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UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
FACULDADE DE ENGENHARIA E ARQUITETURA
CURSO DE ENGENHARIA AMBIENTAL
Gabrielli de Oliveira Vaz
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Bacillus pumilus USANDO
FARELO DE TRIGO COMO SUBSTRATO
Passo Fundo, 2013.
1
Gabrielli de Oliveira Vaz
Produção de biossurfactante por Bacillus pumilus usando
farelo de trigo como substrato
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao
curso de Engenharia Ambiental, como parte
dos requisitos exigidos para obtenção do título
de Engenheiro Ambiental.
Orientador: Profª. Dra. Luciane Maria Colla
Passo Fundo , 2013.
2
Gabrielli de Oliveira Vaz
Produção de biossurfactante por Bacillus pumilus usando farelo
de trigo como substrato
Trabalho de Conclusão de Curso como requisito parcial para a obtenção do título de
Engenheiro Ambiental – Curso de Engenharia Ambiental da Faculdade de Engenharia e
Arquitetura da Universidade de Passo Fundo. Aprovado pela banca examinadora:
Orientador:_________________________
Luciane Maria Colla, Dra.
Faculdade de Engenharia e Arquitetura, UPF
Faculdade de Engenharia e Arquitetura, UPF
Vandré Barbosa Brião, Dr.
Faculdade de Engenharia e Arquitetura, UPF
Passo Fundo, 4 de novembro de 2013.
3
A T E S T A D O
Atesto para os devidos fins que a aluna Gabrielli de Oliveira Vaz, autor do Trabalho
de Conclusão intitulado “Produção de biossurfactante por Bacillus pumilus usando farelo de
trigo como substrato” realizou as alterações sugeridas pela banca examinadora no relatório
final.
Passo Fundo, 29 de novembro de 2013.
Profª. Dra. Luciane Maria Colla
4
AGRADECIMENTOS
Eu não sei a quem agradecer primeiro, e a ordem aqui, não tem maior ou menor grau
de importância, eu apenas quero agradecer de todo o meu coração a quem de alguma maneira
me ajudou na construção deste trabalho.
Primeiramente agradecer a Deus e a Nossa Senhora Aparecida pela vida, e por me
protegerem e iluminarem os meus caminhos.
Agradecer por todo o esforço, dedicação, apoio e amor dos meus pais Loreci de
Oliveira Vaz e Adão de Oliveira Vaz em todos os momentos da minha vida.
Agradecer a toda a minha família, em especial a minha avó Tereza, pelo total apoio
nos estudos e por sempre estarem presentes.
Ao meu namorado Rodrigo, por todo o amor, carinho, companheirismo, cuidado e
principalmente paciência, sempre.
Agradeço aos professores que contribuíram para o meu crescimento e por todo o
conhecimento passado durante o meu período acadêmico, em especial a minha orientadora
Professora Doutora Luciane Maria Colla, pela atenção, paciência e ajuda.
Ao Iziquiel Cecchin e ao Professor Cleomar pela ajuda.
Agradecer a amiga Marilda Ferreira dos Santos Zanfir, por toda a ajuda, paciência e
amizade, obrigada por todo o conhecimento laboratorial passado e por fazer parte da minha
vida.
Ao estudante Rafael Braido pela ajuda e minutos cedidos.
A Ellen Rodrigues pelo conhecimento passado, que possibilitou a execução deste
trabalho.
5
A todos os meus colegas de graduação, pela amizade e companheirismo.
A todos, os meus sinceros agradecimentos!
6
RESUMO
A biorremediação é um processo biotecnológico que utiliza o metabolismo de
microrganismos para eliminação rápida de poluentes presentes no ambiente ou a sua redução
a níveis de concentração aceitáveis. Uma das técnicas de biorremediação de resíduos oleosos
consiste no uso de biossurfactantes, os quais são metabólitos microbianos que tem por função
a de diminuir a tensão superficial e interfacial formando microemulsões entre os resíduos
oleosos e água, facilitando o processo de absorção do contaminante pelo microrganismo para
posterior degradação. O custo de produção de biossurfactantes é aproximadamente de 3 a 10
vezes maior que o custo de surfactantes químicos. Para a produção de biossurfactantes, o uso
de substratos mais baratos e solúveis em água, como por exemplo, os resíduos agroindustriais,
como o farelo de trigo, são alternativas que podem viabilizar a produção e consequentemente
reduzir custos. Objetivou-se utilizar o farelo de trigo como um substrato alternativo para a
produção em estado submerso de biossurfactante, utilizando para produção a bactéria Bacillus
pumilus. A produção foi realizada em meio base composto por farelo de trigo com a adição de
indutores (óleo diesel, gasolina e biodiesel) e fontes de nitrogênio (NH4NO3, ureia e NaNO2).
A produção de biossurfactantes foi avaliada pela determinação da tensão superficial nos
meios fermentados livres de células e através, das atividades emulsificantes A/O (água/óleo) e
O/A (óleo/água). O biossurfactante produzido foi capaz de reduzir a tensão superficial até 37
mN/m quando utilizado óleo diesel como indutor e ureia como fonte de nitrogênio. As
melhores atividades emulsificantes A/O foram obtidas quando utilizado o indutor biodiesel e
ureia como fonte de nitrogênio. As maiores atividades O/A foram obtidas com óleo diesel
como indutor e ureia como fonte de nitrogênio. Conclui-se que, o farelo de trigo pode ser
usado como substrato para a produção de biossurfactante utilizando como produtor a bactéria
Bacillus pumilus.
Palavras-chave: Biorremediação, fonte de nitrogênio, indutor.
7
ABSTRACT
Bioremediation is a biotechnological process which utilizes the metabolism of
microorganisms for rapid elimination of pollutants present in the environment or reduction to
acceptable levels of concentration. One technique for bioremediation of waste oil is the use of
biosurfactants, which are microbial metabolites whose function is to decrease surface and
interfacial tension between the microemulsion forming oily waste water, making the process
of absorption of the contaminant to the microorganism further deterioration. The cost of
production of biosurfactants is approximately 3 to 10 times greater than the cost of chemical
surfactants. For biosurfactant production , the use of less expensive water-soluble substrates ,
such as agro-industrial waste, such as wheat bran, are alternatives that can make possible the
production, and consequently reduce costs. This study aimed to use the wheat bran as an
alternative substrate for biosurfactant production in submerged state, using the bacterium
Bacillus pumilus production. The production was carried out in basic medium composed of
wheat bran with the addition of inducers (diesel, gasoline and diesel) and nitrogen source (
NH4NO3, urea and NaNO2 ). The biosurfactant production was evaluated by determination
of surface tension in the fermented media free of cells and through the activities emulsifying
facturers W/O ( water/oil) and O/W (oil/water). The isolated biosurfactant was able to reduce
the surface tension to 37 mN/m when used diesel oil as inducer and urea as nitrogen source.
The best emulsifying activities W/ O were obtained when using biodiesel inductor and urea as
nitrogen source. The highest activities O/W were obtained with diesel oil as inducer and urea
as nitrogen source. It is concluded that wheat bran can be used as substrate for biosurfactant
production using the bacterium as a producer Bacillus pumilus.
Keywords : Bioremediation , nitrogen source inductor.
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1Tubo de ensaio com emulsão O/A e emulsão A/O ..................................................... 28 Figura 2 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo
fermentativo para os experimentos que utilizaram óleo diesel como indutor ................... 29 Figura 3 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo
fermentativo para os experimentos que utilizaram biodiesel como indutor ...................... 30
Figura 4 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo
fermentativo para os experimentos que utilizaram gasolina como indutor ....................... 30
Figura 5 Gráfico de PARETO para a atividade emulsificante O/A ......................................... 37
Figura 6 Gráfico de PARETO para a atividade emulsificante A/O ......................................... 38
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Funções e aplicações industriais dos biossurfactantes............................................... 19 Tabela 2 Principais grupos de surfactantes de origem natural e sintética. ............................... 20 Tabela 3Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos ........................ 21 Tabela 4 Composição centesimal do farelo de trigo................................................................. 24 Tabela 5 Planejamento Fatorial Completo 3² utilizado para avaliar a influência da fonte de N e
indutor sobre a produção de biossurfactante por B. pumilus. ............................................ 26 Tabela 6 Concentração celular e redução da tensão superficial ............................................... 32
Tabela 7 pH do extrato livre de células .................................................................................... 33
Tabela 8 Atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo para os tempos inicial e em
72 horas. ............................................................................................................................. 34 Tabela 9 Adimensionais das atividades emulsificantes A/O e O/A para os diferentes
experimentos realizados no Planejamento Fatorial Completo 3² ....................................... 35 Tabela 10 ANOVA dos resultados de atividade emulsificante O/A em função das variáveis
estudadas ............................................................................................................................ 36
Tabela 11 Efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante óleo em água ...... 36 Tabela 12 ANOVA dos resultados de atividade emulsificante A/O em função das variáveis
estudadas ............................................................................................................................ 37 Tabela 13 Efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante A/O ..................... 37
10
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 11 2 DESENVOLVIMENTO .................................................................................................... 13
2.1 Revisão Bibliográfica ................................................................................................ 13 2.2 BIOTECNOLOGIA ................................................................................................... 13 2.3 BIORREMEDIAÇÃO ............................................................................................... 13
2.4 BIOSSURFACTANTES ........................................................................................... 15 2.4.1 FATORES QUE AFETAM A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE ........ 17
2.4.2 APLICAÇÕES DOS BIOSSURFACTANTES ................................................. 19
2.4.3 CLASSIFICAÇÃO E NATUREZA QUÍMICA DOS BIOSSURFACTANTES
20 2.4.4 MICRORGANISMOS PRODUTORES DE BIOSSURFACTANTES ............. 20 2.4.5 PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Bacillus pumilus .................... 22 2.4.6 MEIO DE CULTIVO ......................................................................................... 23
2.5 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 24
2.6 Resultados e discussões ............................................................................................. 29 2.6.1 Tensão superficial ............................................................................................... 29
2.6.2 Determinação da concentração de células .......................................................... 31 2.6.3 pH ....................................................................................................................... 32 2.6.4 Atividade emulsificante ...................................................................................... 33
3 Conclusão ........................................................................................................................... 39
11
1 INTRODUÇÃO
Os problemas ambientais tornam-se cada vez mais críticos e frequentes em
decorrência do aumento das atividades industriais e do crescimento desordenado da
população. A contaminação de ambientes, principalmente da água, vem crescendo cada vez
mais, tornando escassa a água de boa qualidade. Essa contaminação se dá pela introdução de
substâncias nocivas que acarreta vários efeitos negativos sobre a vida animal e vegetal
(NITSCHKE; PASTORE, 2003).
Uma das principais vias de poluição das águas é causada pelo petróleo e seus
derivados. Inúmeras técnicas físicas, químicas e biológicas vêm sendo desenvolvidas para a
remoção de petróleo derramado ou para a redução dos seus efeitos sobre o ecossistema.
Pesquisas realizadas demonstram como o meio ambiente reage a tais condições, intervenções
antropogênicas, revelando a significativa atuação de microrganismos na busca da
autopreservação e recuperação. Isso é feito através da capacidade que alguns microrganismos
possuem em degradar este tipo de poluente (NITSCHKE; PASTORE, 2002).
Desai e Banat (1997), afirmam que o custo para a produção de biossurfactantes é de
aproximadamente 3 a 10 vezes maior que o custo de surfactantes químicos, quando
comparados, o que por vezes tem impossibilitado seu uso em maior escala. Contudo, outros
substratos mais baratos e solúveis em água, como os resíduos agroindustriais, mostram-se
como uma excelente opção para a produção de biossurfactante.
Os biossurfactantes são compostos produzidos por diversos microrganismos que
apresentam grupos hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma molécula, o que lhes confere a
capacidade de agir em interfaces, aumentando a capacidade emulsificante, detergente,
lubrificante, solubilizante e dispersante (OLIVEIRA, 2010).
O Estado do Rio Grande de Sul é segundo maior produtor nacional na cultura de trigo.
As maiores regiões produtoras deste grão localizam-se principalmente na porção norte-
noroeste do Rio Grande do Sul, com isso, o farelo de trigo torna-se um subproduto
agroindustrial de fácil obtenção, podendo assim ser usado como um substrato alternativo e de
baixo custo para a produção de biossurfactante (SEPLAG, 2013).
O uso de substratos alternativos como os resíduos agroindustriais tornaria a produção
de biossurfactantes mais viável financeiramente aumentando o seu interesse comercial
(NITSCHKE; PASTORE, 2003).
12
O objetivo geral deste trabalho foi o uso de farelo de trigo como substrato alternativo
para a produção de biossurfactante por Bacillus pumilus em estado submerso. Os objetivos
específicos foram: a) Utilização de farelo de trigo como substrato para a produção de
biossurfactantes; b) Estudar a influência de diferentes indutores a produção de
biossurfactantes pela bactéria Bacillus pumilus; c) Estudar a influência de diferentes fontes de
nitrogênio para a produção de biossurfactantes por Bacillus pumilus.
13
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão Bibliográfica
2.2 BIOTECNOLOGIA
A biotecnologia, segundo Bueno (2008), é o conjunto de conhecimentos e técnicas que
permite aos pesquisadores o desenvolvimento de métodos, técnicas e meios associados a seres
vivos, macro e microscópios, onde, um dos objetivos é o de produzir produtos úteis e que
contribuam para a resolução de problemas relacionados com poluição de meios.
Muitas indústrias tradicionais estão enfatizando um redirecionamento para o
surgimento de novas tecnologias. Uma vez que a biotecnologia faz uso de diversos compostos
com propriedades tensoativas, seja na purificação de produtos biológicos ou em biocatálise e,
esta também necessita dar resposta (preventiva e curativa) aos problemas que os tensoativos
domésticos e industriais possam causar nas estações de tratamento de efluentes. Preocupações
ambientais têm orientado a seleção de tensoativos em que, testes de biodegradabilidade e de
toxicidade começaram a ter uma importância decisiva. Assim, existe a tendência de
aproximar-se a produção do natural, atendendo o princípio, segundo o qual a natureza, por si
só, não tem capacidade de desfazer o que o homem faz (ROCHA, 1999, MULLER; RUSSEL;
LUCASE, 1997, apud BUENO, 2008).
2.3 BIORREMEDIAÇÃO
De acordo com Silveira (2009), dentre os processos biológicos pode-se destacar a
biorremediação, que consiste na utilização de microrganismos ou dos seus componentes na
recuperação de áreas contaminadas, reduzindo ou eliminando os contaminantes, a mesma
pode ser aplicável em meios como águas superficiais, subterrâneas, solos, resíduos, efluentes
industriais em aterro ou áreas de contenção.
Nitschke e Pastore (2002) relatam que se tornaram numerosos os acidentes
relacionados com derramamentos ou vazamentos de petróleo causando muitos problemas
ecológicos e sociais. Para combater esses problemas são usados os conhecimentos das
14
propriedades dos biossurfactantes, que aumentam a interação superficial água/óleo,
facilitando o acesso de substratos hidrofóbicos às células. Com isso aceleram a degradação
dos componentes do petróleo por microrganismos e promovem a biorremediação de águas e
solos de uma forma mais eficaz.
Gaylarde et al., (2005) afirmam que as técnicas de biorremediação desenvolvidas são
ecologicamente mais adequadas e eficazes quando aplicadas em ambientes contaminados por
metais tóxicos e em meios contaminados por moléculas orgânicas de difícil degradação, tais
moléculas são denominadas “recalcitrantes”, que podem ser de origem natural, sintetizadas
pelo metabolismo biológico, ou sintéticas, produzidas por tecnologias industriais modernas e
estranhas ao ambiente natural, por estas razões denominadas “xenobióticas” (xenos, de grego
= estrangeiro).
Os processos biológicos de descontaminação utilizam, geralmente, microrganismos
autóctones (do próprio ambiente) ou introduzidos (estado nativo ou geneticamente
modificados), possuindo a capacidade de degradar compostos poluidores, que resultem em
produtos de degradação com estrutura menos recalcitrante em relação à molécula original, ou
na mineralização do xenobiótico (GAYLARDE et al., 2005).
Fatores podem influenciar à degradabilidade de compostos recalcitrantes, tais como
fatores físicos e químicos e fatores biológicos. A natureza física da matriz onde o composto é
encontrado, temperatura e luz são os principais parâmetros físicos com influência na
degradabilidade de compostos (BUENO, 2008).
Inúmeros são os fatores químicos que podem influenciar, acelerando ou reduzindo, a
taxa de degradação de um poluente. A composição química da matriz ambiental, que define a
capacidade nutritiva, o pH, umidade, teor de oxigênio dissolvido e a composição e estrutura
química do poluente, são fatores que merecem destaque (GAYLARDE et al., 2005).
Dentre os fatores biológicos, devem ser consideradas as condições de biodegradação
de um composto químico no meio ambiente, que depende, sobretudo, da presença de uma
população de microrganismos capas de metabolizar a molécula original e seus produtos de
degradação. Na biosfera atual, não existem, rotas enzimáticas catabólicas capazes de degradar
todos os compostos novos que a cultura humana sintetizou durante os últimos 100 anos
(GAYLARDE et al., 2005).
Enzimas que catabolizam a degradação de compostos naturais podem apresentar baixa
especificidade pelo seu substrato e, com isso, os xenobióticos com estrutura química
semelhante a compostos naturais podem ser reconhecidos pelo sítio ativo de enzima,
possibilitando, assim, que sejam quimicamente transformados. Quando o xenobiótico tem a
15
possibilidade de percorrer todos os caminhos de uma determinada rota catabólica enzimática,
ele se tornara uma possibilidade nutritiva para o microrganismo, tornando-se produtos de sua
degradação aproveitados pelo seu metabolismo construtivo e energético (GAYLARDE et al.,
2005).
A biorremediação e uma tecnologia complexa e sua implementação ocorre em etapas
que compreendem um estudo do ambiente, do tipo de contaminante, dos riscos e da
legislação. Inicialmente, é necessária uma caracterização do tipo e da quantidade do poluente,
bem como avaliações de natureza biológica, geológica, geofísica e hidrológica do sítio
contaminado (GAYLARDE et al., 2005).
Inicialmente, as avaliações biológicas ocorrem em laboratório, visando à otimização
da biodegradação do composto. São realisados testes de bioestimulação, que compreende na
adição de nutrientes e/ou surfactantes, e os testes de bioaumentação, que é baseado na adição
de culturas de microrganismos biodegradadores ou mediadores. Baseando-se nos dados
obtidos, é escolhida a técnica de biorremediação mais adequada para a situação e testes de
campo são realizados, para verificar a eficiência do processo in situ (GAYLARDE et al.,
2005).
2.4 BIOSSURFACTANTES
Os surfactantes têm como função reduzir a tensão superficial, ou seja, reduzir a
energia livre do sistema. Isso se da devido à substituição da maior parte das moléculas de alta
energia na interface diminuindo, assim, a tensão superficial e interfacial dos líquidos. Estes
são constituídos por uma porção hidrofóbica e um grupo hidrofílico, sendo conhecidos
também por substâncias anfifílicas (BUENO, 2008).
As moléculas surfactantes possuem duas propriedades fundamentais:
a) As moléculas saem da solução para se posicionar nas interfaces (ex: ar/líquido,
líquido/líquido) com orientação específica, que também pode ser conhecida como adsorção;
b) Formando agregados orientados, ou também chamados de micelas. Na formação de
micelas em solução, a mesma conferirá as propriedades de detergência e solubilização
(BUENO, 2008).
16
Estas propriedades fazem os surfactantes serem adequados para uma ampla gama de
aplicações industriais envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade
espumante, capacidade umectante, solubilização e dispersão de fases. A maior utilização dos
surfactantes se concentra na indústria de produtos de limpeza (sabões e detergentes), na
indústria de petróleo e na indústria de cosméticos e produtos de higiene (NITSCHKE;
PASTORE, 2002).
Os surfactantes existentes e disponíveis comercialmente, em sua maioria, são
sintetizados a partir derivados de petróleo. A crescente preocupação ambiental da sociedade
combinada com novas legislações de controle do meio ambiente levaram os cientistas a
pesquisar surfactantes biológicos como substitutos dos surfactantes já existentes
(NITSCHKE; PASTORE, 2002).
Biossurfactantes são compostos de origem microbiana que exibem propriedades
surfactantes, ou seja, tem por função diminuir a tensão superficial e interfacial formando
microemulsões nas quais os hidrocarbonetos podem solubilizar-se em água ou a água
solubilizar-se em hidrocarbonetos, possuindo alta capacidade emulsificante, são denominados
biossurfactantes que consistem de subprodutos metabólicos de bactérias, fungos e leveduras
(OLIVEIRA, 2010). Tais compostos são capazes de dividir interfaces entre fluídos com
diferentes graus de polaridade e pontes de hidrogênio tais como óleo/água ou ar/água
interfacial (NITSCHKE; PASTORE, 2002).
Os biossurfactantes possuem aplicações potenciais em diferentes setores industriais
como formulações farmacêuticas e cosméticas, petroquímica, médica, produtos alimentícios e
nas áreas de proteção ao meio ambiente (SINGH; CAMEOTRA, 2004 apud BUENO, 2008).
De um modo geral, os biossurfactantes possuem uma estrutura composta por uma
porção hidrofílica que consiste de aminoácidos, peptídeos, ânions ou cátions; mono, di ou
polissacarídeos e uma porção hidrofóbica consistindo de ácidos graxos saturados ou
insaturados (SINGH; CAMEOTRA, 2004 apud BUENO, 2008).
Os biossurfactantes produzidos por microrganismos procariontes ou eucariontes
podem possuir diferentes estruturas químicas, podendo ser de baixo ou alto peso molecular.
Estruturas de baixo peso molecular são geralmente glicolipídeos contendo os açúcares
ramnose, soforose e trealose e lipopeptídeos que consistem de polipeptídios curtos e os de alto
peso molecular como os biopolímeros que incluem lipoproteínas, complexos
lipopolissacarídeo-proteína e complexos polissacarídeo-proteínas-ácidos graxos,
biossurfactantes que possuem alto peso molecular está relacionado à produção de emulsão
17
(CHRISTOFI; IVSHINA, 2002; RON; ROSENBERG, 2002, LANG, 2002; SULLIVAN,
1998 apud BUENO, 2008).
2.4.1 FATORES QUE AFETAM A PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE
2.4.1.1 Fonte de carbono - indutor
Cerqueira (2007) relata que a fonte de carbono é um dos fatores mais importantes para
a produção de todo e qualquer biossurfactante, a composição do meio de cultivo vai
influenciar diretamente a quantidade e as propriedades dos biossurfactantes a serem
produzidos. As fontes de carbono que normalmente são usadas podem ser divididas em três
categorias: carboidratos, hidrocarbonetos e óleos vegetais.
Alguns microrganismos produzem biossurfactantes somente utilizando fontes de
carbono hidrofóbicas, hidrocarbonetos ou óleos vegetais, outros somente usam carboidratos, e
outros ainda usam diversas fontes de carbono, em combinação ou individualmente (KIM et al,
1997, apud CERQUEIRA, 2007).
2.4.1.2 Fonte de nitrogênio
A fonte de nitrogênio possui um papel importante na produção de biossurfactante,
podendo interferir na mesma, isso pode ocorrer tanto na quantidade como na composição do
biossurfactante, tais estudos, foram realizados para avaliar o efeito da fonte de nitrogênio na
produção de biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa e Rhodococcus spp., onde foram
verificadas que máximas produções somente puderam ser alcançadas quando nitrato foi
utilizado como fonte de nitrogênio (DESAI; BANAT, 1997).
Em estudos realizados por Makkar; Cameotra (1997) foram testadas diferentes fontes
de nitrogênio (0,3%) na produção de biossurfactantes por Bacillus subtilis, tais autores
concluíram que nitrato de sódio, nitrato de potássio e ureia foram as melhores fontes de
nitrogênio testadas usando tal microrganismo.
18
2.4.1.3 Fontes de outros nutrientes
Estudos indicam que a adição de MnSO4 resultou em significante aumento da
produção de biossurfactante e crescimento celular, enquanto CaCl2 e NaCl não apresentaram
efeito algum e que a maior concentração de biossurfactante foi encontrada para a
concentração de 50 mg.L-1 de MnSO4.4H2O, já para a fonte de fosfato, suprida por K2HPO4 e
NaH2PO4 na proporção em peso de 7:1, obteve-se um resultado diferente na produção de
biossurfactante quando fora comparado com o crescimento celular, a máxima concentração
celular somente foi obtida quando 9 g/L de fosfatos foram utilizados, enquanto que a maior
concentração de biossurfactante ocorreu quando utilizou-se 12 g/L de fosfatos (KIM et al.,
1997, citados por PINTO, 2008).
2.4.1.4 Fatores ambientais
Desai; Banat (1997) relatam que alguns fatores ambientais e diferentes condições de
crescimento como a temperatura, agitação e disponibilidade de oxigênio também podem
afetar a produção de biossurfactante através do seu efeito no crescimento ou atividade celular.
Segundo Turkovskaya et al. (2001), durante seus estudos da produção de
biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa em diferentes temperaturas, pH e agitação,
observaram que na ausência de agitação, pouco biossurfactante foi sintetizado a temperatura
ambiente, pois a tensão superficial do meio livre de células foi de 66,9 mN/m, não
apresentando atividade emulsificante. Quando se manteve o meio sem agitação e aumentando
a temperatura para 30ºC, a tensão superficial reduziu consideravelmente (37,4 mN/m),
entretanto a atividade emulsificante permenaceu baixa (10%). Quando se utilizou agitação em
shaker a 160 rpm e temperaturas de 20 e 30ºC, o crescimento celular e rendimento do
surfactante foram superiores, com redução da tensão superficial para 25 mN.m-1, e atividade
emulsificante de 60%. O ótimo pH para o crescimento do microrganismo e biossíntese de
surfactante foi de 7,0-8,0.
19
2.4.2 APLICAÇÕES DOS BIOSSURFACTANTES
As propriedades físico-químicas, características dos biossurfactantes, torna a indústria
petrolífera o maior mercado para os biossurfactantes, pois os mesmos seriam utilizados na
produção de petróleo ou incorporados em formulações de óleos lubrificantes. Outras
aplicações incluem biorremediação, dispersão no derramamento de óleos, remoção e
mobilização de resíduos de óleo em tanques de estocagem, recuperação melhorada de
petróleo, locais poluídos por compostos relacionados à liberação de hidrocarbonetos no
ambiente decorrente da atividade industrial (OLIVEIRA, 2010).
Os biossurfactantes com estrutura anfipática atuam sobre os hidrocarbonetos
emulsificando-os por meio da formação de micelas, que se acumulam na interface entre
líquidos de diferentes polaridades. Isto disponibiliza poluentes hidrofóbicos do solo como os
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) e conferem a capacidade de detergência,
emulsificação, lubrificação, solubilização e dispersão de fases (KUIPER et al., 2004; BICCA;
FLECK; AYUB, 1999 apud BUENO, 2008; DESAI; BANAT, 1997).
Os biossurfactantes atualmente estão sendo usados nos campos que incluem
formulação de produção de produtos de higiene e cosméticos, mineração, agricultura e as
indústrias de papel, têxtil, cerâmica, alimentos e a indústria farmacêutica, as quais podem ser
observadas na Tabela 1 (PIROLLO, 2006).
Tabela 1 Funções e aplicações industriais dos biossurfactantes.
Funções Campos de aplicação
Emulsionantes e
dispersantes
Cosméticos, tintas, biorremediação, óleos e alimentos
Solubilizantes Produtos farmacêuticos e de higiene
Agentes molhantes e
penetrantes
Produtos farmacêuticos, têxteis e tintas
Detergentes Produtos de limpeza e agricultura
Agentes espumantes Produtos de higiene, cosméticos e flotação de
minérios
Agentes espessantes Tintas e alimentos
Sequestrantes de metais Mineração
Formadores de vesículas Cosméticos e sistemas de liberação de drogas
Demulsificantes Tratamento de resíduos e recuperação de petróleo
Redutores de viscosidade Transporte em tubulações e oleodutos
(continua)
20
Dispersantes Misturas carvão-água e calcáreo-água
Fungicidas Controle biológico de fitopatógenos
Fonte: PIROLLO, 2006.
(conclusão)
2.4.3 CLASSIFICAÇÃO E NATUREZA QUÍMICA DOS BIOSSURFACTANTES
Os biossurfactantes são classificados de acordo com sua natureza bioquímica e por sua
origem microbiana, diferentemente dos surfactantes sintéticos que são classificados a partir de
sua natureza e através do seu grupo polar, de acordo com seus constituintes os
biossurfactantes são divididos em classes, na qual podem ser classificados como glicolipídeos,
lipopeptídeos, ácidos graxos, lipídeos neutros, fosfolipídeos e biossurfactantes poliméricos
(LIMA, 2007). A Tabela 2 descreve os principais grupos de surfactantes de origem natural e
sintética.
Tabela 2 Principais grupos de surfactantes de origem natural e sintética.
Fonte: LIMA, 2007.
2.4.4 MICRORGANISMOS PRODUTORES DE BIOSSURFACTANTES
NATURAIS SINTÉTICOS
Alquil poliglicosídeos Alcanolaminas
Biossurfactantes Alquil e aril éter carboxilatos
Amidas de ácidos graxos Alquil aril sulfatos
Aminas de ácidos graxos Alquil aril éter sulfatos
Glucamidas Alquil etoxilados
Lecitinas Alquil sulfonatos
Derivados de proteínas Alquil fenol etoxilados
Saponinas Aminoóxidos
Sorbitol e ésteres de sorbitan Betaínas
Ésteres de sacarose Co-polímeros de óxido de etil/propileno
Sulfatos de álcoois graxos
naturais
Ácidos graxos etoxilados
21
Bezerra (2006) afirma que o êxito ou fracasso em um processo fermentativo começa
com a escolha do microrganismo que pode ser selecionado de materiais contaminados ou não,
certos critérios devem ser considerados na hora da escolha das cepas, para que só assim haja
uma boa produção do metabólito que se deseja.
Uma grande variedade de microrganismos tem a capacidade de produzir
biossurfactantes, evidenciando que a quantidade e a qualidade são influenciadas pela natureza
do substrato e as condições de cultivo (SILVA, 2011).
Alguns critérios recebem destaque tais como, a cepa escolhida deverá ser
geneticamente estável, tenha uma alta velocidade de crescimento, seja pura (livre de
contaminantes), que os custos dos nutrientes sejam baratos, no presente trabalho, será
apresentado o uso de substratos agroindustriais, que tem por finalidade baratear a produção
(BEZERRA, 2006).
Ao escolher o microrganismo desejado, deve-se observar se o mesmo possui elevada
eficiência na conversão do substrato em produto, ou seja, quanto maior a afinidade do
microrganismo com o meio oferecido, maior será a eficiência de conversão, sendo assim,
resultando no acumulo do produto no meio, de forma a obter elevada concentração deste no
caldo fermentado (BEZERRA, 2006).
As classes de biossurfactantes e microrganismos produtores estão distribuídos entre
uma variedade de gêneros, apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3Principais classes de biossurfactantes e microrganismos envolvidos
TIPO DE BIOSSURFACTANTE MICRORGANISMO
GLICOLIPÍDIOS
- Ramnolipídios
- Roforolipídios
- Rrehalolipídios
Pseudomonas aeruginosa
Torulopsis bombicola, T. apicola
Rhodococcus erythropolis,
Mycobacterium sp.
LIPOPEPTÍDIOS E
LIPOPROTEÍNAS
- Peptídio-lipídio
- Viscosina
- Serrawetina
- Surfactina
- Subtilisina
- Gramicidina
- Polimixina
Bacillus licheniformis
Pseudomonas fluorescens
Serratia marcescens
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Bacillus brevis
Bacillus polymyxa
ÁCIDOS GRAXOS, LIPÍDIOS
NEUTROS E FOSFOLIPÍDIOS
(continua)
22
- Ácidos graxos
- Lipídios neutros
- Fosfolipídios
Corynebacterium lepus
Nocardia erythropolis
Thiobacillus thiooxidans
SURFACTANTES POLIMÉRICOS
- emulsan
- biodispersan
- liposan
- carboidrato-lipídio-proteína
- manana-lipídio-proteína
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter calcoaceticus
Candida lipolytica
Pseudomonas fluorescens
Candida tropicalis
SURFACTANTES
PARTICULADOS
- vesículas
- células Várias bactérias
Acinetobacter calcoaceticus
Fonte: PIROLLO, 2006.
(conclusão)
2.4.5 PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR Bacillus pumilus
Existem poucos dados e artigos disponíveis na literatura fazendo referência sobre a
produção de biossurfactantes por B. pumilus, o microrganismo estudado no presente trabalho.
Bugay (2009) revela que os primeiros estudos foram reportados por Morikawa et al.
(1992), que identificaram B. pumilus como sendo um novo produtor de surfactina, porém
outros autores testaram a produção de surfactina por diversas espécies de Bacillus e
concluíram que o biossurfactante produzido por B. pumilus é similar, mas não idêntico, à
surfactina.
Esse tipo de microrganismo se dá em solo, água, ar e em decomposição de tecidos
vegetais, são frequentemente encontrados em simbiose no desenvolvimento radicular de
plantas. Esta bactéria tem a capacidade de produzir inúmeras moléculas, tais como
biossurfactantes, proteases, lignocelulases e uma variedade de toxinas e antibióticos
(OLIVIERA, 2010).
De acordo com estudos realizados, a bactéria B. pumilus produz um lipopeptídeo da
família da surfactina, chamado de pumilacidina (OLIVEIRA, 2010).
Bueno (2008) isolou inúmeros microrganismos de diferentes amostras de solo
contaminado com hidrocarbonetos para avaliar a produção de biossurfactantes. Segundo a
pesquisa, o microrganismo que melhor produziu foi à bactéria identificada como Bacillus
pumilus utilizando como fonte de carbono baixas concentrações de sacarose, adicionado de
óleo diesel como indutor.
23
2.4.6 MEIO DE CULTIVO
O sucesso da produção industrial de biossurfactantes depende diretamente do
desenvolvimento de processos mais baratos e de uso de matérias primas de baixo custo, para
que assim, haja viabilidade na produção, uma vez que estas representam entre 10% a 30% do
custo total, (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998).
A escolha da fonte de carbono não pode ser somente induzida pelo seu custo,
disponibilidade e pelas características nutricionais do agente fermentativo, é extremamente
necessário que se leve em consideração o tipo de aplicação que se deseja do biossurfactante a
ser produzido. Logo, a fonte de carbono é um fator importante no processo de síntese, uma
vez que a alteração do substrato geralmente resulta em modificações da estrutura química do
biossurfactante, ocasionando variação das suas propriedades físico-químicas (LIMA, 2007).
Estudos apontam diferentes tipos de resíduos que podem ser usados como substratos
alternativos na produção de biossurfactantes. Ter o conhecimento da composição adequada de
nutrientes que permita o crescimento celular e o acumulo do produto de interesse é um dos
maiores problemas encontrados durante a escolha do resíduo a ser utilizado. O
estabelecimento de um processo biotecnológico a partir desses substratos alternativos também
apresenta outra dificuldade, que é a padronização devido ás variações naturais de composição
bem como os custos de transporte, armazenamento e tratamento prévio (NITSCHKE;
PASTORE, 2003).
Os resíduos agroindustriais possuem elevados teores de carboidratos e lipídeos,
mostrando-se como substratos interessantes para a produção de biossurfactantes (MAKKAR;
CAMEOTRA, 1998).
As informações descritas no presente trabalho sobre o trigo justificam-se devido ao
fato de que o resíduo gerado durante o processamento, beneficiamento do trigo, o farelo de
trigo, fora utilizado como substrato alternativo para a produção de biossurfactante.
O trigo ocupa o primeiro lugar em volume dos cereais mais produzidos no mundo, já
no Brasil, 90% da produção do grão ocorre no sul do país, destacando-se a região norte-
noroeste como a principal produtora do grão no estado do Rio Grande do Sul
(http://www.cnpt.embrapa.br).
24
Silva (2006) relata que o consumo do trigo não de se dá de forma direta,
primeiramente, os grãos devem ser submetidos a um processo de moagem e refinamento para
só assim possa ser obtida a farinha de trigo, tal processo gera um resíduo que é a casca do
grão ou também conhecido como farelo de trigo. A farinha refinada é comercializada para fins
industriais e alimentícios enquanto o farelo é comercializado de forma incorporada em rações
animais, tendo em vista ser um material rico em fibras e proteínas.
Durante o processo de moagem e refinamento do trigo, para a obtenção da farinha de
trigo, 28% do grão não é aproveitado, originando o farelo de trigo (PINTO, 2008).
Portanto, a utilização deste resíduo agroindustrial para a produção de biossurfactante
torna-se uma alternativa atrativa e de baixo custo. A Tabela 4 apresenta a composição
centesimal em base seca do farelo de trigo.
Tabela 4 Composição centesimal do farelo de trigo
CONSTITUINTES Composição centesimal (%)
Lipídios 3,43
Proteínas 19,79
Fibras 43,69
Carboidratos digeríveis 27,92
Cinzas 6,33
Fonte: RAUPP et al. (2000), apud PINTO 2008.
2.5 MATERIAL E MÉTODOS
2.5.1.1 Microrganismos e manutenção do inóculo
Decesaro et al. (2013) isolou o microrganismo utilizado neste trabalho, tais cepas
foram identificados como sendo a bactéria Bacillus pumilus, cepa originalmente isolada de
solo contaminado com óleo diesel.
A bactéria foi mantida em tubos inclinados contendo ágar padrão para contagem
(PCA) sob-refrigeração a 4ºC, sendo repicadas a cada 30 d.
25
2.5.1.2 Preparo do inóculo
O preparo do inoculo foi realizado em tubos de ensaio contendo 5 mL de meio
nutriente, pH 7, com incubação por 24 h a 30ºC. O meio nutriente foi composto por (g/L):
triptona 5, extrato de levedura 2,5 e glicose 1.
2.5.1.3 Fermentação submersa
O meio fermentativo foi composto por um extrato de farelo de trigo (5% p/v) (fonte de
carbono) adicionado de nutrientes. A partir da metodologia usada por Pinto (2008), ao extrato,
foram adicionados com nutrientes (mM): NH4NO3 (50,0), Na2HPO4 (3,0), KH2PO4 (3,0),
CaCl2 (0,007), MgSO4.7H2O (0,8), EDTA sódico (0,004) e FeSO4.7H2O (2,0).
Como indutores foram utilizados gasolina, óleo de soja e óleo diesel na quantidade de
1% e como fontes de nitrogênio foram usados NH4NO3 (4,0 g/L), ureia (3,0 g/L) e NaNO3
(4,25 g/L).
As fermentações foram realizadas em frascos Erlenmeyers de 125 mL contendo 5 mL
de inóculo e 45 mL de meio de cultivo. Amostragens foram realizadas no tempo inicial e 72
horas para a avaliação da produção de bioemulsificantes em mesa agitadora a 100rpm a uma
temperatura de 30ºC. As análises foram realizadas em triplicata.
2.5.1.4 Planejamento experimental
A Tabela 5 mostra o planejamento experimental utilizado para avaliar a influencia dos
fatores estudados.
26
Tabela 5 Planejamento Fatorial Completo 3² utilizado para avaliar a influência da fonte de N e
indutor sobre a produção de biossurfactante por B. pumilus.
2.5.1.5 Determinação da produção de biossurfactantes
Os caldos fermentados livres de células foram submetidos à análise de tensão
superficial, análise da concentração celular e atividades emulsificantes óleo em água e água
em óleo.
2.5.1.6 Determinação da tensão superficial
A medida da tensão superficial foi realizada, nas amostras centrifugadas, livres de
células, através do tensiômetro Krüss utilizando um anel de platina.
2.5.1.7 pH
O pH foi determinado através de leitura direta em pHmetro digital, utilizando eletrodo
de vidro.
Exp. X1 (Fonte de nitrogênio) X2 (Indutor)
1 -1 (NH4NO3) -1 (Óleo diesel)
2 0 (Ureia) -1 (Óleo diesel)
3 1 (NaNO3) -1 (Óleo diesel)
4 -1 (NH4NO3) 0 (Gasolina)
5 0 (Ureia) 0 (Gasolina)
6 1 (NaNO3) 0 (Gasolina)
7 -1 (NH4NO3) 1 (Biodiesel)
8 0 (Ureia) 1 (Biodiesel)
9 1 (NaNO3) 1 (Biodiesel)
27
2.5.1.8 Determinação da concentração de células
A concentração de células no meio fermentado foi realizada após a centrifugação de
um volume conhecido de amostra, 50 mL, feita secagem a 60ºC por 24h em cápsulas de
alumínio taradas.
2.5.1.9 Atividade emulsificante
As amostras foram centrifugadas e filtradas em papel filtro para a determinação da
atividade emulsificante.
As atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo foram determinadas
segundo metodologia proposta por Pinto et al. (2009), utilizando-se 3,5 mL de extrato e 2 mL
de óleo de milho. A mistura foi agitada em agitador Vórtex a 700 rpm por 1 min. Após 60 min
de repouso foi lida a absorbância do meio emulsificado óleo/água em espectrofotômetro a 610
nm. A absorbância da atividade emulsificante óleo/água foi obtida a partir da diminuição da
absorbância da amostra da absorbância do branco conforme a Equação 1. Após 24 h de
repouso foi realizada a leitura em paquímetro, da altura da emulsão água/óleo formada e da
altura total (altura da emulsão mais altura da camada remanescente de óleo), gerando a
atividade emulsificante água em óleo de acordo com a Equação 2. Três brancos foram
realizados, utilizando água no lugar da amostra e os extratos obtidos a partir dos meios de
cultivo.
A Figura 1 apresenta o esquema da formação das emulsões A/O e O/A no tubo de
ensaio. A formação da emulsão O/A é estimada pela leitura da absorbância 60 min após a
agitação, enquanto a estabilidade da emulsão A/O é estimada pela medida da altura da camada
superior emulsificada em comparação com a altura total de líquido do sistema.
28
Figura 1Tubo de ensaio com emulsão O/A e emulsão A/O
Fonte: PINTO et al (2009).
DABSABSAE brancoamostraAO )(/ Equação 1.
DEEAE brancoamostraOA )(/ Equação 2.
Onde:
AE = atividade emulsificante (AE);
O/A = óleo em água;
A/O = água em óleo;
ABS = absorbância;
E = relação centesimal entre a altura da emulsão água/óleo e a altura total;
D = diluição da amostra em água.
2.5.1.10 Tratamento dos dados
Para verificar o potencial do substrato utilizado bem como dos indutores e fontes de
nitrogênio para a produção de biossurfactante usando a bactéria B. pumilus como
microrganismo produtor, foram feitas comparações dos valores das atividades emulsificantes
água-óleo e óleo-água bem como os valores referentes à tensão superficial em cada
experimento.
Os resultados de atividade emulsificante obtidos a partir dos experimentos do
planejamento experimental foram tratados por análise de variância (ANOVA) a um nível de
significância de 5%, através do programa Statistica 6.0.
29
2.6 Resultados e discussões
2.6.1 Tensão superficial
A determinação da tensão superficial foi utilizada como indicador qualitativo da
produção de biossurfactante. Oliveira (2010) afirma que quanto maior for à concentração do
tenso-ativo no meio, maior será a redução da tensão superficial. A tensão superficial obtida
nos meios de fermentação para os experimentos que utilizaram óleo diesel (-1), gasolina (0) e
biodiesel (1) podem ser observados nas Figuras 2, 3 e 4.
Os resultados obtidos referentes à tensão superficial, utilizando farelo de trigo como
meio base para a fermentação submersa e B. pumilus como microrganismo produtor, foram
significativos para os indutores testados, bem como para as fontes de nitrogênio.
Figura 2 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo
fermentativo para os experimentos que utilizaram óleo diesel como indutor
30
Figura 3 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo
fermentativo para os experimentos que utilizaram biodiesel como indutor
Figura 4 Tensão superficial dos meios de fermentação no início e fim do processo
fermentativo para os experimentos que utilizaram gasolina como indutor
Os resultados mostram que o meio composto pelo indutor óleo diesel acrescido de
ureia como fonte de nitrogênio obteve uma redução na tensão superficial para 37 mN/m. Esse
resultado indica que a bactéria Bacillus pumilus produz um biossurfactante com alto poder
redutor de tensão superficial.
31
Os experimentos que utilizaram biodiesel como indutor apresentaram redução da
tensão superficial, porém, com a utilização de nitrato de sódio como fonte de nitrogênio, onde
a tensão superficial reduziu para 42 mN/m. Usando gasolina como indutor não foi observada
redução da tensão superficial.
De acordo com a literatura, os microrganismos para serem considerados bons
produtores de biossurfactantes devem reduzir a tensão superficial do sobrenadante em relação
com a da água abaixo de 40 mNm-1
e em torno de 35 mNm-1
(DESAI; BANAT, 1997;
BATISTA et al., 2006).
Ambos os resultados mostram-se mais expressivos que o encontrado por Bento e
colaboradores (2003), onde o valor da tensão superficial do biossurfactante produzido por
Bacillus pumilus, utilizando meio de cultura a base de sais e extrato de levedura como fonte
de carbono, foi de 49,5 mN/m.
Comparando-se os resultados obtidos no presente trabalho, os mesmos mostram-se
superiores aos encontrados de tensão superficial por Oliveira (2010), que obteve valores de
tensão superficial de 45 mN/m utilizando Bacillus pumilus e óleo residual de fritura na
concentração de 2 % em 24 horas de fermentação e 5 % em 48 horas e 96 horas de
fermentação. Utilizando melaço a melhor redução da tensão superficial foi nas concentrações
de 4 e 5 % em 48, 72 e 96 horas de fermentação no valor de 42 mN/m.
Bugay (2009) obteve a maior redução de tensão superficial utilizando glicerol e
glucose como fonte de carbono, para as cepas de B. pumilus e B. subtilis, onde a tensão inicial
era de 58mN/m reduzida a 51,4 mN/m e 49,7 mN/m respectivamente.
Segundo Makkar e Rockne (2003), o biossurfactante também é uma fonte de carbono
e muitas vezes mais assimilável que a fornecida para a sua produção, portanto, o aumento na
tensão superficial pode ser explicado pelo fato dos isolados possivelmente terem consumido o
biossurfactante por elas inicialmente sintetizado, permitindo assim a continuidade do
crescimento dos isolados, consequentemente aumentando a tensão superficial.
O uso do farelo de trigo como substrato alternativo para a produção de biossurfactante
quando acrescido de fontes de nitrogênio tais como ureia e nitrato de sódio e indutores como
óleo diesel e biodiesel apresentaram redução na tensão superficial.
2.6.2 Determinação da concentração de células
32
A Tabela 6 mostra os valores referentes à concentração de células obtidas pelos
experimentos em seus respectivos tempos.
Tabela 6 Concentração celular e redução da tensão superficial
Tempo
Exp. Fonte de
nitrogênio Indutor
0
horas(g/mL)
72 horas
(g/mL)
% aumento
na
concentração
de células
%
redução
da TS*
1 NH4NO3 óleo diesel 0,198 0,436 120 4,4
2 Ureia óleo diesel 0,218 0,467 114 19,8
3 NaNO3 óleo diesel 0,194 0,386 99,0 9,2
4 NH4NO3 Gasolina 0,203 0,219 7,9 -
5 Ureia Gasolina 0,194 0,214 10,3 -
6 NaNO3 Gasolina 0,190 0,201 5,8 0,9
7 NH4NO3 Biodiesel 0,289 0,389 34,6 4,7
8 Ureia Biodiesel 0,292 0,448 53,4 7,6
9 NaNO3 Biodiesel 0,303 0,401 32,3 6,3
*TS – Tensão superficial
Pode-se observar que no tempo de 72 horas, o experimento que fez uso do indutor óleo
diesel e fonte de nitrogênio nitrato de amônia obteve o resultado mais expressivo de
concentração celular, atingindo 120% de crescimento celular, comparando os resultados
obtidos para a redução da tensão superficial, o experimento utilizando o indutor óleo diesel e
a fonte de nitrogênio a ureia obteve o melhor resultado, com isso, podemos afirmar que o
crescimento do microrganismo não influenciou na redução da tensão superficial.
Em testes feitos em meio modelo para produção de biossurfactante utilizando como
microrganismo produtor a bactéria Bacillus subtilis, Bueno (2008) afirma que o crescimento
celular é diretamente proporcional à produção de biossurfactante e que, por sua vez, está
relacionada à diminuição da tensão superficial e ao índice de emulsificação.
2.6.3 pH
Os valores obtidos do pH para os diferentes extratos livres de células avaliados podem
ser observados na Tabela 7, que apresenta os valores referentes a fermentação 0h e 72 horas.
33
Tabela 7 pH do extrato livre de células
Experimento Fonte de nitrogênio Indutor 0 horas 72 horas
1 NH4NO3 óleo diesel 7,0 7,2
2 Ureia óleo diesel 7,0 7,5
3 NaNO3 óleo diesel 7,0 7,0
4 NH4NO3 Gasolina 6,8 6,8
5 Ureia Gasolina 7,0 7,0
6 NaNO3 Gasolina 7,2 7,1
7 NH4NO3 Biodiesel 7,4 7,2
8 Ureia Biodiesel 7,1 7,3
9 NaNO3 Biodiesel 6,7 6,9
Turkovskaya et al. (2001) observou que durante seus estudos da produção de
biossurfactante por Pseudomonas aeruginosa o ótimo pH para o crescimento do
microrganismo e biossíntese de surfactante foi de 7,0-8,0.
Os resultados apresentados sugerem que no experimento que o pH variou de 7 no
tempo 0 horas à 7,5 no tempo de 72 horas, obteve-se a maior redução na tensão superficial.
Observa-se então que o ótimo pH para a produção de biossurfactante em meio contendo farelo
de trigo como substrato, óleo diesel como indutor e ureia como fonte de nitrogênio e usando a
bactéria Bacillus pumilus como microrganismo produtor, que o pH sugerido seja o que
encontre-se em uma faixa de 7 à 8.
2.6.4 Atividade emulsificante
A Tabela 8 apresenta os resultados de atividade emulsificante óleo em água e água em
óleo para os experimentos do Planejamento Fatorial Completo 32.
34
Tabela 8 Atividades emulsificantes óleo em água e água em óleo para os tempos inicial e em
72 horas.
*Resultados média ± desvio padrão
As maiores atividades emulsificantes O/A foram encontradas no tempo de 72 horas,
apresentado na Tabela 8, ambas as atividades utilizando óleo diesel como indutor, porém
diferentes fontes de nitrogênio. A maior atividade ocorre quando ao meio fora adicionado
uréia como fonte de nitrogênio (1,201±0,027 UE) e óleo diesel como indutor.
Com relação às AE A/O, os melhores resultados foram obtidos no tempo de 72 horas.
O experimento que apresentou o resultado mais expressivo foi o que fora adicionado biodiesel
como indutor e uréia como fonte de nitrogênio, (28,482±0,572 UE).
Bueno (2008) utilizou vários microrganismos isolados de amostras de solo
contaminado com hidrocarbonetos para avaliar a produção de biossurfactantes. Nesta pesquisa
o microrganismo que melhor produziu foi à bactéria identificada como Bacillus pumilus
utilizando como fonte de carbono baixas concentrações de sacarose, adicionado de óleo diesel
como indutor.
Bento e colaboradores (2003) estudaram a caracterização dos biossurfactantes
produzidos por populações microbianas de solos dos Estados Unidos e da China
contaminados com óleo diesel. Dentre as bactérias produtoras o B. pumilus foi à bactéria que
reduziu significativamente a tensão superficial, e aumentou a emulsificação em 59%.
Biossurfactantes produzidos por Bacillus pumilus em amostra isolada a partir de resíduos de
óleo (CALVO et al., 2008), demonstraram ser esta bactéria um agente promissor para
aplicação ambiental.
2.6.4.1 Análise de variância
Exp. Fonte de
nitrogênio Indutor
AE O/A (UE)* AE A/O (UE)*
0 h 72 h 0 h 72 h
1 NH4NO3 óleo diesel 0,458±0,046 0,564±0,030 26,192±0,455 25,522±0,609
2 Ureia óleo diesel 0,316±0,213 1,201±0,027 24,665±0,783 24,615±0,614
3 NaNO3 óleo diesel 0,388±0,576 1,286±0,123 21,960±0,248 22,905±0,000
4 NH4NO3 gasolina 0,428±0,049 0,357±0,080 25,208±1,290 24,613±0,354
5 Ureia gasolina 0,423±0,059 0,614±0,068 24,167±0,327 22,284±0,522
6 NaNO3 gasolina 0,261±0,039 0,545±0,057 24,589±0,651 25,362±0,092
7 NH4NO3 biodiesel 0,183±0,011 0,329±0,068 24,572±0,5427 24,578±0,133
8 Ureia biodiesel 0,570±0,186 0,459±0,139 22,138±0,581 28,482±0,572
9 NaNO3 biodiesel 0,404±0,056 0,219±0,067 22,548±0,772 29,174±0,790
35
As análises de variância (ANOVA) apresentadas nas Tabelas 10 e 12 foram
construídas a partir dos dados apresentados na Tabela 9, onde podem ser observados os
valores adimensionais obtidos para as atividades emulsificantes O/A e A/O para todos os
experimentos, relacionando-se os resultados obtidos no tempo de 72 h em função do tempo
inicial. A partir da análise de variância foi possível obter as Tabelas 11 e 13 que representam
os efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante O/A e A/O,
respectivamente.
Tabela 9 Adimensionais das atividades emulsificantes A/O e O/A para os diferentes
experimentos realizados no Planejamento Fatorial Completo 3²
Exp. Fonte de
nitrogênio
Indutor AOAdm OAAdm
1 NH4NO3 óleo diesel 0,970935 1,28833
2 NH4NO3 óleo diesel 0,991017 1,046967
3 NH4NO3 óleo diesel 0,961948 1,391101
4 Ureia óleo diesel 0,942126 15,55118
5 Ureia óleo diesel 1,032257 2,566667
6 Ureia óleo diesel 1,021319 3,020356
7 NaNO3 óleo diesel 1,040273 4,0625
8 NaNO3 óleo diesel 1,032139 3,01847
9 NaNO3 óleo diesel 1,057207 2,997778
10 NH4NO3 gasolina 0,949976 0,80593
11 NH4NO3 gasolina 0,980222 2,872017
12 NH4NO3 gasolina 1,083247 0,993348
13 Ureia gasolina 0,941447 1,479058
14 Ureia gasolina 0,895239 1,473552
15 Ureia gasolina 0,928907 1,412245
16 NaNO3 gasolina 0,99172 1,911263
17 NaNO3 gasolina 1,150422 1,772059
18 NaNO3 gasolina 0,961198 2,715596
19 NH4NO3 biodiesel 1,008951 1,335052
20 NH4NO3 biodiesel 0,941084 2,17033
21 NH4NO3 biodiesel 1,04799 1,94186
22 Ureia biodiesel 1,246762 0,546512
23 Ureia biodiesel 1,326594 1,5
24 Ureia biodiesel 1,287581 0,646503
25 NaNO3 biodiesel 1,388859 0,52381
26 NaNO3 biodiesel 1,219739 0,760925
27 NaNO3 biodiesel 1,27515 0,376087
36
Tabela 10 ANOVA dos resultados de atividade emulsificante O/A em função das variáveis
estudadas
Variáveis Soma dos
quadrados
Grau de
liberdade
Quadrado
médio F p
(1)FN (L) 1,0241 1 1,02414 0,143877 0,708093
*FN (Q) 11,0331 1 11,03307 1,549981 0,226237
(2)ind (L) 35,1185 1 35,11854 4,933629 0,036943
*ind (Q) 3,5647 1 3,56474 0,500793 0,486582
Erro 156,6003 22 7,1182
Total SS 207,3408 26
ANOVA; Var.:oa; R-sqr=,24472; Adj:,1074 *FN - Fonte de nitrogênio; *ind- indutor
Tabela 11 Efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante óleo em água
Efeito t(22) P
Média / Interc. 2,22887 4,34092 0,000262
(1)*FN (L) 0,47706 0,37931 0,708093
FN (Q) 1,35604 1,24498 0,226237
(2)*ind (L) -2,79359 -2,22118 0,036943
ind (Q) -0,77079 -0,70767 0,486582
*FN - Fonte de nitrogênio; *ind- indutor
Verifica-se que a variável indutor foi significativa sobre a AE óleo em água (p<0,05).
O efeito do indutor foi negativo, ou seja, houve diminuição da atividade emulsificante óleo
em água passando-se do nível inferior para o superior desta variável.
As Figuras 5 e 6 apresentam o gráfico de Pareto para o efeito das variáveis estudadas.
O eixo Y exibe as variáveis independentes ou as interações entre as variáveis, no eixo X, tem-
se o valor absoluto do efeito estimado, calculado pela razão entre os efeitos estimados e seus
respectivos desvios padrões. Todos os valores que aparecem nos gráficos de Pareto que se
situem à direita do valor p de 0,05 são de elevada significância estatística (estatisticamente
significantes). Estes valores concordam com os dados das tabelas de ANOVA.
37
,3793111
-,707667
1,244982
-2,22118
p=,05
Estimativa de efeito padronizado (valor absoluto)
(1)FN(L)
ind(Q)
FN(Q)
(2)ind(L)
,3793111
-,707667
Figura 5 Gráfico de PARETO para a atividade emulsificante O/A
Tabela 12 ANOVA dos resultados de atividade emulsificante A/O em função das variáveis
estudadas
Variáveis Soma dos
quadrados
Grau de
liberdade
Quadrado
médio F p
(1)*FN (L) 0,077531 1 0,077531 9,45122 0,005549
FN (Q) 0,000685 1 0,000685 0,08355 0,775243
(2)ind (L) 0,159328 1 0,159328 19,42245 0,000223
*ind (Q) 0,076101 1 0,076101 9,27688 0,005929
Erro 0,180472 22 0,008203
Total SS 0,494118 26
ANOVA; Var.:ao; R-sqr=,63476; Adj:,56835; *FN - Fonte de nitrogênio; *ind- indutor
Tabela 13 Efeitos estimados das variáveis sobre a atividade emulsificante A/O
Efeito t(22) p
Média / Interc. 1,062011 60,92803 0<0,001
(1)*FN (L) 0,13126 3,07428 0,005549
FN (Q) 0,010688 0,28906 0,775243
(2)ind (L) 0,188165 4,40709 0,000223
*ind (Q) -0,11262 -3,0458 0,005929
*FN - Fonte de nitrogênio; *ind- indutor
Em relação às atividades emulsificantes água em óleo, as variáveis fonte de nitrogênio
e indutor influenciaram esta variável (p<0,05). Os efeitos das variáveis foram positivos, ou
38
seja, passando-se dos níveis inferior (-1) para (1) das variáveis, houve aumento das atividades
emulsificantes água em óleo.
,289058
-3,0458
3,074284
4,40709
p=,05
Estimativa de efeito padronizado (valor absoluto)
FN(Q)
ind(Q)
(1)FN(L)
(2)ind(L)
,289058
-3,0458
3,074284
4,40709
Figura 6 Gráfico de PARETO para a atividade emulsificante A/O
39
3 Conclusão
A bactéria Bacillus pumilus foi capaz de produzir biossurfactantes utilizando farelo de
trigo como meio base. O óleo diesel e o biodiesel foram os melhores indutores. Entretanto,
quando se faz referência à redução da tensão superficial, o meio composto por farelo de trigo
acrescido do indutor óleo diesel obteve melhores resultados quando comparados aos obtidos
no experimento contendo biodiesel, portanto, o óleo diesel mostrou-se uma fonte indutora
mais eficiente para a redução da tensão superficial.
Com relação às atividades emulsificantes A/O e O/A, a fonte indutora que mais
influenciou a atividade foi o óleo diesel e o biodiesel, apresentando melhores resultados
perante aos demais indutores.
Dentre as fontes de nitrogênio testadas a ureia foi a que apresentou os melhores
resultados.
O crescimento microbiano não influenciou na produção e consequentemente na
redução da tensão superficial do biossurfactante produzido. Portanto, o farelo de trigo é um
substrato alternativo que pode ser usado para a produção de biossurfactante pela bactéria
Bacillus pumilus em fermentação submersa, óleo diesel e biodiesel podem ser usados como
indutores, bem como a ureia como fonte de nitrogênio, ambos acrescidos ao meio de
fermentação composto por farelo de trigo.
Este trabalho foi importante no sentido que a literatura demonstra que a produção de
biossurfactantes por bactérias vem ganhando cada vez mais espaço e importância. Porém, a
produção de biossurfactante em escala industrial ainda é reduzida, devido aos custos
envolvidos em seu processo produtivo. O uso de substratos alternativos como o farelo de
trigo, pode ser uma alternativa para reduzir custos de produção.
40
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