IMUNOVIR Ms. Romeu Moreira dos Santos - Unesp · LOGO RADIOIMUNOENSAIOS TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS • São ensaios que utilizam como marcadores radioisótopos • (Trício H3,

2015

Ms. Romeu Moreira dos Santos

2016

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LOGOINTRODUÇÃO

TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS

• As respostas imunes são úteis de dois modos para diagnosticar umadoença:

• Inicialmente Acs específicos podem ser utilizados para detectar ouidentificar um Ag de interesse.

• Ou por meio de detecção de Acs específicos no soro, é possível determinarse um animal foi previamente exposto a um agente infeccioso.

• A mensuração das interações Ag x Ac com o propósito de diagnóstico édenominada sorologia.


LOGOINTRODUÇÃO


• As técnicas sorológicas podem ser classificadas em três grandescategorias:

• Testes de ligação primária

• Mensura diretamente a ligação do Ag x Ac

• Testes de ligação secundária

• Mensura os resultados da interação Ag x Ac in vitro.

• Testes terciários

• Compreende os testes in vivo, que mensuram o real efeito protetor dos Acs em umanimal.


LOGOREAGENTES UTILIZADOS EM TESES SOROLÓGICOS


• Soro

• Antiglobulinas

• Anticorpos monoclonais

• Anticorpos específicos


LOGOTESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA


• Teste que detectam diretamente o Ag ou Ac de interesse.

• Permitem o reconhecimento do Ag pelo Ac e os complexos imunesformados são, então, mensurados.

• Para mensuração desta reação, um dos reagentes deve estarquimicamente marcado


LOGOTESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA


• Radioimunoensaios

• Ensaios de imunofluorescência

• Ensaios imunoenzimáticos

• Dispositivos descartáveis para imunoensaios

• Citometria de fluxo


LOGOHISTÓRICO


• Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos - 1954: Teste deImunofluorescência (Weller & Coons); 1959: Radioimunoensaio(Yallow & Berson).

• Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Avrameas &Uriel; Nakane & Pierce, 1966).

• Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticorposmonoclonais (Kohler & Milstein, 1975) - desenvolvimento de novostestes (kits comerciais).

• Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes,quimioluminescentes, etc.


LOGORADIOIMUNOENSAIOS


• São ensaios que utilizam como marcadores radioisótopos

• (Trício H3, carbono 14 ou iodo 125)

• Possuem vantagem de serem altamente sensíveis

• Desvantagens: alto custo, manipulação do isótopo

• Aplicabilidade: quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais,alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos.

• Radioimunoensaios para anticorpos

• Radioimunoensaios para antígenos


LOGORADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTICORPOS


• Teste radioalergossorbente (RAST) – mensura IgE no soro de animais alérgicos.

Discos de celulose+ antígeno

Soro teste

Lavagem

Discos de celulose+ antígeno +anticorpos

Sol.Antiglobulina

marcadaAnti-IgE

Anti-IgE se ligaa IgE + Ag

Presença deradioatividade


LOGORADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS


• Imunoensaios de competição são baseados no princípio de que o Ag nãomarcado irá deslocar o Ag radiomarcado dos imunocomplexos.

Ac específicos

Radioatividade nosobrenadante

Precipitadoproteico

• Quantidade de reagente marcado (Ag ouAc) quantifica o Ag ou Ac não-marcado naamostra - competição


LOGORADIOIMUNOENSAIOS PARA ANTÍGENOS



LOGOENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)


Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) auma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV,emite luz no espectro visível.

A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação em ummicroscópio com luz UV (microscópio de fluorescência)

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína –FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos:direta, indireta ou sanduíche.




Teste direto - pesquisa de antígenos (células ou tecidos)

Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos

Referência para sorodiagnóstico de várias doenças.

• Vírus, bactérias e protozoários




Teste direto - pesquisa de antígenos

• Ex. – Raiva, Vírus da leucemia felina (FELV)


LOGO





Teste indireto - pesquisa de anticorpos e eventualmente de antígenos




Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;determinação de classes e subclasses de anticorpos

Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescênciasob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.

Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor

Fluoresceína 495 525 Verde

Rodamina 552 570 Vermelho

Vermelho Texas 596 620 Vermelho

Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja




Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução;determinação de classes e subclasses de anticorpos

Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescênciasob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação.

Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Cor

Fluoresceína 495 525 Verde

Rodamina 552 570 Vermelho

Vermelho Texas 596 620 Vermelho

Ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja


LOGOENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS


Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima (ELISA) Um dos mais importantes imunoensaios empregados na medicina veterinária Utillizado para detectar e mensurar tanto Acs como Ags.


LOGOENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS - ETAPAS


–Revista a superfície das cavidades de uma microplaca apropiada com Ags do agenteinfeccioso que você está interessado em detectar Acs específicos.

–Adicione as amostras de soro de indivíduos a serem testados, se houver anticorposna amostra, eles vão se ligar aos Ags adsorvidos à superfície plástica

–Lave as cavidades da microplaca a fim de remover todos os anticorpos que nãoforem específicos para o Ag em questão

–Adicione um outro tipo de Ac anti-Ig da espécie que você está pesquisando se asamostras de soro têm ou não que deve ter sido previamente marcado com umaenzima

–Adicione o substrato específico para a enzima e deixe a reação de degradaçãoenzimática prosseguir e conferir cor às cavidades da microplaca

–A intensidade da cor (DO) deve ser mensurada em leitor-fotômetro, sendo que asleituras são proporcionais aos níveis dos Acs presentes nas amostras originais desoro contra o Ag em questão.




Método direto – Ags

Método indireto – Acs

Sandwich e Competitivo – Ags e Acs


LOGOELISA INDIRETOELISA INDIRETO

LavagensLavagens

Antígeno

Fonte de proteínasestranhas ao sistema

LavagensLavagensLavagensLavagens

Soro anti

Conjugado anti

LavagensLavagens





•Sandwich-ELISA (S-ELISA) / Duplo Ac-ELISA–As amostras são adicionadas às cavidades de uma microplaca previamenterevestidas com Acs de captura específicos para Ag que se deseja detector

–As cavidades da microplaca são lavadas p/ remover o excesso de substânciasou Ags que não se ligaram especificamente aos Acs de captura

–Uma preparação de Ac secundário conjugado com uma enzima apropriada éadicionada

–O substrato enzimático é então adicionada e haverá, no caso de presença de Agna amostra uma mudança de cor, que pode ser mensurada em leitor-fotômetroapropriado. A intensidade de DO é proporcional à quantidade de Ag presente naamostra.


LOGOELISA DIRETO COM ANTICORPO DECAPTURAELISA DIRETO COM ANTICORPO DECAPTURA

LavagensLavagens

Antígeno

Fonte de proteínasestranhas ao sistema

LavagensLavagensLavagensLavagensLavagensLavagens

Conjugadoanti

Soro anti



LOGOELISA



LOGOELISA



LOGOIMMUNOBLOTTING (Western blotting)

Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel depoliacrilamida para membranas ELISA

Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas +especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Ags

Suportes: membrans de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon,polyvinyldifluoide (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas

Quantificação de bandas por densitometria.












LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA

Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais.

Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolorem produto colorido (deposição pode ser observada diretamente aomicroscópio óptico).

Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidasee Glicose Oxidase.

Método direto Acs primários conjugados (antígenos). Método indireto Acs secundários conjugados (antígenos ou anticorpos).

Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamentoinadequado dos conjugados.



LOGOIMUNOHISTOQUÍMICA



LOGOImunocromatografia


• O sistema é realizado em uma matriz constituída de membrana denitrocelulose ou de náilon coberta por acetato transparente para facilitar avisualização do teste. O antígeno ou o anticorpo é fixado na membrana naforma de linhas ou pontos e o restante da membrana é bloqueado comproteína inerte como nos testes imunoenzimáticos (ELISA).











LOGOCitometria de Fluxo


• Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz efluorescência sob feixe de laser

• Estudo de populações de leucócitos - luz dispersa - tamanho e forma da célula

• Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B

• FACS (fluorescence-activated cell sorter) - separação de uma única célula








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REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE

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