Francisco José Guimarães Joca

Ministério da Saúde

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

Escola Nacional de Saúde pública Sérgio Arouca

ENSP

Centro de Estudo da Saúde dos Trabalhadores e Ecologia Humana - CESTEH

Mestrado em Saúde Pública

Subárea Saúde, Trabalho e Ambiente

Área Temática Toxicologia

Avaliação de genotoxicidade de trabalhadores expostos à sílica

Aluno: Francisco José Guimarães Joca

Orientadora: Profa. Dra. Rita Mattos

Julho - 2009

ii

Fundação Oswaldo Cruz

Centro de Estudo da Saúde dos Trabalhadores e Ecologia Humana - CESTEH

Mestrado em Saúde Pública

Subárea Saúde, Trabalho e Ambiente

Área Temática Toxicologia

Avaliação de genotoxicidade de trabalhadores expostos à sílica

Aluna: Francisco José Guimarães Joca

Banca Examinadora:

Titulares:

Profa. Dra. Rita Mattos (CESTEH-ENSP-FIOCRUZ) - Orientadora

Profa. Dra. Paula de Novaes Sarcinelli (CESTEH-ENSP-FIOCRUZ)

Prof. Dr. Jaime Silva de Lima (UNIRIO)

Suplentes:

Prof. Dr. Moacelio V. Silva Filho (EPSJV-FIOCRUZ)

Prof. Dr. Sérgio Rabello Alves (CESTEH-ENSP-FIOCRUZ)

Julho - 2009

iii

"O estudo em geral, a busca da verdade e da beleza são domínios em que nos é consentido ficar crianças toda a vida”.

Albert Einstein

iv

AGRADECIMENTOS

• Agradeço a Deus por sua infinita Misericórdia e Amor em todas as dimensões de

minha vida.

• Aos meus Pais por terem me gerado, formado e me aturado até hoje.

• A toda a minha família, em especial meus avós, por representarem minhas

referências, raízes e princípios.

• À Fernanda, minha futura esposa, que tem sido muito mais que minha

companheira de caminhada, por seu amor, ajuda, carinho e resistência. E por

sua família que já considero também minha.

• À minha orientadora, Drª Rita de Cássia Oliveira da Costa Mattos, por ter sido a

pessoa que primeiro me recebeu nesta Escola. E que posteriormente me abriu

as portas de seu laboratório, onde me acolheu como aluno e membro de sua

equipe. Por sua confiança, por me orientar e formar até hoje, e por seus muitos

ensinamentos toxicológicos e não toxicológicos.

• Ao Laboratório de agrotóxicos, onde iniciei a caminhada nesta Escola. Ao Dr

Jefferson Oliveira Silva, e a querida Drª Paula Sarcinelli que me acolheram e

me orientaram neste momento.

• A esta Escola que muito me provocou como profissional e pessoa, que com toda

certeza colaborou muito em minha formação, apresentando e reafirmando

muitos valores da minha vida profissional.

• À queridíssima Drª Carmem Marinho por sua amizade, exemplo, estímulo,

formação e ensinamentos que caminham com aqueles que possuem o privilégio

de serem seus alunos e/ou amigos.

• Às professoras Drª Ana Maria Braga e Drª Élida Hennington por suas aulas,

ensinamentos e suas críticas mais que construtivas. A todos os docentes que

contribuíram nesta etapa da minha formação.

• À minha Orientadora de graduação Drª Jussara Lagrotta Candido que contribui

até hoje em minha formação.

• Ao Dr Adriano Caldeira (UERJ), sua aluna Drª Michele e à Drª Helena Zamith

(INCQS) pela disponibilidade, contribuições e trocas sobre a metodologia do

teste do Ensaio Cometa.

• Ao Dr Moacelio Veranio Silva por suas provocações contributivas e ajuda

providente.

v

• Ao Dr Hermano pela disponibilidade, e por dispor de seu tempo para o próprio

atendimento clínico dos trabalhadores avaliados no presente trabalho e a

leitura de exames dos mesmos.

• À equipe do ambulatório que muito colaborou na recepção e na avaliação

ambulatorial dos trabalhadores, especialmente a enfermeira Cristiana e Marisa,

e a Drª Patrícia que, além disso, disponibilizaram os prontuários destes.

• À minha companheira de graduação Maíra, sua chefe Drª Regina Amendoeira e

toda a sua equipe que, com visão institucional, nos deixaram muito à vontade

na utilização do seu microscópio de fluorescência, possibilitando a realização

deste estudo.

• Um agradecimento especial aos companheiros e amigos do Setor de Indicadores

de efeito, por todo apoio, ajuda, trabalho em equipe e convivência produtiva

em nosso setor: Mário, Murata, Ana Luiza, Carlúcio, Helena, Leandro,

Vinício, Isabele, Natália, Marcinha, Ely, Daniel, Simone, Daniele, Lucas e

Valéria.

• Aos companheiros do Laboratório de Toxicologia do CESTEH, como Amanda,

Dr Moacelio, Sayonara, Yvone, Alan, Telma, Fábio e todos os outros pela

constante troca e convivência.

• A todos os voluntários deste estudo, principalmente os trabalhadores expostos à

sílica que propiciaram a realização deste estudo.

• Aos funcionários do CESTEH que diretamente ou indiretamente contribuíram

para a execução deste trabalho e para a minha formação. Assim como a equipe

de ar condicionado que muito trabalhou para tentar manter condições

laboratoriais adequadas.

• Aos meus companheiros de mestrado, por esta produtiva e intensa etapa

construída, e também contínua.

• E finalmente aos meus amigos, sejam os que me acompanham por muitos anos

ou aqueles que descobri há não tanto tempo. Enfim, aqueles que já, há certo

tempo, encontro disponíveis para partilhar as alegrias e dificuldades da vida.

Como João Paulo, Raphael, Afrânio (pai-amigo), Ana Maria, Pe Francisco,

Alex, Jorge, Marcelo.

vi

RESUMO

A exposição ocupacional a poeiras de sílica está associada a diversos

efeitos adversos sobre o sistema respiratório dentre os quais é possível destacar a

pneumoconiose clássica, também conhecida como silicose. Espécies reativas de

oxigênio (EROs) são geradas diretamente pelo depósito de poeiras fibrogênicas no

tecido pulmonar. A produção contínua de EROs, ou sua ineficaz remoção, pode

impactar o sistema antioxidante, induzir estresse oxidativo e provocar danos

celulares nos pulmões. Diferentes estudos em matrizes biológicas apontaram o

Ensaio Cometa como um indicador altamente sensível para a exposição a agentes

carcinógenos e extremamente sensível para uma variedade de classes de danos ao

DNA. É um teste de genotoxicidade simples, de baixo custo, versátil, rápido e

extremamente sensível para qualquer população de célula eucariótica. O objetivo

deste estudo foi avaliar danos genotóxicos e alterações em enzimas do estresse

oxidativo decorrentes da exposição à sílica em trabalhadores expostos e não

expostos atendidos no Ambulatório de Pneumatologia Ocupacional do Centro de

Estudo da Saúde do Trabalhador e Ecologia Humana (CESTEH) da Escola

Nacional de Saúde Pública (ENSP/FIOCRUZ). Ensaio Cometa demonstrou ser um

método sensível e confiável na detecção de danos ao DNA, causados pela

exposição à sílica. Variações na atividade da enzima GST podem ser usadas para

estudos de silicose como um indicador biológico de efeito, pois estas mudanças

podem estar presentes precocemente nesta doença. Neste estudo foi confirmado o

risco dos pacientes silicóticos desenvolverem tuberculose. Isto demonstra quanto a

fisiopatologia desta doença pode impactar o sistema imunológico. O hábito de

fumar mostrou uma associação com o desenvolvimento da silicose e da

tuberculose. Nos trabalhadores expostos à sílica, a exposição ocupacional parece

sobrepujar um possível efeito do tabaco nos níveis dos indicadores enquanto que

em uma população não exposta à sílica o tabagismo mostrou-se impactante.

vii

ABSTRACT

The occupational exposure to silica dusts is associated to several adverse

effects on the breathing system and is possible to highlight the classic

pneumoconiose, known also as silicose. Reactive oxygen species (ROS) are

directly created by the deposit of fibrinogenic dusts on the lung tissue. The

continuous production of ROS, or their ineffective removal, can eliminate the anti-

oxidant system, induce oxidative stress and induce cellular damage in the lung.

Different studies in biological matrix pointed the Comet Assay as a highly

sensitive indicator for carcinogenic agents and extremely sensitive to several

classes of DNA damages. This method can be defined as a simple genotoxicity

assay, with low cost, versatile, rapid and extremely sensitive to any eukaryotic

cell. The aim of this study was to evaluate genotoxic damages and changes in

enzymes that play a role in oxidative stress due to silica exposure in exposed and

unexposed workers seen at the ambulatory of Occupational Pneumatology, part of

Worker’s Health and Human Ecology Study Centre (CESTEH), situated on

National School of Public Health, Oswaldo Cruz Foundation (ENSP/FIOCRUZ).

Comet Assay demonstrated to be a sensitive and realible method for detection of

DNA damage due to silica exposure. Changes on the GST activity can be used for

silicosis studies as an effect biomarker, since these changes may be present early

in this disease. In this report was confirmed the risk of silicotic patients in

developing tuberculosis. This confirms how the physiopathology of silicosis can

impact the immunological system. The tobacco addiction showed a positive

association with silicosis and tuberculosis. Among the workers exposed to silica,

the occupational exposure seems surpass a possible tobacco effect on the

biomarker levels whereas for a silica unexposed population the tobacco addiction

exhibited a significant impact.

viii

LISTAS DE TABELAS

Tabela 1 – Classificação das leituras de raios X em categorias de 0 a 3, conforme

as normas da OIT de 1980 (ILO,1980).........................................................24

Tabela 2 - Quantidade de reagentes para o branco e amostras (em microlitros)...29

Tabela 3 - Características sócio-demográficas do Grupo de Trabalhadores

estudado.....................................................................................................37

Tabela 4 - Níveis dos Indicadores Biológicos no grupo Exposto à sílica (grupo

sílica) e no grupo Laboratório (Grupo Laboratório).....................................42

Tabela 5 - Indicadores Biológicos avaliados dentro da população de trabalhadores

expostos à sílica.........................................................................................48

Tabela 6 - Indicadores Biológicos e o fator idade. ............................................. 49

Tabela 7 - Indicadores Biológicos e as diferentes categorias de Raio X..............51

Tabela 8 - Modelo de Regressão Linear com Variável Dependente: Log TNF .... 64

Tabela 9 - Tabela de Contingência com Trabalhadores Doentes e Não Doentes que

desenvolveram tuberculose.........................................................................65

Tabela 10 - Trabalhadores silicóticos e não silicóticos e o hábito tabagista........67

Tabela 11 - Quadro contendo os trabalhadores que já tiveram tuberculose, e que já

fumaram ou nunca fumaram........................................................................68

ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema da resposta celular induzida pela sílica. ............................................ 11

Figura 2 – Danos Genotóxicos Primários e Secundários (adaptado de SCHINS, 2002). .. 17

Figura 3 – Danos Genotóxicos Primários e Secundários: causas e consequências. ........... 17

Figura 4 – Desenho esquemático da técnica de Ensaio Cometa. (Fonte:

http://www.inf.ufsc.br/~awangenh/temas.html) .......................................................... 19

Figura 5 – Imagem por microscopia de fluorescência da migração de DNA, no ensaio

Cometa. (MOTA et al., 2007)...................................................................................... 19

Figura 6 – Esquema das etapas iniciais do projeto durante o período de sua realização. .. 23

Figura 7 - Fotografia da classificação do ensaio Cometa. Classe 0, sem danos; B- classe

1;C- classe 2; D- classe 3; dano máximo. Fonte: Silva et al., 2000 ............................ 33

Figura 8 - Distribuição das categorias da doença (silicose) classificadas de acordo com o

Raio X por padrões técnicos da OIT (ILO, 1980) no grupo exposto à sílica. ............. 38

Figura 9 - Distribuição dos distúrbios respiratórios avaliados por espirometria no grupo

exposto à sílica ............................................................................................................ 39

Figura 10 - Distribuição dos Indicadores Biológicos Cometa UA, Cometa % e GST

(unidade) do Grupo Exposto à Sílica e do Grupo Laboratório......................43

Figura 11 - Distribuição dos valores do Cometa UA entre as categorias da doença

e no Grupo Laboratório..............................................................................52

Figura 12 - Distribuição dos valores da atividade de GST entre as categorias e o

Grupo Laboratório......................................................................................54

Figura 13 - Distribuição do Log de TNF nos Grupos de idade............................55

Figura 14 - Distribuição dos valores do Ensaio Cometa em relação ao hábito

tabagista no Grupo laboratório....................................................................58

Figura 15 – Correlação da atividade da GST e os níveis de TNF........................62

Figura 16 – Correlação do tempo de exposição à sílica e TNF............................63

x

ABREVIATURAS

AC – Aberrações cromossomiais

CAT - Catalase

CDC – Centro para Controle e Prevenção de Doenças

CDNB - 1 cloro 2-4 dinitro benzeno

CESTEH - Centro de Estudos da Saúde do Trabalhador e da Ecologia Humana

ENSP – Escola Nacional de Saúde Pública

ERN - Espécies Reativas de nitrogênio

ERO - Espécies Reativas de Oxigênio

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

GPx - Glutationa peroxidase

GSH - Glutationa

GST- Glutationa S-Transferase

IARC – Agência Internacional para pesquisa do Câncer

IFN - Interferon-gama

IL- Intreleucinas

MA – Macrófagos Alveolares

MMS - Metil-metanosulfonato

MN - Micronúcleo

MS – Ministério da Saúde

NIOSH – Instituto Nacional para Segurança Ocupacional e Saúde

NK- Células Natural Killer

OIT - Organização Internacional do Trabalho

OMS – Organização Mundial de Saúde

PT – Teste tuberculínico

xi

SCGE - Single-Cell Gel Eletrophoresis

SOD- Superóxido dismutase

SPC - Separação prematura centromérica

TNF-α- Fator de Necrose Tumoral alfa

UT – Unidade Tuberculínica

UA – Unidade arbitrária

xii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 1

1.1 Sílica ........................................................................................................... 2

1.2 Exposição à sílica ......................................................................................... 2

1.2.1 Riscos de Exposição...................................................................................4

1.3 Silicose ........................................................................................................ 5

1.3.1 Caracterização da Silicose..........................................................................6

1.4 Mecanismos celulares e moleculares na silicose e exposição à sílica ............. 7

1.4.1 Resposta do Sistema Imunológico à presença de poeira de sílica.................8

1.5 Silicose e o Estresse Oxidativo ..................................................................... 9

1.6 Genotoxicidade da exposição à sílica .......................................................... 14

1.6.1 Indicadores Biológicos de Genotoxicidade................................................18

1.7 Ensaio Cometa ........................................................................................... 18

2 OBJETIVO ............................................................................................... 21

2.1 Objetivo geral ............................................................................................ 21

2.2 Objetivos específicos .................................................................................. 21

3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 22

3.1 População estudada .................................................................................... 22

3.2 Procedimentos de avaliação física e clínica ................................................. 23

3.2.1 Exame Físico e Entrevista........................................................................23

3.2.2 Exames Radiográficos do tórax................................................................24

3.2.3 Teste tuberculínico cutâneo......................................................................24

3.2.4 Teste espirométrico..................................................................................25

3.3 Coleta das amostras de sangue .................................................................... 25

3.4 Determinações dos parâmetros do estresse oxidativo ................................... 25

3.4.1 Catalase (CAT)........................................................................................25

3.4.2 Glutationa S-transferase (GST).................................................................27

3.5 Metodologia do Ensaio Cometa .................................................................. 29

3.6 Análise dos resultados ................................................................................ 33

3.7 Fator-alfa de Necrose Tumoral (TNF - α) .................................................... 33

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 35

4.1 Caracterização da População de trabalhadores expostos à Sílica .................. 35

4.1.1 Clínica dos trabalhadores expostos à sílica...............................................37

xiii

4.2 Caracterização da população não-exposta (Grupo Laboratório) ................... 39

4.3 Avaliação da Exposição .............................................................................. 40

4.3.1 Expostos não-silicóticos x Expostos silicóticos.........................................46

4.3.2 Idade.......................................................................................................48

4.3.3 Estaleiro..................................................................................................49

4.4 Raio-X e categorias da doença .................................................................... 50

4.4.1 Ensaio Cometa.........................................................................................51

4.4.2 Catalase...................................................................................................52

4.4.3 GST.........................................................................................................53

4.4.4 TNF.........................................................................................................54

4.5 Hábito de fumar ......................................................................................... 56

4.5.1 Na População exposta à sílica...................................................................56

4.5.2 No Grupo Laboratório..............................................................................58

4.6 Correlações ................................................................................................ 59

4.6.1 Log TNF x Anos de Exposição à sílica.....................................................59

4.6.2 Idade x Anos de Exposição à sílica...........................................................59

4.6.3 GST x TNF normalizado por logaritimização (Log TNF)..........................60

4.7 Análises de Regressão Linear ..................................................................... 61

4.7.1 Modelo 1.................................................................................................62

4.7.2 Modelo 2.................................................................................................64

4.8 Tuberculose / Doença..................................................................................64

4.9 Tabagismo / Doença ................................................................................... 66

4.10 Tabagismo / Tuberculose...........................................................................67

4.11 Sensibilidade e Especificidade do Ensaio Cometa .................................... 68

5 CONCLUSÕES ......................................................................................... 70

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 71

Guimarães Joca, FJ 1

1 INTRODUÇÃO

Existem diferentes formas de particulados dispersos no ar, tais como

poeiras, névoas, fumos e neblinas. Todos eles, quando gerados nos ambientes de

trabalho, podem estar relacionados com doenças ocupacionais.

A sílica possui uma ocorrência natural extensiva e um amplo uso, sendo

atribuído a este particulado um papel de destaque na exposição ocupacional de

trabalhadores de diversas ocupações e em inúmeros setores produtivos. O termo

sílica refere-se aos compostos de dióxido de silício (SiO2) nas suas formas

cristalina, vítrea e amorfa. O dióxido de silício é o composto binário de oxigênio e

silício mais abundante da Terra 1.

Poeira é toda partícula sólida capaz de ficar em suspensão no ar, formada

por trituração ou outro tipo de ruptura mecânica de um material original sólido e

possuem diferentes naturezas, origens e tamanhos, geralmente são irregulares e

maiores que 0,5 micrometros 2.

As poeiras são consideradas importantes contaminantes do ambiente de

trabalho por estarem associadas a diversos tipos de doenças do sistema

respiratório. Podem causar diferentes efeitos à saúde humana, sendo absorvidas ou

reagindo com diferentes tecidos. Estes efeitos podem ser pequenas complicações,

maiores agravos ou até mesmo uma doença progressiva e letal, como algumas

pneumoconioses. A intensidade destes danos é relacionada com tamanho, forma,

propriedades químicas, densidade e concentração das partículas no ar, além de

fatores como o tempo de exposição 3.

Quando inaladas e, por conseguinte, em contato com os tecidos biológicos,

estas poeiras induzem uma reação celular que é dependente de sua composição. A

composição do particulado tem uma importante relação com os possíveis efeitos

tóxicos nos trabalhadores expostos. Entretanto, os mecanismos das respostas

biológicas desencadeadas pela exposição são variados e complexos 4.


1.1 Sílica

Sílica é o nome de um grupo de minerais contendo silício e oxigênio,

representado por meio da fórmula geral SiO2. A sílica é uma substância

quimicamente inerte e pode ser de origem mineral, biogênica ou sintética.

Apresenta-se em forma livre, combinada com óxidos metálicos (formando-se

assim os silicatos) e em rochas.

A forma livre (SiO4) pode ser classificada como cristalina que é

quimicamente idêntica, apresentando diferenças apenas em sua estrutura.

Exemplos de formas cristalizadas são o quartzo, a cristobalita e a tridimita que

são as três formas mais importantes sob o ponto de vista da saúde ocupacional. O

α-quartzo é a forma cristalina de sílica mais estável termodinamicamente em

condições ambientais e também a mais abundante. A variedade de arranjos

estruturais que o quartzo pode apresentar resulta nas diferenças em suas

propriedades como solubilidade, características de clivagem, morfologia e

propriedades de superfície e podem ser um fator determinante na resposta

biológica 5.

A sílica cristalina é considerada carcinogênica, na forma de quartzo e de

cristobalita, em especial quando provenientes de fontes com exposições

ocupacionais. Quando sua superfície está recém-fraturada, a sílica cristalina torna-

se mais tóxica para as células do pulmão. As formas não cristalinas de sílica

(sílica amorfa) são consideradas de menor potencial fibrogênico, mas podem ter

suas estruturas transformadas em forma cristalina quando aquecidas a altas

temperaturas 6.

1.2 Exposição à sílica

Pneumoconiose é uma palavra de origem grega (conion = poeira) usada para

expressar pneumopatias relacionadas à inalação de poeiras em ambiente de

trabalho. As pneumoconioses são alterações patológicas pulmonares que impactam

o parênquima pulmonar e são mediadas por processos de hipersensibilidade, como


alguns tipos de alveolites alérgicas, induzidas pela exposição às poeiras orgânicas 7.

As doenças respiratórias associadas à exposição ocupacional a sílica

cristalina foram descritas ao longo da história. Hipócrates, Ramazzini e Lohneiss

já haviam observado e descrito efeitos à saúde dos trabalhadores relacionados à

exposição à sílica. Hipócrates descreveu uma condição de "dificuldade

respiratória" em trabalhadores de minas e, em 1690, Lohneiss observou que,

quando "poeira e pedras alcançam os pulmões, os homens desenvolvem doença

pulmonar e respiram com dificuldade”. Segundo Greenberg 8, encontraram poeira

de sílica nos pulmões de mineiros e dez anos depois, Visconti utilizou o termo

"silicose" para descrever as doenças causadas pela exposição inalatória à sílica.

Tais agravos relacionados à exposição à poeira foram confundidos durante muito

tempo com outros termos, incluindo os termos tuberculose, doença de pedreiros,

asma, entre outros. Esta doença é considerada uma das mais freqüentes doenças

ocupacionais, seguida pela exposição ao tabaco presente no ambiente e à radiação

UV 9.

Segundo Steenland 10, cerca de 8000 pessoas morrem por ano de silicose em

todo o mundo. Ribeiro 11 destaca que o Brasil apresenta a maior prevalência de

trabalhadores expostos à sílica do que a encontrada em países europeus.

Entre os principais riscos encontrados nos ambientes de trabalho está a

exposição a poeiras, favorecendo o aumento de doenças do sistema respiratório. A

Organização Mundial de Saúde (OMS) afirma que o diâmetro aerodinâmico das

partículas está fortemente associado à habilidade que as partículas possuem para

penetrar e se depositar em diferentes locais do trato respiratório 12.

A exposição ocupacional a poeiras de sílica está associada a uma série de

efeitos adversos sobre o aparelho respiratório, dentre os quais se destacam a

bronquite crônica, certas desordens de tecido conjuntivo, autoimunidades, câncer

pulmonar e a pneumoconiose clássica, conhecida como silicose 13.

Esta doença exerce um papel de destaque em diversos programas de órgãos

internacionais relacionados à saúde e trabalho, pois acomete e mata inúmeros

trabalhadores. Um destes exemplos é o Programa de Eliminação Mundial da

Silicose, lançado em 1995 pela Organização Internacional do Trabalho (OIT) e a


OMS, e visa diminuir drasticamente a prevalência desta doença em todo o mundo.

Através da adoção de diversas ações no campo da saúde coletiva, este programa

tem como objetivo principal a erradicação total desta doença até 2030 6.

Alguns fatores da exposição ocupacional á sílica devem ser considerados

tais como: composição da fração respirável, concentração de partículas em

suspensão, teor de sílica e tamanho destas partículas, presença de outros minerais

presentes em fração respirável e tempo de exposição à sílica. Além destes fatores,

a condição de saúde dos indivíduos expostos, como a integridade e efetividade das

respostas imunológica e a presença de outras patologias respiratórias, são bastante

importantes 3.

A poeira de quartzo quando inalada induz um processo inflamatório celular.

Em diferentes modelos de experimentação animal de “curta duração”, a exposição

à sílica por instilação traqueal induziu a formação de discretos nódulos silicóticos.

Esta exposição impede o clearance promovido pelos macrófagos alveolares

ocasionando lesões consecutivas e progressivas. Segundo a OMS, não existem

dados científicos da cinética do clearance de partículas de quartzo quando inaladas

e depositadas no pulmão de humanos. Um conjunto de fenômenos biológicos

ocorre após a instilação da sílica, sendo o estresse oxidativo o que está

relacionado com a capacidade das partículas de sílica de induzir citotoxicidade e

atividade fibrogênica. Estes mecanismos são os responsáveis pelos agravos

desencadeados pela exposição à sílica e estão envolvidos nos danos celulares

causados pelas partículas de sílica, são complexos e ainda não são completamente

conhecidos 3.

1.2.1 Riscos de Exposição

O risco da exposição à sílica é reconhecido desde a antiguidade, em

atividades como construção, mineração e produção de artesanatos e artigos

decorativos. Com o processo de crescimento industrial, o emprego da sílica e seu

consequente risco de exposição também aumentaram. O risco de exposição

ocupacional à sílica é encontrado em diversos ramos de atividade econômica e

diferentes processos de trabalho. Os principais exemplos são: operação de


jateamento de areia; retífica; polimento e reparo de peças metálicas e minerais

com abrasivos contendo sílica; extração e beneficiamento de rochas; mineração de

metais e pedras preciosas; perfuração de poços; indústrias de cerâmica e de

materiais de construção; construção civil; fundições; fabricação de vidro, borracha

e fertilizantes; limpeza e manutenção de moinhos, fornos e filtros; confecção de

próteses dentárias.

A exposição ocupacional à sílica é grande tanto nos países em

desenvolvimento, como nos desenvolvidos embora nos países desenvolvidos exista

uma tendência a diminuir 14. No Estado do Rio de Janeiro, os trabalhadores

expostos são provenientes, em sua maioria, da área do jateamento da indústria

naval. Em menor número, temos trabalhadores autônomos, artesãos, vidraceiros,

metalúrgicos e indivíduos que exercem diversas funções em pedreiras.

1.3 Silicose

A silicose foi reconhecida como uma doença ocupacional já no início da

história da medicina ocupacional. É considerada como a pneumoconiose mais

prevalente no Brasil e no resto do mundo, principalmente nos países em

desenvolvimento 15.

A silicose é uma doença pulmonar incurável causada pela inalação, retenção

e reação pulmonar às partículas contendo sílica cristalina respirável. É

caracterizada pela fibrose do tecido pulmonar. Uma vez iniciada, a doença é

irreversível e geralmente progressiva. As partículas causam fibrose no tecido

pulmonar que reduz a capacidade do pulmão de captar oxigênio do ar 16.

Segundo, Fujimura 17, a susceptibilidade dos indivíduos expostos é um fator

que influencia no desenvolvimento da silicose, especialmente por causa dos

complexos mecanismos celulares e moleculares desta fisiopatologia que são

diferenciadas em especial pelas diversas expressões gênicas destes indivíduos.


1.3.1 Caracterização da Silicose

Entre as pneumoconioses, a silicose se destaca por sua relevância e sua

maior freqüência. Esta complexa fisiopatologia pode ser classificada em três

formas clínicas com diferentes alterações histológicas e radiológicas. A silicose

pode ser abordada como aguda, subaguda e crônica 18.

A silicose crônica é considerada como a forma clássica da doença e pode se

desenvolver após 10-20 anos do início da exposição mesmo com uma exposição a

menores níveis de partículas. A silicose crônica é descrita de três formas: 1-

silicose simples: possui nódulos fibróticos difusos menores que 1 centímetro de

diâmetro e localizam-se nas partes altas do pulmão; 2- conglomerado de silicose

onde os nódulos tornam-se confluentes e substitui eventualmente o parênquima

pulmonar; 3- silicose massiva progressiva, uma lesão pouco comum composta de

nódulos silicóticos confluentes 19.

As partículas de sílica induzem uma reação intersticial reticuloendotelial

que começa pela ação dos macrófagos alveolares que as fagocitam, e as retém na

forma fagossômica. Como já citado, a mecanística de clearence dos macrófagos é

limitada diante das partículas de sílica. A exposição de macrófagos em cultura à

sílica acarreta a morte celular, porém os mecanismos da interação da sílica com a

célula, o destino do particulado e as causas da morte da célula ainda precisam ser

melhores elucidados 20.

A liberação das enzimas fagossômicas no citoplasma dá início a um

processo de morte celular que propicia a liberação das enzimas ativas e lipídeos

dos macrófagos, e os cristais de sílica que foram fagocitados. Estes lipídeos e

enzimas alcançam o sistema linfático na junção dos dutos alveolares, promovendo

a proliferação de células reticulares, promovendo a taxia de mais macrófagos e

fibroblastos para o local. Estas reações perpetuam-se juntamente com a exposição

contínua o que resulta na proliferação de fibras de colágeno, de reticulina e um

infiltrado inflamatório mononuclear que se dispõe em forma concêntrica,

caracterizando assim o nódulo silicótico. Dependendo da penetração dos cristais

de sílica pode ser induzida a formação de nódulos subpleurais, que podem atingir

a pleura visceral através principalmente dos vasos linfáticos.


A histopatologia observada na silicose se compõe por nódulos silicóticos

peribronquiolares e perivasculares, com arquitetura birrefrigentes à luz polarizada.

Na progressão da doença crônica, os nódulos silicóticos tendem a se aglutinar

evoluindo para conglomerados de lesões maiores e posteriormente para sítios de

grande opacidade, podendo ter a deposição de fibrose como uma cicatriz na área

de parênquima pulmonar destruída 13.

A silicose possui um lento desenvolvimento e pode progredir

independentemente da exposição continuada. Assim, boa parte dos casos só será

diagnosticada após alguns anos após a exposição mesmo que o indivíduo já esteja

afastado da mesma. A forma subaguda da doença é caracterizada por apresentar

precocemente alterações radiológicas após cinco anos de exposição à sílica. Além

disso, os sintomas respiratórios costumam ser do tipo limitante e precoce. A

presença de nódulos com infiltrados inflamatórios intersticiais intensos e

descamação celular nos alvéolos caracteriza a histopatlogia desta forma da doença 21.

Existem algumas patologias associadas à exposição à sílica, sendo a silico-

tuberculose a que mais se destaca, ocorrendo tanto em países em desenvolvimento

quanto nos desenvolvidos. Em alguns países em desenvolvimento, como a África

do Sul, a exposição à sílica é responsável por epidemias de tuberculose. A

associação da tuberculose com a silicose é estudada desde o início do século XX.

Este particulado causa um impacto no sistema imune reduzindo a efetividade da

imunidade celular que pode ser refletida na diminuição do número de linfócitos T,

nos efeitos deletérios no metabolismo e nas funções dos macrófagos pulmonares.

Em virtude da silicose e tuberculose, os indivíduos doentes podem apresentar

maior deterioração da função pulmonar 14,22,23.

1.4 Mecanismos celulares e moleculares na silicose e exposição à sílica

Os indicadores biológicos são ferramentas úteis para avaliar a exposição a

substâncias químicas, identificar precocemente as alterações ou efeitos desta

exposição, identificar o início de patologias e predizer suscetibilidades individuais


para o desenvolvimento de determinada doença bem como contribuem para

avaliação dos riscos no ambiente de trabalho.

1.4.1 Resposta do sistema imunológico à presença de poeira de sílica

Diversas citocinas participam do processo inflamatório da silicose. Estas

citocinas são pequenos polipeptídeos mediadores da inflamação e, podem

desenvolver diversos fenômenos biológicos, como inflamação, diferenciação e

crescimento celular, fibrogênese e homeostase, de acordo com o seu local de ação 24.

Muitos mediadores inflamatórios são reconhecidos como cruciais na

indução desta fisipatologia induzida pela exposição à sílica. Entre estes se

destacam citocinas como a Interleucina 1 (IL-1), 6 (IL-6), 10 (IL-10) e o Fator de

necrose tumoral α (TNF-α). O TNF-α, uma citocina tipicamente pleiotrópica se

destacando como um importante mediador da resposta inflamatória e do processo

fibriogênico após a exposição a diferentes agentes tóxicos ao pulmão. As lesões

silicóticas se desenvolvem através da secreção crônica de mediadores

inflamatórios e fibróticos. Modelos experimentais utilizando animais e estudos

clínicos indicam que o TNF-α e o IL-1 são importantes mediadores que regulam a

silicose e são derivados primariamente de macrófagos alveolares e células

epiteliais tipo II nos pulmões 25,26.

Em mineiros expostos a carvão e com pneumoconiose, o TNF-α é liberado

de monócitos de sangue periférico e em mineradores com fibrose progressiva

maciça e com pneumoconiose simples os mediadores TNF-α e IL-1 têm contínua

liberação dos macrófagos alveolares. O TNF-α é uma citocina pró-inflamatória

que desempenha uma série de fenômenos biológicos tanto fisiológicos quanto

patológicos. A superprodução desta citocina provoca danos no organismo e sua

síntese é controlada de forma específica pelas células, através de uma forte

regulação da expressão do gene regulador 27.

A associação pleiotrópica das citocinas com a resposta tecidual frente a

processos de agressão e lesão é conhecida em diferentes tecidos. As citocinas são

moléculas mediadoras que não ficam restritas a respostas efetoras e regulatórias


frente a processos infecciosos. Elas disparam e controlam fenômenos direta e

indiretamente relacionados com a “reação” tecidual, implicando em remodelagens

teciduais que podem ser de reparo funcional ou cicatrizante como a própria

fibrose. Desta forma, a inflamação e seus mediadores, se apresentam como

fenômenos cruciais no desenvolvimento e desfecho de doenças inflamatórias a

serem melhores compreendidas.

1.5 Silicose e o Estresse Oxidativo

A exposição a partículas de sílica provoca uma inflamação persistente

sustentada pela liberação de oxidantes nos alvéolos pulmonares. As espécies

reativas de oxigênio (EROs) incluem radicais hidroxilas, superóxido, peróxido de

hidrogênio e singleto de oxigênio, que são gerados tanto nas superfícies das

partículas de sílica, mas também pelas células fagocíticas na tentativa de digerir as

mesmas partículas. Dois tipos diferentes de radicais de sílica quando ligados

fracamente a íons de ferro geram por diferentes mecanismos os radicais HO• e

O2•- em solução aquosa. A sílica cristalina é um forte estimulador do “burst”

respiratório nas células fagocitárias, tanto como nos macrófagos, aumentando o

consumo de oxigênio e a produção de O•, H2O2 e NO levando há uma intensa

inflamação e a geração de HO• nos pulmões. É através da geração de oxidantes

tanto pelas partículas de sílica cristalina como pelas células ativadas pela mesma

que se propicia lesões pulmonares e disparam os mecanismos e sinalizações

celulares que levam aos impactos genotóxicos secundários da exposição à sílica.

Além disto, o dano oxidativo ao DNA é considerado um importante fator no

processo de carcinogênese 28,29.

As espécies de oxigênio reativas são geradas diretamente pelo depósito de

poeiras fibrogênicas no tecido pulmonar e, indiretamente, pelos macrófagos

alveolares e leucócitos polimorfonucleares, que são liberadas durante a fagocitose

das partículas de poeira. A produção elevada e contínua de EROs ou sua

inadequada remoção pode suprimir o sistema de defesa antioxidante e resultar no

estresse oxidativo, devido a um desequilíbrio entre os antioxidantes e oxidantes,

em favor dos oxidantes, conduzindo a danos celulares no pulmão 30,31,32.


A Figura 1 ilustra a resposta celular à exposição à sílica no tecido

pulmonar. Uma vez a poeira de sílica dentro do espaço alveolar, a partícula pode

reagir com a matriz extracelular (etapa 1) e ser fagocitada pelos macrófagos

alveolares (AMs), que destrói as partículas presentes no pulmão (etapa 2).

Dependendo da característica superficial das partículas, este processo de limpeza

pode se repetir (etapa 3) ou provocar a ativação de macrófagos e/ou levar a morte

celular (etapa 4). Em último caso, os macrófagos serão ativados, a nível celular e

molecular, provocando a ativação dos fatores de transcrição e a liberação de EROs

e espécies reativas de nitrogênio (ERN), fatores quimiotáticos, enzimas líticas,

citocinas, fatores de crescimento, podendo levar a uma eventual morte celular

(necrose/apoptose) e liberação de partículas. Subseqüentes ciclos de ingestão-

reingestão acompanhados por um contínuo recrutamento de AM, neutrófilos

(PMN) e linfócitos são a causa do processo inflamatório crônico pela sílica.

Portanto, as células-alvos, células do epitélio bronquiolar e alveolar, serão então

afetadas por produtos dos macrófagos (etapa 5) e pela própria partícula (de sílica)

extracelular (etapa 6), outra vez resultando na ativação e/ou morte celular 29.

As espécies oxigênio reativas e as citocinas pró-inflamatórias específicas

(TNF-α) ativam fatores transcricionais incluindo o fator-kB (NF-kB), via

específica de sinalização intracelular. A translocação dos fatores de transcrição

para o núcleo do citoplasma inicia subsequentemente a transcrição de genes com

múltiplas funções inflamatórias, incluindo citocinas (TNF, IL-4, IL10) e enzimas

antioxidantes, tais como glutationa peroxidase, superoxido dismutase e catalase 29,31.


Figura 1 - Esquema da resposta celular induzida pela sílica.

(1) interação com a matéria extracelular; (2) fagocitose pelos macrófagos alveolares (AM); (3) Limpeza; (4) ativação dos macrófagos e/ou morte; (5) resposta das células alvos pelos produtos dos macrófagos; (6) ação direta das partículas nas células alvos; (7) geração excessiva de ERO e ERN (adaptado de FUBINI & HUBBARD, 2003)29.

Dentre os antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos podemos citar, a

superóxido dismutase (SOD), a glutationa peroxidase (GPx), a Glutationa S-

Transferase (GST), a catalase (CAT) e a glutationa (GSH) 32,33,34. Estes sistemas estão

localizados em três compartimentos: o tecido pulmonar, fluido intersticial e os

eritrócitos circulantes 35. O eritrócito contém uma grande quantidade de enzimas

antioxidantes e a determinação das atividades dessas enzimas eritrocitárias pode ser

realizada por métodos simples, específicos e não invasivos, utilizando um

equipamento do tipo fotométrico, para a investigação da função do estresse oxidativo

em trabalhadores expostos ocupacionalmente a partículas de poeira em atividades

consideradas de risco para a silicose 33.

A SOD catalisa a destruição do radical ânion superóxido (O2-), convertendo-o

em oxigênio e peróxido de hidrogênio. A ação desta enzima permite a eliminação do

O2- mesmo em baixas concentrações. Existem duas formas de SOD no organismo, a

primeira contém Cu2+ e Zn2+ como centros redox, presente no citosol, e a segunda

contém Mn2+ como centro redox e está presente na mitocôndria.


A enzima catalase atua na dismutação do peróxido de hidrogênio (H2O2) em

oxigênio e água 30,32,34. A molécula de H2O2 isoladamente é praticamente inócua,

porém pode se difundir facilmente através das membranas celulares (membrana do

núcleo e mitocondrial). Devido ao fato da célula possuir metais de transição,

ocorre geração do radical hidroxila (HO•) em seu interior. O radical HO• causa

danos ao DNA, RNA, às proteínas, lipídios e membranas celulares 36,37.

A GSH e as GPx fazem parte de um grupo de enzimas que possuem selênio

(selenocisteína) em sua estrutura, que atuam catalisando a dismutação do peróxido

de hidrogênio em água e oxigênio, sendo que a glutationa opera em ciclos entre

sua forma oxidada e sua forma reduzida na presença de GPx 38.

As GST são um exemplo de enzimas metabólicas, cujos polimorfismos vêm

sendo associados à maior sensibilidade a compostos químicos, representando uma

superfamília de enzimas que atuam nas reações metabólicas de fase II (reações de

conjugação), preparando compostos químicos para serem eliminados do

organismo. A GST também faz parte do sistema de defesa antioxidante do

organismo, auxiliando na resposta ao estresse oxidativo 39. De maneira geral, as

GST catalisam a conjugação do grupamento glutation (GSH) com substratos

eletrofílicos. Estes substratos podem ser endógenos ou metabólitos de

xenobióticos provenientes da primeira etapa (reações de fase I) do processo de

metabolização de substâncias químicas realizado pelo organismo 40,41.

Muitos argumentos suportam a hipótese de que os marcadores da resposta

ao estresse oxidativo sejam um intermediário fenotípico para a pneumoconiose. A

pneumoconiose está relacionada com o aumento quantitativo de peróxido de

hidrogênio e, as enzimas catalase, glutationa peroxidase e a superoxido dismutase

atuam na degradação desta molécula 31.

Recentemente estudos têm mostrado que parâmetros antioxidantes em

eritrócitos apresentaram uma associação negativa de acordo com a severidade das

pneumoconioses, como por exemplo, a enzima SOD, enquanto outras enzimas

apresentam associações positivas, tais como CAT e GPx 30.

Altin e colaboradores 42 realizaram um estudo populacional com 89

trabalhadores, em que objetivou entender melhor a relação entre a exposição

ocupacional à poeira de carvoarias e as atividades das enzimas antioxidantes (SOD


e GPx) e a concentração de malondialdeído (MDA, peroxidação lipídica) em

sangue. O diagnóstico de pneumoconiose, em estágio precoce e em baixo grau, foi

realizado através da tomografia computadorizada. Diferenças estatísticas (p<0,05)

foram encontradas entre os grupos controle (n= 46) e o grupo com pneumoconiose

(n=43, profusões0/1 a 2/2) em relação à MDA, SOD e GPx (r=0,508; r=-0,487 e

r=-0,592, respectivamente). Em paralelo com as profusões das pneumoconioses, os

níveis de MDA foram mais altos, enquanto que as atividades de SOD e GPx

diminuíram com o aumento das profusões.

Já o estudo realizado por Nadif e colaboradores 30 em 240 trabalhadores de

carvoarias na França, separados em grupos com concentrações baixa e alta de

poeira, encontrou correlações positivas e significativas entre a catalase e

glutationa peroxidase de acordo com a exposição à poeira (r=0,350, p=0,006;

r=0,380, p=0,003), enquanto que em relação à superoxido dismutase encontrou

uma correlação negativa (r=-0,380, p=0,003). Comparando-se as enzimas

antioxidantes e os cinco subgrupos de grau de profusão, de acordo com a

classificação da OIT de 1980 43, a atividade da catalase mostrou uma associação

positiva. Já a atividade da SOD apresentou uma associação negativa com relação à

severidade da pneumoconiose. Foi também observada uma relação entre a

atividade da catalase e a pneumoconiose em que foi maior em mineradores com a

contagem de micronódulo.

Em um estudo realizado por Evelo e colaboradores 44 foi observada uma

diminuição da atividade da GST em trabalhadores de carvoarias com um estágio

inicial de pneumoconiose, assim como uma diminuição da atividade da GPx e da

concentração de GSH, podendo estas variações terem sido originadas de danos

causados por EROs.

O tecido epitelial das vias aéreas é um alvo para espécies reativa de

oxigênio (ROS), seja através da inalação dos mesmos do ambiente, oriundos ou

inalados a partir do ambiente exterior ou liberados de leucócitos recrutados e

acumulados durante a inflamação pulmonar. As células epiteliais dos alvéolos e o

fluído do revestimento alveolar possuem a proteção de enzimas e moléculas

antioxidantes 45. Uma dessas moléculas é a glutationa (GSH), um tripeptídeo (γ-L-

glutamil-L-cisteinilglicina) que é o mais abundante, é um onipresente tiol não

proteico encontrada em células no seu estado reduzido. A GSH é um importante


antioxidante protetor frente a radicais livres, compostos eletrofílicos, xenobióticas

e outros oxidantes. A GSH tem participação em diversos eventos celulares como a

resposta inflamatória, a remodelação de matriz extracelular e até mesmo a

regulação de proliferação celular 46.

A enzima GST é uma das principais vias de detoxificação através da

conjugação do xenobiótico com a GSH que é vital antioxidante presente tanto no

interior como no meio extracelular com papel protetor frente a estresses oxidativos

e que desempenha um papel crucial no controle de processos pró-inflamatórios

que acometem os pulmões. Ou seja, a atividade desta enzima pode refletir

alterações no metabolismo da GSH que indicam e implicam em um desequilíbrio

oxidante/antioxidante e por sua vez indicam e implicam em um processo

inflamatório e lesivo nos pulmões. Pode assim também sinalizar e ajudar a

elucidar também os impactos genotóxicos de origem secundária no microambiente

pulmonar. Desta forma, pode fornecer informações que se somem às informações

fornecidas pelos ensaios de genotoxicidade como o Ensaio Cometa 47,48.

Os danos oxidativos ao DNA são considerados como marcadores do próprio

estresse oxidativo e portanto, pode ser também um marcador preditivo de doenças

relacionadas ao estresse oxidativo 49.

1.6 Genotoxicidade da exposição à sílica

O termo genotoxicidade foi utilizado pela primeira vez há três décadas para

descrever componentes da interação química com material genético. O termo

genotóxico é uma expressão geral proposta para expressar efeitos tóxicos, letais e

hereditários no material genético nuclear e externo ao núcleo celular, tanto em

células somáticas como em células germinativas 50.

Substâncias genotóxicas são aquelas que possuem uma capacidade biológica

direta, ou secundária, através de seus metabólitos de alterar a codificação do

DNA. Um agente tóxico é dito genotóxico quando ocasiona alterações na estrutura

ou no conteúdo dos cromossomos (clastogenicidade) ou da sequência de pares de

bases do DNA. Estes efeitos podem ocorrer mesmo em exposições à baixas

concentrações e, deste modo, podem acarretar problemas reprodutivos, alteração


do desenvolvimento embrionário e alterar o desenvolvimento do organismo adulto,

incluindo processos carcinogênicos 51,52,53.

Nas últimas décadas, diversos testes de genotoxicidade foram

desenvolvidos e vêm sendo utilizados para avaliar o potencial genotóxico das

substâncias químicas. Estudos demonstraram alterações citogenéticas associadas à

exposição à sílica, como o aumento da incidência de aberrações cromossomiais e

troca de cromátides irmãs. A sílica cristalina é considerada um carcinógeno

pulmonar sendo classificado pela IARC no grupo de Carcinógenos humanos,

Grupo I 54. Várias propriedades químicas intrínsecas a particulados como a sílica

têm sido propostas para explicar os danos genotóxicos primários e secundários

oriundos da exposição 55.

Os testes de genotoxicidade constituem uma importante etapa de pesquisa

do câncer e na avaliação de risco de potenciais carcinogênicos. A carcinogenese

caracteriza-se como uma sequência de eventos que incluem a ocorrência de

alterações genéticas relacionadas à ativação de oncogenes, a inativação de genes

supressores tumorais, e que podem até culminar na ativação de genes do ciclo

celular. Desta forma, estas alterações implicam em proliferações descontroladas e

até mesmo em indiferenciações celulares. O fenômeno da carcinogênese é dividido

em dois fenômenos: iniciação e a promoção. É justamente na fase de iniciação que

se considera os eventos genotóxicos sendo importantes como regentes da mesma.

Para uma avaliação de risco é necessário tanto avaliar e identificar a

carcinogenicidade de exposições químicas, mas também averiguar se a mesma é

ou não genotóxica 53,55.

Os testes de genotoxicidade são diversos, porém complementares na

avaliação da situação de genotoxicidade, de modo a se encontrar tanto testes

altamente sensíveis como também testes não tão sensíveis, porém mais

específicos. Segundo Møller 56, o teste do Ensaio Cometa é um ensaio adequado e

deve ser incluído no monitoramento de populações em exposição ocupacional.

Além disso, diferentes estudos em matrizes biológicas apontam o Ensaio Cometa

como um indicador altamente sensível para exposição a agentes reconhecidos

como carcinógenos, e extremamente sensível para uma variedade de classes de

danos ao DNA 57,58.


Knaapen 59 encontrou danos ao DNA através do Ensaio Cometa em células

epiteliais de pulmão de ratos expostos por instilação a um padrão de quartzo. Este

autor cita neste estudo alguns trabalhos anteriores que já demonstravam in vivo o

potencial genotóxico da sílica. Dentre eles, Yamano e colaboradores 60 detectaram

este potencial através da quantificação de 8-hidroxido-2’-deoxiguanosina, uma

modificação do DNA caracteristicamente produzida por EROs e que está

relacionada a possíveis pontos de mutação de bases nitrogenadas.

O comportamento físico-químico de particulados é na maioria das vezes

bem diferente dos carcinogênicos químicos não-particulados. Acredita-se que

espécies reativas de oxigênio (EROs) exercem um papel fundamental na

genotoxicidade primária de particulados, que pode derivar de suas propriedades de

superfície e do contato direto com estas, da presença de metais de transição nos

mesmos, da mobilização de ferro intracelular, e da peroxidação de lipídeos.

Outros aspectos relevantes para a genotoxicidade primária são: tamanho de

partículas, sua forma, sua cristalinidade e a sua solubilidade, e pode também

incluir a captação da partícula, a interação com a maquinaria de divisão celular e a

presença de mutagênicos carreados com a partícula 61.

As figuras 2 e 3 ilustram como funcionam os fenômenos relacionados aos

mecanismos que ocasionam tanto os danos genotóxicos primários como os

secundários, ressaltando a utilização de testes de genotoxicidade e de testes de

marcadores de dano oxidativo ao DNA para a detecção destes danos. Os estudos in

vitro contribuem para entender e identificar propriedades genotóxicas primárias

como, por exemplo, no caso da sílica, a geração de oxidantes a partir do quartzo.

Ao passo que estudos in vivo contribuem para o entendimento de como a

inflamação pulmonar induzida por particulados e o estresse oxidativo associado

ocasionam o dano genotóxico secundário. Além disso, este tipo de estudo pode

fornecer informações a respeito de possíveis relações dose-efeito tanto para a

inflamação como para os efeitos genotóxicos 37.


Figura 2 - Danos Genotóxicos Primários e Secundários (adaptado de SCHINS, 2002)37

Figura 3 - Danos Genotóxicos primários e secundários suas causas e conseqüências (adaptado de SCHINS, 2002)37

A matriz biológica comumente usada nos testes de genotoxicidade são as

células sanguíneas onde se encontra a população celular linfocitária que, por

transpassar diversos compartimentos do organismo humano, pode refletir

eficazmente efeitos gerados no organismo exposto, mesmo não sendo células alvos

do agente genotóxico. Além disso, pela sua fácil obtenção, esta matriz colabora

para que a metodologia seja pouco invasiva e mais rápida. Os leucócitos são

classicamente utilizados em testes cromossomiais, e mais recentemente em testes

que detectam quebras no DNA e a formação de adutos como a 8-OHdG, um

marcador de dano oxidativo do DNA 62,63.


1.6.1 Indicadores Biológicos de Genotoxicidade

Os métodos genotóxicos mais comumente utilizados na avaliação de

substâncias químicas são as quebras de fita do DNA, as alterações nas bases

nitrogenadas, a formação de adutos; as Aberrações Cromossomiais (AC), os

micronúcleos (MN), e a troca de cromátides irmãs (SCE). Nos últimos anos, o

Ensaio Cometa em condições alcalina tornou-se uma relevante ferramenta no

contexto do monitoramento biológico humano e estudos de avaliação de danos

genéticos em populações expostas a agentes genotóxicos 64,65.

1.7 Ensaio Cometa

O Ensaio Cometa é um teste de genotoxicidade simples, de baixo custo,

versátil, rápido e extremamente sensível para qualquer população de célula

eucariótica. Também é empregado para investigar os efeitos de antioxidantes e do

estresse oxidativo, além de possuir aplicações em diferentes áreas tais como,

genotoxicidade, monitoramento biológico humano e epidemiologia molecular e até

mesmo a ecotoxicologia 56,58,66,67.

Conceitos da técnica como tratamento alcalino para se obter a detecção da

quebras em fita simples, a necessidade de calibração dos Cometas, a importância

da profundidade do tampão de corrida e as diferentes formas de leitura do Ensaio

estão em ampla discussão e dirigem a melhora e o desenvolvimento da técnica.

Outra discussão que se destaca, é a utilização de padrões internos como o uso de

controles positivos de danos ao DNA, como por exemplo, a exposição de amostras

ao mutagênico MMS, para se obter tais controles 68,69,70.

O ensaio Cometa utiliza células individualizadas em gel de agarose, sobre

lâminas de microscopia filmadas em agarose, que são lisadas e depois submetidas

a um processo de eletroforese (Figura 4). Este processo faz com que a corrente

elétrica desloque o DNA para fora do núcleóide. Esta migração se configura em

um arrasto em forma de cauda, remetendo a imagem de um Cometa que pode ser

visto na figura 5. Por tudo isso, essa técnica foi chamada de ensaio Cometa ou

também de eletroforese em gel de célula única 71.


Figura 4 - Desenho esquemático da técnica de Ensaio Cometa. (Fonte: http://www.inf.ufsc.br/~awangenh/temas.html)

Figura 5 - Imagem por microscopia de fluorescência da migração de DNA, no ensaio Cometa. (MOTA et al., 2007)72

Quanto mais fragmentado estiver o DNA, mais rapidamente o mesmo

migrará na eletroforese. Pode-se visualizar esta migração ao corarmos as Lâminas

com um corante que se ligue a DNA, como o intercalante brometo de etídio, e

submetê-las posteriormente a visualização em microscopia Ótica de Fluorescência.

Quanto maior o arrasto (a cauda formada do Cometa), maior será o dano estimado

ao DNA causado pelo agente genotóxico 52,64,71.

O Ensaio Cometa em condições alcalinas é o mais utilizado atualmente. A

condição alcalina não necessariamente aumenta a sensibilidade da técnica (danos

mínimos poderiam ainda ser detectados sem ele), porém o pH alcalino é

responsável pela formação de uma cauda mais pronunciada e também por uma

melhor resolução do ensaio 73.

Existem diversas e sofisticadas formas para se realizar a leitura das lâminas

do Ensaio Cometa. Os sistemas que se utilizam de softwares são modos menos

trabalhosos, porém demandam aquisições de custo elevado. É possível, contudo,

manter o baixo custo da técnica e a qualidade da leitura quando esta é feita através


da contagem e descriminação dos danos por um operador treinado, expressando,

assim, o resultado da leitura em unidades arbritárias. Alguns estudos mostram que

não há diferença significativa no resultado final do método com operador e com o

que utiliza Softwares específicos 69.

Mediante os fatores individuais que podem influenciar os resultados do

Ensaio Cometa, esta técnica configura uma ferramenta que, apesar de muito útil

para estudos populacionais humanos, ainda não pode ser aplicada à avaliação de

risco individual de doenças como o câncer. É uma ferramenta que no momento só

deve ser aplicada aos indivíduos quando situados em um contexto populacional 73.


2 OBJETIVO

2.1 Objetivo geral

O objetivo deste estudo é avaliar danos genotóxicos e alterações em

parâmetros enzimáticos do estresse oxidativo decorrentes de exposição à sílica, em

trabalhadores expostos e não expostos, atendidos no Ambulatório de

Pneumatologia Ocupacional do Centro de Estudo da Saúde do Trabalhador e

Ecologia Humana (CESTEH) da Escola Nacional de Saúde Pública

(ENSP/FIOCRUZ).

2.2 Objetivos específicos

• Implementação da metodologia de genotoxicidade de Ensaio Cometa no

Laboratório de Toxicologia do CESTEH;

• Aplicação do teste de Ensaio Cometa no universo amostral;

• Determinação das atividades das enzimas do estresse oxidativo Catalase

(CAT) e Glutationa S-Transferase (GST) no universo amostral;

• Determinação dos níveis da Citocina TNF no universo amostral;

• Associação dos sinais clínicos da doença silicose com os parâmetros da

resposta ao estímulo oxidativo e com os resultados da avaliação genotóxica

por ensaio Cometa;

• Associação das variáveis: hábito de fumar, idade e tempo de exposição,

obtidas através de questionário, com os resultados do ensaio Cometa,

parâmetros do estresse oxidativo, níveis de TNF e da avaliação clínica.


3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 População estudada

A população deste estudo foi composta de trabalhadores advindos do

Ambulatório de Pneumopatia Ocupacional do Centro de Saúde do Trabalhador e

Ecologia Humana (CESTEH) da Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca

(ENSP) da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), localizado em Manguinhos, na

cidade do Rio de janeiro. Os trabalhadores foram selecionados aleatoriamente no

banco de dados do Ambulatório de Pneumopatias Ocupacionais tendo estes idades

superiores a 18 anos.

Para a realização desta dissertação, os trabalhadores foram divididos em

dois grupos: não exposto e exposto ocupacionalmente a sílica. O grupo não

exposto foi constituído de técnicos laboratoriais do CESTEH, selecionados

aleatoriamente (Grupo Laboratório).

O grupo exposto à sílica foi subdividido em dois subgrupos: exposto

doente, ou seja, os que apresentavam silicose, e exposto não doente, que não

apresentavam a doença. Para tanto, foi considerado trabalhador exposto doente,

aquele com RX de tórax ≥ 1/0, e exposto não doente, com RX de tórax =0/0, de

acordo com as normas da OIT 43.

Os critérios de inclusão adotados foram: idade superior a 18 anos, atendidos

no Ambulatório de Pneumopatias Ocupacionais, através de livre demanda, com

exposição ocupacional à sílica ou não (grupo Laboratório) e participação

voluntária do estudo através da assinatura do termo de consentimento livre e

esclarecido (TCLE). Como critério de exclusão foi adotado o teste tuberculínico

(PPD de Mantoux) positivo para os voluntários. As análises laboratoriais foram

realizadas no Setor de Indicadores Biológicos do Laboratório de Toxicologia do

CESTEH.

Após o consentimento em participar do estudo, todos os voluntários

seguiram as seguintes etapas (Figura 6): 1- Responder a um questionário de sinais

e sintomas pulmonares e características de suas atividades profissionais e de

exposição a substâncias químicas no ambiente de trabalho; 2- exame clínico; 3-


realização de PPD; 4- espirometria; 4- radiografia e, por fim, 5- coleta das

amostras de sangue para as análises de Ensaio Cometa, de resposta ao estresse

oxidativo, e dosagem de TNF.

Figura 6 - Esquema das etapas iniciais do projeto durante o período de sua realização.

3.2 Procedimentos de avaliação física e clínica

3.2.1 Exame físico e entrevista

Os exames físicos e a entrevista consistiram de análise de dados clínico e

sócio-demográficos, com a finalidade de avaliar o grau de acometimento dos

indivíduos e a evolução clínica dos sintomas, além de identificar outras co-

morbidades, como alcoolismo, tabagismo, diabete mellitus, hepatite, doenças auto-

imunes, insuficiência renal, entre outras.


3.2.2 Exames radiográficos do tórax

A técnica radiológica utilizada encontrava-se dentro dos padrões da

Organização Internacional do Trabalho (OIT) de 1980 43. Foram consideradas

alteradas as radiografias em que a média da leitura era maior que 1/0. As

radiografias foram classificadas quanto à profusão de lesões, e o tipo de lesão no

parênquima pulmonar, e foram divididas em categorias de 0 a 3 (Figura 9),

conforme a gravidade da doença.

Tabela 1 - Classificação das leituras de raios-x em categorias de 0 a 3, conforme as normas da OIT de 1980 43.

3.2.3 Teste tuberculínico cutâneo

O teste tuberculínico (PT) foi feito com 5 UT de PPD-S pela técnica de

Mantoux, de acordo com o Centers for Disease Control 74, com leitura entre 48 e

72 horas. Os resultados da leitura foram registrados, segundo os critérios dos

“CDC” e Ministério da Saúde 7 em: teste tuberculínico positivo e PT negativo. O

teste tuberculínico positivo foi considerado aquele com enduração ≥10mm (forte

reator), enquanto o PT negativo foi considerado aquele com enduração <10mm

(fraco reator ou não reator) 74. O método utilizado para a leitura foi o palpatório e,

no momento da leitura, os indivíduos com PT positivo foram indagados quanto à

presença de sintomas respiratórios prolongados e febre, e encaminhados para

tratamento adequado. Os indivíduos com PT negativo realizaram, após uma

semana, um segundo PT.

Categoria 0 raios-x com leitura 0/-, 0/0 e 0/1

Categoria 1 raios-x com leitura 1/0, 1/1 e 1/2

Categoria 2 raios-x com leitura 2/1, 2/2 e 2/3

Categoria 3 raios-x com leitura 3/2, 3/3 e 3/+


3.2.4 Teste espirométrico

O teste espirométrico foi realizado de acordo com a técnica orientada pela

American Thoracic Society 75 que consiste numa expiração forçada até o limite do

volume de reserva expiratória, após inspiração máxima. A espirometria avalia a

função ventilatória, refletindo dados sobre distensibilidade ou resistência elástica

do aparelho respiratório e sobre a resistência ao fluxo aéreo. É um teste que

auxilia na prevenção e permite o diagnóstico e a quantificação dos distúrbios

ventilatórios, tendo um importante papel na pneumologia ocupacional.

Os indivíduos do grupo Laboratório não passaram pelos procedimentos dos

exames físico, radiográfico do tórax, teste tuberculínico cutâneo e espirométrico.

3.3 Coleta das amostras de sangue

Amostras sanguíneas, com aproximadamente 10 mL, foram coletadas por

profissional habilitado em tubos a vácuo, contendo anticoagulante, e

acondicionadas sob refrigeração até o momento das análises de hemograma

completo, de Ensaio Cometa, das enzimas CAT e GST e da Citocina TNF.

As análises de hemograma completo foram realizadas no Centro de Saúde

da ENSP e a parte experimental do trabalho foi realizada no Laboratório de

Toxicologia do CESTEH/FIOCRUZ. As metodologias executadas foram

padronizadas, de acordo com critérios e testes de acuidade e precisão analíticas.

3.4 Determinações dos parâmetros do estresse oxidativo

3.4.1 Catalase (CAT)

A determinação da atividade da enzima Catalase (CAT) em eritrócitos

humanos foi realizada baseada no método de Aebi 76 que tem por finalidade

quantificar a atividade da enzima CAT através da decomposição de H2O2 a uma

D.O de 230nm.


Soluções utilizadas

• Solução de tampão fosfato [fosfato de potássio monobásico 50mM; fosfato de

sódio dibásico 50mM, pH 7,0];

• Solução de peróxido de hidrogênio [30% de H2O2 em solução de tampão fosfato

(50mM, pH 7,0)];

• Solução de cloreto de sódio isotônico [0,9% NaCl em água destilada].

Procedimento

Nota: As amostras de sangue (coletadas em tubos heparinizados) devem ser

mantidas a 0°C (banho de gelo) durante toda a elaboração das análises, a serem

realizadas no mesmo dia de coleta das amostras para o não comprometimento da

atividade enzimática.

Para cada amostra, separa-se uma alíquota de 2mL em tubos e centrifuga-se

as amostras por 10 minutos a 3500 rpm a 4°C. Posteriormente, despreza-se o

plasma (sobrenadante). Uma alíquota de 500µL de sedimento de eritrócitos de

cada amostra é transferida para outro tubo de centrífuga refrigerada, onde se

acrescenta 5mL de cloreto de sódio (solução salina) para a lavagem dos

eritrócitos. Homogeneízam-se os tubos por 15 segundos e, em seguida, centrifuga-

se as amostras por 10 minutos a 3500 rpm a 4°C. Esse processo de lavagem é

repetido por mais duas vezes. Após as 3 lavagens, transfere-se 50µL do sedimento

de eritrócitos para um tubo de vidro e adiciona-se 200µL de água deionizada, para

a hemólise dos eritrócitos, formando assim o hemolisado concentrado. Este

procedimento é realizado em triplicata. Posteriormente, homogeneízam-se os tubos

por 20 segundo, sendo os mesmos mantidos em banho de gelo até o momento da

leitura no espectrofotômetro.

Momentos antes da análise espectrofotométrica, deve ser preparada a

solução de peróxido de hidrogênio e o hemolisado diluído, através da adição de

5µL do hemolisado concentrado e 2,5mL de tampão fosfato. A leitura das

amostras transcorre no modo cinético por 15 segundos a um comprimento de onda

de 230nm. Para a leitura do branco, adiciona-se na cubeta, 2 mL do hemolisado


diluído e 1 mL de tampão fosfato e para a leitura das amostras, adicionar na

cubeta, 2 mL do hemolisado diluído e 1 mL de peróxido de hidrogênio.

Cálculos

Não é possível definir uma unidade internacional para a catalase, portanto

recomenda-se o uso de uma constante de reação de 1ª ordem (k). Esta constante

pode ser relacionada com o teor de hemoglobina presente na amostra (k/g Hb), que

serve como uma medida da atividade específica da catalase em eritrócitos. Os

cálculos de CAT são baseados nas seguintes fórmulas:

k = (2,3/15) (log A1/A2);

k = 0,153 (log A1/A2) (segundos-1);

k/mL = ka;

k/g Hb = k/mL (1000/b) = 0,153 (a/b)(log A1/A2).

Onde,

A1 = absorvância no t=0;

A2 = absorvância no t=15 segundo;

a = Fator de diluição;

b = teor de hemoglobina (Hb) em grama/litro (g/L)

Nota: Para o cálculo da atividade da enzima catalase há a necessidade do

valor do teor de hemoglobina nos eritrócitos. Portanto, utilizou-se exame de

hemograma completo recente (até 3 meses) ou solicitou-se o pedido do exame

através do laboratório.

3.4.2 Glutationa S-tranferase

A determinação da atividade enzimática da GST foi realizado por

espectrofotometria UV-Visível, utilizando comprimento de onda de 340nm e 1-


cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como substrato universal, de acordo com o

método descrito por Habig et al 77.

Reagentes

• Solução de cloreto de sódio isotônico [0,9% NaCl em água destilada];

• Tampão Fosfato 0,1M [KH2PO4 0,1M; K2HPO4 0,1M; pH=6,5];

• Solução de Etanol (EtOH) 95% (v/v);

• Solução de CDNB 0,3M, preparada em solução de EtOH 95%;

• Solução de GSH 0,3M, preparada em Tampão Fosfato 0,1 M.

Procedimentos

Lavagem de Eritrócitos

Logo após a coleta de sangue, transfere-se, para um novo tubo de ensaio,

uma alíquota de 2 mL de sangue total e centrifuga-se a amostra a 3000 rpm por 30

minutos. Em seguida, retira-se uma alíquota de 500µL de eritrócitos (sedimento),

sendo transferida para um novo tubo de ensaio, onde se adiciona 5 mL de NaCl 0,9

%, para a lavagem dos eritrócitos.

Homogeneíza-se cada tubo por 15 segundos, e posteriormente, centrifugam-se

os mesmos a 3000 rpm por 10 minutos. Ao término da centrifugação, retira-se a parte

sobrenadante, com o auxílio de uma pipeta, tomando cuidado para não aspirar

eritrócitos precipitados. Os procedimentos de lavagem de eritrócito são realizados 3

vezes. Após a terceira lavagem, transferem-se duas alíquotas de 50 µL de eritrócitos

de cada amostra para dois novos tubos, onde se adiciona 1450µL de Água Tipo I e,

em seguida, homogeneíza-se por 30 segundos, ocorrendo a hemólise.

No momento da leitura, prepara-se a mistura de PBS + GSH + CDNB em

um tubo, conforme Tabela 2, homogeneíza-se a mistura, sendo transferida, em

seguida, para a cubeta. Para o branco, adicionar 100µL de PBS no lugar do

hemolisado e para a amostra, adicionar o hemolisado diretamente na cubeta,

fazendo 5 ciclos de aspiração com a pipeta, para homogeneizar. A leitura das

amostras foi realizada em modo cinético, a 340 nm, durante 1 minuto.


Tabela 2 - Quantidade de reagentes para o branco e amostras (em microlitros):

Reagentes Branco Amostra

PBS 2800 2700

GSH 100 100

CDNB 100 100

Hemolisado - 100

Cálculo

Unidade/mL = [∆Abs/min Amostra - ∆Abs/min Branco x (3,0)(FD)]/[(9,6)x(0,1)]

Onde:

Fator de extinção molar = 9,6

Volume do hemolizado utilizado = 0,1 mL

Volume final na cubeta = 3,0 mL

FD = fator de diluição

3.5 Metodologia do Ensaio Cometa

Soluções Utilizadas

• Solução de Lise celular [NCl 2,5 M; Tris-HCl 10 mM; EDTA 100mM; Lauril

Sulfato de sódio 1%; pH 10];

• Tampão de Eletroforese [300mM / 1mM EDTA];

• Tampão de Neutralização [Tris 0,4 M];

• Solução de Brometo de etídeo [40ug/mL];

• Agarose [1,5%];

• Agarose Low Melting Point (LMP) [0,5%];


• Solução A [MMS 80mM];

• Solução B [MMS 0,8mM]; Soluções Controle Positivo

• Solução C [MMS 0,4mM];

Procedimentos

Preparo das lâminas

Inicialmente, as lâminas foram lavadas com etanol absoluto e, em seguida,

mergulhadas em agarose 1,5% a 60°C. Posteriormente, se limpa a parte inferior

das lâminas e deixa-se a agarose gelificar na parte superior, horizontalmente.

Preparo das amostras controle

a) Controle celular – adiciona-se 250uL de sangue total em tubo Eppendorf;

b) Controle solvente – adiciona-se 50uL de tampão PBS a 200uL de sangue total

em Eppendorf;

c) Controle positivo MMS 1 – adiciona-se 50uL de solução B a 200uL de sangue

total em tubo Eppendorf, obtendo-se concentração final de MMS = 16x 10-5 M

(0,16mM);

d) Controle positivo MMS 2 – adiciona-se 50uL de solução C a 200uL de sangue

total em tubo Eppendorf, obtendo-se concentração final de MMS = 8x 10-5 M

(0,08mM);

e) Incuba-se todas as amostras controle junto com as amostras-teste por 2 horas a

37+/-1°C;

Preparo das células

Cada lâmina foi marcada com o código de identificação do indivíduo e/ou

das soluções controle. Em seguida, se homogeneiza o sangue invertendo o tubo

vacutainer algumas vezes. Transfere-se, com o auxílio de um pipetador

automático, uma alíquota de 10uL de sangue total ou de solução controle para tubo

Eppendorf e adiciona-se, lentamente, 120uL de agarose LMP, previamente


aquecida e mantida à 37°C, homogeneizando suavemente à suspensão de células.

Posteriormente, espalha-se a suspensão em uma lâmina contendo um filme de

agarose à 1,5%, que foi preparada na etapa anterior, e coloca-se sobre ela uma

lamínula de 24 x 60mm, antes que a suspensão de células na agarose gelifique.

Prepara-se 5 lâminas por amostra.

Em seguida, as lâminas são colocadas em uma bandeja e deixadas na

geladeira por 5 minutos. Após o tempo determinado, retira-se, cuidadosamente, de

cada lâmina as suas lamínulas e, subseqüentemente, acondiciona-se às lâminas, em

130mL de solução de lise, num recipiente tipo Coplin, revestido externamente com

papel laminado. A partir desta etapa, evita-se a incidência de luz direta, para

prevenir lesões adicionais ao DNA.

As lâminas são guardadas em geladeira por, no mínimo, 1 hora e, no

máximo, 24 horas e, após este período, são arrumadas em fileiras ao lado do anodo

(+) da cuba de eletroforese. Adiciona-se, cuidadosamente, a solução de

eletroforese à 4°C, pelas laterais da cuba, o suficiente para cobrir as lâminas,

deixando-as em contato com o tampão de corrida, por 25 minutos, para possibilitar

o desenovelamento do DNA e assim poder expressar as diferentes classes de

lesões álcali-lábeis.

Ajusta-se o volume da solução e a fonte de eletroforese nas condições de

operação (25v/300A) e procede-se a corrida de eletroforese, por 25 minutos. Ao

término da corrida, retira-se, cuidadosamente, as lâminas da cuba, lavando-as com

tampão de neutralização, 3 vezes com intervalos de 5 minutos, para cada lavagem,

por final as lâminas são fixadas em Etanol por imersão durante 10 minutos.

Deixam-se as lâminas secarem em contato com o ar, à temperatura

ambiente, por 24 horas ou mais, caso haja necessidade. As lâminas secas são

guardadas na sua embalagem original e deixadas à temperatura ambiente.

Os controles das condições ambientais mostraram-se importantes para

garantir o desempenho e os resultados do teste do Ensaio Cometa. A falta do

controle da temperatura e da umidade relativa do ar pode comprometer etapas

cruciais da técnica 58,73,78. Devido a problemas com o sistema de ar condicionado

do Laboratório de Toxicologia do CESTEH, local de realização dos experimentos

e onde foram armazenadas as lâminas para leitura, ocorreu por determinado tempo


a perda de controle destas variáveis, com destaque para umidade. Esta situação

contribuiu para a perda de amostras e o impedimento temporário da realização do

Ensaio.

Coloração das lâminas

Com o auxílio de uma pipeta automática, distribui-se 40uL de solução

corante de brometo de etídeo (40 µg/mL) em cada lâmina, cobrindo-as,

posteriormente, com as lamínulas. Imediatamente após, observa-se ao microscópio

de fluorescência.

Análise dos Cometas ao microscópio

As lâminas foram analisadas em microscópio de fluorescência, equipado

com lentes oculares e lentes objetivas planocromáticas de 10X e 40X e com filtro

de excitação de 560nm (faixa verde) e um filtro de barreira de 590nm. Os Cometas

foram localizados com a objetiva de 20 x e após a sua visualização, as células

examinadas, com a objetiva de 40 x. Cada Cometa foi analisado e sua morfologia

observada, de modo que a lâmina foi lida (escaneada) da esquerda para a direita e

de cima para baixo, na sua porção mais central, de modo a evitar-se à recontagem.

Cada Cometa foi classificado visualmente, de acordo com a intensidade da cauda,

como mostra a figura 7 e, ao final das análises, faz-se o somatório das

classificações dos Cometas encontrados. Foram contados aleatoriamente cinquenta

“células” por lâmina, sendo lidas duas lâminas por indivíduo avaliado.


A B

C D

Figura 7 - Fotografia da classificação do ensaio Cometa.Classe 0, sem danos; B- classe 1;C- classe 2; D- classe 3; dano máximo. Fonte: Silva et al., 200079

3.6 Análise dos resultados

As análises laboratoriais foram realizadas às cegas. Os técnicos

laboratoriais não tiveram acesso aos códigos de identificação das amostras

clínicas. A análise estatística realizada nas comparações entre dois grupos foi o

teste do T-student. A análise multivariada (ANOVA) seguida do teste de

Bonferroni foi utilizada para comparar médias de variáveis contínuas com

distribuição normal ou com N significativo. A medida do grau de relação linear,

entre bivariáveis quantitativas, foi realizada através da análise de coeficiente de

correlação de Pearson. A análise da sensibilidade e da especificidade dos

indicadores biológicos foi avaliada através de curva ROC (receiver operating

characteristic). Em todos os testes, o nível de significância adotado foi o de 5%.

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS 13.0.

3.7 Fator-alfa de Necrose Tumoral (TNF - α)

A dosagem foi realizada por KIT comercial para a dosagem de TNF-α

humana da Invitrogen Corporation, CA, USA.

O método para determinação na TNF-α humana é baseado em um kit de

ELISA (Enzyme Lynked-Immuno-Sorbent Assay), onde um anticorpo monoclonal

específico para TNF-α humana é adsorvido dentro de cada poço de uma


microplaca de leitura. Amostras, incluindo padrões de TNF e controles, e amostras

desconhecidas, são adicionadas dentro de cada poço.

Durante a primeira incubação (2 horas), o antígeno da TNF se liga ao

anticorpo (captura) adsorvido na parede do poço. Depois da 1ª lavagem, um

anticorpo de sinalização específico para TNF, é adicionado. Já na segunda

incubação (1 hora) o anticorpo de sinalização se liga a TNF adsorvida durante a 1ª

incubação. Após a remoção do excesso do segundo anticorpo (sinalização), a

enzima streptavidina-peroxidase é adicionada no poço. Esta se liga ao anticorpo de

sinalização para formar o chamado “sanduíche de 4 membros”. Após a terceira

incubação (30 min) e lavagem para remover toda a enzima não ligada, um

substrato colorido é adicionado, atuando sobre a ligação da enzima com anticorpo

de sinalização, para produzir cor. A intensidade desta coloração produzida é

diretamente proporcional à concentração de TNF humana presente na amostra

inicial.


4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Caracterização da População de trabalhadores expostos à Sílica

A população estudada compreende 84 indivíduos com exposição

ocupacional à sílica em diversos processos de trabalho, sendo que 70,24% destes

trabalham ou trabalharam na indústria naval, em diversos setores, mas com

predomínio do setor de pintura naval. O tempo máximo e mínino de exposição

nesta população foram respectivamente de 10 meses e 44 anos. A Tabela 1

apresenta as características sócio-demográficas destes trabalhadores sendo que

somente 60 trabalhadores responderam ao questionário. Algumas informações

sobre tempo de exposição, hábito de fumar e beber foram obtidas dos prontuários

no Ambulatório de Pneumologia do CESTEH.

A escolaridade informada predominante foi a do ensino fundamental

incompleto apresentando uma freqüência de 29,8%. Além disso, 2,4% possuem

analfabetismo funcional.

Segundo Lima e colaboradores 80, a renda familiar e a escolaridade foram as

mais importantes variáveis preditoras dos acidentes de trabalho. Segundo estes

autores, existem controvérsias sobre esta questão, pois em países desenvolvidos

este fato não é levantado como um importante fator, especialmente quando se trata

de percepção do risco. Zwerling e colaboradores 81 atribuíram a baixa escolaridade

(inferior a quatro anos) que expunha os trabalhadores a um risco cinco vezes

maior do que a alta escolaridade (mais de 11 anos) na comparação com controles

de trabalho. Este risco relativo duplicava quando o autor ajustava em relação aos

vizinhos e quadruplicava em relação ao grupo populacional. Contudo, trata-se de

um fator também pouco estudado em especial quando se relaciona trabalho aos

seus riscos. Estes autores defendem que o uso de “controles de trabalho”

subestima o efeito da escolaridade.

A média da idade dos trabalhadores estudados foi de 50,33 anos (DP =

8,32), sendo o valor mínimo de 26 anos e o valor máximo de 72 anos. O gênero

predominante foi o masculino com 98,81%. Esta população apresentou um tempo


médio de exposição de 19 anos, sendo o menor tempo de 10 meses e o maior de 44

anos. Destes, 32,1 % declaram-se ativos e 66,7 % inativos.

Quanto aos hábitos de vida destes trabalhadores, verificou-se que 35,7%

consomem bebidas alcoólicas e 34,5% declararam não ingerir bebidas alcoólicas.

Em relação ao tabagismo 15,5% declararam-se fumantes, 42,9% dos

trabalhadores declararam-se ex-fumantes e 35,7% não-fumantes. Cinco

trabalhadores (6%) não informaram o seu perfil tabagista. Configurando assim 49

indivíduos já expostos ao tabagismo e 30 indivíduos nunca expostos ao mesmo.

O fato do processo de trabalho em estaleiros predominar nesta população, a

caracteriza como uma população exposta a sílica e à misturas de substâncias

químicas, ou seja enquadrando-se em uma possível situação genotóxica. O

primeiro estudo 82 que demonstrou o aumento de danos ao DNA por ensaio

Cometa em uma população exposta à sílica também possuía o caráter da

multiexposição química devido ao fato de que a população avaliada ser composta

por trabalhadores de fundição e olaria com cargos e atividades diversas. Na

construção de navios e plataformas, os trabalhadores ficam muitas vezes

confinados em áreas sem ventilação, em uma atmosfera pobre em oxigênio e rica

em agentes tóxicos, como fumaças tóxicas de maçaricos e outros tipos de soldas.

Nestes ambientes de trabalhos confinados encontramos altas concentrações de

gases como, dióxido de carbono, monóxido de carbono, metano, sulfeto de

hidrogênio e vapores de hidrocarbonetos, e solventes.


Tabela 3 - Características sócio-demográficas do Grupo de Trabalhadores estudado.

Indústria Naval Já trabalhou 59

Nunca trabalhou 25

Alfabetismo Sabe ler e escrever 58

Não sabe ler e escrever 2

Escolaridade

Ensino Fundamental incompleto 25

Ensino Fundamental completo 13

Ensino Médio incompleto 11

Ensino Médio Completo 8

Mais que o Ensino Médio 1

Sexo Masculino 84

Feminino 1

Ativo / Inativo Ativo 27

Inativo 56

Uso de Bebida Álcoólica Faz uso 30

Não faz uso 29

Tabagismo

Fumante 13

Ex-fumante 36

Não fumante 30

Tabagismo Já fumou 49

Nunca fumou 30

Idade Grupo1- 26 a 50,3 anos 43

Grupo2- 50,4 a 72 anos 41

Tempo de exposição Grupo 1 – até 23 anos 21

Grupo 3 – de 24 até 44 anos 58

4.1.1 Clínica dos trabalhadores expostos à sílica

Observou-se uma frequência de 47 trabalhadores diagnosticados como não-

silicóticos, e 35 trabalhadores com silicose diagnosticada. Entretanto, dois

trabalhadores não obtiveram diagnóstico fechado em relação à silicose.

Nas categorias da silicose diagnosticadas pelo exame de Raios-X ocorreu

uma freqüência que corresponde a 12 indivíduos na categoria 1; 13 indivíduos na

categoria 2; 6 indivíduos na categoria 3 e 50 indivíduos na categoria 0, “normal”.

Três indivíduos não tiveram suas categorias classificadas (Figura 8).


Figura 8 - Distribuição das categorias da doença (silicose) classificadas de acordo com o Raio X por padrões técnicos da OIT (ILO, 1980)43 no grupo exposto á sílica.

O exame de prova respiratória apontou 19 trabalhadores com resultado

“normal”, 12 com distúrbios muito leves, 31 com distúrbios leves, 10 com

distúrbios moderados e somente 7 com distúrbios acentuados, sendo que 5

trabalhadores não realizaram o exame da prova respiratória (Figura 9). Os testes

de função pulmonar podem apresentar resultados importantes, sendo estes

complementares para o diagnóstico da doença ocupacional respiratória. Eles

podem auxiliar desde na avaliação de indivíduos com sintomas respiratórios de

uma forma geral como também na identificação de pacientes com a patologia na

forma subclínica ou em fase inicial. Além disso, permitem a especificação e

quantificação da incapacidade respiratória 13.

As provas de função pulmonar são indispensáveis na investigação das

doenças ocupacionais respiratórias que afetam vias aéreas, assim como no

estabelecimento de incapacidade em pacientes com pneumoconiose. A

espirometria é a forma de avaliação funcional mais corriqueira, rápido, de fácil

execução e baixo custo. Em geral, trabalhadores com função pulmonar alterada ou

com queixas respiratórias, tendem a não permanecer em funções de alta demanda


física. Portanto, é comum o encontro de espirometrias normais em grupos expostos

a riscos respiratórios e, mesmo, em portadores de pneumoconioses 6.

Pilger e colaboradores 83 relacionaram e analisaram parâmetros de

indicadores genotóxicos em uma população de trabalhadores expostos à sílica

cristalina (quartzo) com informações provenientes de exames de provas

respiratórias. Mas, para isto, seriam necessários maiores conhecimentos em

pneumologia e uma satisfatória distribuição estatística para os dados fornecidos

pela prova respiratória. Porém, o presente trabalho compreende relatar os

resultados destes testes (Figura 9). Nesta população de trabalhadores expostos a

sílica, 16 indivíduos (19%) já desenvolveram tuberculose.

Figura 9 - Distribuição dos distúrbios respiratórios avaliados por espirometria no grupo exposto à sílica

4.2 Caracterização da população não-exposta (Grupo Laboratório)

A população do Grupo Laboratório é composta por 26 indivíduos que

possuem atividades laborais no Laboratório de Toxicologia do

CESTEH/ENSP/FIOCRUZ, e que não são ocupacionalmente expostos a sílica.

Todos os indivíduos sabem ler e escrever e 25 (96,15 %) possuem mais que o

ensino médio. A média das idades deste grupo foi de 28,6 anos (DP = 6,62), sendo

18 do sexo feminino e 8 do sexo masculino. Todos os 26 indivíduos são


ocupacionalmente ativos no laboratório. O tempo médio de trabalho em

laboratório é de 7,1 anos (DP = 3,5), sendo o menor tempo de um ano e meio e o

maior de 13 anos.

Sobre os hábitos de vida dos indivíduos deste grupo, em relação ao

consumo alcoólico (fazer ou não fazer uso do álcool) foi encontrado uma

frequência de 65,4% (n = 17) de indivíduos que se autodeclararam usuários de

álcool e 26,9% (n = 7) de indivíduos que declararam não ingerir bebidas

alcoólicas. Apenas dois indivíduos (7,7%) não forneceram informação sobre este

hábito.

No que diz respeito ao tabagismo neste grupo, declararam-se como

fumantes 11,5% (n = 3) dos indivíduos, 7,7% (n = 2) como ex-fumantes e 73,1%

(n = 19) como não fumantes. Dois indivíduos não forneceram informações sobre

tabagismo. Este grupo não passou por avaliações clínicas ambulatoriais.

4.3 Avaliação da Exposição

Alguns estudos que avaliam o impacto genotóxico de exposições químicas

em populações se utilizam de grupos não expostos às mesmas substâncias

químicas, para fins comparativos, mesmo em populações que possuam diferenças

em padrões como idade, tempo de exposição e hábitos de vida, bem como

diferenças no número de indivíduos de ambos os grupos e freqüência de gêneros.

Dušinka e colaboradores 84 estudaram os efeitos genotóxicos do asbesto em

humanos, utilizando uma população exposta de 61 indivíduos e 21 não expostos.

Existiam diferenças significativas entre os grupos nas variáveis: sexo, tempo de

exposição e hábito de fumar. O estudo avaliou o impacto genotóxico através dos

testes do ensaio Cometa, micronúcleos, aberrações cromossomiais. Os resultados

demonstraram uma clara associação entre exposição asbestos e os biomarcadores

utilizados, não sendo encontrada esta associação no grupo não exposto à fibra.

Outro estudo avaliou a associação de polimorfismos e danos

cromossomiais, através de freqüências de MN e AC em trabalhadores exposto em

uma refinaria de petróleo na Coréia. O grupo exposto era composto de 108

trabalhadores diretamente expostos ao benzeno e 33 trabalhadores de escritório da


mesma refinaria. Existiam diferenças significativas entre idade, tempo na

atividade, número de cigarros consumidos por ano (grupo exposto fumava

praticamente três vezes mais que o controle) e hábito de beber. Os resultados

demonstraram diferenças altamente significativas entra a freqüência de AC e MN

entre grupo exposto e controle indicando fortemente que a exposição crônica ao

benzeno ocasiona um relevante impacto genotóxico na população

ocupacionalmente exposta ao mesmo. Outros trabalhos que avaliavam o potencial

genotóxico em diversas exposições demonstram também diferenças entre variáveis

populacionais 85,86,87.

Estes aspectos comprovam que a exposição às substâncias químicas tem

uma relevância importante nos efeitos genotóxicos, de tal forma que algumas

variáveis com potencial de confundimento ficam suprimidas frente à intensidade

do efeito gerado pela exposição.

Os indicadores biológicos, Cometa UA, Cometa em %, atividade da GST e

da Catalase, avaliados nos dois grupos tiveram distribuição normal, com exceção

dos resultados do TNF que foram normalizados através da logaritmização.

Portanto, o log TNF foi utilizado para os cálculos. A Tabela 4 apresenta os

resultados dos indicadores biológicos no grupo expostos à sílica e no Grupo

Laboratório. A Figura 10 apresenta a distribuição dos indicadores nas amostras

populacionais estudadas. Foram encontradas diferenças significativas entre os

grupos populacionais para o ensaio Cometa e a atividade da enzima GST. Para o

Ensaio Cometa obteve-se um p = 0,000 de modo que a média da população

exposta a sílica foi significativamente maior que a média do grupo do laboratório,

e em relação à atividade da enzima GST obteve-se um p = 0,010 de maneira que a

média da população exposta a sílica foi menor que a média do grupo do

laboratório.

O resultado do Ensaio Cometa sinaliza o possível risco genético que se

encontram os trabalhadores desta população exposta à sílica e aponta a

necessidade de se melhor avaliar a mesma população quanto à situação genotóxica

que se encontram e o risco de desenvolverem câncer. Mostra também por medidas

de precaução o quanto é importante acompanhar clinicamente estes pacientes e

como seria importante eliminar a sílica cristalina e outros riscos químicos do

processo de trabalho dos mesmos. Além disso, estes resultados associados a outros


estudos como Başaran e colaboradores 82 apontam o Teste do Ensaio Cometa como

um confiável e sensível método para a detecção de danos no DNA de células

individualmente mas como também sugerem este teste como um indicador

biológico de exposição a sílica.

Tabela 4 - Níveis dos Indicadores Biológicos no grupo Exposto à Sílica (Grupo

Sílica) e no grupo Laboratório (Grupo Laboratório)

p

Min Min

Max Max

8 5

99 21

8 5

72 21

14,91 19

59,45 41

0,41 1,5

3,32 4,1

2,8 -

283,4 -

0,45 -

2,45 -

Média SD

Grupo Sílica Grupo Lab

5,2

5,1

7,04

0,71

-

-0,52

12,17

12,08

30,87

2,35

-

-

SD

17,56

12,65

9,74

0,64

68,38

log TNF 19 - -

55,26

46,45

35,38

1,70

91,44

1,77

GST (Unid/mL

enzima)68 13 0,010

TNF 19 - -

31 12 0,000

Catalase (K/g

Hb)49 15 0,102

n n

Cometa (UA) 31 12 0,000

Média

Cometa (%)


Figura 10 - Distribuição dos Indicadores Biológicos Cometa UA, Cometa % e GST (unidade) do Grupo Exposto à Sílica e do Grupo Laboratório

Møller 56, em um estudo de revisão de literatura, procurou demonstrar

fatores que influenciavam nos resultados do Ensaio Cometa e analisou diversas

padronizações em diferentes estudos realizados em vários países com populações

expostas à diferentes situações. Neste estudo bibliográfico, o autor propõe uma

possível faixa de valor de referência, para populações controles, de 7-11 Cometa

UA. No Grupo Laboratório a média encontrada para UA foi 12,17± 5,2, dentro da

faixa proposta pelo autor.

Neste grupo três indivíduos apresentaram valores em torno de 21 Cometa

UA. Estes indivíduos possuem, além das atividades de trabalho e a presença de

substâncias químicas, o hábito tabagista. Desta forma pode se atribuir, nestes

casos, uma contribuição deste hábito aos valores encontrados.

Os resultados da atividade da enzima GST, demonstram que a exposição à

sílica induziu estresse oxidativo nos trabalhadores avaliados com significância de


p=0,001. É de amplo conhecimento que as EROs são mediadoras dos efeitos

induzidos pela sílica incluindo modificações no DNA, inflamação, fibrose e

injúrias e proliferação celular.

Além disso, se tem como um dos efeitos iniciais da exposição à sílica e fases

iniciais da silicose a depleção dos níveis de antioxidantes em diferentes tipos

celulares e fluídos biológicos. A GSH é um destes antioxidantes impactados. A

Glutationa e as enzimas que fazem parte do ciclo catalítico deste peptídeo tais como a

GST, apresentam associações com alterações dos estados antioxidantes e com o

aumento do estresse oxidativo 88,89.

A Glutatuiona-S-Transferase (GSTs) é uma classe de enzimas com

importante papel fisiológico. As GSTs catalisam a reação de elementos e radicais

oxidantes com o grupamento SH da glutationa neutralizando desta forma seus

sítios eletrofílicos. A determinação da atividade de enzimas deste complexo pode

indicar uma possível correlação entre a diminuição das atividades, como da GST e

o aumento nos níveis de bases de DNA lesadas devido ao dano oxidativo. Esta

interpretação reforça a hipótese de que reações podem levar à formação de

radicais livres podendo aumentar a quantidade de células malignas. A presença de

radicais livres tem sido correlacionada com um grande número de doenças,

indicando que estas espécies não têm um papel etiológico na grande maioria dos

estados patológicos, mas que participam diretamente dos mecanismos

fisiopatológicos que determinam a continuidade e as complicações presentes

nestes processos. Estas alterações implicam em lesões de DNA gerando processos

pré-mutagênicos e podendo levar, em alguns casos, ao câncer 36.

Os resultados encontrados neste estudo refletem estas afirmações. A

atividade da GST apresentou uma média menor na população exposta à sílica.

Neste grupo prevalecem os indivíduos não diagnosticados como doentes e os que

estão na fase inicial da doença.

Os resultados encontrados pelo teste do Ensaio Cometa e da atividade da

GST apontam para o efeito genotóxico primário e secundário que a exposição à

sílica e a silicose acarretam. O teste do Ensaio Cometa também é considerado um

método útil para entender questões relacionadas ao próprio estresse oxidativo em

linfócitos 66. Segundo Dusinska & Collins 49, este ensaio é um teste propício para

medir danos no DNA de diversos tipos em células como linfócitos em populações


humanas seja em exposição ambiental ou ocupacional a diversos agentes

genotóxicos, incluindo substâncias químicas e ao próprio estresse oxidativo, sendo

útil para avaliações de risco.

Com relação ao TNF as análises só foram realizadas no Grupo Exposto a

Sílica. Não sendo possível a comparação entre os grupos.

De um modo geral, fibras e outros particulados possuem comportamento

peculiar frente aos testes de genotoxicidades, sendo seu mecanismo mais

complexo e ainda não totalmente compreendido. Estas peculiaridades têm relação

íntima com o processo inflamatório merecendo “cuidados” na avaliação de seus

efeitos. No passado os estudos se concentravam mais em sistemas de avaliação do

impacto genotóxico primário dos particulados, como, por exemplo, testes in vitro

que incubavam particulados diretamente com amostras de DNA em solução

aquosa. Tais estudos forneciam informações fundamentais, porém é necessária a

avaliação dos mecanismos de danos secundários, principalmente pela participação

de mediadores e diversos efeitos disparados pela exposição a estas substâncias 59.

Para os efeitos genotóxicos de particulados devem ser utilizados testes que

detectem danos ao DNA e alterações dos sistemas antioxidantes endógenos que

reflitam estes danos secundários oriundos do processo inflamatório e o

conseqüente estresse oxidativo. Deste modo tais ensaios permitem investigar e

detectar o comportamento destas fibras em uma potencial situação genotóxica.

Alguns estudos exemplificam estas evidências. Fanizza e colaboradores 90

demonstraram in vitro, através do Ensaio Cometa, o dano ao DNA de caráter

primário e secundário em uma linhagem de células do epitélio pulmonar humano

exposto a diferentes concentrações de um padrão de sílica livre respirável em

cultura de células. Neste estudo os dois tipos de danos foram observados bem

como a relação dose-resposta a tais efeitos. O teste do Ensaio Cometa se insere

nos testes de genotoxicidade que podem ser utilizados para detectar danos ao DNA

com peculiar sensibilidade, nas células de indivíduos expostos a particulados

como a sílica. A determinação da atividade da enzima GST contribui para elucidar

e detectar a participação de EROs na indução dos efeitos genotóxicos secundários.

Outro estudo que também exemplifica este fenômeno observado neste

estudo é o de Zhang e colaboradores 91 que demonstraram com clareza os efeitos


citotóxicos e genotóxicos mediados pelo estresse oxidativo induzido pela

exposição à sílica cristalina em macrófagos alveolares de rato em cultura. Os

autores avaliaram o estresse oxidativo através da determinação do anion

superóxido (O2-) e a formação de H2O2. Alem disso, utilizou o Ensaio Cometa para

avaliar. O trabalho observa a indução da produção de EROs pela exposição à sílica

nestes tipos celulares, o impacto da exposição no sistema antioxidante enzimático

e através do Ensaio Cometa verifica o dano ao DNA causado por tais fenômenos.

Este estudo destaca o quanto é relevante o conhecimento destes mecanismos para

o desenvolvimento de estratégias que possam prevenir ou amenizar os mesmos.

Bașaran e colaboradores 82 demonstraram pela primeira vez o aumento do

dano do DNA em trabalhadores expostos a sílica, através do Ensaio Cometa. A

população de trabalhadores estudadas por Bașaran era oriunda de indústrias de

fundição e cerâmicas. Os resultados de Bașaran mostram a técnica do Ensaio

Cometa como uma promissora ferramenta para o monitoramento biológico de

populações humanas ocupacionalmente expostas a sílica. O presente estudo,

também encontra resultados semelhantes.

4.3.1 Expostos não-silicóticos x Expostos Silicóticos

A Tabela 3 apresenta os resultados dos indicadores biológicos avaliados

dentro da população de trabalhadores expostos à sílica. Foram criados dois

subgrupos desta população: trabalhadores expostos à sílica não doentes (n=47) e

doentes (n=35) para testar se o fator “doença” influenciaria significantemente os

parâmetros analisados. Não houve diferenças significativas para nenhum dos

indicadores. Isto reforça o quanto a exposição é crucial para os efeitos avaliados,

de tal modo que os efeitos da mesma são de tamanha ordem, que o “fator” doença

não altera estes danos.

Pilger e colaboradores 83 detectaram e mensuraram 8-

Hidroxideoxiguanosina, um marcador de lesão oxidativa de DNA, em sangue e

urina de pacientes silicóticos e trabalhadores expostos a quartzo. Os resultados

encontrados convergem com os resultados deste estudo e reforçam que a exposição

à sílica é o fator primordial para estes efeitos tendo o indivíduo desenvolvido


silicose ou não. Neste trabalho, os autores não encontraram diferenças

significativas entre as médias dos níveis de 8-Hidroxideoxiguanosina nos

trabalhadores silicóticos afastados do trabalho e indivíduos que ainda eram

expostos, mas que não apresentavam a doença.

Os resultados deste estudo tornam mais fortes os argumentos de Pilger e

colaboradores 83. O Ensaio Cometa comportou-se como um bom marcador de

efeito da exposição à sílica, porém não parece ser uma ferramenta eficaz para

predizer a doença (silicose).

Além disso, a exposição à sílica parece possuir peculiaridades quanto à

dinâmica do contato deste agente tóxico e a temporalidade do mesmo. De modo

que, mesmo encerrada a intensa exposição à sílica, a mesma permanece em contato

com as células do indivíduo já exposto. Este pressuposto indica que o sistema de

“clearance” celular não consegue ser efetivo para este agente, permanecendo em

contato com o organismo do indivíduo. Desta forma, tem um significado relativo a

interrupção da exposição, pois o indivíduo, uma vez exposto, apresentará

conseqüências biológicas, apesar de cessada a exposição.

A exposição à sílica é impactante com uma magnitude que a faz predominar

em relação ao efeito da silicose. Segundo Donaldson & Tran 92, a inflamação

disparada pela exposição à sílica persiste após esta exposição. Estes fatos

permitem a discussão de que seria mais promissor o entendimento e

desenvolvimento de indicadores que consequentemente possibilitem o melhor

entendimento do impacto da exposição à sílica no organismo humano. Estes

indicadores devem revelar a dinâmica dos fenômenos relacionados como a indução

do estresse oxidativo, a inflamação desencadeada, e os danos genotóxicos

primários e secundários. Estes marcadores poderiam ser utilizados para identificar

precocemente eventos que poderiam ainda ser reversíveis.


Tabela 5 - Indicadores biológicos avaliados dentro da população de trabalhadores expostos a sílica

p

0,32 0,651log TNF 11 1,72 0,64 8 1,83

0,65 0,446

TNF 11 99,95 84,63 8 79,74 38,98 0,540

GST (Unid/mL

enzima)36 1,74 0,61 31 1,62

16,70 0,486

Catalase (K/g

Hb)23 37,8 8,53 25 33,19 10,60 0,105

Cometa (%) 19 47,74 9,57 12 44,42

SD

Cometa (UA) 19 57,26 14,14 12 52,08 22,27 0,433

Exposto não-doente Exposto doente

n Média SD n Média

4.3.2 Idade

Para averiguar se a idade poderia estar atuando como fator de

confundimento para alguns dos indicadores biológicos mensurados, os

trabalhadores expostos foram agrupados em dois grupos de idade: Grupo 1 (de 26

a 50 anos) e Grupo 2 (de 51 a 72 anos). Não houve diferenças significativas entre

os dois grupos para nenhuma das análises biológicas (Tabela 6). Além disso, os

resultados sugerem que nos parâmetros onde ocorreram diferenças significativas

para os grupos expostos e não expostos à sílica, os efeitos da exposição tiveram

uma maior significância, não sendo a idade um fator importante.

Pilger e colaboradores 83 também não encontraram, em relação à idade,

diferença significativa para o parâmetro de dano ao DNA utilizado ao avaliar

população de trabalhadores expostos à sílica e pacientes silicóticos

Existem controvérsias na literatura sobre a influência do fator idade nos

resultados do teste do Ensaio Cometa. Møller 56 discute alguns aspectos que

podem influenciar nos resultados do Ensaio Cometa em populações “saudáveis”,

dentre eles a idade. Os resultados encontrados nesta revisão são contraditórios,


não possuindo consenso, Cemeli, Baumgartner e Anderson 93 sugerem que os

fatores de confundimento tais como: gênero, idade, hábitos de vida, alimentação,

história genética dentre outros não devem ser analisados de forma isolada e que a

associação destes fatores com os indicadores biológicos tem uma dinâmica

complexa.

Tabela 6 - Indicadores Biológicos e o fator idade.

.

p

0,58 0,8151,79110,461,738log TNF

0,42480,34

0,79511,48

Grupo 1 Grupo 2

n Média SD n Média SD

Cometa (UA) 14 55 17,48 17 55,47 18,16 0,942

Cometa (%) 14 45,79 14,35 17 47

Catalase (K/g

Hb)20 37,273 9,73 29 34,07 9,70 0,262

GST (Unid/mL

enzima)33 1,76 0,68 35 1,64 0,60 0,460

TNF 8 76,23 48,42 11 102,50

Grupo 1 (de 26 a 50 anos) e Grupo 2 (de 51 a 72 anos).

4.3.3 Estaleiro

Uma atividade produtiva que há muito possui uma significante expressão no

que diz respeito à exposição ocupacional à sílica e a silicose é o setor de reparo e

construção naval. A operação de jateamento de areia é a principal causa desta

exposição oferecendo alto risco de silicose e é a atividade que mais apresenta

casos graves desta doença. Segundo a OIT 2, é importante notar que qualquer jato

abrasivo, mesmo que não contenha sílica, pode oferecer o risco à silicose, se usado

para remover materiais que contenham sílica, como resquícios de moldes de areia

em perfis metálicos. Ainda no relatório deste programa, a indústria naval possui

uma prevalência desta doença de 23,6% sendo a atividade de jateamento de areia a

principal causa.


Com o objetivo de verificar se existiam diferenças significativas entre o

grupo exposto á sílica, os resultados dos indicadores biológicos foram comparados

segundo a atividade de trabalho. Nenhuma das análises apresentou diferença

significativa entre os dois grupos (Estaleiro n=59 / Não estaleiro n=25). Neste

estudo 35 indivíduos foram considerados silicóticos sendo que 19 destes

pertencem à indústria naval.

4.4 Raio-X e categorias da doença

Os processos inflamatórios, de uma maneira geral, em suas fases iniciais

apresentam um perfil mais agudo e intenso que é seguido de a uma cronificação do

mesmo onde começam a participar citocinas regulatórias que muitas vezes

coincidem com fenômenos fibrogênicos. Uma característica peculiar da silicose é

que o processo inflamatório é persistente e é sustentado pelos processos oxidativos

em todas as etapas da patologia 92.

Foram testados através de ANOVA diferenças significativas entre as

categorias Normal, Cat1, 2 e 3 e o grupo Laboratório. Não foram encontradas

diferenças significativas entre os resultados do Ensaio Cometa, da Catalase e do

TNF dentro do grupo exposto á sílica entre as diferentes classificações de Raios-X

(referentes às categorias da doença), através da aplicação do Teste de Student.

Somente foi encontrada diferença entre as categorias para a GST. A seguir estão

descritos os resultados, discriminados por indicador biológico (Tabela 7).


Tabela 7 - Indicadores Biológicos e as diferentes Categorias de Raio X

-

-

-

15

12,08 g,h,i,j

30,87

13 2,35 l,m,n

-

Laboratório

n Média

12 12,17 c,d,e,f

123

Catalase (K/g Hb)

24 37,00

39,00 d 3

Cometa (%) 22 47,20 g 3 32,33 h

n Média n

Cometa (UA) 22 56,00 c 3

34,45

Categoria Normal Categoria 1

n Média

9

GST (Unid/mL enzima)

39 1,80 a,l 11 1,19 a,b,m

9

10

TNF 12 96,00 2 47,45 2

log TNF 12 1,70 2 1,51 2

Categoria 2 Categoria 3

Média n Média

62,33 e

1,58 n

89,60

1,94

3

3

5

6

3

3

59,00 f

50,00 j

34,50

2,00 b

104,00

2,00

51,33 i

31,13

. pa = 0,029 / pb = 0,043 / pcdefghij = 0,000 / plmn = 0,001

4.4.1 Ensaio Cometa

No que diz respeito ao Ensaio Cometa, todas as categorias de Raios-X do

grupo exposto à sílica possuíram resultados significativamente diferentes dos

resultados do Grupo Laboratório, sendo o p = 0,000.

Estes resultados confirmam os achados anteriores (Tabela 4) onde o grupo

de trabalhadores expostos à sílica apresentou valores bem mais altos do que o

Grupo Laboratório, evidenciando novamente o quanto à exposição a este

particulado é suficiente para gerar danos ao DNA dos linfócitos destes

trabalhadores. O fator doença não foi significativamente influente com relação a

este dano gerado, fato originado pela exposição. Este aspecto retoma a discussão

sobre a utilização do Cometa como um indicador relacionado à exposição à sílica,

independente das fases da doença. A Figura 11 apresenta a distribuição dos

valores de Cometa UA entre as categorias da doença e do Grupo Laboratório.


laboratorioCategoria 3Categoria 2Categoria 1Normal

CATEGORIAS RX

100

80

60

40

20

0

Co

met

aUA

média=56 +/-14,1média=62,33+/-34,33

média=59 +/-11,53

média=39 +/-27,6 média=12,17+/-5,2

Figura 11 - Distribuição dos valores do Cometa UA entre as categorias da doença e no Grupo Laboratório

4.4.2 Catalase

Não foram encontradas diferenças significativas entre os resultados de

nenhum dos grupos e subgrupos no que diz respeito à atividade da Catalase. Isto

também confirma os achados anteriores (Tabela 3). Encontra-se na literatura

evidências da catalase desempenhar papel protetor em macrófagos alveolares de

rato expostos in vitro à sílica cristalina de modo a inibir significantemente a

toxicidade e o estresse oxidativo induzido pela exposição. Além disso, esta enzima

mostrou capacidade de evitar danos ao DNA induzidos pela exposição 91. Porém,

Yvonne e colaboradores 94, verificaram, em experimento in vivo, o aumento da

expressão de enzimas antioxidantes em ratos expostos à sílica. Para todas as

enzimas do sistema antioxidante avaliadas no estudo não foi encontrada alterações

significativas com relação à atividade. O mesmo não foi encontrado nos animais

expostos a amianto que tiveram aumento da atividade da enzima Catalase. Com

relação e expressão destas enzimas somente a Catalase não teve um incremento

nos animais expostos á sílica.

A catalase é uma enzima de difícil saturação de modo a conseguir reduzir

H2O2 em altas concentrações, porém sua eficiência algumas vezes é comprometida

pela baixa concentração deste substrato. A reação enzimática da catalase requer

duas moléculas de H2O2 93.


4.4.3 GST

Os resultados para a atividade de GST apresentaram diferenças

significativas entre as seguintes categorias: Categoria “Normal” e a Categoria 1 (p

= 0,029) sendo a média da categoria normal superior à média da Categoria 1; entre

a Categoria 1 e a Categoria 3 (p = 0,043), de modo que a média da categoria 1 foi

inferior à média da Categoria 3.

Foram observadas diferenças significativas entre o Grupo laboratório e

determinadas categorias: entre o grupo laboratório e a Categoria “Normal”, a

Categoria 1, e a Categoria 2. Não houve diferença entre o Grupo laboratório

(média=2,3) e a Categoria 3 (média=2,0). Este fato demonstra uma recuperação

ao “longo” das categorias da doença, após uma inicial depleção. Estes resultados

vão ao encontro dos resultados já demonstrados anteriormente neste estudo, entre

os grupos expostos e não expostos e o comportamento dos sistemas antioxidantes

frente à exposição à sílica e à própria silicose, como já discutido acima. A Figura

12 apresenta a distribuição dos valores da atividade de GST entre as categorias e o

Grupo Laboratório.

Na exposição à sílica e no início do processo da silicose, existe uma inicial

depleção dos níveis de antioxidantes em diferentes tipos celulares e fluídos

biológicos frente ao estresse oxidativo. Este fato é seguido de uma recuperação

destes níveis. Além disso, já foi demonstrado que ocorre a diminuição dos níveis

da própria GSH nos pulmões na fase inicial da silicose e também apresenta um

aumento da mesma na fase mais tardia da patologia. O mesmo ocorre com a

relação à GSH eritrocitária que apresenta uma dinâmica ao longo das etapas da

doença similar à ocorrida pela mesma nos pulmões 88.

Outro fenômeno que talvez possa ajudar a entender esta dinâmica

relacionada à depleção e “recuperação” da atividade da enzima GST é a dinâmica

da responsividade imunológica e o característico processo inflamatório induzido

pela exposição à sílica e persistente na progressão da silicose. A persistência da

inflamação induzida pela exposição à sílica é sustentada justamente pela liberação

de oxidantes nos espaços alveolares que acarretam inclusive a ativação de

sinalizações celulares relacionadas ao aumento da expressão de citocinas pró-


inflamatórias como a interleucina-1 e o próprio TNF- α 29. Além disso, a GSH é

um protetor antioxidante importantíssimo intra e extracelular frente a oxidantes,

que possui papel chave na sinalização e controle dos processos inflamatórios que

acometem os pulmões 46.

laboratorioCategoria 3Categoria 2Categoria 1Normal

CATEGORIAS RX

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00

GS

T (

un

id/m

L e

nzi

ma)

154

66

56

média= 1,8+/-0,64média=1,58+/-0,62

média=2,0+/-0,42

média=1,19+/-0,46

média=2,35+/-0,71

Figura 12 - Distribuição dos valores da atividade de GST entre as categorias e o Grupo Laboratório

4.4.4 TNF

Os indicadores biológicos foram comparados entre os sub-grupos e não

foram observadas diferenças significativas entre o Grupo 1 e o Grupo 2 para

nenhum dos mesmos resultados, com exceção das médias dos dois grupos para o

log de TNF que apresentaram diferença significativa com um p igual a 0,028. A

distribuição deste parâmetro está representada na Figura 13.

Diversos tipos de evidência subsidiam que a patogênese da silicose envolve

o descontrole de fenômenos imunológicos 24. Portanto, é importante que se

entenda melhor como se comportam os processos imunológicos nesta

fisiopatologia. Algumas citocinas caracteristicamente alteradas na silicose podem

ser avaliadas como marcadores em tais estudos.


Figura 13 - Distribuição do Log de TNF nos Grupos de idade.

Fator de necrose tumoral (TNF) é uma citocina pleiotrópicas expressa por

diferentes células frente a processos infecciosos ou a diversos tipos de injúria.

Esta citocina classicamente pró-inflamatória pode participar de processos

biológicos diversos como morte, proliferação e diferenciação celular. Isto

acontece tanto com implicações nos processos homeostáticas quanto no disparo

e/ou em processos patogênicos 95.

O TNF-α está não só relacionado como um elemento ativo no processo

inflamatório da silicose e no desenvolvimento da fibrose ocorrente na mesma,

mas, além disso, vem-se atribuindo a ele importante papel na carcinogenese

pulmonar induzida por poeiras. Estas características mostram como a influência

desta citocina não está “linearmente” restrita ao processo inflamatório de forma

isolada e direta, possuindo uma complexa mecanística biológica 24.

Já se demonstrou em rato a elevada expressão de TNF e também IL-1 em

células mononucleares e células dos sítios da lesão mesmo após a cessação da

exposição à sílica, demonstrando desta forma a importância desta citocina no

processo inflamatório persistente e lesivo nesta patologia 96.

O processo oxidativo inicial da exposição à sílica se mostra muito

importante no disparo dos mediadores dos fenômenos lesivos e persistentes da

silicose, como indica estudo de Gossart e colaboradores 97, onde se observa que


em ratos expostos à sílica submetidos a um pré-tratamento com um

“neutralizador” de radicais livres, apresentam uma diminuição na produção de

ROS e de TNF em macrófafos alveolares e desta forma, revertiam o estado da

patologia pulmonar 96. Resultados similares foram encontrados por Barrett e

colaboradores 98 que observaram a diminuição da expressão e produção de TNF em

macrófagos murinos expostos à sílica que foram tratados com antioxidantes, como

dentre estes a GSH.

Um estudo experimental com ratos demonstrou que animais jovens

apresentam um aumento significativo de TNF e de células inflamatórias no lavado

broncoalveolar, o que não ocorre nos animais mais velhos.

Tal fenômeno também foi similarmente observado in vitro através de

ensaios com a exposição à sílica de macrófagos oriundos de animais mais velhos.

Corsini e colaboradores 99 já haviam demonstrado também em ratos o declínio com

a idade da produção de TNF em macrófagos alveolares em animais modelos de

silicose aguda. Nestes animais não só a produção de TNF é menor como também

um estresse oxidativo menos intenso.

Deste modo, especula-se que com o envelhecimento diminui a sensibilidade

para alguns efeitos da silicose, o que não se refere somente as citocinas bem como

também aos fenômenos do estresse oxidativo 99.

Os resultados apresentados neste estudo demonstram que os indivíduos

pertencentes ao Grupo 2 embora apresentam idades superiores bem como maior

tempo de exposição não apresentaram diferenças significativas, quando comparadas

com o Grupo 1. Estes aspectos não foram suficientemente fortes para demonstrar

alterações nos indicadores biológicos testados, com exceção do log de TNF.

4.5 Hábito de fumar

4.5.1 Na População exposta à sílica

A fim de averiguar se o tabagismo poderia estar influenciando os resultados

dos indicadores biológicos principalmente no que diz respeito aos resultados do


Ensaio Cometa, foram formados dois sub-grupos no Grupo Exposto à sílica dos

indivíduos que “já fumaram” e que “nunca fumaram”. Não foram encontradas

diferenças significativas para nenhum dos parâmetros avaliados. Em estudo de

uma população de trabalhadores expostos a sílica e pacientes silicóticos, não foi

encontrada diferença significativa entre o hábito de fumar e os níveis 8-

hidroxideoxiguanisina, indicador de dano oxidativo no DNA, porém no grupo

silicótico houve correlação significativa dos níveis deste indicador, hábito de

fumar e o volume respiratório cruzado. Estes resultados indicam uma interferência

do tabagismo nestes parâmetros 83.

Mak e colaboradores 100 avaliaram o risco de Doença Pulmonar Obstrutiva

Crônica (DPOC) em indivíduos fumantes com a doença, comparando com

controles fumantes saudáveis, através da investigação da atividade das enzimas

Catalase e da Manganês Superóxido-Dismutase (Mn-SOD) e do polimorfismo -262

C>T e Ala16Val das respectivas enzimas. Não foram encontradas diferenças

significativas na distribuição dos diferentes genótipos ou freqüência de alelos

entre pacientes e controles para ambas as enzimas. Entre controles saudáveis ou

pacientes com DPOC, não foram observadas diferenças de atividade da SOD. A

Catalase eritrocitária apresentou atividade significativamente maior em pacientes

com DPOC que em controles saudáveis. O aumento na atividade catalase

eritrocitária em pacientes chineses com DPOC provavelmente indica disfunção no

sistema de defesa oxidante/antioxidante, porém não está claro se esse aumento é

compensatório ou um fator patogênico.

O mesmo tipo de estudo foi realizado, utilizando-se a atividade da enzima

GST e seus polimorfismos, com o objetivo de se determinar o papel dos genótipos

que regulam glutationa S-transferase (GST) e sua atividade plasmática na patogênese

da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Para tanto, foram avaliados 163

pacientes com DPOC e 163 controles saudáveis, ambos fumantes. Não houve

diferenças significativas na distribuição dos diferentes genótipos do polimorfismo do

GSTT1, GSTP1 e GSTM1 entre pacientes com DPOC e controles saudáveis. A

atividade da GST foi significativamente maior em pacientes comparados com os

controles, independentemente de suas diferenças genotipicas, não sendo encontrada

diferença de atividade entre os níveis de obstrução ao fluxo aéreo.


4.5.2 No Grupo Laboratório

No Grupo Laboratório também foram formados dois subgrupos quanto ao

hábito de fumar em indivíduos que “já fumaram” e “nunca fumaram”, como pode

ser visto na Figura 18. Na maioria dos parâmetros não ocorreu diferença

significativa entre os subgrupos, mas quanto aos resultados do Ensaio Cometa,

observou-se diferença altamente significativa entre as médias dos subgrupos com

um p igual a 0,001. O subgrupo dos que “já fumaram” com uma média de 19,3 UA

± 2,1 e o subgrupo dos que “nunca fumaram” com uma média de 9,6 UA ± 3,4.

Figura 14 - Distribuição dos valores do Ensaio Cometa em relação ao hábito tabagista no Grupo laboratorio.

Em um estudo realizado por Lu e Morimoto 101, homens fumantes japoneses

foram avaliados quanto aos efeitos causados no DNA pelo cigarro, através de

ensaio Cometa. Quebras de DNA foram significativamente associadas aos anos de

fumo, à quantidade de maços de cigarro/ano e aos níveis de nicotina e alcatrão

(mg/dia). E os níveis de alcatrão mostraram ser preditores significativos do

momento de cauda do Cometa. Estes resultados sugerem que os níveis de

exposição ao cigarro por alcatrão e a nicotina (mg/dia) seriam um parâmetro

sensível na apreciação da genotoxicidade do cigarro nestes indivíduos.


No entanto, segundo o levantamento realizado por Møller 56, o tabagismo

não se apresentou como um forte determinante de genotoxicidade detectado pelo

teste de Ensaio Cometa, sendo necessário um estudo mais consistente para afirmar

tal efeito.

É interessante ressaltar que o tabagismo se confirma como um fator de

exposição para o Ensaio Cometa no Grupo Laboratório, diferente do que se

observa na População de trabalhadores expostos a sílica. Estes resultados

confirmam que no caso dos trabalhadores expostos á sílica, a exposição

ocupacional parece sobrepujar um possível efeito do tabagismo nos níveis dos

indicadores. Enquanto no Grupo Laboratório, a exposição ocupacional não parece

ser fator importante, estando estes indivíduos mais susceptíveis aos efeitos do

tabagismo.

4.6 Correlações

4.6.1 Log TNF x Anos de exposição à sílica

Ao se correlacionar os resultados de TNF (que não apresentou distribuição

normal) normalizados em Log TNF com o tempo de exposição (em anos), foi

encontrada uma correlação negativa entre tais parâmetros (r= – 0,501, p=0,029 e

n = 19). Esta correlação mantém a tendência dos resultados encontrados ao

comparamos os níveis de TNF nos distintos grupos quanto ao tempo de exposição,

onde se observou no Grupo 1, com menor tempo de exposição uma média de Log

TNF superior ao valor da média do Grupo 2 que contém os trabalhadores com

maior tempo de exposição.

4.6.2 Idade x Anos de exposição à sílica

A correlação idade versus tempo de exposição obteve um r= 0,318, p=

0,004 e n de 80 trabalhadores. Esta correlação parece evidenciar que quanto mais

idoso for o indivíduo maior será o tempo de exposição. Estes indivíduos parecem


permanecer no mesmo tipo de ocupação por muito tempo ampliando assim o

tempo de exposição.

4.6.3 GST x TNF normalizado por logaritimização (Log TNF)

Em relação à correlação feita entre os resultados da atividade da GST e

entre o log dos resultados do TNF obteve-se uma correlação positiva (r = 0,562,

p= 0,015 e n= 19). Esta correlação provavelmente se deve a dinâmica entre o

processo oxidativo e o processo inflamatório.

Os mediadores liberados pelos macrófagos através da interação entre os

mesmos e de suas interações com o microambiente alveolar “orquestram” diversos

fenômenos induzidos pela exposição à sílica e na silicose. Esta cadeia de eventos,

disparadas pela exposição, resulta em injúria pulmonar, inflamação resultante da

mesma, de maneira que podem possuir como desfecho histológico, a fibrose de

tecido pulmonar 102.

Em linhagem de células de macrófagos murinos expostos à sílica cristalina,

observou-se um decréscimo tanto nos níveis de RNAm para TNF, como mais

intensamente , nos níveis da proteína quando na presença de antioxidantes, dentre

os quais a GSH. A mensuração foi comparativa à mesma indução por exposição à

sílica na ausência dos antioxidantes utilizados. Alguns trabalhos sugeriram que

somente a exposição direta à própria partícula de sílica pode desencadear a

liberação de TNF induzida pela exposição. Isto sugere que na exposição à sílica a

capacidade de resposta dos macrófagos seria mediada pelo próprio estrese

oxidativo 98.

Gossart e colaboradores 97 sugeriram a participação do estresse oxidativo

induzido pela exposição à sílica na regulação da expressão de TNF em macrófagos

alveolares de rato. A inflamação não só induz o estresse oxidativo, mas como é

induzida pela mediação do mesmo.

Estes dados além de evidenciarem a relação do estresse oxidativo com o

aumento dos níveis de TNF na exposição à sílica sugerem que este pode

potencialmente determinar a expressão de TNF. Este fato associa os efeitos da

exposição à sílica e os mecanismos destes efeitos, que podem servir para a predição e


antecipação de danos mais tardios e irreversíveis. Além disso, mostra a potencial

proteção aos efeitos da exposição à sílica gerada por antioxidantes, sugerindo que é

fundamental entender as modulações dos sistemas antioxidantes endógenos. A

compreensão destes fenômenos pode servir para utilização destes antioxidantes na

prevenção dos danos causados pela exposição á sílica.

A enzima GST situa-se intimamente inserida e envolvida no processo de

defesa endógeno frente a agentes oxidantes como os radicais livres geradores do

estresse oxidativo. Esta enzima multifuncional protege os componentes celulares

contra o estresse oxidativo que estes possam estar submetidos 103.

Castro 104 observou que pacientes silicóticos apresentavam elevados níveis

séricos de TNF nas primeiras fases da doença, mas em indivíduos da Categoria 3

estes níveis apresentavam valores menores.

Estes achados possuem uma relação com a habilidade da enzima GST em

responder prontamente a exposição à sílica e na silicose. Os resultados da

atividade da enzima GST que apresentam uma inicial depleção nas primeiras

etapas da silicose e em trabalhadores expostos à sílica “normais”, é acompanhada

de uma recuperação desta atividade na Categoria 3. Esta categoria apresenta uma

média que se aproxima do valor mediano dos indivíduos não expostos à sílica.

Estes achados podem refletir justamente esta dinâmica discutida sobre a relação

entre o estresse oxidativo e a expressão do TNF.

Deste modo, a atividade desta enzima, sua depleção, sustentação ou

aumento podem funcionar como indicadores do estresse oxidativo. Os achados

neste estudo indicam que esta enzima tem uma relação com o estado de estresse

oxidativo e podendo regular a expressão de TNF, permitindo assim sugerir que a

enzima GST tem uma capacidade preditora para a expressão de TNF induzida pela

exposição à sílica.

4.7 Análises de Regressão Linear

A partir das correlações obtidas foram conduzidas separadamente modelos

de análise de regressão linear controladas pela idade para verificar se os

parâmetros que se correlacionaram com o Log de TNF (Tempo de exposição (TE)


e GST) poderiam predizer alterações significativas nos níveis deste indicador

(Figuras 19 e 20). A idade não interferiu nos modelos, não sendo considerada,

portanto um fator de confundimento (Tabela 5).

4.7.1 Modelo 1

Esta análise de regressão linear foi realizada pelo método “enter” onde a

variável dependente foi Log TNF e a independente TE. Neste modelo, os

resultados encontrados (r2 = 0,261 e p = 0,0026) demonstram que a capacidade da

variável tempo de exposição em predizer os níveis de Log TNF é de 26,1 %. Este

modelo de regressão apoia a discussão feita anteriormente sobre estas variáveis.

Além disso, devem ser levados em consideração fatores além da exposição efetiva

à sílica, como o período total de permanência da sílica nos pulmões, o período de

afastamento da exposição ou período de latência, que podem ter influência na

ocorrência de silicose. Neste estudo, o TE médio foi de 15,2 anos com mínimo de

1 ano e máximo de 45 anos. No presente estudo, o TE médio foi de 19 anos sendo

o tempo mínimo de 10 meses e máximo de 44 anos. Este resultado reforça a

afirmação, devendo a variável TE ser mais bem explorada nos estudos desta

doença ocupacional.

Figura 15 - Correlação da atividade da GST e os níveis de TNF.


Figura 16 - Correlação do tempo de exposição à sílica e TNF


Tabela 8 - Modelo de Regressão Linear com Variável Dependente: Log TNF

Regressão Linear com Variável Dependente: Log TNF

Variável Independente N Sig N r2 Sig r2 β Sig β

Modelo 1 -0,501 0,029 0,261 0,0026 0,237 0,04

GST

Modelo 2 0,562 0,008 0,316 0,01 0,692 0,12

Tempo de exposição

Obs: Ambos controlados pela idade

4.7.2 Modelo 2:

Esta análise de regressão linear foi realizada pelo método “stepwise” onde a

variável dependente foi Log TNF e as independentes: Tempo de Exposição e

Atividade da enzima GST. Neste modelo, a variável tempo de exposição foi

retirada pelo método e os resultados encontrados (r2 = 0,316 e p = 0,010)

demonstram que a capacidade da variável GST em predizer os níveis de Log TNF

é de 31,6 %. Este resultado possui expressiva plausibilidade biológica,

confirmando o envolvimento do estresse oxidativo na regulação da produção de

mediadores inflamatórios como o TNF, e desta forma sua influencia direta no

curso e/ou persistência da inflamação e conseqüentemente no desfecho fibrótico

do tecido pulmonar. Este achado permite sugerir que a atividade da enzima GST

pode ser utilizada nos estudos da silicose como um indicador biológico de efeito,

pois se envolve de maneira precoce nos eventos iniciais que antecedem os efeitos

irreversíveis desencadeados pela exposição à sílica.

4.8. Tuberculose / Doença

A exposição à sílica além de desencadear diversos efeitos impactantes ao

organismo humano, e desenvolver a doença silicose também pode disparar outras

fisiopatologias. A exposição à sílica tem sido relacionada ao desenvolvimento de

diversas doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide, lúpus eritematoso

sistêmico, esclerose sitêmica, e também doença renal crônica. A inflamação intensa

disparada pela exposição à sílica é uma característica em comum entre as patologias.


Além, é claro do possível desenvolvimento de câncer pulmonar desencadeado pela

exposição 10,96.

Dentre as doenças associadas à exposição à sílica e à silicose, a tuberculose

tem destaque sendo conhecida como “silico-tuberculose”. A associação entre a

silicose e a tuberculose já é conhecida há muitos anos, e estudos recentes apontam

também que a exposição à sílica mesmo que sem desenvolvimento da silicose podem

aumentar a predisposição à tuberculose 14,105. Além disso, existem evidências

experimentais que a sílica altera os mecanismos de resposta imunológica dos pulmões

como o impacto prejudicial da exposição à sílica nas funções e atividades dos

macrófagos, propiciando desta forma, uma vulnerabilidade dos expostos à sílica a

exposição ao Bacilo de Koch, aumentando a chance do desenvolvimento da

Tuberculose nestes indivíduos 22.

Estima-se que o risco de trabalhadores silicóticos desenvolverem

tuberculose em relação a pacientes saudáveis controle varia de 2,8 a 49 vezes 22.

Com objetivo de avaliar a associação destas doenças neste estudo, foi realizado

um cálculo de Risco Relativo (RR) (Tabela 9).

Tabela 9 - Tabela de Contingência com Trabalhadores Doentes e Não Doentes que desenvolveram tuberculose.

Já teve Tuberculose 4 12 16

Nunca teve Tuberculose 42 23 65

Total 46 35 81

Exposto não doente Exposto doente Total/Tuberculose

Foi encontrado um RR de 3,8 (95 % de intervalo de confiança-0,162 e

0,921) para os trabalhadores silicóticos desenvolverem tuberculose, onde 75 %

destes que já tiveram tuberculose.

O risco estimado refere-se a “determinação” do fator doença (silicose) no

desenvolvimento da tuberculose. Estes resultados demonstram um importante risco

dos pacientes silicóticos de desenvolverem tuberculose. Isso demonstra o quanto a

mecanística desta fisiopatologia pode impactar de uma maneira global o sistema

imunológico do organismo silicótico. É claro que estes efeitos se somam a outros


acarretados pela prévia exposição à sílica onde a inflamação desencadeada pela

exposição e sua persistência são fatores importantes para o desenvolvimento da

tuberculose.

É importante lembrar que nenhum dos trabalhadores do Grupo estudado,

possuía tuberculose “ativa” diagnosticada, tendo em vista que este era um critério

de exclusão dos sujeitos da amostra.

4.9. Tabagismo / Doença

Muitos estudos contemplam a multicasualidade das doenças associadas ao

tabagismo. O tabagismo na escala de reconhecimento como causa de doenças

pulmonares “ambientais, tem igual importância que as exposições ocupacionais.

Alguns efeitos e danos já são reconhecidamente oriundos da associação entre

exposições ocupacionais e o tabagismo. A exposição a poeiras minerais impacta,

de maneira distinta, indivíduos fumantes e não fumantes, de modo que,nos

fumantes, observa-se um predomínio de padrões obstrutivos. Apesar de ser difícil

a quantificação comparativa nas exposições isoladas, é notório que os efeitos da

exposição combinada são mais intensos que os efeitos da exposição isolada.

Alguns estudos mostram esta associação aditiva dos efeitos da exposição a

particulados como a poeira de carvão e à própria sílica associadas ao tabagismo 106.

Brown, 107 realizou um estudo onde fumantes com menor exposição

desenvolveram com mais freqüência a silicose do que indivíduos não fumantes que

foram expostos à doses similares de poeira cristalina. Estes dados realmente

refletem uma possível e relevante contribuição do hábito tabagista para o

desenvolvimento da silicose.

Foi observada uma freqüência dentro do grupo dos trabalhadores com

silicose diagnosticada (doentes) que corresponde a 68,75% de indivíduos que já

fumaram e 31,25% de indivíduos que nunca fumaram. Para o total de

trabalhadores expostos à sílica que nunca fumaram, 64,3% dos indivíduos não

foram diagnosticados como silicóticos e 35,7% de indivíduos com silicose

diagnosticada. No grupo dos trabalhadores expostos à sílica aqui estudados, não


foi possível observar uma associação significativa entre tabagismo e silicose

(Tabela 10).

Tabela 10 - Trabalhadores silicóticos e não silicóticos e o hábito tabagista

Já Fumou 27 22 49

Nunca Fumou 18 10 28

Total 45 32 77

Exposto não doente Exposto doente Total/Tabagismo

4.10. Tabagismo / Tuberculose

O tabagismo está intimamente relacionado com a tuberculose. Uma alta

prevalência de tabagismo entre os fatores de risco para a tuberculose é encontrada

em diferentes estudos desde 1918 108.

A relação epidemiológica entre o hábito tabagista e a tuberculose é bastante

conhecida onde este hábito aumenta o risco da infecção e também está associado às

taxas e reincidência da doença e de mortalidade. Diferentes e recentes revisões

apontam o tabagismo fortemente associado com o aumento das taxas de infecção por

tuberculose. A literatura sugere que os fumantes são até duas vezes mais suscetíveis a

adquirirem tuberculose 108,109.

Neste estudo, os trabalhadores foram agrupados quanto ao hábito do tabagismo

formando em um mesmo grupo, os fumantes e os ex-fumantes (já fumaram) e os

trabalhadores que nunca fumaram no Grupo exposto á sílica. Entre os trabalhadores

que já tiveram tuberculose encontrou-se uma freqüência de 80% que já fumaram e

apenas 20 % nunca fumaram. Entre os trabalhadores que já apresentaram tuberculose

o número de trabalhadores que já fumaram é 4 vezes maior que o número de

trabalhadores que nunca fumaram. Entre os trabalhadores que nunca tiveram

tuberculose 57,8 % já fumaram e 24,3 % nunca fumaram (Tabela 11).

Os dados encontrados neste estudo não expressaram com significância o

hábito de fumar como um fator “determinante” para o desenvolvimento da

tuberculose. Estes trabalhadores já estão sujeitos às duas situações que


contribuem para o desenvolvimento da tuberculose; a exposição à sílica e / ou à

silicose. O hábito de fumar aumenta o risco para infecções respiratórias diversas

através de alterações fisiológicas, desde disfunções vasculares, à desregulação do

sistema imunológico diminuindo a eficiência da resposta inflamatória no controle

de bactérias patogênicas, inclusive com a diminuição da liberação de citocinas

pró-inflamatórias necessárias para uma resposta imunológica efetiva. Atribui-se

também ao fumo o aumento da virulência bacteriana 110.

Tabela 11 - Quadro contendo os trabalhadores que já tiveram tuberculose e que já fumaram ou nunca fumaram.

Já Fumou 37 12 49

Nunca Fumou 27 3 30

Total 64 15 79

Nunca tiveram tuberculose Já tiveram tuberculose Total/Tabagismo

4.11 Sensibilidade e Especificidade do Ensaio Cometa

Com o intuito de testar a capacidade de predição do teste do Ensaio Cometa

foi aplicada a análise de curvas Receiver Operator Characteristic (ROC) através,

das atividades de Catalase e da GST, destes indicadores biológicos. Este método

testa a capacidade discriminatória de um teste para considerar casos “normais” e

“anormais”, considerando aí as possibilidades de acerto, falsos positivos e falsos

negativos. Embora este teste seja normalmente utilizado para diagnóstico de

doenças, também pode ser empregado em casos onde se deseja e testar à

sensibilidade e especificidade de indicadores.

Idealmente, a utilização da curva ROC que serve para avaliar acurácia

destes indicadores, tem também sido empregada em situações de ausência ou

imperfeição do padrão-ouro. Assim, mesmo que no presente estudo não se tenha o

padrão-ouro, optou-se pela utilização da curva ROC como uma investigação

adicional sobre as qualidades do índice de exposição.

Os resultados com melhor especificidade e sensibilidade obtidos foram 26 e

24 para Cometas em UA e %, respectivamente, sendo adotado o ponto de corte de


25 UA. Este ponto de corte foi utilizado como “padrão” sendo o valor máximo

encontrado para o grupo não exposto, para testar os indicadores enzimáticos de

estresse oxidativo CAT e GST, sendo obtido para a Catalase o ponto de corte de

28,27 (sensibilidade = 80% e especificidade = 100%). Os resultados para a GST

não foram significativos.

Outro ponto de corte utilizado foi o valor de Ensaio Cometa de 40 UA, que,

também, foi utilizado testar os valores das atividades das enzimas Catalase e GST.

O valor de ponto de corte para a Catalase continuou sendo de 28,27 (sensibilidade

= 80% e especificidade= 100%) e os resultados para a GST não significativos.

Estes resultados encontrados confirmam a habilidade do Ensaio Cometa em

detectar com sensibilidade a exposição á sílica e sua estreita relação com o

estresse oxidativo.


5 CONCLUSÕES

� O Ensaio Cometa demonstrou ser um método sensível e confiável na

detecção de danos no DNA, causados pela exposição à sílica, diferenciando

estatisticamente a população exposta da não exposta, sendo possível

considerá-lo um importante indicador de exposição e uma ferramenta útil

em avaliações de danos genéticos de populações expostas a agentes

potencialmente genotóxicos;

� A atividade da enzima GST pode ser utilizada nos estudos da silicose como

um indicador biológico de efeito, pois se envolve de maneira precoce nos

eventos iniciais que antecedem os efeitos irreversíveis desencadeados pela

exposição à sílica. Além disso, apresenta um comportamento dinâmico e

característico ao longo das etapas da silicose.

� Neste estudo foi confirmado o risco importante dos pacientes silicóticos

desenvolverem tuberculose. Isso demonstra o quanto a mecanística desta

fisiopatologia pode impactar o sistema imunológico destes indivíduos.

Estes efeitos se somam a outros acarretados pela prévia exposição à sílica

onde a inflamação desencadeada pela exposição e sua persistência são

fatores importantes para o desenvolvimento da tuberculose.

� O hábito de fumar evidenciou uma associação positiva com o

desenvolvimento da silicose e da tuberculose nos trabalhadores deste

estudo, refletindo desta forma o quanto o tabagismo impacta no sistema

imunológico, seja na susceptibilidade à infecções como no processo

inflamatório.

� Estes resultados confirmam que no caso dos trabalhadores expostos à sílica

a exposição ocupacional parece sobrepujar um possível efeito do tabagismo

nos níveis dos indicadores. Enquanto no Grupo Laboratório, o tabagismo

mostrou-se impactante.


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Francisco José Guimarães Joca