IMUNOLOGIA · IMUNOLOGIA 2018/19 4 Adicionalmente há que considerar que o trabalho prático decorrerá no laboratório de Microbiologia, onde microrganismos de diferentes tipos são

www.ensino.uevora.pt/imuno

IMUNOLOGIA

ManualdeapoioàsSessõesLaboratoriais

2019

CarlosSinogas

IMUNOLOGIA2018/19 2

ÍNDICEPROCEDIMENTOSDESEGURANÇA.........................................................................................................................................3

Riscoquímico/radiológico/biológico.......................................................................................................................3 RegrasePlaneamento..........................................................................................................................................................4 Procedimentosgerais...........................................................................................................................................................5

REGISTOSERELATÓRIOS............................................................................................................................................................6 ANTICORPOSMONOCLONAIS....................................................................................................................................................7

Introdução.................................................................................................................................................................................7 Imunização................................................................................................................................................................................7 FusãoCelular............................................................................................................................................................................8 SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológica.................................................................................................................8 ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutoras.....................................................................................................9 CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonais......................................................................................9 EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais............................................................................10

PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS..............................................................................................................................................11 1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES..............................................................................................................11 2. CALIBRAÇÃODEMICROPIPETAS.........................................................................................................................16 3. TESTEÀIMUNIDADENATURAL...........................................................................................................................19 4. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL........................................................................................................................................22 5. RECOLHADESANGUE................................................................................................................................................23 PreparaçãodoSoro.............................................................................................................................................................23 PreparaçãodeEritrócitos.................................................................................................................................................24

6. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(Humanas)................................................................................25 7. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–Precipitaçãodiferencial........................................................26 8. IMUNOPRECIPITAÇÃO-Qualitativa....................................................................................................................27 Testedoanel..........................................................................................................................................................................27 Testeemlâmina....................................................................................................................................................................28

9. IMUNOPRECIPITAÇÃO–Quantitativa.................................................................................................................29 Curvadeprecipitação.........................................................................................................................................................29 Nefelometria...........................................................................................................................................................................30

10. IMUNODIFUSÃO............................................................................................................................................................31 Imunodifusãosimples........................................................................................................................................................31 Imunodifusãodupla(Ouchterlony)..............................................................................................................................32

11. HEMAGLUTINAÇÃO.....................................................................................................................................................33 12. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(Rápido)...................................................................................................34 13. IMUNOELECTROFORESE..........................................................................................................................................35 14. ELISA(EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay).............................................................................................36 “Checkerboard"....................................................................................................................................................................36 Teste...........................................................................................................................................................................................39 RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA..............................................................................................................42

IMUNOLOGIA2018/19 3

PROCEDIMENTOSDESEGURANÇAOtrabalholaboratorialemImunologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,oriscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesquesecolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadoptampráticasapropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve.

Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenasalgumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradoptadas.

Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipodiferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoserobservadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia.

Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdassituaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados.

Riscoquímico/radiológico/biológicoOsprodutosquímicosempreguesnosensaiosimunológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentesriscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendoentãoseradoptadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte,etc.

AspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderiscoconhecidoparaaSaúdeHumana.

Detodososriscosassociadoscomostrabalhosdeimunologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éaradioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemservistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãodeprodutosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Àsexigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminaçãodosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos.

Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos.

Todasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfecciosas,emparticularasquesãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfecciososnãoexiste.Asoutrasespéciesanimaismaisusadasemtrabalhosdeimunologia,oscoelhos,oscaprinoseosroedores,sãomamíferosafastadosdoHomemquenãorepresentamqualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratóriosdeimunologia.

Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfecçõesocorrememgolpesabertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasouporinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodiretocomamostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidoseconvenientementeimpermeabilizados.

Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofarãousodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigemhumana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentesinfecciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocasoésempreaconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfecciososparaooperadoreadoptaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso".

IMUNOLOGIA2018/19 4

AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,ondemicrorganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodassuperfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada.

RegrasePlaneamentoParaalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidadeparaalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnãoestabelecidas.Importa,porisso,prevenir.

Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam:

Bata

Ousodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereemlaboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusadaapenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,abataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfecciososparaoexteriordolaboratório.

Mãos

Àentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizarpotenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis,máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvaspoderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador.

Comerebeber

Éexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecuçãodeexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquirirohábitodemanterasmãoslongedaboca.

Bancadadetrabalho

Olocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantesdeiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosdesessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentesinfecciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou.

Livrosecadernos

Sóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comooprotocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador,comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação.

Materiais

Todooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostonolocalindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostrasdeorigembiológicadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação.

IMUNOLOGIA2018/19 5

Acidentes

Qualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtromaterialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserdeimediatodesinfectadoscomoapoiodoresponsável.

Planeamento

Nãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdosprocedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodososrecursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepelaprevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.

ProcedimentosgeraisTodososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoeaformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspectivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuitoimportanteusaracabeçaantesdasmãos.

IMUNOLOGIA2018/19 6

REGISTOSERELATÓRIOSÉconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamosapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturaparaeventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosfacilitarãoaaprendizagem,ainterpretaçãodosresultadosobtidosearedaçãoposteriordorelatóriodotrabalho.

Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossíveloprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjectivodorelatorredigirumdocumentocompreensívelparaoleitoresusceptíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaemidênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintessecções:

Título Identificadordoconteúdodorelatório

Resumo Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusõesobtidas

Objectivo Razãodeserdotrabalhorealizado

Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada

Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho

Materialereagentes

Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado

Protocoloexperimental

Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadososprocedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesviosrelativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito

Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos

Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos

Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedosresultadosobtidos

Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasuarepetiçãoououtrasconsideradasadequadas

Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho

Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,algumasdassecçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoeconclusões",porexemplo

IMUNOLOGIA2018/19 7

ANTICORPOSMONOCLONAIS

IntroduçãoAnticorposmonoclonaissãoimunoglobulinashomogéneascomespecificidadedefinida,possíveisdeproduziremlargasquantidades.PodemserobtidasporimortalizaçãodelinfócitosB,clonadoseexpandidosemculturascelularescontínuas(anticorposmonoclonaispropriamenteditos)ouporrecombinaçãodeDNA,expressonoutraslinhascelulareseucarióticas(anticorposmonoclonais“engineered”).

Em1975KöhlereMilsteindescobrirameempregarampelaprimeiravezatecnologiadoshibridomas:fizeramcombinaromaterialgenéticodecélulasnormaisprodutorasdeanticorposcomodecélulasdeorigemmalignadamesmalinhagem.Iniciaramentãoumanovametodologiaquedesdeentãonãoparoudeevoluireconduziuaodesenvolvimentodatecnologiaparaaproduçãodequantidadesvirtualmenteinesgotáveisdeanticorposcomníveisdepurezanuncaantesatingidos.Trata-sedeumatecnologiadeaplicaçãohorizontalemtodasasáreascientíficasdaBiologia,cujoimpactosóécomparávelaodatecnologiadarecombinaçãodoDNA.

OsanticorpossãoproteínasproduzidasporlinfócitosB,destinadasaintervirnosprocessosdedefesaimunitáriadosorganismossuperiores:asimunoglobulinas.Têmcomoprincipalcaraterística,numaperspectivadeaplicaçãocientífica/biotecnológica,acapacidadedeseligaremaoantigénioquereconhecem.Atualmente,paraasuaobtenção,recorre-sequaseexclusivamenteàchamadatecnologiadoshibridomasparaapreparaçãodeanticorposmonoclonais.

Oshibridomassão,comoonomeindica,célulashíbridas,imortalizadasemculturadetecidos,produtorasdeanticorposmonoclonaiscomespecificidadeúnicaepré-determinadapeloprocessodasuapreparação.

Noprocessoclássicoparaaobtençãodehibridomasutilizam-secélulasdebaçodemurganhosimunizadoscomoantigénioquesepretendereconhecer.Esteslinfócitosativadossãofundidoscomcélulasdemielomadamesmaorigemanimal,mutantesnãoprodutoresdeimunoglobulinas,napresençadepolietilenoglicol.Ascélulasentãofundidassãocultivadasemmeioseletivo(contendoHAT)emcondiçõesquedeterminamapenasasobrevivênciadoshíbridosformadosentrelinfócitosecélulasdemieloma.Oshibridomascomascaraterísticaspretendidas,nomeadamentenoqueserefereàespecificidadeantigénica,taxasdeproduçãoecrescimentoetipodeimunoglobulinasãoselecionadospormétodosimuno-enzimáticosepreservadosporclonagemecongelamento.Acaraterizaçãodoanticorpoproduzidoeodesenvolvimentodoprocessoparaasuaproduçãoemlargaescaladependemdosobjectivosfinaisdoinvestigador.

ImunizaçãoOprocessodeimunizaçãodestina-seaconseguirlinfócitosBativadosparaparticiparnafusãocelular.Aespécieanimaleórgãosdondepodemserobtidos(baço,timo,nóduloslinfáticos,sangueperiférico),bemcomoosprotocolosdeimunizaçãodoanimaldependemdaorigemdoantigénio,dasuaimunogenicidadeedodestinoadaraosanticorposapreparar.

OmurganhoBalb/C,espécieanimaldereferência,éaquemaisfrequentementeéutilizadanaobtençãodeanticorposmonoclonais,porsetratardeumanimalpequeno,defácilmanutençãoemanipulaçãonolaboratório,comumsistemaimunitáriobastantebemconhecidoeparaoqualexistemdisponíveislinhascelularesdemielomaadequadasàobtençãodehibridomashistocompatíveiseenxertáveisnoanimal.

Oesquemadeimunizaçãoaadoptardependetambémdotipoeorigemdoantigénioedotipodeanticorpospretendidos.EmgeralumaadministraçãoúnicadeantigénionomurganhoconduzàobtençãodeumamaiorpercentagemdeIgMrelativamenteaIgG.Noqueserefereaoslinfócitosprodutoresespecíficosobtêm-seemmaiorabundâncianobaçonasequênciademúltiplasadministraçõesdeantigénio.Paraantigéniossolúveisdeelevadopesomolecular,éregraproceder-seaumaimunizaçãoemdosesrepetidasdeantigénio,separadasentresicercadetrêssemanasaummês.

IMUNOLOGIA2018/19 8

Aeficáciadoprocessodeimunizaçãoéavaliada2semanasapósumadasúltimasadministrações,poranálisedotítulodosorodoanimalemanticorposcapazesdereconheceroantigénio.AexpansãoclonaldoslinfócitosB,induzidapelapresençadoantigénio,determinaumaconcentraçãomáximadaquelascélulas,produtorasdeanticorposespecíficos,nobaçodoanimal2a3diasapósaadministraçãodoantigénio.

Paraoutrotipodeantigénios,previsivelmenteeliminadosdoorganismopormecanismosemqueosistemaimunitárionãodesempenhaopapelprincipal,comosãooscasosdemoléculashidrofóbicas,hidrofílicasdebaixopesomolecularoufracaantigenicidade,énecessáriorecorreràadiçãodeoutroscompostosqueiniciemarespostaimunitária(haptenos,“carriers”).

FusãoCelularAfusãoentreascélulasdeumamistura,destinadaaimortalizaroslinfócitosprodutoresdeanticorpos,podeocorrerespontaneamente,mascomumamuitobaixaprobabilidade.Paraaumentaressaprobabilidadeintroduzem-seoutrosagentesnamisturadecélulas.

Ascélulasdobaçodosanimaisimunizadossãorecolhidasemisturadascomcélulasdemieloma,damesmaespécieanimal,nãoprodutorasdeanticorposeportadorasdasmutaçõesHGPRT-ouTK-.Ascélulasdamistura,quandonapresençadeagentesfusogénicos,comoproteínasdovírusSendai,PEGoucampoeléctrico(electrofusão,electroporação),fundemosseusconteúdos,determinandooaparecimentodehíbridosintra-einterespecíficos.Aimortalizaçãodoslinfócitos,emparticularquandosetratadecélulasdeorigemhumana,podetambémserconseguidaportransformaçãocomvírustumorigénicos(EBV).

SeleçãoMetabólicaeSeleçãoImunológicaApósoprocessodefusãoobtém-seumamisturadecélulasdediversostipos:linfócitosecélulasdemielomanãointervenientesemqualquerfusão,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumlinfócito,híbridosresultantesdafusãodemaisdeumacélulademielomaehíbridosresultantesdafusãodecélulasdemielomacomlinfócitos.Nascondiçõesdeculturasubsequentesnãosobrevivemoslinfócitosoriginaiseoshíbridosentrelinfócitos,pornãoteremcapacidadeparacresceremculturanaausênciadosconvenientesfatoresdecrescimento.Ascélulasdemielomaeoshíbridosresultantesdefusõesentreestastambémnãopoderãosobreviver,dadoque,apesardepossuíremacapacidadedecresceremcultura,sãoportadorasdemutaçõesdasenzimasHGPRToudaTKe,napresençadeaminopterina,nãoconseguemsintetizarosprecursoresparaasíntesedoDNA.Sópodemcresceremculturaoshíbridosentrecélulasdemielomaelinfócitosquehajamadquiridoacapacidadedecresceremcultura,dosprimeiros,eacapacidadedesintetizarosprecursoresdoDNAatravésdasviasmetabólicasqueutilizamaHGPRTeaTK,provenientesdoslinfócitos.Sãooshibridomas.

Osmétodosimunológicosparaadeteção,quantificaçãoecaraterizaçãodasimunoglobulinasincluemaimunoprecipitação,ensaiosimuno-enzimáticos,imuno-radiométricosedeimuno-fluorescênciaecromatografias.Particularmentenoqueserefereàseleçãoinicialdoshibridomasresultantesdafusãoimpõe-seaadopçãodemétodosderápidaexecução,aplicáveisacentenasdeamostrasedecustosreduzidos.

Deentreoshibridomasresultantes,háqueidentificaraslinhascelularesprodutorasdeanticorposespecíficosdoantigénio.OsmétodosmaisfrequentementeutilizadosnestaseleçãoimunológicasãoaELISA("EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay"),RIA("RadioImmunoAssay"),IRMA("ImmunoRadio-MetricAssay"ou"Sandwich")eImuno-fluorescência.Ométododeprimeiraescolha,aELISA,baseia-senumafixaçãodoantigénioaumsuportesólidoseguidadoreconhecimentodestepelosanticorposproduzidospeloshibridomas.Apresençadosanticorposespecíficoséreveladaporoutrosanticorpos,específicosdaespécie(domíniosconstantesdasimunoglobulinas),econjugadoscomenzimascapazesdealterarascaraterísticascromáticasdeumsubstrato.Sãoselecionadasasculturascujossobrenadantesapresentemreaçãoenzimáticapositivanoensaio.

IMUNOLOGIA2018/19 9

ClonagemePreservaçãodasCélulasProdutorasUmavezidentificadasasculturasprodutorasdosanticorposconvenientesháquepreservá-lase,frequentemente,caraterizá-lasantesdasuautilizaçãoparaaproduçãodosanticorposmonoclonais.

Apartirdomomentoemquepelaseleçãoimunológicasãodetectadoshibridomasprodutores,estasculturasdeverãosercongeladas,mesmoantesdaclonagem,paraevitarasuaperda.

Sendooshibridomascélulaspoliploides,têmumatendêncianaturalparasegregaroscromossomasquepossuememexcesso,razãopelaqualseriaconvenientemanterumapressãoseletivaparapreservaroDNAresponsávelpelasíntesedosanticorpos.Nãoexistindoqualquerantibióticooumetabolitoquepossaexercerestapressãoseletiva,amanutençãodaexpressãoéconseguidaatravésdaclonagem,processoparaisolamentoeexpansãodeumaculturaapartirdeumasócélula.

Ométodomaisexpeditoparaaclonagemdoshibridomaséaclonagempordiluiçãolimite,emqueaculturaédiluídaedistribuídapormicroplacasemconcentraçõesinferioresaumacélulaporpoço.Outrosmétodos,comoaclonagememagarosesãomenosfrequentementeutilizadosporquemaislaboriosos.

Oshibridomas,talcomooutrascélulaseucarióticasestabelecidasemcultura,podemconservar-seporcongelaçãoemazotolíquido,ondesemantémviáveisduranteváriosanos.

CaraterizaçãoePurificaçãodeAnticorposMonoclonaisAcaraterizaçãodoanticorpoobtidoconstituiumrequisitoessencialparaasuaconvenienteutilização.

Aisotipagem,queconsistenadeterminaçãodotipodeimunoglobulinapresente,obtêm-seporreaçãoimunológicacomanticorposdeoutraespécieanimalespecíficosdosdiferentestiposdecadeiasconstantesdemurganho(IgA,IgM,IgG1,IgG2,...).

Aespecificidadeepitópicarelativadediferentesmonoclonaiscontraomesmoantigéniodetermina-seporensaioimunológicoemquecomumaquantidadefixadadeantigéniosefazemreagirmisturasdeanticorposemdiferentespercentagensrelativas.Doisanticorposreconhecerãodiferentesepitoposseumamisturadosdoisoriginaumsinalsuperioraodequalquerdelesisolado,nasaturaçãodoantigénio.

Tambémaafinidaderelativadeumanticorpoparaoantigéniopoderáserrelevante.Determina-sefazendoreagiroantigénio,radioativamentemarcado,comumadeterminadaquantidadedeanticorpo.Oantigéniofixadoporunidadedemassadoanticorporefleteaafinidadeentreosdois,nascondiçõesexperimentaisusadas.Estaquantidadedeantigénio,quandoreferidaaunidadedevolumedosobrenadantedaculturadorespectivohibridoma,constituiumindicativodaprodutividadedestacultura.

Oconhecimentodascaraterísticasfísico-químicas,comoamassamoleculare/ouopontoisoeléctricopoderãoserimportantesparaodesenhodorespectivoprocessodepurificação.

Partindodelinhascelularesdehibridomasprodutores,osanticorposmonoclonaispodemobter-seporculturadecélulas“invitro”epurificaçãoapartirdosobrenadante(comrendimentosdaordemdos100µg/mL)ouapartirdeascitesesorosdeanimaisportadoresdetumoresinduzidospelainjeçãodosrespectivoshibridomas(rendimentosdaordemdos2mg/mL).

Sãométodosdeeleiçãoparaapurificaçãodeanticorposmonoclonaisascromatografiasdeafinidade,nomeadamentecomaProteínaASepharose,sesetratardeimunoglobulinastipoG,oucomoantigéniofixadoaumsuportesólido.

IMUNOLOGIA2018/19 10

EsquemageralparaaobtençãodeAnticorposMonoclonais


PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS

1. PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadasmicropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)enasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.

Materialereagentes

¾ Soluçãosaturadadeazul-de-metileno¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversas¾ Microtubos¾ Espectrofotómetro

Procedimento(porgrupo)

Diluiçõesdecimais

1. Marquemicrotubosde1a82. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8Solvente(mL) 0 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,35 1,5Corante(mL) 1,5 0,15 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,

namesmacuvete.Últimaamostra:controlo).

Diluiçõescentesimal

1. Marquetubosdeensaiode1a62. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6Solvente(µL) 0 1500 1500 1500 1500 1500Corante(µL) 1500 15 0 0 0 0Soluçãoprecedente(µL) 0 0 15 15 15 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos


5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo)

Diluiçõesdetrêsemtrês

1. Marquetubosdeensaiode1a10)2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Solvente(mL) 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1,5Corante(mL) 1,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0Diluição(10x)

3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.4. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamais

diluídaparaamaisconcentrada,namesmacuvete)

Diluiçãoúnica(TPC)

¾ Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais.¾ Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLde

cadaumadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar:a. Diluiçãode5x102b. Diluiçãode5x10-2

Preparaçãodesoluções(TPC)

¾ Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosamisturarparaasuapreparaçãonolaboratório:

a. NaOH0,1Nb. SO4H20,1Nc. NaCl0,1Md. NaCl100mMe. Glicerol10%(fórmulaC3H8O3)f. Glucose10%(fórmulaC6H12O6)g. Etanol70%(fórmulaC2H6O2)

Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35.


RegistodeObservaçõeseResultados

PIPETAGENSEDILUIÇÕES

Operador: Data: ____/____/____

Diluiçõesdecimais

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1 2 3 4 5 6 7 8

Diluiçõescentesimais

Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentraçãocalculada Observações

1 2 3 4 5 6

Diluiçõesdetrêsemtrês Tubo Amostra DOB600nmB/mL Concentração

calculada Observações

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


Gráfico

Observações:


SOLUÇÕES


Componentes Peso/volume

Diluição5X102

Diluição5X10-2

NaOH0,1N(100mL)

H2SO40,1N(100mL)

NaCl0,1M(100mL)

NaCl100mM(100mL)

Glicerol10%(100mL)

Glucose10%(100mL)

Etanol70%(100mL)

Observações


2. CALIBRAÇÃODEMICROPIPETAS

Introdução

Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhosexperimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.

Autilizaçãofrequentedaspipetasdisponíveisnolaboratórioporestudantessemexperiêncialevaautilizaçõesincorretasdonderesultaquealgunsdosvolumesindicadosnosvisoresnãocoincidamcomasquantidadesmedidas.Nestecontextoéimportanteconheceraformadecalibrarasmicropipetasausar.

Materialereagentes

¾ Águadestilada¾ Micropipetasdiversasepontas¾ Microtubos,coposdeboémia¾ Balançadeprecisão

Procedimento(porgrupo)

Ajustedevolume(5µL)

1. Utilizeumapipetade20µL2. Ajusteoindicadordevolumeaos5µL3. Pipete,nabalança,paratubocalibrado5µL4. Observeopesoindicado5. Sesuperioraos5mg,reduzaovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.6. Seinferioraos5mg,aumenteovolumeindicadonapipetaerepita3.e4.7. Quandoaquantidadedeáguadestiladapesadaforde5mg,anoteaindicaçãodevolumeque,na

pipeta,correspondeaos5µL.


1. Utilizeumapipetade200µL2. Repitaospassosdoprocedimentoanterior(de1.a7.)paraamassade50mg(correspondentea

50µL)


1. Utilizeumapipetade1000µL2. Repitaospassosdoprocedimentoinicial(de1.a7.)paraamassade500mg(correspondentea

500µL)


Calibraçãodepipeta(200µL)

1. Meça,nabalança,umvolumede10µLparacopotarado.Anoteopeso2. Repitamaisduasvezesestadeterminação3. Repitaospontos1e2paraosvolumesde20µL;50µL;100µL;150µLe200µL4. Façamédiasdecadaconjuntodetrêspesagenshomólogas5. Desenheográficodecalibraçãodapipeta,fazendocorresponderosvolumesindicadosnovisor

comospesosavaliados.

NB

Osprocedimentosparaoutrosvolumesououtraspipetassãoidênticos.


RegistodeobservaçõeseResultados

CALIBRAÇÃODEPIPETAS


Calibraçãodepipeta20 µL

Volume Peso1 Peso2 Peso3 Média Observações

1µL

2µL

5µL

10µL

15µL

20µL

Calibraçãodepipeta200µL


10µL

20µL

50µL

100µL

150µL

200µL

Calibraçãodepipeta1000µL


50µL

100µL

200µL

500µL

750µL

1000

µL


3. TESTEÀIMUNIDADENATURAL

Materialereagentes

¾ SuspensãodeMicrococos¾ Sorofisiológicoestéril¾ Lisozimapó¾ Espectrofotómetroetubos¾ Pipetasemicropipetas¾ Placasdepetricomagarnutritivo

Procedimentoexperimental

TesteàLisozima(1grupoporturma)1. Preparar8diluiçõesdecimaisdelisozima,emmicrotubos:

Tubo L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10Lisozimapó(mg) 100 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) 1000 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900Diluição 2. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboL93. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana4. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma5. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadaamostraa540nm(tempo0)6. Incubara37ºC7. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.8. Expressarosresultadosemgráfico.


TesteàSaliva(restantesgruposdaturma)1. Recolhercercade2.5mLdesalivaemplacadepetriesterilizada2. Preparardiluiçõesdecimaisdesaliva,emmicrotubos:Tubo S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6Saliva(µL) 1000 Amostraanterior(µL) - 100 100 100 100 100 -Sorofisiológico(µL) - 900 900 900 900 900 900Diluição 3. Rejeitar100µLdadiluiçãodotuboS54. Adicionaracadatubo2mLdesuspensãobacteriana5. Homogeneizarcompipeta,evitandoespuma6. Avaliarmortebacterianaporcultura:

a. Tomarparaeppendorfsnovos100µLdostubospar(S0;S2;S4;S6);b. Incubara37ºCdurante30minutosc. Inocularporespalhamentoemplacadeagarnutritivo;d. Incubara37ºCdurante,pelomenosumanoite;e. Contarcolónias

7. Avaliaramortebacterianapordensitometria:a. Lereregistarosvaloresdaabsorvênciadecadadiluição(S0;S1;S2;S3;S4;S5;S6)a

540nm(tempo0)b. Incubara37ºCc. Repetirleituradoespectrofotómetroacada10minutos.

8. Expressarresultadosemgráfico.9. Avaliaraconcentraçãorelativadebactericidinasnasalivaporcomparaçãocomocontrolopositivo

delisozima


Registoderesultados

TESTEÀIMUNIDADENATURAL

LISOZIMA Absorvência

Tempo(min)

L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10

0

10

20

30

40

SALIVA Absorvência

Tempo(min)

S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6

0

10

20

30

40

Crescimentobacteriano(nºcolónias)

S0 S2 S4 S6

Observações


4. IMUNIZAÇÃOARTIFICIAL

Materialereagentes

¾ Galinhas¾ Excipienteoleoso(AdjuvantedeFreund,Parafinalíquida)¾ Soluçãodeantigénio(BSAa10mg/mLemSF)¾ Seringaseagulhashipodérmicas


Preparaçãodaemulsãoparaimunização

1. Adicionar5mLdesoluçãodeantigénioemtubodeensaio2. Adicionar5mLdeadjuvanteoleoso3. Misturarvigorosamente,comauxíliodeumaseringacomagulha4. Verificaroestadodaemulsãocomumagotasobreasuperfíciedeáguafria

(nãodevemisturar-sedeimediato)

Imunização

Dia1 Recolheramostradesangueparateste

Injetar1mLdeemulsãoporviasubcutâneaemdiversospontos(4a6picadas)



Repetirainjeçãodamesmaquantidadedeantigénioemulsionadoemadjuvanteincompleto

Dia45 Recolhersangueparaanálise

Dia60 Recolhersangueparaanálise

Registartodososdadosdeidentificaçãodosanimais,volumesdesangueesoro,datasdasoperaçõeseoutrasocorrências

Observações


5. RECOLHADESANGUE

PreparaçãodoSoro

Materialereagentes.

¾ Animaisimunizadose/ounãoimunizados(galinhas)¾ Seringasestéreis¾ Centrífuga¾ Microtubos¾ Azidadesódioa10%


1. Picaraveiajugularouaveiadaasaetomaramostradesangueporaspiração(máximo2mL)2. Compensaroanimalcomsorofisiológicoestéril,senecessário3. Marcarotuboehomogeneizarosanguerecolhido.4. Aguardarde20a30minutosatemperaturaambiente5. Arrefecernofrigoríficodurante1hora6. Centrifugar4000rpmdurante10min7. Pipetaraté1mLdesoroporcadamicrotubodevidamenteidentificado8. Adicionarazidadesódioa0,02%final(sock100X)9. Conservarcongeladoa-20ºC.

Observações


PreparaçãodeEritrócitos

MaterialeReagentes

¾ Soluçãoanticoagulante(ACD):o Acidocítrico–4.0g/Lo Citratodesódio–22,6g/Lo D-Glucose–22.0g/L)o Autoclavar

¾ PBS-A¾ Seringas(2,5mL)eagulhaspararecolhadesangue¾ Centrífugadebaixarotação


1. Pipetar300µLdesoluçãoACDparatubosEppendorf(2porgalinha)2. Tomarosanguevenosodaveiajugularoudaasadagalinha(até2,0mLporave)3. Removeragulhadaseringa4. AdicionarimediatamenteacadatuboACDcercade0,9mLdesangue5. Homogeneizarsuavementeporrotação6. Transferirosangueparatubodecentrífugacontendo10mLdePBS-A(pipetaPasteur)7. Centrifugar500gX10minutos8. Removerosobrenadante9. Lavarmaisduasvezesascélulascom10mLdePBS-A,homogeneizandosuavemente10. Ressuspenderosedimentodecélulascom5mLdePBS-A11. Avaliarhematócrito(10%v/v)12. Conservara4ºC

Observações


6. OBSERVAÇÃODECÉLULASSANGUÍNEAS(HUMANAS)

ColoraçãodeWright

Materialereagentes

¾ Sanguetotalcapilar,fresco¾ SoluçãodeWright(corante)¾ Soluçãotampão(6.63gKH2PO4;2.56gNa2HPO4;H2Oad.1L)¾ Lâminasdemicroscópionovas(lavadasedesengorduradas)

Procedimentoexperimental(individual)

(Trabalhoindividualaefetuarcomoprópriosangue)1. ColocarIgotadesanguefrescoa1/3daextremidadedalâmina2. Espalharuniformementeaamostracomauxíliodeoutralâmina(veresquema)3. Deixarsecaraoar4. CobriroesfregaçocomsoluçãocorantedeWright5. Deixaratuardurante2minutos6. Adicionarigualvolumedesoluçãotampão7. Homogeneizarmovimentandoocorantecomjactodeardepipeta8. Deixaratuardurante3a4minutos

(asmargensdeverãoapresentarumacoravermelhadaeocentroumbrilhometálicoesverdeado)9. Removerocoranteporlavagememáguacorrente.Lavaralâminacomáguadestilada10. Deixarsecaraoar.Observaraomicroscópio.Registarobservações,desenhandoeidentificandoos

diferentestiposdecélulas

Observações


7. PURIFICAÇÃODEIMUNOGLOBULINAS–PRECIPITAÇÃODIFERENCIAL

MaterialeReagentes

¾ Soroapurificar¾ SoluçãosaturadadeSulfatodeamónioemágua¾ PBS-A(pH7,2)

o 0,8%NaClo 0,02%KH2PO4o 0,144%Na2HPO4.2.H2O

¾ Microtubos¾ Mangadediálise

Procedimentoexperimental(porgrupo)

1. Pipetar500µLdesoroapurificarparamicrotubo2. Adicionar400µLdesulfatodeamóniosaturado(40-45%)3. Misturareconservarnogelodurante30minutos4. Centrifugar5minnaeppendorf5. Pipetarerejeitarosobrenadante6. Escorrerbemotubo7. Dissolverosedimentocom250µLdePBS8. DialisarcontraPBS-Acontendo0,02%deazidadesódio,pelomenosduranteumanoite9. Recuperaroconteúdodamangadediálise10. Congelara-20ºC.

Observações


8. IMUNOPRECIPITAÇÃO-QUALITATIVA

Testedoanel

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Glicerola10%¾ Microtubosdeensaioemvidro¾ Micropipetas


1. Equilibrartodasassoluçõesetubosa37ºC2. Pipetar200µLdesoroatestare/ouimunoglobulinasparaofundodotubo3. Adicionar20µLdeglicerol,homogeneizandocomapipeta4. Pipetar200µLdesoluçãodeantigénioparaasuperfíciedosoro,cuidadosamenteesemmisturar

asfases5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeumprecipitadoemanelnazonadainterfaceentreasduassoluções

Observações


Testeemlâmina

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Imunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio¾ Lâminasdemicroscópio¾ Micropipetas


1. Equilibrartodasassoluçõeselâminasa37ºC2. PipetarIgotadesoluçãodeantigénionocentrodeumalâmina3. PipetarIgotadesoroatestarsobreagotaprecedente4. Repetircomasimunoglobulinaspurificadas5. Incubara37ºCdurante30minutosa1hora6. Observaraformaçãodeprecipitado7. Registarobservação

Observações


9. IMUNOPRECIPITAÇÃO–QUANTITATIVA

Curvadeprecipitação

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénio(1mg/mL)¾ PBS-A¾ Microtubos¾ Micropipetas


1. Preparardiluiçõesdosoro:10-0,3X10-1,10-1,3X10-2,10-2,3X10-3,PBS2. Pipetar200µLdecadadiluiçãodossorosatestarparacadatubo3. Adicionaracadatubo200µLdesoluçãodeantigénio4. Misturarnovortex5. Incubaremestufaa37ºCduranteumahora6. Centrifugar2minutos7. Observareregistarosníveisdeprecipitadovisívelemcadatubo8. Decantarosobrenadante.9. Escorreresecarosedimento10. Pesarossedimentosapesoconstante11. Quantificarotítulodosoropeladeterminaçãodopontodeequivalênciadorelativamenteao

antigénio

Observações


Nefelometria

MaterialeReagentes

¾ SoroatestarouImunoglobulinaspurificadas¾ Soluçãodeantigénio(BSA)1mg/ml¾ PBS-A¾ Microtuboseppendorf¾ Micropipetas


1. Marcar5tuboseppendorfde1a52. Pipetar200µLdesoroatestarparatubo13. Pipetar100µLdesoroatestarparatubo24. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar5. Transferir100µLdasoluçãodotubo2paraotubo36. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar7. Transferir100µLdasoluçãodotubo3paraotubo48. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar9. Transferir100µLdasoluçãodotubo4paraotubo510. Adicionar200µLdePBS-A.Homogeneizar11. Removererejeitar100µLdasoluçãodotubo512. Adicionar200µLdePBS-Aaotubo613. Adicionaracadatubo800µLdesoluçãodeantigénio14. Homogeneizar.15. Incubara37ºCpor30minutos16. LeraDOdetodosostubos17. Registarosdados.18. Avaliaropontodeequilíbrioecalcularotítulorelativodossoro

Observações


10. IMUNODIFUSÃO

Imunodifusãosimples

MaterialeReagentes

¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas

¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%

¾ SoluçãocorantedeCoomasie(0.25%deazuldeCoomasieemsoluçãodescorante)

¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)

¾ Lâminasdemicroscópio


1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseparaerlenmeyerb. Adicionar9mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Adicionar1mLdesoluçãodeantigénio.Homogeneizar.e. Aplicarcuidadosamenteemcadalâminaumaquantidadequepermitaumaalturade

±2a3mm(5mLporlâminademicroscópio)f. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalg. CompipetaPasteurtruncadaperfuraraagarose(~1,5mmØ)em3locais

equidistantesecentrados.Removeroagarcortadoporaspiração2. Ensaio

a. Distribuirasamostrasdesorosouimunoglobulinasatestarpelosorifícios(~15µLporpoço)

b. Cobriralâminacomfilmeplásticotransparentec. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora

3. Observaraprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração(senecessário)

a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Observareregistarosresultados

Observações


Imunodifusãodupla(Ouchterlony)

MaterialeReagentes

¾ SorosatestarouImunoglobulinaspurificadas

¾ Soluçãodeantigénio10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV(ouII)¾ Azidadesódio10%


¾ Soluçãodescorante(ácidoacéticoglacial-10%,metanol-50%)



1. Preparaçãodogela. Pesar0.1gdeagarouagaroseb. Adicionar10mLdePBS.Fundiremfornodemicro-ondasc. Arrefeceracercade50ºC.Adicionar50µLdeazidaa10%d. Aplicarcuidadosamenteemcadalâmina5mLdegel(±5mmdealtura)e. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontalf. Perfuraraagarose,conformeàilustração(empontosequidistanteseseparadosde1

cmdoorifíciocentral).Aspiraroagarcortadocompipeta.2. Ensaio

a. Encheroorifíciocentralcomsoluçãodeantigéniob. Colocaremcadaumdosoutrosorifíciosvolumesiguaisdesoroatestare

imunoglobulinaspurificadas(nãodiluídoediluídoa1:10)c. Cobrirlâminacomfilmeplásticotransparented. Incubaremestufaa37ºC,emcâmarahúmida,durante,pelomenos,1hora

3. Observarlinhasdeprecipitação.Registaredesenharasobservações4. Coloração

a. CorarogelcomazuldeCoomasieb. Diferenciaremsoluçãodescorante.LavaremPBSc. Secaroagarcompapelabsorvente(compressãoprolongadacommúltiplascamadas

deabsorvente)5. Observareregistarosresultados

Observações


11. HEMAGLUTINAÇÃO

MaterialeReagentes

¾ Eritrócitosdegalinhalavados¾ Sorosatestar¾ Soluçãodeantigénio(10mg/mL)¾ PBS-A¾ Tubosdevidropequenosdefundoredondo


1. Ressuspendersuavementeoseritrócitoslavados;2. Tomar1mLdesuspensãohomogéneaparatudodecentrífuga;3. Centrifugar500GX10minutos;4. Removererejeitarosobrenadante;5. Ressuspenderascélulascom1mLdePBS-A6. Porcadasoroatestar,marcar4tubosedistribuir:

1 2 3 4

PBS-A(µL) 200 100 100 -Suspensãodeeritrócitoslavados(µL) 200 200 200 200Soluçãoantigénio(µL) - - 100 100Soroatestar - 100 - 100

Controlocélulas

Controlosoro

Controloantigénio TESTE

7. Agitarsuavementeostubosparamisturaroconteúdo8. Repousaratemperaturaambienteatéàsedimentaçãodascélulas(verificarsedimentação

completaemtubo1)9. Observareregistarosresultadosemtodosostubos

Observações


12. TESTEIMUNOCROMATOGRÁFICO(RÁPIDO)

MaterialeReagentes

¾ Amostraatestar¾ Dispositivoimunocromatográficodescartável


1. Tomarodispositivoedeixaraqueceràtemperaturaambiente2. AplicarIIIgotasdaamostraaestudarnorecetáculodaamostra3. Observaramigraçãodaamostrapelamatriz4. Observaraformaçãodeumaouduasbandascoradas5. Registaraobservação

Observações


13. IMUNOELETROFORESE

MaterialeReagentes

¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa

10mg/mL¾ AgarouAgarosetipoV

(ouII)¾ Azidadesódio10%¾ Barbitaldesódio

(Veronal)0,2M

¾ Tampãobarbital(2X):- Barbitaldesódio0,2

M-50mL- HCl0,2M-6,0mL- H2Odestiladaad100

mLpH8,6


¾ Soluçãodescoranteo Ác.acéticoglacial-10%o Metanol-50%



Preparaçãodogel

1. Pesar0.15gdeagarlavadoouagaroseparaerlenmeyer2. Adicionar5mLdeáguadestilada.Fundiremfornodemicro-ondas.Arrefeceracercade50ºC3. Adicionar5mLdeT.Barbital2X.Misturar.4. Posicionarperpendicularmenteàlâminaopenteparaformaçãodospoçosdeaplicação5. Aplicaremcadalâmina5mLdesoluçãodeagar1,5%6. Deixarsolidificarsobresuperfíciehorizontal.Removeropente

Eletroforese

1. Adicionaracadaamostradesoro20%deglicerol50%2. EncherosdepósitosdoselétrodoseospoçosdogelcomT.Barbital3. Aplicaraamostradesoroatestarsobotampãodebarbitalemcadapoço4. Colocaralâminanatinadeeletroforese.5. FazeraspontesentreoselétrodoseogelcompapeldefiltroembebidonoT.Barbital6. Cobriralâminacomlarfilm,sembolhasdear7. Aplicaracorrenteelétrica(8mAporlâmina)durante30minutos8. Removeralâminaecorar

Coloração

1. CorarogelcomazuldeCoomasie2. Diferenciaremsoluçãodescorante.3. LavaremPBS4. Observareregistarosresultados

Observações


14. ELISA(ENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY)

“Checkerboard"

Materialereagentes

¾ MicroplacasparaELISA(2X8poços)

¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL(BSA)

¾ Soroatestar¾ 2°.Anticorpo

Soroanti-galinhaconjugadocomperoxidase(diluídoemTampãodebloqueio1:5000)

¾ TampãodeFixaçãopH9,6-0,159%Na2CO3-0,293%NaHCO3-0,02%NaN3

¾ TampãodeBloqueio-5%LeiteempódesnatadoemPBS-A

¾ TampãodeLavagempH7,2-0,8%NaCl-0,02%KH2PO4-0,144%Na2HPO4.2.H2O-0,05%Tween20

¾ TampãodeSubstratopH5,0-1,118%Na2HPO4-0,56%Ácidocítrico

¾ SoluçãoOPD(extemp.)OPD(O-fenileno-diamina)-20mgH2O2-10μlTampãodesubstrato--60mL

¾ 4NH2SO4


1. Marcar8tuboseppendorf(1a8)2. Fazerdiluições:

Tubo(filas) 1 2 3 4 5 6 7 8Tampãodefixação(mL) 1 1 1 1 1 1 1 1Antigénio–BSA10mg/mL(mL) 0,5 - - - - - - -Soluçãoprecedente(mL) - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -

3. Usartodosospoços(de1a8)detrêsfilas(A...H)deumamicroplaca4. Distribuir100µLdecadadiluiçãoparaorespectivopoçodecadaumadastrêsfilasdamicroplaca

(exemplo:colunasA,B,C;poçosdasfilas1a8)5. Anotarasdiluiçõesdeantigéniodecadapoçoutilizado6. Incubar4ºCdurante,pelomenos,24horas,aoabrigodadissecação7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez8. Fazerasdiluiçõesdosoroausar:

Tubo(colunas) A B CTampãodebloqueio(μl) - 900 900Soroatestar(μl) 1000 100 -Soluçãoprecedente(μl) - - 100

9. Distribuir100µLdecadatuboparaospoçosrespectivosdastrêscolunasdamicroplaca10. Incubar37ºCdurante30minutos(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação11. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez12. Distribuir100µLdasoluçãodo2ºAnticorpoporcadapoçodamicroplacautilizado(Cadagrupo

utilizadiferentessoluçõesdiluídas-1:1000;1:2000;1:5000;1:7500;1:10000)13. Incubar37ºCdurante30minutos,aoabrigodadissecação14. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez


15. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço16. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,observandoatéaosurgimento

decornalgunsdospoços17. Adicionar50µLdeH2SO4emcadapoço18. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura

autónoma)19. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço20. DefinirasmelhoresconcentraçõesdeantigénioeanticorpoausarnotestedeELISAarealizarcom

ossorosdecadagrupo


Registoderesultados

Concentraçõesdeantigénio/soro(0a++++)

1 2 3 4 5 6 7 8

Soro 1

Coluna

1:10

1:100

1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0

Antigénio


1 2 3 4 5 6 7 8

Soro 1

Coluna

1:10

1:100

1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0

Antigénio


1 2 3 4 5 6 7 8

Soro 1

Coluna

1:10

1:100

1 1:3 1:9 1:27 1:81 1:243 1:729 0

Antigénio

Observações


Teste

Materialereagentes

(osmesmosqueparaCheckerboard)¾ Soroatestar¾ Soluçãodeantigénioa10mg/mL¾ Soroatestar¾ 2ºAnticorpo-GACIG-HRPO

Diluircadasoluçãodeacordocomosresultadosdaexperiênciaanterior


1. Diluiroantigéniodeacordocomaavaliaçãoefetuadano“checkerboard”.2. Distribuir100µLdesoluçãodeantigénioporpoçodemicroplaca3. Incubar4ºCdurante,pelomenos24horas,aoabrigodadissecação4. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez5. Distribuir200µLdeTampãodeBloqueioporpoço.6. Incubardurante30minutosa37ºC7. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez8. Preparardiluiçõessequenciaisde3em3decadasoroatestar:Amostra(poço) 1(B) 2(C) 3(D) 4(E) 5(F) 6(G) 7(H)T.Bloqueio 120 120 120 120 120 120 120Soroatestar - 60 Diluiçãoanterior - - 60 60 60 60 609. NospoçosdafilaAaplicar100µLdeTampãodebloqueio10. NospoçosdafilasBaHaplicar100µLdasdiluiçõesdosoroatestar(conformetabela)11. Fazerréplicas(repetirpassos8a10emcolunasdiferentes)12. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação13. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez14. Distribuir100µLdasoluçãodiluídado2°.Anticorpoporcadapoçodamicroplaca15. Incubar37ºCdurante1hora(oua4ºCduranteumanoite),aoabrigodadissecação16. Lavartrêsvezescadapoçodamicroplacacom200µLdeTampãodeLavagem,repousando

durante3mindecadavez17. Adicionar200µLdesoluçãoOPDacadapoço18. Incubar37ºCdurante15min,aoabrigodadissecaçãoenoescuro,atéaoaparecimentodecor

nalgunspoços19. Adicionar50µLdeH2SO4porpoço20. Observareregistarasintensidadesdecorrelativas(cadaelementodogrupofazumaleitura

autónoma)21. Estabeleceramédiadasleiturasefetuadasparacadapoço22. Avaliartítuloaproximadodosoro(últimadiluiçãopositivadiferentedocontrolonegativo)


Registoderesultados

Resultadosobservados(de++++a0)–OPERADOR1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Observações



1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

MÉDIADOSRESULTADOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

B

C

D

E

F

G

H

Amostra:_________________________

Títulosdossoros.

Pré-imune

15dias

30dias

45dias

60dias


RepresentaçãoesquemáticadeumaELISA

CarlosSinogas

Documents

IMUNOLOGIA · IMUNOLOGIA 2018/19 4 Adicionalmente há que considerar que o trabalho prático decorrerá no laboratório de Microbiologia, onde microrganismos de diferentes tipos são