FACULDADE DE ODONTOLOGIA “DR. MÁRIO LEITE BRAGA” DE PRESIDENTE PRUDENTE

ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR DO Bifidobacterium animalis subsp.

lactis HN019 EM SOLUÇÃO SALINA.

DISCENTES: BIANCA CRISTINA TIOSSO DA SILVA ÉDER DA SILVA DÓLENS YARA LOYANNE DE ALMEIDA SILVA LEVI

PRESIDENTE PRUDENTE – SP 2017

RESPONSÁVEL: PROFª. DRA. LUCIANA PRADO MAIA COLABORADORA: PROFª. DRA. FABIANA GOUVEIA STRAIOTO

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 4

2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 7

3 MATERIAL E MÉTODO .............................................................................................. 8

4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS ............................................................. 11

5 RESULTADOS ESPERADOS ................................................................................... 12

REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 13

RESUMO

ANÁLISE DA VIABILIDADE DO Bifidobacterium animalis subsp. lactis HN019 EM SOLUÇÃO SALINA.

Introdução: Os probióticos são microrganismos vivos que conferem benefícios a

saúde quando consumidos em quantidades adequadas, sendo indicados para

prevenir e tratar doenças. Os efeitos do uso de probióticos na saúde bucal vêm

sendo investigados, porém, estudos in vitro são necessários para estabelecer

protocolos de utilização dessa nova abordagem terapêutica. Objetivo: O objetivo do

estudo será analisar a viabilidade celular de microrganismos do gênero

Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. lactis) HN019 presentes em solução salina

em condições de armazenamento laboratorial (4oC) e em condições do biotério

(temperatura ambiente). Material e Métodos: Este estudo será in vitro, cego,

totalmente aleatorizado, realizado em triplicata, em 3 experimentos independentes.

Cepas liofilizadas de B. lactis HN019 serão reativadas e posteriormente mantidas

em solução salina em temperatura ambiente, a 4oC e 37oC por 48 horas. Será

realizado monitoramento do padrão de crescimento por meio de leitura da turbidez e

contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). O crescimento do

microrganismo será monitorado a cada 1 hora por meio de leitura do comprimento

de onda e realização de diluição seriada do inóculo a cada leitura. Forma de Análise dos Resultados: Os dados referentes aos valores de turbidez e sua

relação com o número de UFC serão tabulados e a escolha do teste estatístico será

definida após a análise exploratória dos dados. O nível de significância de 5% será

utilizado nas análises. Resultados Esperados: Espera-se com este estudo obter

padronização para utilização de bactérias probióticas do gênero Bifidobacterium

animalis subsp. lactis HN019 em estudos in vivo em animais.

Palavras-chave: Bactérias, Probióticos, Meios de Cultura.

4

1 INTRODUÇÃO

O probiótico é definido como um suplemento alimentar contendo microrganismos

vivos, os quais afetam beneficamente o hospedeiro, melhorando o balanço da microbiota

intestinal, normalmente são indicados para prevenir e tratar doenças. Podendo ser

encontrados em alimentos industrializados presentes no mercado, como leites fermentados e

iogurtes, alimentos fermentados de forma caseira como as coalhadas, queijos, bebidas

frutais. A fermentação usando probióticos é utilizada para a preservação de uma série de

produtos agrícolas sem processar, como cereais, raízes, tubérculos, frutas e hortaliças, leite,

carne, peixe, entre outras1,2. Possui características potencializadoras da redução de riscos

de doenças crônicas, além de proporcionar saúde e bem-estar3.

Durante a última década, a identificação de bactérias associadas à saúde e

potencialmente benéficas que podem residir no sulco gengival e na cavidade oral tem sido

tema de numerosos estudos focados na prevenção e tratamento de doenças4. O consumo de

probióticos pode modificar a flora bacteriana e modular a resposta imunológica5. Pesquisas

mostram a eficácia do probiótico favorecendo a atividade fagocítica inespecífica dos

macrófagos alveolares, sugerindo uma ação sistêmica por secreção de mediadores que

estimulariam o sistema autoimune, atuando, também, no equilíbrio da microbiota intestinal,

alívio da constipação, imunomodulação, prevenção do câncer de cólon, prevenção de

eczemas atópicos, atividade supressiva contra patógenos gastrintestinais, prevenção de

patologias do trato urogenital feminino, desordens intestinais, entre outros, levando a um

aumento da resistência contra a infecção2,6. Esses microrganismos possuem fonte de

compostos bioativos que apresentam promissores efeitos benéficos no metabolismo ósseo e

muscular1,5. Sua colonização no trato gastrintestinal através da competição por sítios de

adesão, restabelece a microflora intestinal após danos quimioterápicos6. Embora resultados

promissores tenham sido relatados na literatura, é importante lembrar que os achados

obtidos sobre os probióticos não podem ser generalizados, uma vez que dependem da

dosagem, frequência e via de administração2.

Estudos clínicos sugerem que os probióticos são seguros para a saúde e podem ter

efeitos positivos sobre a saúde bucal. A maioria dos estudos envolvendo sua utilização na

saúde bucal concentram-se em medidas que visam diminuir a quantidade de Streptococcus

5

mutans, cuja presença é considerada um importante fator de risco para o desenvolvimento

de cárie7. Na doença periodontal, os probióticos podem minimizar a aderência de bactérias

patogênicas, assim como seu estabelecimento, multiplicação e integração. Além de modular

a resposta imune-inflamatória desencadeada pelos patógenos periodontais6,8. Os principais

microrganismos utilizados como probióticos são bactérias dos gêneros Lactobacillus,

Enterococcus, Bacillus e Bifidobacterium6,9–11. Até o momento, estudos que investigaram os

efeitos dos probióticos sobre doenças periodontais utilizaram principalmente

microorganismos do gênero Lactobacillus8. No entanto, surgiram relatos que identificaram os

Lactobacillus associados com condições clínicas patológicas, como bacteremia12 e,

ocasionalmente, endocartite e abscesso13, apesar de ser improvável que os Lactobacillus

fossem os agentes causais nesses casos13. De qualquer forma, essas observações,

juntamente com a emergência de cepas resistentes à vancomicina na prática clínica14,

resultaram em uma preocupação quanto a segurança do seu uso. Nesse contexto, outros

potenciais probióticos merecem ser investigados.

A Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. Lactis) possui propriedades

imunomodulatórias e antimicrobianas15, geralmente está presente na microbiota intestinal, e

apresenta um relacionamento simbiótico com o hospedeiro16. Alguns estudos demonstraram

que a B. Lactis pode diminuir o crescimento de Streptococcus mutans sem causar efeitos

adversos, contribuindo na prevenção da cárie dentária17. Pode também inibir o crescimento

de periodonto patógenos na cavidade oral18, reduzir a quantidade de biofilme bacteriano nas

superfícies dentárias, bem como o índice de placa e o índice gengival em indivíduos

saudáveis6, sendo considerada um probiótico promissor. Apesar das evidências, são poucos

os estudos que têm avaliado os efeitos da suplementação probiótica com bactérias do

gênero Bifidobacterium na periodontite.

O microrganismo B. lactis HN019 (Dupont® de Nemoursand Company, Wilmington,

DE, EUA) foi introduzido mais recentemente como probiótico, sendo comercializado como

um ingrediente para suplementação dietética e produtos fermentados e está disponível em

diferentes produtos (formato de liberação, dose, combinado com outros ingredientes ativos.

O B. lactis HN019 foi isolado de um iogurte comercial e mantido como cepa e consiste em

um bastonete Gram-positivo com morfologia irregular19. Estudos in vitro reportaram

6

propriedades anti-infecciosas e de melhora na resposta imunológica20–23, além de não

exibirem toxicidade oral ou patogenicidade em ratos ou humanos20,24.

Considerando que os B. lactis possam ser um importante aliado na prevenção e no

tratamento de doenças bucais, a determinação de um protocolo de manutenção destes

microrganismos viáveis para desenvolvimento de estudos experimentais em animais que

visem garantir a reprodutibilidade, qualidade dos ensaios e a credibilidade dos resultados é

de suma importância para a estruturação dos futuros pilares da terapia probiótica.

Previamente à utilização desse microorganismo probiótico em estudos experimentais em

animais, é importante padronizar as condições de manutenção e armazenamento da solução

contendo probiótico, considerando a necessidade de otimização de tempo dos experimentos

e uso racional do microrganismo com finalidade de reduzir custos.

7

2 OBJETIVO

O objetivo do estudo será analisar a viabilidade celular de microrganismos do gênero

Bifidobacterium animalis subsp. Lactis (B. lactis) HN019 presentes em solução salina em

condições de armazenamento laboratorial (4oC), em condições do biotério (temperatura

ambiente) e em condições de cultivo normal (37oC).

8

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Desenho experimental Este estudo será in vitro, cego (um dos pesquisadores criará um código de

identificação dos grupos experimentais que será desconhecido pelos operadores), totalmente

aleatorizado. Com objetivo de garantir a reprodutibilidade e padronização dos experimentos,

os mesmos serão realizados em quadruplicata, em 3 experimentos independentes (ou seja,

realizados em dias diferentes) (n=12). Cepas liofilizadas de B. lactis HN019 serão reativadas

e resuspendidas em solução salina em temperatura ambiente, a 4oC e 37oC por 48hs. Será

realizado monitoramento do padrão de crescimento por meio de leitura da turbidez e

contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC).

3.2 Reativação dos Microrganismos Cepas de estoque liofilizadas de B. lactis HN019 (HOWARUTM Bifido, E. I. Dupont® de

Nemoursand Company) serão reativadas em 10 ml de caldo MRS (Man Rogosa and Sharpe,

Difco, Sparks, MD, USA. Deste caldo serão coletadas alçadas para serem semeadas em

placa de petri, contendo Agar MRS enriquecido com L-cisticina (Difco), pela técnica do

esgotamento, a fim de isolar colônias e verificar sua pureza. Estas placas serão

armazenadas por 48h a 37ºC em condições anaeróbicas para favorecer o crescimento da

colônia, decorrido esse tempo a placa contendo a cultura será armazenada em resfriamento

a 2ºC25.

3.3 Monitoramento da viabilidade celular: Para a análise de viabilidade celular da população bacteriana B. lactis HN019 em

salina será realizada curva de crescimento por meio de mensurações sequenciais (intervalos

de 1 hora) da turbidez de solução contendo microrganismo em espectrofotômetro com

comprimento de onda igual a 600nm25. Para cada hora de leitura será realizada a

quantificação de UFC estabelecendo a relação do valor da leitura de espectrofotometria x

número de células durante 48 horas de acordo com as seguintes condições experimentais:

• Grupo 1: solução salina em temperatura ambiente

• Grupo 2: solução salina a 4oC

9

• Grupo 3: solução salina em 37oC em anaerobiose (controle)

Para início do experimento colônias do microrganismo serão individualmente

ressuspensas 1,5 x 108 unidades formadoras de colônia (UFC)4 em 10 ml de salina e

armazenado de acordo com a condição experimental de cada grupo. A suspensão será

agitada por 15 segundos e a turbidez imediatamente verificada por meio de

espectrofotômetro (DU®-65, Beckman, Coulter Inc., Fullerton, CA, USA) a 600 nm.

Dessa forma será possível determinar o período que a cepa em questão entra na fase

estacionária, a qual é caracterizada por diminuição significativa da taxa de crescimento

devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo,

mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de

morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A curva

de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a

taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou

incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente

desfavoráveis.

3.4 Quantificação de Microrganismos A quantificação do microrganismo será por meio da contagem de UFC e os valores

obtidos por espectrometria. A suspensão após a leitura em espectrofotômetro contendo os

microrganismos será vortexada por 1 minuto e a suspensão será diluída serialmente até a

proporção de 1:100.000.000 (10-8) em solução salina. Para isto, uma amostra inicial de cada

repetição de grupo experimental (100 μL) obtida em cada 1 hora de crescimentos dos grupos

experimentais deverá ser diluída de forma seriada em microtubos com salina contendo 900

μL de solução salina estéril. O processo será repetido no mínimo em 6 diluições para que a

concentração de microrganismos diminua, dando origem a colônias suficientemente

separadas, possibilitando assim a contagem. Para a determinação do número de

microrganismos da amostra original multiplica-se o número de colônias formadas a partir da

amostra diluída, pelo volume de diluição. Uma diluição é uma expressão de concentração,

não de volume.

As diluições serão semeadas em placas de petri contendo o meio de cultura Agar

MRS para determinação do microrganismo. A semeadura será realizada pela deposição de

10

alíquotas (20 μL) destas diluições em duplicata nas placas. As placas serão incubadas em

estufa a 37º C por 48h em anaerobiose. As unidades formadoras de colônia (UFC) serão

contadas nas diluições que permitam a visualização das colônias isoladas e os resultados

serão expressos em UFC/ml. (Figura 1)26. .

Figura 1: Placas após semeadura e crescimento dos microrganismos para contagem e

cálculo das UFC/ml.

11

4 FORMA DE ANÁLISE DOS RESULTADOS

Os dados referentes aos valores de turbidez e sua relação com o número de UFC

serão tabulados e a escolha do teste estatístico será definida após a análise exploratória dos

dados. Se observada distribuição normal, será utilizado Teste T para comparações entre os

grupos. No caso de distribuição não-normal será utilizado o teste de Mann Whitney. O nível

de significância de 5% será utilizado nas análises.

12

5 RESULTADOS ESPERADOS

Espera-se com este estudo determinar por quanto tempo o microrganismo probiótico

B. lactis HN019 ficará viável em solução salina em condições de armazenamento

laboratoriao (4oC) e em condições do biotério (temperatura ambiente), com finalidade de

obter padronização e eficiência da aplicação desses microrganismos para estudos in vivo em

animais, estabelecendo assim, um protocolo para execução de pesquisa com estes

microrganismos na instituição.

13

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