ウェスタンブロッティング攻略ガイド（2014 …...E L E C T R O P H O R E S I S B L O T T I N G A N T I B O D Y D E T E C T I O N GE ヘルスケア・ジャパン

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ウェスタンブロッティング攻略ガイド

ECL実験ノート／トラブルシューティング抜粋ウェスタンブロッティング検出プロトコール

71-3742-31

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ウェスタンブロッティング Webサイトwww.gelifesciences.co.jp>> ECL 検索

8

改訂版2014

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2014 改訂版

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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント

トラブルシューティング

準備

　 …ご注意　 …トラブルシュート　 …プロトコールを変更できる箇所　 …より詳しい情報　

ECL Prime ウェスタンブロッティング検出プロトコール（1/5）

ECL Prime ウェスタンブロッティング検出プロトコール・コピーして、実験ノートに貼ってご使用いただくと便利です。・チェックボックス（□）にチェックを入れながら作業していただくと確実です。・「メモ実験条件メモ」には実験条件を記録していただけます。

必要な装置・試薬

3ページの必要な装置・試薬リストをご参照ください ECL Prime Western Blotting Detection Reagents（RPN2232）

ECL Prime Starter Kit Core（72-AS01-20）下表試薬が入っており、はじめて行っていただく際に便利です。

ECL Prime（RPN2232） HRP標識二次抗体ブロッキング剤分子量マーカーメンブレン X線フィルム○ ○ ○ ーーー

実験計画のポイント

「1.電気泳動」から「2.ブロッティング」までは連続的に作業を行うので、あらかじめ所要時間や必要な装置・試薬の準備を確認しましょう（10× 8 cmのミニゲルでは電気泳動で 4時間、ブロッティングで 2時間が目安です）。

抗体の希釈率を検討しておくことで、より確実に結果を得ることができます（参照 83ページ）。

1.　電気泳動

SDS-PAGEでタンパク質を分離します（参照 55～ 64ページ：電気泳動）。アプライするタンパク質量が多すぎるとエクストラバンドが出ることがあります。サンプルの濃度がわからない場合はアプライ量を段階的に分けることをおすすめします。

Rainbow Molecular Weight Markersや ECL DualVue Western Blotting Markersなどの有色マーカー（参照 58ページ）を同時に泳動すると電気泳動やブロッティング効率の確認ができるため便利です。

ポジティブコントロールやネガティブコントロールを同時に泳動することをおすすめします。複数のバンドが検出されたときにどれが目的のタンパク質か確認できます。

メモ実験条件メモ

ゲル濃度ランニングゲル：　　　　　％　スタッキングゲル：　　　　　％泳動バッファー種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：泳動時間：　　　　　　min　電流：　　　　　　mA

2.　ブロッティング準備

メンブレンの選択（参照 70ページ）ニトロセルロースメンブレンの場合･･･10分間ブロッティングバッファーに浸して平衡化します。

PVDFメンブレンの場合･･･100%メタノールによる親水化処理を行います（参照 71ページ）。ブロッティングバッファーを準備します（参照 72ページ）。

SDS-PAGEによって分離したタンパク質を Amersham Hybond PVDF（または Amersham Protran Premium NC）へブロッティングします（参照 69～ 74ページ：ブロッティング）。

ブロッティング後のメンブレンはゲルと接していた面（ブロット面）を覚えておく必要があります。メンブレンの右端をカットするなどして目印をつけておいてください。

すぐに検出しないメンブレンは、風乾後、デシケーター中で 2～ 8℃で 3ヶ月まで保存できます。ただし、乾燥させたときの乾燥ムラがバックグラウンドとして検出されることがあります。リプロービングの予定がある場合はメンブレンを乾燥させないでください。


メンブレン製品名：　　　　　　　　　ロット：ブロッティングバッファー

種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：

ブロッティング時間：　　　　　　min　電流：　　　　　　mA

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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



3.　ブロッキング準備

検出まで連続的に作業するため前もって準備しておきます。

ブロッキングバッファー（2％ ECL Prime Blocking Reagent（RPN418）in PBS-T or TBS-Tまたは 5％スキムミルク in PBS-T or TBS-T）の調製

洗浄バッファー（PBS-T or TBS-T）の調製（参照 4ページ）一次抗体、二次抗体の希釈 CCDイメージャー or 暗室の予約

1 ブロッティング後のメンブレンをブロッキングバッファーに浸します。

検出後、バックグラウンドが高くなった場合は、PBS-T or TBS-T の Tween 20濃度およびブロッキング時間、温度を検討します（参照 80ページ）。

メンブレン上の有色マーカーによりブロッティングの状態を確認できます。

2 室温で 1時間、もしくは 2～ 8℃でオーバーナイト振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

メンブレンはブロッキングバッファー中に 4℃で一晩浸しておくこともできます。

3 新しい洗浄バッファーに浸して振盪します。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2） Check 　□ 2分　□ 2分

1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。

ブロッキング後のメンブレンは PBS or TBS中、4℃で数日間保存可能です。


ブロッキング剤種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：洗浄バッファー種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：

4．一次抗体反応

1 PBS-T or TBS-Tで希釈した一次抗体にメンブレンを浸します。

一次抗体の希釈率は PVDFメンブレンを使用した場合、1：1,000～ 1：30,000を目安に実験を始めます。

バンドが薄い、エキストラバンドが出るなどのトラブルが生じた場合は希釈倍率を検討する必要があります（参照 83ページ）。

2 室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

最適なインキュベーション時間、温度は抗体により異なるため必要に応じて検討します。

3 新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2、15分間× 1、5分間× 3）

Check 　□ 2分　□ 2分　□ 15分　□ 5分　□ 5分　□ 5分 1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。


一次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：

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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

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ワンポイント


準備



5.　二次抗体反応

1 PBS-T or TBS-Tで希釈した HRP標識二次抗体にメンブレンを浸します。

ECL DualVue Western Blotting Markers使用時には HRP標識 S-proteinを希釈液に加えます（参照 60ページ）。

二次抗体の希釈率は PVDFメンブレンを使用した場合、1:50,000～ 1:250,000が目安です。

【ビオチン化二次抗体 -HRP標識ストレプトアビジンの系で検出する場合】 1 PBS-T or TBS-Tで希釈したビオチン化二次抗体にメンブレンを浸します。

【 1 でビオチン化二次抗体をご使用の場合、以下の操作で行います】 4 PBS-T or TBS-Tで希釈した HRP標識ストレプトアビジン（RPN1231-2ML）にメンブレンを浸します。

5 室温で 45分間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

検出後のバンドが薄かった場合は 45～ 60分に変更可能です。

6 新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。　（2分間× 2、15分間× 1、5分間× 3） Check 　□ 2分　□ 2分　□ 15分　□ 5分　□ 5分　□ 5分

1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。

2 室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）


3 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して室温で振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2、15分間× 1、5分間× 3）


ビオチン化抗体を使用しない場合は 6.検出に進みます。


二次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：

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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



6.　検出ここでは Amersham Imager 600シリーズや Image Quant LAS 500のような CCDイメージャーを用いた検出方法と X線フィルムでの検出方法をご説明します。メンブレンを CCDイメージャーで検出することで定量性を高めることができます。

準備

検出試薬の調製（1）ECL Primeの Solution A、Solution Bを室温に戻します。（2）Solution A：Solution B＝ 1：1の割合で混合します。

メンブレン 1 cm2あたり 0.1 mlの検出試薬が必要です。8× 10 cmのメンブレンの場合は 4 ml Solution A、4 ml Solution Bを目安に混合します。

検出試薬は使用直前に混合してください。やむを得ずしばらく（2時間以内）置く場合はホイルで包むか暗所に保存します。

CCDイメージャーの起動（CCDイメージャーでの検出の場合）　　 Amersham Imager 600本体とコントロールソフトウェアを起動します。

1 ラップ上にブロット面が上になるようにメンブレンを置き、全体を覆うように検出試薬をかけます。

メンブレン上に余分な洗浄バッファーが残っているとバックグラウンドが高くなる原因になりますので水気を切ってから行います。

2 5分間、室温で静置します。

4 新しいラップや OHPシートでメンブレンを包みます。気泡が入ったり、皺がよらないようにしてください。

3 メンブレンをピンセットで慎重につまみ上げ、端を紙製のウエス（キムワイプなど）につけて余分な検出試薬を取り除きます。

余分な検出試薬が残っているとバックグラウンドが高くなる原因になります。

5 Blackトレイにブロット面を上にして置きます。Blackトレイを Amersham Imager 600本体に入れ、扉を閉じます。

6 メソッドで Chemiluminescence（化学発光）を選択し、露出方法や時間を実験の目的やサンプルにあわせて調整します。

条件検討開始の推奨露出時間は 60秒です。 8× 10 cmのメンブレンの場合、トレイ位置は上段を使用します。適切な露出時間がわからないサンプルの場合には、露出方法で Increment（逐次撮影）や Semi-automatic（セミオート撮影）を用います。

7 ヒストグラムを参考に、適切な露出が得られた画像を保存します。全体にバックグラウンドがみられる場合は、メンブレンを PBS-Tあるいは TBS-Tで 10分間 2回洗浄した後、再度 6.検出の 1 からくり返します。

［CCDイメージャーでの検出］

※ X線フィルムでの検出は次ページ

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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

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ワンポイント


準備


［X線フィルムでの検出］

5 フィルムカセットにメンブレンをブロット面を上（X線フィルム側）にして置きます。その上に X線フィルムをのせてカセットを閉じます。

赤色安全光の下で作業してください。

フィルムカセット内に検出試薬がつかないように注意します。

X線フィルムの右端を折るなどして上下、裏表の目印とします。

6 30秒～数分間露出します。露出時間（　　　）分目的タンパク質が微量、あるいはシグナルが弱い場合は、露光時間を長くします。5分間以上が目安です。

7 X線フィルムを現像します。検出後のメンブレンは PBS-T or TBS-Tですすいだ後、ラップに包んで 2～ 8℃で 1週間保存できます。

全体にバックグラウンドが見られる場合は、メンブレンを PBS-T あるいは TBS-Tで 10分間 2回洗浄した後、再度 6.検出の 1 からくり返します。

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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備

ECL ウェスタンブロッティング検出プロトコール・コピーして、実験ノートに貼ってご使用いただくと便利です。・チェックボックス（□）にチェックを入れながら作業していただくと確実です。・「メモ実験条件メモ」には実験条件を記録していただけます。


3ページの必要なものリストをご参照ください。 ECL Western Blotting Detection Reagents （RPN2109）

ECL Western Blotting Starter Kit（RPN2108）下表試薬が入っており、はじめて行っていただく際に便利です。

ECL（RPN2109）二次抗体ブロッキング剤分子量マーカーメンブレンフィルム

○ ○ ○ ーーー

コンポーネント詳細二次抗体： Anti-mouse IgG horseradish peroxidase conjugate, 100 µl（NA931-100UL） Anti-rabbit IgG horseradish peroxidase conjugate, 100 µl（NA934-100UL）ブロッキング剤： ECL Blocking Agent（5 g） ※単品販売もしております（40 g入り、RPN2125）


「1.電気泳動」、「2.ブロッティング」までは連続的に作業を行うので、あらかじめ所要時間や必要な装置・試薬の準備を確認しましょう（10× 8 cmのミニゲルでは電気泳動で 4時間、ブロッティングで 2時間が目安です）。


1.　電気泳動

SDS-PAGEでタンパク質を分離します。参照 55～ 67ページ：電気泳動

アプライするタンパク質量が多すぎるとエキストラバンドが出ることがあります。サンプルの濃度がわからない場合はアプライ量を段階的に分けることをおすすめします。


ポジティブコントロールやネガティブコントロールを同時に泳動することをおすすめします。複数のバンドが検出されたときにどちらが目的のタンパク質か確認できます。



ECL ウェスタンブロッティング検出プロトコール（1/5）


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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備


メンブレンの選択（参照 70ページ）。ニトロセルロースメンブレンの場合･･･10分間ブロッティングバッファーに浸して平衡化します。


SDS-PAGEによって分離したタンパク質を Amersham Hybond PVDF（または Amersham Protran Premium NC）へブロッティングします。

参照 69～ 74ページ：ブロッティングブロッティング後のメンブレンはゲルと接していた面（ブロット面）を覚えておく必要があります。メンブレンの右端をカットするなどして目印をつけておいてください。




種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：




ブロッキングバッファー（5％ ECL Blocking Agent（RPN2125） in PBS-T or TBS-Tまたは 5％スキムミルク in PBS-T or TBS-T）の調製

洗浄バッファー（PBS-T or TBS-T）の調製（参照 4ページ）一次抗体、二次抗体の希釈 CCDイメージャー or暗室の予約

1 ブロッティング後のメンブレンをブロッキングバッファーに浸します。



2 室温で1時間、もしくは2～8℃でオーバーナイト振盪します。（　　）：（　　）～（　　）：（　　）メンブレンはブロッキング剤に 4℃で一晩浸しておくこともできます。

3 新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2）

Check 　□ 2分　□ 2分 1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。




ECLウェスタンブロッティング検出プロトコール（2/5）


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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



一次抗体濃度は0.04～0.1 µg/mlを目安に実験を始めます。一次抗体の希釈率はPVDFメンブレンを使用した場合、1:500～ 1:5,000が目安です。


2 室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）





一次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：



ECL DualVue Western Blotting Markers使用時には HRP標識 S-proteinを希釈液に加えます（参照 60ページ）。



2 室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）


3 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2、15分間× 1、5分間× 3）


ビオチン化抗体を使用しない方は 6.検出に進みます。



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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

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ECLPlex

ワンポイント


準備


【 1 でビオチン化二次抗体をご使用の場合、以下の操作で行います】 4 PBS-T or TBS-Tで希釈した HRP標識ストレプトアビジン（PRN1231-2ML）にメンブレンを浸します。

5 室温で 45分間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

検出後のバンドが薄かった場合は 45～ 60分に変更可能です。




二次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：


準備

検出試薬の調製（1）Detection Reagent 1、Detection Reagent 2を室温に戻します。（2）Detection Reagent 1：Detection Reagent 2＝ 1：1の割合で混合します。


混合時に検出溶液が白濁しますが問題ありません。









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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備

















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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備

ECL Selectウェスタンブロッティング検出プロトコール・コピーして、実験ノートに貼ってご使用いただくと便利です。・チェックボックス（□）にチェックを入れながら作業していただくと確実です。・「メモ実験条件メモ」には実験条件を記録していただけます。


3ページの必要なものリストをご参照ください。 ECL Select Western Blotting Detection Reagent（RPN2235）


「1.電気泳動」、「2.ブロッティング」までは連続的に作業を行うので、あらかじめ所要時間や必要な装置・試薬の準備を確認しましょう（10× 8 cmのミニゲルでは電気泳動で 4時間、ブロッティングで 2時間が目安です）。


1.　電気泳動








メンブレンの選択（参照 70ページ）。ニトロセルロースメンブレンの場合･･･10分間ブロッティングバッファーに浸して平衡化します。


SDS-PAGEによって分離したタンパク質を Amersham Hybond PVDF（または Amersham Protran Premium NC）へブロッティングします。

参照 69～ 74ページ：ブロッティングブロッティング後のメンブレンはゲルと接していた面（ブロット面）を覚えておく必要があります。メンブレンの右端をカットするなどして目印をつけておいてください。




種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：


ECL Selectウェスタンブロッティング検出プロトコール（1/6）


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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



ブロッキングバッファー（2％ ECL Prime Blocking Reagent（RPN418）in PBS-T or TBS-Tまたは 5％スキムミルク in PBS-T or TBS-T）の調製

洗浄バッファー（PBS-T or TBS-T）の調製（参照 4ページ）一次抗体、二次抗体の希釈 CCDイメージャー or 暗室の予約

1 ブロッティングのメンブレンをブロッキングバッファーに浸します。





3 新しい洗浄バッファーに浸して 2回すすぎます。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2）

Check 　□ 2分　□ 2分 1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。






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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



一次抗体濃度は 5,000～ 30,000倍を目安に実験を始めます。一次抗体の希釈率は PVDFメンブレンを使用した場合、1:5,000～ 1:30,000が目安です。


2 室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）


3 新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（5分間× 4～ 6回）


X線フィルムで検出する場合は６回洗浄することで、バックグラウンドを抑えられます。


一次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：



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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



ECL DualVue Western Blotting Marker使用時には HRP標識 S-proteinも加えます（参照 60ページ）。



2 室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）


3 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して 2回すすぎます。

4 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（5分間× 4～ 6回）


ビオチン化抗体を使用しない方は 6.検出に進みます。

X線フィルムで検出する場合は 6回洗浄することで、バックグラウンドを抑えられます。

【 1 でビオチン化抗体をご使用の場合、以下の操作を行います】 4 PBS-T or TBS-Tで希釈した HRP標識ストレプトアビジン（RPN1231-2ML）にメンブレンを浸します。

5 室温で 45分間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

6 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して 2回すすぎます。

7 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（5分間× 4～ 6回）


X線フィルムで検出する場合は 6回洗浄することで、バックグラウンドを抑えられます。


二次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：



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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



準備

検出試薬の調製（1）ECL Selectの Solution A、Solution Bを室温に戻します。（2）Solution A：Solution B＝ 1：1の割合で混合します。
















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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備











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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備

ECL Plexウェスタンブロッティング検出プロトコール・コピーして、実験ノートに貼ってご使用いただくと便利です。・チェックボックス（□）にチェックを入れながら作業していただくと確実です。・「メモ実験条件メモ」には実験条件を記録していただけます。


3ページの必要なものリストをご参照ください。 ECL Plex（参照蛍光多重検出用二次抗体 82ページ）低蛍光ガラスプレートメンブレン（参照 70ページ） ECL Prime Blocking Reagent（RPN418）または 5％ BSA（参照 79ページ）


「1.電気泳動」、「2.ブロッティング」までは連続的に作業を行うので、あらかじめ所要時間や準備を確認しましょう（10× 8 cmのミニゲルでは電気泳動で 2時間、ブロッティングで 2時間が目安です）。


表 1 を参考に使用する色素と検出装置の励起波長、フィルター等の条件を確認します（参照 Typhoon FLA 9500の検出条件 96ページ）。

ご注意

基本操作は化学発光検出と同じですが、蛍光検出の際には下記の点にご注意ください。

蛍光検出の成功の秘訣はバックグラウンドを低く抑えることにあります。ブロッキング、洗浄時のバッファー量はメンブレン 1 cm2あたり 2.5 ml 以上使用することをおすすめします。

洗浄時にはメンブレンが十分入る大きさの容器を準備します。容器を使用する前に水とエタノールで洗浄します。

メンブレンは乾かさないようご注意ください。パウダーフリーのグローブを使用します。 CBB、BPB、ボールペンのインク、Triton X-100などの混入はバックグラウンドに影響をおよぼしますのでご注意ください。ゲルの下端のBPBを含む箇所も切りとります（下写真）。


BPBを含む箇所を切りとります

CyDyeλ max（nm）

励起波長蛍光波長

Cy2 489 506

Cy3 550 570

Cy5 649 670

表 1 CyDyeの蛍光波長

ECL Plexウェスタンブロッティング検出プロトコール（1/6）

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MEMO

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ECL

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ワンポイント


準備

1.　電気泳動




メンブレンの選択（70ページメンブレンの選び方）。

ニトロセルロースメンブレンご使用の場合･･･10分間ブロッティングバッファーに浸して平衡化します。

PVDFメンブレンご使用の場合･･･100%メタノールによる親水化処理を行います（参照 71ページ）。ブロッティングバッファーを準備します（参照 72ページ）。

1 濃縮ゲルと BPBを含む箇所を取り除いたゲルをブロッティングバッファーに 20分間浸します。

2 SDS-PAGEによって分離したタンパク質を Amersham Hybond LFP PVDFへブロッティングします。

参照 69～ 74 ページ：ブロッティングブロッティング後のメンブレンはゲルと接していた面（ブロット面）を覚えておく必要があります。メンブレンの右端をカットするなどして目印をつけておいてください。




種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：





ECL Plex Fluorescent Rainbow Markers （参照 59ページ）を同時に泳動すると電気泳動やブロッティング効率の確認ができるため便利です。



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ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備


「3.ブロッキング」～「5.二次抗体反応」まで連続的に作業するため前もって準備しておきます。ブロッキングバッファー（2% ECL Prime Blocking Reagent（RPN418） in PBS-T or TBS-T）洗浄バッファー（PBS-T or TBS-T）の調製（参照 4ページ）一次抗体、二次抗体の希釈検出機器の予約

1 ブロッティング後のメンブレンをブロッキングバッファーに浸します。ゲル片の混入を防ぐため、ゲルのバッファー置換に用いたトレイを使用しないでください。

検出後、バックグラウンドが高くなった場合は、PBS-T or TBS-T の Tween 20濃度（参照 4ページ）およびブロッキング時間、温度を検討します（参照 80ページ）。




3 新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（2分間× 2、5分間× 2）

Check 　□ 2分　□ 2分　□ 5分　□ 5分 1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。

ブロッキング後のメンブレンは次の一次抗体反応まで PBS or TBSに浸しておきます。バックグラウンドの原因となるため乾燥させないでください。




ブロッキング剤メンブレン

2% ECL Prime BlockingReagent in PBS-T/TBS-T 5% BSA in PBS/TBS 5% ECL Blocking

Agent in PBS-T/TBS-T 10% gelatin

AmershamHybond LFP PVDF +++ ++ + –

AmershamProtran

Premium NC++ ++ + –

+++ ：最適です、++ ：適しています、+ ：使用できます、- ：使用できません

表 2 ECL Plex用メンブレンと最適ブロッキング剤Amersham Hybond LFP PVDF は低蛍光の PVDFメンブレンで、抗体除去や微量なタンパク質の検出に適しています。Amersham Protran Premium NC はニトロセルロースメンブレンで、量の多いタンパク質の検出向けです。Amersham Hybond LFP PVDFメンブレンをお使いの場合には、非特異的検出を避けるためにPBS-T またはTBS-T で希釈した2 % ECL Prime Blocking Reagentをご使用ください。



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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備



一次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：


1 洗浄バッファーあるいはブロッキング剤で希釈したマウスあるいはラビット由来の一次抗体にメンブレンを浸します。

一次抗体の希釈率は、Hybond LFPメンブレンを使用した場合、1:100～ 1:5,000が目安です。

多重検出を行う場合はマウス由来とラビット由来の一次抗体を一緒に反応液に入れることができます。抗体液を再利用する場合は別々の反応液で反応させます（参照 85ページ）。


2 室温で 1.5時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

3 新しい PBS-Tに浸して振盪して洗浄します。洗浄回数は次の通りです。（リンス× 2、5分間× 2）

Check 　□リンス　□リンス　□ 5分　□ 5分 1 cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。


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MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備


1 洗浄バッファーあるいはブロッキング剤で希釈した ECL Plex CyDye標識二次抗体（0.3 ml/cm2以上）に浸します。

二次抗体の希釈率は Hybond LFPメンブレンを使用した場合、1:1,250～ 1:4,000が目安です。

4 Tween 20を含まない洗浄バッファーでメンブレンをすすぎます。（リンス× 3） Check 　□リンス　□リンス　□リンス

2 遮光して室温で 1時間振盪します。（　　　）：（　　　）～（　　　）：（　　　）

3 メンブレンを新しい洗浄バッファーに浸して振盪して洗浄します（遮光）。洗浄回数は次の通りです。（リンス× 3、5分間× 4）

Check 　□リンス　□リンス　□リンス　□ 5分　□ 5分　□ 5分　□ 5分 1cm2あたり 4 ml以上のバッファーを使用します。8× 10 cmのメンブレンであれば 320 mlが目安です。

【Hybond LFPを使用した場合】 5 ブロッティング用ろ紙（参照 106ページ）の上にメンブレンを置き 37～ 40℃で 1時間乾燥させます（遮光）。

室温で一晩置いて乾燥させることも可能です。リプロービング（抗体除去）を行う場合は乾燥させずに検出を行います。

検出を行うまでメンブレンは遮光して保存します。


二次抗体種類：　　　　　　　　　　組成：　　　　　　　　　調製日：



26

MEMO

実践編

ECLPrime

ECL

ECLSelect

ECLPlex

ワンポイント


準備

6.　検出ここでは蛍光イメージャー（Typhoon FLA 9500）を用いた検出方法をご説明します。


Cy2 Cy3 Cy5

レーザー blue (473) green (532) red (635)

フィルター BPB1(530DF20) BPG1(570DF20) LPR2(665LP)

表 3 各試薬の検出条件

図 1 各蛍光の励起波長と Typhoon FLA 9500の検出領域Cy2、Cy3、Cy5の発光波長を実線で、Typhoon FLA 9500のレーザー波長を点線、フィルターが通す光の領域を四角で表しました。それぞれの発光波長に適したレーザーとフィルターをお選びください。

レーザー波長

（）

（）

（）

【乾燥させたメンブレンを検出する場合】

1 タンパク質面が下になるように FLUORステージにメンブレンを置き、その上に蛍光ガラスプレートをのせます。 5 に進みます。

5 スキャンを始めます。

Pixel Size：100 µm、PMTボルテージの推奨値：500～ 700 V（ウェットメンブレン）、250～ 500 V（乾燥させたメンブレン）

レーザーやフィルターの条件は表 3 をご参照ください。それぞれの蛍光の励起波長とフィルターの関係を図 1に示しました。Methodから至適の設定を選択します。

【ウェットメンブレンを検出する場合】

1 3 mm厚または 5mm厚の低蛍光ガラス板に載せて挟みます。ウェットメンブレンの場合、メンブレンとガラス板の間に気泡が入らないよう注意してください。気泡の影響でバンドが薄くなる可能性があります。少量の洗浄バッファーをたらしてからメンブレンを置くと気泡が入りにくいです。

2 MULTIステージにセットします。

3 ガラス付きゲル（1枚または 2枚）を手前から入れます。5 mm厚ガラスの場合は深い溝に合わせ、3 mm厚ガラスの場合は浅い溝に合わせます。

4 サンプル面を下向きにしてガラス板を設置します。

厚ガラス板

メンブレン（サンプル面が下）


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