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Fabiane Maria Lima SousaMestranda PPGZ-UFC
Orient.: Prof.: Arlindo Moura
A digestão é necessária para que todas as partes da proteína fiquem uniformemente expostas à dissociação e ionização, e para aumentar a eficiência desses processos.
As bandas/spots protéicos correspondentes à proteína de interesse serão: 1. Excisadas 2. Descoradas 3. Submetidas à digestão enzimática
Imagem gerada pelo PDQuest: Master gel
Proteases normalmente utilizadas:o Quimotripsinao Pepsinao Carboxipeptidaseso Aminopeptidaseso Tripsina ou uma combinação delas
CapacidadePrevisibilidadeDisponibilidade
Cuidados no procedimento Manter o gel umedecido com água destilada para evitar o ressecamento. Deve-se usar reagentes de boa qualidade e procedência conhecida. Durante os procedimentos de corte e digestão, é importante o uso de luvas, jaleco de mangas compridas, e, se possível, touca e máscara, para evitar contaminações, a principal é a queratina humana.
Etapas do procedimentoExcisão ou corte dos spots
o Spot no gel, é cortado no centro e dividido em pedaços menores.
o Existem os métodos manuais (tesoura, bisturi ou gilete), e existe um método computadorizado (spot picker).
Excisão manual com bisturi
Método computadorizado (Spot picker)
Lavagem do gel
o Solução de acetonitrila/bicarbonato de amônioo Desidratado o gel com acetonitrilao Remover a acetonitrila e secar completamente
os géis no Speed Vac.
Digestão com tripsinao Solução de tripsina diluída será distribuída de
forma a cobrir os pedaços de gel.o Extração dos peptídeos (por meio de
lavagens)com ácido fórmico 5% ou TFA 5%/ acetonitrila 50%.
o Concentrar as amostras .
Gel separation – 1D or 2D
ExciseSpot
Trypsin Digest
Protein Peptides
