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Carolina Pessanha Loque
Fungos algícolas associados à macroalgas do litoral do Paraná e Península Antártica
Ouro Preto, MG
2009
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Universidade Federal de Ouro Preto
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas
Pós-Graduação em Ecologia de Biomas Tropicais
Fungos algícolas associados à macroalgas do litoral do Paraná e Península Antártica
Candidata: Carolina Pessanha Loque
Orientador: Dr. Luiz Henrique Rosa
Co-orientador: Dr. Carlos Augusto Rosa
Departamento de Microbiologia/ICB/UFMG
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Ecologia de Biomas Tropicais da Universidade Federal de
Ouro Preto como requisito parcial a obtenção do grau de
Mestre em Ecologia em Ciências Biológicas.
Ouro Preto, MG
2009
DEDICATÓRIA
A minha irmã Paula e ao meu sobrinho Rafael, exemplos de força e muita coragem.
Por mudarem minha vida com amor! Desistir jamais, foco sempre!
AGRADECIMENTOS
À Deus sempre! Presença onipotente em minha vida iluminando meus caminhos e
abrindo portas, mesmo que pareçam fechadas ao primeiro momento.
Ao Prof. Luiz Rosa, por aceitar-me como sua orientanda, desenvolvendo uma nova linha
de pesquisa para o laboratório. Seus ensinamentos ultrapassam o ambiente de trabalho,
sua dedicação a ciência o faz um grande e bom exemplo.
Ao Prof. Carlos Rosa, pela orientação e profissionalismo. Elucidando-me e norteando-me
a agir sensatamente nos momentos mais difíceis.
À Grande Família: meus pais, Catarina e Hélio, pelo amor, apoio e ajuda em tudo que
precisei; meus irmãos, Fernanda, Paula, Carla e Bruno; cunhados e cunhada; meus lindos
sobrinhos Rafael e Victor; aos meus avôs. As coisas ficam mais leves com voces por
perto. E ao Sonilton, que de onde ele estiver estará mergulhando e sorrindo para nós.
Ao meu ´Armor`, suas palavras “calma, vai dar tudo certo” sempre me acalmaram e me
deram mais força.
As colaboradoras, Adriana Medeiros pelo aprendizado, orientação, amizade e alegria de
viver. E Franciane Pellizzari pelos momentos prazerosos nas coletas no Paraná.
À turma mais doida e animada de mestrado que conheci. Camilix, Royal, Jane, Zé
Colméia, Fravinho, Chico, Léo, Defunto, Terror, Canuto, Másio e Alexandre. Hilários
momentos no nosso “Big Brother Selvagem” no Parque Itacolomi, 1ª edição.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Microbiologia, convivência é tudo. Iara, Laura,
Jorge, Fernanda, Marcos Palitinho, Izabel, Débora, Douglas, Léo, Camila, Francisco,
Everton, Bruno e as professoras Silvana, Gabriela e Maria Célia.
Aos técnicos Marly e Luis o meu muito obrigado pela disponibilidade e boa vontade de
ambos.
Aos amigos do laboratório de Ecologia e Biotecnologia de Leveduras, da UFMG, pela
grande ajuda profissional e pessoal. Alguns já se foram e outros apenas chegando. Aline,
Bárbara, Alexandras, Anne Caroline, Camila, César, Elisa, Fátima, Fatinha, Fernanda
Badotti, Fernanda Piló, Luciana Berta, Luciana Brandão, Mariana Ferreira, Mariana
Vieira, Michelle, Mônica, Natália, Pollyanna, Priscila, Raquel, Renata, Silvana e Vivian.
Um agradecimento muito especial a Mariana Vieira, Aline, Luciana Brandão, Silvana,
Mônica e Vivian pela paciência que tiveram de me ensinar.
Aos meninos e suas ajudantes, do Curso de Dossel. Pela oportunidade de ver o mundo
sobre uma árvore de 23 metros.
Ao Rubens Modesto, sua eficiência ímpar só tem a acrescentar ao BIOMAS.
Aos profs. e colaboradores do curso de pós-graduação Ecologia de Biomas Tropicais,
especialmente prof. Sérvio Pontes.
Ao Dr. Carlos Zani, pela gentileza por utilizar a infra-estrutura e os equipamentos do
Laboratório de Química de Produtos Naturais (LQPN). Aos colegas do LQPN Tânia,
Daniela, Patrícia, Luciana, Fernanda, Suzana, Marcinha e Ezequias. Pessoas agradáveis
de conviver.
A Equipe da Escola de Mergulho Mar A Mar: Paula, Dani, Nair, Carlos, Célio, André,
Sandra e todos os instrutores, por cederem gentilmente os equipamentos de mergulho. O
apoio de voces foi de suma importância.
Ao meu padrinho, Tio Dundun, e minha madrinha, Tia Marthinha, por se preocuparem e
interessarem.
As amigas Paulinha, Thê e Lud por entenderem tamanha ausência nos encontros das
amigas.
Ao prof. Pio Colepicole Neto, um reencontro no final com uma ajuda valiosa. Quem sabe
um doutoramento?
COLABORADORES
1Profa. Dra. Franciane Pellizari 2Profa. Dra. Adriana Oliveira Morais 3Prof. Dr. Eurico Cabral de Oliveira 4Bióloga Laura Esteves Furbino
1Laboratório de Ficologia e Qualidade de Água do Mar (LAQUAMAR), Universidade
Estadual do Paraná, campus FAFIPAR. Paranaguá, Paraná.
2Laboratório de Microbiologia Ambiental, Departamento de Botânica, Universidade
Federal da Bahia, Salvador, BA.
3Laboratório de Ficologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São
Paulo, SP.
4Laboratório de Microbiologia, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG, Brasil.
SUMÁRIO
Agradecimentos .......................................................................................................................... i
Sumário ..................................................................................................................................... iii
Lista de figuras .......................................................................................................................... iv
Lista de tabelas ............................................................................................................................v
Resumo .....................................................................................................................................11
Abstract .....................................................................................................................................12
Lista de abreviaturas .................................................................................................................13
1. Introdução .............................................................................................................................15
2. Revisão bibliográfica ............................................................................................................17
2.1 Biodiversidade de fungos marinhos ................................................................................17
2.2 Diversidade de macroalgas .............................................................................................18
2.3 Fungos algícolas ..............................................................................................................21
3. Objetivos ...............................................................................................................................23
3.1 Geral ................................................................................................................................23
3.1.2 Específicos ................................................................................................................23
4. Material e Métodos ...............................................................................................................24
4.1 Área de coleta .................................................................................................................24
4.1.1 Litoral do Paraná ......................................................................................................24
4.1.2 Baía do Almirantado – Antártica ............................................................................26
4.2 Coleta de macroalgas .....................................................................................................27
4.2.1 Litoral do Paraná .......................................................................................................28
4.2.2 Baía do Almirantado – Antártica .............................................................................29
4.3 Isolamento dos fungos ...................................................................................................31
4.4 Identificação dos fungos filamentosos ............................................................................31
4.4.1 Extração do DNA total .............................................................................................31
4.4.2. Obtenção de amplicons ............................................................................................32
4.5 Identificação das leveduras ............................................................................................33
4.5.1 Extração do DNA total .............................................................................................33
4.5.2 PCR com o iniciador M13 ........................................................................................34
4.5.3 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4 .................................................34
4.6 Purificação dos amplicons ............................................................................................. 35
4.7 Reação de sequenciamento dos fungos .......................................................................... 36
4.8 Preciptação de reação de sequenciamento ......................................................................36
4.9 Análise das sequencias ................................................................................................... 37
5. Resultados e discussão ..........................................................................................................38
5.1 Testes preliminares para isolamentos de fungos associados à macroalgas ....................39
5.2 Artigo submetido ............................................................................................................41
5.3 Fungos associados às macroalgas do litoral do Paraná ...................................................59
6. Conclusão integrada ..............................................................................................................66
7. Perspectivas ...........................................................................................................................67
8. Anexos ..................................................................................................................................68
9. Referências bibliográficas ....................................................................................................71
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Pontos de coleta das macroalgas no Estado do Paraná. O símbolo (∆) mostra os
locais onde foram coletas as espécies de macroalgas. Fonte: Google Earth,
(http://earth.google.com, acessado em setembro de 2008) ......................................25
Figura 2. Mapa da Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Antártica. O símbolo (∆)
mostra o local onde foram coletas as espécies de macroalgas (Simões et al.,
2004, com modificações). ........................................................................................27
Figura 3. Espécimes das macroalgas: (a) Monostroma sp., (b) Padina gymnospora
(Kutzing) Sonder., (c) Gayralia oxysperma (Kützing) Vinogradova ex Scagel
et al., (d) Caloglossa leprieurii (Montagne) G. Martens e (e) Bostrychia
radicans (Montagne) Montagne coletadas no litoral do estado do Paraná, Brasil ...29
Figura 4. Espécimes das macroalgas: (a) Adenocystis utricularis (Bory) Skottsberg, (b)
Desmarestia anceps Mont., (c) Palmaria decipiens (Reinsch) Ricker coletadas
na Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Antártica ...............................................30
Figura 5. Exemplos de isolados de fungos filamentosos obtidos das espécies de
macroalgas coletadas no litoral do estado do Paraná ..................................................65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Nível de endemismo dos táxons de macroalgas da Antártica ...................................21
Tabela 2. Número de isolados de fungos obtidos das espécies de macroalgas coletadas no
litoral do estado do Paraná. ......................................................................................62
Tabela 3. Identificação das leveduras associadas às macroalgas coletadas no litoral do
estado do Paraná. ......................................................................................................63
RESUMO
Estudos de fungos associados à macroalgas marinhas são escassos no litoral brasileiro e
Antártico. O estudo destes fungos é de grande importância devido à possibilidade da
descoberta de novas espécies e suas relações ecológicas com as macroalgas hospedeiras.
Neste trabalho foi avaliada a riqueza de espécies de fungos associados à macroalgas
presentes no litoral do estado do Paraná, Brasil e na Baía do Almirantado, Ilha Rei
George, Antártica. Para isolamento dos fungos algícolas associados foram coletadas no
litoral do Paraná as macroalgas Bostrychia radicans, Caloglossa leprieurii, Gayralia
oxysperma, Monostroma sp. e Padina gymnospora; na Antártica Adenocystis utricularis,
Desmarestia anceps e Palmaria decipiens. No total foram obtidos 454 isolados de fungos
associados às macroalgas estudadas. Destes, 379 foram obtidos das amostras do litoral do
Paraná, representados por 301 fungos filamentosos e 78 leveduras. Associados as
macroalgas da Antártica foram obtidos 75 isolados, representados por 27 fungos
filamentosos e 48 leveduras. Os isolados algícolas obtidos foram agrupados em
morfoespécies a partir de suas características fisiológicas, morfológicas ou pelo
polimorfismo genético utilizando técnicas de biologia molecular. Um representante de
cada morfoespécie foi identificado por meio de sequenciamento de regiões ITS e dos
domínios D1/D2 do rRNA gene para os fungos filamentosos e leveduras,
respectivamente. Nas macroalgas do litoral do Paraná foram identificadas as espécies de
leveduras dos gêneros Candida, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Geotrichum,
Hanseniaspora, Hortaea, Pichia, Rhodotorula e Trichosporon. Nas macroalgas da
Antártica foram identificados os fungos pertencentes aos gêneros Geomyces,
Antarctomyces, Oidiodendron, Penicillium, Phaeosphaeria, Metschnikowia, Rhodotorula
e Cryptococcus. Os resultados deste trabalho representam o primeiro estudo de fungos
associados à macroalgas dos litorais do Paraná e da Antártica e contribui para o
conhecimento taxonômico e ecológico de fungos marinhos presentes em ambientes
polares e no litoral sul do Brasil.
ABSTRACT
There are no extensive studies concerning fungi associated with seaweeds in Brazilian
and Antarctic littoral. These studies are relevant because of the possibility of discovering
novel fungal species and their ecological relationship with seaweeds hosts. This study
evaluated the richness of fungi species associated with seaweeds at the coast of Paraná
state, Brazil, and at Admiralty Bay, at King George Island, Antarctica. In order to isolate
algicolous fungi, the seaweeds Bostrychia radicans, Caloglossa leprieurii, Gayralia
oxysperma, Monastrama sp., and Padina gymnospora were collected at Paraná coast; and
Adenocystis utricularis, Desmarestia anceps and Palmaria decipiens at Antarctic littoral.
A total of 454 fungi isolates associated with the selected seaweeds were obtained, being
379 from Paraná samples (301 filamentous fungi and 78 yeasts) and 75 from the
Antarctic ones (27 filamentous fungi and 48 yeasts). The algicolous isolates were
grouped in morphospecies according to their macroscopic and physiological
characteristics, or by genetic polimorfism using molecular biology techniques. One
isolate of each group was then selected to molecular identification by sequencing the ITS
region and D1/D2 domains of rRNA gene, for filamentous fungi and yeasts, respectively.
The taxa Candida, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Geotrichum, Hanseniaspora,
Hortaea, Pichia, Rhodotorula, and Trichosporon were found associated with seaweeds
from Paraná; and Geomyces, Antarctomyces, Oidiodendron, Penicillium, Phaeosphaeria,
Metschnikowia, Rhodotorula, and Cryptococcus associated with Antarctic seaweeds. This
is the first study regarding fungi associated with seaweeds from Paraná and Antarctic
littoral, and our results contribute to the taxonomic and ecological knowledge about
marine fungi from Brazilian and polar ecosystems.
LISTA DE ABREVEATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ANS: Ágar nutriente “standard”
AMM: Água artificial do mar
BDA: Ágar dextrose batata
BLAST: Basic Local Alignment Serch Tool
CTAB: Brometo de cetil trimetilamonio
DNA: Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
EACF: Estação Antártica Brasileira Comandante Ferraz
g: Gramas
g/L: Gramas por litros
GPY: Ágar glicose-peptona e extrato de levedura
h: Hora
H2O: Água
H3BO3: Ácido bórico
HCl: Ácido clorídrico
ITS: Região transcrita interna
K: Potássio
KBr: Brometo de potássio
KCl: Cloreto de potássio
KH²PO4: Monopotássio fosfatase
LBEM: Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular
M: Molar
MgCl2: Cloreto de magnésio
MgSO4: Sulfato de magnésio
min: Minuto
mL: Mililitro
mm: Milímetro
mM: Milimolar
mol/L: Mol por litro
µL: Microlitro
NaCl: Cloreto de sódio
Na2SO4: Sulfato de sódio
NaHCO3: Bicarbonato
NCBI: National Center For Biothecnology
ND: NanoDrop
ng: Nanograma
nm: Nanômetro
PEG: Polietilenoglicol
PCR: Reação em cadeia da polimerase
pH: Potencial hidrogeniônico
p/v: Peso por volume
pmol: Pico mol
RNA: Ácido ribonucléico
r.p.m.: Rotações por minuto
S: Sul
SDS: Dodecil sulfato de sódio
SrCl2: Cloreto de estrôncio
TBE: Tris borato
Tris: trishidroximetilaminometano
U: Unidade
ups: Unidade prática de salina
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais
UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto
V: Volts
W: oeste
X: Vezes
- : Negativo
%: Por cento
° C: Graus Celsius
1. INTRODUÇÃO
Os ecossistemas marinhos compreendem aproximadamente ¾ da superfície da
terra e são considerados fontes de elevada riqueza microbiana (Konig & Wright, 1999). A
microbiota marinha pode ser encontrada na coluna d’água, crescendo em superfícies
como epibiôntes, internamente em diferentes seres vivos como endobiôntes ou simbiontes
de vida livre exercendo um importante papel nos ciclos biogeoquímicos nos oceanos
(Hawksworth, 1991). Fungos presentes nos ecossistemas marinhos são encontrados
associados a diferentes organismos macroscópicos tais como: poríferos, peixes, cnidários,
tunicados e macroalgas. Entretanto este grupo microbiano ainda é relativamente pouco
estudado quanto a suas funções ecológicas, origem evolutiva e como fontes de
metabólitos úteis à medicina, agricultura e indústria (Osterhage et al., 2002; Klemke et
al., 2004). Fungos marinhos são separados em espécies obrigatórias ou facultativas, as
primeiras restritas ao ambiente marinho e as segundas também ocorrendo em ambientes
continentais (Kohlmeyer, 1974).
As macroalgas são organismos bênticos efêmeros ou perenes, as quais
permanecem quase todo o seu ciclo de vida fixas a um substrato sólido, consolidado ou
não, principalmente em rochas ou corais mortos. Desta forma, as áreas com maior
riqueza de espécies de macroalgas são os costões e fundos rochosos e áreas de recifes.
Algumas espécies estão adaptadas para resistir longos períodos de emersão e se tornam
conspícuas nos períodos de marés baixas, formando bandas distintas de diferente
composição florística. Outras macroalgas, por sua vez, não suportam exposição ao ar e
vivem permanentemente submersas, algumas atingindo profundidades superiores a 100
metros em regiões onde a água tem grande transparência
(http://www.ib.usp.br/algaemaris/Algaemaris.php).
Os fungos algícolas são caracterizados por viverem em associação com espécies
de macroalgas marinhas e apresentam grande importância por participarem de forma
efetiva na ciclagem de matéria orgânica nos oceanos. A maioria dos fungos marinhos
associados à macroalgas pertence ao filo Ascomycota e seus anamorfos e vivem de
forma assintomática nestes organismos. O pouco conhecimento da diversidade exibida
por estes fungos os torna organismos especialmente interessantes como fontes de
diversidade biológica, funções ecológicas e origem evolutiva. Os estudos sobre fungos
associados à macroalgas são inéditos no Atlântico Sul e Península Antártica, os quais
acarretam lacunas nas áreas da taxonomia, diversidade, ecologia, fisiologia e
biotecnologia. Muitas espécies de macroalgas do Atlântico Sul e Antártica são
endêmicas ou adaptadas a estas regiões e podem constituir uma fonte atrativa de novas
espécies de fungos para ciência. A abordagem taxonômica e ecológica dos fungos
associados às macroalgas, ou seja, suas inter-relações bióticas são relevantes por definir
os limites de desenvolvimento dos organismos. Por esta razão, um estudo comparativo
sobre riqueza de espécies entre estas populações do Atlântico Sul e Antártica pode
fornecer informações no nível taxonômico, distribuição biogeográfica, especiação e uso
biotecnológico destes microrganismos.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Biodiversidade de fungos marinhos
Os fungos marinhos representam um grupo taxonômico com aproximadamente
1.500 espécies descritas com distribuição pantropical e pantemperada (Hyde & Frohlich,
1998). Estes fungos são os principais organismos decompositores nos oceanos e
apresentam uma significativa habilidade em degradar compostos lignocelulósicos e
animais de diferentes espécies, após sua morte, tais como poríferos, cnidários,
equinodermas, peixes, entre outros. Além disso, estes fungos são conhecidos como
importantes patógenos de plantas e animais; e poucas espécies são conhecidas como
simbiontes (Hyde & Frohlich, 1998). A maioria dos fungos marinhos, incluindo 43
gêneros e 133 espécies, faz parte do filo Ascomycota (Halosphaeriales) e seu anamorfos
(Jones, 1995; Hyde, 2002).
De acordo com Fenical (1997), em 1849 foi descrito e relatada para ciência
Phaeosphaeria typharus, citada como o primeiro fungo marinho facultativo; e em 1869 a
espécie Halotthia posidoniae conhecida como o primeiro fungo marinho obrigatório. O
estudo de fungos marinhos teve um início discreto no final de 1930 e, de acordo com
(Moss & Ross, 1987), os primeiros trabalhos foram publicados pelos pesquisadores
Höhnk & Sparrow e Barghoorn & Linder. A definição mais aceita para fungos marinhos
é a descrita por Kohlmeyer & Kohlmeyer (1979), os quais os dividem em dois grandes
grupos. O primeiro definido como obrigatórios são representados por fungos que crescem
e esporulam exclusivamente em habitats marinhos ou estuarinos; e segundo, chamado de
facultativos são representados por fungos que vem de águas continentais e ambientes
terrestres, os quais crescem e, possivelmente, esporulam em ambiente marinhos. Os
fungos marinhos, dentre os diversos microrganismos presentes nesse complexo e imenso
conjunto de ecossistemas, representam uma fonte valiosa e pouco estudada de novas
espécies para ciência e modelos para estudos ecológicos e evolutivos. Estes fungos são
encontrados associados a diferentes organismos tais como: poríferos, peixes, cnidários,
tunicados e macroalgas.
Muitas das interações ecológicas entre microrganismos e macroalgas são
desconhecidas e podem representar importantes fatores para conservação e exploração
biotecnológica dos ambientes marinhos (Hawksworth, 1991). Além disso, existem poucas
informações sobre o papel dos fungos nos ecossistemas marinhos e detalhes da
distribuição e ocorrência de fungos algícolas são incompletas (Kohlmeyer & Kohlmeyer,
1979; Kohlmeyer & Volkmann-Kohlmeyer, 2003).
2.2 Diversidade de macroalgas
As macroalgas são organismos bênticos efêmeros ou perenes que passam a maior
arte do seu ciclo vital fixos a um substrato sólido, consolidado ou não. Desta forma, as
áreas com maior diversidade específica de macroalgas são os costões, áreas de fundos
rochosos e/ou de recifes de corais (Széchy et al., 2000). Algumas espécies estão
adaptadas para resistir longos períodos de emersão e se tornam conspícuas nos períodos
de marés baixas, formando zonas intermareais de distinta composição florística. Outras
macroalgas, por sua vez, não suportam exposição ao ar e vivem permanentemente
submersas, as quais são chamadas de espécies de infralitoral e podem atingir
profundidades superiores a 100 metros em regiões onde a zona eufótica, como é o caso
do Oceano Atlântico Sul e áreas em torno da Antártica (Clarke, 2003).
Macroalgas representam uma parte altamente produtiva do ecossistema marinho e
são essenciais para ciclagem de nutrientes e estruturação dos habitats para várias espécies
de micro e macrorganismos (Zuccaro et al., 2008). A comunidade de seres vivos
presentes neste sistema representa importantes modelos para investigações de interações
ecológicas nos ambientes naturais.
A extensão da costa brasileira é de aproximadamente 8.5 km
(http://www.mma.gov.br, acessado em agosto de 2009) e neste ambiente marinho as
macroalgas constituem um dos grupos de maior diversidade dentre os organismos
fotossintetizantes. Do total de 32 mil espécies conhecidas em termos mundiais, pelo
menos 820 táxons são relatados na costa brasileira. Neste contexto, as macroalgas
representam uma fonte natural estratégica para estudos taxonômicos, ecológicos,
evolutivos e biotecnológicos.
As espécies de macroalgas marinhas que ocorrem na costa brasileira estão sendo
catalogadas e publicadas no site http://www.ib.usp.br/algaemaris/Algaemaris.php.
Atualmente a lista inclui 643 táxons infragenéricos, sendo 388, Rhodophyta, 88
Phaeophycea e 167 Chlorophyta. O estado que apresenta maior riqueza em táxons
infragenéricos conhecidos é Rio de Janeiro com 465, seguido por São Paulo com 372,
Espírito Santo com 302 e Ceará com 250. Entretanto, estes números podem alteram-se à
medida que novos trabalhos sejam executados
(http://www.mma.gov.br/estruturas/sbf_chm_rbbio/_arquivos/plantas_marinhas.pdf,
acessado em agosto de 2009). A diversidade de macroalgas do Sul do Brasil, em especial,
é distinta das outras regiões do Brasil, pois esta região trata-se de um ecótono entre a
zona tropical e a temperada. Estes ecossistemas costeiros do Sul do Brasil não
apresentam necessariamente grandes diversidades de macroalgas, mas por outro lado
detém alta biomassa de algumas delas, que inclui espécies de interesse comercial usadas
na indústria de ficocolóides, indústria cosmética ou diretamente no segmento alimentício
(Pellizzari et al., 2006).
Isolada dos demais continentes por correntes oceanográficas e pela distância, a
Antártica é um ambiente que se caracteriza por extremos de clima, habitats e
biogeografia. Nos ecossistemas antárticos podem ocorrer grandes variações de
temperatura e salinidade, dessecação, escassez de nutrientes, alta incidência de radiação
ultra-violeta alternada com longos períodos de ausência de luz, mudanças climáticas
acentuadas e descontínuas, além dos ciclos de congelamento e degelo, que influenciam a
distribuição das massas de água no Oceano Austral e geram alterações locais no clima
(Clarke, 2003; Vincent, 2000; Wynn-Williams, 1996).
Estudos sobre a biodiversidade de macroalgas na Antártica são limitados pela
falta de informações taxonômicas e de distribuição geográfica consistente (Clayton,
1994). Devido às condições extremas, a dificuldade de acesso e coleta, muitas espécies
de macroalgas da Antártica permanecem desconhecidas. Estes fatores são responsáveis
pela ausência de uma estimativa precisa da diversidade de macroalgas da região. De
acordo com Wiencke & Clayton (2002), em 1964 Skottsberg estimou a existência de 96
espécies de macroalgas, das quais 16 táxons seriam de Chlorophyta, 19 Phaeophyceae e
61 Rhodophyta. Entretanto, ainda de acordo com estes autores, novos estudos
determinaram a existência de 120 a 130 espécies presentes na Antártica, as quais podem
representar um promissor reservatório de espécies de microrganismos associados.
A flora ficológica presente na Antártica apresenta baixa riqueza de espécies em
comparação com a flora de regiões temperadas e tropicais (Wiencke & Clayton, 2002).
Entretanto a flora marinha Antártica é caracterizada por um alto grau de endemismo
(Clayton, 1994). Phaeophyceae e Rhodophyta apresentam o maior número de espécies
endêmicas, seguido por Chlorophyta (Tabela 1). Além disso, as ordens Desmarestiales,
Ceramiales e Gigartinales apresentam uma alta proporção de espécies endêmicas
(Wiencke & Clayton, 2002), e Palmaria decipiens (Reinsch) RW Ricker representa a
alga mais abundante desta região (Oliveira et al., 2009). Cerca de 90% das espécies de
macroalgas se encontram na região oeste da Antártica, incluindo a Península Antártica,
Ilhas Schetland do Sul e Ilhas Orkey do Sul. Entretanto, a riqueza de espécies diminui
drasticamente no sentido leste e em elevadas altitudes (Wiencke & Clayton, 2002;
Wiencke et al., 2007).
Tabela 1. Nível de endemismo dos táxons de macroalgas da Antártica.
Táxons N° de espécies N° de espécies endêmicas % de endemismo
Rhodophyta 75 24 32
Phaeophyceae 27 12 44
Chlorophyta 17 3 18
Total 119 39 33
Fonte: Wiencke & Clayton (2002).
2.3 Fungos algícolas
Os principais estudos sobre fungos marinhos foram realizados durante as últimas
cinco décadas se concentraram em sua maioria em fungos lignícolas e raramente em
algícolas (Kohlmeyer & Volkmann-Kohlmeyer, 1991). Entre as 465 espécies de fungos
filamentosos marinhos conhecidos, somente 79 foram descritos como algícolas, os quais
exercem, principalmente, relações parasíticas e simbiônticas (Kohlmeyer & Volkmann-
Kohlmeyer, 2003). Os primeiros estudos de fungos associados com macroalgas foram
realizados por Sutherland (1915a,b,c; 1916a,b). Desde então, a evolução tecnológica,
principalmente na melhora da microscopia, permitiu a identificação e determinação
taxonômica de muitos fungos algícolas. A maioria destes fungos pertence ao grupo dos
Ascomycota e seus anamorfos (Kohlmeyer & Volkmann-Kohlmeyer, 1991) e apesar do
seu relevante papel nos ecossistemas litorâneos, o Brasil e Antártica ainda não possuem
uma micota suficientemente estudada. Muitas espécies ainda não foram identificadas, as
quais poderiam ser utilizadas como fonte de diferentes estudos taxonômicos, ecológicos,
evolutivos e biotecnológicos. A maioria dos fungos associados à macroalgas são
organismos sapróbios e sua principal função no meio ambiente é decompor a matéria
orgânica, disponibilizando principalmente carbono e hidrogênio que são assimilados por
outros organismos da cadeia trófica.
Alguns estudos ecológicos e taxonômicos têm demonstrado a existência de
espécies de fungos algícolas inéditas associados às macroalgas dos gêneros Fucus,
Chondrus, Laminaria, Sargassum, Dilsea, Ceramium, Saccorhiza, Ascophyllum,
Cladophora, Halymenia, Halarachnion, Plumaria, Ceratiodictyon, Hypnea,
Enteromorpha, Ulva, Porphyra e Egregia (Kohlmeyer & Volkmann-Kohlmeyer, 1991,
Stanley, 1992, Schulz et al., 2002; Lee at al., 2003; Zuccaro & Mitchell, 2005; Zuccaro
et al., 2008). Nestes estudos, os principais gêneros de fungos encontrados foram
Acremonium, Arthrinium, Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium,
Penicillium, Phoma e Trichoderma, os quais também são comumente encontrados nos
ambientes continentais associados a plantas, matéria orgânica em decomposição e
diferentes tipos de solo (Jones & Byrne, 1976; Kohlmeyer & Kohlmeyer, 1979; Stanley
1992; Kohlmeyer & Volkmann-Kohlmeyer 2003; Zuccaro et al., 2008). Por outro lado,
espécies dos gêneros Spathulospora, Chadefaudia, Haloguignardia, Retrostium,
Histopidicarpomyces e Pontogenia foram encontrados apenas em associação com
macroalgas (Zuccaro et al., 2003; Zuccaro & Mitchell, 2005). Algumas espécies de
fungos tais como Mycophycias ascophylli e Sigmoidea marina apresentam uma
associação mutualística específica e crescem associadas apenas com sua alga hospedeira
(Kohlmeyer et al., 1998; Zuccaro et al., 2008), demonstrando alto grau de
especificidade. A partir de estudos de taxonomia molecular, Zuccaro et al. (2008)
encontraram diferentes espécies de fungos associados com macroalga Fucus serratus
tais como Sigmoidea marina, Acremonium fuci, Cladosporium spp., Dendryphiella
salina e Fusarium spp. De acordo com Hawksworth (2004) existem cerca de 100 mil
espécies de fungos descritos mundialmente e, dentre estes, somente 79 (0,08%) são
fungos algícolas (Zuccaro & Mitchell, 2005). Desta forma, os fungos algícolas podem
ser considerados microrganismos alvos, importantes como fontes de diversidade
biológica (Klemke et al., 2004). A falta de estudos taxonômicos e ecológicos de fungos
presentes em ecossistemas marinhos no litoral brasileiro e no continente Antártico nos
conduz a sugerir que as macroalgas podem constituir uma fonte promissora de riqueza
micológica marinha.
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Contribuir para o conhecimento da riqueza de espécies e distribuição geográfica
de fungos associados às macroalgas marinhas presentes no litoral do estado do Paraná,
Brasil, e na Antártica.
3.1.2 Específicos
1. Coletar e isolar fungos associados à macroalgas do litoral do Paraná e Antártica;
2. Incluir todos os fungos isolados obtidos em uma Coleção de Culturas credenciada;
3. Agrupar em morfoespécies todos os isolados obtidos por meio de processos
fisiológicos, morfológicos e moleculares;
4. Identificar todos os fungos em nível específico por meio de técnicas fisiológicas,
morfológicas e moleculares;
5. Identificar e depositar em herbário de referência as macroalgas hospedeiras dos
fungos algícolas;
6. Ampliar as informações sobre a distribuição geográfica das espécies identificadas;
7. Caracterizar possíveis espécies novas de fungos marinhos associados às
macroalgas.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Áreas de estudo
4.1.1 Litoral do Paraná
Várias áreas de preservação do Brasil abrigam uma das mais ricas biodiversidades
do planeta. O acesso a estas áreas será feito respeitando-se as legislações Estaduais e
Federais de acesso à biodiversidade. Para as coletas foram aprovadas as devidas licenças
junto ao Ministério do Meio Ambiente e Marinha do Brasil.
O litoral do estado do Paraná possui somente 92 km de costa, sendo o segundo
menor litoral brasileiro. Porém, apresenta aproximadamente 400 km de embaiamentos
pertencente ao Complexo Estuarino de Paranaguá e a Baía de Guaiatuba. O complexo
apresenta uma grande diversidade de habitats, desde extensas planícies de marés, como
manguezais, marismas, canais de marés, praias arenosas e costões rochosos. O interior do
sistema é margeado por marismas e manguezais, enquanto parte mais externa é composta
por praias arenosas e alguns costões rochosos. As margens da baía são colonizadas por
florestas de mangue compostas por Laguncularia racemosa, Avicennia schauerianna e
Rhizophora mangle, alternadas por bancos de Spartina alterniflora, alguns costões
rochosos naturais e outros substratos consolidados introduzidos. O clima da região é
pluvial temperado úmido, com chuvas em todos os meses do ano. Os gradientes de
salinidade variam de 12 à 29 ups no verão (estação chuvosa) e de 20 à 34 ups no inverno
(estação seca), máximos de até 36 ups ocorrem na entrada dos canais de acesso, e valores
próximos a zero ocorrem nos setores mais internos do estuário principalmente em
períodos de maior pluviosidade. A temperatura da água varia pouco, tanto no plano
vertical como horizontal. No entanto a variação sazonal é grande, com valores mínimos
entre 17 e 20ºC de junho a setembro e, máximos entre 28 e31ºC, de dezembro (Lana et
al., 2001).
As coletas de macroalgas no estado do Paraná foram realizadas em julho de 2008
nas cidades de Antonina (25° 25' 09''S - 48° 42'54'' W), Guaratuba (25º56´S - 48º35´W),
povoado de Maciel em Matinhos (25° 33' 21''S, 48° 25’ 40'' W) e Ilha do Mel (25º29'29"S
- 48°17’17"W). (Figura 1). No setor mais interno do Complexo Estuarino de Paranaguá,
situa-se a Baía de Antonina. No mais externo, a Baía de Paranaguá onde se localiza o
povoado de Maciel. A Ilha do Mel situa-se próximo ao Canal da Galheta, um dos canais
que conectam a Baía de Paranaguá com o mar aberto. Enquanto Guaratuba pertence à
baía de mesmo nome.
Figura 1. Pontos de coleta das macroalgas no Estado do Paraná. O símbolo (∆) mostra os
locais onde foram coletas as espécies de macroalgas. Fonte: Google Earth
(http://earth.google.com, acessado em setembro de 2008).
4.1.2 Baía do Almirantado – Antártica
O último continente a ser conquistado pelo homem a Antártica,
compreende as terras localizadas abaixo do paralelo 60°. A Baía do Almirantado
(62°09’S, 58°28’W) está localizada ao Arquipélago Shetland do Sul, sendo a maior baía
da Ilha Rei George, com uma área aproximadamente de 131 km2. O clima é determinado
pela passagem de sucessivos sistemas ciclônicos, transportando o ar aquecido e úmido,
fortes ventos e grande volume de precipitação, considerado clima oceânico gelado e
úmido, com médias mensais excedendo 0°C, principalmente nos meses de inverno.
Precipitações de 35-50 cm anuais, com chuvas no verão austral (Rakusa-Suszczewski
1980).
Para as coletas no ecossistema Antártico foram aprovadas as devidas licenças
junto ao Ministério do Meio Ambiente e Marinha do Brasil. Na Antártica as macroalgas
foram coletadas entre dezembro de 2007 e janeiro de 2008 na Baía do Almirantado,
onde se encontra a Estação Antártica Brasileira Comandante Ferraz (EACF) (Figura 2).
Figura 2. Mapa da Baía do Almirantado, Ilha Rei George, Antártica. O símbolo (∆)
mostra o local onde foram coletas as espécies de macroalgas (Simões et al., 2004, com
modificações).
4.2 Coleta das macroalgas
As amostras coletadas correspondem às macroalgas marinhas bentônicas fixas
aos substratos rochosos e arenosos localizados na região entre marés e coletadas durante
o período de maré baixa e diretamente no mar, e também em ambientes estuarinos. O
número amostral variou de 10 a 60 para as diferentes macroalgas e foi determinado de
acordo com as respectivas disponibilidades nos pontos de coleta. As macroalgas foram
coletadas de maneira arbitrária, priorizando exemplares saudáveis sem sinais de
senescência ou doenças. Após a coleta foi retirado o excesso de água e o material
acondicionado em sacos de polietileno. No laboratório, as amostras foram separadas, por
inspeção a olho nu ou sob microscópio estereoscópico, com o intuito de separar os
espécimes de maior interesse e retirar organismos epifíticos.
4.2.1. Litoral do Paraná
Foram coletas as espécies de macroalgas: Bostrychia radicans (Montagne)
Montagne e Caloglossa leprieurii (Montagne) G. Martens (Rhodophyta); Gayralia
oxysperma (Kützing) Vinogradova ex Scagel et al. e Monostroma sp. (Chlorophyta); e
Padina gymnospora (Kutzing) Sonder. (Phaeophyceae, Ochrophyta). Vinte amostras de
Monostroma sp. foram coletadas em Guaratuba, Ilha do Mel e Maciel (n amostral total 60
exemplares). Para a macroalga P. gymnospora (30 exemplares) foram coletadas somente
na Ilha do Mel. Em Antonina foram coletadas B. radicans, C. leprieurii, G. oxysperma,
com n amostral de 10, 16 e 20, respectivamente. Os exemplares foram devidamente
identificados, preservados e depositados no Herbário Maria Eneyda P. Kauffman Fidalgo,
Instituto de Botânica (SP).
Figura 3. Espécimes das macroalgas: (a) Monostroma sp., (b) Padina gymnospora
(Kutzing) Sonder., (c) Gayralia oxysperma (Kützing) Vinogradova ex Scagel et al., (d)
Caloglossa leprieurii (Montagne) G. Martens e (e) Bostrychia radicans (Montagne)
Montagne coletadas no litoral do estado do Paraná, Brasil.
4.2.2. Baía do Almirantado - Antártica
No continente Antártico foi coletado talos de 20 exemplares de cada uma das
macroalgas, Adenocystis utricularis (Bory) Skottsberg, Desmarestia anceps Montagne
(Ochrophyta) e Palmaria decipiens (Reinsch) R.W. Ricker (Rhodophyceae) (Figura 4).
As três espécies foram coletadas em costões rochosos na Baía do Almirantado. Os
exemplares foram coletados durante o verão Antártico nos meses de janeiro, fevereiro e
dezembro de 2008 e janeiro de 2009.
Figura 4. Espécimes das macroalgas: (a) Adenocystis utricularis (Bory) Skottsberg, (b)
Desmarestia anceps Mont., e (c) Palmaria decipiens (Reinsch) Ricker. (A barra
representa a escala real).
4.3 Isolamento dos fungos
Os fragmentos dos talos das macroalgas coletadas foram lavados por 2 min com
água do mar esterilizadas, por três vezes. Após a lavagem, os fragmentos foram
transferidos para placas de Petri contendo os meios de isolamento YM (glicose 1g,
extrato de malte 0,3 g, peptona 0,5 g e ágar 20 g em 100 mL de água) e Ágar Batata
Dextrosado – BDA (Himedia), ambos solubilizados em Água Artificial do Mar – AAM,
com pH 8; e suplementados com 100 μg/mL Cloranfenicol (Sigma). As placas foram
incubadas a 15 e 28ºC, para os fungos da Antártica e Paraná, respectivamente, por um
período de até 60 dias, e os isolados transferidos para novas placas de Petri contendo o
meio de isolamento. A água do mar artificial contém os seguintes sais (g/L): KBr (0,10),
NaCl (23,48), MgCl2 6H2O (10,61), CaCl2 6H2O (1,47), KCl (0,66), SrCl2 6 H2O (0,04),
Na2SO4 (3,92), NaHCO3 (0,19), H3BO3 (0,03) (Höller et al., 1999).
Todos os isolados fúngicos obtidos foram armazenados em glicerol 30% a -80°C
e mantidas por repiques sucessivos no meio de isolamento a 4ºC para estudo. Os isolados
obtidos durante o estudo foram depositados na Coleção de Microrganismos e Células do
Departamento de Microbiologia da Universidade Federal de Minas Gerais.
4.4 Identificação dos fungos filamentosos
4.4.1 Extração do DNA total
A extração do DNA total foi realizada de acordo com Rosa et al. (2009). Os
fungos filamentosos foram crescidos por sete dias em ágar Sabouraud. Fragmentos de
micélio foram colocados em tubo de 1,5 mL acrescidos de 400 µL de tampão de lise
(Tris-HCl - trishidroximetilaminometano 0,05 M; EDTA - ácido etilenodiamino tetra-
acético 0,005 M; NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%) e deixado a – 20ºC por
aproximadamente 10 min. O micélio foi triturado com o auxílio de um pistilo e
acrescidos 5 µL de Proteinase K (50µg/mL). Após homogeneização, o tubo foi colocado
por 30 min. a 60ºC em banho-maria. Após essa etapa, foram adicionados 162 µL de
CTAB (Tris 2 M; NaCl 8,2%; EDTA 2 M e CTAB 0,2%), seguido de homogeneização e
incubação por 10 min a 65ºC. Em seguida, foram acrescentados 570 µL da mistura
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Após homogeneização, o tubo foi incubado por 30
min em gelo. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 min e o
líquido sobrenadante transferido para um novo tubo de 1,5 mL, e acrescentado 10% do
volume da solução de acetato de sódio 3 M. O tubo foi vertido para homogeneização,
incubado a 0ºC por 30 min e centrifugado a 13.200 r.p.m. por 10 min. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo, onde foi adicionado 50% do volume de isopropanol e
centrifugado a 13.200 r.p.m. por 5 min. O sobrenadante foi desprezado por inversão. A
seguir, foram adicionados 200 µL de etanol (Merck) 70% p/v a 4ºC e a suspensão foi
gentilmente homogeneizada. Após este procedimento, a amostra foi centrifugada a
13.200 r.p.m. por 5 min e o sobrenadante desprezado por inversão, seguido por
homogeneização com etanol 70% p/v. A amostra foi seca por aproximadamente 15 min;
100µL de Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M) foram adicionados e a mesma
incubada a 65ºC por 60 min para hidratação do DNA. As amostras foram armazenadas
em freezer a –20ºC.
4.4.2 Obtenção dos amplicons
Os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) foram utilizados para amplificação da região ITS do
rDNA, conforme descrito por White et al. (1990). A Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) foi realizada em um volume final de 50µL contendo 2 μL de DNA, 1 μL de cada
iniciador ITS1 e ITS4 10 μmol-1 (MWG Biotech), 5 μL de tampão de PCR 5X
(Fermentas), 2 μL de MgCl2 25 mM, 2 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de Taq DNA
polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água destilada estéril. As
reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR Express (Thermo
Hybaid). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 min, seguido por
35 ciclos de 1 min de desnaturação a 94ºC, 1 min de anelamento a 55ºC e 1 min de
extensão a 72ºC, e uma extensão final por 5 min a 72ºC. Os produtos de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5 X, eluídos durante
aproximadamente 1 hora a 120 V. Os géis foram corados com solução de brometo de
etídio, visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação
de gel (Vilber Lourmat, France).
4.5 Identificação das leveduras
As leveduras foram identificadas segundo procedimento padrão (Yarrow, 1998) e
chaves taxonômicas presentes em Kurtzman & Fell (1998). Os isolados cujas
identificações não puderem ser resolvidas com base na metodologia convencional foram
submetidos à análise molecular por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
utilizando-se o iniciador M13 (5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (Libkind et al., 2003).
Com base no perfil eletroforético dos produtos amplificados por PCR com o iniciador
M13, dentre os isolados que apresentaram um mesmo padrão de bandas, um foi
selecionado para sequenciamento dos domínios D1/D2 da subunidade maior do DNA
ribossomal utilizando os iniciadores NL1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-
3’) e NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’).
4.5.1 Extração do DNA total
Para extração do DNA total, os isolados de leveduras foram crescidos em ágar
Sabouraud por 24 horas a 15°C, para as leveduras provenientes das macroalgas da
Antártica e 30°C para as do Paraná. Após crescimento, as colônias de leveduras do
Paraná, foram ressuspendidas em 100 μL de água deionizada estéril, congeladas em
nitrogênio líquido por um min e, em seguida, colocadas em água fervente por 10 min (De
Barros Lopes et al., 1996; 1998). Para as leveduras da Antártica, as colônias foram
transferidas a um tubo de 1,5 mL e junto a elas foram adicionados 100 μL de tampão de
lise (Tris-HCl - trishidroximetilaminometano 0,05 M; EDTA - ácido etilenodiamino tetra-
acético 0,005 M; NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%), em seguida 100 μL de
PCI (fenol, cloroformórmico, álcool isoamílico), nas concentrações de 25:24:1. O tubo
foi agitado em vórtex de 3 a 4 min. Após isto, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 r.p.m.
durante 5 min. O liquido sobrenadante foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e
adicionados 100 μL de etanol 96% (Merck) resfriado a 4°C. O tubo fechado foi vertido
por 20 vezes a fim de homogeinizar a solução, e novamente centrifugado a 13.200 r.p.m.
por 2 min. O sobrenadante foi desprezado por inversão e a amostra foi seca até a
evaporação total do etanol e ressuspendida em 100 μL de TE (Tris-HCL -
trishidroximetilaminometano 10 mM; EDTA 1mM). Todas as amostras foram
armazenadas em freezer a –20ºC.
4.5.2 PCR com o iniciador M13
Para confirmação da identificação fisiológica das leveduras, os isolados foram
submetidos à análise molecular, por meio da PCR utilizando o iniciador M13 (5’-
GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (Libkind et al., 2003). Cada ensaio de PCR foi realizado em
25 µL de uma mistura contendo: 5,0 μL de DNA, 2,0 μL do iniciador M13 10 μmol-1
(MWG Biotech), 2,5 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 1,5 μL de MgCl2 25 mM,
1,0 μL de dNTP 10 mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume
final completado com água destilada estéril. As reações de PCR foram realizadas
utilizando o termociclador PCR Express (Thermo Hybaid) sob as seguintes condições:
desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, seguida por 40 ciclos de: desnaturação a 93ºC por
45 segundos, anelamento a 50ºC por 1 min e extensão a 72ºC por 1 min, seguida por
extensão final a 72ºC por 6 min. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese
em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5 X, eluídos durante aproximadamente 1 hora a
120 V. Os géis foram corados com solução de brometo de etídio, visualizados sob luz
ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat,
France).
4.5.3 Amplificação utilizando os iniciadores NL1 e NL4
Dentre as leveduras que apresentarem perfis moleculares distintos, um isolado foi
selecionado para o sequenciamento da região D1/D2 da subunidade maior do rDNA
utilizando os iniciadores NL1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL4
(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) segundo Lachance et al. (1999). A reação de
PCR foi realizada em um volume final de 50 µL contendo: 2,0 μL de DNA, 1,0 μL de
cada iniciador NL1 e NL4 10 μmol-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de PCR 5X
(Fermentas), 2,0 μL de MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10mM, 0,2 μL de Taq DNA
polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água destilada estéril. As
reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR Express (Thermo
Hybaid) sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 2 min, seguida por
35 ciclos de: desnaturação a 95ºC por 15 segundos, anelamento a 54ºC por 25 segundos e
extensão a 72ºC por 20 segundos, seguida por extensão final a 72ºC por 10 min. Os
produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão
TBE 0,5X, eluídos durante aproximadamente 1 hora a 120 V. Os géis foram corados com
solução de brometo de etídio, visualizados sob luz ultravioleta e fotografados em um
sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat, France).
4.6 Purificação dos amplicons
Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados utilizando-se
Polietilenoglicol (PEG). Ao produto de PCR foi adicionado igual volume de uma solução
de Polietilenoglicol 20% em NaCl 2,5 M, que foi mantido em banho-maria à 37ºC por 15
min. O tubo foi centrifugado a 13.500 r.p.m. por 15 min e o sobrenadante retirado e
descartado. A seguir, foram adicionados 125 µL de etanol 70-80% resfriado a 4ºC, o tubo
foi centrifugado a 13.500 r.p.m. por 2 min e o etanol retirado. Este passo foi repetido
mais uma vez e a amostra novamente centrifugada a 13.200 r.p.m. por um segundo (spin
down). O tubo foi deixado à temperatura ambiente para evaporação de todo o excesso de
etanol. Foram adicionados 10 µL de água deionizada estéril e o conteúdo do tubo foi
homogeneizado em vórtex por 15 segundos. Em seguida, o tubo foi incubado em banho-
maria a 37ºC por 40 min. O produto obtido foi dosado em NanoDrop, ND 1000,
(NanoDrop Thecnologies) para ser utilizado nas reações de sequenciamento.
4.7 Reações de sequenciamento dos fungos
O sequenciamento foi realizado utilizando-se o Kit DYEnamicTM (Amersham
Biosciences, USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado
MegaBACETM 1000, no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular (LBEM –
UFMG). Para as reações de sequenciamento foram utilizados 100-150 ng do DNA
purificado e os reagentes presentes no Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences,
USA). A reação de PCR foi realizada em um volume final de 10 µL contendo 4 µL do
pré-mix (presente no kit de sequenciamento) e 1 µL do iniciador (5 μmol-1),
completando-se o volume final com água deionizada estéril. O programa consistiu de 36
ciclos de uma desnaturação inicial a 95ºC por 25 min, seguido por 15 segundos de
anelamento a 50ºC e 3 min de extensão a 60ºC. Após término da ciclagem, os produtos da
reação foram transferidos para uma placa de sequenciamento de 96 poços para serem
precipitados.
4.8 Precipitação da reação de sequenciamento
Para precipitação dos componentes das reações de sequenciamento, 1 µL de
acetato de amônio 7,5 M foi adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de
acetato de amônio foi dispensada na parede lateral dos poços e a placa levemente batida
sobre a bancada para que as gotas do acetato de amônio se misturassem à reação. Em
seguida, foram adicionados 28 µL de etanol absoluto (Merck). A placa foi submetida à
agitação em vórtex e incubada por 20 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Após
período de incubação, a placa foi centrifugada por 45 min a 4000 r.p.m. O sobrenadante
foi descartado virando-se a placa sobre um papel absorvente. Em seguida, foram
adicionados 150 µL de etanol 70% (Merck). A placa foi novamente centrifugada por 15
min a 4000 r.p.m. e o sobrenadante então descartado. Para remoção do excesso de etanol,
a placa foi invertida sobre um papel absorvente, e submetida a um pulso em centrífuga a
900 r.p.m. durante 1 segundo. Em seguida, a placa foi mantida em repouso durante 20-40
min, protegida da luz, para evaporação do etanol.
O DNA das amostras precipitado em cada poço da placa foi então ressuspendido
em 10 µL de Loading buffer (presente no kit de sequenciamento). A placa foi submetida à
agitação em vórtex por 2 min, pulsada em centrífuga por 1 segundo a 900 r.p.m. e
armazenada a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado
MegaBACETM 1000.
4.9 Análise das sequências
As sequências de DNA foram analisadas utilizando-se o programa BLASTn
(Basic Local Alignment Serch Tool - versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) desenvolvido pelo National Center For
Biothecnology.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados e discussão referentes aos objetivos da dissertação foram divididos em três
partes e apresentados da seguinte forma:
5.1. Testes preliminares para a escolha da metodologia para isolamento de fungos
associados à macroalgas;
5.2. O artigo: Fungal community associated with seaweeds from Antarctica,
submetido à Revista Polar Biology (julho de 2009);
5.3. Resultados parciais obtidos do isolamento de fungos das macroalgas coletadas no
litoral do estado do Paraná.
Além disso, é apresentada uma conclusão integrada dos resultados obtidos,
perspectivas e a produção científica gerada ao longo das atividades do curso de Pós-
graduação em Ecologia de Biomas Tropicais.
5.1. Testes preliminares para isolamento de fungos associados à
macroalgas
O cultivo de fungos marinhos requer cuidados especiais, pois simular as
condições nutricionais oferecidas nos oceanos não é uma tarefa fácil e representa um dos
principais fatores limitantes para estudo de microrganismos marinhos. Desta forma, testes
preliminares foram realizados para a escolha do meio de cultura apropriado para
isolamentos dos fungos algícolas neste trabalho. Cinco meios de cultura foram
selecionados para os testes de acordo com Osterhage (2001):
Meio I – ÁGAR ALGA: Alga macerada 20 g/L, Ágar bacteriológico 20 g/L em 1000 mL
de água artificial do mar, suplementado com 200 mg/L de Cloranfenicol (Sigma/EUA)
para evitar o crescimento bactérias contaminantes.
Meio II - ÁGAR NUTRIENTE STANDARD (ANS): KH²PO4 1 g/L, KNO3 1 g/L,
MgSO4 x 7H2O 0,5 g/L, KCl 0,5 g/L, Glicose 0,2 g/L, Sacarose 0,2 g/L, Ágar
bacteriológico 20 g/L em 1000 mL de AAM, suplementado com 200 mg/L de
Cloranfenicol.
Meio III - ÁGAR GLICOSE-PEPTONA E EXTRATO DE LEVEDURA (GPY):
Glicose 1 g/L, Peptona de soja 0,5 g/L, Extrato de Levedura 0,1 g/L, Ágar bacteriológico
20 g/L em 800 mL/L de AAM, suplementado com Cloranfenicol 200 mg/L.
Meio IV - ÁGAR BATATA DEXTROSADO (BDA/Difco) 39 g de BDA em 1 L de
AAM, suplementado com Cloranfenicol 200 mg/L.
Meio V – YM: Glicose 1 g, Extrato de malte 0,3 g, Peptona 0,5g e Ágar bacteriológico
20 g em 100 mL de AAM, suplementado por Cloranfenicol 200 mg/L.
Água Artificial do Mar (AAM) - contém os seguintes sais (g/L): KBr (0,10), NaCl
(23,48), MgCl2 6H2O (10,61), CaCl2 6H2O (1,47), KCl (0,66), SrCl2 6H2O (0,04),
Na2SO4 (3,92), NaHCO3 (0,19), H3BO3 (0,03) (Höller et al., 1999).
Para realização dos testes, 25 amostras da macroalga Padina sp. foram coletadas
em Parati, litoral do Rio de Janeiro em outubro de 2007. Três fragmentos de cada
exemplar foram lavados três vezes com água destilada esterilizada e inoculados em
placas de Petri contendo os respectivos meios testes citados acima. No total foram
utilizadas 25 placas de Petri para cada meio de cultura teste. As placas foram incubadas a
temperatura ambiente por um período de até 15 dias. A taxa de sucesso de cada meio foi
determinada pelo número de placas colonizadas por fungos em cada meio de cultura
teste.
Os meios V (YM) e IV (BDA) apresentaram os melhores resultados em termos de
presença de colônias de fungos. Das 25 placas testadas, 16 contendo o meio V
apresentaram crescimento de fungos, representando 64% de sucesso. O segundo melhor
resultado foi conseguido com meio IV com crescimento de fungos em 15 placas (60% de
sucesso). Os meios II e III apresentaram cinco (20%) e oito (32%) placas com
crescimento de fungos respectivamente. Por outro lado no Meio I não houve crescimento
fúngico.
Desta forma, a partir dos resultados encontrados foi estabelecido que os meios de
cultura IV e V seriam utilizados para isolamento dos fungos algícolas. Estes dois meios
de cultura foram utilizados para coletas e isolamento dos fungos associados às
macroalgas da Antártica e do litoral do estado do Paraná.
5.2. ARTIGO SUBMETIDO
Fungal community associated with seaweeds from Antarctica
Carolina P. Loque1, Adriana O. Medeiros2, Franciane Pellizzari3, Eurico C. Oliveira4,
Carlos A. Rosa5 and Luiz H. Rosa1
1Laboratório de Microbiologia, Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG,
Brazil. 2Laboratório de Microbiologia Ambiental, Departamento de Botânica, Universidade
Federal da Bahia, Salvador, BA, Brazil. 3Laboratório de Ficologia e Qualidade de Água do Mar (LAQUAMAR), Universidade
Estadual do Paraná, campus FAFIPAR. Paranaguá, Paraná, Brazil. 4Laboratório de Ficologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São
Paulo, Brazil. 5Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, C. P. 486,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil.
Correspondence: Luiz H. Rosa, Laboratório de Microbiologia, Universidade Federal de
Ouro Preto, Rua Diogo de Vasconcelos, 122, Ouro Preto, MG, 35.400-000, Brazil. Tel.:
+55-31-3559 1695, Fax: +55-31-3559 1633, e-mail: [email protected]
Abstract
Filamentous fungi and yeasts associated with the seaweeds Adenocystis utricularis,
Desmarestia anceps and Palmaria decipiens from Antarctica were studied. A total of 75
fungal isolates, represented by 27 filamentous fungi and 48 yeasts, were isolated from the
three seaweed species and identified by morphological, physiological, and sequence
analyses of the internal transcribed spacer region (ITS) and D1/D2 variable domains of the
large-subunit rRNA gene. The filamentous fungi obtained from seaweeds were identified as
belonging to the genera Geomyces, Antarctomyces, Oidiodendron, Penicillium, and
Phaeosphaeria. The prevalent species were the filamentous fungus Geomyces pannorum
and the yeast Metschnikowia australis. Two fungal species isolated in our study,
Antarctomyces psychrotrophicus and M. australis, are endemic to Antarctica. The
filamentous fungus Oidiodendron sp. UFMGCB 2696 and the yeast Leucosporidium sp.
UFMG-Ant 386 may represent new species. This work is the first study of fungi associated
with Antarctic seaweeds, and it is a relevant contribution to the taxonomy and ecology of
the marine fungi living in polar environments. These fungal species may have an important
role in the ecosystem and in organic matter recycling.
Key words: Algae, Antarctica, endemism, extreme environments, fungi
43
Introduction
Marine fungi colonize a wide range of organic substrata found in the ocean, such as
sponges, corals, echinoderms, vertebrates and algae. The known of fungal species diversity
from seaweeds is considered incipient; these microorganisms are of particular interest due
to their ecological symbiotic properties (Zuccaro et al. 2003). Pathogens, parasites,
saprobes and mycobionts are the predominant fungi in seaweed communities. However,
there is little data available about the ecology of these organisms (Zuccaro et al. 2008).
Algae represent the second largest source of marine fungi isolated in the sea, and almost
one-third of all known higher filamentous marine fungi are associated with these organisms
(Bugni and Ireland 2004). The majority of fungi associated with algae belong to the
Ascomycota and only few conidial fungi are known. Ecological and diversity studies have
been showed that there are interesting algicolous fungi associated mainly with seaweeds
genera Fucus, Chondrus, Laminaria, Sargassum, Dilsea, Ceramium, Saccorhiza,
Ascophyllum, Cladophora, Halymenia, Ceratiodictyon, Hypnea, Enteromorpha, Ulva,
Porphyra, and Egregia (Kohlmeyer and Volkmann-Kohlmeyer 1991, Stanley 1992,
Zuccaro and Mitchell 2005; Zuccaro et al. 2008). Members of Acremonium, Arthrinium,
Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Penicillium, Phoma, and Trichoderma
have been reported both associated to seaweeds as well as terrestrial environment such as
plants, woods, and soils (Jones and Byrne 1976, Kohlmeyer and Kohlmeyer 1979, Stanley
1992, Kohlmeyer and Volkmann-Kohlmeyer 2003, Zuccaro et al., 2008). In contrast,
species of genera Spathulospora, Chadefaudia, Haloguignardia, Retrostium,
Histopidicarpomyces, and Pontogenia are all specific to seaweeds (Zuccaro and Mitchell
2005). Fungal species such as Mycophycias ascophylli and Sigmoidea marina are mutually
associated with their algal host, and grow within or at the surface of the algal tissue
(Kohlmeyer and Volkmann-Kohlmeyer 1998, Zuccaro et al. 2008). Zuccaro et al. (2008)
have found representatives of the following five taxa as predominant fungal species
associated with brown seaweed Fucus serratus: Sigmoidea marina, Acremonium fuci,
Cladosporium spp., Dendryphiella salina and Fusarium spp.; isolates were recovered from
all thallus parts of F. serratus. According Hawksworth (2004) there are about 100,000
described fungal species in world, and only 79 (0.08%) algicolous fungi are known
44
(Zuccaro and Mitchell 2005). Seaweeds have an important role in organic matter mineral
cycling, being fundamental for the functioning of this littoral and infralittoral ecosystem,
mainly in some shallow areas of the Antarctic. Nedzarek and Rakusa-Suszczewski (2004)
suggest that seaweed beds cover ca. 30% of the bottom surface, with an estimated amount
of 74,000 tons of wet biomass around Admiralty Bay. These communities are characterized
by a high degree of endemism dominated mainly by red and brown seaweeds (Wiencke et
al. 2007). The extensive populations of seaweeds have fundamental roles as primary
producers and food for marine herbivores as well as in habitat structuring (Charpy-Roubaud
et al. 1990). However, investigations into the distribution and occurrence of marine fungi
associated with seaweeds are still scarce worldwide, and no data is available on fungal
species associated with the seaweeds of Antarctica. Thus, the aims of this study were to
isolate and identify marine fungi living in association with three common species of
seaweeds in Antarctica: Adenocystis utricularis, Desmarestia anceps, and Palmaria
decipiens.
Material and methods
Sample collections and isolation of fungi
Twenty fresh thalli of different specimens of Adenocystis utricularis (Bory) Skottsberg,
Desmarestia anceps Montagne (Ochrophyta) and Palmaria decipiens (Reinsch) R.W.
Ricker (Rhodophyceae) (Fig. 1) were collected in stretches of rocky coastline in Admiralty
Bay, King George Island, South Shetland Islands, Antarctic Peninsula (62°09’S, 58°28’W).
Admiralty Bay is the largest bay (131 km2) on King George Island, located in the South
Shetlands Archipelago, Antarctic Peninsula. Research stations of Poland, Brazil and Peru
and refuges from USA and Ecuador are located around this bay. Despite all these research
facilities, there are no studies to date concerning fungi associated with local seaweeds. The
samples were collected on a rocky coastline that becomes ice-free during the Antarctic
summer. The sampling surveys were performed during January, February and December of
2008, and January of 2009.
Discs of 8 mm in diameter were cut from each specimen and washed twice using sterile
local seawater for 2 min. The discs were incubated in Petri dishes containing potato
45
dextrose agar (PDA, Difco, USA) or yeast extract-malt agar (YMA, 1% glucose, 0.5%
peptone, 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, and 2% of agar) for isolation of filamentous
fungi and yeasts, respectively. Both media were prepared with Artificial Sea Water (ASW)
plus chloramphenicol at 100 µg mL-1. The composition of the ASW was as described by
Höller et al. (1999). In addition, 10 thalli of A. utricularis in young, adult and mature stages
each were collected to evaluate the presence of fungi in their inner liquid. A hundred
microlitres of this liquid were placed on PDA/ASW and YMA/ASW. All plates were
incubated up to 60 days at 18°C, and individual colonies of filamentous fungi and yeasts
were purified on PDA and Sabouraud agar (Difco, USA), respectively. Long-term
preservation of mycelial pieces (filamentous fungi) was carried out at –80°C using
cryotubes with sterile glycerol. Yeasts were preserved at - 80°C or in liquid nitrogen for
later identification. All fungal isolates used in this work were deposited in the Culture
Collection of Microorganisms and Cells of the Universidade Federal of Minas Gerais under
codes UFMGCB.
Fig 1. Thalli from Antarctic seaweeds (a) Adenocystis utricularis (Bory) Skottsberg, (b)
Desmarestia anceps Mont., and (c) Palmaria decipiens (Reinsch) Ricker collected in
Admiralty Bay at King George Island, Antarctica. Bars represent the real scale.
46
Fungi identification
The protocol for filamentous fungus DNA extraction was done according to Rosa et al.
(2009). The ITS domains of rRNA gene were amplified with the universal primers ITS1
(5´- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) and ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-
3´), as described by White et al. (1990). Amplification of the ITS region was performed as
described by Rosa et al. (2009). The yeasts were characterized using standard methods
(Yarrow 1998), and their identification was carried out using the taxonomic keys of
Kurtzman and Fell (1998). The yeast identities were confirmed by sequencing of the D1/D2
variable domains of the large-subunit rRNA gene using the primers NL1 (5’-
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) and NL4 (5’-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) as described by Lachance et al. (1999). Sequencing of
the filamentous fungi and yeasts was carried out using an ET Dynamic Terminator Kit in a
MegaBACE™ 1000/Automated 96 Capillary DNA sequencer (GE Healthcare, USA). The
sequences obtained were adjusted using the SeqMan module of the Lasergene software
suite (DNASTAR/Inc.), and a consensus sequence was obtained using the Bioedit software
(v. 7.0.5.3; Ibis Biosciences). To reach species level identification by rRNA gene
sequencing, the consensus sequence was aligned with all sequences of related species
retrieved from the GenBank database using the Fasta 2.0 program (Altuschul et al. 1997).
The consensus sequence data of the algicolous fungi isolated in this work were deposited in
GenBank under the accession numbers FJ911867 to FJ911880. Phylogenetic relationships
were estimated using the MEGA program Version 4.0 (Tamura et al. 2007). The
phylogenetic trees were constructed using the neighbour joining (NJ) algorithm with
bootstrap values calculated from 1,000 replicate runs. The Maximum Composite
Likelihood model was used to estimate evolutionary distance.
Results
From 60 algal thallus samples (20 from each species) comprising 180 algal fragments, a
total of 75 fungal isolates were obtained, of which 27 were filamentous fungi and 48 were
47
yeast isolates. Twenty-five filamentous fungi were obtained from A. utricularis and two
from D. anceps. Thirty-eight yeast isolates were obtained from A. utricularis, eight from D.
anceps and two from P. decipiens. The filamentous fungi obtained from seaweeds were
identified as belonging to the genera Geomyces Traaen, Antarctomyces Stchigel & Guarro,
Oidiodendron Robak, Penicillium Link, and Phaeosphaeria I. Miyake. Two isolates were
not identified as genus level since their ITS sequences were similar to several uncultured
and unidentified fungi. The yeast species were identified as belonging the genus
Aureobasidium Viala & G. Boyer, Cryptococcus Kütz, Leucosporidium Fell et al.,
Metschnikowia Kamenski and Rhodotorula F.C. Harrison (Table 1). From the inner water
of A. utricularis was obtained only the yeast species Metschnikowia australis (Fell & I.L.
Hunter) Mendonça-Hagler et al. with average population counts of 170, 300 and 615 CFU
mL-1 for young, adult and old thalli, respectively.
Table 1. Host seaweeds, isolate code, closest related species, maxima identities, identification, and Genbank accession number of
marine fungal species associated with Adenocystis utricularis and Desmarestia anceps, and Palmaria decipiens collected in Admiralty
Bay at King George Island, Antarctica.
Seaweeds species UFMGCBa
code
Closest related species Maxima
identities (%)
Identification Genbank
accession number
Desmarestia anceps
Mont.
2693 Geomyces pannorum (Link) Sigler &
Carmichael [DQ189229]
97 G. pannorum FJ911877
386 Leucosporidium antarcticum Fell et al.
[AF189906]
88 Leucosporidium sp. FJ911867
206 Metschnikowia australis (Fell & Hunter)
Mend.-Hagler et al. [U76526]
98 M. australis FJ911872
Adenocystis utricularis
(Bory) Skottsberg
2625 Antarctomyces psychrotrophicus Stchigel &
Guarro [AJ133431]
99 A. psychrotrophicus FJ911878
2620 G. pannorum [DQ189229] 97 G. pannorum FJ911876
2696 Oidiodendron truncatum G.L. Barron
[AF062809]
96 Oidiodendron sp. FJ911880
2606 Penicillium solitum Westling [AY373932] 98 Penicillium sp. FJ911874
2623 Phaeosphaeria herpotrichoides (De Not.) L.
Holm [AF439483]
99 P. herpotrichoides FJ911873
2608 Clathrosphaerina zalewskii [EF29222] 88 Fungal sp. FJ911875
2692 Leotiomycetes sp. [GQ153126] 89 Helotiales sp. FJ911879
320 M. australis [U76526] 100 M. australis FJ911869
49
387b M. australis [U76526] FJ911871
213 Rhodotorula mucilaginosa (A. Jörg.) F.C.
Harrison [EF585187]
99 R. mucilaginosa FJ911870
Palmaria decipiens
(Reinsch) Ricker
214 M. australis [U76526] 99 M. australis FJ917671
384 Cryptococcus carnescens (Verona & Luchetti)
M. Takash. et al. [EU194464]
99 C. carnescens FJ911868
Identification was made using BLASTn searches of the ITS1-5.8S-ITS2 and D1/D2 regions of rDNA gene for filamentous fungi and
yeasts, respectively. aCulture Collection of Microorganisms and Cells of the Universidade Federal of Minas Gerais. bM. australis
obtained from inner liquid of A. utricularis.
The predominant filamentous fungus was Geomyces pannorum (Link) Sigler &
Carmichael, where 19 isolates were isolated from A. utricularis and two from D. anceps.
These isolates showed 97 to 99% identities compared with G. pannorum (GenBank
accession number DQ189229). The isolates UFMGCB 2625 and 2720 showed only one
different nucleotide in the ITS region compared with the fungus Antarctomyces
psychrotrophicus Stchigel & Guarro (GenBank access number AM489755). The isolate
UFMGCB 2606 showed a 98% identity with Penicillium solitum Westling (GenBank
access number AY373932), and the isolate UFMGCB 2623 had a 99% identity with
Phaeospharia herpotrichoides (GenBank access number AF439483).
The isolate UFMGCB 2696 presented 96% identity with Oidiodendron truncatum G.L.
Barron (GenBank access number AF062809) and was identified as Oidiodendron sp. This
isolate showed seven nucleotides difference (1.3%) when compared to the O. truncatum
sequence (Fig. 2). Further investigations will be necessary to confirm the isolate as a new
species of Oidiodendron. The isolates UFMGCB 2608 and UFMGCB 2692 showed similar
sequence identities with different uncultured and unidentified fungal species obtained from
soil samples in different regions. The isolate UFMGCB 2692 present 89% of identity with
the Helotiales fungus Leotiomycetes sp. (GenBank access number GQ153126), and it was
identified as Helotiolales sp. However, the taxonomic information given by the ITS
sequences was insufficient to identify at genus or order level the isolate UFMGCB 2608.
Metschnikowia australis was the prevalent yeast species associated with the thalli of the
seaweeds studied during this investigation and in the inner water of A. utricularis, showing
between 99 and 100% identities in the D1/D2 regions of the large subunit of the rRNA gene
when compared to the type strain of M. australis CBS 5847 (GenBank access number
U76526).
51
(a)
(b)
Myxotrichum cancellatum [AF062811] Oidiodendron echinulatum [AF062791] Oidiodendron cerealis [AF062788]
Oidiodendron setiferum [AF062805] Oidiodendron tenuissimum [AF307773] Myxotrichum setosum [AF062815] UFMGCB 2696
Oidiodendron truncatum [AF307775] Oidiodendron flavum [AF062792] Oidiodendron griseum [AY618676] Myxotrichum arcticum [AF062810]
Trametes versicolor [AF042324]
98
98
97
90
55
54
68
4855
0.1
UFMGCB 2608
Uncultured ascomycete [AY969487]
Fungal sp. [FJ235965]
Uncultured Pezizomycotina [DQ273336]
Epacris microphylla root associated fungus [AY268205]
Clathrosphaerina zalewskii [EF029222]
Lachnum clandestinum [U58636]
Helotiales sp. [AM924158]
Trametes versicolor [AF042324]
98
61
24
38
19
52
0.1
52
(c)
Fig. 2. Evolutionary trees showing the relationships among fungi (a) UFMGCB 2696, (b)
UFMGCB 2608, (c) UFMGCB 2692 and the next fungal sequences present in GenBank
databases. The tree was constructed based on the rRNA gene sequence of regions ITS1-
5.8S-ITS2 by using the neighbor-joining method. The numbers represent the percentage of
1,000 bootstrap replications in which a given branch appeared. The tree was rooted by
making Trametes versicolor [AF042324] as outgroup.
The other yeast isolates were identified as A. pullulans (isolated from D. anceps),
Cryptococcus carnescens (isolated from P. decipiens) and Rhodotorula mucilaginosa (both
isolated from A. utricularis). The yeast isolate UFMG-Ant 386 isolated from A. utricularis
presented a 34-nucleotide difference (6.8%) from the Antarctic yeast strain CBS 8928
(GenBank access number AY033640) and Leucosporidium antarcticum strain CBS5942
(GenBank access number AF189906). This strain forms cream-colored colonies on solid
media, and the cells are ovoidal to elongate. Fermentation is absent, and the following
carbon sources are assimilated: glucose, galactose, L-sorbose, maltose, sucrose, trehalose,
lactose, melibiose, melizitose, ethanol, glycerol, erythritol, D-mannitol, D-glucitiol and
succinate. Potassium nitrate, sodium nitrite and L-lysine are utilized as nitrogen source.
This Antarctic strain is not able to grow at temperatures below 20oC. Our molecular and
physiological results suggest that this yeast strain can represent a new species belonging to
the Leucosporidium clade.
Phialea strobilina [EF596821] Bisporella citrina [AF335454] Hyalodendriella betulae [EU040232] Rhizoscyphus ericae [AY394907]
Mycorrhizal fungal [AY394920] UFMGCB 2692
Leotiomycetes sp. [GQ153126] Ascomycota sp. [FJ039690]
Trametes versicolor [AF042324]
81
45
3638
28
18
0.1
53
Discussion
This is the first report about fungi associated with these Antarctic seaweeds. In our study,
the number of Antarctic algicolous fungi (75 isolates) was similar to those numbers found
associated with Fucus serratus L. (116 isolates), an algal species inhabiting temperate
regions (Zuccaro et al. 2003). The prevalent fungal species associated with the seaweeds
were G. pannorum (filamentous fungi) and M. australis (yeast). The genus Geomyces
belongs to Myxotrichaceae (Ascomycota) and comprises a very small proportion of the
fungal biota, with only four known species (Kirk et al. 2001), although with a widespread
distribution. G. pannorum is a keratinophilic and psychrophilic species and has a
ubiquitous distribution in the soils of Arctic and Antarctic regions (Mercantini et al. 1989).
This species is halotolerant (Poole and Price 1971) and moderately cellulolytic
(Kuthubutheen and Pugh 1979). According to Arenz et al. (2006), Geomyces spp. generally
have the ability to colonize and utilize different carbon sources. Zuccaro et al. (2008)
obtained two Geomyces isolates from fresh thalli of F. serratus from a rocky-shore site on
the northeastern side of Helgoland Island, Germany. The presence of G. pannorum
associated with seaweeds in the Antarctic suggests that this fungus could have an important
role in the decomposition and nutrient cycling of these algal species.
Fell and Hunter (1968) described the seawater yeast isolates from the Antarctic as M.
bicuspidata var. australis. Mendonça-Hagler et al. (1985), on the basis of the reduced
intervarietal fertility when crossed with M. bicuspidata var. bicuspidata and the unique
habitat in Antarctic seawater, proposed raising the variety australis to the rank of species.
This yeast species was also isolated from the stomach of the Antarctic krill Euphausia
superba (Donachie and Zdanowski 1998). Our results show that this yeast could be
widespread in the Antarctic ecosystem, and the seaweed thalli were described as a new
habitat for M. australis.
A. utricularis has a very distinct morphology, showing a vesiculous shape with small and
delicate thalli, unusual among the dominant robust and larger fronds and thalli present in
most species of Antarctic seaweeds. This species also has an inner seawater accumulation
that probably works as ballast against pullout by wave action or strong currents,
considering that the seaweeds are attached to the pebbles by a minute holdfast. The
54
occurrence of M. australis in the inner water of A. utricularis vesicle is noteworthy; the
yeast was found in high densities in water vesicles of this alga, and it is probably able to
use photosynthetic nutrients released by A. utricularis. Certainly, this is a new and
interesting habitat for a yeast species since the yeast is protected inside the alga against the
stressful conditions of the environment. The ecological association between M. australis
and A. utricularis merits further investigation.
We have found two isolates of A. psychrotrophicus. This genus is represented by only this
species, which was isolated from Antarctic soil and is related to Thelebolaceae family
(Stchigel et al. 2001). According to Arenz et al. (2006), this species appears to be endemic
to Antarctica, and our results suggest that this species is able to colonize other natural and
living substrates in the Antarctic ecosystem. The species Oidiodendron sp., Penicillium sp.,
Phaeosphaeria herpotrichoides, Rhodotorula mucilaginosa Cryptococcus carnescens
occurred in low frequencies associated with the seaweeds studied.
Species of Geomyces, Penicillium and Oidiodendron were previously found associated with
fresh thalli of F. serratus (Zuccaro et al. 2003, 2008). The marine Phaeosphaeria species
have been obtained from plants living in beach (Kohlmeyer et al. 1998), and in Antarctica,
associated with the grass D. antarctica (Rosa et al. 2009), but uncultured Phaeosphaeria
species (P. avenaria, P. nodorum, P. olivavea, and P. orae-maris) were detected in F.
serratus thalli by molecular methods (Zuccaro et al. 2008). These species are likely minor
components of the fungal communities of these three seaweed species. Fungal sp.
UFMGCB 2608 and Helotiales sp. UFMGCB 2692 may belong to common widespread
fungi, since their ITS sequences are similar to several unidentified fungi isolated from soils
in Europe and Antarctic. Otherwise, these isolates could represent identified fungal groups
that are not currently sequenced. More taxonomic and phylogenetic studies are necessary to
determine the correct identification of these fungal species. The filamentous fungus
Oidiodendron sp. 2696 and the yeast Leucosporidium sp. UFMG-Ant 386 could represent
new fungal species and could be endemic to the Antarctic ecosystems.
Our work shows that seaweeds in Antarctica are a rich source of fungi. Despite the fact that
these fungi have been isolated from living seaweed specimens, most of the fungal isolates
are probably saprobes decomposers of organic matter. These fungal species may have an
important role in the ecosystem and in organic matter recycling.
55
Acknowledgements
This study was made possible with financial and logistic support from the Brazilian
Antarctic Programme (PROANTAR). It is part of the API activity 403 "MIDIAPI
Microbial Diversity of Terrestrial and Maritime ecosystems in Antarctic Peninsula" under
the overall coordination of Dr. Vivian H. Pellizari, and contributes to the umbrella IPY
activities MERGE (Microbiological and Ecological Responses to Global Environmental
Changes in Polar Regions), CAML (Census of Antarctic Marine Life) and SCARMarBIN
(SCAR-Marine Biodiversity Information Network). The work was financially supported by
the Fundação of Amparo the Pesquisa of the Minas Gerais (FAPEMIG) and Conselho
Nacional of Desenvolvimento Científico and Tecnológico (CNPq).
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59
5.3. FUNGOS ASSOCIADOS ÀS MACROALGAS DO LITORAL DO PARANÁ
A partir dos talos das macroalgas Bostrychia radicans, Caloglossa leprieurii,
Gayralia oxysperma, Monostroma sp. e Padina gymnospora coletadas no litoral do Paraná
foram obtidos 379 isolados de fungos, destes 301 fungos filamentosos e 78 leveduras
(Tabela 2).
O complexo Monostroma é composto por macroalgas de talos verdes,
monostromático de importância econômica cuja taxonômica, filogenia e biodiversidade
ainda não foram bem esclarecidos (Pellizzari et al., 2007). Os gêneros Gayralia,
Monostroma e Protomonostroma, Chlorophyta, pertencem a este Complexo, que durante
décadas no Brasil foi identificado equivocadamente como Ulvaria (Pellizzari, 2005). Estas
macroalgas encontram-se em regiões temperadas e subtropicais e são consideradas
tolerantes e facilmente adaptáveis (Pellizzari, 2007). Estas clorofíceas Monostromáticas
ocorrem principalmente ao longo da zona entre-marés, com biomassa concentrada nas
regiões Sul e Sudeste da costa brasileira, concentrando-se em desembocaduras de estuários
e manguezais, podendo colonizar também áreas de costões rochosos (Oliveira, 1977).
Monostroma nitidum Wittrock apresenta alto valor nutricional, representando uma
das algas verdes mais consumidas no Japão (Critchley & Ohno, 1998). Além disso, G.
oxysperma está entre as poucas clorofíceas comestíveis apreciadas por seu sabor e valor
nutricional (Kida, 1990; Tseng, 1981; Pellizzari et al., 2007). Monostroma sp. e Gayralia
oxysperma do Paraná, apresentaram altas concentrações de cálcio, ferro e vitamina C
quando comparadas à outras espécies algais comestíveis (Cassolato et al., 2008) como é o
caso de Porphyra spp. usada na manufatura do sushi (Pellizzari et al., 2007). Além disto,
algas do Complexo Monostroma estão entre poucas clorofíceas comestíveis apreciadas por
seu valor nutricional (Acosta, 1977; Kida, 1990; Tseng, 1981).
Segundo Pellizzari (2007) Monostroma sp., encontrada no litoral do Paraná,
representa possivelmente uma nova espécie de macroalga. Aliado a isto, e ao elevado
potencial econômico para as indústrias alimentícias e de cosméticos, (Cassolato et al.,
2008; Pellizzari et al., 2008) justifica-se o estudo dos fungos associados, os quais podem
exercer interações ecológicas relevantes com esta macroalga.
60
Os mangues são conhecidos por abrigarem uma associação pouco diversificada e de
menor riqueza específica de algas. Nestes ambientes dominam espécies de algas
denominadas “Bostrychietum” encontradas principalmente sobre pneumatóforos. Dentre as
algas mais frequentes desta comunidade destacam-se Bostrychia ssp. e Caloglossa
leprieurii. Os gêneros Bostrychia e Caloglossa (Rhodophyceae) são amplamente
distribuídos nos ambientes tropicais e temperados ao redor do mundo. B. radicans é uma
das espécies mais difundidas do gênero (Zucarello & West, 2006). Habitam costões
rochosos e manguezais apresentando características peculiares para tolerância de diferentes
níveis de incidência de luz solar, salinidade, temperatura, nível de nutriente, períodos de
imersão/dessecação e intensidade do embate de ondas (De Oliveira, 2009). Sendo sua
fisiologia amplamente estudada no que se refere à tolerância de variação de salinidade e à
biogeografia (Zucarello & West, 2003; Cunha & Costa, 2002). No trabalho realizado por
King (1990) em manguezais de Nova Guiné, constatou-se a associação de macroalgas
"Bostrychia-Caloglossa". Esta também observada em trabalho realizado no Estado do
Maranhão (Caridade & Ferreira-Correa, 2007), e no presente trabalho.
De acordo com Yokoya et al. (1999), as macroalgas Bostrychia radicans e Caloglossa
spp. são típicas de regiões de mangue, têm seu desenvolvimento bastante comprometido com as
variações temporal e espacial relacionadas aos fatores ambientais, tais como, temperatura,
níveis de maré e tolerância a tempo de emersão. Segundo os autores, a variação de salinidade é
um fator determinante para a maioria das espécies. Os mesmos observaram ainda, que houve
alta na diversidade de espécies devido ao aumento de sedimentos com nutrientes de esgoto
doméstico.
Caloglossa leprieurii é amplamente difundida nos ambientes de clima tropical e
subtropical (Taylor, 1960). É especialmente abundante em ambiente estuarino (Caridade &
Ferreira-Correa, 2007, Kamiya et al., 2004), mas também pode ser encontrada em costões
rochosos, apresentando características similares aos do gênero Bostrychia (Caridade &
Ferreira-Correa, 2007).
Nos costões rochosos as comunidades algais são bastante ricas e diversificadas. As
algas pardas, Phaeophyceae, são 99% representadas por espécies marinhas. No Brasil as
algas pardas estão representadas por 88 táxons infragenéricos agrupados em 39 gêneros e
oito ordens (Horta et al., 2001). Padina gymnospora é amplamente difundida no Brasil e
61
em termos mundiais. Sendo alvo de estudos devido à sua importância ecológica e
características bioquímicas, incluindo a sua alta capacidade de acumular metais pesados,
como zinco (Salgado et al., 2005), e utilizada como bioindicador (Amando et al., 1996).
62
Tabela 2. Número de isolados de fungos obtidos das espécies de macroalgas coletadas no
litoral do estado do Paraná.
Espécie de macroalga N° de isolados
de leveduras
N° de isolados de
fungos filamentosos
N° total
de fungos
Gayralia oxyperma (Kützing) Vinogradova ex
Scagel et al.
19 123 142
Monostroma sp. 28 68 96
Bostrychia radicans (Montagne) Montagne 18 39 57
Padina gymnospora (Kutzing) Sonder. 13 24 37
Caloglossa leprieurii (Montagne) G. Martens 0 47 47
Total geral 78 301 379
Os isolados de leveduras algícolas obtidos foram agrupados em morfoespécies a
partir de suas características fisiológicas e morfológicas ou pelo polimorfismo genético
utilizando o iniciador M13. Após o agrupamento (dados não mostrados), um representante
de cada morfoespécie foi identificado por meio sequenciamento dos domínios D1/D2 do
rRNA gene. Associados as macroalgas do litoral do Paraná foram identificados as espécies
de leveduras dos gêneros Candida, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Geotrichum,
Hanseniaspora, Hortaea, Pichia, Rhodotorula e Trichosporon (Tabela 3). Todas as
espécies encontradas são leveduras frequentemente isoladas de águas continentais e
marinhas, e/ou associadas com plantas. Nenhuma das espécies pode ser considerada como
especifica das algas estudadas, e provavelmente representam uma biota leveduriforme
transitória destas algas, sendo de fonte alóctone. Estes resultados diferem dos encontrados
por Loque et al. (2009), que encontraram uma espécie de levedura, Metschnikowia
australis, prevalentemente associada com algas do litoral da Antártica.
Os fungos filamentosos associados às espécies de macroalgas do litoral do Paraná
não puderam ser identificados até o momento (Figura 5). Entretanto, estes isolados estão
em fase de agrupamento a partir de suas características morfológicas e um representante de
cada morfoespécie será identificado por meio das técnicas de biologia molecular.
Tabela 3. Identificação das leveduras associadas às macroalgas coletadas no litoral do estado do Paraná.
Espécie de macroalga UFMGCBa Espécie mais próxima Identidade
máxima (%)
Identificação Número de
isolados
Bostrychia radicans Bos6.2 Candida parapsilosis 99 C. parapsilosis 6
Bos1.4 Debaryomyces hansenii 97 D. hansenii 1
Bos10.6 Hanseniaspora uvarum 99 H. uvarum 1
Bos1.2 Rhodotorula mucilaginosa 95 Rhodotorula sp. 2
Gayralia oxysperma Gay9A1 Candida parapsilosis 99 C. parapsilosis 10
Gay18B1 Cystofilobasidium bisporidii 98 C. bisporidii 2
Gay5A1 Pichia sp. 96 Pichia sp. 1
Gay7A1 Trichosporon multisporum 98 T. multisporum 1
Monostroma sp. G6B1 Candida parapsilosis 99 C. parapsilosis 12
Ma20b1 Debaryomyces hansenii 99 D. hansenii 1
G7b1 Geotrichum silvicola 98 G. silvicola 1
G4b1 Hanseniaspora uvarum 99 H. uvarum 1
Me6m1 Hortaea werneckii 98 H. werneckii 2
Ma14 Pichia guilliermondii 96 Pichia sp. 1
G2a1 Rhodosporidium diobovatum 97 Rhodosporidium sp. 1
Ma4b1 Rhodotorula mucilaginosa 99 R. mucilaginosa 5
Padina gymnospora Pad2a1 Rhodotorula mucilaginosa 98 R. mucilaginosa 4
Pad4.a1 Candida parapsilosis 96 Candida sp. 5
Pad28b.1 Cystofilobasidium bisporidii 95 Cystofilobasidium sp. 2
64
Identificação realizada utilizando a busca no banco de seqüência BLASTn a partir da amplificação dos domínios D1/D2 do rRNA
gene. aColeção de Culturas de Microrganismos e Células da Universidade Federal da Minas Gerais.
Figura 5. Exemplos de isolados de fungos filamentosos obtidos das espécies de macroalgas
coletadas no litoral do estado do Paraná.
66
6. CONCLUSÃO INTEGRADA
• Os resultados obtidos neste trabalho representam o primeiro estudo de fungos
associados à macroalgas do litoral do Paraná e Antártica. Tal informação contribui
para o conhecimento da riqueza de espécies e distribuição destes fungos e sua
associação com seus respectivos hospedeiros.
• A riqueza de isolados encontrada no litoral do Paraná demonstra que as macroalgas
da região constituem reservatórios promissores para o isolamento de fungos
marinhos. Esta grande diversidade de fungos encontrados pode estar relacionada às
condições ambientais onde foram coletadas as algas tais como salinidade,
temperatura, pH e disponibilidade de nutrientes.
• As macroalgas da Antártica apresentaram uma baixa riqueza de espécies; entretanto
alguns fungos encontrados constituem potenciais espécies novas e espécies
endêmicas da região.
• Os resultados obtidos demonstram que macroalgas constituem uma fonte atrativa
para obtenção de fungos marinhos, os quais podem ser utilizados como modelos
para estudos taxonômicos, ecológicos, evolutivos e aplicações biotecnológicas.
67
7. PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste estudo abrem diferentes linhas de continuidade de estudos.
Dentre elas, é possível destacar:
• A descrição das possíveis novas espécies encontradas associadas às macroalgas da
Antártica.
• A realização de novas coletas para avaliar o grau de endemismo das espécies
encontradas em associação com as macroalgas da Antártica, distribuição geográfica
das espécies encontradas através de diferentes pontos amostrais da região.
• Melhorar a logística de coleta para aumentar o número de amostras das espécies de
macroalgas e utilização de índices ecológicos para estimar a diversidade de espécies
de fungos algícolas da região.
• Realizar novos levantamentos com a caracterização de fungos associados à
macroalgas presentes no Atlântico Sul até a Antártica.
• Utilizar os fungos algícolas obtidos e devidamente depositados em uma coleção de
culturas como fontes de produtos biotecnológicos; seja para obtenção de moléculas
bioativas ou na degradação de matéria orgânica e poluentes.
68
8. ANEXOS
Artigo submetido
• Loque CP, Medeiros AO, Pellizzari F, Oliveira E, Rosa CA, Rosa, LH. Fungal
community associated with seaweeds from Antarctica, submetido à Revista Polar
Biology (julho de 2009).
Resumos expandidos publicados em anais de congressos
• Loque CP, Medeiros AO, Pellizzari F, Oliveira E, Rosa CA, Rosa, LH. Marine
fungi associated to seaweeds from King George Island, Antarctic Peninsula. In: XI
Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental, 2008, Fortaleza. XI Encontro
Nacional de Microbiologia Ambiental, 2008.
• Rosa, LH., Vaz ABM, Vieira MLA, Loque CP, Medeiros AO, Brandão LR,
Santiago IF, Gonçalves VN, Pellizari FM, Oliveira EC, Caligiorne RB, Campolina
S, Zani CL & Rosa CA. Fungos em amostras na Antártica: diversidade e aplicações
tecnológicas. In: XVI Simpósio Brasileiro Sobre Pesquisas Antárticas, 2008, São
Paulo.
Resumos publicados em anais de congressos
• Casarino JE, Loque CP, Kozovits AR, Sanches MC, Rosa LH. Parâmetros
ecofisiológicos foliares em resposta a diferenças de luminosidade dentro da copa de
Eremanthus erythropappus. In: 59 Congresso Nacional de Botânica, 2008, Natal,
RN, 2008.
Resumos publicados em anais de fórum
• Loque, CP, Casarino, JE, Santiago, IF, Kosovits, AR & Rosa, LH. “Abundância de
fungos endofíticos em diferentes estratos Eremanthus erythropappus Macleish”. IV
Fórum de Microbiologia. Promovido pelo Departamento de Microbiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, no dia 14
de maio de 2008.
69
• Loque, CP, Medeiros, AO, Pellizzari, FM, Oliveira, EC, Rosa, CA & Rosa, LH.,
“Diversidade de fungos associados às macroalgas presentes em ecossistema
Antártico”. IV Fórum de Microbiologia. Promovido pelo Departamento de
Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais, no dia 14 de maio de 2008.
Resumos publicados em anais de workshop
• Loque CP, Medeiros AO, Pellizzari F, Oliveira E, Rosa CA, Rosa, LH. Marine
fungi associated to seaweeds from King George Island, Antarctic Peninsula.
Elaboração de aula e palestra
• Aula teórico-prática para a disciplina Métodos e Técnicas em Coletas de Campo,
para o curso de Ciências Biológicas Bacharelado. Com o tema “Mergulho
Científico”, realizado na UFOP no dia 5 de junho de 2009.
• Palestra para alunos da disciplina Esporte e Ecologia do Curso de Educação Física
da Faculdade Estácio de Sá, Belo Horizonte. Com o tema “Mergulho e Ecologia”.
Realizada na Mar A Mar, Escola de Mergulho no dia 30 de maio de 2009
• Aula para a disciplina Microbiologia Ambiental, CBI 251 (UFOP), para o curso de
Ciências Biológicas Bacharelado, 2° semestre de 2008. Com o tema “Fungos
associados à macroalgas”.
Participação em minicurso
• Medidas de Fotossíntese: Teoria e Prática na Fisiologia de Macroalgas, durante o II
Workshop de Novos Bioativos de Macroalgas. Manejo e Cultivo, Conservação,
Biotecnologia e Técnicas de Bioatividade. Realizado na cidade de Ilha Bela, SP,
durante os períodos de 26 a 29 de julho de 2009, com carga horária de 6 horas.
Participação em eventos
• II Workshop de Novos Bioativos de Macroalgas. Manejo e Cultivo, Conservação,
Biotecnologia e Técnicas de Bioatividade. Realizado na cidade de Ilha Bela, SP,
durante os períodos de 26 a 29 de julho de 2009.
70
• XI Encontro Nacional de Microbiologia Ambiental. Realizado na cidade de
Fortaleza, CE, de 04 a 07 de novembro de 2008.
• IV Fórum de Microbiologia. Promovido pelo Departamento de Microbiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, no dia 14
de maio de 2008. Carga horária 7 horas.
Bolsista CAPES REUNI
Discente responsável pela disciplina Métodos e Técnicas em Coletas de Campo,
para o curso de Ciências Biológicas Bacharelado, UFOP, 1°semestre 2009.
71
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