemostática, fase inflamatória,fase proliferativa e fase de remodelação (DIEGELMANN & EVANS, 2004). Afase hemostática ocorre logo após o estabelecimento da lesão primária na pele,quando há a ruptura de vasos e extravasamento de sangue e linfa. Este eventodesencadeia eativaçãodedescargasadrenérgicasepromovedegranulaçãodemastócitosque causam vasoconstrição do endotélio e deposição de plaquetas. As plaquetasativam a cascata da coagulação e formam trombos ricos em plaquetas queimpedem temporariamente o extravasamento de sangue. Em seguida, o trombo é infiltradopor fibrina e eritrócitos tornando-se mais firme, o que promove um tamponamentomais eficientedosvasos.Alémdisso,aativaçãodasplaquetastambéméresponsável pelaliberaçãodefatoresquimiotáticosparacélulasdedefesaereparaçãotecidual (BALBINO et al., 2005; BROUGHTON et al.,2006).
A fase inflamatória inicia-se com a quimiotaxia de células de defesacomo osleucócitosecélulasdereparocomoosfibroblastos.Essascélulassãoatraídas primariamente por agentes quimiotáticos liberados por plaquetas, como fatorde crescimentoderivadodeplaquetas(PDGF)efatortransformadordecrescimentoβ(TGF-β).Osneutrófilossãoaprimeiralinhadedefesacelular,sãomuitopresentes nasferidascutâneasentreoprimeiroeterceirodiadecicatrizaçãoepromovema “limpeza da ferida”, eliminando por fagocitose corpos estranhos e célulasmortas. Após seu “trabalho” os neutrófilos sofrem apoptose ou são fagocitadospor macrófagos. Somado a isso, mediadores quimiotáticos liberados pelasplaquetas, macrófagos, mastócitos e neutrófilos estimulam a vasodilatação, resultandono surgimentodealgunssinaisclínicosdainflamaçãocomoorubor,edemaeocalor (DIEGELMANN & EVANS,2004).
Os monócitos são atraídos por quimiotaxia para a ferida nafase secundária da inflamação, entre 48 e 96 horas após a lesão inicial, ocasionadapelo TGF-β, PDGF e interleucina 1 sintetizada por células endoteliais, entreoutras quimiocinas. Ao chegarem ao local da lesão os monócitos se diferenciamem macrófagos,queaoseremativados,sãoresponsáveispelaeliminaçãodorestante deneutrófilosapoptóticos,liberaçãodequimiocinasefatoresdecrescimentoque estimulam a fase proliferativa após a inflamação (BROUGHTON et al.,2006).
Os macrófagos ativados sintetizam fatores de crescimento, como: ofator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que estimula a angiogênese; o fatorde crescimentodefibroblastos,queestimulamafibroplasiaeaformaçãodotecido cicatricial; e o fator de crescimento epidermal (EGF), estimulador dare-epitelização. Além da liberação da interleucina 1 e o fator de necrose tumoral α(TFNα), quimiocinas importantes na estimulação da migração de fibroblastos emacrófagos (BROUGHTON et al.,2006).
A fase proliferativa é caracterizada pelo aumento da quantidadede fibroblastos e de vasos neoformados, determinando a formação do tecidode granulação, sendo que este processo inicia-se normalmente quatro dias apósa injúria tecidual. Os fatores de crescimento e as quimiocinas liberadaspelos macrófagos estimulam proliferação e migração de fibroblastos da zona periféricada feridacutâneaparaocentrodalesão,issoocorretambémcomcélulasendoteliais
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paraapromoçãodaangiogênese.Osfibroblastosativadosnaferidacomeçama produzir e depositar colágeno. Quando existe uma quantidade abundantedesta matriz na zona da lesão, essas células interrompem a produção de colágenoe sofrem apoptose, formando uma matriz cicatricial acelular. De forma similar,os vasosneoformadostambémsãodesintegradosporapoptosenestamatrizricaem colágeno (SINGER et al.,1999).
A fase de remodelação é caracterizada pelo processo deprodução, degradaçãoeorientaçãodasfibrascolágenas.Asfibrassofremdegradaçãoesão ressintetizadas e reposicionadas várias vezes, de acordo com o posicionamentodas fibrasdotecidoconjuntivoíntegroadjacente.Essasrepetiçõesculminamemum tecidocicatricialmaisregular,oqueproporcionamaiorresistênciaaonovotecido. Ao final desta etapa observa-se a regeneração dos anexos da pele, comoos folículos pilosos e glândulas, porém, de forma limitada. Além disso, acicatriz apresenta-se como um tecido mais pálido devido aos melanócitosapresentarem capacidade regenerativa muito deficiente (BALBINO et al.,2005). MECANISMO DE AÇÃO DO EXTRATO DA CASCA DE BARBATIMÃONA CICATRIZAÇÃO
A propriedade cicatrizante do extrato da casca do barbatimão jáfoi testada em vários experimentos e em diferentes espécies, como,camundongos (EURIDES et al., 1996), ratos (HERNANDES et al., 2010), coelhos (LIMA,2010), bovinos (SILVA et al., 2009; MOURA, 2011), equinos (MARTINS et al., 2003),ovinos (MENDONÇAetal.,2008),cães(RABELOetal.,2006),gatos(SILVA,2006)eno serhumano(MINATELetal.,2010).Somadoaisso,oprocessodecicatrizaçãode feridas cutâneas também pode ser favorecido por outras atividades biológicasdeste fitoterápico, como a antibacteriana (AUDI et al., 2004; FERREIRA et al.,2010; COSTAetal.,2011),fungicida(ISHIDAetal.,2006)anti-inflamatória(AUDIetal., 2004;LIMAetal.,2010),antioxidante(SOUZAetal.,2007)ehemostática(LIMAet al.,2010).
No processo cicatricial de feridas cutâneas, os taninos têm acapacidade de formar pontes de hidrogênio ou ligações hidrofóbicas duradouras comproteínas, polissacarídeos ou ambos. Com isso, ocorre a formação do complexotanino- proteínaoutanino-polissacarídeo,queporsereminsolúveisemáguaformamuma camada protetora, crosta, sobre a lesão. Abaixo da camada o processode cicatrização ocorre naturalmente. Esta capacidade de precipitação deproteínas também favorece a hemostasia após a injúria (HASLAM, 1996; LIMA et al.,2010).
Outra propriedade que contribui para o efeito cicatrizante do barbatimãoé oestímuloàproliferaçãodequeratinócitoscircundantesaregiãolesionada,oque poderia facilitar a reepitelização da ferida. Esta propriedade é conferidapelos elevados níveis de taninos condensados presentes no extrato do barbatimão.Além disso, essas substâncias têm capacidade de aumentar o número deligações cruzadasentreasfibrascolágenaspresentesnamatrizextracelularauxiliandona orientação destas fibras (HERNANDES et al.,2010).
O processo cicatricial pode ser favorecido pelo efeito antimicrobianodos taninos que possuem três mecanismos de ação principais: (1) inibição dasenzimas microbianas extracelulares, que comprometem a multiplicação e desenvolvimentodo microrganismo; (2) privação de substratos e íons metálicos tais como o ferro,cobre, cálcio,manganêsealumínio,osquaissãonecessáriosaosprocessosfisiológicos
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comorespiraçãomicrobiana;(3)inibiçãodafosforilaçãooxidativa,resultandona morte do microrganismo pela não formação do ATP (adenosina trifosfato)(HASLAN, 1996; LIMA et al., 2010). O extrato da casca de barbatimão também apresentaação anti-inflamatória por inibir a formação de mediadores químicos da inflamação comoa histamina, bradicinina, prostaglandina (LIMA et al., 2010). Além disso,este fitoterápico também promove a redução da permeabilidade vascularpor vasoconstrição (HERNANDES et al.,2010). BASE CIENTÍFICA PARA O USO DO BARBATIMÃO NACICATRIZAÇÃO DE FERIDAS
O uso tópico do extrato aquoso da casca de barbatimãoem camundongos para o tratamento de feridas excisionais de 10 mm dediâmetro apresentou eficiência no processo cicatricial. Pois, o estudo histológico dasamostras quereceberamobarbatimãodemonstroumaiorformaçãodetecidodegranulação desenvolvido e predomínio de fibras colágenas no sétimo e 21º diaspós-operatórios emcomparaçãoaogrupocontrole,emquenãofoiutilizadanenhumasubstância. Além disso, houve a cicatrização completa da ferida no 19ºdiapós-operatório, sendo no outro grupo apenas no 21º dia. Apesar destas diferenças nestesperíodos, o estudo histológico revelou que não houve diferenças no processo cicatricial no3º dia pós-operatório, pois ambos os grupos apresentaram na mesma intensidadeuma finacrostafibrino-leucocitária,tecidodegranulação,célulaspolimorfonuclearese ausência de fibras colágenas (EURIDES et al.,1996).
A utilização da pomada contendo o extrato aquoso do barbatimão a10% para tratamento de feridas cutâneas em ratos wistar submetidosexperimentalmente a distúrbios circulatórios, por meio da ligadura da veia femoral, apresentoua reepitelizaçãocompletadaferidano14ºdiaapósalesãocutânea,diferentemente dogrupocontrole,querecebeusoluçãosalinaa0,9%,poisapenasno30ºdiapós- operatóriodoisdeoitoanimaisapresentaramacicatrizaçãocompletadaferida.O grupoquerecebeuapomadaabasedebarbatimãoapresentou,emrelaçãoao grupo controle: menor presença de neutrófilos no 14º e 30º dia após alesão; ausência de linfócitos no 30º dia pós-cirúrgico; presença acentuada deangiogênese e fibroblastos no 7º dia após a lesão, além de maior quantidade de colágeno no30º dia (COELHO et al.,2010).
Os autores HERNANDES et al., (2010) utilizaram uma pomada a baseda fração semipurificada do extrato da casca da árvore de barbatimão(taninos condensados), na concentração de 1%, em feridas cutâneas excisionais de ratos. A pomada exerceu um efeito trófico sobre a proliferação de queratinócitos,por estimularaproliferaçãodestascélulasaolongodamargemdereepitelizaçãoem relação ao grupo controle no quarto, sétimo e décimo dia após a lesão.O mecanismodeaçãodobarbatimãoparaesteefeitoaindanãofoiesclarecido,mas acredita-se que esteja relacionado aos níveis de proantocianidinas presentesnesta fração do extrato. Apesar do efeito trófico sobre os queratinócitos apresentadona concentração de 1% da fração semipurificada do extrato de barbatimão, nãohouve diferença quanto ao processo de cicatrização da pele quando comparada aogrupo controle que recebeu a pomadabase.
Em coelhos, a pomada a base de extrato aquoso da casca debarbatimão a5%,com20%detaninostotaise50%defenóistotais,auxiliounareparação tecidual de feridas induzidas, sendo que houve retração centrípeta precoce daferida
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enãofoiobservadaintercorrênciaspós-operatórias,comoinfecções.Alémdisso, não se observou secreções a partir do sexto dia após a lesão e formação decrosta sobreaferidaapartirdosegundodia,sendoqueascrostasnãoforamremovidas previamente à aplicação dos produtos em estudo. Microscopicamente, oinfiltrado polimorfonuclear apresentou-se menor no grupo tratado com barbatimão emrelação ao grupo tratado com creme base. Apesar de não terem sido observadasdiferenças no processo de cicatrização como um todo entre o barbatimão e asolução fisiológica, o procedimento de remoção das crostas para a aplicação dofitoterápico poderiacontribuirparaaeficiênciadoproduto,jáqueacrostaprovavelmenteirá dificultar sua absorção (LIMA,2010).
Oestudomacroscópicodaevoluçãodoprocessocicatricialdeferidas incisionais da pele, em gatas submetidas aovario-salpingo-histerectomia, comparando o extrato aquoso de barbatimão com iodopovidona a 10%,não apresentou diferença estatística entre os tratamentos. No entanto, osanimais tratados com o extrato de barbatimão apresentaram aspecto estéticomelhorda feridatratada(SILVA,2006).Tambémemferidasexcisionaisdecães,apomadaa base do extrato da casca da árvore de barbatimão a 10% apresentou-semais eficiente no auxílio à cicatrização. Durante a avaliação macroscópica,100%do grupo que recebeu a pomada a base de barbatimão obteve a cicatrizaçãocompleta daferidaatéos24diasapósalesão,alémdapresençadecrostasespessasjáno sexto dia pós-operatório. Já no grupo controle (solução de cloreto de sódio a0,9%) as crostas foram evidenciadas no 12º dia e em apenas 50% dos animais, sendoque acicatrizaçãocompletadasferidasultrapassouos30dias.Aavaliaçãohistológica realizada no 12º e 24º dias pós-operatórios não apresentou diferença entreos grupos (RABELO et al.,2006).
Em ovinos, o tratamento de feridas com o extrato aquoso do barbatimãoa 10%nãoapresentouresultadossuperioresquandocomparadoàágua,líquidode Dakin a 0,5% e polivinilpirrolidona a 0,1%. No 14º dia após a lesão,estastrês últimassoluçõesresultaramnamaioráreadecontraçãodaferidaemrelaçãoao extrato do barbatimão. Neste mesmo período, os achados microscópicosrevelaram áreas ulceradas com infiltrado inflamatório moderado de polimorfonucleares,além de acentuada desorganização do tecido conjuntivo (BARROSO et al.,2010). Estudandooassunto,MENDONÇAetal.,(2008)apresentaramumcasoclínicode feridapurulentanaregiãomedialdocarpodeumovinodaraçaSantaInês,quefoi tratadopelaassociaçãodolaserAs-Ga-Aldebaixapotênciacomoextratoaquoso dacascadebarbatimão.Foramrealizadassetesessõesdelaserterapiaemdias alternados e logo após cada sessão foram realizados os curativos com o extratode barbatimão. Após 48 horas do início do tratamento foi observada a formação deuma crosta sobre a lesão e ausência de secreções. Este processo cicatricialfoi favorecido pelos efeitos da laserterapia na cicatrização, como a estimulaçãoda angiogênese, fibroplasia e atividade de macrófagos, somadaaatividade adstringente dobarbatimão.
Em bovinos SILVA et al., (2009) utilizaram o extrato aquoso e ounguento da casca de barbatimão, ambos a 10%, associados ao tratamento cirúrgico etoalete dos cascos para recuperação de bovinos da raça Nelore com dermatitedigital. Ambas as apresentações do extrato foram eficientes para o tratamento dadermatite digital, porém o extrato aquoso da casca da árvore de barbatimãoapresentou resultadossuperiores,comrecuperaçãode72,5%dosanimais,seguidode67,5% comounguentodacasca,e12,5%,comopedilúviocomágua(grupocontrole).A
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cicatrizaçãodaslesõescomoextratoaquosoocorreudeformamaisacelerada, sugerindo que o contato direto do extrato com a lesão favorece oprocesso cicatricial. Desta forma, indica-se a utilização do extrato aquoso da cascade barbatimão em pedilúvio para bovinos no tratamento e prevenção de lesõesdigitais.
Sobre o tema, MOURA (2011) descreveu a utilização do extrato glicólicoa 20% da casca do tronco de barbatimão, como solução de pedilúvio a 5%.O fitoterápico auxiliou no tratamento de lesões interdigitais induzidas, com diâmetrode
10mm,embovinos.Nãoseobservoudiferençasmacroscópicasquantoà cicatrização em comparação ao grupo que recebeu apenas água nopedilúvio. Porém, a quantidade de fibras colágenas no grupo que recebeu o barbatimãofoi maior, promovendo desta forma cicatrização qualitativamentemelhor.
Na espécie equina, o extrato aquoso da casca de barbatimãomostrou-se superior como agente cicatrizante de feridas cutâneas excisionais de 2,5cmde diâmetro, em comparação à solução hidro-alcoólica da calêndula(Calendula officinalis),confrey(Symphytumofficinale),esoluçãodecloretodesódio.Houvea formação de crostas espessas nos animais que receberam o extrato debarbatimão, alémdadeposiçãoabundantedefibrinanocentrodalesão,asquaisestimulama multiplicação e migração centrípeta de fibroblastos. Apesar do extrato debarbatimão ter se destacado no processo cicatricial, não houve diferença estatísticasignificativa entre os grupos (MARTINS et al.,2003).
Apomadadebarbatimãoa3%apresentouresultadospromissoresno tratamentodeúlcerasdedecúbito,emdiferentesgrausdelesão,emhumanos. Foram incluídos neste estudo 27 pacientes totalizando 51 lesões de decúbito. Atéo período de dois meses da aplicação do produto, mais de 70 % dospacientes apresentaramasferidascompletamentecicatrizadas,sendoqueaáreadaferida reduziu em média 30% após a primeira semana de aplicação da pomada.Atribuiu-se estapropriedadecicatrizanteaostaninospresentesnaformulaçãodapomadaa base de barbatimão (MINATEL et al.,2010). TOXICIDADE DOBARBATIMÃO
Apesar de estudos anteriores comprovarem a atuação dobarbatimão como coadjuvante na cicatrização em animais, foram poucas as pesquisasque realizaramtestesdetoxicidade,citoxicidade,genotoxicidadeemutagênese,como osdescritosporBÜRGERetal.(1999),REBECCAetal.(2002),COSTAetal. (2010).
O extrato liofilizado da casca de barbatimão administrado por via oralem camundongos possui baixa toxicidade. Doses de até 2000 mg/kg não foramcapazes de provocar sinais de toxicidade e morte, porém, a partir de 2699 mg/kg osanimais apresentaramhipoatividadeemorte.Emratos,osníveisdeglicoseeatividadeda enzima aspartato aminotransferase apresentaram-se elevados com a dose diáriade 800 mg/kg de 1600 mg/kg, respectivamente, durante 30 dias. Também foiobservado atrofia do timo com está última dose. Outro achado importante foi o menor ganhoem peso dos animais que receberam o extrato da casca do barbatimão emdoses superior a 800 mg/kg, fator determinado pela interferência na absorção deproteínas (REBECCA et al.,2002).
Afraçãodetaninoscondensados,procedentedoextratobrutodacasca de barbatimão, em concentrações acima de 2000 mg/kg provocou a mortede
camundongosquandoadministradadiariamenteporviaoral,sendoqueaDL50foi estimadaem3015mg/kg.Portanto,estafraçãodetaninosémenostóxicaquando
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comparadaaoextratobruto.Alémdisso,pormeiodoensaiodemicronúcleos,o extrato de barbatimão não apresentou efeito mutagênico em células damedula óssea de camundongos quando administrado nas doses de 750, 1500, 2250mg/kg. Pelocontrário,estefitoterápicoapresentouefeitoantimutagêniconadosede750 mg/kg, pois quando administrado na dose de 40 mg/kg juntamente coma ciclofosfamida (fármaco indutor de mutagênese), a quantidade deeritrócitos policromáticos micronucleados foi muito menor no grupo que recebeua ciclofosfamida isoladamente, e não apresentou diferença estatísticaquando comparado ao grupo controle negativo para mutagênese. Quanto à toxicidadeem larvas de Artemia salina, a fração de taninos condensados apresentoubaixa toxicidade,poisaconcentraçãode1000mg/Lnãofoicapazdeeliminarem50%a população de A. salina (COSTA et al.,2010).
Por meio dos testes in vitro, SOS cromoteste e SOS-inductest, ambosem cultura de Escherichia coli, e o teste de Ames em cultura de Salmonellatyphimurium, VILARetal.(2010)determinaramqueoextratoetanólicodacascadebarbatimão nasdosesde0.0,0.25,0.5,1.0,5.0e10mg/placaoutubodeculturapossuiefeito citotóxico e genotóxico, porém não possui atividade mutagênica. Entretanto,efeitos genotóxicos não foram observados sobre larvas de Drosophila melanogasterquando emseumeiodedesenvolvimentoforamacrescidos5mLdoextratohidroalcoólico da casca de barbatimão nas concentrações de 66%, 75% e 100%, por meio deteste demutaçãoerecombinaçãosomática,edotesteRing-xloss,quedeterminam, respectivamente, a presença de mutação e recombinação de células somáticas,e danos ao cromossomo em células germinativas (SOUSA et al.,2003).
A administração de 500 mg/kg do extrato bruto da casca debarbatimão, por via oral, do primeiro a sétimo dia de gestação em ratas, não provocoualterações nodesenvolvimentodosfetosno21ºdiadegestação.Noentanto,aadministração de100mg/mLdoextratobrutodesementesdebarbatimãoemratasgestantes, como no procedimento anterior, interferiu na gestação pela presença de fetosmortos no 21º dia de gestação, além de reduzir significativamente o peso uterino. A DL50do extratobrutodasementedebarbatimãofoide4992,8mg/kgemcamundongos quando receberam este fitoterápico por via oral e não foram observadasalterações locomotoras ou de comportamento (BÜRGER et al.,1999).
CONSIDERAÇÕESFINAIS
Muito ainda se tem a evoluir quanto à utilização do barbatimão ede fitoterápicos em geral na Medicina Veterinária. Pois a grande maioria dos estudos in vivo que utilizam esta planta como agente cicatrizante nãocaracteriza adequadamente a substância empregada nos tratamentos. Comodemonstrado nesta revisão, foram poucos os trabalhos que quantificaram os níveis detaninos presentes no extrato da casca de barbatimão, sendo na verdade, umadas avaliações fundamentais para a justificativa do efeito cicatrizante destefitoterápico, já que os níveis elevados de taninos são responsáveis por essapropriedade.
Existem poucos produtos a base de barbatimão destinados àcicatrização deferidascutâneasregistradosemórgãosoficiais.Estefatodemonstraqueouso do barbatimão na cicatrização, sem a realização de testes de controle dequalidade, pode trazer riscos para a população, pois as preparaçõesfitoterápicas, principalmente as de uso popular, podem possuir agentescontaminantes, substâncias adulterantes ou ambos e resultar na ineficiência do produto noprocesso cicatricial dalesão.
Por último, as pesquisas científicas para a validação dopotencial
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cicatrizante do barbatimão, in vivo, devem ser conduzidas de maneira maiscriteriosa quantoàcaracterizaçãodoprodutofitoterápicoutilizado,bemcomooseu mecanismo de ação. Pois só assim haverá maior interesse deindústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de produtos fitoterápicos comqualidade comprovada, servindo como incentivo para realização de mais estudosrelacionados às plantasmedicinais.
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG),ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) eà Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) peloapoio financeiro. À empresa Animalle - Farmácia de Manipulação Veterináriapelo fornecimento do extrato glicólico da casca debarbatimão.
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CAPÍTULO 3 - TRATAMENTO DE FERIDAS EXCISIONAIS DE COELHOS COM
EXTRATO DE BARBATIMÃO (Stryphnodendron adstringens)
ASSOCIADO A CÉLULAS MONONUCLEARES AUTÓLOGAS DA
MEDULA ÓSSEA
RESUMO
Este estudo objetivou avaliar o processo de cicatrização de feridas de coelhos em resposta ao
tratamento com extrato de barbatimão (S. adstringens) associado a células mononucleares autólogas
da medula óssea (CMMO). Utilizaram-se 20 coelhos, distribuídos em quatro grupos: B, extrato de barbatimão a 10% com 9,48% de taninos totais; CB, CMMO com barbatimão; CS, CMMOcom
solução de NaCl a 0,9%; S, solução de NaCl a 0,9%. Clinicamente foi avaliada a presença de crosta,
hiperemia, secreção, hemorragia, reepitelização, área da ferida e tempo de cicatrização em dias. No
terceiro, sétimo, 14º e 21º dias pós-operatórios realizou-se a biópsia das feridas para avaliação microscópica dos indicadores do processo de inflamação e reparo. Houve maior deposição de fibras
colágenas nos grupos B e CB (p=0,00003) no sétimo dia e formação de crostas mais espessas, além de
fibras colágenas mais organizadas no 21º dia nestes grupos. Conclui-se que na fase inicial da cicatrização, o barbatimão estimula a produção de fibras colágenas e promove a formação de crostas
mais exuberantes sobre a ferida e, na fase de remodelação, favorece a orientação das fibras colágenas,
mas a associação deste fitoterápico com CMMO não estimula a cicatrização de feridas de coelhos.
Palavras-chave: AgNOR, cicatrização, colágeno, fitoterapia, terapia celular
TREATMENT OF EXCISIONAL WOUND IN RABBITS WITH BARBATIMAN
EXTRACTS (Stryphnodendron adstringens) ASSOCIATED WITH AUTOLOGOUS
BONE MARROW MONONUCLEAR CELLS
ABSTRACT
This study aimed to evaluate the healing process of wounds of rabbits in response to treatment with barbatiman extract (S. adstringens) associated with autologous mononuclear bone marrow cells (BM-
MNC). We used 20 rabbits, divided into four groups: B, 10% barbatiman extract with 9.48% of total
tannins; CB, BMMC with barbatiman extract; CS BMMC with NaCl 0.9% solution; S, NaCl 0.9% solution. Clinical evaluation was performed by observing the presence of crust, redness, discharge,
bleeding, re-epithelialization, the wound area and healing time in days. In the third, seventh, 14th and
21st postoperative days it was held biopsy of wounds for microscopic evaluation of inflammation and
repair process indicators. There was a greater deposition of collagen fibers in groups B and CB (p = 0.00003) on the seventh day and training thicker crusts, and more organized collagen fibers on the 21st
day these groups. In conclusion, in the initial phase of the healing barbatiman extract stimulates the
production of collagen fibers and promotes the formation of more exuberant crusts on the wounds and remodeling phase favors the orientation of collagen fibers, but when combined with BMMC does not
stimulate the wound healing in rabbits.
Keywords: AgNOR, cell therapy, collagen, wound healing, phytotherapy.
43
INTRODUÇÃO
A cicatrização de feridas consiste na perfeita e coordenada cascata de eventos
moleculares, bioquímicos e celulares que resultam na restauração tecidual1. Vários protocolos
terapêuticos podem otimizar a cicatrização, incluindo o desbridamento cirúrgico, síntese,
administração de medicamentos alopáticos, implante de enxertos ou de biomateriais,
oxigenoterapia hiperbárica, terapia celular2 e a fitoterapia
3. Dentre os fitoterápicos mais
conhecidos, o extrato da casca de barbatimão (Stryphnodendron adstringens) contém
compostos fenólicos, denominados taninos, em níveis superiores a 20%5, que conferem ação
adstringente, antimicrobiana e antioxidante6. Os taninos possuem a capacidade de formar
pontes de hidrogênio ou ligações hidrofóbicas com proteínas, polissacarídeos ou ambos, que
resultam na formação do complexo tanino-proteína ou tanino-polissacarídeo, constituindo
uma camada protetora sobre a lesão (crosta) que favorece o processo de cicatrização. Os
taninos também promovem a hemostasia após a injúria7 e estimulam a reepitelização, porém o
mecanismo de ação não é conhecido8.
A terapia com células mononucleares autólogas da medula óssea (CMMO) é uma
alternativa promissora no auxílio à reparação de lesões teciduais9. As CMMO apresentam
como propriedades terapêuticas a secreção de fatores de crescimento e citocinas10
,e sua fração
composta por células-tronco mesenquimais (CTM) possui a capacidade de diferenciação em
diversas linhagens de tecidos11
. Na cicatrização de feridas, essas células foram empregadas
com sucesso em estudos experimentais, pré-clínicos e clínicos na forma de suspensão ou
associadas a scaffolds. As CTM desempenham papel fundamental em todas as fases da
cicatrização, pois coordenam efeitos de células inflamatórias, inibem os efeitos de citocinas
pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF) e interferon (IFN), e estimulam a
fagocitose. Também favorecem a transição da fase inflamatória para a fase proliferativa, pela
liberação de fatores de crescimento como o endotelial vascular (VEGF), fibroblástico básico
(bFGF) e de queratinócitos (KGF). Na fase de remodelação, as CTM influenciam na
composição da matriz extracelular12
.
Para a avaliação de protocolos de tratamento de feridas, técnicas básicas como a
avaliação clínica pela inspeção13
, morfometria digital14
e histológica pela técnica de coloração
de hematoxilina e eosina15
, podem ser complementadas com técnicas mais específicas, que
permitem avaliar indicadores essenciais para o reparo tecidual, como a mesuração de fibras
colágenas, pela técnica de coloração picrosirius16
e a quantificação de células em proliferação,
pela técnica de AgNOR17
. A mensuração da área ocupada por fibras colágenas da ferida é um
método viável e utilizado para descrever e avaliar a evolução cicatricial e esclarecer a
44
atividade de diferentes tratamentos sobre a cicatrização18
. A técnica de coloração picrosirius
possui alta especificidade e sensibilidade para a avaliação do colágeno, sendo possível captar
fibras de colágeno imaturo, o que não é possível por técnicas menos específicas, e possibilita
que o colágeno apareça com aspecto brilhante sob a luz polarizada em fundo escuro,
impedindo qualquer possibilidade de conflito com outros elementos presentes no tecido19
.
As proteínas argirofílicas das regiões organizadoras de nucléolos (AgNOR) estão
diretamente relacionadas à proliferação celular, especialmente durante a interfase (G1, S, G2)
do ciclo celular, pois o número de proteínas AgNOR está estritamente relacionado à síntese de
RNAr. Portanto, quanto maior a síntese de RNAr, maior o número de proteínas AgNOR e
mais rápido será o processo de proliferação celular. Dessa forma, células com marcação
nucleolar apresentam-se no ciclo celular ativo, portanto, em proliferação20,21
, tornando essa
técnica interessante para a avaliação do processo cicatricial. Como estudos demonstraram o
favorecimento da cicatrização pelo uso de barbatimão22,23
e de CMMO9,24
, a associação dessas
terapias talvez possa favorecer ainda mais o processo de cicatrização de feridas, sendo
necessária a combinação de diferentes técnicas de avaliação do processo de reparo tecidual
para comprovar essa hipótese.
Este estudo objetivou avaliar o processo de cicatrização de feridas cutâneas
excisionais de coelhos em resposta ao tratamento com extrato de barbatimão (S. adstringens)
associado a células mononucleares autólogas da medula óssea, por meio de análises clínicas,
histológicas e histoquímicas.
MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais – UFG
(Protocolo nº 026/2012, ANEXO I). No estudo, foram utilizados 20 coelhos hígidos
(Oryctolaguscuniculus) da raça Nova Zelândia, com idade média de seis meses e peso médio
de 3kg. Os animais foram distribuídos em quatro grupos (B, CB, CS e S) com (n=5), de
acordo com os protocolos terapêuticos empregados no tratamento das feridas: B, extrato
glicólico da casca de barbatimão a 10%; CB, CMMO com extrato de barbatimão; CS, CMMO
associadas a solução de NaCl a 0,9%; e S, solução de NaCl a 0,9% (grupo controle). Os
animais foram alojados em gaiolas individuais no Biotério de Experimentação em Roedores e
Coelhos da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, com ciclo
claro e escuro de 12 horas, temperatura ambiente controlada de 22ºC±2ºC e receberam ração
específica para a espécie e água à vontade. Os animais foram submetidos ao período de
aclimatação de 15 dias, antes dos procedimentos cirúrgicos, e a sala higienizada diariamente.
45
O extrato glicólico da casca de barbatimão foi adquirido de indústria farmacêutica
(Animalle Farmácia de Manipulação Veterinária, Brasil) e diluído para a concentração a 10%.
Em seguida, foi analisado o pH, densidade e teor de sólidos de acordo com a Farmacopeia
Brasileira25
, e fenóis e taninos totais, como descrito por Mole e Waterman26
, obtendo-se a
seguinte caracterização físico-química: pH=4,34, densidade=42,08g/L, teor de
sólidos=4,82%, fenóis totais=10,29% e taninos totais=9,48%.
Para a colheita de CMMO, os animais receberam 2mg/kg de cloridrato de
tramadol, por via intramuscular, como medicação pré-anestésica. Após dez minutos,
administrou-se 30mg/kg de cloridrato de cetamina e 5mg/kg de cloridrato de xilazina, ambos
por via intramuscular, associados em uma mesma seringa. Realizou-se a tricotomia e
antissepsia da região do tubérculo umeral e procedeu-se à colheita e isolamento das CMMO,
fundamentada nos trabalhos de Böyum27
e Oliveira e colaboradores28
com adaptações,
incluindo o emprego de uma agulha hipodérmica 40x12mm para a punção medular umeral
(Figura 1A e 1B), substituição do meio de cultivo MesencultTM
(Meio de cultivo celular, Stem
cell Technologies, Brasil) por DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, Cultilab,
Brasil) e a não utilização da solução de lise eritrocitária. A viabilidade celular obtida foi de
90% e estabeleceu-se a quantidade de 6x105 CMMO a serem aplicadas em cada ferida, nos
grupos CB e CS, diluídas em 0,05mL de DMEM em uma seringa de 1mL. As amostras foram
mantidas refrigeradas em um isopor com gelo até o momento da aplicação, não excedendo a
2h.
Para a promoção das feridas excisionais, empregou-se o mesmo protocolo
anestésico anterior. A região dorsal, desde a nuca às asas do ílio, foi submetida a tricotomia e
antissepsia. No trans-operatório, utilizou-se um punch circular metálico de 8mm para
confeccionar quatro feridas excisionais na região dorsal do tórax, respeitando a distância
mínima de 4cm entre elas e preservando a fáscia muscular (Figura 1C). Cada ferida
representou um período para a avaliação microscópica: terceiro, sétimo, 14º e 21º dia pós-
operatório. Sobre a ferida, aplicou-se uma membrana semipermeável Tegaderm®
(poliuretano, 3MTM
, Brasil), que permaneceu por 72h, para proteção física contra sujidades.
Para melhor fixação da membrana, utilizaram-se quatro gotas do adesivo de metilcianocrilato
ao redor de cada ferida, respeitando-se distância mínima de 2cm da borda da lesão (Figura
1D).
Para a administração dos tratamentos utilizou-se uma seringa de 1mL com agulha
13x0,45mm. O uso dos protocolos iniciou-se imediatamente após a colocação da membrana
semipermeável, perfurando-a com a agulha para depositar a solução sobre a ferida (Figura
46
1E): nos grupos CB e CS, as CMMO foram aplicadas uma única vez nesse momento; nos
grupos B e S, administrou-se a solução de barbatimão e de NaCl a 0,9%, respectivamente, no
volume de 0,05mL. Na sequência, após 48 horas, administrou-se de forma similar as soluções
de barbatimão nos grupos B e CB e a solução de NaCl a 0,9% nos grupos CS e S (Figura 2).
A
B
47
FIGURA21 – Procedimento de colheita e isolamento de CMMO, promoção das feridas e administração dos
tratamentos em coelhos: A, punção da medula óssea do úmero, com agulha 40x12mm acoplada a
uma seringa de 10mL contendo solução de NaCl a 0,9% heparinizada; B, nuvem celular composta
por CMMO após o procedimento de separação celular por gradiente de densidade (seta vermelha);
C, feridas cutâneas excisionais confeccionadas com punch metálico de 8mm; D, feridas após a colocação da membrana de poliuretano; E, Representação esquemática da técnica de aplicação da
solução terapêutica de acordo com o grupo (barbatimão, CMMO ou solução de NaCl a 0,9%).
No terceiro dia pós-operatório, a membrana foi removida e utilizou-se uma
seringa de 10mL com agulha 13x0,45mm para instilação por jateamento da solução
terapêutica (barbatimão ou solução de NaCl a 0,9%), diariamente, até o 21º dia pós-operatório
(Figura 2). A partir desse dia, antecedendo a aplicação das soluções, gazes estéreis
umedecidas na solução de tratamento (barbatimão ou solução de NaCl a 0,9%) foram
empregadas para auxiliar na remoção de possíveis sujidades depositadas sobre as feridas.
C
D
E
48
FIGURA32- Representação esquemática dos protocolos terapêuticos empregados nas feridas excisionais cutâneas
de coelhos tratados com extrato de barbatimão (B), CMMO associadas ao extrato de barbatimão (CB), CMMO associadas a solução de NaCl a 0,9% (CS) e solução de NaCl a 0,9% (S). ECB:
extrato da casca de barbatimão a 10%. CMMO: células mononucleares autólogas da medula óssea.
Solução salina: solução de NaCl a 0,9%.
Para a analgesia pós-operatória, aplicou-se nos animais 2mg/kg de cloridrato de
tramadol, via subcutânea, a cada 8h, por três dias consecutivos. O colar elizabetano foi usado
durante 21 dias. Na avaliação clínica da reparação tecidual, a cada 48h, foram registrados os
parâmetros de hiperemia, hemorragia, secreção, crostas, reepitelização e área da ferida, por
meio da captura de imagens com câmera digital Coolpix L820 (Nikon®, Japão). A área de
cada ferida foi mensurada pelo programa ImageJ (Versão 1.36b, Wayne Rasband, National
Institute of Health, USA), como descrito por Rodrigues e colaboradores29
(Figura 3).
FIGURA4 3 – Descrição do procedimento de mensuração da ferida de coelhos pelo programa Image J: A, captura
da imagem da ferida juntamente com uma régua para ter a referência da escala; B, ajuste do
contraste para favorecer a delimitação da área da ferida; C, área da ferida completamente isolada
pelo plugin Threshold colour que permite a contagem total de pixels e conversão em cm2
(representada em preto).
A
B
C
49
No terceiro, sétimo, 14º e 21º dias do pós-operatório, os animais foram
submetidos a anestesia, de acordo com o protocolo anestésico anterior, para realização das
biópsias de cada ferida, sendo a ferida a ser colhida selecionada por sorteio. As amostras
foram processadas e coradas pela técnica histológica de hematoxilina e eosina (HE) e
histoquímicas de picrosirius16
e de AgNOR30
e examinadas por um único avaliador.
Nas lâminas coradas em HE utilizou-se o aumento de 100x e 400x, e cinco
campos por lâmina, para avaliar as variáveis células polimorfonucleares, células
mononucleares, angiogênese e fibroplasia, descrevendo-as por meio de escores: 0 (ausente),
não observação da variável analisada; 1 (discreto), até 25% do campo ocupado pela variável
analisada; 2,(moderado), de 26 a 50% do campo ocupado pela variável analisada; 3
(acentuado), mais de 50% do campo ocupado pela variável analisada. Para a variável
reepitelização, utilizaram-se os escores 0 (ausente), 1 (parcial), quando a lesão é recoberta
parcialmente pelo epitélio, e 2 (total), quando a lesão é recoberta completamente pelo epitélio.
Na técnica de coloração picrosirius, para mensurar a área ocupada por fibras
colágenas, empregou-se o programa Image J e a média de cinco fotomicrografias por lâmina,
no aumento de 400x, em microscópio de luz polarizada (Figura 4). Para a avaliação da
proliferação celular, pela técnica de coloração AgNOR, foram capturadas três
fotomicrografias da área de ferida e contaram-se aleatoriamente 40 células por
fotomicrografia no aumento de 400x, sob a microscopia de luz. Foi quantificado o número de
proteínas AgNOR17
, representadas pelo grupamento de pontos escuros no interior do núcleo
celular, e a porcentagem de células marcadas, representando as células em proliferação.
FIGURA54 - Mensuração da área ocupada por fibras colágenas em fotomicrografias de feridas de coelhos pelo
programa Image J: A, imagem original da ferida capturada em microscópio de luz polarizada no aumento de 400x, as fibras colágenas estão coradas nas graduações de laranja ao vermelho intenso;
B, área ocupada por fibras colágenas completamente isolada por meio do pluginThreshold
colourrepresentada em preto, a área branca representa a ausência de colágeno.
A B
50
A análise da variância (ANOVA), seguida do teste de Tukey foram empregados
na determinação de diferença estatística entre os grupos para as variáveis paramétricas, como
o tempo de cicatrização em dias; a área da ferida em cm²; a área ocupada por fibras colágenas
em porcentagem; a quantidade de células marcadas em porcentagem e número de proteínas
AgNOR em unidades. Empregou-se o teste de Kruskal-Wallis para as variáveis não
paramétricas das avaliações macroscópicas (hiperemia, hemorragia, secreção, crostas,
reepitelização) e histopatológicas (células polimorfonucleares, mononucleares, angiogênese,
fibroplasia e reepitelização). Todas as análises estatísticas foram realizadas no programa
BioEstat 5.3 com p<0,05.
RESULTADOS
Na análise macroscópica das feridas, a hemorragia esteve presente até 48h após a
confecção das feridas, e a presença de hiperemia discreta foi observada até o terceiro dia pós-
operatório em todos os grupos. Não foi notada secreção purulenta em nenhum animal. A
presença de crosta foi observada a partir do quinto dia pós-operatório em todos os animais e
apresentou-se mais evidente nos animais dos grupos B e CB. No sétimo dia pós-operatório, as
crostas foram identificadas também ao redor da ferida nesses grupos. A presença de
reepitelização foi observada clinicamente a partir do nono dia pós-operatório, em todos os
grupos (Figura 5). A mensuração da área da ferida não apresentou diferenças significativas
entre os tratamentos com o avançar do processo de cicatrização. O tempo médio de
fechamento das feridas foi de 14,8 dias (±1,09) no grupo B, 13,6 dias (±0,54) no grupo CB,
14,6 dias (±1,34) no grupo CS e de 15,6 dias (±1,09) no grupo S e não houve diferença
estatística entre os grupos (Figura 6).
51
FIGURA65- Aspectos macroscópicos das feridas cutâneas excisionais de coelhos tratadas com barbatimão (B),
CMMO com barbatimão(CB), CMMO com solução de NaCl a 0,9% (CS) e solução de NaCl a 0,9%
(S), no dia da cirurgia (dia 0) e no terceiro, sétimo, 14º e 21º dia pós-operatório. Em todos os grupos,
no dia do procedimento ciúrgico observam-se pequenos focos de hemorragia na lesão. No terceiro
dia pós-operatório não se observam hemorragia ou hiperemia em todos os grupos. No sétimo dia pós-operatório, evidencia-se a formação de crostas mais exuberantes nos grupos B e CB,
ultrapassando as bordas da ferida. No 14º dia, observa-se a reepitelização e redução do tamanho das
feridas, e presença da cicatriz no 21º dia pós-operatório em todos os grupos.
FIGURA 76 - Representação gráfica da mensuração média da área e desvio padrão de feridas cutâneas
excisionais em cm2 no decorrer dos dias,pelo programa Image J, de coelhos tratados com
barbatimão (B), CMMOcom barbatimão com (CB), CMMO com solução de NaCl a 0,9% (CS) e
solução de NaCl a 0,9% (S). Eixo X: dia da mensuração da ferida. Eixo Y: área da ferida em cm2.
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 3 5 7 9 11 13 14 16 18 20 21
Área da ferida em cm²
B CB CS S
52
Nas avaliações histopatológicas, nos animais dos grupos B e CB, observou-se
uma camada eosinofílica espessa de aparência proteica sobre o local da lesão (crosta). Abaixo
dessa camada, no terceiro dia pós-operatório, notou-se uma concentração de células
polimorfonucleares de intensidade predominantemente discreta próximo à base da crosta, e de
células mononucleares com intensidade moderada logo abaixo das células
polimorfonucleares. Não houve diferença estatística quanto à intensidade de
polimorfonucleares entre os grupos, no terceiro e sétimo dia de avaliação. A quantidade de
polimorfonucleares decaiu com a evolução do processo cicatricial, até seu desaparecimento
completo aos 14 dias em todos os grupos. Entre o terceiro e o 14° dia, houve aumento na
quantidade de células mononucleares, que decaiu no 21° com a evolução da reparação
tecidual (Figura 7 e 8).
A angiogênese foi identificada a partir do sétimo dia do pós-operatório com
intensidade predominantemente moderada, permanecendo nesse padrão até o 14º dia,
independente do protocolo terapêutico empregado. No 21º dia, a angiogênese regrediu para
discreta em todos os grupos. A partir do sétimo dia pós-operatório, a fibroplasia apresentou-se
com intensidade, variando de moderada a acentuada no 14º e 21º dias em todos os grupos. A
reepitelização esteve presente de forma parcial no sétimo dia pós-operatório, e completa no
14º dia. Não houve diferença estatística entre variáveis histopatológicas entre os grupos
(Figuras 7 e 8).
53
FIGURA87 - Representação gráfica da avaliação histopatológica da presença de células polimorfonucleares (A),
células mononucleares (B), angiogênese (C), fibroplasia (D) e reepitelização (E) em feridas
cutâneas excisionais de coelhos, em escores, tratadas com extrato da casca de barbatimão (B), CMMO com extrato barbatimão (CB), CMMO com solução de NaCl a 0,9% (CS) e solução de
NaCl a 0,9% (S), na coloração de HE, no terceiro, sétimo, 14º e 21º dia pós-operatório. * Para a
variável reepitelização consideraram-se os escores como ausente (0), parcial (1) e total (2). Eixo
x=grupo/período de avaliação e eixo y=nº de animais.
0
1
2
3
4
5
B CB CS S B CB CS S B CB CS S B CB CS S
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Polimorfonucleares A
0
1
2
3
4
5
B CB CS S B CB CS S B CB CS S B CB CS S
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Mononucleares B
0
1
2
3
4
5
B CB CS S B CB CS S B CB CS S B CB CS S
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Angiogênese
0
1
2
3
4
5
B CB CS S B CB CS S B CB CS S B CB CS S
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Fibroplasia
0
1
2
3
4
5
B CB CS S B CB CS S B CB CS S B CB CS S
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Reepitelização*
0(ausente) 1(discreto) 2(moderado) 3(acentuado
C D
E
)
54
FIGURA98 - Representações das fotomicrografias de feridas cutâneas excisionais de coelhos, de acordo com o tratamento (linhas) e período de avaliação (colunas), pela
técnica de coloração hematoxilina e eosina, aumento de 100x (retângulo maior) e 400x (retângulo menor), em microscopia de luz. Grupos: B (extrato de
barbatimão); CB (CMMO com extrato de barbatimão); CS (CMMO com solução de NaCl 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%). Evidencia-se a presença de
infiltrado inflamatório no terceiro dia pós-operatório em todos os grupos. Com sete dias, observa-se a presença de células mononucleares e angiogênese de
moderada a acentuada em todos os grupos, além da presença de crosta mais espessa nos grupos B e CB (estrela). No 14º dia, evidencia-se a fibroplasia e células
mononucleares em todos os grupos. No 21º dia pós-operatório, a fibroplasia apresentou intensidade de moderada a acentuada em todos os grupos.
55
No terceiro dia pós-operatório, não foi observada a presença de fibras colágenas
nas feridas em todos os grupos. No sétimo dia pós-operatório, os animais distribuídos nos
grupos B e CB apresentaram maior quantidade de colágeno, 21,94% e 21,06%
respectivamente, em comparação aos grupos CS (12,11%) e S (13,28%), com diferença
estatística p=0,00003. Em todos os grupos, no 14º e 21º dia pós-operatório houve um aumento
expressivo da área ocupada por fibras colágenas, mas não houve diferença significativa entre
os tratamentos. Somado a isso, foi observado que os animais alocados nos grupos B e CB
apresentaram as fibras colágenas posicionadas de forma mais organizada no 21º dia pós-
operatório em relação aos grupos CS e S (Tabela 1 e Figura 9).
TABELA 1 - Valores, em porcentagem, da mensuração da área ocupada por fibras colágenas de feridas cutâneas
excisionais de coelhos, tratadas com extrato de barbatimão (B), CMMO com extrato barbatimão
(CB), CMMO com solução de NaCl a 0,9% (CS) e solução de NaCl a 0,9% (S) no terceiro,
sétimo, 14º e 21º dia pós-operatório.
A 3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
B CB CS S B CB CS S B CB CS S B CB CS S
M* 0 0 0 0 21,94A 21,06A 12,11B 13,28B 55,38 57,51 54,60 54,50 57,59 58,75 55,96 56,03
DP 0 0 0 0 3,72 2,24 1,09 1,78 4,35 3,63 3,45 3,35 5,85 4,79 2,55 6,53
P - 0,00003 0,533 0,865
A=animal. M=média*Letras diferentes na mesma linha equivalem a diferença entre os tratamentos. DP=desvio
padão. Teste de Tukey empregado entre os tratamentos: BxCB= p>0,05; BxCS= p<0,01; BxS= p<0,01; CBxCS=
p<0,01; CBxS= p<0,01; CSxS= p>0,05.
No terceiro dia pós-operatório, foi observada uma pequena quantidade de células
em proliferação celular em todos os grupos. No sétimo e 14º dias pós-operatórios, evidenciou-
se a maior quantidade de células em proliferação celular e de proteínas AgNOR de forma
similar em todos os grupos. No 21º dia pós-operatório, houve redução significativa nessas
variáveis em todos os grupos, mas não houve diferença entre os tratamentos (Figura 10 e 11).
56
FIGURA 109 - Representações das fotomicrografias de feridas cutâneas excisionais de coelhos, de acordo com tratamento (linhas) e período de avaliação (colunas), pela
técnica de coloração picrosirius, aumento de 400x em microscopia de luz polarizada, demonstrando áreas ocupadas por fibras colágenas representadas pelas
cores que variam do verde ao vermelho intenso. Grupos: B (extrato de barbatimão); CB (extrato de barbatimão com CMMO); CS (CMMO com solução de
NaCl a 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%). Evidencia-se maior quantidade de fibras colágenas nos grupos B e CB no sétimo dia pós-operatório e organização
do posicionamento das fibras colágenas no 21º dia pós-operatório nesses grupos.
57
FIGURA 1110 -Representações gráficas da quantidade de células marcadas (%) pela técnica de coloração AgNOR
(A) e quantidade de grupamentos de proteínas AgNOR (B) no terceiro, sétimo, 14º e 21º dia pós-operatório. Grupos: B (extrato de barbatimão); CB (CMMO com extrato barbatimão); CS (CMMO
com solução de NaCl a 0,9%); e S (solução de NaCl a 0,9%). Eixo X: período de avaliação. Eixo
Y: porcentagem de células marcadas (A) e quantidade de células marcadas (B).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Quantidade de células marcadas (%)
B CB
A
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
3º DIA 7º DIA 14º DIA 21º DIA
Quantidade de AgNOR (unidades)
CS S
B
58
FIGURA 1211 - Representações das fotomicrografias de feridas cutâneas excisionais de coelhos, de acordo com tratamento (linhas) e período de avaliação (colunas), pela
técnica de coloração AgNOR, aumento de 400x em microscopia de luz (escala de cinza), demonstrando proteínas AgNOR representadas por pontos escuros
formando os nucléolos (seta vermelha). Grupos: B (extrato de barbatimão); CB (CMMO com extrato barbatimão); CS (CMMO com solução de NaCl a 0,9%);
e S (solução de NaCl a 0,9%). Observa-se a presença de poucas células em proliferação no terceiro dia pós-operatório e aumento significativo no sétimo e 14º
dia. No 21º dia pós-operatório, evidencia-se a redução da quantidade de células em proliferação.
59
DISCUSSÃO
Neste estudo, o emprego do extrato de barbatimão com uma concentração de
taninos próxima a 8% fundamentou-se na Farmacopeia Brasileira, que recomenda a
concentração mínima de 8% de taninos do barbatimão para fins medicinais25
. Estudos sobre a
cicatrização empregando o barbatimão, comumente, descrevem apenas a concentração
empregada, sem mencionar a concentração de taninos presente. Essa conduta pode gerar
resultados conflitantes, visto que alguns trabalhos apontam o barbatimão como otimizador do
processo de cicatrização22,23
e outros não8,31
. Nesse caso, a não determinação dos níveis de
taninos, principal composto ao qual é conferida a atividade terapêutica do barbatimão5,6,7
,
pode levar a resultados insatisfatórios se os níveis de taninos não forem estabelecidos.
O extrato fluido do barbatimão na formulação empregada não se apresentou
viscoso. Nessas circunstâncias, acreditava-se que essa característica auxiliaria na preservação
e sobrevivência das células, pois ajudaria na conservação das CMMO aderidas à lesão, e não
na solução. Efeito contrário poderia ocorrer, empregando como veículo, pomada ou creme8,23
,
pois a maior densidade e viscosidade desses produtos manteriam as células aderidas ao
medicamento, e não à ferida.
O procedimento de colheita, isolamento e aplicação de CMMO em feridas
mostraram-se facilmente exequíveis, mas é importante ressaltar que o custo dos equipamentos
pode ser um fator limitante para sua popularização na prática clínica. Outros aspectos, como a
produção de fatores de crescimento e citocinas10
e o curto espaço de tempo necessário à
manipulação e aplicação32
, também são benefícios que reforçaram a decisão do uso de
CMMO no presente estudo. Acrescente-se o fato de a possibilidade de rejeição ser mínima,
visto que eram autólogas. Além disso, a preparação da CMMO não requer a expansão de
cultura, minimizando a possibilidade de contaminação33
.
Com base nas análises empregadas, neste estudo, não foi possível comprovar que
as CMMO auxiliem na reparação tecidual. Pode ser que a quantidade de 6x105 de CMMO
administrada por lesão tenha sido insuficiente para desencadear modificações teciduais dentro
do processo de reparação9. No entanto, em outro estudo, empregando quantidades maiores de
CMMO (6,92x106 a 4,91x10
7), o favorecimento do processo de cicatrização também não foi
observado32
. Assim, novos estudos sobre a quantidade mínima necessária de CMMO e até
mesmo os métodos de aplicação, para auxiliar significativamente no processo de cicatrização
de feridas cutâneas, devem ser conduzidos, possibilitando que novas propostas terapêuticas
sejam avaliadas.
60
Acredita-se que o emprego da membrana semipermeável de poliuretano teve
importância fundamental no protocolo adotado, pois protegeu a ferida contra sujidades na fase
inflamatória do processo de reparação tecidual. Sua presença também pode ter auxiliado na
manutenção do extrato de barbatimão em contato com a ferida por um tempo maior. Essa
situação pode ter proporcionado um ambiente adequado para a atuação das CMMO, pois
haveria menor risco de contaminação. Igualmente, a presença da membrana pode ter auxiliado
na manutenção das CMMO no leito ferida34
. Apesar de essas possibilidades terem sido
consideradas, o efeito das CMMO não pôde ser comprovado.
Mesmo não havendo diferença entre os parâmetros clínicos avaliados é importante
ressaltar que os grupos que receberam o extrato de barbatimão apresentaram a formação de
uma crosta mais exuberante, que também foi evidenciada nas avaliações histológicas, nesses
grupos, indicando que os taninos promoveram a precipitação de proteínas7 e permitiram o
desenvolvimento da cicatrização normalmente abaixo da crosta.
Quanto aos achados microscópicos das feridas, quando se empregou a coloração
de HE, verificou-se que a cicatrização ocorreu no tempo fisiológico em todos os grupos1,35
.
Na fase inflamatória ficou evidente a presença da maior quantidade de células
polimorfoncleares. A fase de proliferação mostrou a angiogênese e a fibroplasia de forma
moderada e na fase de remodelação, ficou nítida a maior organização do tecido cicatricial. A
estimulação da reepitelização promovida pelo barbatimão, descrita por Hernandes e
colaboradores8,não foi constatada neste estudo, o que pode estar relacionado à menor
concentração de taninos do extrato utilizado.
A mensuração da área ocupada por fibras colágenas na ferida, empregando a
técnica de coloração picrosirius, mostrou-se um método simples, reprodutível e com alta
especificidade para a avaliação da evolução cicatricial. A técnica possibilitou que o colágeno
aparecesse com aspecto brilhante sob a luz polarizada com fundo escuro, impedindo qualquer
possibilidade de conflito com outros elementos presentes no tecido19
. A ausência de fibras
colágenas no terceiro dia pós-operatório está dentro da resposta fisiológica do organismo à
lesão tecidual, pois a fibroplasia ainda não está presente1,35
. Já a maior porcentagem de área
ocupada por fibras colágenas nos animais alocados nos grupos B e CB, no sétimo dia pós-
operatório, provavelmente ocorreu em virtude da utilização do barbatimão, pois não foi
observada diferença entre esses dois tratamentosnesse período de avaliação, mas sim em
relação aos outros grupos. Como essas características não foram observadas aos 14 e 21 dias
do pós-operatório, infere-se que o barbatimão atuou sobre a produção de fibras colágenas na
fase inicial da cicatrização.
61
O efeito do barbatimão sobre a síntese de colágeno talvez esteja relacionado com
os fibroblastos ativados por fatores de crescimento, como o fator derivado de plaquetas
(PDGF), responsável por estimular a fibroplasia, além do fator de crescimento transformador
β (TGF- β), responsável por estimular a síntese de colágeno para formação de novo tecido
conjuntivo na lesão36
. Foi possível observar que os animais dos grupos B e CB apresentaram
as fibras colágenas mais organizadas no 21º dia pós-operatório, o que pode representar o
favorecimento do processo de cicatrização, visto que a disposição organizada das fibras
colágenas confere à cicatriz maior resistência e melhor aparência estética37
.
Sobre a avaliação da cicatrização, empregando técnicas de coloração especiais
para o colágeno, como o picrosirius, não foram encontrados estudos envolvendo o
barbatimão. Sobre esse tema, outros estudos se limitaram7,8,23,38
a descrever achados
macroscópicos ou histológicos empregando a coloração de hematoxilina e eosina. Essa
constatação dificultou a comparação dos resultados deste estudo com outras pesquisas. Ainda
dentro desse tema, a proliferação celular, avaliada durante o processo de cicatrização, foi uma
tentativa de se comprovar o efeito do extrato do barbatimão sobre a cicatrização,
fundamentando-se na descrição de que o barbatimão estimularia a proliferação de
queratinócitos8. Dessa forma, buscou-se verificar se esse fitoterápico influenciaria de alguma
forma a proliferação de outros tipos celulares, como fibroblastos e células endoteliais,
fundamentais à cicatrização39
, o que não foi observado.
A quantidade baixa de células em proliferação e de proteínas AgNOR em todos os
animais no terceiro dia pós-operatório, caracterizou a fase inflamatória da cicatrização. Já no
sétimo e 14º dia pós-operatório, a resposta tecidual representou a fase proliferativa da
cicatrização, que ocorre geralmente a partir do quarto dia e se prolonga até o 14º dia após a
lesão, e caracteriza-se pelo aumento substancial na quantidade de fibroblastos e angiogênese
que compõem o tecido de granulação1,35
. Como no 21º dia pós-operatório, a quantidade de
células em proliferação e a quantidade de proteínas AgNOR decaíram, ficou evidenciado que
a fase de remodelação da cicatrização havia se instalado, pois apresenta proliferação celular
reduzida1. Esperava-se que a terapia com CMMO pudesse estimular a proliferação celular,
nos grupos B e CB, por serem apontadas como liberadoras de fatores de crescimento que
estimulam a cicatrização10
, mas essa particularidade não ficou comprovada. Portanto, diante
desse achado conflitante, a terapia celular, utilizando CMMO ainda necessita de estudos
aprofundados para se compreender sua eficácia e mecanismos de ação, para melhorar as
técnicas de obtenção e sua aplicabilidade.
62
Correlacionando os dados de produção de fibras colágenas e de proliferação
celular, supõe-se que o barbatimão atuou na estimulação da produção dessas fibras, visto que
não houve o aumento da proliferação celular no sétimo dia pós-operatório em relação aos
outros grupos. Nesse momento, a área ocupada por fibras colágenas apresentou-se em
quantidades muito superiores nos animais dos grupos B e CB. Como a resposta do processo
cicatricial, frente às substâncias naturais de uso popular com atividade biológica, pode ocorrer
em fases variadas da cicatrização40
, a maior deposição de fibras colágenas na fase inicial do
reparo pode ser favorável àcura da ferida.
Ainda que a terapia com CMMO não tenha apresentado resultados promissores no
que tange à reparação cutânea, acredita-se que novos estudos com essa modalidade
terapêutica devam ser desenvolvidos,empregando maior quantidade células. Outras pesquisas
analisando o potencial dessa terapia em feridas de difícil cicatrização também devem ser
propostas, porém, reconhece-se que este é um protocolo contraindicado no caso de feridas
contaminadas. O emprego dessa terapia em cirurgias reconstrutivas ou em feridas de pacientes
diabéticos pode ser sugerido, pois, nesse caso, o tempo de reparação tecidual deverá ser o
mais breve possível para restabelecimento estrutural, estético e funcional da pele.
Apesar da popularidade do barbatimão como coadjuvante na cicatrização,
ressalta-se que sua composição química pode variar substancialmente em decorrência de
vários fatores, como o período sazonal da colheita, a parte da planta utilizada, a técnica de
extração da matéria-primae o método de processamento. Desse modo, muito ainda se tem a
evoluir quanto ao emprego e pesquisa do barbatimão na Medicina Veterinária, pois a maioria
dos estudos in vivo que utilizam essa planta como coadjuvante na cicatrização não
caracterizam adequadamente as substâncias que participam da sua composição química.
Embora as técnicas de avaliação por inspeção, morfometria digital, histologia
(HE) e histoquímicas (coloração AgNOR e picrosirius)tenham se apresentado adequadas para
analisar a evolução do processo de cicatrização de feridas e das respostas teciduais, é preciso
utilizar técnicas mais avançadas em busca de eventos não identificados por esses exames.
Dentre os testes mais específicos e sensíveis que poderiam ser empregados, os de biologia
molecular, como Western blot,imunohistoquímica e a marcação de células-tronco
mesenquimais poderiam elucidar melhor a atuação da terapia celular e do barbatimão na
reparação tecidual.
63
CONCLUSÃO
Com base na metodologia aqui adotada, na fase inicial da cicatrização, o barbatimão
estimula a produção de fibras colágenas e promove a formação de crostas mais exuberantes
sobre a ferida e, na fase de remodelação, favorece a organização das fibras colágenas. No
entanto, a associação desse fitoterápico às células mononucleares autólogas da medula óssea
não estimula a cicatrização de feridas excisionais de coelhos.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) pelo financiamento da
pesquisa. À Farmácia de Manipulação Animalle (Goiânia - GO) e à Guabi (Anápolis-GO)
pelo provimento de insumos.
CONFLITO DE INTERESSES
Não há conflito de interesses em relação ao presente artigo.
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67
CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS
A cicatrização de feridas é um tema de grande importância na prática clínica e
cirúrgica de animais de companhia e produção. A escolha do protocolo terapêutico deve se
basear nas necessidades clínicas do paciente e também no custo necessário para o tratamento.
No que tange ao processamento e isolamento de CMMO, o custo dos equipamentos ainda é
elevado, o que pode limitar seu uso prático. Diferentemente, o barbatimão é de fácil obtenção,
o processamento é simples e apresenta custo acessível, motivos que estimulam sua utilização
na rotina clínica para o tratamento de feridas, mas é preciso empregá-lo de maneira
sustentável.
Os verdadeiros mecanismos de ação, tanto dos fitoterápicos como das células
mononucleares ainda são motivos de especulação. Portanto, ao escolher o extrato de
barbatimão e as células mononucleares autólogas da medula óssea, para compor protocolos
terapêuticos experimentais envolvendo a cicatrização de feridas cutâneas, é importante a
participação de uma equipe multidisciplinar. O envolvimento de diferentes áreas do
conhecimento como clínica médica, cirurgia, patologia, farmacologia e patologia
clínicaengrandece essa modalidade de estudo, além de ser fundamental para a formulação de
protocolos terapêuticos mais elaborados e que apresentem bons resultados.
Embora as técnicas de colheita, isolamento e aplicação de CMMO se mostrem
facilmente exequíveis, o processo requer treinamento básico das pessoas envolvidas, tendo em
vista que a ocorrência de falhas metodológicas podem comprometer a efetividade dessa
terapia e causar elevados prejuízos econômicos. Assim, antes de iniciar pesquisas envolvendo
essa modalidade terapêutica, a execução de um projeto piloto, o processamento do material
colhido da medula em laboratório, a capacitação dos participantes e o treinamento de
protocolos envolvendo a terapia celular são fundamentais para a padronização dos
procedimentos experimentais empregados no estudo.
Ainda que a terapia com CMMO não apresente somente resultados promissores
na reparação tecidual, acredita-se que estudos com essa modalidade terapêutica devam ser
desenvolvidos,empregando células em maior quantidade. Outras pesquisas avaliando o
potencial dessa terapia em feridas de difícil cicatrização também devem ser propostas, à
exceção de feridas contaminadas, pois seu uso é contraindicado. O emprego dessa terapia em
cirurgias reconstrutivas e feridas isquêmicas, talvez seja um campo de pesquisa promissor,
visando à redução do tempo de reparação tecidual para restabelecimento estrutural, estético e
funcional da pele.
68
Apesar da popularidade do barbatimão como auxiliar no processo de cicatrização,
é importante ressaltar que a composição química desse fitoterápico pode variar
consideravelmente em decorrência de vários fatores, como o método de extração e a parte da
planta empregada como matéria-prima, o período sazonal da colheita, localização geográfica
da planta e o método de processamento. Desta forma, muito ainda se tem a evoluir quanto ao
emprego do barbatimão na Medicina Veterinária, pois, a maioria dos estudos in vivo que
utilizam esta planta como cicatrizante não caracterizam adequadamente as substâncias que
participam da sua composição.
A quantificação de taninos no extrato de barbatimão é uma análise básica para a
determinação do efeito cicatrizante, visto que o tanino é o responsável pela propriedade
terapêutica desse fitoterápico. A não quantificação dos componentes existentes no extrato da
plantapode gerar resultados conflitantes quanto ao benefício do barbatimão, comprometendo o
seu emprego na prática clínica e sua aceitação por indústrias farmacêuticas. Portanto, estudos
empregando o barbatimão com diferentes concentrações de taninos são fundamentais para
determinar a concentração mínima necessária para a otimização no processo de cicatrização.
Apesar das técnicas de avaliação por inspeção, morfometria digital, histologia
(hematoxilina e eosina)e histoquímicas (coloração AgNOR e picrosirius), empregadas para
analisar a evolução do processo cicatricial e das respostas teciduais, de acordo com o
tratamentotenham se apresentado adequadas, é preciso utilizar técnicas mais avançadas em
busca de eventos não identificados por esses exames. Como exemplos de testes mais sensíveis
e específicos podem-se citar os testes de biologia molecular, como imunohistoquímica,
Western blot e a marcação de células-tronco mesenquimais poderiam elucidar melhor a
atuação do barbatimão e da terapia celular na reparação tecidual.
Atividades práticas e de pesquisa nas áreas de clínica e cirurgia animal, apontam
que o emprego do extrato da casca de barbatimão mostra-se eficiente para o tratamento de
alguns tipos de feridas de difícil cicatrização em diferentes espécies animais, principalmente
feridas contaminadas e extensas. Essas observações indicam que o uso desse fitoterápico no
tratamento de feridas ainda poderá ser alvo de inúmeras pesquisas, pois muitos constituintes
com propriedades medicinais desse medicamento ainda não foram caracterizados e isolados.
Na oportunidade da repetição deste tema de pesquisa, a utilização de uma maior
quantidade de CMMO e a marcação de células-tronco mesenquimais dessa fração celular,
além do emprego do extrato do barbatimão em diferentes concentrações de taninos, poderiam
demonstrar resultados mais promissores com essas terapias. No entanto, para a realização
desses procedimentos um número bem maior de animais será necessário, o que talvez
69
impossibilite o emprego do coelho como modelo animal, sendo a utilização de espécies
animais menores, como roedores, mais adequada para a adoção destes procedimentos.
Por último, com o conhecimento dos constituintes terapêuticos de plantas
medicinais existentes na flora brasileira, ocorrerá a valorização de inúmeras espécies vegetais,
e, consequentemente, várias ações de desenvolvimento sustentável para a utilização dos
recursos florestais poderão ser adotadas. Acrescentem-se os registros de patentes feitos por
pesquisadores nacionais que poderão minimizar a evasão de divisas decorrentes dos registros
de princípios ativos extraídos da flora existente no Brasil, realizados por empresas
estrangeiras.
70
ANEXO I
Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais/UFG do projeto de pesquisa intitulado
“Terapia celular associada ao extrato de barbatimão (Stryphnodendron sp) na
cicatrização de feridas cutâneas em coelhos”.
