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Fisiologia microbiana: nutrição e crescimento. Nutrição microbiana Componentes necessários às células Meios de cultura Condições ambientais Crescimento populacional Velocidade de crescimento Tempo de geração Medidas do crescimento. Introdução. NUTRIÇÃO MICROBIANA. - PowerPoint PPT Presentation
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Fisiologia microbiana:
nutrição e crescimento
• Nutrição microbiana– Componentes necessários às células– Meios de cultura– Condições ambientais
• Crescimento populacional– Velocidade de crescimento– Tempo de geração– Medidas do crescimento
Introdução
• De todos os organismos vivos, os microrganismos são os mais versáteis e diversificados em suas exigências nutricionais.
• Alguns são tão exigentes quanto o homem e outros animais.
• Todos os organismos vivos compartilham algumas necessidades nutricionais em comum:- carbono- nitrogênio- água
NUTRIÇÃO MICROBIANA
• Em algumas situações os microrganismos são estudados em seu hábitat natural.Ex.: Fendas termais, sistemas de tratamento de resíduos, solo
• Para caracterizar suas propriedades (morfológicas, fisiológicas e bioquímicas) é necessário o cultivo em laboratório.
Cultivo in vitro: quando se conhece as exigências nutricionais
Cultivo in vivo: quando exigências nutricionais específicas são desconhecidas.
NUTRIÇÃO MICROBIANA
NUTRIÇÃO MICROBIANA
Para o cultivo in vitro são utilizados meios de cultura que simulam e até melhoram as condições naturais.
Os elementos químicos principais para o crescimento das células incluem C, N, H, O, S e P e são denominados de macronutrientes.
• O carbono é um dos elementos mais importantes para o crescimento microbiano – todos requerem carbono
• Os compostos orgânicos são os que contém carbono
• Exceção para o dióxido de carbono que é considerado como inorgânico.
NUTRIÇÃO MICROBIANA
MACROnutrientes: necessários em grande quantidade. Tem papel importante na
estrutura e metabolismo.
MICROnutrientes: quantidades mínimas. Funções enzimáticas e estruturais das biomoléculas
Uma célula típica
Matéria seca
Água
C
N
H
P, S, K, Na ...
Componentes necessários às células
• Fonte de Carbono
Compostos orgânicos (microrganismos heterotróficos):- Carboidratos
- Lipídeos - Proteínas
Deles se obtém energia e unidades básicas para o crescimento celular.
Utilização de CO2 (microrganismos autotróficos)
É a forma mais oxidada do carbono, assim a fonte de energia provém da
luz.
• Fonte de Nitrogênio
- É elemento mais abundante depois do C, cerca de 12%
(constituinte das proteínas, ácidos nucléicos, etc.)
► Moléculas orgânicas (aminoácidos, proteínas, etc.)
► Moléculas inorgânicas (NH3, NO3-, N2)
Componentes necessários às células
• Hidrogênio
- Principal elemento dos compostos orgânicos e de diversos inorgânicos (água, sais e gases)
• Função do H:
– Manutenção do pH– Formação de ligações de H entre moléculas – Serve como uma fonte de energia nas reações de oxi-redução da respiração
Componentes necessários às células
• Oxigênio
- Elemento comum encontrado nas moléculas biológicas (aminoácidos, nucleotídeos, glicerídeos ...)
- É obtido a partir das proteínas e gorduras.
► Na forma de oxigênio molecular (O2), é requerido por muitos para os
processos de geração de energia.
• P – Sínese de ácidos nucléicos, ATP;
• S – Estabilidade de aminoácidos, componente de vitaminas;
• K – Atividade de enzimas;
• Mg – Estabilidade dos ribossomos;
• Ca – Estabilidade da parede celular e termoestabilidade de
endósporos;
• Na – Requerido por microrganismos marinhos;
• Fe – Papel-chave na respiração, componente dos citocromos e das
proteínas envolvidas no transporte de elétrons.
Componentes necessários às células
Outros macronutrientes:
• Traços dos seguintes METAIS são necessários na composição de
um meio de cultura:
Zn, Cu, Mn, Co, Mo e B
► Exercem função estrutural em várias enzimas
- Nem sempre sua adição é necessária
- Meios sintéticos com compostos de alto grau de pureza e água ultra
pura podem apresentar deficiências desses elementos.
Requisitos nutricionais - Micronutrientes
• Água
- Componente absolutamente indispensável
(com exceção dos protozoários que englobam partículas sólidas)
► Laboratório: destilada, filtrada, deionizada
• Outros aditivos
Funções: aumentar a conversão, evitar precipitação de íons, controlar a espuma, provocar inibição, estabilizar o pH.
►Quelantes: na autoclavagem ocorre a precipitação dos fosfatos metálicos
Ex.: EDTA, ácido cítrico, polifosfatos
Água e outros aditivos
► Tampões
- Carbonato de cálcio
- Fosfatos
- Proteínas (peptona)
►Inibidores
Ex: produção de ácido cítrico por Aspergillus niger
Utiliza-se Fosfato e pH < 2 para reprimir o ácido oxálico
Outros aditivos
►Indutores
- A maioria das enzimas de interesse comercial precisa de indutores.
Ex: celulose induz a celulasepectina induz a pectinaseamido induz a amilase
►Antiespumantes
- Cultivos com aeração ocorre a produção de espuma
• Remoção de células, perda do produto, contaminação;• Redução do volume do meio
• Um antiespumante reduz a tensão superficial das bolhas
(álcoois, ácidos graxos, silicones, poliglicóis, ... )
Outros aditivos
MEIOS DE CULTURA
Soluções nutrientes para promover o crescimento de microrganismos.
Classes Quimicamente definidos (sais, compostos orgânicos purificados, água)
Complexos (utilizam hidrolisados – caseína, carne, soja, levedura)
Não existe um meio de cultura universal, mas
Existem vários tipos meios para diversas finalidades
Para obter sucesso no cultivo de microrganismos é necessário o conhecimento de
suas exigências nutricionais, para que os nutrientes sejam fornecidos de forma e
proporção adequada.
MEIOS DE CULTURA
MEIOS DE CULTURA
• Como determinar uma composição inicial para um meio de cultivo:
Composição elementar média (% do peso seco)
Elemento Bactéria Fungo
Carbono 52 51
hidrogênio 7 7
Nitrogênio 13 8,5
Fósforo 2,5 0,4-4,5
Enxofre 0,6 0,1-0,5
Potássio 2,5 0,2-2,5
Sódio 0,75 0,02-0,5
Cálcio 0,55 0,1-1,4
Magnésio 0,25 0,1-0,5
Cloro 0,5 -
Ferro 0,1 0,15
Relação C:N média 4:1 6:1
Relação C:N:P:S 85:23:4:1
Passo 1: utilizar dados da composição elementar
Ex: Para produzir 10 g de células bacterianas são necessários de 1,3 g (13%) de N, ou 7,2 g de (NH4)2SO4 (18% de N)
Obs.: Sais com dois componentes [(NH4)2SO4] podem introduzir o excesso de um deles.
Com relação ao carbono considerar também fração para energia e manutenção (heterotróficos)
Fração para biomassa: 1,3 x 4 = 5,2 g de C ou 13 g de glicose (40% de C)
Fração para energia e manutenção (45%): YX/S = 55% 13/0,45 = 28,9 g de glicose
Relação C:N = 28,9/7,2 = 4:1
.... E assim por diante.
Passo 2: otimização
MEIOS DE CULTURA
Temperatura oxigênio pH Radiação eletromagnética Pressão atmosférica, hidrostática e osmótica
Condições ambientais
Efeito da temperatura no crescimento microbiano
Aeróbio Anaeróbio Facultativo Microaerófilo Anaeróbio aerotolerante
Efeito do oxigênio no crescimento microbiano
Meio gelatinoso com indicador redox:
Rosa quando oxidado
Incolor quando reduzido
Durante as reações de redução do O2 são formados vários intermediários tóxicos.
Ex: H2O2, OH°, O2-
Os microrganismos aeróbios e facultativos utilizam enzimas como a catalase para destruir as formas tóxicas
Sistema para cultivo de anaeróbios
Sistema para cultivo de aeróbios
• Em microbiologia crescimento geralmente é o aumento do número de células
• Na maioria dos procariotos ocorre a fissão binária: crescimento e divisão
Varia de minutos até diasDepende muito das condições ambientais
Escherichia Coli - 20 minutosPisolithus microcarpus – 2,5 dias
CRESCIMENTO MICROBIANO
O padrão de crescimento é o exponencial
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 50 100 150 200 250 300
minutos
célu
las
Tratando-se bactérias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por divisão binária, temos:
21 > 22 > 23> 24
Onde N = n° microrganismos ao fim de n divisões N0 é o número inicial
O número de gerações será:
A velocidade exponencial de crescimento (R) é expressa pelo número de divisões no tempo:
A recíproca de R é o tempo de geração:
Essas equações não se aplicam a microrganismos filamentosos.
Assim, é mais conveniente aplicar-se uma equação mais geral, onde se considera a variação da massa (X), em função do tempo como sendo proporcional a concentração de biomassa presente:
n0N =N .2
0n = 3,3(logN- logN )
0
nR =
t - t
01 t - tG = =
R n
dX
Xdt
• Velocidade específica de crescimento:
Num cultivo batelada ocorre o aumento da concentração da biomassa
Assim, é necessário definir uma velocidade de crescimento que considere a
quantidade de biomassa presente.
1 dX
=X dt
A integração dessa equação diferencial fornece a equação algébrica do crescimento exponencial da biomassa:
Ou escrita de outra forma:
iM0i
μ (t-t )X = X e
M 0ilnX = μ .t + lnX
• Tempo de duplicação: considerando que X = 2.X0i, resulta:M
ln2G =
μ
dX
Xdt
dX
.Xdt
O estudo cinético de um cultivo microbiano consiste da análise da evolução dos valores de concentração de um ou mais componentes do sistema, em função do tempo de cultivo.
► microrganismo, nutrientes, metabólitos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120
2
4
6
8
10
12
14
S (
g.L-1
)
Tempo (dia)
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
X (
g.L-1
)
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
9,0
CP (
mg.
L-1)
O ciclo de crescimento
• A fase exponencial reflete apenas uma parte do ciclo de crescimento de uma população microbiana
• O crescimento de microrganismos em um recipiente fechado (batelada) apresenta um ciclo típico com todas as fases de crescimento.
1) Fase Lag
Período de adaptação da cultura
• Mudança de meio, preparação do complexo enzimático
• Reparação das células com danos.
2) Fase exponencial
Fase mais saudável das células onde todas estão se dividindo.
• A maioria dos microrganismos unicelulares apresentam essa fase, mas as
velocidades de crescimento são bastante variáveis:
- Procarióticos – crescem mais rapidamente que os eucarióticos
- Eucarióticos menores crescem mais rapidamente que os maiores
3) Fase estacionária:
Num sistema fechado (tubo, frasco ou biorreator) o crescimento exponencial
não pode ocorrer indefinidamente.
• Ocorre a limitação por depleção de nutrientes e acúmulo de metabólitos.
Divisão = morte → crescimento líquido nulo
• Ainda pode ocorrer: metabolismo energético e produção de metabólitos
secundários
4) Fase de morte (declínio):
• A manutenção de uma cultura no estado estacionário por longo tempo conduz as
células ao processo de morte.
- A morte celular é acompanhada da lise celular
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO
• Podem ser realizadas pelos seguintes métodos:
1) Peso seco total das próprias células – filtração, secagem e pesagem
2) Peso de algum componente celular – extração, secagem e pesagem
3) Variação no número de células a) contagem de células totais b) contagem de células viáveis
a) Contagem de células totais (contagem microscópica direta)
Utilizam-se câmaras especiais de contagem (lâmina com grade quadriculada)Ex.: Câmara de Neubauer
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem direta
• Vantagens: método rápido e fácil
• Desvantagens
Não distingue as células vivas das mortas
Pode-se omitir células pequenas
Células móveis precisam ser imobilizadas
Entre outras.
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO – contagem indireta
b) Contagem de células viáveis:
Contagem das colônias formadas em meio de cultura em placas.
Razões:
Erros devido à junção de células na colônia
Restrições podem fazer células viáveis não originar colônias
São empregadas várias diluições decimais porque é difícil prever o número de viáveis.
É contada a placa com 30 a 300 colônias
• Diluição das suspensões celularesAmostras concentradas precisam ser diluídas
MEDIDAS DO CRESCIMENTO MICROBIANO
Outros métodos:
TurbidimetriaAs células dispersam a luz e quanto mais células mais turvo é o meio
Pode ser medida com um espectrofotômetro
•O uso da turbidimetria exige a construção de uma curva padrão•Turbidez X quantidade de células
Contagem eletrônica