IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE REDES DE GENES … · Obrigada pelo carinho, amizade e compreensão em cada momento de dificuldade. ... para a auto renovação das CTCs, formação

Programa de Pós-graduação em Tecnologias aplicadas a saúde

Daniela Oliveira Lima Magalhães

IDENTIFICAÇÃO E ANÁLISE DE REDES DE GENES ENVOLVIDOS NO CÂNCER

DE MAMA E CÉLULAS-TRONCO CANCEROSAS

Belo Horizonte, MG

2018




Belo Horizonte, MG

Setembro, 2018

Dissertação apresentada ao Programa de

Mestrado em Tecnologias aplicadas a saúde

das Faculdades Promove, como requisito

parcial para obtenção do título de mestre.

Orientadora: Professora Dra. Ludmilla Regina

de Souza David




Aprovada em ___/___/___ pela banca constituída dos seguintes professores:

_______________________________________ Profa. Dra. Carla Silvana de Oliveira e Silva

_________________________________________ Profa. Dra. Ludmilla Regina de Souza David

________________________________________ Profa. Dra. Rosangela Silqueira Hickson Rios

Belo Horizonte, de de 2018.

Faculdades Promove de Belo Horizonte Rua Aimorés 123 – 31.256-000 – Belo Horizonte, MG

www.faculdadepromove.com.br

Dissertação apresentada ao Programa de

Mestrado em Tecnologias aplicadas a

saúde das Faculdades Promove, como

requisito parcial para obtenção do título

de mestre.

http://www.faculdadepromove.com.br/

Dedico este estudo a minha mãe,

guerreira, fonte inspiradora deste

trabalho. Na qual me inspirei em

aumentar cada minuto de sua vida.

Às minhas filhas, Isadora e Isabela, que

tanto sentiram a minha ausência.

Ao meu esposo, Ítalo, companheiro de

sempre.

Dedico também àquelas mulheres que já

receberam e, principalmente, às que

ainda irão receber o diagnóstico de

câncer de mama.

Desejo que este estudo possa contribuir

para a detecção precoce da doença e

para o início e a conclusão do tratamento

em um tempo mais curto possível.

AGRADECIMENTOS

- A Deus por me iluminar e guiar sempre para um bom caminhar.

- Meus queridos pais, Rosarinha e Lima, agradeço a vocês por terem me dado

condições e exemplos para eu ter um bom “alicerce de vida”.

- A minhas amadas filhas, Isadora e Isabela, minhas razões de viver. Minha principal

vontade de crescer, de ser melhor, sempre foi para poder dar exemplo a vocês, e

para que pudéssemos ter condições de um futuro melhor. Amo demais vocês!

- A meu amado esposo, Ítalo, pelo companheirismo, paciência e amizade.

- Minha orientadora e agora amiga, Ludmilla, agradeço-lhe pela oportunidade de tê-

la como orientadora. Ao seu lado aprendi novos conhecimentos científicos e de vida.

Obrigada pelo carinho, amizade e compreensão em cada momento de dificuldade.

- A enfermeira Franciele Ornelas e ao mestre em T.I. Diego Vinicius Castro pela

parceria e amizade.

- Muito obrigada ao meu sogro e minha sogra, Edmilson e Serva, pelo carinho e

cuidado com minha filha, Isadora, nas viagens mensais.

- Minhas amigas, agradeço por todos os elogios, convivência, risadas, conversas e

apoio... Amigas adoçam o viver e ao mesmo tempo nos ajudam a ver a vida quando

uma “névoa” cisma em cobrir nossos olhos.

- Meus irmãos (ãs) e cunhados (das), obrigada por sempre acreditarem em mim.

“A mente que se abre a uma nova ideia jamais retorna ao seu tamanho

original”. (EINSTEIN)

RESUMO

As células-tronco são células indiferenciadas presentes em tecidos embrionários e

extraembrionários. Estudos têm evidenciado a presença de uma população de

células com características de células-tronco em muitos tipos de neoplasias

malignas, entre elas o câncer de mama. As células-tronco cancerosas têm

contribuído com a progressão da doença e evolução para um quadro clínico de

metástase e pior sobrevida em pacientes diagnosticados com o câncer de mama.

Portanto, o objetivo do corrente estudo consistiu em analisar as redes de interações

gênicas das células-tronco cancerosas (CTC), células-tronco cancerosas no câncer

de mama (CTCM), câncer de mama (CM) e metástase de origem no câncer de

mama (MM). Para construir as redes de interações gênicas das condições estudas,

foram identificados os genes de cada condição na base de dados Genecards.

Marcadores de células-tronco cancerosas foram selecionados a partir de revisão da

literatura e analisados quanto à interação com outros genes em cada rede. Os

mapas de interações genômicas foram elaborados com o auxílio do software

STRING, e as análises estatísticas das interações foram realizadas no programa

SPSS® PASS Statistic 18. As redes CTC, CTCM, CM e MM apresentaram 386, 81,

396 e 160 genes, respectivamente. Em cada rede foram selecionados 8 genes

líderes, sendo eles os genes que apresentaram os maiores números de interações

dentro de cada rede: CTC (TP53, AKT1, CTNNB1, MYC, JUN, STAT3, EGFR e

NOTCH1), CTCM (STAT3, EGFR, CTNNB1, JUN, NFKB1, NOTCH1, FOS e ESR1),

CM (TP53, PIK3CA, AKT1, EGFR, MAPK1, EP300, SRC e CDK2) e MM (TP53,

EGFR, STAT3, JUN, HDAC1, ERBB2, VEGFA e HDAC2). Os grupos CTC e CTCM

apresentaram o maior número de genes líderes em comum. TP53, AKT1 e EGFR

foram genes líderes da rede de CTC que também se encontraram na rede de CM.

TP53, EGFR, STAT3 e JUN foram genes comuns aos grupos CTC e MM. EGFR foi

um dos genes líderes de todas as condições estudas. Dentre os marcadores

putativos de células-tronco cancerosas (WNT1, NOTCH1, NANOG, CD44 e

ALDHA1), apenas o CD44 foi encontrado nas 4 condições apresentadas neste

trabalho. NOTCH1 realizou interações nas redes de células-tronco (CTC e CTCM) e

CM, e foi o marcador que apresentou melhores combinações nas redes de células-

tronco cancerosas referentes à alta interação dentro da rede (alto WNL) e poucas

interações em redes globais (baixo TIS). NANOG, WNT1 e SOX2 apresentaram

interações apenas nas redes de células-tronco. ALDH1A1 apresentou-se apenas

nas redes CTC e CM, mas com apenas 1 interação em cada rede. Dessa forma,

percebe-se que o estudo dos mapas de interações gênicas revela diversos genes

relevantes para cada condição estudada, e genes que são importantes para os

processos relativos ao câncer de mama (CTCM, CM e MM), como os genes EGFR e

CD44. NOTCH1 foi o único marcador de CTC que também foi considerado um dos

genes líderes. Muitas outras interpretações podem ser realizadas a partir dos

resultados obtidos, destacando-se diferentes genes importantes para as condições

biológicas estudadas.

Palavras-chave: Células-tronco tumorais, carcinoma de mama, metástase,

biomarcadores.

ABSTRACT

Stem cells are undifferentiated cells found in embryonic and extra-embryonic tissues.

Studies have shown the presence of a population of cells with characteristics of stem

cells in many types of malignant neoplasms among them the breast cancer. Cancer

stem cells have contributed with disease progression and evolution to a clinical

picture of metastasis and worse survival in patients diagnosed with breast cancer.

Therefore, the objective of this study was to analyze gene interactions networks of

cancer stem cells (CSC), cancer stem cells in breast cancer (BCCSC), breast cancer

(BC) and source metastasis in breast cancer (BCM). To build networks of gene

interactions studying conditions, were identified the genes of each condition in the

Genecards. Cancer stem cells markers were selected from literature review and

analyzed regarding interaction with other genes in each network. The genomic

interactions maps were drawn up with the aid of software STRING, and the statistical

analysis of the interactions were performed in the program SPSS® PASS Statistic 18.

The CSC, BCCSC, BC and BCM networks, presented 386, 396, 81 and 160 genes,

respectively. In each network 8 genes were selected leaders with genes that showed

the greatest numbers of interactions with in each network: CSC (TP53, AKT1,

CTNNB1, MYC, JUN, STAT3, EGFR e NOTCH1), BCCSC (STAT3, EGFR, CTNNB1,

JUN, NFKB1, NOTCH1, FOS e ESR1), BC (TP53, PIK3CA, AKT1, EGFR, MAPK1,

EP300, SRC e CDK2) e BCM (TP53, EGFR, STAT3, JUN, HDAC1, ERBB2, VEGFA

e HDAC2). The CSC and BCCSC groups presented the largest number of leading

common genes. TP53, AKT1 and EGFR genes were leaders of the CSC network

which also met in BC. TP53, EGFR, STAT3, and JUN genes were common to the

CSC and BCM groups. EGFR was one of the leading genes of all conditions studied.

Among the putative markers of cancer stem cells (WNT1, NOTCH1, NANOG, CD44

e ALDHA1), only the CD44 was found on 4 conditions presented in this work.

NOTCH1 realized interactions in the stem cells networks (CSC and BCCSC), and

BC, and was the marker that presented bets combinations of cancer stem cells

networks, regarding the high interaction within the network (WNL) and few

interactions in global networks (low TIS). NANOG, WNT1 and SOX2 showed

interactions only in the stem cell networks. ALDH1A1 presented only in the CSC and

BC networks, but with only 1. Thus, the study of gene interaction maps reveals

several genes relevant to each condition studied, and genes that are important for

breast cancer processes (BCCSC, BC and BCM), such as EGFR and CD44 genes.

NOTCH1 was the only CsC marker that was considered one of the leading genes.

Many other interpretations can be made from the obtained results, highlighting

different genes important for the biological conditions studied.

Key-Words: Tumor stem cells, breast carcinoma, metastasis, biomarkers.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

FIGURA 1- Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2016 por sexo no Brasil, exceto pele não melanoma...................... 25

FIGURA 2 - Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2018 por sexo no Brasil, exceto pele não melanoma...................... 26

FIGURA 3 - Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2018 por sexo nos Estados Unidos da América, exceto pele não

melanoma.................................................................................................................. 26

FIGURA 4- Etapas de iniciação e promoção relativos ao processo da

carcinogênese........................................................................................................... 28

FIGURA 5- Bloqueio da progressão do ciclo celular desencadeado pela proteína

supressora de tumor p53 para a realização do reparo do dano no

DNA........................................................................................................................... 29

FIGURA 6- Visão esquemática do microambiente tumoral....................................... 30

FIGURA 7- Fontes de heterogeneidade no câncer................................................... 37

FIGURA 8- Autorrenovação e diferenciação de células-tronco normais e células-

tronco tumorais.......................................................................................................... 38

FIGURA 9- Os principais mecanismos de resistência terapêutica em células-tronco

de câncer de mama................................................................................................... 40

FIGURA 10- Mapa de interação dos 386 genes envolvidos na rede de células-tronco

cancerosas................................................................................................................ 52

FIGURA 11- Mapa de interação dos 81 genes envolvidos na rede das células-tronco

cancerosas do câncer de mama............................................................................... 53

FIGURA 12- Mapa de interação dos 396 genes envolvidos na rede do câncer de

mama......................................................................................................................... 54

FIGURA 13- Mapa de interação dos 160 genes potencialmente envolvidos na rede

de metástase de origem no câncer de mama........................................................... 55

FIGURA 14- Distribuição dos genes da rede de células-tronco cancerosas em

função das interações gênicas e análise de agrupamento....................................... 57

FIGURA 15- Distribuição dos genes da rede de células-tronco cancerosas da mama

em função das interações gênicas e análise de agrupamento................................. 57

FIGURA 16- Distribuição dos genes da rede de câncer de mama em função das

interações gênicas e análise de agrupamento.......................................................... 58

FIGURA 17- Distribuição dos genes da rede de metástase de mama em função das

interações gênicas e análise de agrupamento.......................................................... 58

FIGURA 18- Representação dos marcadores putativos de células-tronco

cancerosas................................................................................................................ 60

FIGURA 19- Número de interações realizadas por marcadores de células-

tronco......................................................................................................................... 62

LISTA DE TABELAS

TABELA 1- Genes líderes das condições estudadas................................................ 56

TABELA 2- Interações realizadas por marcadores de células-tronco cancerosas................................................................................................................ 63

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

PI3K Fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinase

ABC Cassete de ligação a ATP

AKT1 Serina/treonina quinase 1

ALDH Enzima aldeído desidrogenase

ALDH1 Aldeído desidrogenase 1

ALDH1A1 Aldeído desidrogenase 1, membro A1

APC Polipose adenomatosa Coli

ATM Quinase serina/treonina ATM

CD133 Antígeno CD133 ou prominina 1

CD24 Molécula de adesão do grupo de diferenciação 24 ou antígeno

estável ao calor

CD44 Molécula de adesão do grupo de diferenciação 44, que pertence

ao grupo sanguíneo Indiano

CD49f Subunidade alfa da integrina 6

CD61 Subunidade beta da integrina 3

CDK2 Quinase dependente de ciclina 2

ChK Quinase de ponto de checagem;

CI Carcinoma localmente invasivo

CIS Carcinoma in situ

CM Câncer de mama

c-Myc Proto-oncongene MYC, fator de transcrição BHLH

CTC Células-tronco cancerosas

CTCM Células-tronco cancerosas do câncer de mama

CTNNB1 Beta catenina

DNA Ácido desoxirribonucleico

DP1 Fator de transcrição DP1

E2F Fator de transcrição da família E2

EGFR Receptor do fator de crescimento epidérmico

TEM Transição epitélio-mesenquimal

EP300 Proteína de Ligação E1A P300

ERBB2 Receptor de proteínas tirosina-quinase tipo 2

ESR1 Receptor de estrogênio 1

EUA Estados Unidos da América

FAK Proteína quinase de adesão focal

FN1 Fibronectina 1

FOS Proto-oncogene Fos, Subunidade Fator de Transcrição AP-1

G0 Fase de repouso por tempo indeterminado

G1 Primeira fase de intervalo na intérfase no ciclo celular

G2 Segunda fase de intervalo na intérfase do ciclo celular

GPI Glicosilfosfatidilinositol

HDAC1 Histona desacetilase 1

HDAC2 Histona desacetilase 2

HER-2 Receptor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico

HIF1A Subunidade alfa do fator 1 induzível por hipóxia

HUGO Organização do Genoma Humano

IGF1R Receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 1

INCA Instituto Nacional do Câncer

JAG1 Proteína Jagged-1

JUN Proto-Oncogene Jun, Subunidade Fator de Transcrição AP-1

KLF4 Fator de transcrição 4 da família Kruppel

Let-7 Precursor do microRNA de Let-7

LIF Citocina da família da interleucina 6

LIN28 Lin-28 homólogo

LIN28A Lin-28 homólogo A

MAPK1 Proteína quinase ativada por mitógeno 1

MDR1 Proteína de resistência a multidrogas 1;

MeSH Medical Subject Headings

MET Proto-oncogene MET, Receptor tirosina quinase

MiARNs Pequenos ácidos ribonucléicos

miR-452 MicroRNA 452

MM Metástase originada do câncer de mama

MMP2 Metaloproteinase da matriz 2

MMP9 Metaloproteinase da matriz 9

MTOR Alvo mecanicista da rapamicina quinase

MYC Proto-oncogene MYC, Fator de transcrição BHLH

NANOG Fator de transcrição homeobox Nanog

NFKB Subunidade Kappa B do Fator Nuclear

NFKB1 Subunidade Kappa B do Fator Nuclear 1

NICD Domínio intracelular de Notch (NICD).

Notch Via de sinalização Notch

NOTCH1 Proteína Notch associada à translocação TAN-1

Oct-4 Proteína de Ligação a Octómero 4

P21 Proteína Interativa com CDK 1

P53 Proteína Tumoral P53

P-gp Glicoproteína P

PIK3CA Subunidade catalítica de fosfatidilinositol-4,5-Bisfosfato 3-

Quinase Alfa

POU5F1 POU Classe 5 Homeobox 1

ROS Espécies reativas de oxigênio

SNAI2 Membro da família de fatores de transcrição dedo de zinco

SOX2 Sexo determinando região Y-Box 2

SPP1 Fosfoproteína Secreta 1

SRC Proto-oncogene SRC, tirosina quinase não receptora

SRR2 Reforço junsante de SOX2

STAT3 Transdutor de Sinais e Ativador da Transcrição 3

STRING Ferramenta de Pesquisa para Recuperação de Interações entre

Genes/Proteínas

TCF Fator de transcrição funcional

TGFβ Fator de crescimento transformador beta

TIS Pontuação de interações totais

TNM T=tumor, N= acometimento linfonodal e M= metástase à

distância

TP53 Proteína supressora de tumor P53

TWIST1 Fator de transcrição BHLH da Família Twist 1

UICC União Internacional Contra o Câncer

VEGF Fator de Crescimento Endotelial Vascular

VEGFA Fator de Crescimento Endotelial Vascular A

WNL Número ponderado de ligações

WNT Membro da família WNT

WNT1 Membro da família WNT 1

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 19

2 OBJETIVOS ..................................................................................................................................... 22

2.1 Objetivo geral: .......................................................................................................................... 22

2.2 Objetivos específicos: ............................................................................................................. 22

3 JUSTIFICATIVA .............................................................................................................................. 23

4 REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................................................ 24

4.1 Câncer ....................................................................................................................................... 24

4.2 Câncer de mama ..................................................................................................................... 32

4.3 Células-tronco cancerosas ..................................................................................................... 35

4.4 Células-tronco cancerosas em câncer de mama ............................................................... 40

4.5 Marcadores putativos de células-tronco cancerosas ......................................................... 43

4.6 Bioinformática ........................................................................................................................... 45

5 METODOLOGIA .............................................................................................................................. 48

5.1 Caracterização do estudo ....................................................................................................... 48

5.2 Identificação dos genes .......................................................................................................... 48

5.3 Construção e análise do mapa de interações genômico ................................................. 48

5.4 Definição dos genes marcadores putativos de células-tronco cancerosas .................... 50

5.5 Análises das interações realizadas pelos genes marcadores putativos de CTC .......... 50

6 RESULTADOS ................................................................................................................................ 51

7 DISCUSSÃO .................................................................................................................................... 64

8 CONCLUSÃO .................................................................................................................................. 73

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 74

19

1 INTRODUÇÃO

As células-tronco são células indiferenciadas ou com pequeno percentual de

diferenciação presentes em tecidos embrionários e extraembrionários. Podem

permanecer em estado quiescente até a fase adulta ou diferenciar-se em diversos

tecidos a partir da expressão de determinados genes. Pesquisas têm demonstrado

resultados benéficos na utilização dessas células para o tratamento de doenças, de

modo que as células-tronco representam as potenciais terapias para o tratamento de

muitas doenças no futuro (SOUZA et al., 2003; YANG et al., 2016; LEON, et al.

2015). Os constantes estudos com células-tronco resultaram na identificação de

células-tronco cancerosas (CTC) em um conjunto de tumores humanos, o que

sugere que estas células também possuem potencial para desencadearem o

desenvolvimento de cânceres (YANG et al., 2016; KONRAD et al., 2017).

[...] apenas um pequeno número de células da massa tumoral é capaz de proliferar e formar novos tumores quando enxertado em animais imunodeficientes, como demonstrado no câncer de mama, próstata e leucemia. As células com essas habilidades são denominadas de células-tronco tumorais e compartilham diversas características com sua contraparte normal (SOUZA, 2006, p. 379).

As células-tronco tumorais foram inicialmente identificadas na leucemia

mielóide aguda humana por Bonnet e Dick (1997). Posteriormente, foram descritas

em tumores sólidos, próstata, cérebro, ovário, cólon, pele, pulmão, e, em particular,

no câncer de mama (PICCIRILLO e VESCOVI, 2007). Os estudos com essas células

têm indicado que tumores mais agressivos possuem uma maior quantidade de

células-tronco cancerosas em sua população celular (HANAHAN e WEINBERG,

2011).

As CTCs apresentam capacidade de auto-renovação, diferenciação em pelo

menos uma linhagem específica, heterogeneidade, quiescência, atividade de

telomerase ativa, resistência à apoptose e consequente longevidade, além da

habilidade de migrar e favorecer o processo de metástase (SOUZA, 2006). Essas

células são ainda resistentes aos tratamentos e aumentam em número após

pequenas doses de radiação fracionada, caracterizando um processo de

repopulação acelerada das células tumorais observada durante intervalos de tempo

20

no tratamento radioterápico. São também resistentes à quimioterapia e possuem

capacidade de acentuar certas formas de dormência tumoral, cujas células

cancerosas latentes persistem por anos ou décadas após remoção cirúrgica ou

radio/quimioterapia e são capazes de regenerar o tumor após o final da terapia

(HANAHAN e WEINBERG, 2011).

O câncer de mama é considerado o segundo tipo de câncer mais comum

entre as mulheres e responsável por 25% de casos novos a cada ano (INCA, 2016).

A presença de uma pequena população de células-tronco cancerosas e

heterogeneidade tumoral tem sido observado neste tipo de neoplasia (LEON, et al.

2015). As células deste tipo de câncer possuem um fenótipo de superfície

CD44+/CD24-, que apresentam propriedades iniciadoras de tumor com

características de pluripotência e capacidade invasiva. A presença desse fenótipo de

superfície sugere uma transição de um fenótipo epitelial (CD44-/CD24+) para um

fenótipo mesenquimal (CD44+/CD24-), o que capacita a célula a mover-se do tumor

primário para um sítio metastático (MANI et al., 2008). A disseminação das células

tumorais da mama se inicia precocemente e normalmente acontece através das vias

linfáticas. Os implantes secundários são frequentemente encontrados em vértebras

e arcos costais, caracterizando a metástase óssea (SLEEMAN e THIELE, 2009).

Nesse tipo de tumor, a disseminação metastática é a principal causa da baixa

sobrevida dos pacientes (FREUDENBERG, 2009; RUITERKAMP, 2011).

A partir dessas evidências, metodologias que contribuam para a

compreensão da biologia do câncer de mama se fazem necessárias, e a

identificação de biomarcadores que auxiliem na eliminação das células-tronco

cancerosas da mama são fundamentais (CALIFF, 2018). Estudos de bioinformática

têm recebido bastante atenção no cenário mundial das ciências da saúde na

interpretação e na compreensão de grandes volumes de dados. Em câncer de

mama, estudos in silico identificaram 390 novos pares de fármacos anticâncer

capazes de exibir efeitos sinérgicos antitumorais, muitos deles estão em fase de

testes in vitro (JAERGER et al., 2017). Em outros estudos, ferramentas

computacionais são utilizadas para a identificação de padrões de mutação em

grandes estudos de genômica de câncer e para a realização de simulações

moleculares e construção de estruturas proteicas (VERLI, 2014; HOU et al., 2016).

Dessa forma, estudos que visam contribuir com conhecimentos acerca da biologia

tumoral, especialmente referente aos processos de proliferação e progressão dos

21

tumores associados às características das CTCs, são de fundamental importância

para futuras estratégias terapêuticas e representam uma abordagem promissora no

tratamento do câncer de mama.

Desta forma, a presente pesquisa teve o intuito de analisar as redes de

interação gênica de quatro condições, células-tronco cancerosas (CTC), células-

tronco cancerosas do câncer de mama (CTCM), câncer de mama (CM) e a

metástase originada do câncer de mama (MM). Além disso, objetivou-se identificar

as interações realizadas por marcadores de células-tronco cancerosas com os

genes das redes em estudo.

22

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral:

Avaliar as redes de interações gênicas das células-tronco cancerosas,

células-tronco cancerosas no câncer de mama, câncer de mama e da metástase de

origem do câncer de mama.

2.2 Objetivos específicos:

- Construir o mapa de interação genômico das células-tronco cancerosas,

células-tronco cancerosas no câncer de mama, câncer de mama e da

metástase de origem do câncer de mama;

- Identificar os genes líderes de cada condição estudada;

- Avaliar as interações realizadas por genes marcadores de células-tronco

cancerosas em cada condição.

- Realizar um estudo comparativo dos genes líderes e genes marcadores de

células-tronco cancerosas nas condições estudadas.

23

3 JUSTIFICATIVA

Estimativas apontam que o câncer apresenta elevada incidência em todo o

mundo e que até 2030 cerca de 21,4 milhões de novos casos serão diagnosticados

no Brasil, e o número de óbitos será de 13,2 milhões de pessoas (BRASIL, 2015).

Especificamente para o câncer de mama, que é o segundo tipo de câncer mais

frequente entre as mulheres, foram estimados que 57.960 novos casos seriam

registrados para o biênio 2016-2017 no Brasil (INCA, 2016). A presença de uma

população de CTCs em cânceres de mama representa um importante fator na

promoção de resistência clínica, permitindo a evolução para um tumor mais

agressivo ao longo do tempo. Nesse cenário, as disseminações metastáticas

contribuem para uma alta taxa de mortalidade e pior prognóstico dos pacientes

(VELASCO-VELÁZQUEZ et al., 2013).

Diante disso, percebeu-se a necessidade de identificar os genes que mais

interagem nas células-tronco do câncer de mama, e comparar com os genes

evidenciados na população de células-tronco cancerosas. Além disso, é relevante

para a compreensão da biologia do câncer de mama, conhecer os genes mais

importantes para o câncer de mama e sua condição metastática, além de verificar

como os genes mais importantes da condição CTCs interagem nas condições de

câncer de mama e metástase originada do câncer de mama. E ainda, a

compreensão das interações realizadas por genes marcadores de células-tronco

cancerosas nas redes de CTCs, CTCs da mama, câncer de mama e metástase

originada do câncer de mama pode assessorar estudos futuros sobre tais genes nas

condições patológicas descritas.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Velasco-Vel%26%23x000e1%3Bzquez%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22249027

24

4 REFERENCIAL TEÓRICO

4.1 Câncer

A palavra câncer foi utilizada pela primeira vez por Hipócrates, que é

considerado o pai da medicina, e viveu entre 460 e 377 a.C. (BRASIL, 2011).

“Câncer” veio do grego karkínos, que significa caranguejo, e como definição é

compreendido como um grupo de mais de 100 doenças com crescimento celular

desordenado e com capacidade de se infiltrar em órgãos e tecidos vizinhos (INCA,

2012). Pesquisas demonstram relatos de câncer em múmias do Egito há mais de

3000 anos a.C. (BRASIL, 2011).

O câncer é considerado uma doença insidiosa e a segunda causa de morte

global, estando atrás somente das doenças cardiovasculares. Trata-se de um

problema de saúde pública, diante da sua relevância no âmbito epidemiológico,

social e econômico (INCA, 2012; BRENNER, 2016). Segundo pesquisas realizadas

em 2015, foram evidenciados 17,5 milhões de novos casos de câncer no mundo e

8,7 milhões de pessoas morreram com esta doença (FITZMAURICE, 2017). As

causas dessa doença associam-se à exposição a fatores externos ao hospedeiro,

como tabaco, micro-organismos infecciosos e uma dieta não saudável, e por fatores

intrínsecos, como mutações genéticas, hormônios e condições do sistema

imunológico (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2015).

Nas últimas décadas vem ocorrendo no Brasil um fenômeno chamado de

transição epidemiológica. Tal fenômeno diz respeito a três mudanças específicas:

aumento da morbimortalidade pelas doenças e agravos não transmissíveis e pelas

causas externas; deslocamento da carga de morbimortalidade dos grupos mais

jovens para grupos mais idosos; e predomínio da morbidade em função da

mortalidade. O câncer está entre as doenças responsáveis por essas mudanças do

perfil epidemiológico do país (BRASIL, 2011). Pesquisas apontam que até 2030

cerca de 21,4 milhões de novos casos serão diagnosticados no Brasil, e o número

de óbitos será de 13,2 milhões de pessoas (BRASIL, 2015).

O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais recorrente nas regiões

Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil e nos EUA (INCA, 2013; DE

25

SANTIS et al., 2017). Estudo desenvolvido nos EUA afirma que aproximadamente

252.710 novos casos de câncer de mama invasivo e cerca de 63.410 casos de

carcinoma in situ foram estimados para 2017 (DE SANTIS et al., 2017).

No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), foram

diagnosticados 57.120 novos casos de câncer no ano de 2014 (INCA, 2014). Em

2016, foram estimados 57.960 novos casos (INCA, 2016). Os cânceres mais

incidentes em 2016 foram os cânceres de próstata, pulmão, cólon e reto e estômago

para o sexo masculino; e os cânceres de mama, colo do útero, cólon e reto e

glândula tireoide para o sexo feminino (Figura 1).

Figura 1- Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2016 por sexo no Brasil, exceto pele não melanoma.

Fonte: INCA Estimativa 2012 - Incidência de câncer no Brasil.

Para 2018 são estimados 600 mil novos casos de câncer no Brasil, sendo o

câncer de próstata o mais incidente no sexo masculino (61.200 casos), seguido dos

cânceres em traqueia, brônquio e pulmão com 17.330, cólon e reto com 16.660 e

estômago com 12.920 diagnósticos. Já no sexo feminino, os cânceres de mama,

cólon e reto, e colo do útero lideram em incidência, com 59.700, 18.980 e 16.370

novos casos, respectivamente (Figura 2) (INCA, 2017).

26

Figura 2 - Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2018 por sexo no Brasil, exceto pele não melanoma.

Fonte: INCA Estimativa 2016 - Incidência de câncer no Brasil.

Nos EUA, estima-se que em 2018, 856.370 indivíduos do sexo masculino

terão algum tipo de câncer, sendo que 19% deles apresentarão câncer de próstata,

14% câncer de pulmão e brônquios e 9% câncer colorretal. Nas mulheres, o câncer

de mama será responsável por 30% dos casos, seguido por pulmão e brônquios

(13%) e colorretal (7%), conforme representado na figura 3 (SIEGEL et al., 2018).

Figura 3 - Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes

estimados para 2018 por sexo nos Estados Unidos da América, exceto pele não

melanoma.

Fonte: Estimativa 2018 – A Cancer Journal for Clinicians. Inglês/Português: Males/Machos;

Prostate/Próstata; Lung & bronchus/Pulmão e Brônquios; Colon & rectum/Cólon e reto; Urinary

bladder/Bexiga urinária; Melanoma of the skin/Melanoma; Kidney & renal pélvis/Rim e Pelve renal;

Non-Hodgkin lymphoma/Linfoma não-Hodgkin; Oral cavity & pharynx/Cavidade oral e faringe;

Leukemia/Leucemia; Liver & intrahepatic bile duct/Fígado e ducto biliar intra-hepático;

27

Females/Fêmeas; Breast/Mama; Colon & rectum/Cólon e reto; Uterine corpus/Colo uterino;

Thyroid/Tireoide; Melanoma of the skin/Melanoma; Non-Hodgkin lymphoma/Linfoma não-Hodgkin;

Pancreas/Pâncreas; Leukemia/Leucemia; Kidney & renal pélvis/Rim e Pelve renal.

O estilo de vida da população pode definir o tipo de câncer mais prevalente

de acordo com cada região, além de apresentar diferenças de acordo com o

desenvolvimento do país, sendo que alguns deles são mutáveis e evitados por meio

da conscientização da sociedade (PEREIRA, 2016). Pesquisadores têm buscado

identificar mutações genéticas relativas ao processo da carcinogênese desde o

sequenciamento do genoma humano, para assim tentarem promover a prevenção e

cura dessa doença. As alterações genéticas hereditárias decorrentes de mutações

na linhagem germinativa são responsáveis por cerca de 15% dos casos. Em

contrapartida, 85% dos tumores decorrem de alterações genéticas que surgem de

maneira aleatória como consequência da interação do homem com o meio em que

vive (GONÇALVES et al., 2010; INCA, 2014).

Os principais fatores de risco e associados ao câncer são o uso de tabaco,

alimentação inadequada, inatividade física, obesidade, consumo de álcool, agentes

infecciosos, radiação, poluição ambiental, comportamento sexual, nível

socioeconômico, idade, raça e gênero (INCA, 2017). Além destes, a história familiar

destaca-se como importante fator de risco (CGHFBC, 2001).

As neoplasias que dão origem ao câncer, em sua grande maioria, surgem

quando uma única célula exposta a agentes carcinogênicos sofre alterações

genéticas ou epigenéticas que influenciam no seu mecanismo de proliferação e

apoptose (Figura 4). Após esse processo, inicia-se a fase de promoção, em que as

células sofrem mitoses consecutivas, formando vários clones celulares. O terceiro

estágio, a progressão, caracteriza-se pelo descontrole da multiplicação celular e a

célula possui autonomia para se proliferar. Na fase de conversão, as células tornam-

se invasivas (INCA, 2008).

28

Figura 4: Etapas de iniciação e promoção relativos ao processo da carcinogênese.

Fonte: INCA, 2008.

As células neoplásicas possuem seis características que as difere das

células normais: autossuficiência em sinais proliferativos, insensibilidade aos sinais

antiproliferativos, evasão por apoptose e potencial replicativo ilimitado. O

descontrole da proliferação celular ocorre por meio da ativação de oncogenes e a

repressão de genes supressores de tumor (WICHA, 2006; GOUVEA et al., 2014).

Mutações em proto-oncogenes, que correspondem a um grupo de genes que

controlam a proliferação e diferenciação celular, fazem com que eles se tornem

oncogenes, favorecendo assim a proliferação celular descontrolada (WARD, 2002).

Os genes supressores de tumor são perdidos ou inativados em diversos tipos de

cânceres. Os genes supressores de tumor mais comuns são os genes TP53 e Rb.

Quando ativados, a célula interrompe a divisão celular na fase G1 por intermédio da

proteína p21, permitindo o reparo do DNA danificado antes que o fator de

transcrição E2F ative a síntese de novos filamentos de DNA (Figura 5) (WARD,

2002).

29

Figura 5. Bloqueio da progressão do ciclo celular desencadeado pela proteína

supressora de tumor p53 para a realização do reparo do dano no DNA.

Fonte: WARD, 2002. Painel à esquerda: ciclo celular prosseguindo normalmente sob a vigilância

passiva de p53, cujos níveis se mantém baixos. Painel à direita: níveis aumentados de p53 em função

de um dano no DNA e consequente ativação de p21 para impedir a ligação da ciclina B com a

quinase CDK2. Dessa forma, a proteína Rb não será fosforilada, impedindo assim a liberação do fator

de transcrição formado pelo complexo E2F-DP1, que não poderá ativar os genes essenciais para a

progressão na fase de síntese (fase S). G0: fase de repouso do ciclo celular; G1 e G2: fases de

intervalo no ciclo celular.

Estudos demostram que o microambiente tumoral é também fundamental no

processo da carcinogênese, contribuindo com a progressão, agressividade e

disseminação metastática. O microambiente tumoral é um ambiente organizado e

dinâmico, onde células cancerosas e matriz extracelular interagem para favorecer a

migração das células tumorais. O aumento do volume tumoral é marcado pelo

surgimento de uma área em hipóxia, a qual torna-se o principal desencadeador da

angiogênese. Essa última caracteriza-se pela proliferação de células endoteliais,

necrose de células tumorais, permeabilidade de vasos sanguíneos, degradação da

matriz extracelular e formação de novos vasos. Nesse ambiente, células

inflamatórias, que surgem na tentativa de conter o tumor, possuem um importante

papel no fornecimento de fatores de crescimento mutagênicos para as células

cancerígenas, contribuindo para a angiogênese e resistência à morte celular (Figura

6) (TATE e AGHI, 2009; GORKEM, 2015).

30

Devido à angiogênese, formam-se vasos sanguíneos imaturos que

contribuem para o aumento da hipóxia. Estudos têm demonstrado também que os

vasos sanguíneos anormais criam um nicho vascular que abriga células-tronco

tumorais, as quais correspondem a uma pequena fração de células capazes de

originarem um novo tumor e conferir resistência às terapias (TATE e AGHI, 2009;

GORKEM, 2015).

Figura 6: Visão esquemática do microambiente tumoral.

Fonte: GORKEM, 2015. Inglês/Português: Extracellular matrix proteins/Proteínas da matriz

extracelular; Cancer cell/Células cancerosas; Cancer stem cell/Células-tronco cancerosas;

Hypoxic/Hipóxia; Apoptotic cancer cell/Célula cancerosa apoptótica; Cancer associated

fibrosblasts/Fibroblastos associados ao câncer; Tumor-associated macrophages/Macrófagos

associados ao tumor; T-cells/Células T; Natural killer cells/Células assassinas naturais; B-cell/Células

B; Pericyte/Pericitos.

A formação de novos vasos, sendo muitos deles considerados imaturos,

contribui para a ocorrência do fenômeno metastático. A metástase consiste no

processo de deslocamento de células cancerígenas de um determinado local para

outro, encontrando possíveis locais para formar um novo tumor. O deslocamento

das células tumorais pode ser feito através da circulação sanguínea, linfática e por

cavidades do corpo, como peritônio, pleura ou espaços subaracnóideos (SLEEMAN

e THIELE, 2009). Das células que entram em circulação, cerca de 0,01% chega a

desenvolver novos tumores. A grande maioria das células metastáticas são

31

eliminadas por apoptose ou através da ação lítica de células citotóxicas. As células

sobreviventes a esse processo se estabelecem no novo microambiente, podendo

desenvolver novos tumores ou permanecer em repouso (CHAMBERS et al., 2002).

Trata-se da principal causa de morbidade e mortalidade por câncer, chegando a

cerca de 90% das mortes, talvez por ser o obstáculo mais difícil e incompreendido

quando se trata de tumores malignos (CHAFFER e WEINBERG, 2011; BACAC e

STAMENKOVIC, 2008).

Está cada vez mais claro que as células tumorais dependem do seu microambiente para estabelecer as metástases e que dependem das células do estroma do tecido do hospedeiro para sua progressão, tais como a diversidade de atividade proteolítica que elas próprias podem não possuir (BACAC; STAMENKOVIC, 2008, p.222,223. Tradução do autor)**

Estima-se que cerca de 10% das pacientes são diagnosticados com

metástase (FREUDENBERG, 2009). Os subtipos específicos de câncer são

caracterizados por padrões diferentes de metástase, com impactos diversos sobre a

sobrevida do paciente (GERRATANA, 2015). Por isso, os métodos e incentivos

públicos para o diagnóstico precoce do câncer e as melhorias no tratamento

sistêmico têm contribuído para a redução da mortalidade (BRASIL, 2011; WANG et

al., 2017).

As modalidades de tratamento para o câncer são cirurgia, radioterapia,

quimioterapia, terapia hormonal, terapia de imunossupressão e terapia direcionadas

a moléculas específicas (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2015).

A radioterapia pode ser utilizada como modalidade pré-operatória, que visa

reduzir o tamanho do tumor para facilitar o procedimento cirúrgico, como

radioterapia pós-operatória ou pós-quimioterapia (radioterapia profilática) e como

radioterapia paliativa, que objetiva o tratamento local do tumor primário ou de

metástases (BRASIL, 2011).

A quimioterapia utiliza de quimioterápicos administrados em intervalos

regulares com a finalidade de tornar os tumores ressecáveis ou melhorar o

prognóstico, e visando a cura após tratamento cirúrgico, para o tratamento de

** It is increasingly clear that tumor cells depend upon their microenvironment to metastasize and that they even rely on host

tissue stromal cells to provide functions, such as a diversity of proteolytic activity, that they themselves may lack (BACAC;

STAMENKOVIC, 2008, p.222,223)

32

neoplasias hematopoiéticas de evolução crônica ou ainda para a paliação de sinais

e sintomas que comprometem a capacidade funcional do paciente (BRASIL, 2011).

Terapia hormonal é a classe terapêutica com maior eficiência no tratamento

dos tumores receptores hormonais de estrogênio e progesterona positivos (KALIKS,

2016). As células cancerígenas podem responder de diversas formas ao tratamento

(LIEDKE, 2006).

O tratamento do câncer teve uma grande evolução nas últimas décadas, e

juntamente com o avanço no diagnóstico precoce colabora com o aumento nos anos

de sobrevida. A taxa de sobrevida dobrou nos últimos 40 anos, porém com

diferenças entre os países. Na Inglaterra, metade das pessoas diagnosticadas com

câncer sobrevive por 10 anos ou mais, e as taxas de sobrevivência são maiores nas

mulheres que nos homens (CRUK, 2011). Na Finlândia a taxa de sobrevivência após

5 anos de diagnóstico aumentou em 5% entre os anos de 2000 e 2014 (CANCER

SOCIETY OF FINLAND, 2016).

A sobrevida em cinco anos dos cânceres de cólon, reto e mama aumentou de

forma constante nos países mais desenvolvidos (ALLEMANI et al., 2015). Para

indivíduos que foram diagnosticados entre 2005 e 2009, a sobrevida para câncer de

cólon e reto atingiu 60% ou mais em 22 países ao redor do mundo; para o câncer de

mama, a sobrevida em 5 anos aumentou para 85% ou mais em 17 países do mundo

(ALLEMANI et al., 2015).

As melhorias na sobrevida do câncer nos últimos 15 anos têm acontecido

sobretudo devido a melhores investimentos na saúde, monitoramento público dos

hospitais quanto ao tempo de espera e melhoras nos tratamentos em diversos

países no mundo (WEGWARTH, 2015). A meta da Organização Mundial da Saúde é

de uma redução de 25% nas mortes por câncer outras doenças não transmissíveis

em pessoas com idade entre 30-69 anos até 2025 (WON H., 2012).

4.2 Câncer de mama

O câncer de mama é uma neoplasia heterogênea causada pelo acúmulo

progressivo de aberrações genéticas e epigenéticas, tais como mutações,

amplificações cromossômicas, deleções, rearranjos, translocações e duplicações

(WOODS, 2007). É uma doença complexa, com apresentações esporádica e

33

familiar, como a maioria dos canceres, e se classifica como a neoplasia que mais

acomete a população feminina e a maior causa de morte por câncer no mundo entre

as mulheres (INCA, 2016).

O câncer mamário é o segundo tipo de câncer mais recorrente nas regiões

Sul, Sudeste, Centro-Oeste e Nordeste do Brasil, bem como EUA (INCA, 2013; DE

SANTIS et al., 2017). Estudo desenvolvido nos EUA afirmou que aproximadamente

252.710 novos casos de câncer de mama invasivo e cerca de 63.410 novos casos

de carcinoma in situ foram estimados para 2017 (DE SANTIS et al., 2017). No Brasil,

foram diagnosticados 57.120 novos casos de câncer de mama no ano de 2014

(INCA, 2014), e foram estimados 57.960 novos casos para 2016 (INCA, 2016).

Estimativas brasileiras para o ano de 2018 apontam cerca de 59.700 novos

casos de câncer de mama no Brasil. Provavelmente a região sudeste será a mais

acometida, com 30.880 novos diagnósticos, sendo que São Paulo terá o maior

número de mulheres com câncer de mama, chegando a 16.340 casos, superior aos

índices para toda a região Sul, que tem estimativa de 11.030 novos cânceres (INCA,

2017). Em virtude do acima exposto, esta condição destaca-se como um dos

principais problemas de saúde pública, além de ser a principal causa de morte por

câncer em alguns países que estão em desenvolvimento (SIEGEL, 2012; OMS,

2013).

O câncer de mama pode iniciar-se a partir de lesões hiperplásicas, cujo

epitélio apresenta alterações genéticas e na sua estrutura, porém ainda não

possuem atipias citológicas. Quando as hiperplasias chegam a apresentar atipias

celulares, ocorre a oclusão dos ductos resultando no carcinoma intraductal in situ

(CIS). Neste estágio, as atipias são mais evidentes e há um aumento significativo da

atividade mitótica epitelial e maiores alterações genéticas. Assim, o processo

progride chegando ao carcinoma localmente invasivo (CI), no qual ocorre o

rompimento da membrana basal e extravasamento das células epiteliais para o

estroma circundante, o que predispõem à disseminação metastática para vários

órgãos, como pulmões, ossos e fígado (TLSTY et al., 2004).

De acordo com a classificação chamada de estadiamento clínico TNM

(T=tumor, N= acometimento linfonodal e M= metástase a distância), preconizada

pela União Internacional Contra o Câncer (UICC), e mais aceito, o câncer de mama

também pode ser classificado em: Tx: tumor não pode ser avaliado; T0: não há

evidência de tumor primário; Tis - carcinoma intraductal in situ/ carcinoma

34

intraductal; Tis - carcinoma intralobular in situ/carcinoma intralobular; Tis (Paget) –

doença de Paget do mamilo sem tumor na mama, ou T1 – tumor ≤ 2 cm em sua

maior dimensão, T1mic (microinvasão) - ≤ 0,1 cm, T1a - >0,1 ≤0,5 cm, T1b - >0,5 ≤

1,0cm, T1c - >1,0 ≤2,0cm, T2 - tumor >2cm ≤5cm em sua maior dimensão, T3 -

tumor >5cm em sua maior dimensão, T4 - tumor de qualquer tamanho, com

extensão direita à parede torácica e/ou à pele, T4a - extensão à parede torácica

(costelas, músculos intercostais e serrátil anterior), T4b - edema (inclusive tipo casca

de laranja), ulceração da pele ou nódulos cutâneos satélites confinados à mesma

mama, T4c - associação de T4a e T4b, T4d - carcinoma inflamatório (BRASIL, 2011;

BRASIL, 2018).

Além dos sistemas de classificação de tumores tradicionais, existem também

os biomarcadores moleculares que auxiliam o diagnóstico e a conduta terapêutica

empregada, como os receptores hormonais de estrogênio e progesterona e o

receptor de crescimento epidérmico humano-2 (HER2) (WEIGEL e DOWSETT,

2010; BRASIL, 2018).

Os receptores de estrogênio e progesterona são os fatores preditivos mais

utilizados para a escolha do tratamento hormonal, sendo que o receptor de

estrogênio tem sido o indicador prognóstico mais estudado. Tal fato se deve à

relação positiva entre a presença do receptor de estrogênio e melhorias na

sobrevida do paciente (ONCOGUIA, 2017; BRASIL, 2018). No tumor receptor

hormonal negativo, a terapia hormonal é menos benéfica e os mesmos tendem a

crescer mais rápido. No câncer de mama triplo negativo, como não há receptor de

estrogênio, progesterona e da proteína HER2, estes crescem e se disseminam mais

rapidamente, e nesse caso o tratamento quimioterápico é a opção mais indicada

(ONCOGUIA, 2017; BRASIL, 2018).

Segundo Weigelt et al. (2005), o óbito dos portadores de tumor de mama é

consequência da disseminação metastática, e não do desenvolvimento do tumor

primário. A disseminação metastática ocorre nos estágios iniciais da doença

(FREUDENBERG, 2009; RUITERKAMP, 2011). Devido a isso, cerca de 80% dos

pacientes com câncer de mama recebem terapia adjuvante. No entanto, 40% destes

pacientes apresentam recidiva e morte em decorrência das metástases (WEIGELT

et al., 2005). Cerca de 36% dos pacientes com câncer de mama metastático morrem

no primeiro ano de acompanhamento médico (ORDING, 2016). Os principais alvos

de metástases do câncer de mama são os ossos, pulmões, fígado e cérebro.

35

Indivíduos que apresentam metástase no cérebro têm o maior risco de mortalidade,

chegando a 62% no primeiro ano de diagnóstico, enquanto os acometidos nos ossos

e pulmões têm 32% de chance de óbito no mesmo período (ORDING, 2016).

Os tumores que são receptores hormonais positivos, como o câncer de

mama, geralmente têm metástases nos ossos. Porém, esse tipo de câncer pode

apresentar metástase em qualquer órgão do corpo, o que dificulta o tratamento e a

sobrevida do paciente (HO, 2015; LOBBEZOO, 2015; ORDING, 2017).

Há aproximadamente uma década, o tratamento do câncer de mama era

conduzido após evidências da morfologia do tumor, e a abordagem cirúrgica

consistia em procedimentos mutilantes de retirada da mama com uma grande

margem de segurança (PACHNICKI et al., 2012; TIEZZI, 2007). Atualmente,

adotam-se procedimentos menos mutilantes, uma vez que a elevada margem de

segurança demonstrou exercer pouca influência no prognóstico. Assim, operações

conservadoras associadas ao tratamento radioterápico tornaram-se eficientes no

controle da doença local (TIEZZI, 2007). Pacientes com câncer mamário não

metastático geralmente utilizam terapias pré-operatórias, o que proporciona a

redução do tamanho do tumor primário (AMOROSO et al., 2015).

No tratamento realizado com terapias hormonais, as drogas utilizadas atuam

de forma a bloquear a ação do estrogênio, e retardam a progressão do tumor, sendo

a primeira escolha para pacientes com câncer de mama em estágio avançado e que

apresente receptores. As drogas mais utilizadas no tratamento hormonal do câncer

de mama são estrogênios, antiestrogênio, progestagênios e androgênios hormonais

(INSTITUTO ONCOGUIA, 2014).

Já a quimioterapia adjuvante é um dos tratamentos que aumenta a sobrevida

do paciente e reduz a taxa de recorrência, com aumento de 2 a 3% da sobrevida

global em dez anos em pacientes que já passaram pela menopausa e que tenham

tumores receptores hormonais positivos. Antraciclinas e taxanos são alguns dos

quimioterápicos utilizados (TESTA e MANO, 2011).

4.3 Células-tronco cancerosas

As células-tronco são definidas como células que possuem a capacidade de

se perpetuarem através da autorrenovação e de se diferenciarem em células

36

maduras de um tecido particular (REYA et al., 2001). Elas são classificadas em

células-tronco embrionárias, presentes apenas nos primeiros estágios do

desenvolvimento e são capazes de originar todos os tipos celulares, e em células-

tronco adultas, células multipotentes, capazes de se diferenciarem em múltiplas

linhagens com expressão de marcadores de superfície específicos do tecido de

origem. As células-tronco adultas podem ser divididas em células-tronco

hematopoiéticas, que dão origem às células sanguíneas, e em células-tronco não

hematopoiéticas (células-tronco mesenquimais), encontradas em todo o corpo,

incluindo medula óssea, cérebro, sangue periférico, vasos sanguíneos, músculo

esquelético, pele, polpa dental, coração, intestino, fígado, epitélio do ovário e do

testículo (ISSCR, 2018).

Muitos tumores contêm células do câncer fenotipicamente e funcionalmente

heterogêneas (MAGEE et al., 2012). Para se explicar a teoria da heterogeneidade

nos tumores, tem-se apresentado dois modelos específicos. No modelo da evolução

clonal, qualquer célula com capacidade proliferativa que sofra mutações genéticas

ou epigenéticas pode levar à formação de novos tumores. No modelo das células-

tronco cancerosas (CTC), apenas uma pequena população de células dentro do

tumor é capaz de proliferar e formar novos tumores. Fatores ambientais e a

diferenciação das células-tronco cancerosas fornecem mecanismos para gerar

heterogeneidade fenotípica e funcional (Figura 7) (REYA et al., 2001; VISVADER e

LINDEMAN, 2008; MAGEE et al., 2012).

37

Figura 7. Fontes de heterogeneidade no câncer

Fonte: MAGEE, PISKOUNOVA et al., 2012. (A) Fatores genéticos ou mudanças epigenéticas; (B)

Fatores do microambiente tumoral; (C) Modelo de células-tronco tumorais, com a hierarquia celular.

Contribuição dos fatores A, B e C para o aumento dessa heterogeneidade (D).

Há cerca de 150 anos observou-se semelhanças entre as células-tronco

embrionárias e adultas com as células cancerosas (WICHA et al., 2006). 82 anos

após essas especulações, pesquisadores confirmaram a existência de células-

tronco cancerosas, mostrando que uma célula tumoral, à semelhança de uma célula-

tronco, foi capaz de gerar células descendentes e favorecer o crescimento de um

novo tumor (MAKINO, 1956; BRUCE, VAN DER GAAG, 1963; KLEINSMITH,

PIERCE, 1964). Autores como Hamburger e Salmon (1977) confirmam a hipótese de

que alguns cânceres podem conter pequenas subpopulações de células idênticas às

células-tronco normais. Bonnet e Dick (1997) identificaram células-tronco

cancerosas em leucemia mielóide aguda humana ao observarem que um pequeno

grupo de células tumorais foi capaz de se replicar facilmente in vitro, enquanto o

mesmo não ocorreu com as demais células leucêmicas. Posteriormente, as células-

tronco foram descritas em diversos tipos tumorais, como próstata, cérebro, ovário,

cólon, pele, pulmão, e, em particular no câncer de mama (PICCIRILLO e VESCOVI,

2007).

38

Atualmente o surgimento, progressão e recidiva de tumores, a ocorrência de

metástases e falhas em terapias têm sido relacionadas às funções orquestradas

pelas células-tronco cancerosas (CTC). Trata-se de uma subpopulação de células

dentro do tumor que apresentam um metabolismo único, autofágico, invasivo e

propriedades de quimiorresistência que lhes permitem renovar continuamente e

resistir às terapias oncológicas (VALLE et al., 2018). Acredita-se que as CTC

possuem a capacidade de auto-renovação e tendem a acumular alterações

genéticas ao longo do tempo, evadindo-se dos mecanismos de controle do

microambiente e, com isso, contribuindo para a evolução tumoral (SHIPITSIN e

POLYAK, 2008) (Figura 8).

Figura 8. Autorrenovação e diferenciação de células-tronco normais e células-tronco

tumorais.

Fonte: JORDAN et al., 2006. A seta curva indica a habilidade de autorrenovação das células-tronco

normal e tumoral. O potencial de multidiferenciação é indicado pelas setas retas contínuas. A seta

pontilhada indica o surgimento das células-tronco tumorais a partir das células progenitoras. As

células-tronco tumorais surgem a partir de mutações nas células-tronco normais ou nas células

progenitoras, que crescem e se diferenciam para produzir o tumor primário.

As CTC também podem se diferenciarem em células maduras de um tecido

particular, assim como possuir longas durações nos ciclos celulares (REYA et al.,

2001). Tais características proporciona a essas células a capacidade de produção

de todos os tipos celulares de um tumor, o que confere a heterogeneidade tumoral

(CAMPBELL e POLYAK, 2007). Possuem ainda, capacidade de quiescência,

39

permanecendo-se em estágio G0, e tornam-se ativadas apenas quando recebem

sinais apropriados do seu nicho. Apresentam também atividade de telomerase ativa,

impedindo que os telômeros se encurtem e consequentemente parem de reproduzir,

e elevado nível de proteínas anti-apoptóticas, como os membros da família Bcl-2 e

inibidores da apoptose, o que confere a elas resistência à apoptose e longevidade

(SOUZA, 2006; WICHA et al., 2006).

Além disso, as CTC possuem habilidade de induzir a angiogênese tumoral,

migração e metástase. A resistência das células-tronco tumorais ao tratamento

quimioterápico é baseada na hipótese de que estas células reúnem características

fundamentais ao fenômeno de resistência, incluindo a capacidade em reparar danos

no DNA, a expressão aumentada de proteínas que realizam o efluxo de agentes

quimioterápicos para fora da célula (transportadores ABC) e a baixa taxa de divisão

celular, fazendo com que não respondam à maioria dos agentes quimioterápicos que

têm como alvo as células em divisão (Figura 9) (DEAN, 2005). Segundo Bozorgi,

Khazaei (2015), as células-tronco cancerosas possuem altos níveis de proteínas

anti-apoptóticas e da enzima aldeído desidrogenase (ALDH). A ALDH, encontra-se

diretamente envolvida, na radiorresistência das CTC por meio da remoção direta de

radicais de oxigênio (ROS) que são produzidos no meio intracelular e pela produção

indireta de nicotinamida adenina dinucleotídeo (fosfato), um composto antioxidante

(considerados aceptores de ROS - ROS scavenging). O paradigma que a resistência

da droga origina no fenótipo de células-tronco pode estimular novas estratégias para

o desenvolvimento de terapias anti-câncer (DEAN, 2005).

40

Figura 9: Os principais mecanismos de resistência terapêutica em células-tronco de

câncer de mama.

Fonte: BOZORGI, KHAZAEI, KHAZAEI, 2015. MDR1 = proteína de resistência a multidrogas 1; P-gp

= glicoproteína P; BCRP = proteína de resistência ao câncer de mama; ABC = cassete de ligação a

ATP; ATM = quinase serina/treonina ATM; ChK = quinase de ponto de checagem; ALDH1 = aldeído

desidrogenase 1; ROS = espécies reativas de oxigênio.

Todas as características inerentes às CTC mencionadas acima fazem com

que o tratamento dessas neoplasias promova uma seleção de células-tronco

tumorais e um repovoamento rápido do tumor, o que ocasiona recorrência de um

tumor muito mais agressivo e resistente (BAO et al., 2006). Dessa maneira, as

células-tronco cancerosas são um alvo atrativo e necessário para terapias contra o

câncer.

4.4 Células-tronco cancerosas em câncer de mama

41

As células-tronco cancerosas em câncer de mama têm sido amplamente

estudadas desde a década de 90. Elas têm apresentado importante influência na

agressividade do tumor e na resistência aos tratamentos em função da capacidade

de auto-renovação e a existência de canais de íons que facilitam o bombeamento de

medicamentos para o meio extracelular (YARAK e OKAMOTO, 2010).

Marcadores de superfície são usados para o isolamento e identificação de

células-tronco cancerosas no câncer de mama, como as proteínas

transmembrânicas com fenótipo CD44+CD24-, identificadas pela primeira vez em

2003 por Al-hajj et al. (2003). Desde então, esse fenótipo tem sido utilizado como um

fenótipo de confiança para o isolamento de células-tronco cancerosas da mama

(BOZORGI et al., 2015).

A glicoproteína de superfície celular CD44 é um receptor específico para o

ácido hialurônico, colágeno, fibronectina e sulfato de condroitina, considerados

componentes importantes da matriz extracelular. Regula a adesão célula-célula e

interação célula-matriz, bem como a migração celular e também a ligação à citocina

osteopontina (BOZORGI et al., 2015 e ORIAN-ROUSSEAU, 2010). Formas variantes

de CD44, em particular CD44v6, possuem expressão tecido-específica e estão

associadas a tumores mais agressivos e pior prognóstico, incluindo o câncer de

mama (AFIFY et al., 2009).

Já a glicoproteína CD24, quando expressa em níveis baixos, CD24-, aumenta

a capacidade de crescimento e metástase tumoral (BOZORGI et al., 2015). Trata-se

de uma proteína mucinosa glicosilada pesada, ligada à membrana celular via âncora

de GPI (Glicosilfosfatidilinositol). CD24 é o ligante de P-seletina, um transportador do

tipo ABC superexpresso em células resistentes a multidrogas e expresso em

receptores de adesão de células endoteliais ativadas e plaquetas, indicando

importante papel no processo de quimiorresistência e metástase (AIGNER et al.,

1998; KIM et al., 2007).Está envolvida na regulação da proliferação celular e na

interação célula-célula, encontra-se expressa em pré-linfócitos B normais, assim

como em vários cânceres hematológicos e em tumores sólidos (LIM, 2005).

Outro importante marcador de células-tronco do câncer da mama é a

atividade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH), uma proteína que provém de

uma família de enzimas presentes no citoplasma responsáveis por catalisar a

oxidação de aldeídos intracelulares, além de oxidar o retinol no ácido retinóico

durante a diferenciação de células-tronco rudimentares. Algumas isoformas da

42

família ALDHA1 têm sido implicadas na progressão e resistência a terapias

(THOMAS et al., 2016). Outros marcadores utilizados para identificar as células-

tronco cancerosas na mama são CD133, CD49f e CD61 (BOZORGI et al., 2015;

SUN et al., 2015).

Algumas vias de sinalização celular são fundamentais para o

desenvolvimento do câncer de mama. As CTC tipicamente demonstram ativação

persistente de um ou mais mecanismos de transdução de sinal envolvidos no

desenvolvimento e homeostase tecidual, incluindo as vias de sinalização Notch, Wnt

e Hedgehog. Alterações nessas vias estão relacionadas com a resistência às

terapias e à proliferação descontrolada de células-tronco cancerosas durante e após

o tratamento (SUN et al., 2015). Em mama, as vias Notch e Hedgehog alteradas

resultam em um fenótipo de células-tronco cancerosas. Os receptores

transmembrana Notch (Notch 1 a Notch 4) são primariamente envolvidos na

comunicação entre células, e apresentam papeis importantes na dormência e

recorrência do câncer de mama. Notch1 tem sido ativado em pacientes

adenocarcinoma negativo para o receptor de estrógeno (GU et al., 2012;

ABRAVANEL et al., 2015). As proteínas da sinalização Hedgehod estão envolvidas

com o desenvolvimento e reparo de tecidos normais embrionários e transição das

células do epitélio para o mesênquima. A cascata de sinalização Wnt promove a

ativação do fator de transcrição β-catenina, a regulação dos níveis de cálcio

intracelular e o citoesqueleto, e desempenha um papel fundamental na auto-

renovação das células-tronco e na preservação de um estado indiferenciado

(BOZORGI et al., 2015).

Os fatores de transcrição também interferem na progressão e resistência do

câncer de mama. SOX2 e NANOG são fatores de transcrição que atuam como

reguladores da pluripotência, além de manter o estado indiferenciado das células.

NANOG é capaz de promover a pluripotência independente da fosforilação de

STAT3 ativada por LIF. Ele também regula 14 dos 22 genes alvos de STAT3

envolvidos na manutenção do estágio indiferenciado. NANOG também regula o ciclo

celular por ligação ao promotor da ciclina D1. Indução de NANOG causa regulação

aumentada de CD133 e ALDH1 (KAUFHOLD et al., 2016). CD133 é uma

glicoproteína transmembrana codificada pelo gene PROM1, está localizado

preferencialmente em protuberâncias e microvilosidades da membrana plasmática,

sendo relacionada com a organização das membranas, metabolismo da glicose e

43

modulação do citoesqueleto. CD133 é o antígeno de superfície celular mais

frequentemente utilizado para detectar e isolar CTCs de tumores sólidos, entre eles

o câncer de mama (GLUMAC e LEBEAU 2018). 43% dos carcinomas basais de

mama possuem expressão aumentada de SOX2 (BOZORGI et al., 2015). Ativação

de SOX2 promove o aumento da proliferação via indução de uma das proteínas

reguladoras do ciclo celular, a ciclina D3 (KAUFHOLD et al., 2016). Wang et al.

(2017) mencionaram em seu estudo que a superexpressão de SOX2 pode aumentar

a proliferação e a invasão de células de câncer de mama e promover o processo da

transição epitélio-mesenquimal (TEM). SOX2 pode ser um biomarcador preditivo do

prognóstico do câncer de mama, e um potencial alvo terapêutico.

4.5 Marcadores putativos de células-tronco cancerosas

Em estudos das células-tronco cancerosas tem-se identificado genes

biomarcadores preditivos para o mau prognóstico em vários carcinomas (YOU,

2018). Sabe-se que detectar células-tronco cancerosas no sangue é importante para

monitorar pacientes com câncer, afim de se identificar as metástases em estágio

inicial e personalização da terapia empregada (MANSOORI et al., 2017).

As vias de sinalização geralmente não atuam sozinhas, interagem com outras

formando uma rede biológica complexa e coordenada, contribuindo para a

diversidade celular das células-tronco durante a embriogênese e a homeostase dos

tecidos. Essa interação pode desempenhar papeis essenciais no câncer e na

biologia da células-tronco cancerosas. A exemplo, observa-se que, ao passo que a

proteína Mel-18, considerada reguladora negativa da autorrenovação da células-

tronco cancerosas do câncer de mama, ao ser inibida, ativa a sinalização da via

Wnt, que, por sua vez aumenta a expressão do gene alvo WNT JAGGED-1, levando

à ativação da via Notch e consequente autorrenovação das células-tronco

cancerosas. Assim como a regulação positiva do gene JAGGED-1, induz a

sinalização da via Notch, elevando a atividade do oncogene β-catenina das

sinalizações de Wnt e Notch em células de câncer colorretal (WON et al., 2012;

KOURY et al., 2017).

Marcadores como SOX2 e NANOG são responsáveis pela regulação da

pluripotência e auto-renovação de células-tronco e por isso desempenham papéis

44

fundamentais na carcinogênese em vários tumores malignos, como de pulmão,

mama e endométrio. O marcador SOX2 está associado positivamente com a

ocorrência de metástases em linfonodos (SHAN et al., 2012; YOU, 2018). O

aumento da expressão do marcador NANOG demonstrou também maior resistência

a terapêuticos, maior metástase e invasão tumoral, tornando o NANOG um

biomarcador de células-tronco cancerosas, fundamental para a auto-renovação e

disseminação de tais células através da via de sinalização do fator de crescimento

IGF1R (SHAN et al., 2012).

Sabe-se que a via de sinalização Notch quando sofre mutações promove a

tumorigênese, inibição da apoptose, além do comprometimento da divisão e

diferenciação celular (SHEN et al., 2016). Shen et al., (2016) retratam que NOTCH

não apenas regula a expressão de células cancerosas, como também facilita a

ativação de células tumorais associadas a macrófagos mediado por TGFβ. Shen et

al., (2016) afirmam ainda que os subtipos de câncer de mama, Câncer de mama

básico (BLBC) e o Câncer de mama Triplo Negativo, são ativados por NOTCH e

altamente infiltrados por macrófagos.

Koury et al., (2017), afirmam que a ativação anormal da via de sinalização

Notch desempenha um papel fundamental nas células-tronco cancerosas no câncer

de mama, pâncreas e glioblastoma. Mencionaram ainda que a inibição da proteína

fascina (proteína agregadora da actina) reduziu o fenótipo de CTCs através da

regulação negativa de genes pluripotentes de células-tronco cancerosas, como

OCT4, NANOG, SOX2 e KLF4, e com isso as células apresentaram menor potencial

para a formação de colônias e tumoresferas. Em contrapartida, a ativação da via de

sinalização de Notch apresentou maior tumorigênese.

Células do câncer de próstata submetidas à transição epitélio mesenquimal

(TEM) exibiram características de células-tronco, caracterizadas pelo aumento da

expressão de Notch 1, além de outros genes pluripotentes como SOX2, NANOG,

OCT4 e LIN28, indicando que a via de sinalização Notch está intimamente envolvida

na TEM (KOURY et al., 2017).

Em pesquisa realizada por Kim et al., (2017), demonstrou-se que níveis

elevados da expressão dos genes relacionados aos marcadores de células-tronco

cancerosas ALDH1 e NOTCH, principalmente o NOTCH3, estavam associados a

células-tronco cancerosas e com o Carcinoma Seroso de Ovário quimiorresistentes

e células de câncer de ovário resistentes ao paclitaxel. Além disso, a elevada

45

expressão do gene NOTCH3 foi associado ao mau prognóstico, ou seja, estágio

avançado, linfonodos e metástases à distância.

A desregulação da sinalização Wnt está ligada à tumorigênese de muitos

tipos de câncer, assim como a resistência aos medicamentos utilizados nas terapias

oncológicas (GENECARDS, 2018; YANG et al, 2017). A via de sinalização Wnt está

envolvida no processo da transição epitélio-mesenquimal (TEM), processo biológico

que permite que a célula epitelial sofra modificações bioquímicas, moleculares e

morfológicos, resultando na aquisição de um fenótipo de células mesenquimais, com

capacidade de migração, invasão, resistência e apoptose. TEM é considerado um

dos passos iniciais na cascata de invasão e metástase tumoral (BEKAII-SAAB,

2017).

A desregulação da via Wnt também está associada à mutação dos genes

APC e β-catenina, visto que a inativação da função da proteína APC resulta da

ativação da sinalização Wnt e fosforilação e degradação de β-catenina. Tais

mutações foram descritas em vários cânceres, incluindo 10% dos cânceres

colorretais. Alterações na via de sinalização Wnt também interrompe o crescimento e

a diferenciação de células-tronco (KOURY et al., 2017).

Identificado pela primeira vez em 2003, o marcador de superfície de

células-tronco cancerosas CD44 é uma glicoproteína de superfície celular e um

receptor específico para o ácido hialurônico. Sua interação com a osteopontina,

proteína de ligação codificada pelo gene SPP1, leva à progressão tumoral, além de

contribuir para a progressão, adesão, movimentação e migração, levando à

angiogênese e metástase tumoral (BOZORGI et al., 2015; KIN, 2018). Kim et al.

(2017) indicaram que as células com fenótipo CD44+/CD24- possuíam maior

resistência à irradiação e superior capacidade de reparar danos ao DNA quando

comparadas com outras células.

4.6 Bioinformática

A bioinformática tem auxiliado pesquisadores e tem sido uma das áreas mais

conspícua na ciência moderna. Esta área do conhecimento envolve aspectos

multidisciplinares e disponibiliza um conjunto variado de ferramentas para

armazenar, processar, analisar e avaliar dados genéticos, bioquímicos e de biologia

molecular, através de experimentos in silico, por meio de simulações

46

computacionais. Além disso, tem sido utilizada em diversas áreas, como a

construção de banco de dados, mineração de dados, análises de sequências,

identificação e análise de genes, relacionamento entre genes e proteínas. A

bioinformática também tem auxiliado os estudos laboratoriais ao prever a

conformação tridimensional das proteínas, construir árvores filogenéticas, modelos

evolutivos, construir bibliotecas genômicas, estudar as funções biológicas, desenho

de drogas, entre muitas outras aplicações (NOTARI, 2012; PEREIRA, 2016).

Uma das áreas pertencente ao estudo da bioinformática é a biologia de

sistemas, campo que investiga as interações entre os componentes de um sistema

biológico e auxilia a compreender como acontecem as interações entre os genes. As

redes biológicas são construídas a partir da teoria dos grafos. Os grafos são

representados por conjuntos de nós ou vértices, conectados entre si por conectores

ou arestas. Os nós podem representar genes, proteínas, indivíduos, enquanto que

as arestas representam a relação entre cada par de nós. Esta representação gráfica

é denominada rede (MOREIRA, 2015; VERLI, 2014).

O estudo de redes de genes ou proteínas depende da integração das

informações disponíveis em bases de dados. A ferramenta GeneCards é um banco

de dados integrado de fácil utilização, que fornece informações genômicas,

proteômicas, transcriptômicas, genética, clínica e funcional sobre todos os genes

humanos anotados e previstos. Dados sobre as funções celulares e o envolvimento

com doenças são também fornecidos por essa base de dados (GENECARDS,

2018). A base de dados Search Tool For The Retrieval Of Interacting Genes/Proteins

(STRING – Ferramenta de Pesquisa para Recuperação de Interações entre

Genes/Proteínas) é uma base de dados de interações entre proteínas ou genes que

incluem associações físicas diretas, indiretas e interações funcionais, que resultem

de previsões computacionais, a partir da transferência de conhecimentos entre

organismos. Interações obtidas de outros bancos de dados interligados, conhecidos

como banco de dados primários, também estão presentes no STRING

(SZKLARCZYK, 2017). Essas interações ajudam a descrever as funções de um

gene. O conhecimento sobre os parceiros na interação é um requisito importante

para entender melhor a função de um gene (FRANCESCHINI et al., 2015).

A base de dados STRING abrange atualmente 9.643.763 proteínas de 2.031

organismos. Todas as associações do STRING são fornecidas com uma pontuação

de confiança probabilística. Essas pontuações são escaladas entre zero e um. Elas

47

indicam a probabilidade estimada de que uma dada interação seja biologicamente

significativa, específica e reprodutível, tendo em vista a evidência de suporte, ou

seja, os canais de evidência. O resultado é uma rede de associações previstas para

um determinado grupo de gene. Os nós da rede são os genes e as arestas

representam as associações funcionais previstas. Uma aresta pode ser

representada com até sete linhas de cores diferentes, sendo que estas linhas

indicam a existência dos tipos de provas utilizadas na previsão das associações

(SZKLARCZYK, 2017).

Os canais de evidência do STRING são o canal de experiências (a evidência

vem de experimentos reais no laboratório), o canal de banco de dados (utiliza dados

que foram afirmados por um curador perito humano), o canal de mineração de textos

(baseado em menções de nomes de proteínas em todos os resumos da PubMed e

em uma coleção interna de mais de três milhões de artigos de texto completo),

o canal de coexpressão (dados de expressão gênica provenientes de uma variedade

de experiências de expressão), canal de vizinhança (canal de predição baseados em

genoma), canal de fusão (os pares de proteínas recebem uma pontuação de

associação quando há pelo menos um organismo onde seus respectivos ortológos

se fundem em um único gene codificador de proteínas) e o canal de co-ocorrência

(avalia a distribuição filogenética de ortólogos de todas as proteínas em um

determinado organismo) (SZKLARCZYK, 2017).

Estudos de bioinformática envolvendo redes de interação gênica em células-

tronco cancerosas do câncer de mama podem assessorar a compreensão a respeito

da biologia dessa condição, e servir de base para estudos celulares e moleculares

futuros.

48

5 METODOLOGIA

5.1 Caracterização do estudo

O presente estudo caracteriza-se como uma pesquisa exploratória de

natureza computacional.

5.2 Identificação dos genes

A identificação dos genes envolvidos com as condições estudadas foi

realizada através de pesquisas na base de dados de genética humana GeneCards®,

utilizando a nomenclatura oficial para genes humanos Human Genoma Organzation

(HUGO). Os descritores adotados para cada condição foram definidos de acordo

com a biblioteca de descritores de assuntos médicos Medical Subject Headings

(MeSH). Como critério de inclusão para a condição “Cancer stem cells”, o termo

selecionado a partir dos descritores do MeSH foi aquele que apresentou o maior

número de genes na rede. Para a condição “Breast cancer”, o termo selecionado foi

o sinônimo que referenciava à condição maligna da mama. Não havia termos válidos

para as condições de “metastasis of breast cancer” e “Breast cancer stem cells”. O

descritor utilizado para a identificação dos genes relativos às células-tronco

cancerosas foi "cancer stem cells". Para o estudo das células-tronco cancerosas no

câncer de mama utilizou-se o descritor "breast cancer stem cells". Os descritores

para câncer de mama e metástase originada do câncer de mama foram “breast

cancer” e "metastasis of breast cancer", respectivamente. Com exceção da condição

câncer de mama, nas demais condições em estudo foram utilizados todos os genes

relacionados ao homo sapiens fornecido pela base de dados genética humana

GeneCards®. No câncer de mama, foram identificados 8.610 genes relacionados a

essa condição, sendo selecionados para o corrente estudo 400 genes com as

pontuações (scores) mais elevadas. Todos os genes estudados possuíram um nível

de confiança acima de 0,9 fornecido pela base GeneCards®.

5.3 Construção e análise do mapa de interações genômico

49

Após a identificação dos genes, foi construído um mapa genômico de cada

condição estudada com o auxílio do software STRING (Search Tool for the Retrieval

of Interacting Genes/Proteins) versão 10.0. Somente as interações gênicas com grau

de confiança acima de 0,9 foram utilizadas nas análises. Foram utilizadas todas as

fontes de interações ativas (mineração de texto, experimentos, base de dados, co-

expressão, vizinhança, fusão de genes e co-ocorrência). No mapa genômico, os nós

das redes representam os genes enquanto as arestas representam as associações

proteína-proteína. Uma aresta pode ser representada por até oito linhas de cores

diferentes, sendo que tais linhas indicam a existência dos tipos de prova utilizadas

nas associações, sejam elas por interações conhecidas ou previstas (SZKLARCZYK

et al., 2017).

A análise do mapeamento da rede de genes na base de dados STRING

resultou em um arquivo Text Output contendo as pontuações para todas as

associações realizadas por cada gene em cada rede em estudo. Assim, tais

pontuações foram tabuladas no editor de planilhas Excel 2013 e multiplicados por

1000. Posteriormente foi realizada a soma da pontuação de interação de cada gene,

com o intuito de encontrar a pontuação única denominada Weighted Number of

Links (WNL), número ponderado de ligações (POSWAR et al., 2015). O WNL refere-

se ao cálculo da soma das associações de cada gene dentro da rede a que pertence

(PEREIRA, 2016). Na presente pesquisa, também foi calculada a pontuação de

interação global dos genes denominada Significant Global Connectivity (TIS),

conectividade global significativa. Os valores de TIS foram estabelecidos somando-

se as associações de cada gene a partir dos valores obtidos do arquivo de

interações globais Protein Network Data gerado pelo software STRING. Ele refere-se

ao cálculo dos valores das associações de cada gene em todas as redes disponíveis

na base de dados do software STRING (PEREIRA, 2016). A razão entre WNL/TIS

representa os genes mais influentes dentro da rede em estudo. Genes que não

realizaram interações são chamados de genes órfãos (POSWAR et al., 2015;

PEREIRA, 2016; SANTOS et al., 2016).

Os genes de cada mapa genômico foram agrupados em função dos seus

valores de WNL por meio da análise de agrupamento realizada pelo algorítmo K-

means no programa de estatística SPSS® PASS Statistic 18.0. Para avaliar as

diferenças entre os grupos gerados pela análise de K-means, foi realizada a análise

de variância (ANOVA) e pós-teste de Tukey Kramer. A significância estatística foi

50

fixada em um P valor < 0,001. Os genes que apresentaram maiores valores de WNL

foram considerados genes líderes (SANTOS et al., 2016).

Gráficos da relação do WNL/TIS e os resultados do agrupamento através do

algoritmo K-means foram construídos no programa SPSS® PASS Statistic 18.0.

5.4 Definição dos genes marcadores putativos de células-tronco cancerosas

Os marcadores putativos de células-tronco cancerosas foram definidos com

base em pesquisas realizadas em artigos científicos publicados na biblioteca

Medical Literature Analysis and Retrieval System Online, MEDLINE, através da base

de dados online de referências de ciências da vida, PubMed. O critério de inclusão

para os genes marcadores de células-tronco cancerosas nesse estudo foi estar

entre os genes mais comumente utilizados nos artigos científicos como marcadores

putativos e estar presente na rede de células-tronco cancerosas do corrente estudo.

Portanto, os genes marcadores putativos de células-tronco cancerosas estudados

foram WNT1, NOTCH1, NANOG, SOX2, CD44 e ALDH1A1.

5.5 Análises das interações realizadas pelos genes marcadores putativos de

CTC

O número de interações realizadas por cada gene marcador de células-tronco

cancerosas foi realizada em cada condição biológica estudada. O gráfico

representativo dessa condição foi construído no programa GraphPad Prisma® 5.0.

Os genes que interagem com os marcadores de células-tronco cancerosas WNT1,

NOTCH1, NANOG, SOX2, CD44 e ALDH1A1 também foram definidos para cada

condição estudada.

51

6 RESULTADOS

Identificação e análise dos genes associados às condições biológicas estudadas

A pesquisa através da base de dados genética GeneCards® permitiu a

identificação de um total de 1116 genes para todas condições estudadas, sendo

que, 1023 genes foram inseridos no estudo por estarem presentes em Homo

sapiens. Na rede de células-tronco cancerosas (CTC) e células-tronco cancerosas

do câncer de mama (CTCM) foram estudados 386 genes e 81 genes,

respectivamente. Na rede do câncer de mama (CM) e na metástase originada do

câncer de mama (MM) foram identificados 396 e 160 genes, respectivamente. Os

mapas das interações gênicas de cada condição podem ser visualizados nas figuras

10 a 13. Os genes que mais interagem apresentam maior número de ligações.

Dentre os 1023 genes inseridos no estudo, 178 (17,4%) genes não

realizaram nenhuma interação gênica dentro da rede, sendo por esse motivo

considerados genes órfãos. A porcentagem de genes órfãos em cada rede foi de

14% em CTC (55 genes), 21% em CTCM (17 genes), 15% em CM (60 genes) e 29%

em MM (46 genes).

52

Figura 10: Mapa de interação dos 386 genes envolvidos na rede de células-tronco

cancerosas.

Fonte: Dados da pesquisa. Construído com nível de confiança > 0,9. Os genes considerados órfãos

são aqueles que não apresentam interação com outros genes da rede. A associação vermelha indica

fusão de genes; verde: genes vizinhos; azul escuro: co-ocorrência de genes; roxa: homologia

proteica; rosa: relação determinada experimentalmente; amarela: relação determinada por estudos de

mineração de textos; azul claro: relação proveniente de um banco de dados com curadoria; preta: co-

expressão gênica.

53

Figura 11: Mapa de interação dos 81 genes envolvidos na rede das células-tronco cancerosas do câncer de mama.






expressão gênica. Fonte: Dados da pesquisa.

54

Figura 12: Mapa de interação dos 396 genes envolvidos na rede do câncer de

mama.






expressão gênica.

55

Figura 13: Mapa de interação dos 160 genes potencialmente envolvidos na rede de

metástase de origem no câncer de mama.






expressão gênica.

A análise do número ponderado de interações dentro da rede (WNL) em

função das interações realizadas na rede global (TIS) permitiu a distribuição dos

genes por grupo e a identificação dos genes considerados líderes de cada condição.

As figuras 14 a, 15 a, 16 a e 17 a apresentam as distribuições de todos os genes em

função dos valores de WNL e TIS. Percebe-se em tais figuras que todos os genes

líderes se encontram acima da linha de tendência de regressão (R2 linear). Em cada

56

rede estudada, foram considerados genes líderes os 8 genes com maiores valores

de WNL. A tabela 1 apresenta os genes líderes de cada condição estudada.

O gene TP53 apresentou maior valor de WNL nas redes de células-tronco

cancerosas (CTC), metástase originada do câncer de mama (MM) e na rede do

câncer de mama (CM). Em CTC e MM, o gene TP53 foi o único gene do grupo A

(grupo portador do maior WNL), enquanto na rede de CM o grupo A foi composto

pelos genes TP53 e PIK3CA. Já na rede das células-tronco cancerosas do câncer

de mama, os genes STAT3, EGFR, CTNNB1 e JUN foram evidenciados no grupo A.

A comparação dos genes líderes em cada condição estudada demonstra que

EGFR foi um gene líder presente em todas as condições estudadas. TP53, STAT3 e

JUN também se destacaram porque foram evidenciados em 3 condições. Os grupos

de CTC e CTCM apresentaram o maior número de genes líderes em comum

(STAT3, EGFR, CTNNB1, JUN e NOTCH1). NFKB1, FOS e ESR1 foram genes

líderes da rede de CTCM que diferiram dos líderes da rede de CTC. TP53, AKT1 e

EGFR foram genes líderes da rede de CTC que também se encontraram na rede de

CM. TP53, EGFR, STAT3 e JUN foram genes comuns aos grupos CTC e MM.

Tabela 1: Genes líderes das condições estudadas

Células-tronco cancerosas

Células-tronco cancerosas do câncer de mama

Câncer de Mama Metástase originada do câncer de mama

Genes

Grupos Genes Grupos Genes Grupos Genes Grupos

TP53 AKT1

CTNNB1 MYC JUN

STAT3 EGFR

NOTCH1

A B B B C C D D

STAT3 EGFR

CTNNB1 JUN

NFKB1 NOTCH1

FOS ESR1

A A A A B B B C

TP53 PIK3CA AKT1 EGFR

MAPK1 EP300 SRC CDK2

A A B C C C C C

TP53 EGFR STAT3

JUN HDAC1 ERBB2 VEGFA HDAC2

A B C C C D D D

Fonte: Dados da pesquisa.

As análises dos dados relacionadas ao agrupamento e distribuição de genes

por grupos estão representadas nas figuras 5b, 6b, 7b e 8b. A análise preliminar de

k-means revelou os genes pertencentes a cada grupo nas condições em estudo,

sendo 14 grupos para a rede de células-tronco cancerosas e para a rede do câncer

de mama, 6 grupos para células-tronco cancerosas do câncer de mama e 9 grupos

57

para a rede de metástase originada do câncer de mama. A partir da análise Anova

One Way, identificou-se que houve diferença estatisticamente significante nos

valores de WNL dos grupos de cada condição estudada, todos os p valores foram p<

0,001.

Figura 14: Distribuição dos genes da rede de células-tronco cancerosas em função

das interações gênicas e análise de agrupamento.

Fonte: Dados da pesquisa. Representação dos genes em função dos valores de WNL (número ponderado de ligações) e TIS (Conectividade Global Significativa) (a). Distribuição dos genes por análise de agrupamento k-means (b).

Figura 15: Distribuição dos genes da rede de células-tronco cancerosas da mama

em função das interações gênicas e análise de agrupamento.

Fonte: Dados da pesquisa. Representação dos genes em função dos valores de WNL (número

ponderado de ligações) e TIS (Conectividade Global Significativa) (a). Distribuição dos genes por

análise de agrupamento k-means (b).

58

Figura 16: Distribuição dos genes da rede de câncer de mama em função das

interações gênicas e análise de agrupamento.

Fonte: Dados da pesquisa. Representação dos genes em função dos valores de WNL (número ponderado de ligações) e TIS (Conectividade Global Significativa) (a). Distribuição dos genes por análise de agrupamento k-means (b).

Figura 17: Distribuição dos genes da rede de metástase de mama em função das

interações gênicas e análise de agrupamento.

Fonte: Dados da pesquisa. Representação dos genes em função dos valores de WNL (número

ponderado de ligações) e TIS (Conectividade Global Significativa) (a). Distribuição dos genes por

análise de agrupamento k-means (b).

59

Análise de marcadores putativos de células-tronco cancerosas nas redes de CTC,

CTCM, CM e MM

Os marcadores putativos de células-tronco cancerosas WNT1, NOTCH1,

NANOG, SOX2, CD44 e ALDH1A1 foram obtidos a partir de informações da

literatura. Todos estão presentes na rede de células-tronco cancerosas e percebeu-

se na figura 18 a que tais genes possuem distintos valores de WNL e TIS. Destacou-

se também na figura 18, a presença dos marcadores de células-tronco cancerosas

nas condições CTCM (Figura 18 b), CM (Figura 18 c) e MM (Figura 18 d). O único

marcador presente em todas as quatro condições é o CD44, cujo valor de WNL foi

abaixo da linha de tendência regressiva (R2 Linear) em CTC, CTCM e CM. Na rede

de metástase do câncer de mama, o marcador CD44 possui uma maior interação

com a rede de metástase (WNL acima da linha de tendência regressiva) e menor

interação com outras redes (baixo TIS). O marcador NOTCH1 foi encontrado nas

redes de CTC, CTCM e CM, estando acima da linha de tendência regressiva em

todas as redes (Figuras 18 a, 18 b, 18 c). Esse marcador foi o marcador de células-

tronco cancerosas com melhores combinações de alto WNL e baixo TIS nas redes

de células-tronco cancerosas (CTC e CTCM). Já o marcador WNT1 foi encontrado

nas redes de CTC e CTCM (Figuras 18 a e 18 b), em ambas acima da linha de

tendência regressiva. Dentre os marcadores em estudo, NANOG foi o que

apresentou o maior valor de TIS, e apresentou-se nas redes de CTC e CTCM

(Figuras 18 a, 18 b). SOX2 também foi evidenciado apenas nas redes de CTC e

CTCM apresentando valores de WNL acima da linha de tendência regressiva e

baixo valor de TIS (Figuras 18 a, 18 b), enquanto que o marcador ALDH1A1 foi

encontrado nas redes de CTC e CM apresentando os menores valores de WNL

quando comparado aos demais marcadores (Figuras 18 a, 18 c).

60

Figura 18: Representação dos marcadores putativos de células-tronco cancerosas.

Fonte: Dados da pesquisa. Redes de células-tronco cancerosas (a), células-tronco cancerosas no

câncer de mama (b), câncer de mama (c) e metástase originada do câncer de mama (d).

Os genes que interagem com os marcadores putativos de células-tronco

cancerosas ALDH1A1, CD44, NANOG, NOTCH1, SOX2 e WNT1 foram avaliados e

representados na Tabela 2. A rede que apresentou um maior número de interações

gênicas com os marcadores putativos de CTC foi a rede de células-tronco

cancerosas, com 105 interações, seguida da rede de CTCM com 39 interações,

câncer de mama com um total de 38 interações e por último a rede de metástase

com apenas 10 interações. A rede de metástase apresentou apenas um marcador

putativo, o CD44. Os genes líderes de cada condição biológica estudada foram

representados com um asterisco.

A análise das interações realizadas por cada gene marcador de células-

tronco cancerosas revelou que o ALDH1A1, apesar de fazer parte das redes das

células-tronco cancerosas e do câncer de mama, com 01 interação em cada rede

(Figura 19), não apresentou nenhuma interação com as redes de CTCM e MM

(Tabela 2). Este marcador também não interagiu com nenhum gene líder das

condições estudadas.

61

O gene CD44 foi o único marcador selecionado que apresentou interação

com as quatro condições estudadas. Na rede de CTC ele realizou 11 interações, em

CTCM 04, no CM 09 interações e na rede de MM 10 interações (Figura 19). Além

disso, esse marcador realizou interações com genes líderes em todas as redes,

EGFR, MYC, STAT3 e TP53 (CTC), EGFR e STAT3 (CTCM), TP53 (CM) e EGFR,

ERBB2, STAT3 e TP53 na (MM). Também foram evidenciadas interações com

genes relacionados à carcinogênese, como o gene supressor de tumor TP53, o fator

de transcrição e oncogene STAT3, os receptores de fator de crescimento epidérmico

(EGFR e ERBB2), bem como com genes que participam do processo de metástase,

como FN1, MMP2 e MMP9.

O marcador NANOG realizou interações apenas nas redes de CTC (13

interações) e CTCM (08 interações), sendo que na primeira ele interagiu com quatro

genes líderes (CTNNB1, STAT3, TP53 e NOTCH1) e na rede de CTCM com três

genes líderes (NOTCH1, STAT3 e CTNNB1). NANOG interagiu com os genes KLF4,

LIN28A, MTOR, POU5F1, SOX2 em ambas as redes CTC e CTCM.

Já o gene marcador de células-tronco cancerosas NOTCH1 foi detectado

nas redes de CTC, CTCM e CM. Apesar de não ter realizado interações com a rede

de metástase do câncer de mama, foi o marcador que fez mais interações, um total

de 94, sendo que 54 interações foram realizadas na rede de células-tronco

cancerosas, 17 na rede de CTCM e 23 interações em CM (Figura 19). Este

marcador interagiu com os genes CTNNB1 e HIF1A nas três condições CTC, CTCM

e no CM. Apresentou interações com os genes líderes AKT1, CTNNB1, STAT3,

JUN, TP53, EGFR e MYC na rede de CTC, CTNNB1, STAT3, JUN, EGFR, FOS e

NFKB1 na rede de CTCM e os líderes AKT1 e EGFR no CM. NOTCH1 e CD44

foram os marcadores de células-tronco cancerosas que mais fizeram interações com

os genes líderes (Tabela 2).

O marcador SOX2 realizou 13 interações na rede de CTC e 06 interações na

rede CTCM. Em ambas as redes, SOX2 interagiu com apenas um gene líder, o

STAT3 (tabela 2). KLF4, LIN28A, NANOG, POU5F1 e TWIST1 interagiram com

SOX2 nas redes CTC e CTCM.

62

O marcador WNT1 apresentou interações com as redes de CTC (13

interações), CTCM (04 interações) e CM (05 interações). Nas três condições, ele

realizou interação com o gene CTNNB1, sendo que nas redes de CTC e CTCM este

gene aparece como gene líder.

Figura 19:Número de interações realizadas por marcadores de células-tronco.

CSC CSCM CM MM0

20

40

60ALDH1A1

CD44

NANOG

NOTCH1

SOX2

WNT1

Condições

Nú

mero

de i

nte

raçõ

es

Fonte: Dados da pesquisa. Células-tronco cancerosas (CTC); Células-tronco do câncer de mama (CTCM); Câncer de mama (CM) e Metástase originada do câncer de mama (MM).

63

Tabela 2: Interações realizadas por marcadores de células-tronco cancerosas.

Fonte: Dados da pesquisa. Células-tronco Cancerosas (CTCs); Células-tronco cancerosas do câncer

de mama (CTCM); Câncer de Mama (CM) e Metástase originada do câncer de mama (MM). Genes

em destaque são os considerados líderes na pesquisa. *Genes líderes.

ALDH1A1

CTC CYP2C9

CTCM

- Câncer de mama

CYP1A1

Metástase

-

CD44

CTC CDH1, EGFR*, ERBB2, HLA-A,

ICAM1, IQGAP1, MMP9, MYC*,

SPP1, STAT3*, TP53*

CTCM

CDH1, EGFR*, ERBB2,

STAT3*

Câncer de mama

ERBB2, FN1, HMMR,

MMP2, MMP9, PTPRC,

SPP1, TP53*, TRIM25

Metástase

B2M, CDH1,

EGFR*,

ERBB2*,

FN1, MMP2,

MMP9, SPP1,

STAT3*,

TP53*

NANOG

CTC CDX2, CTNNB1*, FGF2, GATA6,

KLF4, LIN28A, MTOR,

NOTCH1*, POU5F1, SOX2,

STAT3*, TDGF1, TP53*

CTCM

CTNNB1*, KLF4, LIN28A,

MTOR, NOTCH1*,

POU5F1, SOX2, STAT3*

Câncer de mama

- Metástase

-

NOTCH1

CTC

ADAM17, AKT1*, APC, ATOH1,

BCL2, BMP4, CCND1, CDH1,

CDKN1A, CTBP1, CTNNB1*,

DLL1, DLL4, E2F1, E2F3,

EGFR*, ERBB2, ERBB3, EZH2,

FBXW7, FOS, FOSL1, GLI1,

HDAC3, HEY1, HIF1A, IGF1R,

IKZF1, IL4, JAG1, JUN*, KLF4,

MMP9, MYC*, NANOG, NCSTN,

NFKB1, NOTCH3, NOTCH4,

NUMB, POGLUT1, POSTN,

PTEN, SKP1, SKP2, SMAD3,

SNAI1, SNAI2, SOX9, STAT3*,

TCF3, TFDP1, TP53*, WNT5A

CTCM

CDH1, CTNNB1*, DLL4,

EGFR*, ERBB2, FOS*,

FOSL1, HIF1A, JUN*,

KLF4, NANOG, NCSTN,

NFKB1*, NOTCH4, SNAI2,

STAT3*, TCF3

Câncer de mama

AKT1*, APC, CCND1,

CDKN1A, CTNNB1,

E2F1, E2F3, EGFR*,

EP300, ERBB2,

FBXW7, FOS, GATA3,

HDAC1, HDAC4,

HDAC6, HIF1A, JUN,

MYC, NOTCH4,

PSEN2, RBBP8, SKP2

Metástase

-

SOX2

CTC ATOH1, CDX1, CDX2, FGF2,

KLF4, LIN28A, NANOG,

POU5F1, POU5F1B, PROM1,

STAT3*, TDGF1, TWIST1

CTCM

KLF4, LIN28A, NANOG,

POU5F1, STAT3*, TWIST1

Câncer de mama

- Metástase

-

WNT1

CTC

BMP4, CCND1, CTNNB1*,

HDAC3, LRP6, NOTCH2,

PPARG, PPARGC1A, RAC1,

SHH, WIF1, WNT5A, WNT5B

CTCM

CTNNB1*, LRP6, PPARG,

WIF1

Câncer de mama

CTNNB1, GSK3B,

RAC1, WNT10B,

WNT5A

Metástase

-

64

7 DISCUSSÃO

Após a descoberta de que uma população de células do tumor de mama,

conhecidas como células-tronco, apresenta importante papel na iniciação e

disseminação do tumor, uma série de pesquisas têm sido realizadas para identificar

as cascatas de sinalizações e as proteínas envolvidas com a manutenção das

características de células-tronco (MANI et al., 2008; DITTMER, 2018). Na busca por

novas terapias e alvos que possam identificar essas células na massa tumoral e

eliminá-las sem o comprometimento do bem estar do paciente, a identificação de

candidatos a biomarcadores torna-se um importante ponto de partida (CORRÒ e

MOCH, 2018). Assim, propusemos no corrente estudo avaliar por abordagem

computacional as redes de interações gênicas das condições células-tronco

cancerosas, células-tronco cancerosas do câncer de mama, câncer de mama e

metástase originada do câncer de mama, assim como fazer um paralelo entre genes

importantes para essas condições.

O corrente estudo revelou que a rede de células-tronco cancerosas apresenta

386 genes envolvidos com essa condição, sendo 8 deles (TP53 (Proteína

supressora de tumor p53), AKT1 (AKT Serina/Treonina Quinase 1 ) CTNNB1 (Beta

Catenina 1), MYC (Proto-Oncogene MYC, Fator de Transcrição BHLH), JUN (Jun

Proto-Oncogene, Subunidade Fator de Transcrição AP-1), STAT3 (Transdutor de

Sinais e Ativador da Transcrição 3), EGFR (Receptor do Fator de Crescimento

Epidérmico), NOTCH1 (Proteína Notch associada à translocação TAN-1))

considerados líderes em função das suas elevadas interações dentro da rede. O

gene TP53 se destacou como o maior gene líder dessa rede e também foi

considerado líder nas condições de câncer de mama e metástase originada do

câncer de mama. Conhecido como um guardião do genoma, o gene TP53 codifica

uma proteína chamada p53, que faz parte de uma família de proteínas com atividade

supressora de tumor (MAXIMOV e MAXIMOV, 2008). Em condições normais, essa

proteína induz o bloqueio do ciclo celular, senescência e apoptose em resposta aos

eventos de estresse celular, como hipóxia e danos no DNA (PERRI et al., 2016).

Mutações no gene TP53 evidenciadas no câncer de mama têm contribuído para a

sua progressão. Em células-tronco cancerosas, evidências indicam que a proteína

p53 está diretamente relacionada com processos de auto renovação, diferenciação,

65

quiescência e resistência a fármacos. Apesar de não ter sido considerado um gene

líder das células-tronco cancerosas da mama, a proteína p53 regula a pluripotência

celular por promover, por exemplo, bloqueio da expressão de Nanog e da proteína

quinase de adesão focal (FAK) (PRABHU et al., 2012). Na sinalização cruzada entre

a proteína quinase de adesão focal (FAK), p53, Mdm2 e Nanog, FAK fosforila Mdm2

para facilitar a ubiquitinação e degradação de p53, o que tem sido implicado na

proliferação de CTC, mobilidade, invasão e diferenciação. Em contrapartida, a

ativação de p53 inibe Nanog e FAK, favorecendo a manutenção das características

das células-tronco (OLIVOS e MAYO, 2016). Quando Nanog ativa FAK, e FAK

estável fosforila Nanog, esta sinalização cruzada favorece a mobilidade e invasão

das células-tronco cancerosas e tem um papel significante na metástase tumoral

(GOLUBOVSKAYA, 2013). Em tumores de mama, mutações em p53 foram

correlacionadas com expressão elevada de FAK (GOLUBOVSKAYA, 2013). A

desregulação de p53 tem sido descrita em vários estudos como um fator para o

favorecimento da migração celular, transição epitélio-mesenquimal e metástase.

Receptores de adesão celular, integrinas, ativação de fatores de crescimento, como

EGFR, entre outros, são componentes que também contribuem para a promoção de

metástases com a proteína p53 mutada (ARJONEN et al., 2014; CHANDER et al.,

2014).

No câncer de mama também foram evidenciados 8 genes líderes (TP53,

PIK3CA (Subunidade Catalítica de Fosfatidilinositol-4,5-Bisfosfato 3-Quinase Alfa),

AKT1, EGFR, MAPK1 (Proteína Quinase Ativada por Mitógeno 1), EP300 (Proteína

de Ligação E1A P300), SRC (Proto-oncogene SRC, tirosina quinase não receptora),

e CDK2 (Quinase Dependente de Ciclina 2) e 396 genes envolvidos com essa

condição. Os genes líderes desse estudo, com exceção do gene MAPK1, podem ser

considerados candidatos a drogas em função de suas elevadas interações nas

redes em estudo e baixa interação nas redes globais. MAPK1, diferente dos demais

líderes, apresentou alta interação na rede de CM e nas redes globais (elevado TIS).

O gene PIK3CA juntamente com o gene TP53 foram os genes que apresentaram as

maiores quantidades de interações na rede, sendo por isso evidenciados no grupo

A. Este gene é fundamental na via de sinalização fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K),

com implicações em diversos eventos celulares, tais como proliferação,

diferenciação e migração. Em câncer de mama, cerca de 27% de mutações são

66

detectadas em PIK3CA (MANGONE et al., 2012). Evidências sugerem que

mutações em TP53 e PIK3CA são frequentes no câncer de mama e podem ser

considerados fatores chaves para a progressão desse tipo de câncer. PIK3CA e

TP53 são os genes mais comumente mutados em cânceres de mama positivos para

o receptor de estrógeno e negativos para esse receptor, respectivamente (KIM et al.,

2017). Estudos relatam associação entre a ocorrência de mutações do éxon 20 do

gene PIK3CA com a presença de mutações do gene TP53 (MANGONE et al., 2012;

KOTOULA et al., 2016). Em função disso, inibidores de PI3K já estão sendo

utilizados no tratamento de pacientes com câncer de mama apresentando mutações

em PI3KCA na triagem clínica (KIM et al., 2017).

Os genes STAT3, EGFR, CTNNB1, JUN, NFKB1 (Subunidade Kappa B do

Fator Nuclear 1), NOTCH1, FOS (Proto-Oncogene Fos, Subunidade Fator de

Transcrição AP-1) e ESR1 (Receptor de estrogênio 1) foram identificados como

líderes na rede de interação gênica das células-tronco cancerosas do câncer de

mama, sendo que STAT3, EGFR, CTNNB1 e JUN estão presentes no grupo A desta

condição com valores elevados de WNL e baixos de TIS. O gene STAT3 é um fator

de transcrição intrínseco na promoção da tumorigênese, atuando na invasão e

crescimento de tumores, sendo ativado pela fosforilação do resíduo de tirosina por

pela proteína JAK (LIU et al., 2016). Em nosso estudo, STAT3 foi considerado um

dos genes líderes em CTC, CTCM e MM. Thakuret et al. (2015) relataram que a

inibição da via de sinalização STAT3 compromete a manutenção das células-tronco

do câncer de mama no microambiente tumoral. O segundo líder desse grupo foi o

gene EGFR. A superexpressão ou ativação do gene EGFR está diretamente

relacionado a um prognóstico ruim em vários tipos de tumores sólidos, incluindo o

câncer de mama (KANG et al., 2017). Manupati et al. (2017) sugeriram que em

função da alta expressão de EGFR nas células-tronco cancerosas do câncer de

mama em comparação com as demais células cancerosas da mama, este gene

pode ser um bom alvo terapêutico. E ainda, a atenuação da via de sinalização EGFR

levou à reversão da TEM em CTC de mama, juntamente com uma maior capacidade

de resposta a quimioterápicos. Em nosso estudo, que não tem como proposta

avaliar a intensidade da expressão gênica, mas a importância dele na rede em

termos de número de interações realizadas, percebe-se uma importância do EGFR

como gene líder em ambas as redes. CTNNB1 também foi um gene evidenciado no

grupo A em CTCM. Ele é um membro chave na via de sinalização Wnt/β-catenina,

67

que está associada ao desenvolvimento e progressão do câncer e na manutenção

das CTCs. Esse gene encontra-se também envolvido na manutenção de

marcadores putativos de CTCs, como é o caso do CD44 e CD133 (MOON et al.,

2014). O gene JUN também se apresentou no grupo A da rede de células-tronco do

câncer de mama, sendo considerado líder em CTC, CTCM e MM. O proto-oncogene

Jun e a proteína β-catenina regulam a transcrição de NANOG, conferindo habilidade

de autorenovação às CTCs (IBRAHIM et al., 2012).

Conforme esperado, a rede de células-tronco cancerosas e a rede de

células-tronco cancerosas do câncer de mama apresentaram o maior número de

genes líderes em comum (STAT3, EGFR, CTNNB1, JUN e NOTCH1). As proteínas

sintetizadas por esses genes têm em comum a participação nos mecanismos que

regulam a pluripotência celular, modulando as atividades de proliferação,

diferenciação e apoptose (KIDDER et al., 2008; SOLOZOBOVA e BATTLER, 2011;

TANABE et al., 2016; AI et al., 2017). EGFR tem a capacidade de acelerar o

processo de proliferação das células-tronco pluripotentes e atrasar sua senescência,

atuando também em interação com outros genes, entre eles o gene STAT3 (AI et al.,

2017). A proteína beta-catenina 1 interage com moléculas de sinalização, como por

exemplo Wnt e Notch, culminando na transcrição de genes relacionados à

proliferação celular (TANABE et al., 2016).

A análise comparativa dos genes líderes das condições de CTC e CM

revelou que AKT1 e EGFR são fundamentais para ambas as condições. A proteína

Serina/Treonina Quinase 1 (AKT1) juntamente com PI3K são necessários para a

manutenção das características de células-tronco em CM, e participam de eventos

celulares como proliferação, sobrevivência, crescimento e angiogênese (GARGINI et

al., 2015). Elevada incidência de mutações no gene AKT1 relaciona-se à redução da

sobrevida das CTC, redução na geração de células CD44+/CD24-, perda do fenótipo

de células-tronco mesenquimais e recuperação de marcadores epitelais. Segundo

Gargini et al. (2015), a identificação de PIK3 e AKT são prováveis relevantes alvos

terapêuticos. De maneira similar, EGFR contribui com a expressão de marcadores

de auto-renovação, ativação da proliferação, invasão e resistência das células-

tronco aos tratamentos quimioterápicos (ABHOLD et al., 2012; HAN et al., 2013).

EGFR encontra-se superexpresso em 15-20% de todos os carcinomas mamários e

em 50-70% de câncer de mama triplo negativo, e sua alta expressão associa-se a

68

um maior volume tumoral, ocorrência de metástases e pior sobrevida (KOZLOVA et

al., 2017).

A comparação entre os genes líderes das CTC e MM revelou que EGFR,

STAT3 e JUN são relevantes para o perfil de CTCs assim como para as células

metastáticas originadas do câncer de mama. Conforme relatado anteriormente,

EGFR atua ativando vários outros genes, inclusive STAT3, atuando sobretudo no

aumento da proliferação e disseminação das células tumorais. C-jun, um proto-

oncogene superexpresso em CM, ativa fatores de transcrição e também contribui

para a auto renovação das CTCs, formação de angiogênese e disseminação

metastática, o que justifica o elevado número de interações realizadas por esses

genes em ambas as redes.

Nos últimos anos, esforços consideráveis foram investidos na detecção e

caracterização de marcadores de células-tronco cancerosas. O resultado é que há

um número cada vez maior de tais moléculas marcadoras, inclusive que diferem

entre tipos tumorais. A maioria dos marcadores já descritos são proteínas. Alguns

são lipídeos e carboidratos (KARSTEN e GOLETZ, 2013). WNT1, NOTCH1,

NANOG, SOX2, CD44 e ALDH1A1 foram os genes marcadores de células-tronco

cancerosas observados em nosso estudo.

O marcador putativo de células-tronco cancerosas NOTCH1 foi o único

marcador identificado como gene líder das CTCs, e inclusive das CTCM. Isso

demonstra que esse gene e, consequentemente, sua proteína, são importantes para

a identificação fenotípica bem como a manutenção das características típicas de

uma célula-tronco cancerosa. NOTCH1 foi também o marcador putativo de CTCs

que mais realizou interações nas redes do corrente estudo, um total de 94

interações. Ele somente não fez parte da rede de metástase. Nas redes de CTC e

CTCM foram registradas interações com 54 e 17 genes, respectivamente. Em CTC,

NOTCH1 interage com todos os genes líderes. Em CTCM, ele só não interagiu com

o gene líder ESR1. Na rede do CM, NOTCH1 interagiu com 23 genes, dentre eles

dois líderes (AKT1 e EGFR). Interações com CTNNB1 e HIF1A foram observadas

em todas as três redes.

A regulação de NOTCH1 na via Wnt está relacionada à sua ação sobre a

translocação de β-catenina para o núcleo, e consequente ativação da transcrição de

69

diversos genes (ISHIGURO et al., 2017). Conforme mencionado anteriormente, β-

catenina ativa a sinalização Wnt e, consequentemente, estimula a proliferação

celular. De maneira similar, HIF1A é uma subunidade de um fator de transcrição,

HIF1, que regula a resposta celular em condições de hipóxia. A hipóxia lidera o

recrutamento de HIF1A nos promotores responsivos a NOTCH1, e eleva a

expressão de genes regulados por NOTCH1. Segundo Gustafsson et al., (2005), a

hipóxia bloqueia a diferenciação de células progenitoras através da regulação de

Nocht1. Esses dados reforçam a importância de NOTCH1 como um gene necessário

à manutenção das células-tronco cancerosas. Estudos relatam a participação da

proteína Notch1 nos eventos relativos à proliferação, invasão e quimioresistência em

cânceres, entre eles o câncer de mama (VENKATESH et al., 2018) (BOSE, 2017;

BRZOZOWA-ZASADA et al., 2017; HARBUZARIU et al., 2016). A alta de expressão

de NOTCH1 tem sido correlacionada com menor diferenciação do câncer de mama,

com 80% das hiperplasias epiteliais do tipo usual, 67% dos carcinomas ductais in

situ, 89% dos carcinomas ductais invasivos e 57% dos carcinomas lobulares

invasivos, além de ser fundamental na transição epitélio mesenquimal. A ativação do

gene JAG1 por NOTCH1, evidenciada na rede de células-tronco cancerosas,

contribui diretamente para a indução da TEM e disseminação metastática ao ativar

NF-κB e seus genes alvo a jusante, as metaloproteinases da matriz MMP2, MMP9 e

o fator de crescimento VEGF (Li et al., 2014; BRZOZOWA-ZASADA et al., 2017;

RIZZO et al., 2008; SHAO et al., 2015).

Outro biomarcador que se destacou no presente estudo foi o gene CD44,

em especial porque foi o único marcador que realizou interações em todas as redes

em estudo. CD44 realizou 34 interações nas quatros redes, sendo 11 delas na rede

de CTC, 4 na rede de CTCM, e 9 em CM. Foi o único marcador que esteve presente

na rede de metástase originada do câncer de mama (MM), com 10 interações. Em

todas as redes o marcador CD44 apresentou interação com genes líderes, como o

gene supressor de tumor TP53, o fator de transcrição e oncogene STAT3, os

receptores de fator de crescimento epidérmico (EGFR e ERBB2), bem como com

genes que participam do processo de metástase, como FN1, MMP2 e MMP9. Nas

redes de CTCM, CM e MM, o marcador CD44 fez interações com os genes líderes

EGFR, ERBB2, STAT3 e TP53, o que reforça o envolvimento desse gene nos

processos de desenvolvimento e disseminação das células tumorais da mama

(OWCZAREK et al., 2017; WINCEWICZ et al., 2011). Por se tratar de uma

70

glicoproteína de superfície celular e um receptor específico para o ácido hialurônico,

sua ligação ao ácido hialurônico favorece a proliferação, migração e invasão de

células neoplásicas da mama (ESMAEILI et al., 2018). Foi também o marcador que

apresentou o menor valor de TIS, fazendo com que seja um importante candidato à

inativação pela sua baixa relevância em outras redes.

O marcador WNT1 realizou interações nas redes CTC, CTCM e CM. Em

todas interagiu com o gene CTNNB1, um dos genes líderes das CTC e CTCM. É

uma proteína de sinalização pertencente à família de ligantes WNT, implicada em

diversos fenômenos relativos à embriogênese, diferenciação e migração celular

(JANDA et al., 2012; ANSHULA et al., 2017). Ligantes de WNT ativam moléculas de

sinalização que estimulam a transcrição genética e acúmulo de β-catenina no

núcleo. β-catenina associa-se ao fator de transcrição funcional (TCF), um fator de

transcrição que interfere na transativação de genes envolvidos com a progressão do

tumor, invasão e consequente metástase. Estudos demonstram que muitos ligantes

de WNT promovem a transição epitélio-mesenquimal e a atividade de CTC em

vários tipos de tumores, e em especial o aumento na expressão de WNT1 promove

um enriquecimento da população de CTC (ALOK et al., 2017; MUZIO, 2001; ZHANG

et al., 2017). A superexpressão de Let-7 inibe a sinalização WNT1, sendo por esse

motivo considerado um bom indicador da intensidade de células-tronco cancerosas

(JIN et al., 2016).

O marcador NANOG, fator de transcrição envolvido com a auto-renovação

de células-tronco embrionárias indiferenciadas, tem sido estudado como um dos

genes mais expressos heterogeneamente em células-tronco cancerosas e em

células-tronco induzidas. NANOG desempenha importante papel na manutenção da

auto renovação celular e da pluripotência. Presente na rede de células-tronco

cancerosas e células-tronco cancerosas da mama, NANOG foi o marcador que

apresentou o maior valor de TIS, o que sugere que possui uma maior interação com

outras redes. Subpopulações de células-tronco com baixa expressão de Nanog são

mais propensas à diferenciação do que as que apresentam alta expressão (YU et

al., 2018; GLAUCHE et al., 2010).

Estudos tem mostrado que o marcador NANOG realiza interações com

importantes genes específicos de célula-tronco, como o SOX2. Essa interação

também foi evidenciada em nossa rede de células-tronco cancerosas (MITSUI et al.,

2003; YU et al., 2018). Além disso, ele realizou interações com quatro genes líderes

71

na rede de células-tronco cancerosas, CTNNB1, NOTCH1, STAT3 e TP53, e com

três genes líderes na rede de células-tronco cancerosas na mama, CTNNB1,

NOTCH1 e STAT3. NANOG interagiu ainda com os genes KLF4, LIN28A, MTOR,

POU5F1, SOX2 nas duas condições de CTC e CTCM. De maneira similar, Sox2

também realizou interações apenas nas redes de CTC e CTCM, e interagiu com

KLF4, LIN28A, POU5F1 e TWIST1, que também foram ligantes de NANOG.

KLF4, Kruppel Like Factor 4, é um membro da família KLF de fatores de

transcrição, envolvido na regulação da proliferação, diferenciação, apoptose e

reprogramação de células somáticas, exercendo papel fundamental na indução de

células-tronco pluripotentes (TAKAHASHI et al., 2007). Yori et al. 2011

demonstraram que o KLF4 inibiu a invasão e a metástase distal do câncer de mama

pela supressão da transição epitelial-mesenquimatosa, enquanto que Foster et. al.,

2005 apontaram que a expressão de KLF4 foi aumentada em 70% das amostras de

tecido de câncer de mama. É possível que KLF4 funcione ora como um oncogene,

ora como supressor de tumor, dependendo do tipo histológico e microambiente

(SONG et al., 2017; MOON et al., 2011). LIN28A, proteína de ligação de RNA que

regula a auto renovação de células-tronco, assim como POU5F1, também conhecido

como Oct-4, são considerados marcadores de células-tronco embrionárias humanas

indiferenciadas (TSIALIHAS e ROMER, 2015; CAI et al., 2016; MAHERALI et al.,

2007). Em estudo, Shen et al. (2017) identificou que Lin28A pode ativar o receptor

de andrógenos (AR) por meio da regulação de c-myc e promover o crescimento do

tumor mamário ER-/Her2+ através da proliferação e invasão de células de câncer de

mama. Sendo assim, LIN28A pode ser um alvo interessante para o tratamento do

câncer de mama ER-/Her2+. Kearney et al. (2010) identificaram baixa expressão de

LIN28A em câncer de mama e malignidades humanas avançadas. Cai et al. 2016

encontraram que a elevada expressão de POU5F1/Oct-4 em tecidos do câncer de

mama estão associados à metástase com linfonodos sentinelas e à distância. A

interação molecular entre Nanog, Sox2 e Oct-4 está diretamente ligada à

pluripotencia e regulação de células estaminais mesenquimais (GAGLIARDI et al.,

2013; NIU et al., 2011; MOHAMMADIAN e NEGAHDARI, 2017). SOX2 também

interagiu com oncogene TWIST1, presente na rede de CTC e CTCM. TWIST1 tem

sido expresso em vários carcinomas metastáticos, relacionando-se aos mecanismos

de angiogênese, extravasamento e instabilidade cromossômica, além de proteção

contra apoptose (PUISIEUX et al., 2006). Tais características sugerem que TWIST1

https://en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mohammadian%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29199459

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mohammadian%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29199459

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seja responsável pela manutenção de células-tronco cancerosas e consequente

resistência à quimioterapia (ROBERTS et al., 2016). Wu e Yang (2011) identificaram

que TWIST1 é expresso em condições de hipóxia, associando-se à resistência à

quimioterapia, já que células hipóxicas respondem menos a drogas quimioterápicas.

Relatos da literatura apontam também que as populações tumorais

enriquecidas para a atividade ALDH1, considerado também como um marcador de

células-tronco, mostraram ter maior mobilidade, potencial de invasão e metástase

do que a maior parte da população de células de câncer (LI et al., 2017). A enzima

ALDH1 catalisa a oxidação intracelular de aldeídos, em especial a oxidação de

retinol a ácido retinóico, o que é essencial para a diferenciação inicial das células-

tronco, e em contrapartida tem sido apontado como a causa da resistência dessas

células a drogas (CHUTE et al., 2006; ROUDI et al., 2015). A combinação entre a

alta razão CD44/CD24 e ALDH1+ é uma forma de se caracterizar células-tronco

cancerosas da mama (LI et al., 2017). Apesar de ser um marcador usual para CTC

na literatura, ALDH1A1 foi encontrado nas redes de CTC e CM apresentando os

menores valores de WNL quando comparado aos demais marcadores. Foi também

o marcador que menos realizou interações nas redes estudadas, interagindo apenas

com CYP2C9 em CTC e CYP1A1 em CM. Mesmo não tem sido evidenciadas muitas

interações nas redes estudadas, o gene ALDH1A1, assim como outros marcadores

de células-tronco avaliados nesse trabalho, são comprovadamente importantes no

estudo e identificação das células-tronco cancerosas, bem como são importantes

marcadores da evolução da neoplasia maligna. Estudos posteriores podem ser

realizados com outros genes relevantes para as CTC, em especial as CTCM, e que

não são considerados genes líderes.

73

8 CONCLUSÃO

O presente estudo relatou, por meio de ferramentas de bioinformática, as

redes de interações gênicas evidenciadas nas condições de células-tronco

cancerosas, células-tronco cancerosas do câncer de mama, câncer de mama e na

metástase originada do câncer de mama.

Além disso, os resultados obtidos permitem concluir que:

1- Os mapas de interação gênica das redes de células-tronco cancerosas,

células-tronco cancerosas de mama, câncer de mama e metástase de mama

revelaram 386, 81, 396 e 160 genes, respectivamente.

2- Os genes TP53, AKT1, CTNNB1, MYC, JUN, STAT3, EGFR e NOTCH1

foram os genes que mais interagiram na rede de células-tronco cancerosas,

sendo por isso considerados os líderes dessa condição.

3- Os genes STAT3, EGFR, CTNNB1, JUN, NFKB1, NOTCH1, FOS e ESR1

foram os genes líderes da rede de células-tronco cancerosas do câncer de

mama.

4- Os genes TP53, PIK3CA, AKT1, EGFR, MAPK1, EP300, SRC e CDK2 foram

os genes líderes da rede do câncer de mama.

5- Os genes TP53, EGFR, STAT3, JUN, HDAC1, ERBB2, VEGFA e HDAC2

foram os genes líderes da rede de metástase de originada da mama.

6- As redes de CTC e CTCM apresentaram maior número de genes líderes em

comum. EGFR foi gene líder em todas as condições estudadas. TP53, STAT3

e JUN também foram genes líderes que se destacaram porque estiveram

presentes como líderes em três condições estudadas.

7- Todos marcadores de CTCs, WNT1, NOTCH1, NANOG, SOX2, CD44 e

ALDH1A1, apresentaram-se no grupo de CTC, destacando-se o CD44 que

realizou interações em todas as elas.

8- NOTCH1 realizou interações nas redes de células-tronco (CTC e CTCM) e

CM. NANOG, WNT1 e SOX2 apresentaram interações apenas nas redes de

células-tronco cancerosas. ALDH1A1 apresentou-se apenas nas redes CTC e

CM, mas com apenas 1 interação em cada rede.

9- NOTCH1 é considerado um marcador de células-tronco cancerosas e foi

também considerado gene líder dessa condição.

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