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IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO DA
MATRIZ EXTRACELULAR PELA TÉCNICA FLUORIMÉTRICA NO
TECIDO COLORRETAL NEOPLÁSICO E NÃO NEOPLÁSICO
Acadêmica: Gabriela Tognini Saba
Orientador: Prof. Dr. Jaques Waisberg
IX CICI – Congresso de Iniciação Científica do IAMSPE
10.12.2015
INTRODUÇÃO
Estudo realizado na Disciplina de Biologia Molecular da Universidade
Federal de São Paulo (UNIFESP), no Serviço de Gastroenterologia
Cirúrgica do Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo (IAMSPE)
e no Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina do ABC.
Projeto aprovado em comissão de ética em pesquisa do IAMSPE (parecer
número 090/04)
INTRODUÇÃO
Ácido Hialurônico (AH): polissacarídeo encontrado na superfície celular e
matriz extracelular de quase todos os tecidos humanos 1,2
• Um dos principais componentes da matriz pericelular que circunda células
tumorais
• Sintetizado na membrana plasmática por ação da enzima hialurônico sintetase e
chega à matriz celular por alongamento de sua cadeia 3
http://www.madsci.org/posts/archives/2001-
04/986571103.Bc.r.html em 03/11 /2015 às
21:52
INTRODUÇÃO
Altas concentrações AH:
• Remodelação tecidual fisiológico (rápida proliferação celular) ex. cicatrização de
feridas e desenvolvimento fetal 2,4
• Tumores humanos: Mesotelioma5, Tumor de Wilms6, Tumor de Mama7, Tumor
Gástrico8,9 e Tumor Colorretal10,11
Nos tecidos neoplásicos, altas concentrações de AH estimulam:
• Motilidade celular 12
• Adesão celular 13
• Neovascularização 14
• Protege da ação de células citotóxicas 16 e agentes quimioterápicos 17,18,19
OBJETIVO
Verificar, por espectrometria de massa, a presença e a quantificação de
glicosaminoglicanos no tecido colorretal neoplásico e não neoplásico.
MATERIAIS E MÉTODOS
Esse estudo foi realizado de acordo com os padrões éticos aceitos pela
Declaração de Helsinki da Associação Médica Mundial, adotado em 1964 e
emendado em 1996.
Critérios de Inclusão:
• Doentes adultos de ambos os sexos
• Carcinoma do intestino grosso confirmado pelo estudo histopatológico da lesão
extirpada
Critérios de Exclusão:
• Presença de outra neoplasia maligna concomitante ou prévia em qualquer outra
localização
CASUÍSTICA
Duas amostras de tecidos obtidas de 64 pacientes com carcinoma
colorretal sem doença metastática e que foram operados de 2005 a 2006 no
Departamento de Cirurgia do Hospital do Servidor Público Estadual
• Área macroscópica de tecido neoplásico
• Área de tecido não neoplásico (10cm acima da neoplasia)
DOSAGEM DO AH Realizada por método fluorimétrico20 no Laboratório de Biologia Molecular da
UNIFESP
1. Amostras de concentrações desconhecida de AH provenientes da proteólise do tecido
2. Diluídas em tampão Tris-HCI 0,05M (pH 7,75, contendo 0,15M de NaCI e 1% de BSA)
3. Aplicada em triplicatas na placa de leitor de ELISA (modelo ELX 800, Universal
Microplate Reader, Bio-tek Instruments Inc., Highland Park, WI, USA) previamente
tratada com sonda
4. Incubação por 12h a 40 graus Celsius, lavagem com Tris-HCl e incubação com sonda
Biotinilada para AH
5. Revelação com Estreptavidina (Perkin-Elmer, Wallac Oy, Turku, Finlândia) marcada
com európio
6. Incubação com solução enriquecedora (Perkin-Elmer, Wallac Oy, Turku, Finlândia) para
liberação do európio retido na placa
A fluorescência do európio foi medida por fluorímetro e a concentração do HA foi
determinada com a utilização de programa específico para esse sistema
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Utilizou-se software SPSS, versão 13.0 (SPSS Inc., lllinois, USA)
• Média aritmética
• Desvio Padrão
• Teste t student com medidas repetidas
Nível de significância fixado em 0,05 (5%)
RESULTADOS
64 pacientes: 37 mulheres (57,8%)
27 homens (42,2%)
Média de idade: 68,5±7,3 anos (44-81a)
Localização do CA: 32 no Reto (50,0%)
32 no Cólon
(50,0%) 17 Direito
(26,6%)
15 Esquerdo (23,4%)
Figura 1. Medidas descritivas para HA segundo
localização, sexo, estadiamento TNM, classificação
Dukes, comprometimento linfonodal e invasão vascular (*
= P<0.05)
RESULTADOS
Nos doentes sem comprometimento linfonodal, a quantificação do
HA, inclusive do HA com baixo peso molecular, foi maior no tecido
neoplásico do que no não neoplásico (p=0,06).
No grupo de doentes com comprometimento linfonodal, não houve diferença
na quantificação de HA entre o tecido neoplásico e não neoplásico.
Não houve relação entre o tamanho da neoplasia colorretal e a quantidade
tecidual de HA.
RESULTADOS
Expressão de AH foi menor no tecido neoplásico que na mucosa adjacente
não neoplásica. (p=0,87)
10.00000000
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0
100
HLS B HA 100 (1.900) Cm (78:152) 1: TOF MS ES- 267421.2171
160.8507
323.0026
210.9637757.2626
619.2938497.5421
1995.43481129.75201022.6401884.3260 1892.66061719.35511398.11331248.6136 1527.8442
OHO
HO
OH
NH
O
O
O
OHO
HOOH
O
O
NH
OH
HO O
OO
O
OH
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Espectro - HA
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HO
OHO
HO
OH
N10.00000000
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0
100
HLS B HA 100 (1.900) Cm (78:152) 1: TOF MS ES- 267421.2171
160.8507
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210.9637757.2626
619.2938497.5421
1995.43481129.75201022.6401884.3260 1892.66061719.35511398.11331248.6136 1527.8442
10.00000000
m/z100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900
%
0
100
HLS B HA 100 (1.900) Cm (78:152) 1: TOF MS ES- 267421.2171
160.8507
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210.9637757.2626
619.2938497.5421
1995.43481129.75201022.6401884.3260 1892.66061719.35511398.11331248.6136 1527.8442
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HO
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Espectro - HA
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OH
N
Figura 2. Espectro de massa
referente à degradação do tecido
colorretal com hialuronidase (AH, do
inglês, HA).
RESULTADOS
Análise da eletroforese em gel de tris-acetato para verificar o perfil do AH
nos tecidos analisados encontrou-se a presença de AH de baixo peso.
Figura 3. Gel de tris-acetato com
identificação de ácido hialurônico (AH, do
inglês, HA) de baixo peso nas amostras
de tecido colorretal.
Pa
drã
o
AA
E-N
AA
E-C
AM
A-N
AM
A-C
AP
P-N
AP
P-C
HA de baixo
peso molecular
Pa
drã
o
AA
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AA
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AM
A-N
AM
A-C
AP
P-N
AP
P-C
Pa
drã
o
AA
E-N
AA
E-C
AM
A-N
AM
A-C
AP
P-N
AP
P-C
HA de baixo
peso molecular
RESULTADOS
Figura 4. Fragmentação referente a
degradação do HÁ com hialuronidase.
DISCUSSÃO O estroma da maioria dos tumores malignos, incluindo o câncer
colorretal, contém mais AH do que o dos correspondentes tecidos não
neoplásicos 10,29
• O AH tem diferentes papéis na neovascularização dependendo dos seus
fragmentos de baixo peso molecular 14,37
• A síntese de HA é regulada por fibroblastos do estroma circundante que abrem
espaços através do tecido conjuntivo e, assim, facilitando a disseminação de
células neoplásicas 29
• O aumento da concentração de HA estimula a motilidade das células neoplásicas 12
A variabilidade nos níveis citosólicos de HA no carcinoma colorretal, o que
parece estar relacionado à heterogeneidade biológica destes tumores. 10
• Nível elevado de HA associado com resultado desfavorável no carcinoma
colorretal ressecável.
• O HA pode fornecer informações adicionais às fornecidas por outros marcadores
bioquímicos atualmente utilizados no câncer colorretal
Em neoplasias avançadas, a elevação dos níveis de HA pode ser a
consequência do bloqueio da drenagem linfática, que é a via de depuração
do HA 11
DISCUSSÃO
O ácido hialurônico apresentou menor expressão no tecido tumoral em
comparação ao tecido não neoplásico AH de baixo peso molecular não
biotinilado.
• A determinação da quantidade de HA no tecido colorretal empregada dependeu da
interação entre o HA com a proteína de ligação biotinilada, sendo tal interação
dependente do tamanho da molécula de HA.
• Os picos encontrados no espectro de massa, também se referem ao HA de baixo
peso molecular.
O HA de baixo peso molecular, mas não o HA de elevado peso molecular,
reduziu o crescimento do carcinoma colorretal in vitro e in vivo. 2
O HA promove a adesão à laminina e pode facilitar a invasão da membrana
basal e o aparecimento de metástase 6
CONCLUSÃO
Entender como as mudanças na superfície celular e composição e na
sequência dos GAG extracelulares influencia a capacidade das células e
tecidos para alterar dinamicamente as respostas às moléculas de
sinalização.
• Compreensão de como as mudanças em um nível molecular manifesta-se em
relação ao fenótipo celular.
• Enorme potencial do método para análise em estudos de interação de
glicosaminoglicanos altamente heterogêneos;
A quantificação do HA no tumor pode ser útil para a identificação de um
subgrupo de doentes com tumores podem ser resistentes à quimioterapia.
REFERÊNCIAS1. YURCHENCO, P.D., SCHITTNY, J.C. (1990) - Molecular architeture of basement membranes. FASEB J 4: 1577-1590.
2. HERSZÉNYI, L.; PLEBANI, M.; CARRARO, P.; DE PAOLl, M.; ROVERONI, G.; CARDIN, R; FOSCHIA, F.; TULASSAY, Z.; NACCARATO, R and FARINATI, F. (2000) - Proteases in
gastrointestinal neoplasic diseases. Cliniea Chimiea Aeta, 291: 197¬187.
3. L10TTA, L.A. and WEWER, R C. (1986) - Biochemical interactions of tumor cells with the basement membranes. Annual Reviews of Biochemistry 55: 1037 - 1057.
4. SAMPAIO, L.O.; DIETRICH, C.P. and FILHO, O.G. (1977) - Changes in the sulfated mucopolysaccharide composition in mammalian tissue during growth and in cancer tissue. Biochim.
Biophys. Acta 498: 123¬-131.
5. VYNIOS, D.H.; KARAMANOS, N.K. and TSIGANOS, C.P. (2002) ¬Advances in analysis of glycosaminoglycans: its application for the assessment of physiological and pathological states of
connective tissue. J. Chromatography B (Review).
6. WEGROWSKI, Y. and MAQUART, F.X. (2004) - . Involvement of stromal proteoglycans in tumour progression. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 49 (3) : 259-68.
7. HASCALL, V.C. and HASCALL, G.K (1981) - Proteoglycasn. In Cell Biology of Extracellular Matriz. E.D. Hay, editor. Plenum Press, New York, 39-63.
8. DIETRICH, C.P. (1984) - A model for cell-cell recognition and control of cell growth mediated by sulfated glycosaminoglycans. Braz. J. Med. Bio!. Res. 17: 5 - 15.
9. NADER, H.B.; DIETRICH, C.P.; BUONASSISI, V. and COLBURN, P. (1987) - Heparin sequences in the heparan sulfate chains of the endothelial cell proteoglycan. Proc. Natl. Aead. Sei.
USA 84: 3565¬3569.
10. MICHELACCI, Y.M. and DIETRICH, C.P. (1986) - Structure of chondroitin sulphate from whale cartilage: distribution of 6- and 4-sulphated oligosaccharides in the polymer chains. Int. J. Biol.
Maeromol. 8: 108¬113.
11. DIETRICH, C.P. and DIETRICH, S.M.C. (1972)- A simple micromethod for the identification of heparin and other acidic mucopolysaccharides from mammalian tissues. Ana!. Biochem., 46:
209-215.
12. TOLEDO, O.M. and DIETRICH, C.P. (1977) - Tissue specific distribution of sultated mucopolysaccharides in mammals., Biochim. Biophys. Acta 498: 114-122.
13. POBLACIÓN, C.A and MICHELACCI, Y.M. (1986) - Structural differences of dermatan sulfates frem different origins. Carbohyd. Res. 147. 87¬100.
14. SAMPAIO, L.O. and DIETRICH, C.P. (1981) - Changes of sulfated mucopolysaccharides and mucopolysaccharidases during fetal development, The Journal of Biological Chemistry 256:
9205-9210.
15. JERONIMO, S. A; FERNANDES, M.Z.; MELO, F.P.; SAMPAIO, L.O.; DIETRICH, C.P and NADER, H.S. (1994) - Glycosaminoglycan structure and content differ according to the origins of
human tumors. Brazilian joumal of medical and biological research 27: 2253-2258.
16. BERTO AGA, O. S.; MICHELACCI, Y.M. and SAMPAIO, L.O. (2001) -Galactosaminoglycans from normal myometrium and leiomyoma. Brazilian journal of medical and biological research
,34: 633-637.
17. SILVA, M.E. and DIETRICH, C. P. (1975) - Structure of heparin. Characterization of the products formed from heparin by the action of a heparinase from Flavobacterium heparinum. J. Biol.
Chem. 250: 6841-6846.
18. DIETRICH, C.P.; TERSARIOL, I.L.; TOMA, L.; MORAES, C.T.; PORCIONATTO, M.A.; OLIVEIRA, F.W. and NADER, H.B. (1998) ¬Structure of heparan sulfate: identification of variable and
constant oligosaccharide domains in eight heparan sulfates of different origins. Cell Moi Biol (Noisy-Ie-grand) 44(3):417-29.
REFERÊNCIAS
20. GAMBARINI, AG.; MIYAMOTO, C.A; LIMA, G.A; NADER, H.B. and DIETRICH, C.P. (1993) - Mitogenic activity of acidic fibroblast growth factor is enhanced by highly sulfated oligosaccharidesderived from heparin and heparan sulfate. Moi Cell Biochem. 124(2):121-9.
21. PORCIONATTO, M.A; NADER, H.B. and DIETRICH, C.P. (1999) ¬Heparan sulfate and cell division. Braz J Med Biol Res.;32(5):539-44.
22. DIETRICH, C.P.; NADER, H.B. and STRAUS, A.H. (1983) - Structural differences of heparan sulfates according to the tissue and species of origin. Biochemical and biophisical researchcommunications 111(3): 865-871.
23. HYEONG-ROK, K; MARIE, AW.; CHRISTOPHER, M.W.; JOJI, 1.; DAVID, E. and MELANIE, AS. (2004) - Hyaluronan Facilitates Invasion of Colo Carcinoma Cells in Vitro via Interaction withCD44. Caneer Researeh 64: 4569-4576.
24. TOOLE, B.P. (2002) - Hyaluronan promotes the malignant phenotype.
Glycobiology, 12: 37R-42R.
25. HAYEN, W.; GOEBELER, M.; KUMAR, S.; RIESSEN, R and NEHLS, V. (1999) - Hyaluronan stimulates tumor cell migration by modulating the fibrin fiber architecture. J Cell Sei, 112: 2241-2251.
26. ZHANG, Y. ; THANT, A. A. ; MACHIDA, K. ; ICHIGOTANI, Y. ; NAITO, Y. ; HIRAIWA, Y.; SENGA, T. et aI. (2002) - Hyaluronan-CD44s signaling regulates matrix metalloproteinase-2 secretion in a human lung carcinoma cell line QG90. Cancer Res, 62: 3962-3965.
27. L1U, N.; GAO, F.; HAN, Z.; XU, X.; UNOERHILL, C.B. and ZHANG, L. (2001) - Hyaluronan synthase 3 overexpression promotes the growth of TSU prostate cancer cells. Câncer Res 61 (1): 5207-5214.
28. SCOTT, J.E. (2001) - Structure and function in extracellular matrices depend on interactions between anionic glycosaminoglycans. Patho!. Biol 49: 284-289.
29. Zaia, J. and Costello, C.E. (2001)- Tandem mass spectrometry of sulfated heparin-like glycosaminoglycan oligosaccharides. Anal Chem. 75(10):2445-55.
30. PREBYL, B.M.; KACZMAREK, C.; TUINMAN, A A and BAKER, D.C. (2003) - Characterizing the electrospray-ionization mass spectral fragmentation pattern of enzymatically derived hyaluronicacid oligomers Carboydrate Researeh 338: 1381-1387.
31. ZAMFIR, A. and KATALlNIC, J.P. (2004) - Capillary electrophoresis-mass spectrometry for glycoscreening in biomedical research,Electrophoresis, 25: 1949-1963.
32. SIUZOAK, G. (2005) - An introduction to Mass Spectrometry lonization: An excerpt from the expanding role of mass spectrometry in Biotecnology, 20. Edição, MCC Press, San Diego.
33. AJCC CANCER STAGING MANUAL (2002) - Sixth Edition, American Joint Committee on Cancer, New York, Spring-Verlag.
34. DUKES, C.E. (1932) - The classification of cancer of the rectum, J. Pathl. Bacteriol., 35:323-332.
35. DIETRICH, C. P. and DIETRICH, S. M. C. (1976)- Electrophoretic behaviour of acidic mucopolysaccharides in diamine buffers. Ana!. Biochem. 70: 645-647.
36. DIETRICH, C. P.; MCDUFFIE, N. M. and SAMPAIO, L. 0.(1977)-Identification of acidic mucopolysaccharides by agarose gel electrophoresis. J. Chromatogr. 130: 299-304.
37. MICHELACCI, Y.M. and DIETRICH, C.P. (1973) - Studies on the induction of a chondroitinase in Flavobacterium heparinum, Bioehimie. 55: 893¬898.
38. MICHELACCI, Y.M. and DIETRICH, C.P. (1976) - Chondroitinase C from Flavobacterium heparinum. J. Biol. Chem. 251: 1154-1158.
39. NADER, H.B.;PORCIONATTO, M.A.; TERSARIOL, I.L.; PINHAL, M.A.; OLIVEIRA, F.W.; MORAES, C.T and DIETRICH, C.P. (1990) ¬Purification and substrate specificity of heparitinase I andheparitinase 11 from Flavobacterium heparinum. Analyses of the heparin and heparan sulfate degradation products by 13C NMR spectroscopy. J.Biol Chem. 265(28):16807-13.
40. MARTINS, J.RM; PASSEROTII, C.C; MACIEL, RM.B.; SAMPAIO, L.O.; OIETRICH, C.P. and NAOER, H.B. (2003)- Practical determination of hyaluronan by a new noncompetitive f1uorescence-based assay on serum of normal and cirrhotic patients. Analytical Biochemistry 319: 65-72.
