Identificação e Mapeamento de Genes Associados a Mecanismos de

Fitopatogenicidade de Crinipellis perniciosa Através da Obtenção de

ESTs Projeto de Doutorado Direto e

Resultados Parciais

Orientador: Gonçalo A. G. PereiraCo-orientador: Lyndel W. Meinhardt

Doutoranda: Johana Rincones

IntroduçãoIntrodução• A Vassoura-de-Bruxa:

– Grande importância econômica para o Brasil (15% a 4% em 10 anos)

– Crinipellis perniciosa– Basidiomiceto, Agaricales, Tricholomataceae– Ciclo de vida hemibiotrófico– Projeto Genoma– Bla bla bla bla.....................

IntroduçãoIntrodução• Por que ESTs (Expressed sequence tags)?

– cDNA: seqüências codantes livres de introns– cDNAs podem ser seqüenciados completos ou como

ESTs gerando 300 a 500 bp ou ~100 aa para busca por similaridade

– Complementam o seqüenciamento genômico:• Nível de complexidade de um tecido• Influência de fatores ambientais sobre a expressão do

tecido• Úteis no mapeamento físico• Identificação de introns e exons• Estudo evolutivo de genes e clonagem

IntroduçãoIntrodução• Bases de dados no GeneBank e COGEME

possuem seqüências de ESTs para mais de 20 fungos, alguns dos quais são fitopatogênicos

• A análise por similaridade dos ESTs de C. perniciosa permitiria estabelecer a função putativa de ~40% dos genes

• Alinhamentos entre os ESTs e a seqüência genômica permitiriam identificar introns, exons e seqüências regulatórias

• Mapeamento físico, identificação de genes alvo para drogas ou inativação com sondas antisense, sondas para microarrays

JustificativaJustificativa• Um dos primeiros em analisar cDNAs associados

à fitopatogenicidade de um fungo geneticamente complexo e com o genoma em andamento

• O estudo da expressão gênica do fungo durante a interação com o hospedeiro facilitaria a compreensão da doença e os mecanismos gerais de fitopatogenicidade

• Microarrays não fornecem informações sobre seqüência, tamanho e localização dos cDNAs

• Complementa o mapeamento proposto no projeto de mestrado

Projeto de MestradoProjeto de Mestrado• “Mapeamento físico do genoma de C. perniciosa”:

– Estabelecimento do cariótipo molecular por PFGE– Seleção de clones de DNA genômico para

localização cromossômica (Contigs, funcionais)– Arranjo destes clones em membranas de nylon– Eluição das bandas cromossômicas a partir dos

géis de PFGE e marcação radioativa – Hibridização Southern para estabelecer a

localização cromossômica dos clones selecionados

– Anotação dos genes e agrupação dos contigs por cromossomo

ObjetivosObjetivos• Ampliar o mapa físico do projeto de mestrado

com informações referentes a:– Expressão gênica: identificação de genes de

fitopatogenicidade– Estrutura destes genes: introns, exons,

seqüências regulatórias Mediante a construção de biblioteca subtraída de

cDNA e seqüenciamento de ESTs• Localização cromossômica por hibridização• Clonagem e seqüenciamento de transcritos

completos a partir de bibliotecas não subtraídas

Materias e MétodosMaterias e Métodos• Linhagem: CP02 (Genoma) com 8 cromossomos

de 2,9 a 5,9 Mb e um tamanho total de ~30 Mb• Extração de RNA total em presença e ausência de

extrato de cacau• Obtenção de mRNA• Síntese de cDNA: “Hibridização Subtrativa por

Supressão” e construção de bibliotecas full-length• Clonagem e seqüenciamento de ~5000 ESTs• Análise das seqüências e seleção de 96 clones

para mapeamento e 96 clones para obtenção de seqüência completa (full-length cDNA)

RNA TotalRNA Total• Extração de RNA total:

– Meio sintético (6 g/L KNO3, 0,52 g/L KCl, 0.52 g/L MgSO4, 1,52 g/L KH2PO4, traços FeSO4 e ZnSO4 e pH 6,8) contendo 10 g/L Glicose (Driver) ou 10 g/L Cacau (Tester)

– 5 períodos de crescimento: 3 curtos (24h, 48h e 72h) e 2 longos (6 dias e 8 dias)

– Micélio macerado em nitrogênio líquido, extraído com TRIzol e PVP-40 e precipitado em isopropanol e citrato de sódio: Polisacarídeos!

RNA TotalRNA Total– Os RNAs dos 5 períodos de crescimento para

cada amostra (Tester e Driver) foram misturados e purificados em coluna Qiagen

Cacau Glicose 24h 48h 72h 6d 8d 24h 48h 72h 6d 8d

mRNA e cDNAmRNA e cDNA• Extração de mRNA

– Com oligo dT biotinilado e partículas paramagnéticas com estreptavidina (Promega). Amostras concentradas em SpeedVac para obter ~1ug/uL. cDNA obtido por extensão de primer polyT e transcriptase reversa (primeira fita) e com T4 DNA polimerase (segunda fita) (Clontech)

1 2 3

bp

1353—603 ---310 ---

1- phiX174/Hae III

2- cDNA a partir de mRNA de placenta humana (Kit)

3- cDNA a partir de mRNA de Cp extraído em Glicose (Driver)

mRNA e cDNAmRNA e cDNA• Amplificação do mRNA e síntesis de cDNA por

LD-PCR (SMART- Clontech)5’ PolyA 3’

mRNA

Primer SMART

GGG

GGGCCC

Primer PCR LD-PCR

TR

cDNA fita simples

cDNA dupla fita amplificado

Primer dT modificado5’

CCC 5’3’

CCC3’ 5’GGG 3’5’

5’5’ PolyA 3’

Degradação RNA

mRNA e cDNAmRNA e cDNA 1 Kb 15 18 21 24 27 30

1 Kb 15 18 21 24 27 30

2500 bp ----2000 bp ----------------

1500 bp----1000 bp----

500 bp----

Glicose Cacau

A padronização resultou num número ótimo de 18 ciclos para a amostra crescida em Glicose e 21 ciclos para a amostra crescida em Cacau

mRNA e cDNAmRNA e cDNA

1Kb M G18 C21

3000 bp----2500 bp----

2000 bp----1500 bp----1353 bp----------1078 bp----------

872 bp----------

603 bp----------

310 bp----------281 bp--------------------

271 bp----------234 bp--------------------

194 bp----------

Após a padronização, a reação foi repetida num volume final de 100 uL e utilizando o número otimizado de ciclos para cada amostra.

Estes cDNA de dupla fita serão utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA full-length utilizando a metodologia SMART (Clontech)

Primers sintetizados por Imprint funcionaram

Número ótimo de 19 ciclos para Glicose e 26 ciclos para Cacau

A reação foi repetida num volume total de 200 uL para hibridização subtrativa

mRNA e cDNAmRNA e cDNA• LD-PCR para biblioteca subtrativa (Primers SuperSMART)

Hae P18 G18 C21

bp

1353--

603---310---

G21 G24 C24 C27

~2000

~700

Bibliotecas Bibliotecas Full-lengthFull-length

• O cDNA amplificado por LD-PCR foi purificado e digerido com Sfi I para eliminação dos primers e criação das bordas cohesivas necessárias para a clonagem direcionada no plasmídio pDNR-Lib (Clontech)

M 1 2 3 4 5 6 1 – Glicose após LD-PCR (18 ciclos)

2 – Glicose após purificação (GFX, Amersham)

3 – Glicose após digestão com Sfi I

4 – Cacau após LD-PCR (21 ciclos)

5 – Cacau após purificação

6 – Cacau após digestão com Sfi I

Bibliotecas Bibliotecas Full-lengthFull-length• Os produtos da digestão foram fracionados por

tamanho para evitar a presência de fragmentos pequenos que clonan preferencialmente

M G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 10 11 12

M 13 14 15 16 M C1 C2 C3 C4 C5 C6

M C7 C8 C9 10 11 12 13 14 15 16

Foram coletadas as frações 6, 7, 8 e 9 de cada amostra e precipitadas em presência de glicogênio overnight

Os cDNA de cada amostra foram ligados no plasmídeo pDNR-Lib (Clontech) e transformados em células eletrocompetentes de E. coli DH5

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• Hibridização Subtrativa por Supressão (PCR-

Select, Clontech)cDNA Tester e Driver

Digestão com Rsa I (GTAC)

Tester dividido em duas populações, cada com um adaptador diferente

Hibridização normaliza e enriquece com seqüências presentes unicamente no Tester

Moldes para PCR são gerados a partir de seqüências diferenciais

PCR de Supressão

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• Digestão com Rsa I

MM 1 2 3 4 5 6

bp

1353-

603--310--

1 – Driver após LD-PCR (19 ciclos)2 – Driver após purificação3 – Driver após digestão com Rsa I4 – Tester após LD-PCR (26 ciclos)5 – Tester após purificação6 – Tester após digestão com Rsa I

MM 1 2 3 4 5 6

1 – Driver após digestão2 – Driver após purificação3 – Driver após precipitação 4 – Tester após digestão5 – Tester após purificação6 – Tester após precipitação

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• Ligação dos adaptadores e hibridização

Tester com Adaptador 1 Driver Tester com Adaptador 2

Primeira hibridização6-8 horas

Segunda hibridização: mistura as amostras em presência de mais driver

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• PCR de Supressão

Preenche as bordas PCR com primers dos adaptadores

Não amplifica

Amplificação linear

Amplificação Exponencial

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• Teste de eficiencia da ligação dos adaptadores

M 1 2 3 4 5 6

1 – T/Adap1 FN For e PCR Primer 2 – T/Adap1 FN For e FN Rev3 – T/Adap2 FN For e PCR Primer4 – T/Adap2 FN For e FN Rev 5 – Full-length cDNA Primer FN For e FN Rev

1 – T/Adap1 FN For e Nest Primer 12 – Idem3 – T/Adap2 FN For e Nest Primer 24 – Idem 5 – Idem6 – Full-length cDNA e PCR Primer

M 1 2 3 4 5

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• PCR de Supressão

M 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

1 – PCR primária (primer PCR) da subtração2 – PCR primária do controle não subtraído3 – PCR primária do controle do kit4 – PCR secundária (Primers nested 1 e 2) da subtração5 – PCR secundária do controle não subtraído6 – PCR secundária do controle do kit

Hibridização SubtrativaHibridização Subtrativa• Clonagem em vetor TA:

• A PCR secundária foi repetida utilizando 10 ciclos ao invés de 15 e os produtos de PCR foram ligados no vetor TOPO TA (Invitrogen) segundo instruções do fabricante

• Células elotrocompetentes de E. coli DH5 foram transformadas com o vetor por eletroporação

• As bactérias não cresceram...

• Análise das seqüências: Bioinfo

• Eluir as bandas cromossômica de géis de pulsed-field: Gabriel

Próximas EtapasPróximas Etapas• Verificar a eficiência da subtração com ensaios de

hibridização• Validar as bibliotecas por seqüenciamento: Raquel

• Mapeamento dos clones• Seleção de clones para obtenção de transcritos

completos• Screening das bibliotecas full-length

• Seleção dos clones para mapeamento