Ana Maria Araújo Soares

Implementações metodológicas para o estudoeletrofisiológico e comportamental em um modelo

animal de autismo

Natal2015

Ana Maria Araújo Soares

Implementações metodológicas para o estudoeletrofisiológico e comportamental em um modelo

animal de autismo

Dissertação apresentada ao Instituto doCérebro da Universidade Federal do RioGrande do Norte, para a obtenção de Tí-tulo de Mestre em Neurociências.Orientador: Rodrigo Neves Romcy Pereira

Natal2015

ii

Soares, Ana M. A.Implementações metodológicas para o estudo eletrofisi-

ológico e comportamental em um modelo animal de autismo57 páginasDissertação (Mestrado) - Instituto do Cérebro da Uni-

versidade Federal do Rio Grande do Norte.

1. eletrofisiologia in vivo

2. autismo

3. modelo VPA

I. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Institutodo Cérebro.

Comissão Julgadora:

Prof. Dr. Prof. Dr.Claudio Queiroz Marcelo Cairrão Araújo Rodrigues

Prof. Dr.Rodrigo Neves Romcy Pereira

iii

Ao pequenininho da família, Arthur...

iv

AgradecimentosAo sair de engenharia elétrica para encarar um mestrado em neurociências, nunca imaginei

que chegar a esse momento seria fácil. Mas confesso também que não sabia quão grande seria

esse desafio. Durante essa jornada tive a enorme sorte de cruzar pessoas maravilhosas em meu

caminho e, sem elas, com certeza eu não estaria escrevendo essas palavras hoje.

Depois de três meses conhecendo o mínimo da neurociência, me habituando a manipular os

ratos, aplicar injeções e outras coisinhas mais. Chegou o dia que eu realizaria a minha primeira

cirurgia em um animal. Naquele dia eu estava tão nervosa, a vontade que eu tinha era de largar

tudo naquele momento e voltar para os meus circuitos eletrônicos. Foram 9h de cirurgia. Durante

todo esse tempo, não fiquei sozinha um minuto. Houve um revesamento de colegas naquela sala

para ajudar, me aconselhar, me acalmar ou, simplesmente, trazer algo para eu me alimentar.

No final do dia, eu estava morta, o rato vivo. E comecei a pensar em todas as pessoas que me

ajudaram durante aquele dia, em como eu nunca teria conseguido sem cada uma delas. Fiz uma

listinha e fui comprar chocolates para cada uma delas que tinha me ajudado. Resultado: 10% da

bolsa daquele mês foi gasto em chocolates. Essas 9h são um retrato do período em que trabalhei

no Instituto, muitos desafios, mas sempre vencidos com ajuda de inúmeras mãos. Então, hoje,

essa listinha cresceu muito e não seria justo que eu citasse cada pessoa que faz parte dela, pois

a chance de esquecer alguém seria muito grande. Então meu agradecimento é amplo e irrestrito

a todos do ICe que, com certeza, tem uma pequena responsabilidade por essa dissertação. Seja

por me ajudar nas cirurgias, seja por ensinar o que é um neurônio ou simplesmente por ter tido

tempo para um cafézinho naqueles dias que eu estava precisando.

Em particular, gostaria de agradecer ao meu orientador Prof. Rodrigo Neves Romcy Pereira e

aos professores Richardson Leão, Katharina Leão e Adriano Tort que participaram do meu comitê

de acompanhamento e me deram sugestões e contribuições muito relevantes para realização desse

trabalho. Além disso, agradeço a Capes que apoiou financeiramente a realização desse mestrado.

Por fim, agradeço a toda minha família. Meus pais que sempre foram meus exemplos e

tornaram viável todo caminho que percorri para chegar aqui. Meus irmãos que me aturaram

sempre, me ligavam toda semana para me dar força e não me deixaram desistir. E ao meu com-

panheiro, melhor amigo, namorido, Vincent, que sempre me apoiou e me incentivou a continuar

nos momentos mais difíceis.

Sem vocês, eu não teria conseguido. MUITO OBRIGADA!!!

v

Resumo

O autismo é um transtorno do desenvolvimento que se manifesta nos primeiros anos de

vida e apresenta semiologia heterogênea. Esta patologia afeta a maturação do encéfalo e produz

alterações sensoriais, de linguagem e de interação social no início na infância. O modelo expe-

rimental de autismo utilizando ácido valproico (VPA) durante o período gestacional tem sido

demonstrado ter alta validade de face e permitir estudos tanto das bases neuropatológicas quanto

neuro-funcionais durante o desenvolvimento. A despeito do recente interesse por este modelo

como instrumento de compreensão dos aspectos básicos da fisiopatologia do autismo, a maioria

dos estudos experimentais têm se concentrado nos aspectos comportamentais, histológicos e ce-

lulares. Neste trabalho, foram propostas estratégias experimentais de avaliação comportamental

associadas a eletrofisiologia in vivo, uma técnica que nunca fora utilizada para avaliação desse

modelo. Animais controles e experimentais, submetidos previamente a um procedimento cirúrgico

para implante de eletrodos crônicos, participaram de experimentos de livre exploração, interação

social e condicionamento ao medo.

Palavras-chave: autismo, modelo de autismo VPA, eletrofisiologia in vivo, interação social em

roedores

vi

Abstract

Autism is a neurodevelopmental disorder that presents a very heterogeneous semiology. This

pathology affects brain maturation causing sensory, social and language impairments in early

childhood. The animal model of autism induced by prenatal exposure to Valproate (VPA)

exhibits both construct and face validity. It allows to study autism neuropathological and

neurofunctional basis during development. Several works based on VPA models that aim to

understand behavioral, histologic and cellular aspects of autism have been reported. In this work,

we present new experiments to evaluate electrophysiological activity in vivo during behavioral

tasks of model VPA. Control and experimental animals were submitted to a surgical implantation

of chronical electrode arrays on medial Prefrontal Cortex (mPFC) and hippocampus. After one

week, these animals were used in open-field, social interaction and fear conditioning experiments.

Keywords: autism, VPA model, eletrophysiology in vivo, social interaction

Lista de Figuras

1.1 Etiologia do autismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Diagnóstico segundo DSM-V . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Curva de crescimento cerebral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.4 Animais VPA x Animais controles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

4.1 Linha temporal do desenho experimental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.2 Matrizes de eletrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.3 posição dos eletrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4.4 Experimento de interação social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.5 Gaiola compartilhada com animais familiares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.6 Setup do experimento de interação social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.7 Representação temporal dos estímulos sonoros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4.8 Divisão do aparato em zonas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

5.1 Trecho ilustrativo de LFP dos animais em exploração . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5.2 PSD do LFP dos animais em atividade exploratória . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5.3 Trecho ilustrativo de LFP dos animais em repouso . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

5.4 PSD do LFP dos animais em repouso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

5.5 Trecho ilustrativo de LFP dos animais em repouso . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.6 PSD do LFP dos animais em interação social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.7 PSD média do ritmo teta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.8 PSD média do ritmo beta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

5.9 PSD média do ritmo low gamma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

5.10 PSD média do ritmo high gamma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.11 Coerência entre CPFm e hipocampo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

Lista de Figuras viii

5.12 Taxa de congelamento durante extinção do medo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.13 Espectrograma cortical do animal controle na extinção do medo . . . . . . . . . . 36

5.14 Espectrograma hipocampal do animal controle na extinção do medo . . . . . . . 37

5.15 Espectrograma cortical do animal VPA na extinção do medo . . . . . . . . . . . 38

5.16 Espectrograma hipocampal do animal VPA na extinção do medo . . . . . . . . . 39

Lista de abreviaturas

CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais em Pesquisa

CPFm Cortex pré-frontal medial

CS+ estímulo sonoro pareado ao choque

CS- estímulo sonoro não pareado ao choque

DMN Default Mode Network

DSM-V Manual de Diagnóstico e Estatística dos Transtornos Mentais V

E12 Dia embrionário 12

FFT Transformada Rápida de Fourier

i.p. intraperitoneal

ICe Instituto do Cérebro

IRM Imagem por Ressonância Magnética

PSD Densidade Espectral de Potência

TDI Transtorno Desintegrativo Infantil

TEA Transtornos do Espectro Autista

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

VPA Ácido valpróico

VUS Vocalizações ultrassônicas

Sumário

1 Introdução 1

1.1 Autismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Neuropatologia do autismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.3 Alterações funcionais e de circuitaria no autismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.4 Modelo de autismo por exposição pré-natal a ácido valpróico . . . . . . . . . . . 6

1.5 Circuitos neurais em modelos experimentais de autismo . . . . . . . . . . . . . . 9

1.6 Comunicação hipocampo-córtex pré-frontal medial . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.7 Medo e extinção do medo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.8 Vocalizações ultrassônicas de ratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2 Justificativa 14

3 Objetivos 15

3.1 Objetivos específicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4 Materiais de Métodos 16

4.1 Modelo animal de autismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.2 Confecção de matrizes de eletrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.3 Cirurgia para implante de eletrodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.4 Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade exploratória e interação social 20

4.5 Condicionamento pelo medo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

4.6 Extinção do medo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4.7 Registro eletrofisiológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4.8 Análise de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4.8.1 Pré-tratamento do sinal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4.8.2 Análise de LFPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Sumário xi

5 Resultados 27

5.1 Exploração de um novo ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

5.2 Animais em interação social . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.3 Condicionamento ao medo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

6 Discussão 40

Referências Bibliográficas 45

Capítulo 1

Introdução

1.1 Autismo

O autismo é um transtorno do desenvolvimento de etiologia multifatorial que se manifesta nos

primeiros anos de vida apresentando diversas formas de expressão. A descrição inicial dessa

patologia foi realizada pelo psicólogo americano Leo Kanner, em 1943, que descreveu um grupo

de 11 crianças com dificuldade de interação social, deficiência na comunicação verbal e não-

verbal, ansiedade, dificuldades em processar informações emocionais e comportamentos repetitivos

(Kanner et al., 1943). Segundo Kanner, o autismo afetava crianças biologicamente normais

possivelmente em decorrência de cuidados neonatais inadequados. Esta hipótese prevaleceu até

a década de 60, quando diversos pesquisadores passaram a defender causas biológicas para o

transtorno. (figura 1.1).

Atualmente, a denominação transtorno do espectro autista (TEA) engloba várias formas

de expressão do autismo: o autismo propriamente dito, a síndrome de Asperger, o transtorno

desintegrativo infantil (TDI) e TDI não-especificado. Esta classificação foi apresentada na última

versão do Manual de Diagnóstico e Estatística dos Transtornos Mentais (DSM-V) (Association

et al., 2003). Vale ressaltar que cada uma destas patologias difere quanto às suas características

clínicas, etiopatogênicas e de prognóstico. A síndrome de Rett, anteriormente presente como

um TEA por suas características clínicas, foi removida deste grupo por apresentar etiologia

genética conhecida. Segundo as novas definições, para o diagnóstico de TEA são necessárias

disfunções em pelo menos dois domínios de comportamentos: interação/comunicação social

e padrões comportamentais repetitivos e restritivos (figura 1.2). Também é muito comum a

observação de atraso no desenvolvimento da linguagem e alterações no processamento sensorial.

1.1. Autismo 2

Figura 1.1: Modificação na expressão gênica ou exposição a fatores ambientais durante o períodode neurogênese e maturação das redes neurais promovem alterações na organização sináptica ecortical que refletem no desenvolvimento motor e comportamental característico do indivíduocom autismo (Adaptado de Pardo e Eberhart (2007)).

Declínio cognitivo pode ser observado em uma parcela dos autistas, nos quais atividade paroxística

ou crises epilépticas são mais frequentes (García-Peñas, 2009).

Figura 1.2: Para diagnóstico de TEA, segundo DSM-V, é necessária disfunção em dois domínioscomportamentais.

A implementação de novos critérios de diagnóstico e serviços especializados mostram que

a prevalência atual dos TEA na população atinge 1 em 68 crianças norte-americanas, sendo a

prevalência do autismo propriamente dito de 1 em 500 (for Disease Control et al., 2014). Meninos

são mais afetados pelo transtorno, na proporção de 4:1 com relação a meninas (Wing e Potter,

2002; Geschwind, 2009).

Os principais fatores etiológicos associados ao autismo podem ser agrupados em fatores gené-

ticos, imunes ou xenobióticos. Estudos têm mostrado que eles podem alterar o desenvolvimento

1.1. Autismo 3

embrionário e/ou pós-natal levando ao fenótipo autista. Com relação aos fatores genéticos, vários

estudos mostram um aumento no risco para TEA em famílias com um ou mais parentes com

o transtorno. Além disso, a concordância na expressão do autismo entre gêmeos monozigóticos

varia de 60-90 %, enquanto que entre irmãos dizigóticos é de 3-5 % (Gilbert, 2000). Contudo, este

componente genético parece depender da interação entre genes de risco e a composição genética

global do indivíduo (background genético). De fato, a maioria dos estudos são correlacionais e

ainda não foi encontrada nenhuma alteração gênica que por si só fosse responsável por desenca-

dear TEA em 100% dos portadores – o que indica que a herança de traços autistas deve ser a

resultante da interação entre múltiplos genes.

Outro fator etiológico associado ao autismo é a resposta imune da mãe quando exposta a

agentes patogênicos durante a gravidez. Evidências indicam que estas reações podem afetar o

desenvolvimento cerebral do feto através da placenta, levando a anomalias no desenvolvimento

neuronal ou glial (Mead e Ashwood, 2015; Knuesel et al., 2014). Um exemplo disto são os estudos

epidemiológicos mostrando que infecção materna por rubéola durante a gravidez aumenta o

risco de desenvolvimento de autismo nos filhos (Singh, 2009). De maneira similar, a exposição

do bebê a agentes infecciosos no período pós-natal também pode contribuir para alterações

comportamentais semelhantes às do autismo, como infecções do sistema nervoso central como

meningoencefalites bacterianas e virais (García-Peñas, 2009).

Recentemente, o aumento do uso de pesticidas e drogas para controle de algumas patologias

(p.ex. câncer e epilepsia) têm aumentado o risco de mulheres grávidas darem a luz a crianças

autistas. Drogas administradas durante a gravidez como a talidomida, ácido valpróico (VPA) e

etanol, principalmente no primeiro trimestre de gestação, são agentes teratogênicos associados ao

risco de desenvolvimento de alterações comportamentais e autismo (Arndt et al., 2005; Strömland

et al., 1994; Christianson et al., 1994; Nanson, 1992). Em um recente estudo epidemiológico

avaliando uma população de mais de 600 mil crianças nascidas com autismo na Dinamarca

entre 1996 e 2006 verificou-se que o uso do VPA, por mulheres com ou sem epilepsia, durante

a gravidez aumenta o risco de nascimento de crianças com TEA ou autismo propriamente dito

em até 5 vezes (Christensen et al., 2013). Interessante, os autores não observaram diferenças

na frequência de crianças com TEA ou autismo propriamente dito com relação ao período

da gravidez (1𝑜 ou 2o-3o trimestres) em que as mães receberam VPA ( 750 mg/dia). O uso

de outras drogas anti-epilépticas, como carbamazepina (>500 mg/dia), oxcarbazepina (>500

mg/dia), clonazepam (> 4 mg/dia) e lamotrigina (>150 mg/dia), não aumentou do risco para

1.2. Neuropatologia do autismo 4

TEA ou autismo propriamente dito.

1.2 Neuropatologia do autismo

Estudos de imagem por ressonância magnética (IRM) e de tecido post-mortem revelam a exis-

tência de padrões morfológicos alterados bem característicos de pacientes autistas quando com-

parados a indivíduos controle. Em termos gerais, Courchesne et al. (2007) observaram que os

encéfalos de pacientes autistas sofrem um rápido crescimento durante o período pós-natal inicial

(0-2 anos) e depois passam por uma desaceleração no crescimento com a idade (4 anos em diante)

(figura 1.3). Em alguns casos, uma terceira fase de mudanças estruturais pode ser observada em

regiões cerebrais de pré-adolescentes, caracterizada por um processo de degeneração neuronal.

Figura 1.3: Curva de crescimento do cérebro ao longo dos anos em indivíduos autistas e normais.(Courchesne et al., 2001)

Entre as principais alterações neuropatológicas estão o aumento do volume cerebral durante

os primeiros anos de vida (figura 1.3), anormalidades nos núcleos dos nervos cranianos, hipoplasia

de estruturas do tronco cerebral, perda de células de Purkinje no cerebelo, além de alterações

nas estruturas do córtex frontal e lobo temporal (Stevenson et al., 1997; Courchesne et al., 2001;

Bauman e Kemper, 2005). A consistência destas alterações estruturais foi avaliada em uma

série de 17 estudos com 359 pacientes com TEA mostrando aumento do volume encefálico e

do volume da amígdala em crianças, redução do volume do corpo caloso em jovens e adultos,

redução de matéria branca no lobo temporal, aumento da espessura cortical no lobo parietal,

crescimento anormal dos lobos temporal e frontal, e anormalidades no crescimento das fibras do

1.3. Alterações funcionais e de circuitaria no autismo 5

córtex pré-frontal e giro cingulado (Chen et al., 2011). Regionalmente, os lobos frontais e os lobos

occipitais apresentam o maior e o menor grau de crescimento observados (Carper et al., 2002),

respectivamente , sendo que dentro do lobo frontal, a convexidade dorsolateral se mostra mais

hiperatrofiada (Carper e Courchesne, 2005). Além disso, pacientes autistas apresentam aumento

da densidade celular e diminuição do tamanho dos neurônios no córtex pré-frontal (CPFm) e na

área lobo temporal. Essas estruturas estão fortemente envolvidas no processamento cognitivo,

social e emocional (Bauman e Kemper, 2005). Schumann et al. (2004) e Groen et al. (2010),

também mostraram um aumento do volume do hipocampo esquerdo em crianças e adolescentes

autistas. A análise ultraestrutural de tecidos post-mortem de pacientes com TEA, utilizando

a coloração de Golgi, revelou um aumento na densidade de espinhas dendríticas apicais em

neurônios piramidais da camada II dos lobos frontal, temporal e parietal, assim como na camada

V restrita ao lobo temporal (Hutsler e Zhang, 2010). Anormalidades sinápticas e redução do

tamanho das minicolunas corticais também foram observadas por Casanova et al. (2002). Estas

observações fortemente sugerem um funcionamento aberrante em diversas circuitarias corticais

em indivíduos com TEA.

1.3 Alterações funcionais e de circuitaria no autismo

Do ponto de vista funcional, estudos recentes indicam uma sincronização inter-hemisférica re-

duzida em crianças autistas que se correlaciona com a severidade do autismo (Anderson et al.,

2011; Dinstein et al., 2011). Associado aos estudos que indicam alterações de mielinização, é

plausível supor que o comprometimento da conectividade entre regiões encefálicas distantes

afetam a integração de informações multimodais. Evidências recentes também apontam para

disfunções em circuitos locais. A combinação entre dificuldade de comunicação social e rituais

motores com estados de hiper-sensibilidade sensorial, emocional e seletividade atencional alterada

apresentadas pelos autistas podem ser o resultado do encurtamento e desorganização de certas

projeções. Alguns autores chegam a propor que no cérebro autista os sinais são insuficiente-

mente diferenciados do ruído ou da informação irrelevante e, assim o conteúdo de informação

relevante está reduzido (Baron-Cohen e Belmonte, 2005). Algumas evidências neuropatológicas

e funcionais apontam para uma combinação de hiper-conectividade em circuitos locais com

hipo-conectividade de longa distância (Belmonte et al., 2004a,b). Esta idéia é consistente não

somente com os prejuízos cognitivos e atencionais, mas também pelos prejuízos de percepção

1.4. Modelo de autismo por exposição pré-natal a ácido valpróico 6

auditiva, percepção visual, impulsividade e empatia (Teitelbaum et al., 1998; Plaisted et al., 2003;

Milne et al., 2002; Just et al., 2004). Esta hipótese poderia também explicar tanto as ilhas de

super-habilidades e interesses restritos, como a dificuldade dos autistas em integrar elementos

perceptuais em uma unidade.

A rede cerebral denominada Default Mode Network (DMN) tem extrema importância na

cognição social e é formada pelo córtex cingulado posterior, córtex pré-frontal medial, córtex

temporal lateral, lobo parietal inferior e hipocampo (Buckner et al., 2008). Achados consistentes

mostram que pacientes autistas apresentam déficits na comunicação entre os nós dessa rede

(Assaf et al., 2010; Weng et al., 2010). Uma hipoconectividade funcional na DMN seria coerente

com os relatos comportamentais de pacientes autistas com deficiências em teoria da mente,

empatia e interação social. Além da DMN, diversas outras redes implicadas em processamento

de informações sociais e emocionais parecem alteradas nos pacientes autistas (Uddin et al., 2013;

von dem Hagen et al., 2012; Supekar et al., 2013; Keown et al., 2013). Isto poderia explicar a

dificuldade de integração de informações sócio-emocionais apresentada por estes indivíduos.

1.4 Modelo de autismo por exposição pré-natal a ácido valpróico

Diversos modelos experimentais têm sido propostos para o estudo do autismo, sendo os modelos

em roedores os mais comuns. Como em qualquer modelo de doenças do sistema nervoso é

importante ter claro suas principais características como validade de face, validade de construto e

validade preditiva. Como validade de face se entende que o modelo deve apresentar características

comportamentais e fisiológicas (moleculares, celulares e eletrofisiológicas) mais próximas possível

do transtorno observado em humanos. Validade de construto se refere aos mecanismos celulares e

moleculares por trás da etiologia da doença. Já a validade preditiva trás a informação do quanto

uma estratégia de tratamento aplicada no modelo animal é possível de reproduzir seus efeitos

em humanos. Assim, os modelos em roedores apresentam vários graus de validade, sendo que a

presença de comportamentos sociais alterados e estereotipados - os endofenótipos mais comuns

do transtorno em humanos - o que garante em diferentes graus sua validade de face.

Em roedores, temos (1) os modelos baseados em alterações genéticas específicas envolvendo

neurexina-1, neuroligina-3, neuroligina-4, reelina, MeCP2, TSC2 e FMR1 (Etherton et al., 2009;

Patterson, 2011; Waltereit et al., 2011); (2) os modelos de linhagens geneticamente selecionadas

que apresentam traços comportamentais de sociabilidade alterada como os camundongos BTBR

1.4. Modelo de autismo por exposição pré-natal a ácido valpróico 7

T+tf/J (BTBR) (Scattoni et al., 2008), (3) os modelos baseados em lesões de estruturas límbicas

como a amígdala e o hipocampo ventral (Daenen et al., 2002; Wolterink et al., 2001) e (4) os

modelos baseados em exposição a drogas ou agentes patogênicos durante a gestação (Rodier

et al., 1997; Dufour-Rainfray et al., 2010).

O modelo que decidimos estudar é induzido por exposição de ratos ao ácido valpróico (VPA)

no período embrionário. Este é um modelo que agrega tanto uma consistente validade de face

quanto validade de construto. Uma vez que produz alterações comportamentais semelhantes

àquelas observadas em crianças nascidas de mães que receberam VPA durante a gravidez, uma

droga usada para estabilização de humor e anti-epiléptica (Rodier et al., 1997; Williams et al.,

2001). O trabalho que trouxe a tona a correlação entre uso de VPA durante a gestação e o autismo

foi o de Christianson et al. (1994). Estes autores observaram que crianças que apresentavam

síndrome do valproato fetal (caracterizada por traços fenotípicos de má formação) recebiam com

maior frequência diagnóstico de TEA. O período de sensibilidade à droga e o surgimento de

má-formações levaram à hipótese de que o TEA pudesse ser o resultado de alguma interferência

com os processos de desenvolvimento durante o período embrionário. De fato, além do VPA,

a exposição do embrião a outros agentes patogênicos durante o primeiro trimestre de gestação

parece também estar relacionado a um maior número de casos de autismo.

Em 1996, Rodier et al. (1996) propuseram um modelo animal para estudo das alterações

de espectro autista baseado na administração pré-natal de VPA em ratas prenhas Rodier et al.

(1996). Desde então, este modelo tem sido reproduzido e recentemente foi caracterizado com

sucesso por nosso grupo de pesquisa. Em resumo, ratas prenhas, com controle do dia da fecunda-

ção, recebem uma injeção de VPA, em dose única na data de fechamento do tubo neural de sua

prole (E12). Como resultado, os filhotes apresentam uma série de alterações comportamentais

que se assemelham em muito àquelas observadas em pacientes autistas. Dentre estas alterações

se observa um retardo no desenvolvimento pós-natal, maior atividade locomotora, menor intera-

ção social, aumento do comportamento esterotipado (processos de auto-limpeza), aumento de

ansiedade e baixa sensibilidade à dor. Ao contrário de drogas como a talidomida, que apresentam

efeitos diferentes quando administradas em ratos e em humanos, o VPA tem mostrado resultados

semelhante aos observados na espécie humana, sendo por isso um modelo bastante validado na

literatura para o estudo das bases neurofisiológicas do autismo (Schneider e Przewłocki, 2005;

Markram et al., 2007; Bambini Júnior, 2010; Sousa, 2013).

Várias alterações neuroquímicas têm sido observadas no modelo VPA em roedores. Dentre

1.4. Modelo de autismo por exposição pré-natal a ácido valpróico 8

(a) (b) (c)

(d) (e)

Figura 1.4: Diferenças entre animais controle e animais VPA. (a) Fotografia de um animalcontrole; (b) Distância média percorrida por animais de cada grupo em 5 minutos de livreexploração; (c) Duração de episódios de auto-limpeza; (d) Fotografia de um animal VPA ondenota-se má formação da cauda; (e) Tempo médio gasto por animal dos dois grupos em cada umadas 3 zonas: interação social (IS), zona neutra (ZN) e interação com objeto (IO). Sousa (2013)

elas, podemos citar a redução da capacidade de proteção contra estresse oxidativo (Bambini-

Junior et al., 2011), alteração na neurotransmissão NMDA (Rinaldi et al., 2007), aumento da

recaptação de glutamato (Silvestrin et al., 2013) e hipo-responsividade dopaminérgica (Hara

et al., 2015). Recentemente nosso grupo mostrou que além destas alterações, os animais expostos

ao VPA em útero apresentam alterações na circuitaria inibitória do córtex pré-frontal medial

(CPFm). Esta alteração se deve a uma redução, nas áreas do córtex cingulado anterior (Cg) e

pré-límbica (PL) do CPFm, do número de neurônios inibitórios que expressam parvalbumina

(PV+). Estas células constituem uma população de neurônios em cesto ou candelabro que têm

alta taxa de disparos e forte poder inibitório, pois inervam o corpo celular e o segmento inicial

do axônio de seus alvos, respectivamente. O que sugere uma hiper-excitabilidade local no CPFm

e uma possível disfunção na conectividade entre o hipocampo e o CPFm neste modelo (Brandão

e Romcy-Pereira, 2015). Além disto, Sousa (2013) também observou alterações comportamentais

e na circuitaria inibitória do CPFm na geração de filhotes de pais tratados com VPA.

Em outro estudo, Anomal et al. (2015) mostraram que animais tratados com VPA apresen-

1.5. Circuitos neurais em modelos experimentais de autismo 9

tam alterações nas respostas eletrofisiológicas do córtex auditivo primário (A1) a tons puros.

Estes animais apresentam maior representação de frequências altas (10-50 kHz) em A1, assim

como limiar de intensidade sonora mais alto e campos receptivos auditivos menos específicos.

Estas características indicam um processamento auditivo aberrante nos animais VPA quando

comparados aos controles.

1.5 Circuitos neurais em modelos experimentais de autismo

Estudos recentes mostram que animais expostos ao VPA na fase embrionária apresentam alte-

rações em microcircuitos no CPFm, na forma de uma hiper-conectividade e hiper-plasticidade

na circuitaria cortical local quando comparada aos animais controle (Rinaldi et al., 2008). Estes

achados sugerem que tal padrão estrutural e funcional seria a representação no modelo animal do

que ocorre no córtex de indivíduos autistas. Esta hiperfuncionalidade local seria a consequência

de distúrbios na formação e maturação destas circuitarias (Markram et al., 2007). Anormalidades

na migração neuronal e/ou na maturação sináptica poderiam levar a uma organização aberrante

das conexões locais e das projeções de longa distância, decorrentes da exposição ao VPA durante

o desenvolvimento embrionário.

Estados comportamentais que indicam um certo grau de hiperexcitabilidade neuronal em pa-

cientes autistas, como ansiedade elevada, epilepsia, distúrbios do sono ou agressividade sugerem

um desbalanço excitatório-inibitório em circuitos neurais autistas (Gogolla et al., 2009; Rubens-

tein e Merzenich, 2003). As causas deste desequilíbrio podem ser o aumento da neurotransmissão

glutamatérgica, a diminuição da neurotransmissão GABAérgica, ou mesmo a combinação dos

dois fatores. Estudos eletrofisiológicos em fatias cerebrais de animais VPA reforçam esta hipótese.

Rinaldi e colaboradores mostraram um aumento da neurotransmissão mediada por receptores

NMDA em fatias de animais VPA quando comparadas a fatias dos controles (Rinaldi et al., 2007).

Em outro estudo realizado por Banerjee et al. (2013), onde se caracterizou o sistema GABAér-

gico, os autores mostram um forte prejuízo da neurotransmissão inibitória pré e pós-sináptica

no modelo animal. Interessante notar que durante o desenvolvimento do sistema GABAérgico

cortical o neurotransmissor GABA deixa de ser excitatório (durante o período embrionário até

início pós-natal) e passa a ser inibitório a partir de P7-P10 (Rivera et al., 1999). Este fenômeno

se deve à diminuição da concentração do íon Cl− no meio intracelular por meio da expressão do

co-transportador Na+/K+/Cl−, NKCC2 que exporta Cl− para o meio extracelular. Recentemente

1.6. Comunicação hipocampo-córtex pré-frontal medial 10

foi mostrado que na área CA3 do hipocampo, a transição entre o papel excitatório-inibitório

do GABA está alterada em animais VPA (Tyzio et al., 2014). Nos neurônios embrionários, a

maior concentração de Cl− no meio intracelular no hipocampo controle força o fluxo de Cl− em

resposta a ativação de receptores GABA-A (efeito excitatório). Este gradiente, entretanto, sofre

uma queda abrupta e pontual no primeiro dia pós-natal (P0) em decorrência da liberação de

oxitocina (redução do efeito excitatório do GABA) e, finalmente, volta a ser reduzida aos níveis de

animal adulto entre os dias pós-natal 15 e 30 (P15 e P30). Tyzio et al. (2014) mostraram que esta

sequência não ocorre nos animais VPA, sugerindo que a disfunção da homeostase da sinalização

GABAérgica durante o desenvolvimento pós-natal poderia gerar uma circuitaria hiper-excitável

no hipocampo, onde os autores estudaram, e os comportamentos alterados no modelo VPA.

1.6 Comunicação hipocampo-córtex pré-frontal medial

Disfunções na comunicação entre regiões corticais de pacientes autistas parecem estar associada

a grandes dificuldades destes indivíduos em integrar informações e interpretar estímulos externos

(Matlis et al., 2015; Wolf et al., 2009). O fato de crianças autistas serem incapazes de interagir

reciprocamente com o seu meio social pode refletir uma deficiência do córtex pré-frontal em

interagir reciprocamente com outras regiões corticais (Godsil et al., 2013; Lewis et al., 2014).

Tem sido descrito que pacientes autistas apresentam disfunções no córtex pré-frontal e no lobo

temporal. Alguns estudos mostraram alterações anatômicas e moleculares nestas áreas (Cour-

chesne et al., 2011; Ziats e Rennert, 2013). Ambas regiões fazem parte da DMN que apresenta

conectividade funcional entre seus nós reduzida nesses indivíduos (Assaf et al., 2010).

Recentemente alguns estudos têm mostrado alterações na neurotransmissão basal e plasti-

cidade sináptica entre o hipocampo e o córtex pré-frontal no modelo VPA (Sui e Chen, 2012;

Martin e Manzoni, 2014). Entretanto estes estudos foram realizados em animais anestesiados e

nenhum deles abordou o acoplamento funcional entre estas duas áreas durante tarefa de natureza

social (Codagnone et al., 2015). O córtex pré-frontal é a segunda principal saída de informações

do hipocampo em direção ao córtex. Sua conectividade com o hipocampo é monossinaptica e

fundamental para a execução de tarefas de memória de trabalho, e plasticidade sináptica envol-

vida na formação de memórias de longo prazo (Jay et al., 2004; Romcy-Pereira e Pavlides, 2004).

O acoplamento entre essas regiões foi inicialmente descrito em diferentes estados comportamen-

tais (Jones e Wilson, 2005; Bertolino et al., 2006; Wierzynski et al., 2009; Lesting et al., 2011).

1.7. Medo e extinção do medo 11

Estes autores mostraram que neurônios registrados no CPFm disparam preferencialmente em

uma determinada fase do ritmo teta hipocampal (Siapas et al., 2005). Além disso, a coerência

entre oscilações teta das duas regiões é elevada durante tarefas de tomada de decisão e cunho

emocional (O’Neill et al., 2013). O interessante é que animais com maiores taxas de acerto na

tarefa apresentaram maior coerência entre as áreas, sugerindo que o acoplamento entre o CPFm

e o hipocampo está associado ao aprendizado. Estudos recentes têm mostrado que modelos de

ansiedade e esquizofrenia apresentam redução tanto na coerência em teta quanto no acoplamento

entre essas duas áreas (Sigurdsson et al., 2010).

1.7 Medo e extinção do medo

A dificuldade de interpretação e expressão de mensagens de caráter emotivo são características

comuns em pacientes autistas (Boraston et al., 2007; Charbonneau et al., 2013; Sato et al., 2012).

Em particular, a identificação e manifestação de medo é bastante alterada. Esses indivíduos

apresentam fobias (Mayes et al., 2013), problemas em identificar expressões de medo ou de raiva

(Wallace et al., 2008), condicionamento ao medo exacerbado (South et al., 2011) e dificuldades

em esquecer eventos de carga emocional aversiva (Gaigg et al., 2008).

O pequeno número de estudos psicofisiológicos examinando paradigmas de medo condicionado

clássico em seres humanos com transtorno do espectro autista têm rendido resultados discordantes

(Salmond et al., 2003; Gaigg et al., 2008; South et al., 2011; Bernier et al., 2005). Uma parte

destes estudos reportam diferenças entre a aquisição de medo condicionado entre indivíduos

autistas e indivíduos controle, enquanto outra não reporta nenhuma diferença. Vale salientar

que um dos grandes problemas em estudos com humanos é a grande heterogeneidade encontrada

entre indivíduos com transtornos do espectro autista.

Em ratos foi descrito que animais tratados com ácido valpróico são mais ansiosos e apresentam

memórias ligadas ao medo com níveis anormalmente elevados e de maior persistência, com

tendência a sobre-generalizar o medo a diferentes estímulos sensoriais e maior dificuldade de

extinguir ou esquecer (Markram et al., 2008).

1.8 Vocalizações ultrassônicas de ratos

Os ratos são capazes de vocalizar e ouvir dentro de uma faixa de frequência cujos limites são

superiores aos humanos. Enquanto nós, humanos, somos capazes de ouvir sons entre 20 Hz e 20

1.8. Vocalizações ultrassônicas de ratos 12

kHz, os roedores podem ouvir sons de frequência superiores a 50 kHz. Diversos estudos apontam

para grande relevância etológica das vocalizações como sinais sociais para os ratos (Knutson

et al., 2002; Brudzynski, 2005, 2013; Burgdorf et al., 2008). Por isso o estudo dessas vocalizações e

de suas representações neuronais constitui uma ferramenta bastante interessante para a pesquisa

sobre comunicação, emoção e interação social em ratos.

Os ratos adultos desenvolvem dois tipos básicos de vocalizações ultrassônicas (VUS) que são

denominados genericamente “20 kHz” e “50 kHz” (Brudzynski, 2013; Wöhr e Schwarting, 2013).

As vocalizações de 20 kHz são emitidas durante estados emocionais negativos e situações aversivas,

enquanto chamadas de 50 kHz são emitidas em estados emocionais positivos (Brudzynski e Pniak,

2002; Knutson et al., 2002).

Tem sido sugerido que um dos papéis das vocalizações de 20 kHz é o de alertar a atenção de

toda a colônia de coespecíficos acerca da presença de predadores (Blanchard et al., 1991; Litvin

et al., 2007) ou outro perigo (Brudzynski e Ociepa, 1992; Brudzynski, 2001). As vocalizações de

22kHz são também correlacionadas com o comportamento de congelamento (do inglês, freezing)

e outros indicadores de medo (Lee et al., 2001; Choi e Brown, 2003).

Por meio de experimentos de playback foi mostrado que os chamados de 20 kHz podem

induzir inibição locomotora (Wöhr e Schwarting, 2007) e a atividade neuronal em áreas do cérebro

envolvidas na regulação do medo, como a amígdala e a substância cinzenta periaquedutal(Wöhr

e Schwarting, 2013). Descobertas recentes indicam ainda que os ratos estão predispostos a formar

associações de memória entre 22kHz e estímulos aversivos (Allen et al., 2007; Endres et al., 2007;

Bang et al., 2008; Furtak et al., 2007) e que esses chamados desempenham um papel importante

na transmissão social do medo (Kim et al., 2010).

As vocalizações de alta frequência (50kHz) ocorrem em contextos comportamentais naturais

de conteúdo emocional positivo, incluindo jogo juvenil (Knutson et al., 1998), atividade social

exploratória (Brudzynski e Pniak, 2002; Assini et al., 2013), acasalamento(McGinnis e Vaku-

lenko, 2003) e antecipação de estímulos gratificantes (Knutson et al., 1998). Estas vocalizações

também são emitidas na consolidação de contatos sociais (ou seja, interações não-combativas

de abordagem, proximidade individual e afeto) e na antecipação de tais contatos (Brudzynski

e Pniak, 2002; Willey e Spear, 2012; Willey et al., 2009). Eles podem desempenhar um papel

no aumento da coesão do grupo social e cooperação (Łopuch e Popik, 2011) e na estimulação e

coordenação de comportamento social (Thomas et al., 1983; Galef e Jeimy, 2004; Brudzynski,

2013; Burgdorf et al., 2008).

1.8. Vocalizações ultrassônicas de ratos 13

Contrariamente aos chamados de 20kHz, o playback de chamados de 50kHz tende a aumentar

a atividade locomotora do animal e causar comportamentos aproximativos (Wöhr e Schwarting,

2007; Burgdorf et al., 2008). Também foi mostrado que ratos treinados para escolher um tipo

de vocalização efetuam a autoadministração de playback dos chamados de 50kHz de frequência

modulada e evitam o playback de vocalizações de 20 kHz (Burgdorf et al., 2008). Uma vez que

estes chamados de 50kHz são expressos durante a antecipação da cópula (McIntosh et al., 1978;

Barfield e Thomas, 1986; Bialy et al., 2000) , jogo e brincadeira (Knutson et al., 1998), antecipação

de estímulos gratificantes e no contexto de auto-estimulação elétrica do feixe prosencefálico medial

(Burgdorf et al., 2000), foi postulado que estes chamados são um marcador sensível para respostas

não-condicionadas e condicionadas positivas (Knutson et al., 1999) e Panksepp e Burgdorf (2003)

assumiram mesmo que estes chamados refletem um estado afetivo positivo semelhante à alegria.

Capítulo 2

Justificativa

O modelo experimental de utilizando VPA durante o período gestacional tem sido demonstrado

ter alta validade de face e permitir estudos tanto das bases neuropatológicas quanto neuro-

funcionais durante o desenvolvimento. A despeito do recente interesse por este modelo como

instrumento de compreensão dos aspectos básicos da fisiopatologia do autismo, a maioria dos

estudos experimentais têm se concentrado nos aspectos comportamentais, histológicos e celula-

res. Recentemente alguns estudos eletrofisiológicos mostraram alterações eletrofisiológicas em

animais anestesiados. Entretanto, ainda se faz necessário uma avaliação eletrofisiologia animais

durante diferentes estados comportamentais e interações sociais. Portanto, neste estudo preten-

demos contribuir para o preenchiemnto desta lacuna através da implementação de estratégias

experimentais de avaliação comportamental associadas a eletrofisiologia in vivo, além de avaliar

o acoplamento funcional entre o hipocampo e o CPFm no modelo VPA de autismo em animais

em livre movimento.

Capítulo 3

Objetivos

Este trabalho tem como objetivo a implementação de estratégias metodológicas para o estudo

de comportamentos sociais em animais modelo de autismo, bem como, caracterizar, por meio de

registros eletrofisiológicos extracelulares, a comunicação entre o hipocampo e o córtex pré-frontal.

3.1 Objetivos específicos

• Planejamento e organização de setup experimental para registro de vocalizações simultâneo

a registros eletrofisiológicos e de vídeo;

• Planejamento e organização de setup para realização de um protocolo de condicionamento

ao medo. Na fase se extinção da memória aversiva, os estímulos sonoros são sincronizados

ao registro eletrofisiológico;

• Registrar potenciais locais de campo (LFP) no córtex pré-frontal e no hipocampo simulta-

neamente de animais VPA e controle;

• Avaliar os padrões oscilatórios hipocampais e corticais basais durante exploração de um

ambiente novo;

• Avaliar os padrões oscilatórios hipocampais e corticais basais durante interação social;

Capítulo 4

Materiais de Métodos

A linha temporal dos experimentos está representada simplificadamente na figura 4.1. Animais

(P120±30) tratados com ácido valpróico e controles foram submetidos a cirurgias de implantes

de matrizes de eletrodos no hipocampo e no córtex pré-frontal medial (área pré-límbica). Todos

os animais tiveram ao menos sete dias de recuperação após a cirurgia e a partir de então foram

habituados ao experimentador por pelo menos mais 5 dias antes de serem submetidos aos testes

comportamentais. O conjunto de testes realizados foram: atividade exploratória, interação social,

condicionamento ao medo e extinção. Com exceção do condicionamento ao medo, durante todos

os outros experimentos foram registrados potenciais de campo locais (LFP) no hipocampo e no

córtex pré-frontal.

Figura 4.1: Esquema temporal do desenho experimental.

4.1 Modelo animal de autismo

Utilizamos ratos Wistar machos e fêmeas mantidos no Biotério Setorial do Instituto do Cérebro

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). Fêmeas com ciclos de fertilidade

controlados foram colocadas para acasalar individualmente com machos não relacionados con-

4.2. Confecção de matrizes de eletrodos 17

sanguineamente durante o período noturno (ou período de atividade). Na manhã seguinte ao

acasalamento, a fecundação e a determinação do primeiro dia gestacional (E0) foi confirmada

pela presença de espermatozóides na lavagem vaginal.

Passados 12 dias da fertilização (E12,5), data correspondente ao final do fechamento do tubo

neural nestes animais, um grupo de fêmeas recebeu uma injeção intraperitoneal de valproato de

sódio (VPA, 500 mg/kg, i.p.; Sigma, P4543) dissolvido em solução salina na concentração de 250

mg/mL. A administração de VPA na dose 500 mg/kg tem sido mostrada atingir níveis séricos

máximos da ordem de 900𝜇g/mL em menos de 1 h, com meia-vida de eliminação plasmática

de 2,3 h (Binkerd et al., 1998). Essas proles foram utilizadas como grupo VPA. Outro grupo de

fêmeas grávidas receberam uma única injeção de salina em E12,5 e seus filhotes foram utilizados

como animais controles.

Após o nascimento, a prole permanece com a mãe por 21 dias durante a amamentação.

Passado este período, os animais machos são transferidos para gaiolas em grupos de dois a

quatro, onde ficam mantidos até a realização dos procedimentos experimentais. Todos os animais

são alojados em gaiolas de polipropileno (414 x 344 x 168 mm3) com raspa de madeira no assoalho

numa sala com temperatura (21±2°C), umidade e ciclo de claro-escuro (de 12-12h; ligado às 7:00h

e desligado às 19:00h) controlados com livre acesso à comida e água. Todos os procedimentos

experimentais realizados com os animais foram previamente aprovados pela Comissão de Ética

no Uso de Animais em Pesquisa (CEUA) da UFRN, sob o protocolo no. 044/2011. Apenas

animais machos foram utilizados no testes experimentais.

4.2 Confecção de matrizes de eletrodos

Para registrarmos potenciais locais de campo, utilizamos matrizes de eletrodos que foram confecci-

onadas em nosso laboratório no Instituto do Cérebro. Para tal, foram utilizados fios de tungstênio

de 50 µm de diâmetro revestidos com teflon. Os eletrodos foram alinhados verticalmente em duas

fileiras de 4 eletrodos de maneira que o espaçamento entre eles fosse de 300 µm (figura 4.2a).

O manuseio dos eletrodos foi feito com bastante cautela afim de evitar danos ao revestimento

e somente a ponta do eletrodo foi deixada exposta para aquisição o sinal elétrico intracerebral.

Por fim, as pontas opostas foram conectadas a um conector Würth (1,27mm, dual-socket 18

pinos de ouro) através de uma mini placa de circuito impresso de produção do nosso laboratório

(figura 4.2b).

4.3. Cirurgia para implante de eletrodos 18

(a) (b)

Figura 4.2: Matrizes de eletrodos. (a) as matrizes 2x4 implantadas no CPFm e no hipocampoforam confeccionadas com eletrodos de tungstênio 50𝜇m e espaçamento de 300𝜇m; (b) Foto deuma matriz utilizada nos implantes.

Os eletrodos foram submetidos ao processo de galvanização por eletrólise em uma solução

de ouro contendo nanotubos de carbono, com intuito de reduzir as impedâncias para faixa entre

50 e 100 kW segundo descrito em Ferguson et al. (2009). Nesse processo, as pontas dos eletrodos

são imersas em uma solução de ouro enquanto uma corrente negativa os atravessa. Este fluxo de

elétrons faz com que o ouro se deposite nas pontas dos eletrodos. A galvanização, bem como as

medições de impedâncias de cada eletrodo, foram realizadas utilizando o equipamento NanoZ

(Neuralynx, USA). O equipamento gera microcorrentes para depósito do ouro e em seguida envia

sinusoidais de 1 KHz para avaliação das impedâncias. Este processo é repetido algumas vezes

até a obtenção dos valores desejados.

4.3 Cirurgia para implante de eletrodos

Ratos machos (idade 120±30 dias) experimentais e controles foram submetidos a cirurgias de

implante de duas matrizes de eletrodos 2x4 (fios de tungstênio revestidos com teflon de 50 𝜇m;

espaçamento horizontal: 300 𝜇m; impedância: ∼70 kΩ à 1 kHz). Uma matriz foi implantada no

hipocampo dorso-posterior (AP= -5.8; DV=3,2; ML=4,5) e a segunda matriz implantada no

CPFm (AP= +3,6; DV=3,8; ML=0,6). Neurônios dessas regiões se conectam monossinaptica-

mente (Hoover e Vertes, 2007).

Para a cirurgia, os animais foram previamente anestesiados com uma mistura de cloridrato de

cetamina (100 mg/kg, i.p.; Agener) e cloridrato de xilazina (8mg/kg, i.p.) e, foram mantidos com

a temperatura corporal controlada na faixa de 37 ± 2 °C. Para manutenção, foram administradas

doses suplementares de cetamina intraperitoneal (30% da dose inicial). Os procedimentos de im-

4.3. Cirurgia para implante de eletrodos 19

Figura 4.3: Representação do corte coronal do cérebro de um rato Wistar nas coordenadas(AP= -5.8; DV=3,2; ML=4,5) à direita e (AP= +3,6; DV=3,8; ML=0,6) à esquerda. Amboshemisférios esquerdos apresentam em vermelho marcador retrógrado aplicado no córtex pré-frontal medial pré-límbico (Hoover and Vertes, 2007) mostrando conexão monossináptica entre asduas regiões onde foram implantados os eletrodos. As localizações dos implantes estão ilustradasnos hemisférios esquerdos dos cortes ilustrados.

plante foram realizados como previamente descrito no protocolo da CEUA, com todos os cuidados

necessários para garantir assepsia e ausência de dor (i.e., uso de materiais autoclavados, antibiótico

e analgésico pós-cirúrgico). Mais especificamente, no pré-operatório foi injetado um antibiótico

(Flotril® injetável 2,5%) intra-muscularmente, cloridrato de lidocaína sub-cutâneamente para

anestesia local da região de incisão e também injetado o anti-inflamatório/analgésico Maxicam

0.2%. Além disso, durante a cirurgia também injetamos salina (NaCl 0.9%) sub-cutâneamente

para prevenção de desidratação e mantivemos os olhos do animal úmidos com gel lubrificante. A

cabeça do animal foi desinfetada topicamente com Iodopovidona 10% antes da incisão e, após a

mesma, o crânio foi limpo com peróxido de hidrogênio 3%. Após a cirurgia de implante, aplicamos

na região da sutura uma pomada com propriedades antibióticas, anti-inflamatórias, anti-alérgicas,

anti-pluriginosas, anestésicas e anti-micóticas (Crema 6A, contendo dexametasona, neomicina,

bacitracina, griseofulvina e benzocaina). Finalizado o implante, os animais foram monitorados

até recobrirem atividade locomotora e então, devolvidos ao biotério onde ficaram em recuperação

por pelo menos uma semana antes do início dos registros eletrofisiológicos. Após o período de

recuperação, os animais foram manipulados para habituação com o experimentador.

4.4. Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade exploratória e interação social 20

4.4 Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade explora-

tória e interação social

Segundo dados anteriormente obtidos em nosso laboratório, ratos expostos ao VPA durante a

gestação apresentam alterações comportamentais caracterizadas por redução de interesse social,

aumento de comportamentos estereotipados e hiperatividade se comparados a animais controles

(Sousa, 2013). A interação com um animal não-familiar leva à formação de uma memória social

em roedores. Durante este processo, tanto o hipocampo quanto regiões corticais são recrutadas

para a codificação e posterior consolidação desta memória episódica. Tendo isto em consideração,

nosso interesse foi avaliar a atividade oscilatória hipocampal e pré-frontal durante atividade

exploratória e interação social. Além disso, mesurar o grau de sincronização entre as duas áreas.

O experimento foi realizado com três ratos controles e três ratos experimentais implantados

com eletrodos no CPFm e no hipocampo. Em sessões individuais, cada animal foi conectado

ao cabo de registro (contendo um pré-amplificador – headstage) e submetidos aos paradigmas

descritos nesta seção. Este experimento é realizado em uma sequência de quatro fases distintas

numa arena retangular principal (86x57x40 𝑐𝑚3) com dois pequenos compartimentos laterais

(17x17x40 𝑐𝑚3) (figura 4.4). Nas fases 1 e 3, os compartimentos laterais permaneceram vazios e

o animal pode explorar livremente por toda arena principal. As divisórias entre a arena principal

e os compartimentos auxiliares foram confeccionadas em madeira com revestimento preto similar

às paredes da arena principal. Já nas fases 2 e 4, um animal familiar ou não-familiar é colocado

em um dos compartimentos e um objeto branco de tamanho similar a um rato Wistar no outro.

Neste caso, as divisórias utilizadas entre a arena principal e os compartimentos auxiliares foram

confeccionadas de acrílico transparente com orifícios circulares de 1,5 cm espaçados por 2 cm

para permitir a interação entre os animais. A sequência de apresentação de animal familiar ou

não-familiar foi randomizada, bem como o lado do compartimento em que são colocados. As

quatro fases são separadas por intervalos de cinco minutos quando o animal é retirado da arena

principal e posto em sua caixa de origem. Com exceção da terceira fase que tem duração de 10

minutos, todas as fases têm duração igual a 20 minutos.

Os animais familiares são ratos Wistar pareados por sexo e idade e compartilham a mesma

gaiola com os animais experimentais por pelo menos 5 dias antes do início dos experimentos de

interação social. As gaiola de manutenção dos animais no biotério são divididas ao meio com

uma prancha de acrílico transparente com orifícios circulares de 1,5 cm (ver figura 4.5). Desta

4.4. Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade exploratória e interação social 21

Figura 4.4: O experimento é dividido em quatro fases. Em todas as fases, o animal pode exploraro compartimento central livremente. Nas fases 1 e 3, os compartimentos laterais encontram-sevazios. Já nas fases 2 e 4, um dos compartimentos comporta um animal e o outro um objetobranco de tamanho similar a um rato. A linha temporal do experimento é ilustrada na parte debaixo da figura.

maneira, os animais podem interagir através de vocalizações, pistas olfativas e contato visual,

sem risco de danos ao capacete do animal implantado. Os animais não familiares são ratos Wistar

pareados por sexo e idade pertencentes a outras gaiolas também mantidos em pares.

Por pelo menos 5 dias antes do dia de experimentação, os animais foram manuseados diari-

amente pela manhã por pelo menos 15 minutos cada. Durante as sessões experimentais, foram

realizados registros eletrofisiológicos contínuos, registro de áudio ultrassônicos e filmagem do

comportamento sincronizada com os registros. A iluminação do ambiente foi realizada por um

conjunto de leds infra-vermelhos. Após o teste, os animais retornaram às suas caixas de origem

e foram levados ao biotério. O aparato comportamental foi limpo com uma toalha umedecida

com água.

A aquisição de dados neurais foi realizada através do sistema Omniplex (Plexon Inc.) utili-

zando headstage de alta impedância de entrada com ganho de 20X (HST/32V-G20). Os registros

eletrofisiológicos e os dados comportamentais de posicionamento do animal foram sincronizados

através do sistema CinePlex (Plexon Inc.). Dois microfones ultrassônicos Avisoft Bioacoustics

4.4. Acoplamento hipocampo-CPFm durante atividade exploratória e interação social 22

Figura 4.5: Os animais familiares dividiram gaiola com os animais experimentais durante 3 diasanteriores aos experimentos. A gaiola era dividida por uma placa de acrílico transparente e comorifícios circulares de 1,5 cm de diâmetro

CM16/CMPA foram utilizados para registrar as emissões vocais dos animais. A posição dos

mesmos foi pensada de maneira a possibilitar futura identificação do rato emissor. Conforme

ilustrado na figura 4.6, um deles foi colocado em direção ao animal aprisionado no pequeno

compartimento enquanto a direção do segundo foi paralela a parede mais longa do aparato de

maneira que o som emitido pelo animal aprisionado chegue bastante atenuado a entrada deste

microfone.

Figura 4.6: Esquema representativo do setup do experimento de interação social. Utilizando umsistema de aquisição de dados NI USB-6531, os registros ultrassônicos dos microfones foramsincronizados aos registros de vídeo e eletrofisiológicos do sistema da Plexon.

Na figura 4.6, vemos o esquema ilustrativo do setup experimental. Um script Matlab foi

4.5. Condicionamento pelo medo 23

desenvolvido a fim de sincronizar o início dos registros de áudio aos registros de vídeo e neurais.

Quando executado no notebook, um pulso elétrico era enviado a uma saída digital do sistema de

aquisição de dados National Instruments NI USB-6351 concomitantemente ao início do registro

das vocalizações. A saída digital do NI USB-6531 foi conectada a entrada digital da Plexon e,

desta forma, podemos sincronizar os registros sonoros aos registros de vídeo e eletrofisiológicos

posteriormente.

4.5 Condicionamento pelo medo

O condicionamento pelo medo é um paradigma comportamental bastante utilizado para estudar

essa emoção em modelos animais. Portanto, se apresenta como um bom mecanismo de estudo

de alterações emocionais presentes no autismo. Este protocolo de condicionamento ao medo que

descreveremos nesta seção foi testado em dois animais sendo um controle e outro modelo de

autismo. Neste paradigma, um estímulo sonoro previamente não aversivo (CS+) é apresentado

algumas vezes em conjunto a um choque de baixa intensidade ao animal. O animal, então, passa

a demonstrar reações características de medo (congelamento, aumento de frequência cardíaca)

ao ouvir aquele som mesmo quando não associado a um choque. Em indivíduos com estresse

pós-traumático e ansiedade generalizada existe uma grande probabilidade de “generalização”

comportamental a estímulos não aversivos diversos. A generalização se refere ao fato da resposta

comportamental ser exacerbada mesmo quando seguindo um estímulo inofensivo que não tenha

sido previamente apresentado em conjunto com estímulos aversivos.

Os experimentos de condicionamento discriminativo pelo medo são realizados em um aparato

cujo assoalho consiste em barras de metal por onde é dado choques de intensidade em torno de

0,3 mA. Com exceção da parede frontal da caixa que é transparente, todas as paredes são opacas

em tonalidade cinza. Após cada sessão as caixas foram limpas com solução de ácido acético 1%.

Dois estímulos sonoros de diferentes frequências foram apresentados, um deles pareado ao choque

(CS+) e o outro não (CS-). Cada estímulo com duração de 30 segundos em uma sequência de

27 bips de 0,5 s (ver figura 4.7). No caso do CS+, o último bip foi co-terminado com um choque.

Os bips eram compostos por tons puros de 4 kHZ (CS+) e 10kHz (CS-).

O animal foi colocado no aparato e pôde explorar a caixa livremente por 2 minutos. Após

esse período, foram apresentados os estímulos sonoros cuja ordem de apresentação é a seguinte:

5 CS+ e 5 CS- intercalados e separados por intervalos aleatórios de 30 a 120 s. Durante todo

4.6. Extinção do medo 24

Figura 4.7: Cada estímulo sonoro, CS+ ou CS-, era composto por 27 bips sequenciais. A duraçãode cada um era de 500 ms e se repetiam a cada 1100 ms. A duração total de cada estímulo erade 30 s.

o experimento, foram realizados registros de VUS através de microfone ultrassônico e registro

de vídeo. No entanto, registros eletrofisiológicos não foram feitos para evitar danos ao pré-

amplificador presente no headstage em decorrência da corrente elétrica aplicada no animal.

4.6 Extinção do medo

Um dia após o condicionamento pelo medo, realizamos a extinção dessa memória aversiva através

da apresentação seguidas vezes do estímulo sonoro CS+ sem estar pareado com o choque. A

extinção do medo foi realizada numa arena cujas características são bem diferentes daquelas

da arena do condicionamento. Suas paredes e assoalho são pretos, de madeira e limpos com

álcool 70%. Apresentamos os mesmos estímulos CS+ e CS- utilizados no condicionamento. A

apresentação dos CS- é importante para avaliarmos a ocorrência ou não a generalização. O

animal foi deixado explorar a caixa livremente por um período de dois minutos, e a seguir foi

apresentada uma sequência de quatro CS- seguidos por doze CS+. O intervalo de tempo entre

cada CS variou entre 30 e 120 segundos aleatoriamente. Durante o experimento, foram realizados

registros eletrofisiológicos contínuos, registro de áudio ultrassônicos e filmagem sincronizada com

os registros. A iluminação do ambiente foi realizada por um conjunto de leds infra-vermelhos.

Após o teste, os animais retornaram às suas caixas de origem e foram levados ao biotério.

4.7 Registro eletrofisiológico

A aquisição de dados foi realizada através do sistema Omniplex (Plexon Inc., USA) utilizando

headstage de alta impedância de entrada com ganho de 20X (HST/ 32V-G20). Os registros

eletrofisiológicos e os dados comportamentais de posicionamento do animal e velocidade de

locomoção foram sincronizados através do sistema CinePlex (Plexon Inc., USA). O sinal de cada

eletrodo foi amplificado entre 100 e 1000 vezes, filtrado entre 0,1 e 7700 Hz e digitalizado a 1

4.8. Análise de dados 25

kHz para para análise de LFPs.

4.8 Análise de dados

A análise de dados foi realizada atavés do software CinePlex e de rotinas escritas por nós para

Matlab 2013b (MathWorks, Natick, MA).

4.8.1 Pré-tratamento do sinal

Utilizamos o CinePlex para realização das primeiras análises off-line dos dados. Essa ferramenta

permite visualização dos sinais registrados através do sistema Omniplex em sincronia com o vídeo.

Alguns canais foram previamente excluídos das análises por sofrerem bastante interferência de

ruídos eletromagnéticos e/ou de artefatos de movimento. Apesar da medição pré-operatória de

impedância de todos os eletrodos, o manuseio da matriz durante a cirurgia pode danificar a

conexão dos fios de tungstênio à placa de circuito impresso ou até mesmo partir os eletrodos.

Através do Cineplex é possível definir marcadores de eventos de interesse. Definimos, então,

intervalos onde apareciam artefatos de movimento nos canais não-excluídos. Esses marcadores

foram utilizados em rotinas do MatLab para seleção dos trechos analisados e mostrados nos

Resultados deste trabalho. Além disso, identificamos e sinalizamos uma série de comportamen-

tos: atividade exploratória, repouso, interação com animal e interação com objeto. Atividade

exploratória foi definida como movimentação de cabeça, pescoço e vibrissas mesmo se o animal

não estivesse propriamente ambulando. Repouso foi definido como imobilidade sem sem pros-

tração do corpo em posição de sono. Por fim, os trechos de interação foram determinados pela

aproximação do focinho do animal experimental com a grade que o separava do outro animal

(interação social) ou do objeto (interação com objeto).

Definimos três zonas distintas dentro do aparato que foram diferenciadas pela distância às

regiões de interação com animal e objeto. As duas primeiras zonas A e B, adjacentes a gaiola

do animal e do objeto, respectivamente, foram estabelecidas como áreas quadradas com lado

de 28,5 cm. A zona C, localizada no lado oposto a ambas gaiolas, possuía área retangular de

57x28,5 cm2 (figura 4.8).

4.8. Análise de dados 26

Figura 4.8: Três zonas foram delimitadas dentro do aparato: A, B e C. As duas primeiras, A e B,são quadradas com vértices iguais a 28,5 cm e a segunda retangular de área igual a 57x28,5 cm2.A zona A é adjacente a gaiola do animal de exposição, a zona B é adjacente a gaiola do objetoe, por fim, a zona C fica no lado oposto a ambas gaiolas.

4.8.2 Análise de LFPs

Densidade espectral de potência (PSD): Foi calculada através do método de Welch com janelas

Hamming de 1024 pontos e sobreposição de 50% do segmento de LFP. A normalização da PSD

foi resultado da divisão de cada ponto da PSD bruta pela soma de todos os pontos da PSD

excluindo aqueles correspondentes a faixa de frequência entre 58 e 62 Hz. Essa faixa de frequência

foi excluída das análises pois em alguns registros possuía muita energia proveniente de ruído da

rede de energia elétrica local.

Coerência: A coerência é uma medida da correlação entre duas séries temporais. Em neurofisi-

ologia, onde dados eletrofisiológicos de campo (LFP) são registrados simultaneamente em várias

áreas, podemos usá-la como parâmetro estimativo da sincronia entre regiões cerebrais. Neste

relatório, utilizamos o método de Welch para cálculo da coerência entre o CPFm e o hipocampo

com janelamento hamming de 1024 pontos, overlap de 50% e Transformada Rápida de Fourier

(FFT) de 1024 pontos.

Capítulo 5

Resultados

5.1 Exploração de um novo ambiente

Três animais controles e três animais experimentais tendo sido manipulados por no mínimo

cinco dias antecedentes foram deixados explorar livremente um novo ambiente durante a fase 1

do experimento descrito em 4.4. Durante este período, foram registrados potenciais de campo

local (LFP) simultaneamente no córtex pré-frontal e no hipocampo ventral. Para realização

das análises dividimos o experimento em dois momentos: o primeiro enquanto o animal esteve

ativo em atividade de exploração com as vibrissas em movimento; e o segundo quando animal

esteve em repouso, no entanto, sem dormir. Para realização das análises mostradas nesse capítulo,

utilizamos o melhor canal de registro do hipocampo e o melhor do córtex pré-frontal, isto é,

aqueles menos sujeitos a ruídos elétricos e artefatos de movimento.

Podemos ver na figura 5.1, trechos representativos de LFPs de animais controles (5.1a e

5.1b) e animais VPA (5.1c e 5.1d) em momentos de exploração. Já é bem descrito que durante

atividade locomotora, os ratos apresentam oscilação hipocampal em ritmo teta (entre 4 e 12 Hz)

sustentada. Mesmo através da representação do sinal no domínio do tempo, podemos observar

que assim como o grupo controle, o grupo VPA também apresenta aumento da potência na faixa

de teta. Percebe-se que a oscilação mais lenta de maior potência alcança seu valor de pico em

torno de 8 vezes dentro do período de 1 s representado, correspondendo a frequência de teta. Essa

característica fica mais clara, no entanto, quando observamos os dados no domínio de frequência.

A densidade espectral de potência normalizada apresentada na figura 5.2 refere-se ao conjunto

de trechos extraídos em que os animais estiveram em locomoção. A faixa de frequência da rede

elétrica local, em torno de 60 Hz, foi excluída da representação. Os gráficos em cinza correspondem

5.1. Exploração de um novo ambiente 28

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.1: Trechos ilustrativos de LFP de animais controle (em preto) registrados no (a) Córtexpré-frontal medial e no (b) hipocampo; e animais VPA (em vermelho) registrados no (c) córtexpré-frontal medial e no (d) hipocampo. Os animais estavam em atividade exploratória

ao grupo controle e aqueles em vermelho ao grupo VPA. Sendo ambos da esquerda extraídos do

córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo. Vemos que os dois

grupos apresentam um pico na faixa de teta em ambas regiões cerebrais. Outro pico em torno

de 18 Hz é presente tanto no hipocampo como no pré-frontal medial do grupo controle. Por

fim, notamos um pico na faixa de high gamma (62 – 90 Hz) no córtex pré-frontal dos animais

controle.

Figura 5.2: PSD do LFP dos animais em atividade exploratória. Os gráficos em cinza corres-pondem ao grupo controle (n=3) e aqueles em vermelho ao grupo VPA (n=3). Sendo ambos daesquerda extraídos do córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo.

Durante a atividade de livre exploração, um animal controle e um animal VPA não ficaram

5.1. Exploração de um novo ambiente 29

em repouso em momento algum. Portanto, para as analises dos momentos em repouso, somente

dois animais de cada grupo foram utilizados. Vemos na figura 5.3 trechos representativos de LFPs

desses momentos e podemos notar que nesse caso as ondas são mais chatas. A potência de teta

claramente se mostra reduzida neste caso. No entanto, esse fato fica mais nítido se compararmos

as figuras 5.4 e 5.2 que representam a PSD normalizada para os dois momentos distintos.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.3: Trechos ilustrativos de LFP de animais controle (em preto) registrados no (a) Córtexpré-frontal medial e no (b) hipocampo; e animais VPA (em vermelho) registrados no (c) córtexpré-frontal medial e no (d) hipocampo. Os animais estavam em repouso.

Figura 5.4: PSD do LFP dos animais em repouso. Os gráficos em cinza correspondem ao grupocontrole (n=2) e aqueles em vermelho ao grupo VPA (n=2). Sendo ambos da esquerda extraídosdo córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo.

5.2. Animais em interação social 30

5.2 Animais em interação social

Nesta seção abordaremos os resultados provenientes da etapa do experimento de interação social

(seção 4.4) quando cada animal fora colocado na arena principal enquanto um animal familiar

estava presente em um compartimento lateral da mesma. Os dois espaços eram separados por

uma parede de acrílico transparente e com orifícios circulares de 1,5 cm ao longo de toda ela.

Desta forma, os animais podiam interagir através da visão, do olfato e de vocalizações. Somente

dados provinientes de dois animais de cada grupo foram utilizados nessas análises. Durante esse

período, separamos os trechos de interação com o animal familiar conforme explicado em 4.8.1.

Podemos ver na figura 5.5, trechos representativos de LFPs de animais controles (5.5a e 5.5b) e

animais VPA (5.5c e 5.5d) nesses momentos. Ao analisarmos a PSD dos dois grupos durante a

interação social (figura 5.6), não observamos nenhuma diferença significativa.

(a) (b)

(c) (d)

Figura 5.5: Trechos ilustrativos de LFP de animais controle (em preto) registrados no (a) Córtexpré-frontal medial e no (b) hipocampo; e animais VPA (em vermelho) registrados no (c) córtexpré-frontal medial e no (d) hipocampo. Os animais estavam interação social.

Afim de elucidar com mais clareza as diferenças entre as densidades espectrais de potência

entre os dois grupos de animais nos três momentos distintos: em exploração, em repouso e em

interação social; separamos o PSD por ritmos oscilatórios cerebrais: Teta, Beta, Low gamma

e High Gamma (figuras 5.7, 5.8, 5.9 e 5.10). As barras correspondem ao valor médio da PSD

dentro da faixa de frequência de cada ritmo. Para comparar os resultados dos grupos, utilizamos

teste-t. Os resultados e comparações que realizaremos, no entanto, servem como caminho para

futuras investigações visto o pequeno número de ratos.

5.2. Animais em interação social 31

Figura 5.6: PSD do LFP dos animais em interação social. Os gráficos em cinza correspondem aogrupo controle (n=2) e aqueles em vermelho ao grupo VPA (n=2). Sendo ambos da esquerdaextraídos do córtex pré-frontal medial, enquanto aqueles da direita vêm do hipocampo.

Conforme já mostrado em diversos estudos, o grupo controle apresenta aumento da potência

do ritmo Teta hipocampal quando em exploração se comparado quando encontra-se em repouso

(p=0,025) (figura 5.7). Nossos resultados mostram também uma diferença dessas medições nos

momentos de exploração e interação social para o grupo controle (p=0,00096). No entanto, estas

alterações não ocorrem no grupo VPA. Por fim, não foram encontradas diferenças entre os grupos

para o ritmo teta seja hipocampal seja cortical.

Figura 5.7: PSD média do ritmo teta no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita) nos trêsmomentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interaçãosocial (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto asvermelhas correspondem aos animais VPA.

5.2. Animais em interação social 32

Para os outros ritmos, não foram encontradas diferenças significativas. Tanto beta quanto

gamma (dividido em low e high) se mostram bem similares entre os animais controles e experi-

mentais em todos os momentos analisados (figuras 5.8, 5.9 e 5.10).

Figura 5.8: PSD média do ritmo beta no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita) nos trêsmomentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interaçãosocial (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto asvermelhas correspondem aos animais VPA.

Figura 5.9: PSD média do ritmo low gamma no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita)nos três momentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) eem interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controleenquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

Analisamos também a coerência entre as regiões CPFm e hipocampo dos animais nos três

momentos previamente descritos (figura 5.11). Para facilitar a comparação, de maneira semelhante

ao que fizemos para as análises de PSD, calculamos a coerência média para cada ritmo oscilatório.

5.2. Animais em interação social 33

Figura 5.10: PSD média do ritmo high gamma no CPFm (esquerda) e no hipocampo (direita)nos três momentos distintos: em exploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) eem interação social (linhas horizontais). As barras cinzas correspondem aos animais controleenquanto as vermelhas correspondem aos animais VPA.

Figura 5.11: Coerência média entre CPFm e hipocampo dos ritmos oscilatórios teta, beta, lowgamma e high gamma representados na esquerda para direita em três momentos distintos: emexploração (sem textura), em repouso (linhas diagonais) e em interação social (linhas horizontais).As barras cinzas correspondem aos animais controle enquanto as vermelhas correspondem aosanimais VPA.

5.3. Condicionamento ao medo 34

Com relação ao ritmo teta, vemos que o grupo controle apresenta valores de coerência

bastante similares em todos os momentos. Já o grupo VPA que apresenta valores próximos ao

grupo controle nos períodos de exploração e repouso, apresenta uma elevação considerável da

coerência no momento de interação social. Apesar de não significativas, as diferenças encontradas

para o grupo VPA entre o momento de interação social e o momento de exploração (p=0.1448)

ou o momento de repouso (p=0.1941) podem indicar um caminho a ser seguido em futuros

experimentos com maior número de animais.

Ao analizarmos a coerência do grupo VPA entre o CPFm e o hipocampo na faixa de beta,

vemos uma diminuição quando ocorre exploração em relação ao período de repouso (p=0.0033)

ou em relação ao período de interação social (p=0.0226)

Já o ritmo gama que foi dividido em low e high apresenta diferenças na sua faixa de frequência

mais elevada. A coerência de high gamma do grupo VPA durante a o repouso é bastante elevada

se comparada aos momentos de exploração.

5.3 Condicionamento ao medo

O protocolo de condicionamento ao medo foi testado em dois animais sendo um controle e outro

modelo de autismo. Após o paradigma de condicionamento, os ratos ao serem apresentados ao

CS (originalmente não aversivo), apresentam comportamento de congelamento caracterizado

pela cessação da ambulação e manutenção de movimentos apenas em decorrência da atividade

respiratória. Além desta alteração comportamental, vários estudos também mostram alterações

de parâmetros autonômicos como aumento da frequência cardíaca e ritmo respiratório. Como

explicado na seção 4.5, durante o protocolo de condicionamento ao medo, os animais foram

expostos a estímulos CS+ e estímulos CS-. No dia seguinte, realizamos o protocolo de extinção

do condicionamento em uma arena completamente distinta daquela onde ocorreu o treinamento.

O protocolo de extinção foi dividido em cinco fases. A primeira corresponde ao período basal

quando o animal é colocado na caixa e deixado explorar livremente. Durante este período nenhum

estímulo (sonoro ou choque) é apresentado. Na fase seguinte, foram apresentados quatro estímulos

CS-. Já nas três últimas fases, foram apresentados quatro CS+ em cada uma delas, porém, desta

vez, eles não estavam associados a choque. Na figura 5.12, vemos o percentual do tempo que

os animais ficaram congelados em cada fase do protocolo de extinção. Dividimos cada fase em

quatro períodos de mesma duração já que, com exceção da primeira, quatro estímulos foram

5.3. Condicionamento ao medo 35

apresentados em cada uma delas. O valor de cada barra corresponde à média dos percentuais de

tempo que os animais ficaram congelados nos quatro períodos de cada fase. O animal controle

(figura 5.12a) parece ter generalizado o medo a qualquer um dos estímulos, CS- ou CS+, pois

entrou em congelamento nas últimas quatro fases durante quase todo tempo. Já o animal

VPA (figura 5.12b) não parece generalizar o medo e o percentual de tempo em congelamento

só é significativo nas fases quando o CS+ é apresentado. A medida que os estímulos sonoros

anteriormente apresentados em associação ao choque são apresentados isoladamente, ocorre um

processo de extinção da memória aversiva. Esse processo, normalmente, fica claro com a queda

no tempo de congelamento apresentado pelo animal. Infelizmente, nenhum dos dois animais

apresentou extinção da memória consistente com a literatura. No entanto, é possível notar,

principalmente no caso do animal VPA, uma redução no percentual do tempo que o animal

passou parado indicando o início do processo de extinção.

(a) (b)

Figura 5.12: Taxa de tempo em que cada animal ficou congelado em cada fase do protocolo deextinção do medo. (a) animal controle; (b) animal VPA.

Durante o protocolo de extinção ao medo, realizamos registros eletrofisiológicos no córtex

pré-frontal medial e no hipocampo. Como descrito na seção 4.5, cada estímulo sonoro, CS+ ou

CS-, é composto por 27 bips sequenciais de duração de 500 ms. As figuras 5.13, 5.14, 5.15, 5.16,

mostram o espectrograma médio pré e pós bips da segunda fase (CS-), da terceira fase (primeiros

quatro CS+) e da última fase (últimos quatro CS-), na ordem de cima para baixo. O tempo 0

corresponde exatamente ao início de cada bip.

As figuras 5.13 e 5.14 correspondem aos registros do animal controle no córtex pré-frontal

medial e no hipocampo, respectivamente. Como podemos observar, as respostas evocadas pelos

estímulos sonoros em ambas regiões são bastante claras. O aumento na potência de gama

parece estar associado ao medo de que aquele bip preceda um choque. Essas figuras sugerem

a generalização do medo visto que a apresentação do CS- (5.13a e 5.14a) gera esse aumento,

5.3. Condicionamento ao medo 36

(a)

(b)

(c)

Figura 5.13: Média do espectrograma do CPFm do animal controle pré e pós inicio de um bip (a)da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada; (a) da etapa 3 quando a primeirabateria de quatro CS+ é apresentada; (a) da etapa 5 quando a última bateria de quatro CS+ éapresentada.

corroborando, assim, os achados comportamentais. Vemos, então, que a medida que os estímulos

sonoros ocorrem sem choque, a resposta passa a ser de menor intensidade.

As figuras 5.15 e 5.16 correspondem aos registros do animal VPA no córtex pré-frontal medial

e no hipocampo, respectivamente. Diferentemente do animal controle, este animal não parece

ter generalizado o medo a ambos estímulos. Coerentemente ao comportamento, o aumento da

potência de gama na presença de CS- não ocorre (figuras 5.15a e 5.16a), sugerindo que o animal

diferenciou CS- e CS+ e não apresentava medo do choque na presença de CS-. Já na primeira

bateria de CS+ (figuras 5.15b e 5.16b), a resposta evocada parece clara e é diminuída a medida

em que o estímulo é apresentado na ausência de choque, o que se constata com a última bateria

de CS+ (figuras 5.15c e 5.16c).

5.3. Condicionamento ao medo 37

(a)

(b)

(c)

Figura 5.14: Média do espectrograma do hipocampo do animal controle pré e pós inicio de umbip (a) da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada; (a) da etapa 3 quando aprimeira bateria de quatro CS+ é apresentada; (a) da etapa 5 quando a última bateria de quatroCS+ é apresentada.

5.3. Condicionamento ao medo 38

(a)

(b)

(c)

Figura 5.15: Média do espectrograma do CPFm do animal VPA pré e pós inicio de um bip (a)da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada; (a) da etapa 3 quando a primeirabateria de quatro CS+ é apresentada; (a) da etapa 5 quando a última bateria de quatro CS+ éapresentada.

5.3. Condicionamento ao medo 39

(a)

(b)

(c)

Figura 5.16: Média do espectrograma do hipocampo do animal VPA pré e pós inicio de umbip (a) da etapa 2 quando uma bateria de quatro CS- é apresentada; (a) da etapa 3 quando aprimeira bateria de quatro CS+ é apresentada; (a) da etapa 5 quando a última bateria de quatroCS+ é apresentada.

Capítulo 6

Discussão

Estratégia metodológicos para o estudo de comportamentos sociais

A deficiência na interação/comunicação social é um dos dois fatores utilizados para diagnósticos

em pacientes autistas. Em nosso laboratório, utilizando modelos animais de autismo VPA, foram

realizados experimentos que comprovaram déficits de interação social nesses animais. No entanto,

nenhuma pesquisa fora realizada sobre a caracterização eletrofisiológica nesse modelo durante um

episódio de interação social ou resposta ao medo. Visando contribuir para o preenchimento desta

lacuna, nos propusemos neste trabalho iniciar a implementação de estratégias metodológicas que

sejam capazes de acoplar o monitoramento comportamental por vídeo (p.ex. interação social),

registros eletrofisiológicos com múltiplos eletrodos e registro de emissões ultrassônicas.

A definição de interação social é bastante ampla e envolve inúmeras variáveis. Com o objetivo

de isolar alguns parâmetros, o experimento é composto de quatro fases. A apresentação de

um animal familiar e outro não-familiar nos permite eliminar o fator novidade. Já o objeto de

tamanho similar ao animal colocado no compartimento oposto permite a diferenciação entre

interação social e interação com um objeto. Ademais, as fases sem exposição de animais são

importantes para medições de níveis basais.

As VUS são muito importantes para comunicação entre os roedores. Diversos estudos mostram

um cunho emocional e social importante a depender da frequência desses sons. Ademais, a

vocalização de um rato pode despertar respostas em outro animal ouvinte. Portanto, durante o

experimento foram utilizados microfones ultrassônicos. A identificação da valência e do emissor

das VUS é um mecanismo muito interessante para melhor compreensão da interação entre os

animais. Esperamos que esse setup seja utilizado futuramente no laboratório para experimentos

41

com modelos VPA e também de outras patologias com prejuízo social.

Dois animais de cada grupo passaram por todas as fases desse protocolo o que nos permite

tecer alguns comentários qualitativos. Observamos que o tempo que todos os animais, tanto

controles quanto VPAs, passam a interagir com o objeto é muito reduzido, não excedendo 30s

num período de 20 minutos em nenhum dos casos. Outro fato importante é a manipulação prévia

dos animais que devem estar o menos estressados possível para explorar e interagir livremente.

Por fim, notamos que os animais aprisionados podem emitir taxas bastante distintas de VUS.

A medição desse elemento é de bastante importância para compreensão do comportamento do

animal que está sendo analisado. Ao ouvir uma vocalização de valência positiva ou negativa, é

natural que as respostas neuronais sejam distintas. Infelizmente, não pudemos analisar este fator

até o momento, mas esperamos utilizá-lo em experimentos futuros.

Os experimentos de condicionamento e extinção do medo foram realizados somente com

dois animais: um controle e um VPA. O objetivo era validar do começo ao fim os setups para

experimentos futuros dentro do laboratório. O grande desafio desses protocolos foi sincronizar

todos os eventos sonoros e comportamentais ao registro eletrofisiológico. Infelizmente, o registro

eletrofisiológico durante a etapa de condicionamento não foi possível, pois o choque aplicado nas

patas do animal poderia danificar o headstage. Durante o primeiro dia do protocolo, os animais

são apresentados a baterias de estímulos sonoros associados a um choque (CS+) e não-associados

a choque (CS-). No segundo dia, apresentamos os mesmos estímulos, no entanto, ambos na

ausência de choque. O comportamento natural do animal ao ser colocado em um ambiente novo

é explorar. Porém, ao ouvir aquele estímulo que fora anteriormente apresentado em presença do

choque, caso o rato tenha criado a memória aversiva, imediatamente ele fica imóvel (congela).

A medida que o estímulo é apresentado, essa memória aversiva vai sendo extinta e a curva de

tempo de congelamento decai. Dizemos que o animal generalizou o medo, quando ele também

congela ao ouvir o estímulo CS-. As razões para que isso ocorra incluem estresse e ansiedade e,

portanto, manipulação e habituação do animal ao experimentador são indispensáveis.

Acerca dos resultados mostrados nas figuras da seção 5.3 não podemos generalizá-los aos

grupos, pois o número de animais é insatisfatório. No entanto, se analisarmos cada animal

individualmente, podemos tecer algumas considerações. O gráfico de barras que ilustra o tempo

de congelamento de cada animal por fase do protocolo de extinção (figura 5.12) deixa claro que

o animal controle desde o começo, na fase basal (BL), já se movimenta menos que o animal

VPA. Esse comportamento pode ser um indicador de estresse, o que também pode explicar a

42

generalização do medo ao estímulo CS- que este animal apresentou. Segundo Markram et al. (2008)

que realizaram experimentos de condicionamento pelo medo com animais VPA, esses animais

apresentam maior taxa de generalização e menor taxa de decaimento da curva de congelamento

na fase de extinção. Em nosso laboratório, será necessário reproduzir os experimentos com um

maior número de animais para que sejamos capazes de avaliar esses achados.

Com relação aos registros eletrofisiológicos, também podemos diferenciar facilmente o espec-

trograma do animal que generalizou e aquele que não generalizou. Vemos que tanto no hipocampo

quando no CPFm, o animal controle apresenta um aumento significativo da potência do sinal

na faixa de gama e bastante sincronizado com o início dos bips de CS- e de CS+. No caso do

animal VPA, que não generalizou, esse padrão só ocorre nas etapas onde CS+ é apresentado.

Implante de matrizes de eletrodos

O processo de fabricação das matrizes de eletrodos foi realizado em nosso laboratório. Desde o

projeto até a implementação, pequenos detalhes devem ser pensados afim de minimizar os riscos

durante a cirurgia. Por desejarmos realizar o registro síncrono em duas regiões diferentes, esses

cuidados foram ainda maiores. Após a escolha da localização dos implantes, com auxílio do atlas

estereotáxico (Paxinos e Watson, 2007), escolhemos o espaçamento e estrutura de cada matriz.

Os fios escolhidos foram de tungstênio 50𝜇 pelo bom compromisso rigidez/impedância. Outros

fios foram testados, porém fios muito finos podem se curvar durante a descida dorso-ventral para

posicionamento dos eletrodos. Já fios muitos espessos, além de causar maiores danos ao tecido,

tem impedância reduzida o que acarreta em maior captação de ruídos e dificuldade no registro

multi-unitário.Toda manipulação de fios de tungstênio deve ser feita com bastante cautela para

que o revestimento não seja danificado. O corte do fio que ficará em contato com o tecido cerebral

deve ser reto e limpo de forma que somente o plano perpendicular ao eletrodo esteja desencapado.

Os eletrodos são ligados ao conector Würth através de uma placa de circuito impresso. Como o

tungstênio não tem forte adesão à solda de estanho, utilizamos a tinta de prata para conectar

os fios à placa. É importante que a tinta esteja bem seca para manipulação da placa. Por fim,

realizamos a galvanização dos conforme descrito em 4.2.

Para o correto posicionamento dos eletrodos, devem ser considerados o espaçamento entre

eletrodos de cada matriz e a distância entre as duas matrizes. Para respeitarmos os espaçamentos

entre os eletrodos utilizamos os chamados gabaritos. Os gabaritos nada mais são que pequenas

43

folhas de papel com orifícios de 50𝜇 alinhados e espaçados de 300𝜇. Com dois gabaritos posi-

cionados de maneira que um fio possa atravessar ambos de maneira perpendicular, com ajuda

de uma pinça emborrachada e uma lupa, atravessamos os eletrodos pelos furos de maneira a

organizar nossa matriz. Outro desafio é respeitar a distância entre as duas matrizes, uma que

será implantada no CPFm e outra no hipocampo. Caso um erro ocorra durante a montagem,

saberemos durante a cirurgia quando marcarmos as coordendas com o uso do estereotáxico. No

entanto, com o procedimento cirúrgico em andamento, não resta mais nada a ser feito e, na

maioria dos casos, o implante é realizado em somente uma região de interesse. Após diversas

estratégias para diminuir esse risco durante a confecção da matriz, tomamos a decisão de deixar

as matrizes independentes de maneira que no momento do implante, cada uma pudesse ser

posicionada isoladamente. Apesar de prolongar a cirurgia cerca de 45 minutos mais, conseguimos

colocar os eletrodos exatamente no local desejado.

O procedimento cirúrgico total leva em média cerca de 6h30. Durante esse período, quando

o animal encontra-se anestesiado, é muito importante reidratá-lo através de injeção de salina,

controlar sua temperatura corporal e lubrificar e proteger seus olhos. Todos esses cuidados são

importantes para evitar complicações pós-cirúrgicas. Após a realização da craniotomia, com

muita cautela retiramos a dura-mater. Caso esse procedimento não seja bem realizado, os ele-

trodos se chocaram com a meninge ou pedaços de ossos e serão danificados. Uma vez que as

pontas dos eletrodos tocam o encéfalo, a descida da matriz até a coordenada desejada deve ser

feita lentamente ( 100𝜇/min). Desta maneira, a medida que os eletrodos descem, o tecido vai se

acomodando e menos neurônios são mortos. Ao final, o capacete é fechado e fixado a parafusos

presos ao crânio através de acrílico dental.

Oscilações em animais VPA

O ritmo teta é uma oscilação cerebral de frequência entre 4Hz e 12Hz. Em roedores, observa-se

aumento na potência deste ritmo no hipocampo durante a vigília ativa, quando exploram um

ambiente ou objetos (Vanderwolf, 1969). Ao comparamos o teta hipocampal dos dois grupos,

controle e VPA, observamos que o segundo grupo apresentou maior potência em todos os trechos

analisados (figura 5.7). Esse achado, caso confirmado com o aumento do número de animais

por grupo, poderia estar relacionado com a hiperlocomoção e hiperatividade apresentada pelos

animais experimentais (Sousa, 2013; Schneider e Przewłocki, 2005).

44

A coerência em teta entre o hipocampo e o CPFm parece estar relacionada a ansiedade,

além de formação e extinção de memórias aversivas (Adhikari et al., 2010, 2011; Johansen et al.,

2012). Durante os momentos de interação social, o grupo controle apresenta redução da coerência

em teta CPFm-hipocampo (figura 5.11 esquerda-superior) enquanto o grupo VPA apresenta

aumento (relação coerência VPA/controle = 3,29:1). Este achado poderia indicar um aumento

do nível de ansiedade no grupo VPA ao encontrar um de seus pares o que não ocorre no grupo

controle.

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