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Anais do XX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do V Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
22 e 23 de setembro de 2015
IDENTIFICAÇÃO DE CUPINS NA REGIÃO DE CANANÉIA, LITORAL SUL DO ESTADO DE SÃO PAULO
Fernando Salgado Camorani
Faculdade de Ciências Biológicas Centro de Ciências da Vida
Edmilson Ricardo Gonçalves Grupo de Pesquisa: Ecologia, Biologia Molecu-
lar e Filogenia de cupins e formigas Centro de Ciências da vida [email protected]
Resumo: O número de espécies em uma ilha é decorrente das taxas de migração e extinção locais, tornando este ambiente muito particular quanto as espécies que nele ocorrem. No Brasil, pouco se sabe sobre as espécies de Isoptera que ocorrem em ambientes insulares, quando comparados às regiões costeiras. Assim, o objetivo desse trabalho foi identificar, por taxonomia clássica e molecular, as espécies de cupins que ocorrem na Ilha Comprida, litoral sul do estado de São Paulo. Nossa hipótese é de que poucos dados moleculares estão disponibilizados no GenBank referentes as espécies de cupins de ecosssitemas brasileiros. Para tanto, foram realizadas duas coletas e amostrados 29 ninhos. Primeiramente, as espécies foram identificadas com uso de chaves taxonômicas e por comparação com aquelas depositadas no Museu de Zoologia da USP. O DNA dos cupins foi extraído e a região do gene coI foi amplificada por PCR. Os produtos do PCR foram sequenciados e comparados aos do GenBank (NCBI). Todas os cupins coletados foram identificados como pertencentes à Familia Termitidae, representada por três gêneros: Nasutitermes, Diversitermes e Microcerotermes. O código de barra de DNA permitiu a identificação até gênero, visto que é a primeira vez que essas espécies têm seus genes coI sequenciados. Não foram encontradas, até o momento, sequencias similares depositadas no GenBank, comprovando nossa hipótese. Para os representantes do gênero Microcerotemes não foi definida a espécie, tanto por taxonomia clássica quanto por molecular, sugerindo uma provável nova espécie. Palavras-chave: térmita; taxonomia molecular; cu-pim
Área do Conhecimento: Ciências Biológicas – Bio-logia Molecular
1. INTRODUÇÃO Ilha Comprida apresenta uma extensão de
72 km que se separa do continente sul americano devido à presença de canais lagunares. É uma regi-ão que apresenta uma planície resultante de trans-gressões e regressões durante períodos anteriores e ações geológicas dinâmicas que afetam ainda esta região [1]. Apresenta um solo arenoso recober-to com serrapilheira e abriga um conjunto de flora, praias e dunas muito importantes. A Ilha Comprida apresenta uma função direta no complexo estuari-no-lagunar de Cananéia, pois é incumbida de formar as condições ambientais nesta laguna [2]. Essa ilha apresenta um ecossistema bem complexo, incluindo vegetação de dunas, mangues, restinga, praias e mata atlântica, além de abrigar alguns exemplares da fauna ameaçados de extinção [3].
Um estudo realizado com anuros mostrou que a região costeira de Cananéia atualmente é resultado de cinco eventos geológicos: o primeiro teve como característica a transgressão (Pleistoce-no), onde o nível do mar ergueu-se cerca de 8 m acima do nível atual, levando a um isolamento das ilhas do complexo Lagamar. Seguido a isso, uma fase de regressão aconteceu, ainda no Pleistoceno e cerca de 17.000 anos atrás o nível do mar chegou a 110 m abaixo do atual. No quarto estágio, outro quadro de transgressão, isolando as ilhas e no quin-to estágio o nível do mar se estabilizou ao nível atu-al [4].
Os cupins apresentam grande importância na manutenção do meio ambiente, participando em processos de fluxo de nutrientes bem como decom-posição. Além disso, os cupins são importantes para o fluxo de minerais e aumento da porosidade do solo [5]. Segundo Constantino, a região neotropical con-templa cinco famílias de cupins (Kalotermitidae, Rhi-notermitidae, Serritermitidae, Stolotermitidae e Ter-mitidae). A família Termitidae se divide em oito sub-
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famílias, porém na região neotropical encontram-se somente Apicotermitinae, Nasutitermitinae, Synter-mitinae e Termitinae. Levando isto em conta, o Brasil apresenta cerca de 92 gêneros e 559 espécies. Até 1999 foram descritas cerca de 2.750 espécies de cupins nas regiões tropicais do planeta, sendo que no Nordeste brasileiro somente 28 espécies de cupins foram registradas [6]. O estudo de cupins na região brasileira é muito escasso e poucas sequên-cias de DNA relativo ao gene citocromo oxidase se encontram depositadas no banco de dados GenBank (NCBI). Atualmente, somente 14 espécies apresen-tam sequências depositada no GenBank (NCBI.nlm.nih.gov) relativo ao gene citocromo oxi-dase subunidade I, II e II (COI, COII e COIII), alguns com sequência de COI e COII, outros somente com COI, o gene escolhido para os projetos de identifi-cação molecular da biodiversidade no planeta [7].
2. Material e Métodos
2.1 Coleta das amostras de cupim
As coletas foram realizadas em diversos pontos na região de Ilha Comprida, abrangendo um total de 28 ninhos (Quadro 1 e Quadro 2). Para isso, foram necessárias duas idas ao local, uma em Agosto de 2014 e outra em Janeiro de 2015. As áreas de coleta estão indicados na figura 1. Os ninhos foram georreferenciados e fotografados. Em seguida, um fragmento de cada ninho foi retirado com auxílio de uma picareta e colocado em um saco plástico com as devidas informações (nº do ninho, local e data) e posteriormente levado ao laboratório da Pontifícia Universidade Católica de Campinas.
2.2. Triagem do material e acondicionamento das amostras.
Como primeira etapa no processo de triagem, os cupins foram colocados em uma placa de petri com o auxílio de um pincel para, em seguida, serem armazenados em frascos entomológicos contendo álcool 80%. Nesta etapa não foram separados pelas castas e sim pelo ninho. Na segunda etapa da tri-agem, o material foi separado, uma parte para análise de DNA e outra para análise taxonômica tradicional. Após o processo de triagem o material foi armazenado em frascos contendo álcool 80% a -20ºC até o momento da extração de DNA.
Figura 1. Georreferenciamento dos ninhos referentes à segunda coleta em Ilha comprida, São Paulo, com o número do ninho em destaque (Foto: Google Maps).
2.3. Extração e purificação de DNA Para a extração de DNA de cupins, foi uti-
lizada cabeça e abdômen macerados em 30 micro-litros de tampão PBS (Phosphate Buffered Saline) em tubo de microcentrifuga utilizando o kit illustra™ tissue & cells genomic Prep Mini Spin de acordo com o protocolo de extração descrito pelo fabricante (GE).
2.4. Amplificação e sequenciamento de DNA
Para o sequenciamento de DNA, foram realiza-das algumas etapas prévias: a amplificação do gene desejado pelo método de Polymerase Chain Reac-tion (PCR), desenvolvido por Kary Mullis nos anos 80 e por fim o sequenciamento em questão. O gene mitocondrial utilizado para as análises foi o coI (citocromo oxidase, subunidade I). O Quadro I indi-ca as sequências dos primers para a amplificação desse gene mitocondrial.
As condições de amplificação por PCR foram as seguintes: O volume final foi de 25µL con-tendo 2,5 µl de tampão 10X, 17,4 µL de água, 0,5 mM de magnésio, 150 ng de DNA, 0,2 mM de dNTP, 5 pmoles de cada primer (direto e reverso) e 2,5 Unidades de enzima Taq DNA polimerase (Thermo Scientific), utilizando os seguintes ciclos de
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amplificação: 1 ciclo de 94 0C por 1 minuto (desna-turação inicial); 35 ciclos de 94 0C por 1 minuto (desnaturação), 450C por 1 minuto (anelamento) e 72 0C por 2 minutos (extensão); 1 ciclo de 72 0C por 3 minutos (extensão final).
Quadro I – Sequência dos primers para amplificação por PCR dos genes mitocondriais coI (Citocromo Oxidase subunidade I).
Gene Primer Sequências Fonte
COI HCO 5' ATA CCT CGA CGW TAT TCA
GA 3' [8]
COI LCO 5' GGT CAA CAA
ATC ATA AAG ATA TTG G 3'
[8]
COI CO1R 5’ ACT TSA GGG TGY CCR AAG 3’ [9]
COI CO1L 5’ ACW AAY CAY AAR GAY ATT GG
3’ [9]
COI LepF 5’ ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G 3’
[10]
COI LepR 5’ TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA 3’
[10]
Sendo: W = T ou A; Y = T ou C; S = C ou G; R = G ou A
Os produtos das amplificações de PCR foram visualizados em gel de agarose 1% em TAE (Tris-HCL, Ácido acético e EDTA) utilizando corante BlueGreen de acordo com as especificações do fab-ricante (LGC Biotecnologia). O resultado pode ser observado na Figura 2. Em resultados onde ocorreu o aparecimento de mais de uma banda de amplifi-cação, a banda de tamanho correto foi extraída diretamente do gel com o auxílio de um bisturi ester-ilizado, transferida para um tubo de microcentrífuga e purificado com o kit Illustra™ GFX™ PCR DNA and Band Purification Kit (fabricante GE). Os produtos de PCR foram submetidos ao sequencia-mento no Centro de Biologia Molecular e Engen-haria Genética da UNICAMP, utilizando-se BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosys-tems).
2.5. Análise das sequencias de DNA
Os dados do sequenciamento foram anali-sados através de programas específicos para
análise de qualidade do sequenciamento (Sequence Scanner, V1.0, Life Technologies Corporation), edição e comparação das sequências (Geneious 6.0 (Biomatters Limited – HTTP://geneious.com, Kearse et al., 2012). Com esse último programa foi possível excluir da sequência as regiões de baixa qualidade e primers e gerar a sequência consenso (Anexo 5.1) a partir de duas ou mais sequências (obtidas com primers direto e reverso, por exemplo), melhorando a qualidade da sequência final para que pudesse ser comparada no banco de dados através da fer-ramenta BLASTn do site NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/).
3. Resultados
3.1.Extração de DNA e amplificação por PCR
As extrações realizadas com as amostras ref-erentes às duas coletas forneceram DNA suficiente para as análises posteriores. As extrações foram realizadas com o auxílio de um kit para extração de DNA (illustra™ tissue & cells genomic Prep Mini Spin Kit) e armazenadas no freezer. Na etapa se-guinte, de amplificação por PCR, cinco amostras geraram produtos de amplificação, e o tamanho do produto de PCR amplificado foi do tamanho espera-do (~650 pb). A relação do resultado de produtos de PCR gerados por amostra é indicado no Quadro II.
3.3. Sequenciamento de DNA e comparação com o banco de dados.
Os produtos de PCR obtidos foram enviados para o sequenciamento e os dados retornados foram analisados com auxílio de programas es-pecíficos. As sequências de DNA analisadas para as cinco amostras resultaram em três gêneros diferentes: Nasutitermes sp., Microcerotermes sp. e Diversitermes sp., representados abaixo na Figura 2.
Figura 2. Gêneros de cupins encontrados em Ilha Comprida, região de Cananéia: A) Microcerotermes
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sp., B) Nasutitermes sp., C) Nasutitermes sp. e D) Di-versitermes sp.
Os resultados de sequenciamento do gene mi-tocondrial coI foram submetidos para comparação com sequencias de genes de diferentes espécies depositadas no banco de dados GenBank. A sub-missão das sequências neste banco nos trouxe re-sultados apenas de gêneros, pois o grau de simi-laridade com as sequências do banco foram inferi-ores a 98% em todos os casos, como indicado no Quadro III.
Quadro III – Resultado da comparação no Gen-Bank das amostras obtidas pelo sequenciamento e seus respectivos graus de similaridade.
4. Discussão
A utilização do gene citocromo oxidase subunidade I vem sendo amplamente usado para identificar espécies [11]. Os resultados de amplifi-cação do gene mitocondrial coI de cupins obtidos no presente trabalho foram similares àqueles descritos por Melo e colaboradores para outras espécies, ou seja, um produto de amplificação com cerca de 650 pb. O insucesso na amplificação do gene mito-condrial coI de diversos cupins (Quadro II) muito provavelmente se deve ao fato de serem espécies distantes filogeneticamente das espécies usadas para a elaboração dos primers de PCR [8, 11]. Essa distância genética implica em diferenças nas se-quencias gênicas, explicando o insucesso na ampli-ficação. Para contornar tal problema, teríamos a necessidade de desenvolver outros primers mais adequados para essas espécies coletadas, ou mesmo tentarmos novas condições de amplifi-cações.
Com relação à identificação taxonômica dos cupins por comparação com o Genbank (NCBI), só pudemos identificar até o nível de gênero. Isso se deve ao fato da limitação de informações das es-pécies brasileiras nesse banco de sequências gênicas mundiais. Uma vez que a identificação é realizada por comparação, se o banco não está bem representado, não permite a identificação. A fauna térmita não só do Brasil, mas como da região Neo-tropical é pouco conhecida e especificamente na Mata Atlântica, foram feitas pesquisas em poucas áreas [13]. Tais resultados só nos apontam a ne-cessidade de mais pesquisas com a termitofauna brasileira, permitindo melhor conhecimento das es-pécies, seus papeis biológicos e, em casos necessários, possíveis manejos. A presença do gênero Nasutitermes como resultado de duas das cinco amostras pode ser compreendida devido a ser um gênero muito encon-trado na região do sudeste brasileiro [14]. Dentre as espécies de Nasutitermes encontradas neste presente trabalho, uma delas pode ser classificada através da taxonomia clássica como Nasutitermes corniger, que segundo Constantino, citado por Reis e Cancello, é considerada uma das mais im-portantes espécies-praga da região sul americana. As amostras de Microcerotermes encontra-das também não puderam ser identificadas até es-pécie, tanto por taxonomia clássica quanto molecu-lar, sendo que os dados moleculares apresentaram 92% de similaridade com Microcerotermes parvus quando comparados no banco de dados. Esta por-centagem indica que as amostras coletadas para este trabalho e a amostra depositada no banco são do mesmo gênero, porém de espécies diferentes, pois de acordo com Hebert e colaboradores, quando duas espécies apresentam moléculas de DNA com divergência entre 5,8% até 9,1% são do mesmo gênero, porém de espécies distintas. Tanto os re-sultados de taxonomia molecular, quanto os de tax-onomia clássica sugerem que as amostras de Mi-crocerotermes pertencem a uma espécie nova, nun-ca descrita na literatura cientifica. Os resultados aqui encontrados apontam para a necessidade de novas coletas na região e da continuidade dos estudos para a conhecimento da termitofauna na região de Cananéia e a descrição dessa espécie nova do gênero Microcerotermes.
5. REFERÊNCIAS
Amostra Espécie mais próxima de acordo com o GenBank
Grau de Similaridade
1 Nasutitermes corniger 92%
2 Microcerotermes parvus 92%
3 Neocapritermes araquaia 92%
4 Nasutitermes araquaia 94%
5 Microcerotermes parvus 92%
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[2] Campos, W. W. Análise e mapeamento da estrutura da paisagem da Ilha Comprida, no litoral sul de São Paulo. 2013. 165f. Dissertação (Mestrado em Geogra-fia Física) – Programa de Pós-Graduação de Geogra-fia Física, Universidade de São Paulo, Brasil, 2013.
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[4] Zina, J.; Prado, C. P. A.; Brasileiro, C. A.; Had-dad, C. F. B. Anurans of the Sandy coastal plains of the Lagamar paulista, state of São Pau-lo, Brazil. Biota Neotrop. Vol. 12, n.1, pp. 251-260, 2012.
[5] VASCONCELLO, A.; MÉLO, A. C. S.; SEGUNDO, E. M. V.; BANDEIRA, A. G. Cupins de duas florestas de restinga do nordeste brasileiro. Sér. Zool. Vol (95(2), pp 127-131, 2005. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/isz/v95n2/a03v95n2.pdf>. Acesso: 02 Jun 2015.
[6] BANDEIRA, A. G.; VASCONCELLOS, A. Estado atual do conhecimento sistemático e ecológico sobre os cupins (Insecta, Isoptera) do nordeste brasileiro. Revista Nordestina de Biologia. Vol. 13(1/2), pp 37-45, 1999. Disponível em: < http://www.ies.ufpb.br/ojs/index.php/revnebio/article/viewFile/12075/7027>. Acesso? 02 Jun 2015.
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Quadro II – Resultado das amplificações realizadas com primers HCO/LCO, CO1L/CO1R e LF/LepR.
Coleta Ninho Amostra Taxonomia Clássica Resultado da Amplificação com HCO/LCO
Resultado da Amplifi-‐cação com CO1R/CO1L
Resultado da Amplifi-‐cação com LepF1/LepR1
1ª
2 1 Nasutitermes sp. -‐ + -‐ 3 2 Microcerotermes sp. -‐ + -‐ 5 3 Diversitermes sp. + + -‐
11 4 Nasutitermes sp. + -‐ -‐ 20 5 Microcerotermes sp. + + NT 1 6 Microcerotermes sp. -‐ -‐ -‐ 4 7 Nasutitermes jaraguae -‐ -‐ -‐ 6 8 Nasutitermes ehrhardti -‐ -‐ -‐ 8 9 Nasutitermes ehrhardti -‐ -‐ -‐ 9 10 Não classificado -‐ -‐ -‐
10 11 Nasutitermes sp. -‐ -‐ -‐ 12 12 Nasutitermes sp. -‐ -‐ -‐ 13 13 Nasutitermes ehrhardti -‐ -‐ -‐
2ª
1 14 Nasutitermes ehrhardti -‐ -‐ -‐
2 15 Nasutitermes jaraguae -‐ +* -‐
3 16 Nasutitermes sp. -‐ +* -‐
4 17 Nasutitermes jaraguae -‐ -‐ -‐
6 18 Nasutitermes aquilinus -‐ -‐ -‐
7 19 Microcerotermes sp. -‐ -‐ -‐
8 20 Microcerotermes sp. -‐ -‐ -‐
9 21 Microcerotermes sp. -‐ -‐ -‐
10 22 Nasutitermes ehrhardti +* -‐ -‐
11 23 Microcerotermes sp. +* -‐ -‐
12 24 Microcerotermes sp. +* -‐ -‐
13 25 Sem soldado NT NT NT
14 26 Nasutitermes aquilinus -‐ -‐ -‐
15 27 Microcerotermes sp. -‐ -‐ -‐
