FUNDAO OSWALDO CRUZ

CENTRO DE PESQUISAS GONALO MONIZ

Curso de Ps-Graduao em Biotecnologia em Sade e

Medicina Investigativa

TESE DE DOUTORADO

CONTRIBUIO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA

VACINA CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

NAIARA CARVALHO TEIXEIRA BAGUES

Salvador- Bahia

2016

FUNDAO OSWALDO CRUZ

CENTRO DE PESQUISAS GONALO MONIZ

Curso de Ps-Graduao em Biotecnologia em Sade e

Medicina Investigativa

CONTRIBUIO PARA O DESENVOLVIMENTO DE UMA

VACINA CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

NAIARA CARVALHO TEIXEIRA BAGUES

Orientador: Geraldo Gileno de S Oliveira.

Co-orientadora: Cristiane Garboggini M. de Pinheiro.

Tese apresentada ao Curso de Ps-

Graduao em Biotecnologia em Sade e

Medicina Investigativa, para a obteno

do grau de Doutora.

Salvador- Bahia

2016

Ficha Catalogrfica elaborada pela Biblioteca do

Centro de Pesquisas Gonalo Moniz / FIOCRUZ - Salvador - Bahia.

Bagues, Naiara Carvalho Teixeira

B148c Contribuio para o desenvolvimento de uma vacina contra leishmaniose

visceral canina. / Naiara Carvalho Teixeira Bagues. - 2016.

98 f. : il. ; 30 cm.

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Gileno de S Oliveira, Laboratrio de

Patologia e Biointerveno.

Tese (Doutorado em Biotecnologia em Sade e Medicina Investigativa)

Fundao Oswaldo Cruz, Instituto de Pesquisas Gonalo Moniz, 2016.

1. Leishmaniose visceral. 2. Bao. 3. Vacina. 4. Carga parasitria. 5. Co.

I. Ttulo.

CDU 616.993.161

DEDICATRIA

Dedico a meu Pai Joaquim Lopes Teixeira (in memoriam)

AGRADECIMENTOS

Aos meus orientadores Dr. Geraldo Gileno e Dra. Cristiane Pinheiro pelo apoio e

incentivo durante todo o desenvolvimento do doutorado. Agradeo pela convivncia,

confiana e sugestes preciosas na elaborao do trabalho.

Aos pesquisadores Dr. Washington Luis, Dr. Lain Pontes-de-Carvalho, Dra. Patrcia

Veras e Dra. Deborah Fraga pelas colaboraes e sugestes dadas.

Ao CPQGM (Centro de Pesquisas Gonalo Moniz) e a PgBSMI (Ps-Graduao em

Biotecnologia em sade e Medicina Investigativa) pela infraestrutura disponibilizada para o

desenvolvimento do estudo.

A CAPES (Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior) e ao

Programa Brasil Sem Misria pelo financiamento do projeto e pela bolsa de estudo concedida

durante a execuo deste trabalho.

Elivani Sacramento,tcnica e amiga do LPBI, pelos auxlios em experimentao

sempre que necessrio.

Aos tcnicos Srgio, Liliane e Rafela pelo apoio em suas respectivas reas de servio.

s bibliotecrias do CPqGM, pelas orientaes na elaborao da verso final desta

tese.

A todos os amigos do LPBI e em especial aos amigos do grupo Brbara Oliveira,

Catiule Santos, Jssica Mariane, Marcus Vincius, Maria Carolina e Matheus Moreno pelo

incentivo, conselho e carinho sempre que necessrio.

Ao meu marido Thiago Bagues pelo amor e companheirismo dedicados a mim ao

longo de todos esses anos.

A minha me e meus irmos por cada gesto de amor e incentivo ao longo de toda a

minha vida.

BAGUES, Naiara Carvalho Teixeira. Contribuio para o desenvolvimento de uma vacina

contra leishmaniose visceral canina. 98 f. il. Tese (Doutorado) Fundao Oswaldo Cruz,

Instituto de Pesquisas Gonalo Moniz, Salvador, 2016.

RESUMO

INTRODUO: A Leishmaniose visceral (LV) uma doena infecciosa e parasitria

que se encontra em expanso no Brasil. A espcie que causa a doena no Brasil a

Leishmania infantum. O co o principal reservatrio do parasita. Uma vacina contra

leishmaniose visceral canina (LVC) pode favorecer o controle da doena. Este trabalho tem

como objetivo contribuir para o desenvolvimento de uma vacina contra LVC.

OBJETIVO: O estudo do primeiro captulo visou o desenvolvimento de um modelo

para a avaliao de antgenos candidatos vacina contra LVC. METODOLOGIA: Um

experimento foi realizado para obteno de ces resistentes a LVC. Os linfcitos dos animais

deveriam ser capazes de reconhecer antgenos potencialmente teis para o desenvolvimento

de uma vacina. Para isso, uma cepa de L.infantum foi isolada de co naturalmente infectado e

doente (Camaari, Bahia). Seis ces adultos e sadios foram inoculados com 1x108

formas

promastigotas em fase estacionria de cultura por via drmica e acompanhados por dois anos.

RESULTADOS: Os animais apresentaram: 1) rea de indurao e ulcerao rasa no local da

inoculao do parasita com cura espontnea em um perodo inferior a trs meses, 2) ausncia

de manifestaes clnicas e de alteraes hematolgicas e bioqumicas sricas, 3) produo

baixa e flutuante de anticorpos da classe IgG reativos a antgenos de Leishmania, 4) resposta

linfoproliferativa (em 4 de 6 ces) frente a estimulao com antgenos de Leishmania, 5)

produo baixa de IFN- em um ensaio realizado com sangue total incubado por 24h com

antgenos de Leishmania (4 de 5 ces), 6) carga parasitria baixa em aspirado de bao,

detectada por PCR em tempo real. CONCLUSO: Os animais desenvolveram uma forma

subclnica da infeco ao lado de resposta imune humoral e celular fracas.

OBJETIVO: No segundo captulo foi testado um ensaio de avaliao da produo de

citocinas por clulas de sangue de ces naturalmente infectados por Leishmania infantum. O

quantiFERON modificado permite a avaliao in vitro e de maneira rpida da produo de

citocinas contra Leishmania em animais de rea endmica. METODOLOGIA: Antgeno

solvel e antgenos recombinantes de L. infantum (rLci2-NT-5R-CT e rLci2-NT-CT) foram

produzidos e utilizados no ensaio para a estimulao do sangue total de27 ces de rea

endmica e no endmica para LVC por 24h. O plasma foi coletado e a produo das

citocinas caninas IFN-, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF- foram quantificadas. RESULTADO:

Devido a problemas tcnicos no foi possvel avaliar os dados obtidos e, consequentemente,

no foi possvel caracterizar grupos de animais susceptveis e resistentes.

OBJETIVO: No terceiro captulo, a carga parasitria e aspectos histolgicos em

diferentes regies do bao de ces com LVC foi analisada. METODOLOGIA: A carga

parasitria e alteraes histolgicas no bao de 6 ces com LVC foram avaliados por

amostragem de trs seces inferior, mdia e superior do rgo. RESULTADO: Observou-se

uma variao na distribuio na carga parasitria do bao do mesmo animal. Avaliaes

histolgicas (desorganizao polpa branca, granulomas, periesplenite, clulas plasmticas, e

infiltrao polimorfonuclear) mostraram uma variao na freqncia (granulomas) ou

intensidade (perisplenite) no bao de 2 dos 6 ces. CONCLUSO: Conclui-se que a

distribuio da carga parasitria e as alteraes histolgicas no bao de ces com LV mostram

um certo grau de heterogeneidade.

Palavras-chave: Co, Leishmaniose visceral, Bao, Resposta imune, Carga parasitria,

Vacina

BAGUES, Naiara Carvalho Teixeira. Contribution to the development of a vaccine against

canine visceral leishmaniasis. 98f. il. Tese (Doutorado) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto

de Pesquisas Gonalo Moniz, Salvador, 2016.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Visceral Leishmaniasis (VL) is an infectious parasitic disease

which is increasing in Brazil. The species that causes the disease in Brazil is

Leishmaniainfantum. The dog is the main reservoir of the parasite. A canine visceral

leishmaniasis vaccine (CVL) may favor the control of the disease. This paper aims to

contribute to the development of a vaccine against CVL.

OBJECTIVE: The first chapter study aimed the development of a model for the

evaluation of candidate antigens for a vaccine against CVL. An experiment was conducted to

obtain resistant dogs to CVL. Lymphocytes of these animals should be able to recognize

potentially useful antigens for a vaccine development. METHODOLOGY: For this, a strain

of L. infantum was isolated from naturally infected and sick dog (Camaari, Bahia). Six dogs

and healthy adults were intradermally inoculated with 1 x 108 promastigotes in the stationary

phase culture and were followed for two years. RESULTS: The animals showed: 1)

induration area and shallow ulceration in parasite inoculation site with spontaneous healing in

a period of less than three months, 2) absence of clinical symptoms and hematological and

biochemical changes, 3) low and floating production of antibodies IgG reactive to Leishmania

antigens, 4) lymphoproliferative response (in 4 of 6 dogs) compared to stimulation with

leishmanial antigens, 5) low IFN- in a test performed on whole blood incubated for 24 h with

antigen Leishmania (4 of 5 dogs), 6) a low parasite load in spleen aspirates, detected by real-

time PCR. CONCLUSION: These animals developed a subclinical form of the infection

alongside with a weakspecific humoral and cellular immune response and weak cell.

OBJECTIVE: The second section was tested in a trial evaluating cytokine production

by blood cells of dogs naturally infected with Leishmaniainfantum. The modified

QuantiFERON allows evaluation both in vitro and quickly production of cytokines against

Leishmania in animals in an endemic area. METHODOLOGY: Soluble antigen and

recombinant antigens of L. infantum (rLci2-5R-NT-CT and rLci2-NT-CT) were produced and

used in the assay for the stimulation of whole blood of 27 animals from endemic and non-

endemic area for LVC for 24h. Plasma was collected and cytokine production of canine IFN-

, IL-2, IL-6, IL-10 and TNF- cytokines were quantified. RESULTS: Due to technical

some problems, it was not possible to characterize groups of animals susceptible and resistant

in relation to modified QuantiFERON assay results.

OBJECTIVE: In the third chapter, the parasite load and histological aspects in

different regions of the spleen of dogs with CVL were analyzed. METHODOLOGY: The

parasite load and histological changes in the spleen of 6 dogs with CVL were evaluated by

sampling three sections of the spleen (lower, middle and upper section of the organ).

RESULTS: There was a variation in parasitic load distribution in the spleen of the same

animal. Histological evaluations (disorganized white pulp, granulomas, periesplenite, plasma

cells, and polymorphonuclear infiltration) showed a variation in the frequency (granulomas)

or intensity (perisplenite) in spleen in 2 of 6 dogs. CONCLUSION: Therefore, the

distribution of the parasitic load and histological changes in dogs spleen with VL show a

certain degree of heterogeneity.

Keywords: Dog, Visceral leishmaniasis, Spleen, Immune response, Parasite load, Vaccine

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Caracterizao clnica, imunolgica e parasitria em ces de rea

endmica para leishmaniose visceral submetidos a ensaio de

quantiFERON modificado...........................................................................

64

Tabela 2 Caracterizao clnica e imunolgica de ces com leishmaniose visceral

avaliados quanto a distribuio da carga parasitria esplnica....................

78

Tabela 3 Achados histolgicos no bao de ces com leishmaniose visceral

avaliados quanto a distribuio da carga parasitria esplnica....................

80

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Acompanhamento de ces inoculados com Leishmania por via drmica

quanto a resposta humoral e celular, produo de IFN-, IL-2, IL-10 e

TNF- e carga parasitria esplnica...........................................................

26

Figura 2 Esfregao de material aspirado de bao de co de rea endmica

submetido a colorao pelo mtodo de Wright .........................................

35

Figura 3 Curva de proliferao de Leishmania isolada do co de rea endmica.... 36

Figura 4 Leso cutnea no local da inoculao experimental da Leishmania em

ces..............................................................................................................

37

Figura 5 Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania por via

drmica........................................................................................................

39

Figura 6 Avaliao de anticorpos especficos em ces inoculados com

Leishmania por via drmica........................................................................

41

Figura 7 Avaliao da proliferao celular de PBMC ces inoculados com

Leishmania por via drmica........................................................................

43

Figura 8 Avaliao de IFN-, IL-2, IL-10 e TNF- em ces inoculados com

Leishmania por via drmica........................................................................

46

Figura 9 Determinao da carga parasitria no baco de ces inoculados com

Leishmania por via drmica........................................................................

47

Figura 10 Desenho esquemtico de antgenos recombinantes de Leishmania

derivados de cinesina .................................................................................

58

Figura 11 Avaliao por SDS-PAGE e Western blot de antgenos recombinantes

de Leishmania derivados de cinesina purificado........................................

66

Figura 12 Avaliao de IFN-, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF- em ces de rea

endmica e em ces de rea no endmica para Leishmaniose visceral

canina..........................................................................................................

68

Figura 13 Desenho esquemtico do bao de co indicando as reas das quais foram

obtidas amostras para estudo histolgico e determinao da carga

parasitria ...................................................................................................

75

Figura 14 Carga parasitria em diferentes regies do bao de ces com

leishmaniose visceral .................................................................................

79

Figura 15 Achados histolgicos do bao de ces com leishmaniose visceral

avaliados quanto a distribuio da carga parasitria esplnica...................

81

LISTA DE ABREVIATURAS

ALT Alanina aminotransferase AST Aspartato aminotransferase BCIP 5-bromo 4-cloro 3-indolil fosfato BSA Soro albumina bovina CCZ Centro de Controle de Zoonoses cDNA cido desoxirribonucleico complementar CEUA Comit de tica para o Uso de Animais CFSE Carboxifluorsceina succinimidil ster CMNSP Clulas mononucleares de sangue perifrico Con A Concanavalina A cpm Cintilao de partculas betas por minuto DO Densidade ptica DMSO Dimetilsufxido DNA cido desoxirribonucleico DPP Ensaio imunocromatogrfico baseado em plataforma de duplo percurso DTH Reao de hipersensibilidade tardia EDTA cido etilenodiamino tetra-actico ELISA Ensaio imunoenzimtico EU Unidade de medida de endotoxina FML Fucose-Manose-Ligantes GM-CSF Fator estimulador de colnias de granulcitos e moncitos His Histidina IFAT Teste de imunofluorescncia indireta IFN- Interferon gama Ig Imunoglobulina IL Interleucina IPTG Isopropil--D-thiogalactosdeo LB Luria Bertani LPS Lipopolissacardeo LV Leishmaniose Visceral LVC Leishmaniose visceral canina MAPA Ministrio da Agricultura e Pecuria e Abastecimento MS Ministrio da Sade NBT Nitroazultetrazlio-dimetil formamida NK Natural killer PBMC Clulas mononucleares de sangue perifrico PBS Tampo fosfato tamponado com salina PCR Reao em cadeia da polimerase PHA Fito-hemaglutinina RIFI Ensaio de imunofluorescncia indireta RNA cido ribonucleico Rpm Rotaes por minuto SBF Soro Bovino Fetal SDS Dodecil sulfato e sdio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS SLA Antgeno solvel de Leishmania SRD Sem raa definida TAE Tris-acetato-EDTA Th Linfcitos T auxiliares TMB Tetrametilbenzidina TNF- Fator de necrose tumoral alfa TNF- Fator de necrose tumoral beta

SUMRIO

1 REVISO DE LITERATURA .................................................................................... 13

1.1 Aspectos gerais sobre a leishmaniose visceral ................................................................ 13

1.2 Diagnstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC).................................................... 14

1.3 Aspectos gerais da imunidade contra Leishmania infantum ........................................... 16

1.4 Estratgias utilizadas para o desenvolvimento de vacinas .............................................. 17

2 OBJETIVOS DO TRABALHO ................................................................................... 20

2.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................ 20

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .......................................................................................... 20

3 DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO PARA AVALIAR ANTGENOS

CANDIDATOS A VACINA CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

...................................................................................................................................... 21

3.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 22

3.2 MATERIAL E MTODOS ........................................................................................... 24

3.2.1 Isolamento, caracterizao e obteno do inculo de Leishmania ................................ 24

3.2.2 Animais .......................................................................................................................... 25

3.2.3 Inoculao intradrmica com L. infantum ..................................................................... 25

3.2.4 Acompanhamento clnico dos ces................................................................................ 26

3.2.5 Avaliao clnico-patolgica ......................................................................................... 26

3.2.6 Coleta de sangue perifrico ........................................................................................... 27

3.2.7 Obteno de soro ........................................................................................................... 28

3.2.8 Obteno de clulas mononucleares de sangue perifrico ............................................ 28

3.2.9. Preparao de antgenos de Leishmania ........................................................................ 29

3.2.10 Resposta imune humoral ............................................................................................... 29

3.2.11 Resposta imune celular .................................................................................................. 30

3.2.12 Mensurao de citocinas ................................................................................................ 31

3.2.13 Avaliao da carga parasitria por PCR em tempo real e cultura ................................. 34

3.2.14 Anlise estatstica .......................................................................................................... 35

3.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 36

3.3.1 Isolamento, caracterizao e preparao do inculo de Leishmania para injeo

intradrmica em ces .................................................................................................... 36

3.3.2 Avaliao clnica de ces inoculados com Leishmania infantum por via drmica ......... 37

3.3.3 Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania infantum por via

drmica ......................................................................................................................... 39

3.3.4 Produo de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania infantum por

via drmica .................................................................................................................... 41

3.3.5 Resposta linfoproliferativa em ces inoculados com Leishmania infantum por via

drmica ......................................................................................................................... 42

3.3.6 Produo de citocinas em ces inoculados com Leishmania infantum por via drmica . 44

3.3.7 Carga parasitria no baco de ces inoculados com Leishmania infantum por via

drmica ......................................................................................................................... 47

3.4 DISCUSSO ................................................................................................................. 49

3.5 CONCLUSO ............................................................................................................... 52

4 AVALIAO DE CITOCINAS PRODUZIDAS POR CLULAS DE SANGUE

PERIFRICO DE CES DE REA ENDMICA PARA LEISHMANIOSE

VISCERAL .................................................................................................................. 53

4.1 JUSTIFICATIVA ......................................................................................................... 54

4.2 MATERIAL E MTODOS .......................................................................................... 56

4.2.1 Animais ......................................................................................................................... 56

4.2.2 Avaliao dos ces........................................................................................................ 56

4.2.3 Coleta de sangue perifrico .......................................................................................... 57

4.2.4 Antgenos e mitgenos .................................................................................................. 57

4.2.4.1 Antgeno solvel de Leishmania infantum .................................................................... 57

4.2.4.2 Antgeno recombinante de Leishmania infantum ......................................................... 57

4.2.5 Avaliao das protenas recombinantes por SDS-PAGE e Western Blot ........................ 61

4.2.6 Mensurao de citocinas: IFN-, IL-2, IL-6, IL-10 e TNF- .......................................... 62

4.2.7 Anlise estatstica ............................................................................................................ 63

4.3 RESULTADOS ............................................................................................................... 64

4.3.1 Caracterizao clnica, imunolgica e parasitria dos animais de rea endmica para

leishmaniose visceral .................................................................................................... 64

4.3.2 Produo de citocinas por clulas de sangue perifrico de ces de rea endmica para

leishmaniose visceral aps a estimulao com antgenos de Leishmania .................... 66

4.4 DISCUSSO ................................................................................................................. 70

4.5 CONCLUSO ................................................................................................................ 71

5. ESTUDO DA CARGA PARASITRIA E ASPECTOS HISTOLGICOS EM

DIFERENTES REGIES DO BAO DE CES COM LEISHMANIOSE

VISCERAL. ................................................................................................................. 72

5.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 73

5. 2 MATERIAIS MTODOS .............................................................................................. 75

5.2.1 Animais ........................................................................................................................... 75

5.2.2 Coleta de amostras de bao ............................................................................................ 75

5.2.3 Processamento histolgico ............................................................................................. 76

5.2.4 PCR em tempo real ......................................................................................................... 76

5.2.5 Declaraes ticas........................................................................................................... 77

5.2.6 Anlise estatstica ........................................................................................................... 77

5.3 RESULTADOS ............................................................................................................... 78

5.3.1 Caracterizao clnica, imunolgica e parasitolgica dos ces estudados. ..................... 78

5.3.2 Avaliao da carga parasitria em diferentes regies do bao de ces com leishmaniose

visceral .......................................................................................................................... 79

5.3.3 Anlise histolgica de diferentes regies do bao de ces com leishmaniose visceral ... 81

5.4 DISCUSSO ................................................................................................................... 83

5.5 CONCLUSO ................................................................................................................. 85

6 CONSIDERAES FINAIS E PERSPECTIVAS ...................................................... 86

REFERNCIAS ............................................................................................................. 88

ANEXOS .......................................................................................................................... 97

13

1 REVISO DE LITERATURA

1.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE A LEISHMANIOSE VISCERAL

A leishmaniose visceral (LV) endmica em mais de 80 pases e sua prevalncia

excede 12 milhes de casos no mundo. A cada ano, aproximadamente 500 mil casos de LV

ocorrem no mundo, 90% dos casos ocorrem na ndia, Sudo, Sudo do Sul, Nepal,

Bangladesh, Etipia e Brasil (ALVAR et al., 2012; SUNDAR, 2001). Epidemias recorrentes

de LV ocorrem na frica Oriental (Etipia, Qunia, Sudo do Sul e Sudo) causando altos

ndices de morbi-mortalidade nas comunidades afetadas(WHO, 2010).

A LV uma doena parasitria que se encontra em expanso no Brasil (BRASIL,

2014). uma zoonose que pode acometer tanto o homem, quanto o co. O co (Canis

familiaris) parece ser o principal reservatrio do agente causal (CORREDOR, 1989; DEANE

e DEANE, 1954). No Brasil, no perodo de 2003 a 2012, a mdia anual de casos de LV foi de

3.565 casos e a incidncia de 1,9 caso/ 100.000 habitantes e quando no tratado, o indivduo

pode evoluir para o bito em mais de 90% dos casos.(BRASIL, 2014)

A LV causada, na maioria das vezes, por uma das espcies de protozorios do

complexo Leishmania donovani, composto pela Leishmania donovani, Leishmania infantum e

Leishmania chagasi (LAINSON; RYAN; SHAW, 1987). No Novo Mundo, a Leishmanisose

visceral (LV) causada por Leishmania chagasi, idntica Leishmania

infantum(MAURCIO; STOTHARD; MILES, 2000). A L. donovani a espcie causadora da

doena no subcontinente indiano, em partes da sia e na frica, enquanto que, a L. infantum

causa uma zoonose na Bacia Mediterrnea, na regio central e no sudoeste da sia e da

Amrica do Sul (DESJEUX, 2001; MAURICIO et al., 1999)

Protozorios do gnero Leishmania possuem um ciclo heteroxnico, sendo necessrio

um hospedeiro invertebrado e outro vertebrado para completarem seu ciclo de vida. A

Leishmania transmitida pela picada de fmeas de dpteros da famlia Psychodidae e

subfamlia Phebotominae (flebotomneos), sendo Lutzomyialongipalpis a principal espcie

transmissora da Leishmaniainfantum no Brasil (LAINSON et al., 1977). O parasito pode ser

adquirido pelo inseto durante a realizao do repasto sanguneo em um hospedeiro vertebrado

infectado, que na forma zoontica da leishmaniose visceral pode ser o co. No tubo digestivo

do flebtomo, o protozorio se transforma em formas promastigotas, a passa por um processo

de multiplicao e mudanas bioqumicas, resultando em formas infectivas chamadas

14

promastigotas metacclicas (RITTIG; BOGDAN, 2000). Quando o inseto vetor infectado

realiza um novo repasto sanguneo, promastigotas metacclicas podem ser inoculadas em um

novo hospedeiro vertebrado, que pode ser o homem ou o co. Aps serem fagocitados por

macrfagos, essas formas se transformam em amastigotas dentro de fagolisosomas, onde

ocorre a multiplicao. A partir da os parasitos podem disseminar-se para rgos ricos em

clulas do sistema fagoctico mononuclear, como por exemplo, bao, fgado, medula ssea e

linfonodos (HANDMAN, 2001).

Tanto o homem quanto o co, podem desenvolver desde um quadro de infeco

assintomtico at uma doena grave potencialmente letal aps terem sido inoculados com L.

infantum pelo inseto vetor (BRASIL, 2014). Quando ocorre o desenvolvimento da doena, as

manifestaes clnicas e alteraes anatomopatolgicas, clinico-patolgicas e imunolgicas

apresentadas so semelhantes no homem e no co (BRASIL, 2014). Aps um perodo de

incubao, alguns ces com doena progressiva podem desenvolver linfoadenopatia,

dermatite, onicogrifose, perda de peso, caquexia, conjuntivite, elevada resposta de anticorpos

e uma baixa resposta mediada por clulas do sistema imune entre outros (SEMIAO-SANTOS

et al., 1995).

As medidas para o controle da leishmaniose visceral preconizadas pelo Ministrio da

Sade so: 1) diagnstico precoce e tratamento adequado de casos da doena em humanos; 2)

eliminao de ces infectados; 3) utilizao de inseticida no domiclio e peri-domiclio em

reas endmicas para combate ao inseto vetor; 4) atividades em educao em sade (BRASIL,

2014). Portanto, as medidas recomendadas incluem diagnstico e tratamento de casos

humanos, controle do inseto vetor e eliminao de ces soropositivos (DESJEUX, 2004). No

entanto, a eliminao dos ces soropositivos pode ser dada tardiamente,isso ocorre, em parte,

porque tais medidas aplicadas pelo Sistema de Sade so de difcil execuo e de alto custo

para serem mantidas de forma sistemtica e por longos prazos (COURTENAY et al., 2002), o

que implicaria em um maior investimento por parte do governo e, alm disso, nem todos os

ces infectados apresentam-se sintomticos, mascarando a doena. Ou seja, uma parcela

apresenta manifestaes clnicas compatveis com a doena e outra parcela no revela

manifestaes clnicas (assintomticos) (MORENO; ALVAR, 2002).

1.2 DIAGNSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA (LVC)

Ces desempenham papel fundamental na epidemiologia da leishmaniose visceral,

sendo considerados os principais reservatrios para a doena humana. Os parasitas se alojam

15

em rgos linfides perifricos e o bao o rgo que se destaca na filtrao do sangue

corpreo (STEINIGER; RTTINGER; BARTH, 2003) e consequentemente no

armazenamento de altas densidades do parasito (REIS et al., 2006). O diagnstico

parasitolgico feito pelo encontro de formas amastigotas do parasito em material biolgico

obtido de medula ssea, linfonodo ou do bao uma tcnica muito confivel. E a deteco

precoce de ces infectados em rea endmica importante para minimizar a expanso da

doena e faz parte das medidas preconizadas pelo Ministrio da Sade (MS) para o controle

da LV (BRASIL, 2014).

Atualmente existem diferentes testes que podem ser usados para diagnsticos. Os

parasitolgicos visam a deteco do parasito em esfregaos e imprints, alm do isolamento

do parasita em cultura; os testes imunolgicos utilizam mtodos sorolgicos (deteco de

anticorpos anti-Leishmania ex.: ensaio de imunofluorescncia indireta (RIFI) e ELISA)

(BALEEIRO; PARANHOS-SILVA; C, 2006; DOS-SANTOS et al., 2008) e a amplificao

do DNA do parasita por PCR (REIS et al., 2013; SOLC et al., 2012).

Cada teste apresenta seus pontos positivos, mas tambm os negativos. Apesar de

existir uma grande variedade de tcnicas, nenhuma apresenta 100% de sensibilidade e

especificidade (GONTIJO; MELO, 2004). Por vezes ces assintomticos podem produzir

resultados falso-negativos(ALMEIDA et al., 2005; BRASIL, 2014) ou at mesmo ocorrer

reao cruzada com outros parasitas e outras espcies de Leishmania (FERREIRA et al.,

2007; SCHULZ et al., 2003).

O Ministrio da sade atualmente indica para o diagnstico imunolgico para a

pesquisa de anticorpos contra Leishmania, o ensaio deimunofluorescncia indireta (RIFI),

testes rpidos imunocromatogrficos e o ensaio imunoenzimtico (ELISA). Para o RIFI,

consideram-se como positivas as amostras reagentes a partir da diluio de 1:80. Nos ensaios

imunocromatogrficosso considerados positivos quando a linha controle e a linha teste

aparecem na fita ou plataforma. J o ELISA no est disponvel na rede pblica de sade, no

entanto, algumas unidades de sade da rede privada utilizam kits de ELISA registrados e

comercializados no Brasil. (BRASIL, 2014)

Estudos que utilizaram as tcnicas de biologia molecular (ex.: reao em cadeia da

polimerase em tempo real) descrevem alta sensibilidade e especificidade (MIR et al., 2008;

SOLANO-GALLEGO et al., 2001; SOLC et al., 2012).

Diversos autores sugerem a associao entre os parmetros clnicos, epidemiolgicos,

parasitolgicos e sorolgicos como necessrios para o diagnstico definitivo da leishmaniose

visceral canina. Dos-Santos relata que utilizao associada de parmetros parasitolgicos e

16

imunolgicos podem melhorar o desempenho e predio da susceptibilidade a LVC (DOS-

SANTOS et al., 2008)

1.3 ASPECTOS GERAIS DA IMUNIDADE CONTRA LEISHMANIA INFANTUM

Ainda no so completamente compreendidos os fatores que predispem ao

desenvolvimento da forma clnica polissintomtica ou que promovem o controle, mesmo que

temporrio, da infeco por L. infantum no co. No entanto, estudos tem demonstrado que a

resposta imune no homem e no co envolvida no reconhecimento e controle de infeces por

patgenos intracelulares, incluindo a infeco causada por L. infantum, dependente de

linfcitos T especficos com diferenciao Th1 (clulas T CD4+ e T CD8+) e do

estabelecimento de linfcitos T de memria (PINELLI, 1995; KAYE et al., 2004a; PINELLI

et al., 1994a).

Linfcitos do tipo Th1 so capazes de produzir diversas citocinas (exemplo: IFN-,

IL-2, IL-3, fator estimulador de colnias de macrfagos e granulcitos (GM-CSF) e fator de

necrose tumoral alfa (TNF-)) e so responsveis pela imunidade celular, por reaes

inflamatrias, e auxlio de linfcitos B para a produo de anticorpos da subclasse IgG2a. Por

outro lado, os linfcitos do tipo Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 e so responsveis

pela imunidade humoral, reaes alrgicas e estmulo de linfcitos B para a produo,

predominantemente, de anticorpos da subclasse IgM, IgA e IgG1 (MOSMANN; COFFMAN,

1989)

Ces com doena sintomtica podem apresentar febre, anemia, leses de pele,

onicogrifose, emagrecimento, hepatoesplenomegalia, linfoadenopatias, entre outros sinais da

doena (MORENO; ALVAR, 2002). Estudos demonstram que a susceptibilidade est

correlacionada com ausncia da resposta linfoproliferativa e ausncia da produo de

citocinas como IFN- e IL-2 (PINELLI et al., 1994; RHALEM et al., 1999) e produo de IL-

10 que capaz de suprimir a atividade de clulas apresentadoras de antgenos e linfcitos T

(BACELLAR et al., 2000).A parcela de ces que no apresentam manifestaes clnicas,

provavelmente, composta por um subgrupo de animais resistentes, que controlaro a

infeco. Embora no existam evidncias diretas de todas as etapas do processo de induo de

resposta imune Th1 contra a L. infantum no homem, no co e at mesmo no modelo murino, o

cenrio geral parece ser o descrito a seguir. Clulas apresentadoras de antgeno, incluindo

clulas dendrticas, capturam os microrganismos invasores, ou fragmentos desses

microrganismos, na pele e migram para regio T de linfonodo de drenagem (RIBEIRO-

17

GOMES; SACKS, 2012; THALHOFER et al., 2011). Clulas dendrticas que amadurecem

em condies de estimulao intensa desenvolvem a capacidade de expressar molculas

coestimulatrias e produzir IL-12 (LANGENKAMP et al., 2000). No linfonodo, aps

processamento de antgenos do protozorio, clulas dendrticas que expressam peptdeos da

Leishmania acoplados a molculas do complexo principal de histocompatibilidade (classe I e

classe II), molculas coestimulatrias como (por exemplo, CD80 e CD86) (PINELLI et al.,

1999)e produzem IL-12 (KAYE et al., 2004) so capazes estimular a proliferao e a

diferenciao de linfcitos T nave em linfcitos T efetores (T CD4+ e T CD8+) Th1. Com a

diferenciao, as clulas T CD4+ Th1 produzem IFN- e fator de necrose tumoral (TNF)-alfa

nos tecidos afetados pela infeco e essas citocinas ativam mecanismos leishmanicidas

(incluindo a produo de xido ntrico, H2O2 e on superxido) em macrfagos infectados

pelo protozorio (KAYE et al., 2004; MURRAY; CARTELLI, 1983). Alm disso, linfcitos

T CD8+ tambm podem produzir IFN- ou exercer atividade citotxica sobre clulas

infectadas pela Leishmania (TSAGOZIS; KARAGOUNI; DOTSIKA, 2005).

Com a montagem da resposta imune celular especfica ocorre o desenvolvimento de

linfcitos T de memria (provavelmente linfcitos de T de memria central e de memria

efetora), os quais promovem o controle da infeco em longo prazo. Por outro lado, quando

acontece uma falha no estabelecimento de reposta imune Th1 em indivduos inoculados por L.

infantum, pode ocorrer diferenciao de linfcitos naive em linfcitos Th2 e/ou de linfcitos

T regulatrios (Treg), os quais no contribuem para o controle da infeco e/ou favorecem a

instalao da doena. (RAI et al., 2012; ZWINGENBERGER et al., 1990)

1.4 ESTRATGIAS UTILIZADAS PARA O DESENVOLVIMENTO DE VACINAS

So muitas as tentativas de controle da leishmaniose visceral canina, mas uma

alternativa para o controle da leishmaniose visceral zoontica seria a preveno da infeco

canina e/ou da transmisso do parasito do co para o inseto vetor. Assim, a utilizao de uma

vacina efetiva para uso canino, culminaria, provavelmente, na reduo da incidncia de LV

humana (DYE, 1996; MORENO; ALVAR, 2002).

Vrias estratgias distintas j foram usadas para seleo de antgenos de candidatos a

componente de vacina contra leishmaniose como, por exemplo: a) obteno de uma frao de

protenas, dentro de uma faixa de peso molecular, a partir de lisado de Leishmania

(MONJOUR et al, 1988), b) identificao de antgenos solveis de Leishmania, fracionados

por eletroforese em duas dimenses, e capazes de induzir resposta linfoproliferativa em

18

indivduos curados de leishmaniose tegumentar (MELBY; NEVA; SACKS, 1989); c) seleo

de uma frao de antgenos de Leishmania capazes de ligar-se a fucose e manose

(PALATNIK-DE-SOUSA et al., 1996); d) seleo de plasmdeos de biblioteca de expresso

codificando antgenos capazes de induzir resposta imune protetora em camundongos

(MELBY et al., 2000)

Vrios antgenos candidatos a componente de uma vacina, incluindo Fucose Manose

Ligante (FML), protena quimrica Q, LACK, MML quimrica, cistena proteases (CPA e

CPB), KMPII, TRYP, GP63, A2 e fatores excretados os secretados de formas promastigotas

Leishmania infantum (LiESP), foram avaliados em associao com adjuvante (entre eles,

saponina Quil A, uma frao de saponina denominada QA-21 e MPL-SE) em camundongos e

em ces, mostrando graus variados de proteo contra a infeco causada pelo desafio

experimental (GRADONI, 2015)

A avaliao da resposta imune de indivduos aps a administrao de antgenos

produzidos por DNA plasmideal vem sendo realizada. Alm disso, formulaes que

favoream a distribuio de plasmdeos, a otimizao de plasmdeos (com otimizao de

cdons) (SCHNEIDER; GREENE; ALLISON, 1997), a adio de sequncia lder para

promover a secreo de protenas (YANG et al., 2001) e mtodos para aumentar a entrada de

plasmdeo em clulas teciduais e, consequentemente, promover a expresso de protenas

recombinantes codificadas pelo plasmdeo, tm sido desenvolvidas (AIHARA; MIYAZAKI,

1998).

Muitos experimentos so realizados no sentido de caracterizar a resposta imune

induzida por antgenos candidatos vacina contra LV canina, incluindo parasitas vivos ou

mortos, antgenos purificados, antgenos recombinantes, bactrias vivas expressando

antgenos recombinantes e plasmdeos codificando antgenos (MIR et al., 2008).

No Brasil, h mais de trs dcadas pesquisadores vm trabalhando com o objetivo de

desenvolver uma vacina contra leishmaniose visceral canina. As formulaes vacinais que

foram estudadas de forma mais avanada foram elaboradas protena A2/saponina

(comercializada com o nome de Leish-Tec, de Leishmania infantum, (FERNANDES et al.,

2008) e fatores secretados/excretados de Leishmania infantum (LiESAp-MDP, (LEMESRE et

al., 2007). Contudo, os resultados obtidos com essas formulaes vacinais ainda no foram

confirmados de forma independente, usando-se uma metodologia adequada, por outros grupos

pesquisa.

At o presente momento duas vacinas contra leishmaniose visceral canina foram

desenvolvidas e avaliadas em Fase III, a Leish-Tec (Hertape, Brasil) e a Canileish (Virbac,

19

Frana). A vacina Leish-Tec formulada com a protena recombinante de L. donovani A2 e

saponina Quil A, enquanto que a vacina Cani-Leish formulada com LiESP e a frao de

saponina QA-21.

Em um ensaio de fase III da vacina Cani-Leish, realizado com ces beagle, os animais

foram avaliados por 24 meses aps alojamento em uma rea altamente endmica. Nesse

ensaio, foi observada prenveno do surgimento de manifestaes clnicas compatveis com

LV, sendo a eficcia de 68%. A avaliao de parasitismo por cultura de material aspirado de

medula ou linfonodo, mostrou que 3 de 41 e 9 de 39 dos animais vacinados e do grupo

controle, respectivamente, exibiam infeco ativa (OLIVA et al., 2014).

As vacinas contra leishmaniose visceral canina avaliadas em fase III mostram apenas

proteo parcial contra o desenvolvimento da infeco, doena ou transmisso de Leishmania

de ces infectados para o inseto vetor (BORJA-CABRERA et al., 2002; DA SILVA et al.,

2001; FERNANDES et al., 2012; LEMESRE et al., 2007). Isso sugere que continua sendo

necessria a seleo de novos antgenos com capacidade proteger ces contra leishmaniose

visceral

20

2 OBJETIVOS DO TRABALHO

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver ferramentas teis para o desenvolvimento uma vacina contra leishmaniose

visceral canina

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Desenvolver um modelo para avaliar antgenos candidatos a vacina contra

leishmaniose visceral canina;

Avaliar citocinas produzidas por clulas de sangue perifrico em ces de rea

endmica para leishmaniose visceral

Estudar a carga parasitria e aspectos histolgicos em diferentes regies do bao de

ces com leishmaniose visceral.

21

3 DESENVOLVIMENTO DE UM MODELO PARA AVALIAR

ANTGENOS CANDIDATOS A VACINA CONTRA

LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA

22

3.1 JUSTIFICATIVA

Vrias estratgias tm sido utilizadas para a seleo ou avaliao de antgenos

candidatos a compor uma vacina contra leishmaniose visceral. Muitos pesquisadores

selecionaram antgenos baseados em: a) facilidade de isolamento, por exemplo, fatores

excretados ou secretados (CIBRELUS et al., 1999), b) separao de molculas de formas

promastigotas em gel de poliacrilamida (FROMMEL et al., 1988), c) separao molculas de

formas promastigotas em gel de poliacrilamida seguida de transferncia para membrana de

nitrocelulose e reatividadea clulas mononucleares de sangue perifrico humano infectados

com L. donovani (MELBY; NEVA; SACKS, 1989), e) reatividade de polipeptdeos

recombinantes a anticorpos e esplencitos de camundongos infectados com L.

infantum(WILSON et al., 1995), f) expresso em formas amastigotas, na ausncia de

expresso em formas promastigotas, de L. donovani (CHAREST; MATLASHEWSKI, 1994),

ou g) reatividade de polipeptdeos recombinantes a anticorpos de ces ou seres humanos

infectados com L. infantum (OLIVEIRA et al., 2011). Vrios pesquisadores avaliaram o

potencial de antgenos para compor uma vacina contra LV canina pela imunizao de

camundongos ou ces e estudo da resposta imune induzida (GHOSH; ZHANG;

MATLASHEWSKI, 2002; LEMESRE et al., 2005). Nem sempre existe correlao entre a

induo resposta imune protetora em camundongos e em ces (DUNAN et al.,

1989;FROMMEL et al., 1988) e a avaliao inicial de antgenos em ces muito onerosa.

Portanto, provavelmente, uma estratgia melhor para a seleo de antgenos candidatos e

avaliao inicial seria utilizar clulas de sangue perifrico de ces resistentes a LV que

apresentem resposta imune celular especfica. Tais ces podem ser obtidos pela inoculao

natural ou experimental com Leishmania. Em princpio, esses animais apresentam resistncia

ao desenvolvimento da doena pelo fato do sistema imune deles ter montado reposta imune

celular contra alguns antgenos do parasito. Portanto, clulas mononucleares de sangue

perifrico desses animais devem ser capazes de revelar os antgenos protetores.

Previamente, Teixeira e colaboradores (TEIXEIRA et al., 2011) imunizaram com

lisado de L. infantum em adjuvante incompleto de Freund e, posteriormente, inocularam com

formas promastigotas da fase estacionria de cultura em ces. Esses animais no

desenvolveram manifestaes clnicas e apresentaram resposta imune celular especfica

durante dois anos de acompanhamento. Provavelmente, tais animais desenvolveram

resistncia contra LV e clulas mononucleares de sangue perifrico deles poderiam ser teis

23

para a seleo de antgenos candidatos. Infelizmente, a administrao de adjuvante

incompleto de Freund promoveu o aparecimento de abscesso no local da injeo, impedindo o

uso desse modelo para a seleo de antgenos candidatos. Uma alternativa para a obteno de

ces resistentes a LV seria a inoculao de Leishmania, em cultura de promastigotas na fase

estacionria, por via intradrmica (Eugenia Carrillo e Francisco Javier Moreno, Instituto de

La Salud Carlos III, Madrid/ Espanha, comunicao pessoal, dados no publicados).

No presente trabalho, foi avaliada a inoculao de Leishmania por via drmica visando

a obteno de um modelo de ces resistentes a LV til para a seleo ou avaliao de

antgenos candidatos a vacina contra LV canina

24

3.2 MATERIAL E MTODOS

3.2.1 Isolamento, caracterizao e obteno do inculo de Leishmania

No curso da implementao de medidas de controle da LV por parte de agentes do

Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Camaari, Bahia, um co foi identificado com

resultados positivos no ensaio imunocromatogrfico baseado em plataforma de duplo

percurso (DPP) com antgeno rK28, (BioManguinhos)]. O animal tambm apresentava

manifestaes clnicas compatveis com LV, incluindo perda de peso, linfadenopatia,

onicogrifose e ceratoconjuntivite. Esse animal tambm foi submetido puno aspirativa de

bao guiada por ultrassonografia, conforme mtodo descrito previamente (BARROUIN-

MELO et al., 2004) com permisso do proprietrio, o que resultou no encontro do parasito. O

animal foi submetido eutansia e pequenos fragmentos deregies diferentes do bao foram

coletados, macerados e ressuspensos em meio de cultura Schneider (Sigma Aldrich, St Louis,

Missouri, EUA)com dimetilsulfxido (DMSO) a 20% e armazenados em nitrognio lquido.

O material aspirado do bao foi usado para fazer esfregaos em lmina de vidro e

submetido colorao pelo mtodo de Wright e examinado ao microscpio ptico.

Amostras da suspenso de tecido esplnico armazenada em nitrognio lquido foram

descongeladas e colocadas em meio de cultura bifsico [gar-sangue e meio de cultura

Schneider contendo 20% de Soro Bovino Fetal (SBF, Gibco BRL Life Technologies, Nova

York, EUA). Depois da observao de formas promastigotas sob o microscpio invertido,

foram feitas passagens sucessivas do parasita em frascos plstico em meio Schneider

contendo 20% de SBF. Ao longo de duas passagens sucessivas foi determinada a curva de

proliferao da Leishmania. Alm disso, uma amostra da cultura foi enviada ao Laboratrio

de Referncia Nacional para Tipagem de Leishmania [Coleo de Leishmanias do Instituto

Oswaldo Cruz (CLIOC), Fundao Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro]para caracterizao da

espcie de Leishmania, realizada pelo mtodo de eletroforese de enzimas (registro RE-

020/2013, CAM/BR2013/CAO01).

Para apreparao do inculo, 7,5 mL da cultura de Leishmania em meio Schneider

contendo 20% de SBF que estava em fase estacionria foi centrifugada a 2.500 x g durante 10

minutos a temperatura ambiente e o sedimento foi ressuspenso em PBS a 1 x 109/ mL e

armazenado em gelo at o momento do uso.

25

3.2.2 Animais

Foram usados 12 ces adultos, 4 machos e 8 fmeas, sem raa definida, com idade

entre 2 e 3 anos. Esses animais foram doados pelos seus proprietrios quando tinham cerca de

60 a 90 dias de idade. Os animais foram mantidos no canil de experimentao do Centro de

Pesquisas Gonalo Moniz (CPqGM/ FIOCRUZ) recebendo rao industrializada e gua ad

libitum. Alm disso, os ces foram tratados com vermfugos, vacinados contra raiva em co e

contra as principais doenas infecciosas que acometem a espcie, como por exemplo,

leptospirose, cinomose, adenovirose, virose causada por parainfluenza, parvovirose, hepatite

viral e coronavirose.

Dois grupos de 6 ces cada foram formados, um grupo controle e um grupo teste.

Tanto o grupo controle quanto o grupo teste foram formados com 2 machos e 4 fmeas cada.

Os ces foram submetidos puno esplnica, usando-se mtodo descrito previamente

(BARROUIN-MELO et al., 2004). O material aspirado do bao dos animais foi submetido a

extrao de DNA e reao de PCR em tempo real para deteco de DNA de Leishmania,

conforme mtodo descrito previamente (FRANCINO et al., 2006). O resultado da PCR em

tempo real foi negativo para todos os animais.

Todos os procedimentos realizados com os animais no presente estudo foram

realizados de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais e foram aprovados pelo

Comit de tica para o Uso de Animais (CEUA) do Centro de Pesquisa Gonalo Moniz,

Fundao Oswaldo Cruz (CPqGM FIOCRUZ), sob protocolo de n. 021/2011.

3.2.3 Inoculao intradrmica com L. infantum

Os ces do grupo controle foram utilizados apenas como doadores de sangue para uso

como controle negativo nos ensaios realizados in vitro.

Os animais do grupo teste foram injetados com 100 L de soluo salina tamponada

com fosfato (PBS, NaCl a 137 mM, KCl a 2,68mM, Na2HPO4 a 9,58 mM e NaK2PO4 a

1,47 mM) por via drmica no lado esquerdo do abdmen. Alm disso, cada animal do grupo

teste foi inoculado com 1x108 formas promastigotas de fase estacionria de cultura de

Leishmania, em um volume de 100 L por via drmica no lado direito do abdmen. O

isolamento, caracterizao e obteno do inculo foram descritos no item 3.2.1. As injees

26

foram realizadas usando-se seringas de 1 mL e agulha de 8 x 0,3 mm (BD Pharmingen, San

Jose, EUA).

3.2.4 Acompanhamento clnico dos ces

Os animais foram avaliados clinicamente pela Dra. Julia Liger de Freitas, mdica

veterinria, 1, 3, 6, 9, 12 e 14 meses aps a inoculao de Leishmania. No exame clnico

foram avaliados estado geral, temperatura, pele e mucosas, unhas, linfonodos superficiais,

fgado e bao. (Figura 1)

Alm disso, a pele na regio do abdmen foi examinada em busca de rea de induo

e/ou ulcerao 1, 10, 30, 45, 80 e 90 dias aps a injeo de PBS ou de inoculao de

Leishmania.

3.2.5 Avaliao clnico-patolgica

Para avaliao clnico-patolgica, foram realizadas coletas 6 mL de sangue pela veia

jugular de cada co inoculado com Leishmania, usando-se seringa e agulha, 1 dia antes e 9

meses aps a inoculao. As mostras de sangue foram transferidas para tubos de poliestireno

com ou sem anticoagulante (cido etilenodiamino tetra-actico-EDTA,) (Vacuette, Campinas,

So Paulo, Brasil). As amostras de sangue foram usadas para realizao de hemograma

(eritrograma, leucograma e plaquetograma), dosagem de uria, creatinina, protenas sricas

(totais, albumina e globulinas) e transaminases [transaminase alanina aminotransferase

(ALT), e transaminase aspartato aminotransferase (AST)]. (Figura 1)

27

Figura 1. Acompanhamento de ces inoculados com Leishmania por via drmica quanto a

resposta humoral e celular, produo de IFN-, IL-2, IL-10 e TNF- e carga parasitria

esplnica.Linha do tempo (em meses) representando as atividades realizadas para avaliao e

acompanhamento da gerao do modelo canino potencialmente resistente a leishmaniose visceral

canina. Leishmania infantumfoi isolada de um co naturalmente infectado e inoculada em 6 ces do

canil (dia zero). Foram feitas avaliaes clnicas (0, 1, 3, 6, 9, 12 e 14) bioqumicas, hematolgicas,

avaliao da resposta humoral com dosagem de IgG (0, 3, 6, 9, 12, 14), avaliao de resposta imune

celular com ensaio de proliferao celular frente a antgeno solvel de Leishmania (3 e 18

meses),mensurao de IFN- (3 e 6 meses) por ELISA e das citocinas (IFN-, IL-2, IL-10 e TNF-) no

18 ms com kit Milliplex (Millipore), avaliao da carga parasitria no bao realizada a partir da

extrao de DNA para a posterior anlise de amplificao de DNA de Leishmania por PCR em tempo

real e busca do parasito no material esplnico atravs de cultivo (12 e 21).

3.2.6 Coleta de sangue perifrico

Para a avaliao de anticorpos sricos, foram realizadas coletas de amostras de 6 mL

de sangue um dia antes e 3, 6, 9, 12 e 14 meses aps a inoculao em cada animal do grupo

teste.

Para a avaliao de linfoproliferao e/ou mensurao de citocinas foram realizadas

coletas de amostras de 20 mL de sangue aps a inoculao de Leishmania. As amostras de

sangue foram coletadas 18 meses ou 3, 6 e 18 meses de cada animal do grupo controle e teste,

respectivamente, aps a inoculao de Leishmania. As amostras foram coletadas pela veia

ceflica.

-1 0 1 3 6 9 12 14 21

Inoculao

meses

A: Avaliao clnica: Estado geral, peso, temperatura, aspectos de pele, linfonodos, fgado, bao etc.

B: Avaliao hematgica e bioquimica: Hemograma completo, dosagem de enzimas hepticas, uria, cretinina,

etc.

C: Avaliao da resposta imune humoral: Mensurao de IgG no soro por ELISA

Avaliao da resposta imune celular

D: Linfoproliferao (ensaio com timidina ou ensaio com CFSE e citometria de fluxo utilizando PBMC em

cultura)

E: Mensurao de citocinas (IFN- SN PBMC 48 h por ELISA e IFN-, IL2, IL10 e TNF sangue

total 24 h por Luminex)

F: Avaliao do parasitismo no bao (PCR de puno esplnica e cultura)

A

C

BB F FE EE

D

18

D

28

3.2.7 Obteno de soro

As amostras de sangue coletadas dos ces do grupo teste foram transferidas para tubo

de falcon com capacidade de 15 mL e mantidas 4 C por cerca de 8 horas. Em seguida os

tubos foram centrifugados por 10 minutos a 1.500 x g, temperatura ambiente. O soro de

cada tubo foi coletado e alquotas de soro foram colocadas em tubos Eppendorf de 1,5 mL. Os

tubos foram armazenadas a -20 C at o momento do uso.

Alm disso, alquotas de soro provenientes de dois ces de Pelotas, Rio Grande do Sul

(rea no endmica para LV) (gentilmente cedidas pela Msc Manuela Silva Solc), e de dois

ces oriundos de Jequi, Bahia, apresentando LV, mantidas em nosso laboratrio a -20 oC,

foram usadas como controle negativo e positivo de ensaio, respectivamente.

Os ces provenientes de Pelotas mostravam-se sadios, sem anticorpos anti-Leishmania

em avaliao feita pelo ensaio imunoenzimtico (ELISA), e exibiam resultados negativos de

cultura e PCR em tempo real de material aspirado de bao para deteco de Leishmania. Os

animais oriundos de Jequi apresentavam manifestaes clnicas compatveis com LV,

anticorpos anti-Leishmania avaliados por ELISA e resultados positivos para cultura e PCR em

tempo real de material aspirado do bao para a deteco de Leishmania.

3.2.8 Obteno de clulas mononucleares de sangue perifrico

A obteno de CMNSP foi realizada, essencialmente, conforme mtodo descrito por

Pereira e colaboradores (PEREIRA et al., 2015). Resumidamente, as amostras de sangue

foram diludas de 1:2 em soluo de Hanks (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA)

tamponada com 10 mM de HEPES (Sigma Aldrich), pH 7,0, colocadas sobre Ficoll-paque

(GE Healthcare, Pittsburgh, EUA) e centrifugadas a 450 x g por 30 minutos a temperatura

ambiente. As clulas localizadas na interface entre o plasma e o Ficoll-paque foram coletadas

e lavadas 2 vezes com salina pela centrifugao a 450 x g por 10 minutos a 4 C. Finalmente,

as clulas foram ressuspensas em meio RMPI 1640 com 10% de soro fetal bovino(Gibco BRL

Life Technologies), L-glutamina a 2 mM, (Sigma-Aldrich), e 2-mercaptoetanola 0,01

mM(Sigma-Aldrich) (meio RPMI completo) e ajustadas para a concentrao de 2 x

106CMNSP /mL ou lavadas e ressuspensas em PBS /BSA 0,1% (Sigma-Aldrich).

29

3.2.9. Preparao de antgenos de Leishmania

Antgenos solveis de Leishmania foram obtidos a partir da

cepaMHOM/BR2000/Merivaldo previamente obtida no laboratrio a partir de paciente com

leishmaniose visceral do municpio de Jequi, Bahia (BALEEIRO; PARANHOS-SILVA; C,

2006). A cepa foi utilizada para infectar hamster e posteriormente fragmentos de bao de

hamster foram macerados e armazenados em nitrognio lquido at o momento do uso.

Uma alquota foi descongelada e cultivada em meio de cultura Schneider (Sigma-

Aldrich, Saint Louis, MO, EUA) com pH 7,2 e suplementado com 20 % de soro bovino fetal

inativado (meio Schneider suplementado) a 24 oC por 4 dias. As formas promastigotas

resultantes foram transferidas apartir de 6 passagens em meio Schneider suplementado para

eliminao de debris de tecido esplnico.

Para a obteno das formas amastigotas, formas promastigotas em uma concentrao

de 5x106 parasitos/mL, foram cultivadas a 24 C, por 3-5 dias, at o incio da fase estacionria

e posteriormente foram transferidas para estufa 37C. Aps 13 dias de cultivo, formas

amastigotas foram lavadas 3 vezes em salina, centrifugando-se a 2.500x g, por 10 minutos a 4

oC. Em seguida, os parasitos em suspenso foram submetidos a lise por 5 ciclos de

congelamento em nitrognio lquido e descongelamento a 4 C e seguido por sonicao

(Sonifier 250, Branson Ultrasonics Corporation, Danbury, EUA) para fragmentao com

aplicao de 10 pulsos de 500 watts, com 20 segundos de durao, com intervalos de 1

minuto entre cada dois pulsos consecutivos, mantendo-se o material sob gelo. A eficincia do

processo de lise dos parasitos foi testada visualmente ao microscpio ptico. O lisado foi

dividido em duas partes. Uma parte para ser usada sem modificao adicional (denominada

lisado total) e a outra parte para ser usado somente o sobrenadante obtido aps centrifugao a

3000x g, por 5 minutos a 4 oC (denominado frao solvel). Vrias alquotas da frao solvel

foram congeladas a -70 oC at o momento do uso.

3.2.10 Resposta imune humoral

A deteco de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania nos animais do grupo teste foi

realizada por ELISA usando-se, essencialmente, o mtodo descrito por Baleeiro e

colaboradores (BALEEIRO; PARANHOS-SILVA; C, 2006). Resumidamente, em placas de

microtitulao de 96 poos de fundo chato, os poos foram sensibilizados com antgenos

30

solveis (SLA) de Leishmania infantum na concentrao de 3,125 g/mL (diludos em

tampo carbonato-bicarbonato a 0,06 M, pH 9,6) usando-se 100 L/poo. Os poos das placas

foram lavados com tampo de lavagem (PBS pH 7,2 contendo 0,05% tween 20 (Vetec, Duque

de Caxias, Brasil), bloqueados com tampo de bloqueio (PBS pH 7,2, BSA 4 mg/mL, 0,05%

tween 20) e, depois, lavados novamente com PBS pH 7,2 contendo 0,05% tween 20. As

amostras de soro de cada co do grupo teste, de Jequi e de Pelotas, foram colocadas

duplicadas de poos. As amostras de soro de co, foram diludas de 1:800 em soluo

diluente (PBS pH 7,2, BSA 4 mg/mL, 0,05% tween 20),foram aplicados100 L/poo, por 1

hora. Os poos foram lavados e, depois disso, foram acrescentados anticorpos de coelho anti-

IgG de co conjugados a peroxidase (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, EUA)

diludos a 1:8.000 em soluo diluente, usando-se 100 L/poo. As placas foram incubadas

por 1 hora a temperatura ambiente e, depois disso, os poos foram lavados. O substrato da

peroxidade [TMB (3,3, 5,5-tetrametilbenzidina) a 1 mg/mL em tampo fosfato/citrato

(fosfato de sdio a 0,046 M, citrato de sdio a 0,022 M, pH 5,0) com 10 % de

dimetilsulfxido (DMSO) e 2 L de H2O2 a 30 %(v/v)] foi acrescentado aos poos, 100

L/poo. As placas foram incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente, protegidas da

luz. A reao enzimtica foi interrompida pela adio de 50 L/poo de cido sulfrico a 4 M

(Quimex, So Paulo, Brasil). A densidade ptica foi avaliada a 450 nm em um

espectrofotmetro (SpectraMax 340PC, Molecular Devices, Califrnia, EUA).

3.2.11 Resposta imune celular

A resposta linfoproliferativa frente estimulao com antgenos de Leishmania ou

mitgenos foi avaliada em clulas mononucleares de sangue perifrico (CMNSP) pelo ensaio

de incorporao de timidina triciada ou pelo ensaio de marcao com carboxifluorescena

succimidil ster (CFSE).

O ensaio de linfoproliferao pela incorporao de timidina triciada a CMNSP foi

realizada em placas de microtitulao de 96 poos de fundo chato. Nas placas, 2 x 105

CMNSP de co ressupensas em meio RPMI completo foram colocadas por poo usando-se

um volume de 100L/poo. Em triplicatas de poos com CMNSP de cada co, foram

adicionados 100 L de meio RMPI completo, meio RMPI completo com SLA para alcanar a

concentrao final de 10 L/mL ou concanavalina A (Con A) para alcanar a concentrao

final de 5 L/mL. As placas contendo CMNSP em meio de cultura ou Con A foram incubadas

por 3 dias a 37 C em atmosfera mida com 5% de CO2. As placas contendo CMNSP em

31

meio de cultura ou em meio de cultura com SLA foram incubadas por 5 dias sob as condies

descritas acima. Dezoito horas antes do congelamento das clulas, foram adicionados a cada

poo 30 L de meio RMPI completo contendo 1 Ci de timidina [H]3+ (atividade especfica

2 Ci/mM, Amersham Biosciences,Uppsalla, Sucia). Depois disso, as placas foram

armazenadas a -20 C at o momento da coleta das clulas. As clulas foram coletadas em

uma membrana de fibra de vidro (Packard, Meriden, EUA) usando-se um coletor de clulas.

Finalmente, a radioatividade na membrana foi determinada em um aparelho Matrix 9600

Direct Beta Counter (Packard, Houston, Texas, EUA)

O ensaio de linfoproliferao com CMNSP marcadas com CFSE (Life Technologies)

foi realizado aps colorao das clulas seguindo-se as recomendaes do fabricante.

Resumidamente, 1 x 107

CMNSP de cada co foram ressuspensas em um volume de 2 mL de

PBS com BSA a 0,1 % em um tubo Falcon de 50 ml (BD Falcon, Bedford, EUA) e incubadas

com CFSE a 5 M por 10 min, a 37 C. Cada tubo Falcon foi imerso em gelo picado por 5

min. As clulas de cada tubo foram lavadas 2 vezes com RPMI base gelado, centrifugando-se

a 450 x g por 10 minutos a 20 oC. Depois disso, as clulas foram ressuspensas em meio RPMI

completo e foram colocadas em placas de microtitulao 96 poos de fundo chato. As clulas

foram colocadas a 2 x 105/poo em 100 L/poo. As duplicatas de poos de cada co, foram

acrescentados 100 L de meio RPMI completo ou RPMI completo com SLA para

concentrao final de 1 g/mLou 10 g/mL ou fito-hemaglutinina (PHA) (Sigma-Aldrich)

para a concentrao final de 6 g /mL. As placas foram incubadas por 5 dias a 37 C em

atmosfera mida com 5% de CO2.As clulas de duplicatas de poos foram transferidas para

um tubo de poliestireno de 5 mL com tampa (BD falcon). A cada tubo foram adicionados 2

mL de PBS 1x. Os tubos foram centrifugados a350 x g por10 minutos a 20oC. Os

sobrenadantes foram descartados e as clulas de cada tubo foram ressuspensas com 250 L de

PBS com formaldedo a 1%. Os tubos foram armazenados a 4 oC protegidos da luz por cerca

de 15 h at a aquisio em citmetro. A anlise das clulas de cada tubo foi realizada pela

aquisio 10.000 eventos em um citmetro de fluxo LSR Fortessa (BD Biosciences, New

Jersey, EUA), utilizando-se o software FACS Diva. A anlise dos dados adquiridos foi

realizada usando-se o programa de computador FlowJo verso 7.6.

.

3.2.12 Mensurao de citocinas

A concentrao de interferon gama (IFN-) em sobrenadantes de CMNSP cultivadas

por 48horas e a concentrao de IFN-, IL-10, IL-2 e TNF- em plasmas de sangue total

32

cultivados por 24 horas foram determinadas por ELISA ou por Milliplex (EDM Millipore,

Darmstadt, Alemanha), respectivamente.

O ensaio para a avaliao de IFN- em sobrenadantes de cultura de CMNSP de ces

foi realizado em placas de microtitulao de 96 poos de fundo chato, 2 x 105 CMNSP de

cada co, ressuspensas em meio RPMI completo, foram colocadas em cada 12 poos, em um

volume de 100 L/poo. Em cada quadruplicata de poos com CMNSP de cada co foram

adicionados 100 L de meio RPMI completo ou RPMI completo com SLA para a

concentrao final de10 g/mL ou Con A a 5 g /mL (Sigma-Aldrich). As placas foram

incubadas por 48 horas a 37 C em atmosfera mida com 5% de CO2. Depois disso, o

sobrenadante de CMNSP cada co cultivado em condies idnticas foi coletado em tubo

Eppendorf de 1,5 ml. Os tubos foram centrifugados a400 x g por 10 minutos a temperatura

ambiente e os sobrenadantes resultantes foram transferidos para novos tubos Eppendorf e

armazenados a -20 oC at o momento do uso.

A determinao da concentrao de IFN- por ELISA foi realizada usando-se

anticorpos produzidos pela R&D Systems (Minneapolis, EUA) e seguindo-se as

recomendaes do fabricante. Resumidamente, placas de microtitulao de 96 poos de alta

capacidade de ligao de protenas (Corning Costar, Nova Iorque, EUA) foram sensibilizadas

com anticorpo monoclonal de camundongo anti-IFN- de co a 2 g/mL (MAB 781, R&D

Systems), diludo em PBS, com 100 L/poo. As placas foram incubadas a temperatura

ambiente durante cerca de 14 horas. Os poos foram lavados com tampo de lavagem (PBS

pH 7,4, 0,05% de tween 20). Os poos foram bloqueados com tampo de bloqueio (PBS pH

7,4, 1% de BSA, 5% de sacarose e 0,05% de azida de sdio) por 1 hora a temperatura

ambiente. Os poos foram lavados com soluo de lavagem. As amostras de sobrenadante

foram testadas em duplicata com 100 L/poo. Para a curva padro, foram preparadas

diluies seriadas duplas de IFN- canino (R&D systems) comeando com a concentrao de

8.000 pg/mL e terminando 15,6 pg/mL. Em duplicatas de poos foram colocadas 100 L/poo

de IFN- em cada uma das diluies descritas acima. As placas foram incubadas por 24 horas

a 4 C. Os poos foram lavados com 400L de tampo de lavagem. Em seguida, anticorpos

de cabra anti-IFN- canino conjugado a biotina (BAF781) a200ng/mL foram acrescentados

100 L/poona concentrao de 200ng/mL, diludo em PBS com 2% de soro de cabra

inativado, e as placas foram incubados por 2 horas a temperatura.Os poos foram lavados com

400L de tampo de lavagem. Posteriormente, estreptavidina conjugada a peroxidase (R&D

systems) diluda de 1:200 em tampo diluente (PBS pH 7,4, 1% de BSA), foi acrescentada

100 L/poo. As placas foram incubadas por 20 minutos a temperatura ambiente. Finalmente,

33

o substrato da peroxidase (TMB) em tampo fosfato-citrato (previamente descrito) foi

adicionado aos poos a 100 L/poo. A reao enzimtica foi interrompida pela adio de

50 L/poo de cido sulfrico a 1 M (Quimex, So Paulo, Brasil). A densidade ptica

avaliada a 450 nm em um espectrofotmetro (SpectraMax 340PC, Molecular Devices).A

concentrao de IFN- canino foi estimada pela comparao da mdia dos valores de DO das

duplicatas de cada amostra com a curva de calibrao, usando o programa GraphPad Prism

v.5.0 software (San Diego, EUA) e expressas em pg/mL.

O ensaio para a avalio de IFN-, IL-10, IL-2 e TNF-em plasma de sangue total

(ensaio do quantiFERON modificado) foi realizado em tubo Eppendorf de 2 mL. Amostras de

1 mL de sangue heparinizado de 5 ces do grupo teste e de 3 ces do grupo controle foram

colocadas em 6 tubos cada. Os tubos com amostras de sangue receberam 10 L de PBS, SLA

a 5, 10 ou 25 mg/mL. Alm disso, amostras de 1 mL de sangue heparinizado diludo de 1:2 ou

1:4 em RPMI completo dos 8 animais mencionados acima, foram colocadas em tubos de 2

mL contendo 10 L de Con A a 5 g/mL. Os tubos foram incubados a 37 oC por 24 horas.

Posteriormente, os tubos foram centrifugados a 2.000 x g por 10 minutos a 4C e o plasma foi

coletado e armazenado em quadruplicatas a -20 C at o momento do uso.

Para a mensurao das citocinasIFN-, IL-10, IL-2 e TNF-, os plasmas foram

descongelados e utilizadoscom o Kit Milliplex (Millipore, Darmstadt, Alemanha), seguindo-

se as recomendaes do fabricante. Resumidamente, placas de 96 poos foram sensibilizadas

com 25 L da mistura de anticorpos imobilizados em esferas magnticas. Posteriormente

foram acrescentadas 25 L da curva padro de citocinas caninas (IFN-, IL-10, IL-2 e TNF-)

em diluio seriada (de 10.000 a 2,44 pg/ mL para IFN- e de 50.000 a 12,2 pg/ mL para as

demais citocinas) em duplicata. Alm disso, tambm foram acrescentadas 25 L dos

plasmasobtidos e descongelados previamente. As placas foram incubadas a 4C, por

aproximadamente 15 h.

Os poos foram lavados com 200 L de tampo de lavagem 1x (diludo em gua

deionizada), posteriormente foram acrescentados 25 L de anticorpo de deteco e a placa foi

incubada sob agitao durante 1h em agitador de placas digital (IKA MS3, Staufen,

Alemanha). Em seguida, 25 L de Estreptavidina Ficoeritrina foram incubadas s placas por

30 minutos, posteriormente lavadas com 200 L de tampo de lavagem e acrescentadas 150

L de tampo de ensaio. A intensidade de florescncia mdia e a quantidade de cada citocina

em pg/mL foi lida em aparelho LUMINEX 200 (Milliplex Analyzer Millippore) com auxlio

de um programa computacional software Xponent 3.1. Os ensaios foram realizados na

34

Plataforma Luminex situada no Laboratrio de Imunofarmacologia do Instituto Oswaldo

Cruz/ RJ.

3.2.13 Avaliao da carga parasitria por PCR em tempo real e cultura

A determinao da carga parasitria por grama de tecido foi realizada por PCR em

tempo real em amostras de aspirado de bao coletadas 12 e 21 meses aps a inoculao de

Leishmania. Os ces foram submetidos puno esplnica, usando-se mtodo descrito

previamente (BARROUIN-MELO et al., 2004). O material aspirado do bao dos animais foi

pesado e submetido a extrao de DNA e reao de PCR em tempo real para deteco de

DNA de Leishmania.

A partir de amostras de aspirado esplnico obtidas aps a inoculao, o DNA das

amostras foi extrado com DNAeasy Blood & Tissue kit (Qiagen, Hilden, Alemanha),

seguindo as recomendaes do fabricante, e a concentrao foi determinada em um

espectrofotmetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, EUA). As

amostras de tecido foram digeridas com proteinase K overnight (Mary et al., 2004).

O ensaio de PCR em tempo real foi realizado, essencialmente, de acordo com o

mtodo descrito por Francino e colaboradores (FRANCINO et al., 2006). Resumidamente,

triplicatas de 25 l de reaes foram realizadas com 150 ng de DNA da amostra, primers

LEISH-1(5'-AACTTTTCTGGTCCTCCGGGTAG-3') e LEISH-2 (5'-

ACCCCCAGTTTCCCGCC-3') e uma sonda FAM-MGB (FAM-5'-

AAAAATGGGTGCAGAAAT-3'-MGB) de seqncia conservada de mini crculo de DNA

de Leishmania ou iniciadores especficos e sonda para a deteco de gene 18S rDNA

mamferos (controlo negativo, Applied Biosystems, Carlsbad, EUA), 0,2 mg / L de

albumina de soro bovino, e TaqMan mix master (Applied Biosystems). Para a preparao de

uma curva de calibrao, foram utilizadas quantidades de 0,1-105 de DNA de promastigotas

de Leishmania. As reaes foram realizadas e lidas num sistema de PCR em tempo real fast

7500 (Applied Biosystems, Foster City, EUA). A carga parasitria foi expressa por nmero de

Leishmanias por 100 mg de DNA)

A partir de amostras de aspirado esplnico obtidas 12 e 21 meses aps a inoculao de

Leishmania nos ces, culturas foram mantidas a 23 C e examinadas semanalmente sob

35

microscpio ptico por um ms. A presena de formas promastigotas vivas e ativas foram

consideradas como resultado positivo.

3.2.14Anlise estatstica

Os grficos e a maioria das anlises foram realizados a partir do software GraphPad

Prism v.5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). A proliferao celular foi avaliada de

modo qualitativo, comparando a mdia de proliferao celular dos dois grupos (teste e

controle) frente estimulao com o antgeno solvel de Leishmania infantum.

A produo de anticorpos da classe IgG e a produo das citocinas foram avaliadas

atravs do Teste No-Paramtrico de Friedman seguido de ps teste de Dunn para

comparao adicional entre cada dois grupos. Os valores estabelecidos para a significncia

estatstica foram definidos como: * p

36

3.3 RESULTADOS

3.3.1 Isolamento, caracterizao e preparao do inculo de Leishmania para injeo

intradrmica em ces

Uma cepa de Leishmania foi isolada de um co de Camaari, Bahia, com sinais

clnicos compatveis com LV (perda de peso, linfadenopatia, onicogrifose e

ceratoconjuntivite), resultado de ensaio imunocromatogrfico DPP positivo e apresentando

formas amastigotas dentro de macrfagos em esfregao de material esplnico e colorao pelo

mtodo de Wright (Figura 2). O isolamento da Leishmania foi realizado aps a eutansia do

animal e cultura de macerado de tecido do bao em meio bifsico gar sangue-Schneider com

20 % SBF.

Figura 2 Esfregao de material aspirado de bao de co de rea endmica submetido a colorao pelo

mtodo de Wright. Esfregao foi realizado a partir da puno esplnicade um co de rea endmica para

leishmaniose visceral canina. O esfregao de puno esplnica foi realizado em lminas de vidro que foram

posteriormente coradas pelo mtodo Wright e analisadas em microscpio ptico com objetiva de 100x. Foram

observadas formas amastigotas de Leishmania em macrfagos.

Oito a nove dias aps a inoculao de macerado de tecido esplnico em meio gar

sangue-Schneider, foram observadas formas promastigotas de Leishmania na cultura. Depois

da primeira, as passagens subsequentes foram realizadas em meio Schneider com 20 %

SBF.Uma amostra da cultura foi utilizada para identificao taxonmica como Leishmania

infantum (cepa CAM/BR2013/CAO01) atravs do mtodo de eletroforese de enzimas pelo

servio do Laboratrio de Referncia Nacional para Tipagem de Leishmaniada Coleo de

Leishmanias do Instituto Oswaldo Cruz CLIOC.

37

Para determinar a curva de proliferao e identificar a fase estacionria de crescimento

da cepa isolada, foi avaliada a concentrao de Leishmania em amostras do primeiro ao

stimo dia de cultura da segunda passagem. Pela curva de proliferao, observou-se que no

quinto e sexto dia que o parasito havia alcanado a fase estacionria de crescimento. (Figura

3)

Figura 3. Curva de proliferao de Leishmania isolada do co de rea endmica.As culturas foram iniciadas

com 1x105/mL em meio Schneider contendo 20% de SBF e foram acompanhadas por 7 dias at final da fase

estacionria. As Leishmanias foram cultivadas em quadruplicatas. Os cultivos so representados nas curvas em

verde, laranja, azul escuro e preto. De acordo com as curvas de crescimento, a cepa recm isolada

CAM/BR2013/CAO01alcanou a fase estacionria no 5 dia de cultivo.

Formas promastigotas de Leishmania da cepa CAM/BR2013/CAO01 na fase

estacionria de crescimento, obtidas aps cinco dias da terceira passagem de cultura, foram

lavadas e ressuspensas em PBS e ajustada em concentrao 1 x 109/mL, e 100 L foram

usadas para a inoculao intradrmica em ces.

3.3.2 Avaliao clnica de ces inoculados com Leishmania infantum por via drmica

Seis animais do grupo teste foram injetados com 100 L de PBS com 1x10

8 formas

promastigotas de fase estacionria de cultura de Leishmania, por via drmica no lado direito

do abdmen.

Avaliao clnica dos animais consistiu na avaliao no local a inoculao. A pele do

abdmen do animal foi analisada em busca de rea de indurao e/ou ulcerao 1, 10, 30, 45,

Tempo (dias)

0 1 2 3 4 5 6 7 80

1000

2000

3000

Pro

masti

go

tas X

10

5/m

L

38

80 e 90 dias aps a inoculao de Leishmania. As dimenses mdias das leses dos ces

foram registradas em diferentes tempos. As mdias de todos os 6 ces nos diferentes tempos

foram: 0 (tempo 1), 0,47 (tempo 10), 1,08 (tempo 30), 1,06 (tempo 45), 0,59 (tempo 80) e 0

(tempo 90) conforme demosntrado na figura 4.

Na avaliao clnica sistmica foram avaliados o estado geral, a temperatura, pele e

mucosas, unhas, linfonodos superficiais, fgado e bao. Alm da presena, a severidade dos

sinais clnicos tambm foram analisados. No houve qualquer alterao sistmica ou

manifestao clnica caracterstica para leishmaniose visceral canina ao longo dos dois anos

de acompanhamento, exceto pela endurao cutnea causada provavelmente por inflamao

drmica no local da inoculao.

Figura 4: Leso cutnea no local da inoculao experimental da Leishmania em

ces.Ces foram inoculados com 1 108Leishmania por via intradrmica no lado direito e

com PBS do lado esquerdo do abdmen. (A) A mdia das medidas da leso foi registrada nos

tempo 0, 10, 30, 45, 80 e 90. Os pontos significam amdia das medidas da rea de endurao

(cm) obtida por animal. As curvas representam a evoluo das medidas das ulceras por cada

PBS L. infantum PBS L. infantum PBS L. infantum

C

o 0

4

C

o 0

1

C

o 0

5

C

o 0

2

C

o 0

6

Co

03

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

1

2

3

Dim

en

so

md

ia d

a

en

du

rao

(cm

)

Tempo (dias)

A

B

39

animal. (B) Imagens representativas do 30 dia de acompanhamento aps a inoculao da

Leishmania: presena da endurao nos seis animais e formao de ulcera rasa em trs

animais.

3.3.3 Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania infantum por

via drmica

Para avaliao clnico-patolgica, amostras de sangue foram usadas para realizao de

hemograma (eritrograma, leucograma e plaquetograma), dosagem de uria, creatinina,

protenas sricas (totais, albumina e globulinas) e transaminases [transaminase alanina

aminotransferase (ALT), e transaminase aspartato aminotransferase (AST)].

O ensaio de eritrograma consitiu em diversos exames como: contagem de hemcia

hemoglobina, hematcrito, volume corpuscular mdio (VCM), hemoglobina corpuscular

mdia (HCM), concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM) e RDW. Nove

meses aps a inoculao, as mdias dos valores dos animais e o valor de referncia para cada

paramtro foram: contagem de hemcia: 7,3 (valor de referncia: 5,5 - 8,5milhes/mm),

hemoglobina: 15,9 (valor de referncia: 12,0 - 18,0 g/dL), hematcrito: 48,5 (valor de

referncia: 37,0 - 55,0 %), VCM: 66,7 (valor de referncia: 60,0 - 77,0 fL), HCM: 21,9 (valor

de referncia: 19,0 - 23,0 pg), CHCM: (valor de referncia:32,0 - 36,0 g/dL), RDW: 16,4,

(valor de referncia:14,0 - 17,0 %).

O ensaio de leucograma consitiu em leuccitos, neutrfilos segmentados, neutrfilos

bastonetes, linfcito, moncito, eosinfilo. Nove meses aps a inoculao, as mdias dos

valores dos animais foram: contagem de leuccitos: 7.200 (valor de referncia: 6.000-17.000),

neutrfilos segmentados: 4.396(valor de referncia: 3.500 - 11.500), neutrfilos

bastonetes:279,8(valor de referncia: 0 300), linfcito:2.055(valor de referncia: 1.000 -

4.800), moncito: 72 (valor de referncia: 150 - 1.350), eosinfilo:375,7(valor de

referncia:100 - 1.250).

O ensaio de plaquetograma consitiu em contagem de plaquetas: 231.500 (valor de

referncia: 175.000 - 500.00) e PPT: 6,7 (valor de referncia:6,0 - 8,0)

No ensaio bioqumica srica, nove meses aps a inoculao foram realizadas dosagem

de ALT: 85,8 (valor de referncia:21 -102 UI/L), fosfatase alcalina: 28,6 (valor de

referncia:20 - 156UI/L), protena total: 6,1 (valor de referncia:5,4 - 7,1g/dl), albumina:

2,7(valor de referncia:2,6 - 3,3g/dl), globulina: 3,4(valor de referncia:2,7 - 4,4g/dl), uria:

55,1(valor de referncia:21,0 - 60,0mg/dl) e creatinina 1,1(valor de referncia:0,5 - 1,5mg/dl)

Para a maioria dos parmetros testados, no houve qualquer alterao em relao aos

valores de referncia, no entanto para contagem de hemcias, dosagem de uria e creatinina,

40

dois ces apresentaram valores pouco acima dos valores de referncia e para a dosagem de

albumina, um co apresentou valor pouco abaixo do valor de referncia (Figura 5).

Figura 5:Avaliao clnico-patolgica de ces inoculados com Leishmania por via drmica. Cerca

de 6mL de sangue foram coletados em momentos distintos e submetidos a anlise laboratorial.

Diversas anlises foram realizadas como: Hemcias, Hemoglobina, VCM, HCM, CHCM, RDW,

Leuccitos, Neutrfilos segmentados, Neutrfilos bastonetes, Metamielcitos, Linfcitos, Moncitos,

Eosinfilos, Plaquetas, ALT (TGP), Fosfatase Alcalina, Protenas Totais, Albumina, Globulinas,

Uria, Creatinina. Apenas algumas das anlises esto sendo mostradas nos grficos acima

demonstrando que no houve alterao excessiva em relao aos valores de referncia (representados

nas barras horizontais). Barras vermelhas: valores mnimos e mximos de referncia, barra preta:

mdia e desvio padro.

globulinas

2

3

4

5

6

g/d

l

uria

0

20

40

60

80

mg

/dl

creatinina

0 90.5

1.0

1.5

2.0

mg

/dl

Hemcias

5

6

7

8

9

10

milh

es /

mm

3

Hemoglobina

12

14

16

18

20

g/d

l

albumina

2.2

2.4

2.6

2.8

3.0

3.2

3.4

g/d

l

linfcitos

0

1000

2000

3000

4000

/mm

3

plaquetas

0 9

200000

300000

400000

500000

/mm

3

Tempo (meses) Tempo (meses)

41

3.3.4 Produo de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania

infantum por via drmica

Para a produo de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania

infantum por via drmica, soros dos animais foram coletados antes da inoculao e 3, 5, 9, 12

e 14 meses aps a inoculao. A deteco de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania nos

animais do grupo teste foi realizada por ensaio imunoenzimtico indireto (ELISA) usando-se,

essencialmente, o mtodo descrito por Baleeiro e colaboradores(BALEEIRO; PARANHOS-

SILVA; C, 2006). Alm dos soros de ces do grupo teste, foram utilizados tambm soros de

ces de rea endmica (Jequi, Bahia) e soros de ces de rea no endmica para leishmaniose

visceral (Pelotas, Rio Grande do Sul).

O grupo de seis ces inoculados com Leishmania exibiu baixos valores de densidade

ptica (DO) em ELISA para mensurao de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania:

tempo (X SD): antes da inoculao (0,19 0,02), 3 meses (0,57 0,28), 5 meses (0,36

0,15), 9 meses (0,53 0,10), 12 meses (0,50 0,11) e 14 meses (0,45 0,13) (Figura 6)

Os nveis de anticorpos da classe IgG anti-Leishmania antes da inoculao

apresentavam-se baixos e aumentaram no terceiro ms aps infeco experimental por

Leishmania infantum principalmente para o co 06que atingiu o nvel mximo de DO aps a

inoculao (1,1). Nos demais meses de acompanhamento, os nveis de anticorpos foram

baixos e oscilantes e mantidos at o 14 ms aps a inoculao com valores mnimos de 0,2 e

mximo de 0,7 conforme figura 6.

A produo de anticorpos em cada ms foi avaliada atravs do Teste No-Paramtrico

de Friedman seguido do Ps-teste de Dunn para comparao adicional entre cada ms em

relao ao tempo zero. A Produo de anticorpos foi estatisticamente significante aos 3 meses

(* p

42

Figura 6 Avaliao de anticorpos especficos em ces inoculados com Leishmania por via

drmica. Sangue perifrico de ces experimentalmente infectados com Leishmania infantum foi

coletado nos tempos 0, 3, 6, 9, 12 e 14 meses ps infeco e o s