Início - UNIFAP - ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO ......Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca Central da Universidade Federal do Amapá 615.32 L732e

Universidade Federal do Amapá - UNIFAP

Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação

Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical - PPGBIO

Mestrado e Doutorado

UNIFAP / EMBRAPA-AP / IEPA / CI-BRASIL

CLARISSA SILVA LIMA

ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO EM RATOS SUBMETIDOS

AO TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE Copaifera duckei Dwyer

(SUBCRÔNICO E REPRODUTIVO)

Macapá - AP

2014

CLARISSA SILVA LIMA

ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLÍNICO EM RATOS SUBMETIDOS



Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Biodiversidade Tropical, como parte dos

requisitos para obtenção do título de Doutor em

Biodiversidade Tropical.

Área de concentração: Uso sustentável da

biodiversidade

Orientador: Prof. Tit. José Carlos Tavares

Carvalho.

Macapá - AP

2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Biblioteca Central da Universidade Federal do Amapá

615.32

L732e Lima, Clarissa Silva

Estudo da toxidade não clínico em ratos submetidos ao tratamento

com óleoresina de Copaifera duckei Dwyer (subcrônico e reprodutivo) /

Clarissa Silva Lima; orientador, José Carlos Tavares Carvalho. -- Macapá,

2014.

265 f.

Tese (doutorado) – Fundação Universidade Federal do Amapá,

Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Tropical, 2014.

1. Copaíba. 2. Óleoresina de copaíba. 3. Creme vaginal. 4. Toxidade

subcrônica e reprodutiva. I. Carvalho, José Carlos Tavares, (orient). II.

Fundação Universidade Federal do Amapá. III. Título.

CLARISSA SILVA LIMA

ESTUDO DA TOXIDADE NÃO CLINICO EM RATOS SUBMETIDOS



Aprovada em: 30/05/2014

Banca Examinadora:

_________________________________________________

Prof. Dr. Ricardo Bezerra de Oliveira (UFOPA)

________________________________________________

Profa. Dra. Dayse de Sousa Dantas (UNIFAP)

__________________________________________________

Prof. Dr. Caio Pinho Fernandes (UNIFAP)

__________________________________________________

Prof. Dr. Madson Ralide Fonseca Gomes (UNIFAP)

Orientador:

__________________________________________________

Prof. Tit. José Carlos Tavares Carvalho (UNIFAP)

Dedico este trabalho a minha filha Luana Beatriz,

que precisou suportar minhas ausências no Lar.

AGRADECIMENTOS

À Deus.

A Universidade Federal do Amapá, através do Programa de Pós Graduação em

Biodiversidade Tropical.

Ao Prof. Tit. José Carlos Tavares Carvalho, meu orientador, por confiar no meu

potencial para realização deste trabalho e, principalmente, pela compreensão e apoio na etapa

final deste trabalho.

Aos meus ex e atuais alunos de iniciação científica (Monique Kawakami, Uriel Davi,

Clarice Flexa, Charles Barros, Jimaine Nascimento, Ícaro Sarquis e Ruan Felipe) e os demais

IC´s que ajudaram no projeto, se dedicando dia a dia com as atividades desenvolvidas no

Laboratório de Pesquisa em Fármacos. Obrigada, sem vocês este trabalho não teria sido

realizado.

Ao CNPq pela bolsa de doutorado concedida.

Ao Governo do Estado do Amapá, por meio da Fundação de Amparo a Pesquisa

(FAPEAP), pelo apoio financeiro através do auxílio tese.

Ao Dr. Didier Stien pelo estágio de doutoramento concedido no Centre National de la

Recherche Scientifique – Gif-Sur Yvette (Fr.).

Ao Laboratório farmacêutico Almeida Prado Ltda, pela parceria na produção e obtenção

dos cremes vaginais.

A Professora Dra. Tânia Toledo (Laboratório de Biofármacos, Viçosa/MG) pela

parceria na realização do teste subcrônico.

A Dra. Nelma Rocha, pela leitura das lâminas da análise histopatológica.

Ao Prof. Dr. Alexander Florentino, pela ajuda na análise estatística dos dados.

A amiga Profa. Msc. Mayara Tânia pelo incentivo, apoio e ajuda nas micrografias da

análise histopatológica.

Ao aluno Anderson Pena, pela ajuda na elaboração dos abstracts.

As profas. Beatriz Sá, Ms. Caroline Miranda e Dra. Elizabeth Vianna, pelo apoio e

incentivo, principalmente nos momentos mais difíceis.

Ao Breno William pelo apoio nesta jornada da pós-graduação desde longa data.

Aos colaboradores, principalmente equipe do Laboratório de Pesquisa em Fármacos, e

amigos que de alguma forma contribuíram para a execução deste trabalho, meu muito

obrigada.

“Todas as vitórias ocultam uma abdicação”.

(Simone de Beauvoir)

RESUMO

As infecções do trato genital feminino têm sido a causa mais frequente de consulta

ginecológica e em contrapartida, nas últimas décadas têm-se observado a revalorização do

emprego das preparações fitoterápicas. No entanto, muitos dos produtos derivados de plantas

utilizados no Brasil não possuem estudos não clínicos de toxidade reprodutiva. O óleo de

copaíba é um importante produto que vem sendo utilizada na medicina tradicional, desde o

tempo da colonização. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar a toxidade não

clínica em ratos submetidos ao tratamento com óleoresina Copaifera duckei Dwyer (ORCD) e

creme vaginal contendo este óleoresina (CVORCD), em níveis subcrônico e reprodutivo. Para

a caracterização fitoquímica do ORCD, utilizou-se cromatografia gasosa acoplada à

espectrometria de massas (CG-EM). Para avaliar os efeitos tóxicos em fase de tratamento

subcrônico do ORCD do CVORCD foram utilizados ratos (Rattus norvegicus), linhagem

wistar (machos e fêmeas) que foram tratados por via oral (v.o) e intravaginal (i.v). Os grupos

receberam por 22 dias a dose de 320 mg/kg, 40 mg/kg e 28 mg/kg, respectivamente, com

ORCD (v.o - ORCD), ORCD (i.v - ORCDV) e creme vaginal com ORCD (i.v - CVORCD).

Os grupos controles foram receberam com 0,5 mL de água destilada (v.o) e 220 mg do creme

vaginal base (i.v). Para avaliar a toxidade reprodutiva, utilizou-se ratas prenhas submetidas ao

tratamento com ORCD nos períodos de pré-implantação e pós-implantação do blastocisto no

útero (análise da teratogenicidade), desenvolvimento fetal e lactação. O ORCD foi

administrado por via oral (v.o), nas doses que correspondem a 10% da DL50 (3758,16 mg/kg)

e 50% da DL50. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos: Grupo

controle G1 (0,5 mL de água destilada), Tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e Tratado G3

(1874 mg/kg de ORCD). O estudo da toxidade reprodutiva compreendeu quatro ensaios:

Experimentos (E1, E2, E3 e E4), de acordo com os segmentos I, II e III dos estudos de

toxicologia reprodutiva. Para tanto, 80 animais foram utilizados, sendo 60 fêmeas (n=5/grupo

experimental) e 20 machos reprodutores. Na caraterização fitoquímica, o ORCD apresentou

teor de cariofileno em torno de 500 ng/mL (0,5%), representando uma faixa adequada para

quantificação pelos métodos propostos. O tratamento subcrônico com ORCDV e o CVORCD

não provocou sinais clínicos de toxicidade, nenhuma morte foi registrada e não alterou o

desenvolvimento ponderal dos animais. As fêmeas tratadas com ORCD apresentaram maior

ingestão de água, mas o consumo de ração não foi diferente em machos e em fêmeas. O uso

do CVORCD não alterou a ingestão de água das fêmeas, mas alterou o consumo de ração. O

ORCDV foi capaz de provocar efeito hipoglicemiante e elevação dos níveis séricos de

creatinina. Os parâmetros hematológicos dos animais (machos e fêmeas) não foram alterados

pelo uso oral do ORCD (320 mg/kg). O uso do CVORCD alterou o hematócrito, os linfócitos

e a concentração de hemoglobina. O uso do CVORCD e ORCDV, não alteraram os

parâmetros bioquímicos das ratas. Com relação à toxidade reprodutiva, no E1, o ORCD

administrado no período de pré-implantação não provocou sinais clínicos de toxidade no

grupo E1G2. Contudo, no grupo E1G3 foram observados alguns sinais clínicos de toxidade

aguda (diarréia, piloereção, estresse, agitação, tremores, hemorragia nasal e vaginal). Além

disso, houve registro de um óbito, no d5 de prenhez (6º dia de tratamento). O ORCD (366,89

mg/kg e 1874 mg/kg), demonstrou não alterar o processo de sincronização, com êxito nas

implantações do blastocisto no útero. Quanto as perdas pós-implantação, estas foram

avaliadas mesmo não compreendendo o período de tratamento com ORCD. No E2, o

tratamento com ORCD no período pós-implantação (d6-d15) evidenciou toxidade aguda

causando diarréia e agitação após o tratamento, tanto no grupo E2G2 como no grupo E2G3.

Porém outros sinais clínicos de toxidade ocorreram apenas com o tratamento com a maior

dose (1874 mg/kg), tal como estresse, piloereção, sialorréia, apatia, desidratação, hemorragia

nasal e vaginal, caracterizando aborto espontâneo. Na análise da teratogenicidade, o ORCD

nas doses administradas não causou nenhum tipo de alteração ou malformação, tanto

externamente como internamente (esquelética e visceral). No E3, período de desenvolvimento

fetal, o ORCD, provocou sinais clínicos de toxidade aguda (agitação, sangramento e estresse)

em 2 animais no E3G2. Com o aumento da dose, de 366,89 mg/kg para 1874 mg/kg, além

desses sinais, diarréia e piloereção também foram relatados nas progenitoras do E3G. Após o

tratamento com ORCD 1874 mg/kg, todas as ratas vieram a óbito. O ORCD 366,89 mg/kg

apresentou efeito sobre o índice de viabilidade, índice de desmame e razão sexual, com

diferença estatística (p<0,05). O ORCD 366,89 mg/kg não alterou o trabalho de parto, mas o

E3G2 obteve maior tempo de prenhez (23.0 ± 0.31) e tamanho da ninhada (8.80 ± 0.66). No

E4, as lactantes tratadas com o ORCD apresentaram agitação e estresse após o tratamento,

sendo ainda relatado piloereção em uma lactante do grupo E4G2 que recebeu a menor dose

(366,89 mg/kg) e sangramento nasal e uma das ratas do E4G3. Esses sinais clínicos foram

detectados nos experimentos, E1 (pré-implantação), E2 (pós-implantação) e E3

(desenvolvimento fetal). O ORCD nas doses utilizadas (1874 e 366,89 mg/kg) não causou

aumento do tempo de prenhez, nem mesmo diminuição do índice de nascimento, de

viabilidade e tamanho da ninhada. Todavia o índice de desmame e a razão sexual diferiram

(p<0,05) do grupo controle E4G1. No exame histopatológico, todos os animais tanto do grupo

controle (E4G1) como dos tratados (E4G2 e E4G3) apresentaram integridade tecidual dos rins

analisados, e os achados na avaliação histopatológica hepática não diferiram dos do grupo

controle. Assim, ORCD e o CVORCD demonstrou segurança de uso na maior parte dos

ensaios realizados, toxidade subcrônica e reprodutiva. Além disso, as doses testadas

correspondem a supradoses das possíveis a serem usadas na terapêutica.

Palavras-chave: óleoresina de copaíba, creme vaginal, toxidade subcrônica e reprodutiva

ABSTRACT

The infections of the female genital tract have been the most frequent cause of gynecological

consultation, and in compensation, in the last decades it has been observed the use of the

phytotherapeutic preparations. However, many of the derived products of plants used in

Brazil do not present non-clinical studies of reproductive toxicity. Copaiba oil is an important

product that has been used in the traditional medicine, since the colonization period. This

way, this study had as objective to evaluate the non-clinic toxicity in mice submitted to the

treatment with C. duckei oleoresin Dwyer (ORCD) and vaginal cream containing this

oleoresin (CVORCD), in subchronic and reproductive levels. For the phytochemical

characterization of ORCD, gas chromatography coupled with mass spectrometry was used

(CG-MS). Rats were used in order to evaluate the poisonous effects in phase of subchronic

treatment of ORCD of CVORCD (Rattus norvegicus), Wistar lineage (males and females)

that were treated orally (v.o) and intravaginal (i.v). The groups received for 22 days the dose

of 320 mg/kg, 40 mg/kg and 28 mg/kg, respectively, with ORCD (v.o - ORCD), ORCD (i.v -

ORCDV) and vaginal cream with ORCD (i.v - CVORCD). The control groups received 0,5

mL of distilled water (v.o) and 220 mg of vaginal cream base (i.v). To evaluate the

reproductive toxicity, pregnant female rats were used, in order to submit the treatment with

ORCD in the pre-implantation periods and post-implantation of the blastocyst in the uterus

(analysis of the teratogenicity), fetal development and lactation. ORCD was administered

orally (v.o), in the doses that correspond to 10% of DL50 (3758,16 mg/kg) and 50% of DL50.

This way, the groups were submitted to the following treatments: Control groups G1 (0,5 mL

of distilled water), Treated G2 (366,89 mg/kg of ORCD) and Treated G3 (1874 mg/kg of

ORCD). The study of the reproductive toxicity developed four samples: Experiments (E1, E2,

E3 and E4), according to the segments I, II and III of the studies of reproductive toxicology.

80 animals were used, 60 female (experimental n=5/grup) and 20 reproductive males. In the

phytochemical characterization, ORCD presented caryophyllene content of 0.5 µg/mL

(0,5%), representing an appropriate rate for quantification, through the proposed methods.

The subchronic treatment with ORCDV and CVORCD did not cause clinical signs of toxicity,

no death was recorded and it did not change the weight development of the animals. The

female rats treated with ORCD showed a higher ingestion of water, but the ration

consumption was not different in males and in females. The use of CVORCD did not change

the ingestion of water of the females, but it changed the ration consumption. ORCDV was

capable to cause hypoglycemic effect and rose the levels of serum creatinine. The

hematological parameters of the animals (males and females) were not changed by the oral

use of ORCD (320 mg/kg). The use of CVORCD changed the hematocrit, the lymphocytes

and the hemoglobin concentration. The use of CVORCD and ORCDV, did not change the

biochemical parameters of the female rats. Regarding to the reproductive toxicity, in E1,

ORCD administered in the pre-implantation period did not cause clinical signs of toxicity in

the group E1G2. However, in the group E1G3 some clinical signs of acute toxicity were

observed (diarrhea, piloerection, stress, agitation, tremors, and nasal and vaginal hemorrhage).

Furthermore, there was one death, in the pregnancy d5 (6th day of treatment). ORCD (366,89

mg/kg and 1874 mg/kg), showed not to change the synchronization process, with success in

the implantation of the blastocyst in the uterus. About the loss post-implantation, they were

evaluated even because they were not used during the treatment period with ORCD. In E2,

the treatment with ORCD in the period post-implantation (d6-d15) it evidenced an acute

toxicity causing diarrhea and agitation after the treatment, both in the group E2G2 and in the

group E2G3. However other clinical signs of toxicity just happened with the treatment with

the highest dose (1874 mg/kg), such as stress, piloerection, sialorrhea, apathy, dehydration,

nasal and vaginal hemorrhage, and characterizing spontaneous abortion. In the analysis of the

teratogenicity, ORCD in the administered doses did not cause any change, such as

malformation, both externally and internally (skeletal and visceral). In E3, period of fetal

development, ORCD, caused clinical signs of acute toxicity (agitation, bleeding and stress) in

2 animals in E3G2. Because of the increase of the dose, of 366,89 mg/kg for 1874 mg/kg,

beyond of those signs, diarrhea and piloerection they were also recorded in the progenitors of

E3G. After the treatment with ORCD 1874 mg/kg, all the female rats died. ORCD 366,89

mg/kg showed effect over the viability rate, weaning rate and sexual reason, with statistical

difference (p <0,05). ORCD 366,89 mg/kg did not change the labor, but E3G2 showed a

higher period of pregnancy (23.0 ± 0.31) and size of the brood (8.80 ± 0.66). In E4, the lactic

ones treated with ORCD presented agitation and stress after the treatment, and was recorded

piloerection in a lactic one of the group E4G2, that received to smallest doses (366,89 mg/kg)

and nasal bleeding in one of the female rats of E4G3. Those clinical signs were observed in

the experiments, E1 (pre-implantation), E2 (post-implantation) and E3 (fetal development).

ORCD in the used doses (1874 and 366,89 mg/kg) they caused neither increase of time in the

pregnancy, nor decrease of the rate of birth, of viability and size of the brood. Although the

rate of weaning and the sexual reason were different (p <0,05) of the control group E4G1. In

the histopathology exam, all the animals, not only from the control groups (E4G1) but also

from the treated ones (E4G2 and E4G3) presented tissue integrity of the analyzed kidneys,

and the records in the hepatic histopathologic evaluation hepatic were not different from those

in control groups. Accordingly, ORCD and CVORCD showed safety use in most of the

accomplished samples, subchronic toxicity and reproductive. Besides, the tested doses

correspond to the supradose of the possible ones to be used in the therapeutics.

Keywords: copaiba oleoresin, vaginal cream, subchronic and reproductive toxicity.

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA

DE Copaifera duckei Dwyer E DO CREME VAGINAL CONTENDO O ÓLEORESINA

Tabela 1. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei

(ORCD 320 mg/kg) e água destilada (Controle) sobre os parâmetros

bioquímicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.

130

Tabela 2. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de

C. duckei (CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV

40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre os parâmetros

bioquímicos de ratas, linhagem Wistar.

130

Tabela 3. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei

(ORCD 320 mg/kg) e água destilada (Controle) sobre os parâmetros

hematológicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.

131

Tabela 4. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de

C. duckei (CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV

40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre os parâmetros

hematológicos de ratas, linhagem Wistar.

132

CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS

SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM ÓLEO RESINA DE C. duckei NOS

PERÍODOS DE PRÉ-IMPLANTAÇÃO E PÓS-IMPLANTAÇÃO E ANÁLISE DA

TERATOGENICIDADE

Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance

reprodutiva materna de ratas prenhas tratadas no período de pré-

implantação (d0-d5).

172

Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance

reprodutiva materna de ratas prenhas tratadas no período de pós-

implantação (d6-d15).

180

Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-

implantação (d6-d15), sobre a frequência das anomalias e malformações

externas e internas (esqueléticas e viscerais) em ninhadas e recém-

nascidos.

184


implantação (d6-d15), sobre o percentual das anomalias e malformações

externas e internas (esqueléticas e viscerais) em ninhadas e recém-

nascidos.

187


implantação (d6-d15), sobre os pontos de ossificação em recém-nascidos.

192

CAPÍTULO 4 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE Copaifera duckei NOS PERÍODOS

PERINATAL E PÓS-NATAL

Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros

reprodutivos maternos de ratas tratadas no período de pós-implantação

(d16-d20).

222

Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento

geral da progênie de ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal

(d16-d20).

226

Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo

estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no

período de desenvolvimento fetal (d16-d20).

227

Tabela 4. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase

do ciclo estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas

tratadas no período de desenvolvimento fetal (d16-d20).

227

Tabela 5. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a atividade motora da

progênie (F0) de ratas tratadas no período de pós-implantação (d16-d20).

228


reprodutivos maternos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-

dpn19).

233


bioquímicos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

234


hematológicos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

237

Tabela 9. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os órgãos de ratas

tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

239

Tabela 10. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento

geral da progênie de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

250

Tabela 11. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo

estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no

período de lactaão (dpn13-dpn19).

251

Tabela 12. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase

do ciclo estral, período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas


252


progênie (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

253

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representção esquemática dos períodos críticos do desenvolvimento nos três

períodos (implantação, embrionário e fetal).

54

Figura 2. Esquema geral. Segmentos I, II e III dos estudos de toxicologia reprodutiva 59

Figura 3. Formação de terpenóides via condensação de unidades de isoprenílicas

derivadas de duas rotas bioquímicas: Ácido mevalônico ou Metileritritol

fosfato.

66

CAPÍTULO 1 - CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

Copaifera duckei Dwyer POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A

ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM)

Figura 1. Cromatograma do padrão trans-cariofileno obtido em Cromatógrafo Gasoso

6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

97

Figura 2.

Perfil de fragmentação do padrão trans-cariofileno, obtido em Cromatógrafo

Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-

EM).

98

Figura 3. Curva de calibração do padrão trans-cariofileno, coeficiente de correlação

0,997975237; inclinação da reta 3,58189E-05.

99

Figura 4. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificada pelo

método H&L, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a

Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

103

Figura 5. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificado pelo

método IUPAC, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado

a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

103

Figura 6. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (RF 3340) não esterificado, obtido

em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de

Massa 5973 (CG-EM).

104

Figura 7. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, esterificado pelo método

IUPAC, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a

Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

106

Figura 8. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, não esterificado, obtido em

Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa

5973 (CG-EM).

106

Figura 9. Cromatograma do Branco utilizado no método de esterificação IUPAC,

obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro

de Massa 5973 (CG-EM).

107

Figura 10. Cromatograma e análise quantitativa do óleoresina de C. duckei, obtido em

Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa

5973 (CG-EM).

108

CAPÍTULO 2 – AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA

DE Copaifera duckei Dwyer E DO CREME VAGINAL CONTENDO O ÓLEORESINA

Figura 1. Efeito da administração (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320

mg/kg) e água destilada (Controle) sobre o desenvolvimento ponderal de

ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os valores representam a média

± E.P.M (n=5/grupo).

126


mg/kg) e água destilada (Controle) sobre o consumo diário de água de ratos

(machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os valores representam a média ±

E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05.

127


mg/kg) e água destilada (Controle) sobre o consumo diário de ração de

ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os valores representam a média

± E.P.M (n=5/grupo).

127

Figura 4. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei

(Tratado CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. duckei (Tratado

ORCDV 40 mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre o

desenvolvimento ponderal de ratas, linhagem Wistar. Os valores

representam a média ± E.P.M (n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo

Controle CVB, **

p < 0.05 grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD.

128


(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e

creme vaginal base (Controle CVB) sobre o consumo diário de água de

ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M

(n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **

p < 0.05

grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD.

128


(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e

creme vaginal base (Controle CVB) sobre o consumo diário de ração de

ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M


p < 0.05

grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD.

129




TERATOGENICIDADE

Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 1 e 2 para avaliar a toxicologia

reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C. duckei, de

acordo com os segmentos I (pré-implantação e pós-implantação) e II

(teratogenicidade).

154

Figura 2. Esfregaço vaginal confirmando o indicativo de prenhez pela presença de

espermatozóides e células queratinizadas (fase estro).

154

Figura 3. Análise das anomalias e/ou malformações externas dos RNs. 156

Figura 4. Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas

dos RNs.

160

Figura 5. Processamento dos RNs e secções seriadas de Wilson (1965) 161

Figura 6. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1)

septo nasal e (2) palato.

162


coana, (2) lentes, (3) cristalino, (4) bulbo olfatório e (5) retina.

162


ventrículos laterais e (2) 3º ventrículo.

162

163

Figura 9. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1)

Timo, (2) Traquéia, (3) Esôfago e (4) Medula espinhal.

163


Arco da aorta, (2) Traquéia, (3) Esôfago, (4) Veia cava superior, (5) Veia

pulmonar, (6) átrios e (7) Pulmões.

163


átrios direito e esquerdo, (2) Aorta ascendente, (3) Artéria pulmonar (4)

brônquios após bifurcação da traquéia, (5) Aorta descendente, (6) Lobos

pulmonares e (7) Esôfago.

164


Septo interventricular, (2) Ventrículos direito e esquerdo (3) Veia cava

inferior (4) os quatro lobos do pulmão (5) Aorta descendente, e (6)

Esôfago.

164

Figura 13. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1)

Diafragma, (2) Veia cava inferior e (3) pulmões.

164

Figura 14. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1)

Fígado, (2) Ápice do estômago e (3) Diafragma.

165

Figura 15. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve. (1)

Papila renal (2) Pelve renal e (3) Rin direito.

165

Figura 16. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve e Análise

dos órgãos reprodutores. (A) Macho. (1) Testículos, (2) Epidídimo, (3)

Canal deferente, (4) Bexiga, (5) Ureter e (6) reto. (B) Fêmea. (1) Útero

(cornos uterinos direito e esquerdo), (2) Ovários direito e esquerdo abaixo

dos (3) rins, (4) Bexiga, (5) Ureter e (6) reto.

165

Figura 17. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 1874 mg/kg (E1G3) no

período de pré-implantação (d0-d5). Sinal clínico de Toxidade aguda

(hemorragia nasal).

167

Figura 18. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e

ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de

ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5) e após o

tratamento (d14). No grupo controle (E1G1) foi administrada água

destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e

valores com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E1G1) e

b(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de Variância

(ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).

168

Figura 19. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e 169

ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas

prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5) [1] e após o

tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água

destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e

valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao E1G1)

e b(E1G3 em relação ao E1G2) e

c(1 tratamento em relação 2 após o

tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste

de tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).


ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas

prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5). No grupo

controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os

pontos representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão

indicados pelos índices a(em relação ao E1G1) e

b(E1G3 em relação ao

E1G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de

tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).

170


ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas

prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5) [1] e após o

tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água

destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e

valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao

E1G1), b(E1G3 em relação ao E1G2) e




170


ORCD 1874 mg/kg (E1G3), sobre o consumo diário de ração (g) de ratas

prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5). No grupo






tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).

171


período de pós-implantação (d6-d15). Sinal clínico de toxidade aguda e

aborto espontâneo.

174


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de

ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) e após o

tratamento (d21). No grupo controle (E2G1) foi administrada água


valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao E2G1)

e b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de Variância

(ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

176


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas

prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) [1] e após o

tratamento (d16-d20) [2]. No grupo controle (E2G1) foi administrada

177

água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e





de tukey (n= 5/grupo).


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas

prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No grupo


dados representam a média ± Erro Padrão da Média e resultados com p <

0,05, estatisticamente significativos, são representados pelos índices a(em

relação ao E2G1), b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de

variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

177


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas

prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) [1] e após o

tratamento (d16-d20) [2]. No grupo controle (E2G1) foi administrada

água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e




tratamento). Foi aplicado Análise de Variância (ANOVA) seguido do

teste de tukey (n= 5/grupo).

178


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão diária de ração (g) de ratas

prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No grupo






tukey (n= 5/grupo).

179


período de pós-implantação (d6-d15). (A) Útero normal com fetos e

placentas (E2G1) e (B) Útero de rata com reabsorções tardias no corno

esquerdo (E2G3) (ponta da seta).

181


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre recém-nascidos de progenitoras

tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No grupo controle

(E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). As barras

representam a média dos grupos. PIP: Pequeno para Idade de Prenhez.

AIP: Adequado para Idade de Prenhez, GIP: Grande para Idade de

Prenhez. O Teste do qui-quadrado foi aplicado e os percentuais não

diferiram entre si ao nível de 5% (p>0,05).

183


período de pós-implantação (d6-d15). (A) Fontanela normal (E2G1) e (B)

Fontanela com anomalia de grau moderado – Ossificação incompleta

(E2G3) (ponta da seta).

188

Figura 32. Malformação esquelética (Agenesia de esternébrio) A. Esterno nomal de

um RN do grupo controle (E2G1) e B. Ausência de esternébrio do grupo

189

tratado (E2G2) (ponta da seta).

Figura 33. Alteração esquelética (Falanges com ossificação incompleta) A. Falanges

inferiores de um RN do grupo controle (E2G1) e B. Falanges inferiores

com ossificação incompleta (E2G3) (ponta da seta).

189

Figura 34. Malformação visceral A. ventrículos laterias e 3º ventrículo normais

(E1G3) e B. ventrículos laterais e 3º ventrículo malformado - hidrocefalia

leve (E2G2) (ponta da seta).

190

Figura 35. Alteração visceral A. Rins normais (E1G3) e B. Rin direito alterado –

hipoplasia renal (ponta da seta).

190

CAPÍTULO 4 - AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE Copaifera duckei NOS PERÍODOS

PERINATAL E PÓS-NATAL

Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 3 e 4 para avaliar a toxicologia

reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C. duckei, de

acordo com o segmento III (perinatal e pós-natal).

211


ORCD 1874 mg/kg (E3G3), sobre a massa de ratas prenhas, tratadas no

período perinatal, correspondente ao período de desenvolvimento fetal

(d16-d20). No grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada

(0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados

com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E3G1) e

b(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado Análise de variância


220


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre a ingestão de água de ratas prenhas,

tratadas no período perinatal, correspondente ao período de

desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi

administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a

média ± E.P.M. Os valores não diferiram entre si ao nível de 5%

(p>0,05). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste


221


ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o consumo de ração de ratas prenhas,

tratadas no período perinatal, correspondente ao período de

desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi


média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E3G1) e

b(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado

Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey e Teste t não

pareado (n= 5/grupo).

221


ORCD 1874 mg/kg (E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal

(lactação) da progênie de ratas tratadas no período perinatal,

correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No

grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal).

224

Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi aplicado Teste t não

pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).


ORCD 1874 mg/kg (E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal (pós-

lactação) da progênie de ratas tratadas no período perinatal,

correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No

grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal).

Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi aplicado Teste t não

pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).

225


ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a massa de ratas lactantes, tratadas no

final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi




Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

230


ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a ingestão de água de ratas lactantes,

tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1)

foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam

a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E4G1) e


Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

231


ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre o consumo de ração de ratas

lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo


pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são

indidados pelos índices a(em relação ao E4G1) e



tukey (n= 5/grupo).

232

Figura 10. Aspecto microscópico de rin (corte longitudinal) de rata lactante que

recebeu água destilada (5mL) do dpn 13 - dpn 19 (E4G1). A. Região

cortical - glomérulos renais e cápsulas Bawman, sem alteração tecidual e

túbulos contorcidos proximais íntegros. B. Região cortical - células sem

alterações citoplasmáticas e nucleares (ponta da seta). C. Região

glomerular, sem alterações tecidual (HE, 20x).

240

Figura 11. Aspecto microscópico de rin (corte transversal) de rata lactante que

recebeu ORCD (366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região

cortical – ducto coletor cortical evidenciando núcleos e citoplasmas

íntegros (ponta da seta) B. Região cortical evidenciando glomérulo e

capsula de Bowman sem alteração tecidual (ponta da seta) (HE, 40x).

241

Figura 12. Aspecto microscópico de rin de rata lactante que recebeu ORCD (1874

mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G3). A. Região cortical com ductos

proximais evidenciando a presença de células cubóides simples íntegras

com núcleos e citoplasma íntegros (ponta da seta - HE, 40x). B. Região

medular – ductos longitudinais com células íntegras (ponta da seta - HE,

20x). C. Presença de dois glomérulos integros e capsula bawman sem

242

alterações (ponta da seta - HE, 20x).

Figura 13. Aspecto microscópico do fígado de rata lactante que recebeu ORCD

(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Hepatócitos normais sem

grandes alterações celulares (ponta da seta) (HE, 20x). B. Hepatócitos

com microvacuolização citoplasmática intensa (ponta da seta) (HE,

20x). C. Hepatócitos com microvacuolização citoplasmática intensa

(HE, 40x).

243


(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). Colestase extra-hepática

(ponta da seta - HE, 20x).

244


(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região centrolobular

normal (ponta da seta - HE, 20x). B. Necrose focal em região

centrolobular (ponta da seta - HE, 10x).

245


ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a massa corporal da progênie

(período de lactação), de ratas lactantes tratadas no final da lactação

(dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água


resultados com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao

E2G1), b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância


247


ORCD 1874 mg/kg (E4G3), sobre a massa corporal da progênie

(período de pós-lactação), de ratas lactantes tratadas no final da lactação

(dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água


resultados com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao

E4G1) e b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de

variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

248


1874 mg/kg (E4G3) sobre o descolamento do pavilhão auricular de

lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Pavilhão auricular antes do descolamento

(B) Pavilhão auricular após descolamento (ponta da seta).

249


1874 mg/kg (E4G3) sobre a abertura palpebral ocular bilateral de

lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Palpebras antes da abertura (B) Palpebras

após a abertura (ponta da seta).

250

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO 1 - CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE



Quadro 1. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano 100

Quadro 2. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano 100

Quadro 3. Pontos da curva de calibração e suas correspondentes concentrações 100

Quadro 4. Composição do óleo-resina de C. duckei e os respectivos tempo de

retenção (TR) conforme o tratamento da amostra: esterificado (H&L),

esterificado (IUPAC) e não esterificado.

105




TERATOGENICIDADE

Quadro 1. As quatro fases do ciclo estral, mediante exame de citologia vaginal. 155

LISTA DE ABREVIATURAS

OECD Organization for Economic Cooperation and Development

OMS Organização Mundial de Saúde

FDA Food and Drugs Administration

US EPA U.S. Environmental Protection Agency

REACH Registration, Evaluation, and Authorization af Chemicals

ICH International Conference on Harmonisation of technical requirements for

registration of Pharmaceuticals for human use

NCI National Cancer Institute

WHO World Health Organization

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

CGAR Cromatografia Gasosa de Alta Resolução

CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada à Espectômetria de Massas

min Minutos

mL Mililitros

ORCD Óleoresina de Copaifera duckei

°C Graus Celsius

m Metros

mm Milímetros

µm Micrômetros

µL Microlitros

TR Tempo de Retenção

H&L Hartman e Lago

n Número

mg Miligrama

g Grama

ng Nanograma

spp. Espécie

UFV Universidade Federal de Viçosa

kg Kilograma

v.o Via oral

v.v Via vaginal

i.p Intraperitoneal

EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid

AST aspartato aminotransferase

ALT alanina aminotransferase

HDL High Density Lipoprotein

CHCM hemoglobina corpuscular média

VCM Volume corpuscular médio

EPM Erro padrão da média

CVORCD creme vaginal do óleoresina de C. duckei

ORCDV óleoresina de C. duckei via vaginal

CVB Creme vaginal base

CEMIB Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em

Animais de Laboratório

UNICAMP Universidade de Campinas

LACEN-AP Laboratório Central do Amapá

DL50 Dose Letal 50%

RNs Recém-nascidos

AIP Adequado para Idade de Prenhez

PIP Pequeno para Idade de Prenhez

GIP Grande para Idade de Prenhez

SNC Sistema Nervoso Central

dpn Dia pós-natal

rpm Rotações por minuto

HE Hematoxilina-eosina

dL Decilitro

U/L Unidade por litro

MPV Volume Plaquetário Médio

PDW Amplitude de distribuição das plaquetas com base no tamanho

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................................... 8

ABSTRACT ............................................................................................................................ 10

1 INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................... 30

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 32

2.1 BIODIVERSIDADE E OS PRODUTOS NATURAIS ................................................................... 32

2.2 ENSAIOS DE TOXIDADE NÃO CLÍNICO DE PRODUTOS NATURAIS ................ 36

2.3 O USO DE MEDICAMENTOS NA GESTAÇÃO ......................................................... 40

2.3.1 Embriologia humana e comparada ...................................................................... 47

2.3.2 Toxicologia reprodutiva e legislação .................................................................... 54

2.4 O GÊNERO COPAIFERA .............................................................................................. 62

2.4.1 Copaifera duckei Dwyer......................................................................................... 70

3 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 72

4 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 88

3.1 GERAL ........................................................................................................................... 88

3.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 88

CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE

COPAIFERA DUCKEI DWYER POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A

ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM) ................................................................... 89

RESUMO ................................................................................................................................. 90

ABSTRACT ............................................................................................................................ 91

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 92

2 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 96

2.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL ...................................................................................... 96

2.2 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA

(CG-EM) ............................................................................................................................... 96

2.2.1 Parâmetros do equipamento CG-EM .................................................................. 96

2.2.1.1 Dados do equipamento ..................................................................................... 96

2.2.1.2 Condições da análise ........................................................................................ 97

2.2.1.3 Identificação dos compostos ............................................................................. 97

2.2.2 Preparo da amostra ............................................................................................... 98

2.2.2.1 Quantidade de partida ....................................................................................... 99

2.2.2.2 Construção da curva de calibração ................................................................... 99

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 102

4 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 110

5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 111

CAPÍTULO 2: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO ÓLEORESINA E

DO DO CREME VAGINAL DE C. DUCKEI DWYER.................................................... 115

RESUMO ............................................................................................................................... 116

ABSTRACT .......................................................................................................................... 117

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 118

2 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 122

2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 122

2.2 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................................... 122

2.2.1 Animais ................................................................................................................. 122

2.2.2 Vias de administração e doses utilizadas ........................................................... 123

2.2.3 Grupos experimentais ......................................................................................... 123

2.3 AVALIAÇÃO DA TOXIDADE EM FASE DE TRATAMENTO SUBCRÔNICO DO

ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL) .............................................. 123

2.3.1 Desenvolvimento ponderal e consumo de água e ração ................................... 123

2.3.2 Coleta da amostra ................................................................................................ 124

2.3.3 Avaliação dos parâmetros bioquímicos ............................................................. 124

2.3.4 Avaliação dos parâmetros hematológicos ......................................................... 124

2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 124


3.1 AVALIAÇÃO DA TOXIDADE EM FASE DE TRATAMENTO SUBCRÔNICO

DO ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL) .................................. 126

3.1.1 Desenvolvimento ponderal, consumo de água e ração ..................................... 126

3.1.2 Avaliação dos parâmetros bioquímicos ............................................................. 129

3.1.3 Avaliação dos parâmetros hematológicos ......................................................... 131

4 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 136

5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 137

CAPÍTULO 3: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM RATAS

SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM ÓLEO RESINA DE C. DUCKEI NOS


TERATOGENICIDADE ..................................................................................................... 143

RESUMO ............................................................................................................................... 144

ABSTRACT .......................................................................................................................... 145

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 146


2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 152

2.2 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................................... 152

2.3 ANIMAIS ..................................................................................................................... 152

2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS.............................................. 152

2.5.1 Seqüência experimental ...................................................................................... 155

2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal) ......................................................... 155

2.5.3 Período de Acasalamento .................................................................................... 155

2.5.4 Experimento 1 (E1) .............................................................................................. 156

2.5.4.1 Tratamento no período pré-implantação (d0-d5) E1 ...................................... 156

2.5.4.2 Toxidade aguda nas progenitoras E1 .............................................................. 157

2.5.4.3 Avaliação da performance reprodutiva E1 ..................................................... 157

2.5.4.3.1 Teste para confirmação dos sítios de implantações e de reabsorções E1

................................................................................................................................ 158

2.5.5 Experimento 2 (E2) .............................................................................................. 158

2.5.5.1 Tratamento no período pós-implantação (d6-d15) E2 .................................... 158


2.5.5.3 Avaliação da performance reprodutiva E2 ..................................................... 158


................................................................................................................................ 159

2.5.6 Avaliação da Embriofetotoxidade E2 ................................................................ 159

2.5.6.1 Peso e classificação dos recém-nascidos (RNs) E2 ........................................ 159

2.5.7 Teratogenicidade E2 ............................................................................................ 160

2.5.7.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas E2 ................................. 160

2.5.7.2 Análise das anomalias e/ou malformações internas E2 .................................. 160

2.5.7.2.1 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas

E2 ............................................................................................................................ 160

2.5.7.2.2 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações viscerais E2

................................................................................................................................ 161

2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E1 E E2 ............................................................................. 166


3.1 EXPERIMENTO 1 (E1) ............................................................................................... 167

3.1.1 Toxidade aguda nas progenitoras E1 ................................................................ 167

3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E1 ....................................... 168

3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E1 .................................................... 169

3.1.2 Performance reprodutiva materna E1 .............................................................. 171

3.2 EXPERIMENTO 2 (E2) ............................................................................................... 174


3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E2 ....................................... 175

3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E2 .................................................... 176

3.2.2 Performance reprodutiva materna E2 .............................................................. 179

3.2.3.1 Embriofetoxidade E2 ...................................................................................... 182

3.2.4 Teratogenicidade E2 ............................................................................................ 183

3.2.4.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas e internas (esqueléticas e

viscerais) E2 ............................................................................................................... 183

3.2.4.1.1 Contagem dos pontos de ossificação E2 ................................................. 191

4 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 193

5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 194

CAPÍTULO 4: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE C. DUCKEI NOS PERÍODOS PERINATAL

E PÓS-NATAL ..................................................................................................................... 202

RESUMO ............................................................................................................................... 203

ABSTRACT .......................................................................................................................... 204

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 205


2.1 MATERIAL .................................................................................................................. 209

2.2 ASPECTOS ÉTICOS .................................................................................................... 209

2.3 ANIMAIS ..................................................................................................................... 209

2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS.............................................. 209

2.5 DESENHO EXPERIMENTAL .................................................................................... 210

2.5.1 Seqüência experimental ...................................................................................... 212

2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal) ......................................................... 212

2.5.3 Período de Acasalamento .................................................................................... 212

2.5.4 Experimento 3 (E3) .............................................................................................. 212

2.5.4.1 Tratamento no período perinatal in útero (d16-d20) E3 ................................. 212


2.5.4.2.1 Avaliação de massa corporal das progenitoras E3 ................................ 213

2.5.4.2.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3 ................ 213

2.5.4.3 Avaliação da progênie exposta no período perinatal (in útero) E3 ................ 213

2.5.4.3.1 Massa da progênie E3 ............................................................................. 213

2.5.4.3.2 Avaliação do desenvolvimento geral e sexual da progênie E3 ............... 214

2.5.4.3.2.1 Descolamento dos pavilhões auriculares E3........................................ 214

2.5.4.3.2.2 Surgimento de pelos E3 ........................................................................ 214

2.5.4.3.2.3 Abertura palpebral ocular bilateral E3 ............................................... 214

2.5.4.3.2.4 Manifestações das características sexuais E3 ..................................... 214

2.5.4.3.2.5 Avaliação da atividade motora E3 ....................................................... 214

2.5.5 Experimento 4 (E4) .............................................................................................. 215

2.5.5.1 Tratamento no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4 ..................................... 215

2.5.5.2 Toxidade aguda nas lactantes E4 .................................................................... 215

2.5.5.2.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4 ....................... 215

2.5.5.2.2 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4 ....................... 215

2.5.5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4

................................................................................................................................ 216

2.5.5.2.4 Análise histopatológica das lactantes E4 ................................................ 216

2.5.5.3 Avaliação dos lactentes expostos no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4 ... 217

2.5.5.3.1 Toxidade aguda dos lactentes E4 ............................................................ 217

2.5.5.3.2 Massa dos lactentes E4............................................................................ 217

2.5.5.3.3 Avaliação do desenvolvimento geral da progênie ................................... 217

2.5.5.3.4 Descolamento dos pavilhões auriculares ................................................ 218

2.5.5.3.5 Surgimento de pêlos ................................................................................ 218

2.5.5.3.6 Abertura palpebral ocular bilateral ........................................................ 218

2.5.5.3.7 Manifestações das características sexuais .............................................. 218

2.5.5.3.8 Avaliação da atividade motora................................................................ 218

2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E3 E E4 ............................................................................. 218


3.1 EXPERIMENTO 3 (E3) ............................................................................................... 219


3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das progenitoras E3.......................... 219

3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3 ......................... 220

3.1.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos de progenitoras expostas no período

perinatal (in útero) (E3) .............................................................................................. 222

3.1.2 Toxidade na progênie de progenitoras tratadas no período perinal in útero

(d16-d20) E3 .................................................................................................................. 223

3.1.2.1 Desenvolvimento ponderal progênie (Lactação) ............................................ 223

3.1.2.2 Desenvolvimento ponderal da progênie (pós-lactação) E3 ............................ 225

3.1.2.3 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E3 ............................................ 225

3.1.2.3.1 Avaliação da atividade motora E3 .......................................................... 228

3.1 EXPERIMENTO 4 (E4) ............................................................................................... 229

3.2.1 Toxidade aguda das lactantes E4 ....................................................................... 229

3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4................................ 229

3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das lactantes E4 ............................... 230

3.2.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos das lactantes E4 ............................... 232

3.2.1.4 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4 ........ 234

3.2.1.5 Análise histopatológica das lactantes E4 ........................................................ 238

3.2.2 Toxidade aguda nos lactentes E4 ....................................................................... 246

3.2.2.1 Sinais clínicos de toxidade aguda E4 ............................................................. 246

3.2.2.2 Desenvolvimento ponderal dos lactentes durante a lactação (tratamento) E4

.................................................................................................................................... 247

3.2.2.3 Desenvolvimento ponderal dos descendentes após lactação (pós-tratamento)

E4 ................................................................................................................................ 248

3.2.2.4 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E4 ............................................ 249

3.2.2.4.1 Avaliação da atividade motora E4 .......................................................... 252

4 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 254

5 REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 256

CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................... 262

APÊNDICE............................................................................................................................266

30

1 INTRODUÇÃO GERAL

O conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos naturais advindos da

biodiversidade amazônica, tem se tornado um importante instrumento no desenvolvimento de

novos produtos farmacêuticos. O óleo de copaíba é um importante produto natural utilizado

na medicina tradicional, desde o tempo da colonização do Brasil, pois a população indígena já

utilizava este óleo para cicatrizar o umbigo dos recém-nascidos. Há tempos vem sendo,

comumente, indicado como anti-inflamatório, antisséptico e cicatrizante, principalmente, das

vias aéreas superiores e urinárias.

Apesar da existência de vários anti-inflamatórios, analgésicos e antissépticos no

mercado farmacêutico, os óleos de copaíba nunca deixaram de ser utilizado pela população

brasileira, principalmente na região amazônica. Além disso, existem várias formulações e

formas farmacêuticas (cápsulas, óvulos e xaropes compostos com mel e copaíba) disponíveis

nas prateleiras de farmácias e drogarias. É reconhecido como um dos produtos naturais mais

utilizados pela população amazônica, onde tem uma grande representação econômica e social,

principalmente, por ser uma espécie nativa e ter várias comunidades que dependem do seu

extrativismo.

No contexto histórico as copaibeiras já foram, comumente, derrubadas, obtendo-se

uma extração de óleo não racional. Isso ocorre devido aos desmatamentos crescentes na

Região Amazônica, com interesse na madeira, que acaba transformando o óleo de copaíba em

subproduto da indústria madeireira. Contudo, já foi descrito na literatura que é possível extrair

o óleoresina de copaíba de maneira ecologicamente sustentável, com uma recuperação

máxima de 100 % do óleoresina em apenas um ano, dependedo do tamanho da árvore.

As ações anti-inflamatória e antimicrobiana do óleo de copaíba já foram comprovadas,

no entanto, ainda há dificuldades em estabelecer a relação entre a composição química e suas

atividades farmacológicas. É comum a existência de diversas espécies de copaibeiras em uma

mesma região, que acaba por proporcior uma variabilidade química entre os óleos obtidos,

dificultando sua validação como fitoterápico. Neste contexto, é importante ressaltar que o uso

de preparações, mesmo fitoterápicas, não pode ser utilizado de maneira indiscriminada pela

população. Além dos estudos que comprovam a ação farmacológica desses produtos, são

necessários, ainda, estudos toxicológicos para avaliar a segurança, tanto do produto natural (o

óleo de copaíba), como do produto final acabado, o medicamento fitoterápico.

31

A ausência de informações sobre os riscos associados ao uso de alguns produtos,

mesmo o naturais, é um dos principais fatores que levam a intoxicações. Pode parecer trivial

quando comparada com aquela apresentada pelos medicamentos convencionais; entretanto, a

toxidade de plantas medicinais é um problema de saúde pública, devido à crença de que estas

não causam efeitos adversos. É comum sua utilização pelas gestantes e lactantes como recurso

medicamentoso, para fins de aliviar ou curar doenças. Por isso, não se pode considerar que

por se tratar de produtos naturais, essas substâncias sejam inócuas; sendo necessária a

realização de ensaios toxicológicos para fornecer a comunidade dados científicos sobre

segurança e toxidade das mesmas.

Gestantes constituem um grupo populacional que, culturalmente, utiliza as plantas

medicinais, por acreditarem que estas não causam danos ao feto ou ao neonato. A utilização,

mesmo de preparações fitoterápicas, nesse grupo pode gerar riscos a saúde, podendo ocorrer

graves conseqüências, tanto para a mãe como para o feto. Nesse caso, embora raros, os

estudos toxicológicos bem controlados são necessários, inclusive durante o período

gestacional.

A grande maioria dos produtos derivados de plantas utilizados, culturalmente, no

Brasil não possui estudos pré-clínicos de toxidade reprodutiva, e o efeito desses produtos

sobre o sistema reprodutivo é desconhecido. Devem-se utilizar os mesmos cuidados dos

medicamentos alopáticos para comprovar a sua segurança. A política de plantas medicinais e

medicamentos fitoterápicos foram aprovados em 2006 objetivando inserir terapias alternativas

e práticas populares (incluindo a fitoterapia) no sistema único de saúde (SUS). Por isso, há

necessidade de estudos toxicológicos e a implantação de políticas de fitofarmacovigilância

devem ser tomadas como prioridade para a saúde pública.

Os estudos de toxicologia reprodutiva de produtos naturais ainda são incipientes no

Brasil, contudo, são necessários, para que a classe médica possa prescrever o uso desses

produtos naturais. Diante desta problemática, o presente estudo buscou avaliar os possíveis

efeitos tóxicos, após longo período de uso (subcrônico), provocados pelo óleo de copaíba e/ou

pelo medicamento fitoterápico (creme vaginal). Buscou-se ainda, um amplo estudo para

avaliar e a toxidade reprodutiva em diferentes períodos (pré-natal e pós-natal).

32

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 BIODIVERSIDADE E OS PRODUTOS NATURAIS

Os componentes da biodiversidade podem fornecer uma ampla gama de produtos de

importância econômica. Dentre eles destacam-se os fitoterápicos e os fitofármacos, originados

dos recursos genéticos vegetais (GUERRA et al. 1998). O Brasil é considerado o primeiro em

megadiversidade, tanto em número de espécies quanto em níveis de endemismo (ALBAGLI,

2001). Estima-se entre 10 e 20% do número total de espécies do planeta (DIAS, 2001). A

biodiversidade existente nos vários biomas brasileiros (Caatinga, Cerrado, Pantanal, Mata

Atlântica, Amazônia e Pampa) permite que o país desenvolva ciência e tecnologia na

produção de medicamentos de origem vegetal (VILLAS BOÂS; GADELHA, 2007). Existem

mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000,

consideran-se, ainda, que mais da metade dessas espécies se encontram nas florestas tropicais,

cuja área corresponde a apenas 7% da superfície da terra (MARQUES, 2000; GUERRA et al.,

1998).

As plantas são uma fonte importante de produtos naturais biologicamente ativos,

muitos dos quais se constituem em modelos para a síntese de um grande número de fármacos.

Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se impressionados pelo fato desses

produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade

em termos de estrutura e de propriedades físico-químicas e biológicas (GUERRA et., 1998).

Os produtos naturais são micromoléculas ou metabólitos secundários, com estruturas

complexas, baixo peso molecular, marcantes atividades biológicas e, diferentes dos obtidos do

metabolismo primário. São encontrados em concentrações relativamente baixa e em

determinados grupos de plantas (POSER; MENTZ, 2004). Esses produtos desempenham um

papel fundamental, pois servem como ponto de partida para a pesquisa e desenvolvimento de

novos fármacos. Algumas triagens são empregadas para selecionar os produtos naturais que

contém atividades biológicas, tal como os estudos randômicos, quimiotaxinômicos,

etnobotânicos, etnofarmacológicos, e etológicos (MCCHESNEY et al., 2007).

Na abordagem randômica, a coleta de plantas se dá ao acaso. Pode-se randomizar uma

coleta em área genérica, com diversidade taxonômica reconhecida para triagens fitoquímicas

e farmacológicas; preferencialmente em regiões com alto grau de diversidade e endemismo. O

estudo quimiotaxonômico ou filogenético consiste na seleção de espécies de uma família ou

33

gênero, para as quais se tenha algum conhecimento fitoquímico de ao menos uma espécie do

grupo. Um bom exemplo são as espécies do gênero Bauhinia que possuem algumas

substâncias químicas em comum como glicosídeos, triterpenos, lactonas e flavonóides

(SILVA; CECHINEL FILHO, 2002). Outro exemplo são as espécies do gênero Hypericum,

notadamente H. perforatum L, que tem a hipericina como principal constituinte. Em H.

barbatum Jacq. encontrou-se conteúdo de hipericina 3.9 vezes maior que em H. perforatum

(SMELCEROVIC; SPITELLER, 2006).

Apesar de a indústria farmacêutica empregar as mais diferentes técnicas, tal como, a

biologia molecular, química combinatória e a química computacional, a investigação da

atividade biológica de produtos naturais com base no uso tradicional é o ponto chave na busca

de novas moléculas. Isso por duas razões básicas: o tempo e o baixo custo envolvido na

chegada de um medicamento ao mercado (PETROVICK et al., 1997; ALVES, 2005).

O resgate dos conceitos locais que são desenvolvidos com relação às plantas e ao uso

que se faz delas podem ser identificados através dos estudos etnobotânicos. Segundo

Albuquerque et al. (2007), estuda a inter-relação direta entre pessoas e plantas, incluindo

todas as formas de percepção e apropriação dos recursos vegetais. Indo mais além do que o

registro dessas drogas utilizadas, a etnofarmacologia inclui uma avaliação experimental

obtidas informações etnomédicas, avaliando a eficácia das técnicas “tradicionais” fazendo uso

de um grande número de modelos farmacológicos (WALLER, 1993; DI-STASI, 2005;

ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006). Não obstante, na abordagem etológica os estudos

são feitos com base na observação do comportamento animal para avaliar a utilização de

metabólitos secundários por esses animais, ou outras substâncias não nutricionais dos

vegetais, com a finalidade de combater doenças ou controlá-las (HUFFMAN, 2003; CARRAI

et al., 2003; KRIEF et al., 2004).

Para obtenção de novos fármacos, dois aspectos distinguem os produtos de origem

natural dos sintéticos: a diversidade molecular e a função biológica. A diversidade molecular

dos produtos naturais é muito superior àquela derivada dos processos de síntese, que, apesar

dos avanços consideráveis, ainda é limitada. Desde o final do século XIX, os avanços na

química orgânica possibilitaram a modificação da estrutura dos produtos naturais, tendo em

vista um aumento na atividade ou seletividade e a redução dos efeitos colaterais ou a

toxidade. Apesar da criação e modificação de novas moléculas em laboratório, para

Chechinel-Filho e Yunes (2001) os produtos naturais são sintetizados mediante um processo

de química combinatória inigualável, a seleção natural e a evolução biológica, que

34

proporcionam uma diversidade estrutural de moléculas em diferentes alvos biológicos.

Newman e Grag (2007) fizeram um levantamento sobre as novas drogas inseridas no

mercado nos últimos 25 anos. Os dados demonstraram que 6 % dessas drogas foram

originárias, exclusivamente, de produtos naturais e 28 % foram derivadas desses produtos

(semissíntese). Se juntarmos com mais 5 % de drogas obtidas a partir de síntese (com grupo

farmacofórico oriundo de um produto natural), mais 12 % de drogas que mimetizam a partir

de síntese um produto natural (incluindo grupo farmacofórico obtido de um produto natural) e

12 % de drogas sintéticas (que mimetizam produtos naturais), temos um total de 63 % versus

37 % daqueles obtidos, somente, a partir de síntese química com screening farmacológico

randomizado.

Dentre as espécies vegetais brasileiras, inúmeras são possuidoras de propriedades

farmacológicas relevantes, importantes não só como alternativa terapêutica, mas também

como fonte econômica para o país (MARINHO et al., 2007). A grande dificuldade esbarra na

escassa inovação tecnológica em pesquisa e exploração de produtos naturais, apesar da

abundância desses produtos nos países em desenvolvimento. No Brasil, as inovações têm sido

de baixa ou média intensidade, sendo que os fitoterápicos mais vendidos no mercado

brasileiro são produzidos a partir de espécies estrangeiras (WAGNER, 2002). Por outro lado,

grandes empresas sediadas em países industrializados, como Alemanha, França, Estados

Unidos e Japão, vêm aplicando competências científicas e tecnológicas no desenvolvimento

de produtos derivados de plantas medicinais, muitas vezes oriundas dos países em

desenvolvimento e com emprego tradicional, e se consolidando como líderes neste crescente e

promissor mercado (YUNES; PEDROSA; CECHINEL-FILHO, 2001).

Segundo Funari e Ferro (2005), as populações dos países em desenvolvimento reúnem

cerca de 80% da população mundial, entretanto, são compradores de apenas 20% de

medicamentos a nível mundial. Não obstante, os fitoterápicos vêm sendo amplamente

utilizados, com crescimento em torno de 10 % a 20 % de suas vendas em vários países. Cerca

de ¼ do mercado brasileiro de medicamentos corresponde ao uso de produtos de origem

natural (SANT’ANA, 2002). Como exemplo, nos últimos 10 anos as florestas tropicais foram

responsáveis por fornecer matéria prima que resultou na produção de 60 % das novas drogas

utilizadas para o tratamento do câncer (NEWMAN; GRAG, 2007; MCCHESNEY et al.,

2007).

O custo de um medicamento originado a partir de plantas medicinais gira em torno de

35 milhões de dólares. Já a descoberta de um novo medicamento sintético varia de 500 a 800

35

milhões de dólares, podendo levar entre sete a vinte anos de pesquisa para chegar ao mercado

(SANT’ANA, 2002; MCCHESNEY et al., 2007). Diante disso, revela-se a necessidade de se

buscar alternativas na geração dos fitoterápicos para superar a dependência externa dos

medicamentos sintéticos, principalmente quando se confrontam os preços médios praticados

no Brasil em comparação com aqueles praticados nos países desenvolvidos. Nesse quadro,

confronta-se um hemisfério norte rico em tecnologia, mas pobre em recursos genéticos e

hemisfério sul pobre em tecnologia, mas riquíssimo em diversidade biológica (GUERRA et

al. 1998).

A utilização da medicina informal ou popular realizada por indivíduos que se valiam

de seus diferentes saberes é bastante difundida no Brasil onde algumas plantas consideradas

medicinais são comercializadas livremente (BOCHNER et al., 2012). Isso pode ser devido,

dentre outros fatores, ao alto custo dos medicamentos industrializados como também ao

difícil acesso à assistência médica. Por meio disto, tradições terapêuticas por meio das plantas

contribuíram para a formação da medicina popular. Segundo Calixto (2005), este fato deve-se

à pobreza e ao pouco acesso à medicina moderna. É nesse contexto social que as plantas

medicinais adquirem importância como agentes terapêuticos. A OMS (Organização Mundial

de Saúde) define que planta medicinal é “todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais

órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores

de fármacos semissintéticos” (WHO, 2002).

No Brasil, sabe-se que várias comunidades dependem da medicina tradicional para

tratar diversas doenças infecciosas e parasitárias como as tropicais, contudo, a maioria das

pesquisas, em termo global, tem dado pouca importância os dados epidemiológicos, das

doenças endêmicas, dos países em desenvolvimento (doenças tropicais), no que diz respeito à

descoberta de um novo fármaco. Isso porque as grandes indústrias farmacêuticas não se

interessam em produzir medicamentos para as ditas “Doenças Negligenciadas”, tal como,

tuberculose, malária, esquistossomose, leishmaniose e tripanossomose entre outras

(TROUILLER et al., 2001). Apesar da flora exuberante e da enorme variedade de espécies

nativas, o mercado brasileiro de medicamentos fitoterápicos caracteriza-se,

predominantemente, pela utilização de plantas europeias e asiáticas. Isso se devia,

principalmente, ao incipiente desenvolvimento do seguimento farmacêutico no país, com

poucos investimentos em pesquisas na área de fitoterapia (CHECHINEL-FILHO; YUNES,

2001).

36

No entanto, nos últimos anos, segundo Klein e seus colaboradores (2009), o mercado

de medicamentos derivados de plantas, os fitoterápicos, tem atraído a atenção da indústria

farmacêutica, setor para o qual são destinados bilhões de dólares e que possui ascendente

expansão. Diante deste cenário, cabe ressaltar o considerável número de artigos publicados no

Brasil com o termo “copaíba”, associado à sua elevada biodiversidade, o que atribui à flora

nativa amplo potencial de aplicação farmacológica e medicinal (AZEVEDO, 2003).

2.2 ENSAIOS DE TOXIDADE NÃO CLÍNICO DE PRODUTOS NATURAIS

O uso de plantas medicinais no alívio de qualquer moléstia é uma prática antiga das

atividades humanas. A Organização Mundial de Saúde traz recomendações à difusão dos

conhecimentos necessários ao uso das plantas medicinais, embora sejam popularmente

consideradas terapêuticas, frequentemente possuem propriedades tóxicas desconhecidas pela

população. Entretanto, a utilização da medicina informal ou popular realizada por indivíduos

que se valiam de seus diferentes saberes é bastante difundida no Brasil onde algumas plantas

consideradas medicinais são comercializadas livremente (BOCHNER et al., 2012). Isso pode

ser devido, dentre outros fatores, ao alto custo dos medicamentos industrializados como

também ao difícil acesso à assistência médica, fato que contribui para a continuidade da

medicina tradicional.

Sabe-se que muitas destas plantas apresentam substâncias que podem desencadear

reações adversas e inúmeros trabalhos científicos têm relatado efeitos tóxicos principalmente

sobre o fígado, e em escala menor sobre os rins, sangue, pele, sistema nervoso, cardiovascular

e reprodutor, bem como efeitos mutagênicos e carcinogênicos (SOARES, 2008). A literatura

tem demonstrado numerosos estudos de extratos de plantas com algum efeito terapêutico, o

que torna cada vez mais necessário estabelecer parâmetros de toxicidade (SHAHJAHAN,

2004; TCHAMADEU et al., 2011). Segundo Calixto (2000), dois tipos de efeitos adversos

podem ser atribuídos ao uso de plantas medicinais. O primeiro é considerado intrínseco a uma

determinada planta e pode ser relacionada à sua toxidade, a uma super dosagem e/ou a

interação com outros fármacos. O segundo, extrínseco, está relacionado a erros de

identificação, falta de padronização no preparo, contaminação, substituição, adulteração de

plantas e dosagem incorreta.

Toxidade é a propriedade potencial de uma determinada substância química de instalar

um estado patológico em conseqüência de sua introdução ou interação com o organismo

37

(OGA, 2008). A toxicidade de plantas medicinais constitui hoje um problema sério de saúde

pública. O Surgimento do conceito de “natural”, em muito contribuiu para o aumento do uso

das plantas medicinais nas últimas décadas. Para muitos, esse conceito significa “ausência de

substâncias químicas”, que são aquelas que podem causar dano ou, de outra forma,

representam perigo. Assim, os produtos naturais passaram a ser sinômino de produtos

saudáveis, seguros e benéficos. Esse conceito é extremamente equivocado, já que muitas

plantas contêm substâncias capazes de exercer ação tóxica sobre organismos vivos

(MENGUE; MENTZ; SCHENKEI, 2001). Por esse motivo há uma preocupação crescente

nos meios científicos que envolvem estudos fitoterápicos, pois tem sido comum a ocorrência

de adulterações e toxidez dos mesmos.

A propriedade de cada planta em causar toxidade pode ser verificada através da

avaliação toxicológica, obtendo-se dados como dosagem, sinais, efeitos provocados que irão

determinar o potencial de toxicidade. Uma das formas de proceder à avaliação toxicológica é

através da administração de quantidade do composto em estudo ou doses do extrato em

animais podendo ser realizada a toxicidade aguda, subcrônica ou crônica. A toxicidade aguda

provoca uma resposta rápida num curto período de tempo (por convenção de poucas horas ou

poucos dias), provocando geralmente uma elevada mortalidade. Na toxicidade crônica, os

efeitos se manifestam num longo período de tempo (de semanas a meses) (DIAS et al, 2002).

Assim, a investigação do potencial tóxico de plantas medicinais pode elucidar

importantes aspectos farmacológicos de seus princípios naturais, permitindo uma utilização

segura, respeitando seus possíveis riscos toxicológicos (MENGUE; MENTZ; SCHENKEI,

2001). Os testes de toxicidade em geral são utilizados para avaliar ou para prever os efeitos

tóxicos nos sistemas biológicos ou para averiguar a toxicidade relativa das substâncias

(FORBES; FORBES, 1994). Os principais objetivos da avaliação da segurança nos ensaios

não clínicos é caracterizar os efeitos tóxicos relacionados ao órgão alvo, dose dependência,

tempo de exposição, reversibilidade dos efeitos e tempo em que os sinais de toxidade

aparecem e desaparecem (FDA, 2010).

A toxidade aguda está relacionada à exposição a uma substância química por

menos de 24 horas, mesmo sendo realizada apenas uma administração e seus efeitos durante

14 dias após a administração (KLAASSEN; WATKINS, 2012). Esses ensaios são utilizados

para classificar e rotular apropriadamente as substâncias de acordo com o seu potencial de

toxidade ou letalidade e devem ser usadas em estudos subsequentes de toxidade prolongada

38

(VALADARES, 2006; BRASIL, 2013). A toxidade subaguda está relacionada a exposição

repetida de a uma determinada substância química em um organismo, por um período de um

mês ou menos, o que pode levar a toxidade sistêmica do organismo, dependendo do seu grau

de exposição (KLAASSEN; WATKINS, 2012).

A toxidade sistêmica pode ser identificada através da diminuição do peso corporal

dos animais e por alterações no consumo de água e ração (CUNHA et al., 2009), além de

sinais comportamentais como prostração, apatia e a presença de pelos eriçados. Segundo Lapa

et al. (2010), a toxidade sistêmica também pode ser identificada por meio das alterações

relacionadas a massa relativa dos órgãos, sendo importante para a avaliação da toxidade de

uma determinada substância nociva ao organismo.

O teste de toxidade prolongada analisa e caracteriza todos os efeitos provocados

por uma determinada substância quando administrada diariamente a animais experimentais,

em doses previamente estabelecidas e por períodos prolongados. Os principais parâmetros que

devem ser observados durante o período de tratamento são modificações na atividade motora

e no comportamento, no consumo de água e ração, no peso dos animais na cor e textura dos

pelos e na frequência cardiorrespiratória. Ao fim dos experimentos, os animais devem ser

sacrificados para a coleta de sangue (estudo bioquímico e hematológico) e remoção dos

órgãos para análise macro e microscópica (BRASIL, 2013).

A toxidade subcrônica avalia a exposições, variando de 21 a 90 dias em roedores

e um ano para animais de grande porte. A avaliação da toxidade reprodutiva devem

contemplar avaliações nas seguintes fases: (Fertilidade e desenvolvimento embrionário

inicial; desenvolvimento pré e pós-natal, incluindo função materna; desenvolvimento embrio-

fetal e avaliação do potencial de toxidade reprodutiva) (OECD, 2001; BRASIL, 2013).

Inúmeros trabalhos envolvendo estudos não clínicos in vivo de produtos naturais, utilizam

parâmetros bioquímicos, hematológicos e anatomopatológicos para avaliar possíveis sinais de

toxicidade (LEMÔNICA et al., 1996; LYRA et al., 2005; VALADARES et al. 2006;

ARAGÃO et al., 2006).

Os testes não clínicos são apenas regulatórios, durante a sua realização existe a

oportunidade de descobrir novas potencialidades do medicamento, corrigir problemas de

efeitos colaterais e toxicidade. Apesar de muitos dos fitoterápicos utilizados no nosso país se

mostrarem eficazes ao longo de anos de utilização, uma boa parte dessas substâncias são

isentas de estudos que comprovem sua segurança e eficácia, e aquelas indústrias que as

comercializam e almejam continuar com seu registro do Ministério da Saúde deverão

39

comprovar cientificamente em animais e em seres humanos tais propriedades (FUNARI;

FERRO, 2005; BENT, 2008).

Assim, os estudos não clínicos dos medicamentos fitoterápicos passaram a ser

exigidos. Esse fato levou diversos paises à edição de normas legais, subsidiando o

desenvolvimento de estudos científicos para comprovar a eficácia e a segurança desses

medicamentos (BRASIL, 2004a; BRASIL, 2004b). A norma estipula que os testes de

avaliação de risco sejam realizados em duas espécies de mamíferos, uma roedora e uma não

roedora, machos e fêmeas de linhagem isogênica, em número suficiente para garantir a

análise estatística dos resultados, sem exageros que infrinjam os “Princípios Éticos da

Experimentação Animal” (SCHNAIDER; SOUZA, 2013). Estabelece ainda a via de

administração a ser usada, doses e duração de tratamento, tendo por base os preconizados para

o uso do fitoterápico em humanos (BRASIL, 2014).

Em 2006, foi publicado o decreto que aprova a Política Nacional de Plantas

Medicinais e Fitoterápicos e dá outras providências, que tem o objetivo de garantir à

população brasileira o acesso seguro às plantas medicinais e fitoterápicos, promover seu uso

racional, o uso sustentável da biodiversidade, desenvolver a cadeia produtiva e a indústria

nacional. A Política foi formulada para atender a demandas dos setores públicos e privados e

traz importantes contribuições para a indústria farmacêutica, pois promove a utilização de

plantas medicinais e fitoterápicos no SUS. A política de fitoterápicos propõe as diretrizes

relacionadas: (i) ao fomento à pesquisa, desenvolvimento tecnológico e inovação, (ii) à busca

pela garantia da segurança, eficácia e qualidade dos produtos, (iii) à implantação de

plataformas tecnológicas com integração de cultivos e produção e (iv) à adoção de Boas

Práticas de Fabricação no processo Produtivo (BRASIL, 2006).

Segundo o Ministério da Saúde, plantas medicinais “são aquelas que possuem

uma história de uso tradicional como agente terapêutico. E o fato de uma planta ter entre seus

constituintes precursores químicos de fármacos não necessariamente a caracteriza como

planta medicinal. Possuir precursores de síntese não significa que a planta pode ser utilizada

na produção de medicamentos”. Os fitoterápicos são definidos como medicamentos cujos

componentes terapeuticamente ativos são exclusivamente plantas ou derivados vegetais

(extratos, sucos, óleos, ceras, etc.) (BRASIL, 2004b). A diferença entre planta medicinal e

fitoterápico reside no processo de elaboração que a planta sofre, no qual a elaboração

privilegia uma formulação específica, que o caracterizado como um fitoterápico. De acordo

com a Resolução RDC Nº. 48, de 16 de março de 2004, fitoterápico é “todo medicamento

40

tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais

com finalidades profiláticas, curativas ou para fins de diagnóstico, com benefício para o

usuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos do seu uso, assim como

pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade” (BRASIL, 2004b).

No Brasil estima-se que esse mercado gira em torno de US$ 160 milhões por ano.

E o fato de atração é o ritmo do crescimento das vendas internamente, mais de 15% anuais,

contra 4% dos medicamentos sintéticos (CARVALHO et al., 2008). O uso e o comércio

destes recursos foram estimulados pelas necessidades de uma crescente população que

demanda cada vez mais das plantas medicinais para o cuidado de sua saúde e para seus cultos

e tradições religiosas; em especial pela facilidade de acesso, devido aos custos elevados da

medicina ocidental, aos efeitos colaterais provocados pelos fármacos sintéticos, além do

crescente interesse nacional e internacional pelo potencial terapêutico e econômico que

representam e a demanda de novos produtos pela indústria farmacêutica (HOLTEZ et al.,

2002).

A segurança deve ser o principal critério na escolha de um fitoterápico. Com

relação aos fitoterápicos, a seleção criteriosa, análises químicas, ensaios clínicos e medidads

regulatórias restritivas devem ser seguidos e respeitados (SILVEIRA et al., 2008). Ensaios

clínicos controlados devem confirmar se esses medicamentos são realmente seguros para uso

a curto, médio e longo prazo. Não é eticamente aceitável, nem moralmente justificável

prescrever fitoterápicos sem a evidência científica de sua qualidade, eficácia e segurança.

Portanto, a pesquisa clínica cientificamente conduzida é necessária para proporcionar

informações adicionais aos pacientes (VEIGAJÚNIOR; MELO, 2008; BENT, 2008).

2.3 O USO DE MEDICAMENTOS NA GESTAÇÃO

A gestação é uma condição fisiológica na qual o metabolismo materno pode ser

influenciado por xenobióticos, que de alguma forma podem afetar o sucesso da implantação,

desenvolvimento e crescimento do feto (DARUICH et al, 2001). Nesse período, os

mecanismos metabólicos de alguns órgãos os tornam mais susceptíveis a lesões, de forma que

a função materna normal é indispensável para o desenvolvimento adequado do feto. As

características do concepto e sua capacidade de desenvolvimento e maturação são expressões

da capacidade de fertilização de células germinativas, concepção bem-sucedida e o

subseqüente desenvolvimento intrauterino. O desenvolvimento peri e pós-natal depende do

41

potencial de desenvolvimento do indivíduo e de sua habilidade de enfrentar variadas

circunstâncias ambientais (MELLO; LANGELOH, 2006).

A cada ano, em torno de 10 a 20 novos compostos químicas são lançadas no mercado.

Embora estas drogas sejam testadas em animais, normalmente, há pouca ou nenhuma

experiência na gravidez humana. A ausência de quaisquer dados humanos aumenta o risco.

Os agentes químicos aos qual o concepto está exposto durante o período de desenvolvimento

representam um risco potencial para a ocorrência de toxidade. O risco pode variar ou não só

em função da natureza e concentração do agente. Esse fator é dependente da interação do

mesmo com outros fatores como espécie, estado nutricional, e especialmente, susceptibilidade

individual. O agente pode ser embriotóxico levando a alteração reversível, sem consequências

tardias ao indivíduo, ou teratogênico, levando a alteração irreversível, podendo ou não causar

consequências que limitem a sobrevivência do indivíduo (HARBIRSON, 1980).

Cerca de 2-4% dos recém-nascidos nascem com anomalias congênitas (OAKLEY,

1986). Essa incidência é independente do uso de drogas durante a gravidez, pois menos de 1%

de anomalias congênitas são atribuídas à exposição de medicamentos prescritos na gestação

(BECKMAN; BRENT, 1987). Destes 99% restantes, cerca de 9% deve-se às condições

maternas, tais como diabetes, infecções ou o abuso de álcool, e em torno de 20-25% pode ser

genético e 65% de origem desconhecida (HANSEN; HARRIS, 2013).

Atualmente, dentre as milhares de drogas terapêuticas disponíveis no mercado, apenas

20 fármacos ou grupos de droga são "universalmente reconhecidos como teratógenos

humanos" (SCHARDEIN, 2000). Destes, um total de onze estão incluídos em apenas dois

grupos de drogas, os agentes anticancerígenos e anticonvulsivantes. O misoprostol quando

utilizado em doses elevadas podem ser abortivos (PIZZOL; KNOP; MENGUE, 2006), e

talvez o agente antifúngico fluconazol (PURSLEY et al., 1996). Os achados mais comuns em

estudos teratológicos são morte embrião/feto (abortos), retardo do crescimento fetal, e um

aumento da incidência de aberrações menores em estrutura e variações na ossificação do

esqueleto, mas nenhum aumento de malformações estruturais (WEBESTER; FREEMAN,

2001).

Aborto recorrente é definido como aquela gravidez em que ocorre mais ou menos 3

três perdas consecutivas, e tem uma incidência de 1% a 3%. Em 50% dos casos, os as causas

podem ser identificadas, os 50% restantes, no entanto, não apresenta uma causa definida

(RAI; REGAN, 2006) embora estudos tenham apontado um papel de estresse oxidativo na

etiologia da perda gestacional recorrente (AGARWAL et al., 2008). O aborto espontâneo

42

menciona a rescisão não intencional de uma gravidez antes da viabilidade fetal de 20 semanas

de gestação ou quando o peso fetal form menor que 500 g. Isso ocorre em 8% a 20% das

gestantes. (GUPTA et al., 2007). A etiologia é constituída principalmente de anormalidades

cromossômicas, que representam cerca de 50% de todos os abortos. Com relação aos defeitos

congênitos causas genéticas parecem ser responsáveis por 15-20% destes, fatores ambientais

são reconhecidamente responsáveis por 7%, 20% são de etiologia multifatorial mas em mais

de 50% dos casos a causa permanece desconhecida (RAI; REGAN, 2006).

No início dos anos 60, mais de 10 mil crianças, no mundo, nasceram com defeitos

congênitos graves devido ao uso da talidomida no início da gravidez (KOREN et al., 1989). A

gravidade dos efeitos da talidomida e os sistemas de órgãos afetados foram dependentes do

dia exposição na gestação. Por exemplo, exposição à talidomida em dias de gestação 34-38

causada polidactilia e anotia, mas a exposição em dias de gestação 42-47 focomelia

produzidos dos membros inferiores (HANSEN; HARRIS, 2013). Estes resultados

demonstram a importância do tempo de exposição aos agentes teratogênicos. Por outro lado,

estudos epidemiológicos têm contribuído pouco, pois somente a carbamazepina (ROSA,

1991) e o ácido valpróico foram descobertos a partir de um registo de defeitos congênitos

(ROBERT; GUIBAUD, 1982). A maneira acidental que os teratógenos humanos têm sido

descobertos não expressa a certeza que todos os teratógenos já tenham sido identificados.

Berkovitch et al. (2000) relataram os efeitos fetais da metoclopramida, comumente usados no

primeiro trimestre da gravidez para tratar náuseas e vômitos. A indicação, a exemplo da

talidomida, também era para tratar os sintomas de náuseas, durante a gravidez.

A segurança da talidomida não tinha sido devidamente testada, e os testes posteriores

em roedores, em sua maioria, não conseguiu demonstrar o potencial da talidomida para causar

defeitos de nascimento (SCHARDEIN, 2000). O fabricante negou responsabilidade e diante

disso, a população, em geral, ainda desconfia, no que concerne, a segurança apresentadas

pelos fabricantes de produtos farmacêuticos, o que acaba envolvendo um certo ceticismo

sobre a importância dos testes dos medicamentos em animais.

Nos estudos em animais, os teratógenos não demonstram efeito da dose (BRENT,

1983). Assim, a dose e tempo exato de exposição, bem como a duração da exposição são

considerações importantes. Agentes teratogênicos com altas taxas de efeito podem ser

rapidamente detectados. A talidomida foi detectada somente após quatro anos no mercado e a

isotretinoína após um ano. Cerca de 40 anos depois, ainda não se sabia, exatamente, como a

talidomida causava defeitos ao nascimento (STEPHENS; FILLMORE, 2000) e por que os

43

roedores não eram afetados. Por isso que, atualmente, as nova drogas são testadas tanto na

prenhez de roedores como na prenhez de coelhos, para melhor identificar o potencial

teratogênico. No entanto, a adequação dos testes e seus usos para prever se a droga é ou não

teratógeno humano, ainda permanece controverso. Isso deve-se, principalmente as diferenças

genéticas (SCHÜLER-FACCINI et al., 2001).

Há numerosos exemplos de animais experimentais e vários casos suspeitos em seres

humanos que demonstram existir diferenças genéticas na resposta a um teratógeno. A

fenitoína, por exemplo, é um teratógeno humano bem conhecido. Entre 5% e 10% dos

embriões expostos este anticonvulsivante apresenta a síndrome da hidantoína fetal.

Entretanto, cerca de um terço dos embriões expostos tem somente algumas anomalias

congênitas, e mais da metade do genótipo do embrião não é afetada. Parece, portanto, que o

genótipo do embrião não é afetado e este determinará se um agente teratogênico pertubará ou

não o seu desenvolvimento (HANSEN; HARRIS, 2013).

Normalmente, os roedores são utilizados nestes estudos, entretanto, devido às

diferenças genéticas entre as espécies, alguns estudos não foram bem sucedidos na

identificação de teratógenos humanos. Por exemplo, os corticóides, potentes teratógenos em

roedores, são considerados seguros para o homem, por outro lado, a talidomida, um

teratógeno potente para o homem, é seguro para a maioria dos animais. Desta forma, a

evidência definitiva de uma droga ser ou não teratogênica para os humanos só pode ser

comprovada no próprio homem (SCHÜLER-FACCINI et al., 2001).

Para se provar que um agente é um teratógeno, é necessário demonstrar que, nas

gestações nas quais as mães foram expostas ao agente (abordagem prospectiva), a frequência

de anomalias é maior do que a porcentagem de casos espontâneos, ou que crianças

malformadas tenham um histórico de exposição materna ao agente maior do que as crianças

normais (abordagem retrospectiva). É difícil obter ambos os tipos de dados de uma forma não

preconcebida. Os relatos de casos não são convincentes, exceto quando tanto o agente quanto

o tipo de anomalia são tão raros que sua associação em vários casos pode ser considerada uma

não coincidência (WEBSTER; FREEMAN, 2001).

O uso de medicamentos prescristos ou não durante a gravidez é surpreendentemente

alto. A maioria das mulheres grávidas consome pelo menos um medicamento durante a

gravidez. Apesar de somente 7% a 10% das anomalias serem causadas por teratógenos

identificados, novos agentes continuam a ser identificados. Com relação aos medicamentos

utilizados na gestação, as tetraciclinas que cruzam a membrana placentária e se depositam nos

44

ossos e nos dentes do embrião nos locais de calcificação ativa. Pode causar defeitos dos

dentes, por exemplo hipoplasia do esmalte e diminuição do crescimento dos ossos longos.

Foram relatados mais de 30 casos de deficiência auditiva e de danos ao oitavo nervo craniano

em crianças expostas a derivados da estreptomicina no útero (MOORE; PERSAUD, 2008).

A penicilina tem sido amplamente utilizada durante a gravidez, parecendo não causar

danos ao embrião e ao feto. A warfarina é indubitalvemente um teratógeno. O período de

maior sensibilidade fica entre 6 e 12 semanas após fertilização. Já a heparina não cruza a

mambrana placentária, por isso é a droga preferencial para as mulheres grávidas que

necessitam de tratamento com anticoagulantes (MOORE; PERSAUD, 2008).

Aproximadamente uma a cada 200 mulheres grávidas são epilépticas e necessitam de

tratamento com anticonvulsivante. A fenitoína é indubitavelmente um teratógeno. A síndrome

da hidantoína fetal ocorre 5% a 10% das crianças nascidas de mães tratadas com

anticonvulsivantes fenitoína ou hidantoína. O ácido valpróico era a droga preferencial para o

tratamento de diferentes tipos de epilepsia; entretanto, seu uso por mulheres grávidas tem

levado a um padrão de anomalias composto por defeitos craniofaciais, do coração e dos

membros. Há, também, um aumento do risco de defeitos do tubo neural. O fenobarbital é

considerado uma droga antiepiléptica segura para ser usada durante a gravidez (MOORE;

PERSAUD, 2008).

Os compostos químicos inibidores de tumores são altamente teratogênicos, pois estes

agentes inibem a mitose nas células que se dividem rapidamente. É recomendado que sejam

evitados, especialmente nos três primeiroas meses de gravidez. A isotretionina, usada para o

tratamento da acne cística grave, é um teratógeno humano, mesmo em doses muito baixas. O

período crítico para a exposição parece ser da 3ª a 5ª semana. É alto o risco de aborto

espontâneo e de defeitos congênitos após exposição ao ácido retinóico. O acompanhamento

pós-natal de crianças expostas no útero à isotretionina revelou deficiências neuropsicológicas

significativas. A talidomida é totalmente contra-indicada para mulheres em idade fértil.

Atualmente, com cuidados apropriados, a talidomida é utilizada para o tratamento da

hanseníase e as outras doenças por causa de suas atividades imunossupressoras (MOORE;

PERSAUD, 2008).

Estudo conduzido, recentemente por Hansen e Harris, (2013) demonstrou que algunas

teratógenos humanos induzem efeitos deletérios através de mecanismos envolvendo a geração

de espécies reativas de oxigênio (EROS) e estresse oxidativo, entretanto, as definições

clássicas do estresse oxidativo não coincidem totalmente com os princípios fundamentais

http://www.almedina.net/catalog/autores.php?autores_id=892








45

básicos da teratologia. Esse artigo de revisão demonstra exemplos de teratógenos que

induzem EROS e lesão oxidativa, e descrevem os mecanismos teratogênicos relacionados ao

estresse oxidativo, fornecendo justificativa aos períodos de desenvolvimento da sensibilidade

e susceptibilidade das espécies. Outro atigo de revisão também buscou na literatura disponível

os papéis de espécies reativas e estresse oxidativo nos processos fisiológicos reprodutivos

normais e anormais. No entanto, as investigações realizadas em animais ou em estudos in

vitro produziram resultados muito divergentes (AGARWAL et al., 2012).

Deve-se ressaltar que o uso de medicamentos na gestação, envolve uma

responsabilidade coletiva entre o médico (prescritor), o laboratório farmacêutico (fabricante),

os órgãos reguladores e, inclusive, a mulher gestante. Por exemplo, uma mulher, que durante

a gestação continua usando inibidores da ECA (enzima conversora de angiotensina) no

tratamento da hipertensão durante o segundo e terceiro trimestresa. Se ela engravidou, durante

o pré-natal, ela precisará mudar para um anti-hipertensivo não fetotóxicos antes do segundo

trimestre (CLAYTON, 1994). Para os medicamentos com suspeita de toxicidade conhecida na

gravidez, é de responsabilidade das empresas farmacêuticas, previsto em lei, informar, para

que os médicos possam avaliar o risco/benefício e informar ao paciente. “O medicamento só

deve ser usado durante a gravidez se os benefícios superam os riscos." Por exemplo, a malária

por ser uma doença letal, deve ser tratada durante a gravidez independente do potencial

teratogênico do medicamento (CLARK et al., 2004).

Bendectin foi retirado do mercado em 1983 com a empresa enfrentando mais de 300

ações judiciais que reivindicam os potenciais defeitos de nascimento 900 mil defeitos de

nascimento (BRENT, 1983; BRENT, 1995). Inibidores da ECA são os únicos teratógenos

humanos que parece exercer seu efeito apenas no segundo e terceiro trimestres, quando eles

afetam a função do rim fetal. Na verdade, inibidores da ECA não são realmente teratogênicos,

mas são fetotóxicos com efeitos farmacológicos conhecidos (hipotensão), causando danos

renais no feto. Existem medicamentos, que se tomados durante o primeiro trimestre, são tão

propensos a causar desenvolvimento anormal que o aborto torna-se a opção preferida

(WEBSTER; FREEMAN, 2001). A talidomida e isotretinoína são, provavelmente, os

teratógenos humano mais perigoso, afetando pelo menos 30% dos embriões expostos durante

o período suscetível; fármacos citotóxicos também podem afetar uma elevada proporção de

embriões. Para outros teratógenos humano, o risco é muito mais baixo, aumentando a taxa

normal de defeitos congênitos de 2-4% para 4-9% (WEBSTER; FREEMAN, 2001).

46

No entanto, nas bulas de medicamentos observa-se, frequente, o conflito entre

informações das bulas dos medicamentos e evidências científicas sobre o uso dos mesmos

durante a gestação e, também, no aleitamento (ANDERSON et al., 2003). Os medicamentos

oriundos de plantas são amplamente utilizados pela população mundial e possuem uma

extensa história no emprego à prevenção e tratamento de doenças, desde antes de Cristo

(OUEDRAOGO et al., 2012). Considerando que gestantes e lactantes constituem um grupo

populacional que culturalmente recorre ao uso de plantas medicinais, riscos para a gestante e

para o feto têm tornado constante a preocupação com o uso de fitoterápicos, não apenas no

período periconcepcional, mas durante toda a gravidez.

Nas últimas décadas observou-se a revalorização do emprego de preparações

fitoterápicas. Assim, alguns grupos farmacêuticos passaram a desenvolver esforços voltados

para o aprimoramento de medicamentos fitoterápicos e sua produção em escala industrial. O

novo avanço desses medicamentos, longe de ser volta ao passado, caracteriza-se pela busca de

produção em escala industrial, diferentemente das formas artesanais que caracterizavam os

estágios iniciais de sua utilização (TUROLLA; NASCIMENTO, 2006). A Organização

Mundial de Saúde (OMS) reconhece a importância do uso tradicional, mas para a utilização

de uma planta com finalidade terapêutica, em nível de saúde pública, é fundamental o

estabelecimento de sua segurança, eficácia e garantia de qualidade das preparações (RATES,

2001; WHO, 2002; LAPA et al., 2010).

A utilização dos produtos naturais e preparações fitoterápicas por gestantes, também,

podem gerar riscos a saúde, com graves conseqüências, tanto para a mãe como para o feto

(HANCOCK et al, 2008). Desta forma, embora raros, os estudos não clínicos de toxicologia

reprodutiva são importantes, devendo-se utilizar os mesmos cuidados, tanto para

medicamentos alopáticos como para fitoterápicos (WU et al., 2008). O período de gestação é

uma das fases mais sensíveis do ciclo reprodutivo e que resulta em repostas importantes.

Hoje, sabe-se que, nesse período, a maioria dos agentes atravessa facilmente a placenta e,

dessa maneira, pode-se considerar que a exposição materna a agentes externos, entre esses os

agentes químicos (xenobióticos), podem resultar em efeitos importantes sobre um organismo

passivo, alvo secundário desses agentes, que é o organismo embriofetal (DAMASCENO et

al., 2008).

Na utilização de qualquer medicamento durante a gestação, deve sempre ser levado

em conta a relação risco-benefício. Esse mesmo cuidado deve ser aplicado ao uso de plantas

medicinais. Assim, para cada situação específica, deve ser estabelecida uma relação risco-

47

benefício própria. Se para muitos medicamentos as informações disponíveis são escassas,

para as plantas medicinais essa escassez de dados é ainda mais acentuada. Na presença de

alguma informação que sugira risco para a gestação, medicamentos ou mesmo plantas

medicinais devem ser evitadas, até que evidências garantam seu uso seguro (MENGUE;

MENTZ; SCHENKEI, 2001).

Mengue et al., (2001) fizeram um levantamento na literatura sobre plantas com relatos

de ação abortiva ou com suspeita de qualquer outro risco para a gestação. Foram encontrados

relatos sobre Boldo (Coleus barbatus), Poejo (Cunila platyphylla), comigo-ninguém-pode

(Dieffenbachia picta), feto-macho (Dryopteris filix-mas), algodoeiro (Gossypium

barbadense), carapanauba (Himatanthus drasticus), agoniada (Himatanthus lancifolius), louro

(Laurus nobilis), bucha, bucha-do-norte, bucha-paulista, buchinha (Luffa operculata), melão-

de-são-caetano (Momordica charantia), pariparoba (Potomorphe umbellata), arruda (Ruta

graveolens), catinga-de-mulata (Tanacetum vulgare).

O levantamento de dados, divulgação das informações e estudos de toxidade ssão

ferramentas importantes para apresentar a população e diminuir, pelo menos em parte, a

crença que produtos naturais são desprovidos de efeitos tóxicos ou adversos (LAPA, 2001;

MARLIÉRE et. al., 2008; SILVEIRA et al., 2008; CUNHA et al., 2009; LAPA, 2010). Testes

realizados em roedores detectaram efeito carcinogênico e hepatotóxico dos vegetais ricos em

cumaria (LACY; O’KENNEDY, 2004). Com efeito, a escassez de dados sobre avaliação de

toxicidade reforça a necessidade de estudos dessa natureza que trazem grande contribuição

para utilização segura dos fitoterápicos pela população humana, além de detectar diferenças

significativas no pefil farmacocinético e farmacológico/tóxico, bem como os efeitos

sinérgicos/aditivos (WEBSTER; FREEMAN, 2001; OUEDRAOGO, 2012; WILLS et al.,

2012).

Em complemento aos estudos de toxicidade em animais, estudos epidemiológicos e

laboratoriais têm demonstrado que produtos vegetais podem exercer efeitos tóxicos pela

produção de metabólitos secundários, causando desde resistência vascular até

teratogenicidade em embriões de roedores (LATHER, 2011; OUEDRAOGO, 2012).

2.3.1 Embriologia humana e comparada

Segundo Almeida et al. (2000), fecundidade é a capacidade para a reprodução, ao

passo que fertilidade refere-se à concretização da reprodução, que pode ser avaliada pelo

48

produto final (número de indivíduos). Na mulher, a duração máxima da fertilidade é de varia

de 24 a 48 horas e a motilidade dos espermatozoides, após o coito, dura de 48 a 60 horas.

Enquanto isso, na rata a duração máxima da fertilidade é de 14 horas e a da motilidade de 17

horas. Na camundonga, a duração máxima da fertilidade é estimada em cerca de 6 horas e a

da motilidade em 13 horas. Tais dados demonstram o quanto é variável a duração da

fertilidade e da motilidade nas vias genitais das fêmeas das diferentes espécies (ALMEIDA,

2009).

A função reprodutora feminina pode ser dividida em duas fases principais: primeira, a

preparação do corpo feminino para a concepção e gestação; segunda, o período da própria

gestação (GOPINATH, 2013). A capacidade reprodutiva de uma fêmea envolve aspectos

variados de fisiologia reprodutiva, tal com, produção hormonal equilibrada, capacidade de

produção de gametas adequados, produção hormonal equilibrada, alterações morfológicas e

bioquímicas do oviduto e do útero, compatíveis com os processos de transporte

(espermatozóides e zigoto) e fases (precoces e tardias) do desenvolvimento do concepto

(GUERRA, 2002). Já o sucesso da gestação em mamíferos depende da manutenção de níveis

adequados de duas classes de hormônios esteróides sexuais, os progestogênios e os

estrogênios. As gestações em ratos e seres humanos exibem certas similaridades que não são

compartilhadas por todas as espécies de mamíferos. O intervalo entre o coito e a implantação

do blastocisto no útero tem duração similar, de quatro a seis dias, embora a gestação para o

primeiro seja de aproximadamente 22 dias, e para os seres humanos seja de aproximadamente

270 dias (ALMEIDA, 2009).

O útero humano apresenta um estreitamento inferior, o colo uterino ou cérvix, que se

abre na vagina. A única barreira física entre a vagina e o útero é um rolhão de muco cervical.

A abertura vaginal localiza-se posteriormente à abertura uretral (GOPINATH, 2013). O útero

nos roedores é um órgão em forma de Y. Ele consiste num par de alongados cornos uterinos

independentes entre si. Caudalmente, esses cornos são rodeados por musculatura, formando

um pequeno corpo uterino e logo abaixo deste corpo, encontra-se a cervix uterina (WALKER;

HOMBERGER, 1997). Os ovários constituem-se de uma massa sólida de células e tecidos,

dividindo-se em medula (no centro do ovário, e constituído de tecido conjuntivo altamente

vascularizado) e córtex (constituído por tecido conjuntivo denso e folículos, que envolvem os

oócitos) (GOPINATH, 2013).

Na mulher, logo após a ovulação, o folículo ovariano sofre colapso. Sob a influência

do LH, as paredes do folículo se desenvolvem em uma estrutura glandular, o corpo lúteo, que

49

secreta progesterona e alguma quantidade de estrogênio (STOUFFER, 2006). Se o ovócito é

fecundado, o corpo lúteo aumenta de tamanho e forma o corpo lúteo gravídico, aumentando

sua produção hormonal. A degeneração do corpo lúteo é impedida pela gonadotrofina

cariônica humana (hCG). No entanto, se o ovócito não é fecundado, o corpo lúteo involui e

degenera cerca de 10 a 12 dias após a ovulação, quando é chamado de corpo lúteo da

menstruação. Posteriormente o corpo lúteo é transformado em uma cicatriz branca no ovário,

formando o corpo albicans (corpo lúteo degenerado) (MOORE; PERSAUD, 2008).

Na mulher as variações cíclicas na secreção de gonadotrofinas estão na base das

transformações que ocorrem no ovário durante um ciclo mensal (ciclo menstrual). O ciclo

ovárico faz-se acompanhar de variações cíclicas na secreção de estradiol e progesterona que,

interactuando com o hipotálamo e hipófise, regulam a secreção de gonadotrofinas

(STOUFFER, 2006). A duração de um ciclo menstrual típico é de 28 dias, podendo variar

entre os 21 e os 35 dias. Já as fêmeas são animais poliéstricos, e o ciclo reprodutivo tem a

duração de cerca de 4 a 5 dias, e entre 4 a 12 oócitos são ovulados por ciclo (WALKER;

HOMBERGER, 1997).

O período gestacional varia nas diferentes espécies. Na mulher o período gestacional é

estimado em 9 meses ou 10 meses lunares, tendo início a fecundação e formação do zigoto e

término com o parto. A esse período é chamado de gravidez na mulher e de prenhez nos

animais. Embora os termos sejam sinônimos, no caso humano o primeiro se aplica com mais

propriedade. Assim, destaca-se o tempo de prenhez de alguns mamíferos utilizados em

estudos experimentais, roedores (camundonga – 19 a 21 dias; rata – 21 a 23 dias) e não roedor

(coelha – 30 a 32 dias) (ALMEIDA, 2009).

O desenvolvimento de mamíferos pode ser dividido em quatro fases: (1) período do

ovo. Inicia-se na fecundação e vai até à implantação, ocorrendo antes da segunda semana de

desenvolvimento em humanos e até o 6º dia em ratos (2) período embrionário, é o período

de pico em relação à divisão celular, diferenciação e morfogênese do embrião (período

principal de organogênese), com ínício da segunda à oitava semana pós-fecundação em

mulheres e 15º dia em ratas, (3) período fetal, correponde ao período em que o feto está

completamente formado, porém ainda há diferenciação do sistema nervoso central (SNC),

bem como crescimento ponderal do feto,compreende oito semanas completas pós-fertilização

até o término em mulheres e em ratas correponde do 16ª ao término, aproximadamente 23º

dias e por fim, o (4) neonatal, que ocorre apenas crescimento e maturação fisiológica. Vai do

até o 28º após o nascimento em humanos e até o 10º dia em ratos.



50

No contexto da biologia do desenvolvimento, é importante a compreensão dos

processos, detalhadamente, tanto em humanos como nos roedores. Na espécie humana, o sítio

de fecundação, normalmente, é a ampola da tuba uterina. Se o ovócito não for fecundado

neste local, ele passará lentamente pela tuba uterina em direção à cavidade do útero, aonde irá

se degenerar. Se houver fecundação (união de um espermatozóide e um ovócito), uma

complexa sequência de eventos moleculares, coordenados, ocorrem e termina com a mistura

dos cromossomos maternos e paternos na metáfase da primeira divisão mitótica do zigoto

(célula totipotente altamente especializada) (MOORE; PERSAUD, 2008).

O processo de divião mitótica que ocorre no zigoto denomina-se clivagem ou

segmentação (cerca de 30 horas após a fecundação). Dele resultam, inicialmente, duas células

filhas chamadas blastômeros. Continuando a clivagem, de duas células inicias originam-se

quatro. Após o estágio de oito células, os blastômeros mudam sua forma e se agrupam

firmemente uns com os outros, formando uma bola compacta e passa a ser chamado de

mórula (12 a 32 blastômeros) (MOORE; PERSAUD, 2008; ALMEIDA, 2009). Cerca de

quatro dias após a fecundação a mórula alcança o útero e após esse estágio, o concepto passa

a ser chamado de blastocisto. Cerca de seis dias após a fecundação, o blastocisto adere ao

epitélio endometrial.

No fim da primeira semana, o blastocisto está superficialmente implantado na camada

compacta do endométrio e obtém sua nutrição dos tecidos maternos. Após a liberação de

enzimas proteolíticas que erodem o tecido conjuntivo do endométrio, ocorre a implantação do

blastocisto dentro do endométrio, que se completa durante a segunda semana do

desenvolvimento embrionário (MOORE; PERSAUD, 2008). No rato, camundongo, e macaco,

o período de implantação compreende a primeira semana de prenhez (ALMEIDA, 2009). A

formação da placenta em humanos inicia-se no finl da primeira semana do desenvolvimento,

com a nidação. A placenta discoidal é o tipo encontrado nos primatas e nos roedores

(ALMEIDA, 2009).

Após, segue a gastrulação, processo formativo pelo qual o disco embrionário

bilaminar é convertido em um disco embrionário trilaminar. Esse processo é o início da

morfogênese (desenvolvimento da forma e estrutura de vários órgão e partes do corpo), que se

inicia com a formação da linha primitiva. Cada uma com três camadas germinativas

(ectoderma, mesoderma e endoderma) do disco embrionário dá origem a tecidos e ógãos

específicos: O ectoderma dá origem à epiderme, ao sistema nervoso, à retina e a muitas outras

estruturas e endoderma é a fonte de revestimentos epiteliais das vias respiratórias e do trato







51

gastrointestinal. Das células glandulares originam órgãos associados, tais como o fígado e o

pâncreas. Já o mesoderma, este, dá origem ao revestimento do músculo liso, aos tecidos

conjuntivos e aos vasos associados a tecidos e órgãos. Forma a maior parte do sistema

cardiovascular e dá origem às células sanguíneas e à medula óssea, aos ossos, aos músculos

estriados e a órgãos do sistema reprodutor e secretor (MOORE; PERSAUD, 2008).

O desenvolvimento embrionário é, essencialmente, um processo de crescimento e de

aumento crescente da complexidade estrutural e funcional. No final do período

organogenético, os principais sistemas de órgãos já começam a se desenvolver e todas as

principais estruturas internas e externas se estabelecem da quarta à oitava semana em

humanos e do 5º ao 15º dia de prenhez nas ratas. Esse período é marcado por uma série de

processos, definidos seqüencialmente, que vai desde a proliferação (reprodução somática das

células), a diferenciação e migração celular até a organogênese propriamente dita. É o período

de formação de órgãos rudimentares e a exposição a teratógenos durante esse período pode

causar grandes anomalias congênitas (MOORE; PERSAUD, 2008) (Figura 1).

No fim da oitava semana, o embrião apresenta características nitidamente humanas,

entretanto, a cabeça ainda é desproporcionalmente grande, constituindo quase a metade do

embrião. As pálpebras estão se fechando e, no fim da oitava semana, começam a uni-se em

fusão epitelial. Os pavilhões auriculares começam a assumir sua forma final, mas ainda

representa implantação baixa. O período fetal, que se estende da nona semana até o

nascimento, é caracterizado pelo crescimento e desenvolvimento das estruturas. Na rata se

estabelece do 16º dia de prenhez até o nascimento. Nos humanos, o sexo é claramente

distinguível na 12ª semana e os fetos são viáveis 22 semanas após a fecundação, mas suas

chances de sobrevivência não são boas até varias semanas mais tarde.

Para extrapolar efeitos do rato para o ser humano, é necessário usar as informações

disponíveis na literatura para reconhecer as semelhanças e também as diferenças da função

endócrina e reprodutiva entre mamíferos (GRAY et al., 2004). Durante a gestação, há

mudanças no sistema neuroendócrino com o intuito de se manter a saúde da mãe e de fornecer

condições ideais para o desenvolvimento fetal. Para que a gestação seja bem-sucedida, é

necessário que uma complexa seqüência de eventos adaptativos e mudanças hormonais, sejam

bem coordenadas (NOGUEIRA; LIBERMAN, 2002).

Os teratógenos só parecem ser capazes de causar anomalias após o início da

diferenciação celular; entretanto, suas ações iniciais podem causar morte do embrião, por

exemplo, durante as duas primeiras semanas do desenvolvimento. Ainda são obscuros os





52

mecanismos exatos pelos quais drogas, compostos químicos e outros fatores ambientais

perturbam o desenvolvimento do embrião e induzem anormalidades (WEBSTER; FREEMN,

2001). É errôneo presumir que as anomalias sempre resultam de um único evento ocorrido

durante o período crítico, ou que, usando tabelas, seja possível determinar o dia no qual a

anomalia foi produzida. Tudo o que se pode afirmar é que a perturbação do desenvolvimento

pelo teratógeno tem que ocorrer antes do término do período crítico do tecido, parte ou órgão

envolvido.

Ao considerar a possível teratogenicidade de um agente, como uma droga ou um

composto químico, três princípios importantes devem ser considerados: (1) os períodos

críticos do desenvolvimento humano, (2) a dosagem da droga ou composto químico e (3) o

genótipo (constituição genética) do embião (MOORE; PERSAUD, 2008).



53

Figura 1. Representação esquemática dos períodos críticos do desenvolvimento nos três períodos (implantação, embrionário e fetal).

Fonte: Retirado de Moore e Persaud (2008).



54

2.3.2 Toxicologia reprodutiva e legislação

Durante algum tempo, acreditou-se que o útero era intransponível a agentes externos e

que a placenta constituía-se em uma verdadeira barreira entre os organismos materno e fetal.

O conceito de “barreira placentária” foi abalado no início dos anos 60, pela “Tragédia da

Talidomida”, um medicamento comercializado como sedativo moderado, usado para diminuir

náuseas em mulheres grávidas. Defeitos significativos nos fetos foram causados com a

ingestão de uma única dose durante a gestação (SMITHELLS; NEWMAN, 1992).

Anomalias congênitas, defeitos ao nascimento e malfarmações congênitas são termos

usados frequentemente para descrever perturbações do desenvolvimento presentes no

nascimento. Defeitos ao nascimento é a principal cauda de mortalidade infantil e podem ser

estruturais, funcionais, metabólicas, comportamentais ou hereditárias. Uma anomalia

congênita é uma anomalia estrutural de qualquer tipo; entretanto, nem todas as variações são

anomalias. Variações anatômicas são comuns e a anomalias congênitas são classificadas em

quatro tipos: malformações, dirupção, deformação e displasia (MOORE; PERSAUD, 2008).

Essas anomalias podem ser resultantes de fatores genéticos ou ambientais, podendo ser

também, pela combinação destes dois fatores, apresentando uma etiologia multifatorial.

Podem existir dois fatores genéticos: o gênico, envolvendo a herança dos genes que causam a

anomalia e o cromossômico, abordando as aberrações cromossômicas representadas pelo

número anormal de cromossomos. Entre os fatores ambientais existem os agentes infecciosos,

como por exemplo, o vírus da rubéola, citomegalovírus e o parasita Toxoplasma gondii; os

agentes químicos, envolvendo fármacos, por exemplo, talidomida, ácido retinóico, álcool e

ácido valpróico; e os agentes físicos, como raios-X e radiação atômica (FAVERO, 2006).

O interesse pelas malformações congênitas data tempos históricos, desde a antiga da

civilização. Naquele tempo, a explicação para tal fato seria que estas “teras”, designados de

monstros, estavam relacionadas a um evento mitológico ou, principalmente, à punição dos

pecados (GILDEN; BODEWITZ, 1991). No entanto, as malformações nunca despertaram

interesse pela comunidade científica, pois os cientistas se detinham, praticamente, à

incidência de malformações em condições de laboratório e, só esporadicamente, estas

alterações eram associadas às situações cotidianas, por exemplo, com a exposição ao vírus da

rubéola e à radiação. Foi o desastre da talidomida que alterou o curso dessas pesquisas e,

desde então são muitos os laboratórios e pesquisadores mobilizados no estudo destes efeitos

tóxicos (ROGERS; KAVLOCK, 2001).



55

Toxicologia reprodutiva é um termo é recente, uma área do conhecimento

relativamente nova, que tem suas raízes fortemente relacionadas à teratologia. É uma das

áreas mais complexas da toxicologia preditiva. A complexidade se deve, em parte, à própria

natureza e duração do processo reprodutivo. Entende-se por reprodução o processo biológico

que assegura a continuidade das espécies, possibilitando que o material genético existente seja

passado às gerações seguintes. Portanto, o ciclo reprodutivo não consiste apenas na

concepção, gravidez e nascimento, mas tem início com a produção de gametas nos pais (ainda

no período pré-natal do organismo parenteral), seguindo pela fertilização e desenvolvimento

embriofetal, nascimento e desenvolvimento pós-natal até a maturidade sexual, quando o

descendente adulto torna-se capaz de procriar (MOORE; PERSAUD, 2008).

A toxicologia reprodutiva avalia os efeitos toxicológicos de determinadas substâncias

sobre a prole. Por exemplo, busca identificar se um medicamento, utilizado por mulheres

gestantes, poderá causar danos à saúde da mãe ou do feto. A Food and Drugs Administration

(FDA) preconiza a realização de testes de toxidade reprodutiva para avaliar os efeitos de uma

substância química sobre o processo de reprodução dos mamíferos. Esses ensaios, geralmente,

compreendem a exposição de animais sexualmente maduros antes da concepção, durante o

desenvolvimento pré-natal e após o nascimento e, continuadamente até sua maturação sexual,

dependendo do protocolo experimental.

Os estudos nesta área incluem malformações estruturais, retardo no crescimento, dano

no desenvolvimento e a morte do organismo, se preocupa também, com o estudo da cinética,

mecanismo de ação tóxica, patogênese e as conseqüências da exposição aos agentes tóxicos

ou condições que levem ao desenvolvimento anormal do animal (ROGERS; KAVLOCK,

2001). O processo de caracterização de muitos dos mecanismos de teratogênese incluem

mutação, aberração cromossomal, interferência na mitose, alteração da integridade e da

função do ácido nucleico, falta de precursores do metabolismo, alterações do metabolismo

intermediário, inibição enzimática, alteração do equilíbrio osmolar e mudanças nas

características das membranas (BRENT; BECKMAN, 1990).

A toxicologia reprodutiva se subdivide em toxicologia pré e pós-natal (PETERS,

1998). Desta forma os estudos nessa área têm que ser igualmente abrangentes para que se

possam detectar diferentes tipos de agravos nas diferentes fases do ciclo reprodutivo. No

Brasil, a RE nº 90 da ANVISA, de 16 de março de 2004, regulamentou os testes não clínicos,

inclusive o de toxidade reprodutiva (BRASIL, 2004; BRASIL, 2013). Em 31 de janeiro de

2013 foi publicado um novo guia, “Guia para a condução de estudos não clínicos de



56

toxicologia e segurança farmacológica necessária ao desenvolvimento de medicamentos”, que

trata dos ensaios a serem realizados, tais como toxidade de longo prazo (carcinogenicidade),

efeitos na reprodução e prole em duas gerações sucessivas (teratogênese, neurotoxidade

tardia, entre outros). Esse guia estipula que os testes de toxidade para avaliação de risco de

um novo medicamento sejam realizados em no mínimo duas espécies mamíferos, sendo uma

delas não-roedora (BRASIL, 2013). Os estudos em reprodução são considerados de longo

prazo e em geral, a positividade de um destes testes, em qualquer espécie, exclui a utilização

do produto na espécie humana, durante a gravidez (LAPA et al., 2010).

Os estudos de toxidade reprodutiva consistem em ensaios realizados em animais,

objetivando verificar o potencial de um xenobiótico provocar efeitos adversos sobre o

processo reprodutivo, incluindo a fertilidade, o desenvolvimento embriofetal,

desenvolvimento pós-natal dos descendentes até a maturidade sexual. Desta forma os estudos

de toxidade reprodutiva têm que ser igualmente abrangentes para que se possam detectar

diferentes tipos de agravos nas diferentes fases do ciclo reprodutivo (ROGERS;

KALVLOCK, 2001).

A gestação em mamíferos pode ser dividida em três períodos: pré-implantação,

organogênese e fetal (FRITZ; GIESE, 1990). A fase de pré-implantação compreende o

período que vai desde a fecundação até a implantação do blastocisto no útero, na espécie

humana, esse período vai até o 17º dia pós-fecundação, enquanto que em ratos e

camundongos, até o 6º dia (FRITZ; GIESE, 1990). Esta fase é caracterizada pela presença de

células totipotentes em divisão e a exposição a um agente tóxico pode impedir a implantação

do blastocisto no útero (ROGERS; KALVLOCK, 2001). A redução do número de células no

embrião, durante essa fase, pode induzir retardo na formação do blastocisto (KOLA; FOLB,

1986) e, conseqüentemente, aumento nas perdas pré e pós-implantação (LEMÔNICA et al.,

1996). Segundo Almeida e Lemônica (2000), a taxa de perda pré-implantação é a correlação

entre o número de ovos liberados e aqueles que, depois de fecundados, conseguiram ser

implantados no útero. Já a perda pós-implantação refere-se à relação entre o número de

blastocistos implantados e aqueles que não conseguiram se desenvolver. Ao blastocisto

implantado, que não conseguiu se desenvolver dá-se o nome de “reabsorção” e isso indica

falha no desenvolvimento do embrião.

Após a implantação, inicia-se a fase de organogênese, que na espécie humana vai do

18º ao 57º dia de gestação, e no rato, do 7º ao 14º. Esse período é caracterizado por uma

intensa proliferação e migração celular, remodelamento tissular e formação rudimentar das

57

estruturas do corpo. É o período de maior susceptibilidade, à ação de agentes teratogênicos e

embriofetotóxicos, no qual o maior número de malformações pode ser induzido, sendo

considerado o período teratogênico clássico (BRENT, 1993). Após esta fase, dá-se início a

terceira fase, conhecida como fase fetal, caracterizada por diferenciação e crescimento

tissular, maturação fisiológica dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto.

Compreende o período que vai do 57º dia pós-fertilização até o término em humanos, e do 16º

ao 21º em ratos (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS; KALVLOCK, 2001). Nesse período, a

sensibilidade frente a malformações anatômicas é extremamente baixa, porém a exposição a

agentes químicos pode produzir morte celular e inibição da divisão celular. Essas alterações

podem interferir com a formação dos sistemas nervoso, endócrino e imunológico,

promovendo desordens funcionais e de comportamento (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS;

KALVLOCK, 2001).

O guia da ANVISA (BRASIL, 2013) foi criado baseando-se em documentos de

agências reconhecidas pela vigilância sanitária de medicamentos (FDA, EMEA), instituições

de Harmonização (ICH, OECD) e de interesse na área (NCI, WHO), visando a orientação de

empresas/pesquisadores sobre como realizar estudos não clínicos de segurança, durante o

desenvolvimento de medicamentos. A EMA (European Medicines Agency) e a FDA

apresentam notória experiência internacional na área de regulação e vigilância sanitária de

medicamentos, sendo o FDA o órgão responsável pelo controle de alimentos e drogas no

território americano e a A EMA responsável pela proteção e promoção da saúde pública e

animal na União Européia. A seleção das instituições de harmonização deve-se ao fato de

seus guias serem reconhecidos, introduzidos e referenciados por agências reguladoras de

vários países (como Canadá, Austrália, Estados Unidos, União Européia). A ICH

(International Conference on Harmonisation), que é umas conferências de harmonização

agências reguladoras e indústrias dos Estados Unidos, Europa e Japão, discutem cientifica e

tecnicamente procedimentos necessários à avaliação da segurança, qualidade e eficácia dos

medicamentos. A OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) é um

grupo composto por trinta países membros que produz acordos, decisões e recomendações

internacionais em áreas onde acordos multilaterais são necessários para que países, na esfera

individual, possam contribuir para a progressão da economia globalizada.

Os estudos mais utilizados para essas avaliações são divididos em três segmentos e são

adaptados de normas da US EPA (Environmental Protection Agency) e recomendados pela

FDA e OECD (Figura 2).

58

Figura 2. Esquema geral. Segmentos I, II e III dos estudos de toxicologia reprodutiva.

O segmento I refere-se à toxidade crônica, avaliando os efeitos sobre a fertilidade de

machos e fêmeas, sendo os machos tratados antes e durante o acasalamento e as fêmeas

durante a gestação e lactação; o segmento II avalia a teratogenicidade, como possíveis

alterações no desenvolvimento da progênie exposta durante a fase de organogênese; segmento

III, de toxidade peri e pós-natal, avalia efeitos sobre o desenvolvimentos pré e pós-natal de

progênies expostas durante as fases de desenvolvimento fetal e lactação.

Os testes de avaliação da toxidade reprodutiva, geralmente, compreendem a exposição

de animais sexualmente maduros antes da concepção, durante o desenvolvimento pré-natal e

após o nascimento e, continuadamente até sua maturação sexual (LEMÔNICA, 2001). Os

estudos podem avaliar uma ou mais gerações, dependendo da carasterística química do agente

(OECD, 2001; BRASIL, 2013).

Os sinais clínicos, evidentes, de toxidade materna, resultante da morte ou redução no

ganho de peso corporal também são avaliados (CALLIARI-MARTIN, 1998). A avaliação

ponderal da gestante é um dos parâmetros mais relevante, isso porque, avalia de modo

indireto o grau de comprometimento materno e fetal. Segundo Lyra et al. (2005) a perda de

massa corporal é um dos principais indicadores de toxidade materna, pois o ganho de peso

insuficiente pode acarretar a restrição de crescimento intra-uterino (SCHWAREZ et al.,

59

1996). Com relação à escolha da dose, alguns critérios deverão ser seguidos: utiliza-se uma

dose que produza efeitos tóxicos, outra em que os animais não manifestem qualquer alteração

de toxidade e outra, intermediária entre estas. A substância a ser testada deverá ser

administrada, no mínimo, da implantação à cesariana. Um dia antes do parto, as fêmeas são

submetidas à cesariana, avaliando-se o número de corpos lúteos, nº de implantações, com

fetos e placentas pesados e, a seguir, metade da prole utilizada para avaliação esquelética e a

outra metade para pesquisa de anomalias viscerais (OECD, 1996; US EPA, 1996; OECD,

2001).

A avaliação da performance reprodutiva materna é um dos principais parâmetros

utilizados nos protocolos convencionais de avaliação de toxidade do desenvolvimento. Esta

avaliação permite verificar com maior precisão e profundidade, se a subatância avaliada e o

seu principal metabólito produz efeitos tóxicos, não só diretamente no organismo fetal, mas

também na fisiologia reprodutiva da fêmea, o que poderia levar aos efeitos tóxicos no feto

(US EPA, 1996). A maior limitação de muitos protocolos de avaliação de toxidade é que não

há exame de filhotes, em nenhuma fase pós-natal, o que, na maioria das vezes, poderá levar a

erros no julgamento sobre o efeito teratogênico da substância testada (CLAUDIO et al. 1999).

Por exemplo, algumas substâncias podem causar aumento de morte pós-natal, depois

de algumas semanas de nascimento, podendo produzir outro efeitos, que serão visualizados

somente após o nascimente, como a catarata, por exemplo, que se manifesta somente após o

21º dia de vida (NAROTSKY; KAVLOCK, 1995). Além disso, há outra crítica relevante aos

protocolos de avaliação de toxidade do desenvolvimento, refere-se à carência de dados

toxicocinéticos, antes de se realizar estes testes, ficando bastante subjetiva a escolha das três

doses do xenobiótico a ser avaliado, bem como do comportamento cinético da substância em

estudo (CLAUDIO et al. 1999).

Por outro lado, segundo os dados da REACH (Registration, Evaluation, and

Authorization of Chemicals) da União Européia, estima-se que 54% dos custos dos

medicamentos são utilizados em ensaios de toxicidade reprodutiva e do desenvolvimento

(PIERSMA, 2006). Os maiores custos estão associados com ensaios de duas gerações em

ratos, que custa na faixa de 500 a 750 mil dólares. Os ensaios que envolvem apenas

toxicidade do desenvolvimento são relativamente mais baratos, em cerca de um décimo do

custo, que os estudos que envolvem duas gerações (SCIALLI, 2008). O cumprimento dos

requisitos dos testes com animal poderia resultar no uso de quase 22 milhões de animais

vertebrados para o registo de produtos químicos existentes e um custo de até várias centenas

60

mil dólares por substância registada. Os gastos e o uso de animais poderiam ser reduzido pelo

uso de testes in vitro, modelos quantitativos da relação estrutura- atividade, e agrupamento

substâncias de relacionados. No entanto, embora a REACH incentive, intensamente, os

métodos que evitem os testes em animal vertebrado os testes in vitro ou análise quantitativa

da relação estrutura-atividade não são capazes de substituir a toxidade reprodutiva e do

desenvolvimento do animal (SCIALLI, 2008).

Enquanto novas informações surgem sobre a origem das desordens do

desenvolvimento, resultante da exposição perinatal de substâncias químicas, há uma grande

preocupação relativa à adequação dos protocolos existentes ao aferir os potenciais riscos da

exposição às diversas substâncias químicas, durante o desenvolvimento. Embora existam

pequenas variações nos protocolos de avaliação de risco de toxicologia pré-natal, entre as

agências de regulamentação, de maneira geral, estas requerem, para o teste, um grupo de

animais controle, e no mínimo, outros três, nos quais receberão as diferentes doses da

substância química a ser avaliada (US EPA, 1996; OECD, 2001; BRASIL, 2013).

O leite materno é uma mistura complexa cuja composição é dependente das

atividades de secreção da glândula mamária e dos processos de transporte nela existente,

refletindo as necessidades nutricionais dos neonatos mamíferos (MCMANAMAN;

NEVILLE, 2003). No entanto, o leite pode também ser uma via de excreção materna de

substâncias tóxicas (BEGG et al., 2002). De fato, diversas substâncias químicas são capazes

de serem transferidas pelo leite, representando uma importante fonte de intoxicação do

neonato. Como exemplos, estão algumas toxinas encontradas em plantas, como alcaloides

pirrolizidínicos e ptaquilosídeos (MEDEIROS; GÓRNIAK; GUERRA, 1999) e alguns

contaminantes ambientais como o mercúrio e o chumbo (ROZMAN; KLAASSEN, 2001).

Por outro lado, a despeito da grande importância da excreção de vários xenobióticos

no leite e suas prováveis consequências na saúde do neonato, surpreendentemente, muito

pouca atenção tem sido dada à toxicologia do desenvolvimento pós-natal e a exposição aos

diferentes agentes tóxicos pelo leite (FLEISHKER, 2002). De fato, Loebstein, Lalkin e Koren

(1997) apontam que há grandes lacunas nas informações sobre a transferência para o leite, em

humanos e animais, de substâncias químicas, bem como a extensão da exposição do lactente

aos xenobióticos.

A toxidade de plantas medicinais e medicamentos fitoterápicos é um grave problema

de saúde pública. Os efeitos adversos, possíveis alterações e toxidez, bem como a ação

sinérgica (interação com outras drogas) ocorrem comumente. As pesquisas realizadas para a

61

avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes,

assim como o controle da comercialização pelos órgãos oficiais em feiras livres, mercados

públicos ou lojas de produtos naturais (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005). O uso popular e

mesmo o tradicional, não são suficientes para validar, eticamente, os produtos naturais como

eficazes e seguros. Nesse sentido, eles não se diferenciam de qualquer outro xenobiótico

sintético. Sua preconização ou autorização oficial do seu uso medicamentoso deve ser

fundamentada em evidências experimentais comprobatórias e a segurança do seu uso deve ser

comprovada, inclusive, durante o período gestacional (SIMÕES et al., 2000).

Alguns estudos de toxicologia reprodutiva tem sido realizados no Brasil, como o

estudo realizado por Lyra et al. (2005), que avaliaram o efeito tóxico, em ratas prenhas, do

óleo de sementes de neem (Azadiracha indica A. Juss), utilizado na medicina popular como

repelente. Esse estudo não demonstrou toxidade materna e efeito anti-implantação; contudo,

houve a redução de massa corporal fetal, que pode indicar possível embriofetotoxidade.

Almeida e Lemônica (2000) observaram que o tratamento com 880 mg/kg de Coleus

barbatus durante o período de pré-implantação apresenta efeitos que justificam o uso popular

da referida planta, de efeito abortivo. A exposição neste período também interfere no

deenvolvimento embriofetal. Aragão et al. (2009) avaliaram a toxidade reprodutiva, em ratas

wistar prenhes, tratadas por via oral, nas doses de 250 mg/kg e 500 mg/kg, com extrato seco

de Cassia occidentalis L., não sendo observado diferenças estatísticas significativas, contudo,

foi observado a presença de natimortos nas duas doses utilizadas, indicando que sua utilização

não deve ser recomendada durante o período gestacional.

Borges et al. (2005) avaliaram a toxidade do Hypericum perforatum (erva de São

João), administrado em ratas, no período de organogênese, não sendo apresentadas

manifestações tóxicas para ratas prenhas, nesse período. Uma preparação fitoterápica, Kava

Kava® (Piper methysticum Forst) também foi avaliada quanto a sua toxidade sistêmica e

reprodutiva, não sendo observado, hepatotoxidade, toxidade sistêmica, reprodutiva nem o

aparecimento de teratogenicidade na dose de 35 mg/kg (PINTO, 2004).

A diferença genética, entre as espécies, faz com que se torne necessário, a utilização

de mais de uma espécie nos ensaios de toxicologia reprodutiva (MENGUE et al., 2001;

BRASIL, 2009d). O estudo realizado por Van-Cauteren et al. (1987) utilizou três diferentes

espécies de animais (ratos, coelhos e camundongos) nos ensaios, possibilitou observar as

diferentes respostas toxicológicas a cada espécie. Outro fator importante é o período

gestacional exposto a esse agente, pois, a susceptibilidade de cada órgão a uma determinada

62

anomalia ou malformação dependerá da etapa em que se encontra o desenvolvimento, de

forma que o concepto seja sensível a diferentes períodos (CALLIARI-MARTIN, 1998;

ROGERS; KAVLOCK, 2001).

2.4 O GÊNERO COPAIFERA

As árvores de copaíba são nativas da região tropical da América Latina e também da

África Ocidental. Na América Latina são encontradas espécies na região que se estende do

México ao norte da Argentina (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002). O gênero Copaifera possui

106 espécies, sendo 24 destas endêmicas do Brasil (THE PLANT LIST, 2013; QUEIROZ,

MARTINS-DA-SILVA, COSTA, 2014). Entre as espécies mais abundantes, destacam-se: C.

officinalis L. (norte do Amazonas, Roraima, Colombia, Venezuela e San Salvador), C.

guianensis Desf. (Guianas), C. reticulata Ducke, C. multijuga Hayne (Amazônia), C.

confertiflora Benth (Piauí), C. langsdorffii Desf. (Brasil, Argentina e Paraguay), C. coriacea

Mart. (Bahia), C. cearensis Huber ex Ducke (Ceará) (PIO-CORRÊA, 1931; MORS; RIZZINI,

1966).

São árvores de crescimento lento, que podem viver até 400 anos. Medem de 25 a 40

metros de altura com casca aromática, folhagem densa, flores pequenas, frutos secos, do tipo

vagem monospérmica e deiscente. O tronco é áspero, de coloração escura, medindo de 0,4 a 4

metros de diâmetro e os canais secretores estão presentes na região cortical dos caules,

dispostos de modo que se prolonguem até o lenho, tornando-se abundante e formando bolsas

(SILVA et al., 2008). As folhas são alternadas, pecioladas e penuladas e os frutos contêm uma

semente ovóide, envolvida por um arilo amarelo, rica em lipídios (RIGAMONTE-

AZEVEDO, 2004). As flores são pequenas, apétalas, hermafroditas e arranjadas em panículos

axilares, com floração a partir dos cinco anos de idade, em plantios (SILVA et al., 2008). A

identificação botânica utilizando as características das flores da copaíba é difícil, dado o curto

período em que ocorrem e a elevada altura das árvores (TAPPIN et al., 2004).

Todas as espécies de copaifera spp. produzem um óleoresina no interior do tronco,

chamada de óleo de copaíba (SALGADO et al., 2001; FERREIRA et al., 2004; ISAIAS et al.,

2008). Por esse motivo, a árvore é popularmente conhecida como pau-de-óleo, árvore do óleo

diesel, árvore de depósito, bálsamo de copaíba (MACIEL et al., 2002; ALMEIDA et al.,

2006), copaíba vermelha, copaibeira, oleiro, podoi, cupaúba, cupiúva (FREITAS;

OLIVEIRA, 2002; FERREIRA et al., 2004; PINTO et al., 2004; LIMA NETO et al., 2008),

63

copaibeira de minas ou copaíba da várzea (GUERRA et al., 2006; MARTINS et al., 2008).

Chamada pelos indígenas de copaíva ou copahu, a origem do nome copaíba vem do tupi,

Kupa’iwa e kupa’u, que significa a árvore de depósito, ou que tem jazida, em alusão ao óleo

que guarda em seu interior (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002).

Esse produto é de grande destaque pela larga indicaçäo popular e tradição de uso, com

açäo anti-inflamatória e cicatrizante, sendo sua administração, principalmente por via oral. No

entanto, na literatura diversos estudos já foram realizados sobre a composição e conservação

de sementes das espécies C. multijuga (FAÇANHA; VARELA, 1986; GARCIA; LIMA,

2000) e C. langsdorfii (OLIVEIRA; QUEIROZ, 1995) e, atualmente, diversos trabalhos de

investigação fitoquímica têm sido realizadas em outras partes da planta, tal como semente e

folhas (VEIGA-JÚNIOR et al., 2006; CHEN et al., 2009.; SOUZA et al., 2012; SENEDESE

et al., 2013; TRINDADE et al., 2013).

Alves et al. (2012) estudaram o extrato hidroalcoólico da folha de C. lansdorffii

avaliado quanto ao potencial genotóxico e a sua influência sobre a genotoxicidade induzida

pelo quimioteráico doxorubicina usando o teste do micronúcleos no sangue periférico de

ratos Swiss. A análise por HPLC quantificou os dois principais heterosídeos flavonóides,

quercitrina e afzelina . Os resultados demonstraram que o extrato da folha de C. Lansdorffii

não foi genotóxico, e sugeriram que a atividade antioxidante deve-se existência de um ou

mais compostos ativos no extrato.

No entanto, o conhecimento tradicional é atribuído principalmente ao óleo da copaíba,

que vem desde o Brasil seiscentista com o Padre José de Anchieta citando seu efeito

cicatrizante. Após, passou a constar na farmacopéia britânica em 1677 e na americana em

1820, dada a tamanha importância deste óleo pelos pesquisadores da época. Em 1929 foi

publicada a primeira edição da Farmacopéia Oficial Brasileira, formalizada em uma

convenção médica, e nela foram incluídas algumas espécies nativas descritas por naturalistas,

que observaram suas propriedades (MAIMOM, 2000). Atualmente, esse óleo é

comercializado em farmácias e lojas de produtos naturais de todo o país, com indicações

diversificadas, sendo muito utilizado no contexto da medicina natural.

O óleo de copaíba provém de canais esquizolizígeos, que são secretores, localizados

em todas as partes da árvore. São canais formados pela dilatação de espaços intercelulares

(meatos). O caráter mais saliente desse aparelho está no lenho, onde os canais longitudinais,

distribuídos em faixas concêntricas, nas camadas de crescimento demarcadas pelo

parênquima terminal, reúnem-se com traçados irregulares em camadas lenhosas muitas vezes

64

sem se comunicarem (CASCON, 2004). É produzido e secretado por glândulas especiais

localizadas no caule, sendo armazenado em cavidades intercelulares da árvore (OLIVEIRA et

al., 2006; ANDRADE, 2008; ISAIAS et al., 2008).

Alencar (1982) afirma que algumas árvores praticamente não exudam óleo ou o fazem

em quantidades muito pequenas para coleta (o que os mateiros chamam de “árvores macho”).

Nas espécies de Copaifera spp. as concentrações das substâncias podem variar em função da

temperatura, radiação solar, precipitação pluviométrica, quantidade de nitrogênio no solo e

outros. No entanto, Langenheim (1994) afirma que a composição química parece ser mais

sensível a fatores bióticos externos, tal como: a injúria provocada por insetos ou fungos do

que a própria luminosidade.

No entanto, estudo recente conduzido por Barbosa et al. (2012) demonstrou que a

variação na composição parece também depender do tipo de solo. Os outros fatores

(sazonalidade, diâmetro à altura do peito- DAP) estudados não demontraram nenhuma

influência significativa sobre a composição química e os fatores abióticos dos óleos de

dezesseis amostras de óleoresina Copaifera multijuga Hayne. Oliveira et al. (2006) e Ramos

(2006) afirmam que diversos fatores podem ser atribuídos a variações na composição

química, como a coexistência de várias espécies no mesmo local de coleta, fatores biológicos

como insetos e fungos, ou fatores abióticos (luminosidade, solo e concentrações de

nitrogênio).

Segundo Brito et al. (2005), em condições patológicas, há exudação das árvores de

Copaifera, o qual funciona como defesa da planta contra animais, fungos e bactérias.

Vasconcelos et al. (2008) afirma que do ponto de vista biológico, é um produto de excreção

ou desintoxicação do organismo vegetal. Do ponto de vista químico, é um produto do

metabolismo secundário do vegetal (terpenóides) (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). Os

isoprenoides (isopreno e os terpenoides) protegem a planta contra agentes abióticos, tais como

a oxidação, ao extinguir espécies de oxigênio reativas e ao reagir com o ozônio (O3) da at-

mosfera (LORETO et al., 2001). Além disso, protegem a planta do calor ao reduzir espécies

de oxigênio reativas produzidas por altas temperaturas, protegem as plantas de

microorganismos e repelem insetos (COPOLOVICI, et al., 2005; HUANG et al., 2012;

PINTO-ZEVALLOS et al., 2013).

Estes constituem uma grande variedade de substâncias vegetais, sendo este termo

empregado para designar todas as substâncias cuja origem biossintética deriva da unidade do

isopreno (pirofosfato de isopentila = IPP). A unidade isoprênica, por sua vez, origina-se a

65

partir do ácido mevalônico ou do metileritritol fosfato. Os esqueletos carbônicos dos

terpenóides, por sua vez, são formados pela condensação cabeça-cauda de um número

variável de unidades isoprênicas (SANTOS, 2004) (Figura 3).

Figura 3. Formação de terpenóides via condensação de unidades de isoprenílicas derivadas de duas

rotas bioquímicas: Ácido mevalônico ou Metileritritol fosfato.

Fonte: DEWICK, 2009.

No citoplasma, a rota do mevalonato (MVA) produz IPP a partir de moléculas

utilizando a acetil coenzima A. A enzima farnesil pirofosfato sintase catalisa a formação de

duas moléculas de IPP e uma de DMAPP para formar farnesil pirofosfato (FPP), o precursor

dos sesquiterpenos (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). O óleo de copaíba é uma exudato

constituído por ácidos resinosos e compostos voláteis, tendo como designação óleoresina

(VEIGA-JUNIOR et al., 2005). A fração de óleo essencial é composta basicamente de

66

sesquiterpenos, predominante na maioria deles, e a fração resina de ácidos diterpênicos

(VEIGA-JÚNIOR. et al., 1995). É produzido e secretado por glândulas especiais localizadas

no caule, sendo armazenado em cavidades intercelulares da árvore (OLIVEIRA et al., 2006;

ANDRADE, 2008; ISAIAS et al., 2008).

A existência d e mais de 20 espécies de Copaifera no Brasil, facilita a

ocorrência de um mistura de óleoresinas, decorrentes de diversas espécies presentes na área

de coleta. Na literatura é descrito a ocorrência de variabilidade na composição química dos

óleoresinas (VEIGA-JÚNIOR, 2002; CASCON; GILBERT, 2000). Essa variação pode

decorrer em relação à concentração e natureza dos diterpenos e sesquiterpenos presentes

(VEIGA-JUNIOR et al., 2005; RAMOS, 2006). Entre os sesquiterpenos α-copaeno e δ-

cadineno foram os principais compostos de oleoresina de C. martii (ZOGHBI et al, 2007. ); β-

cariofileno, β-selineno e β-bisaboleno em C. duckei (LAMEIRA et al., 2009), β-bisaboleno,

trans-α-bergamoteno em C. reticulata do estado Pará (ZOGHBI et al., 2009a,b), β-cariofileno,

β-selineno e β-bisaboleno em C. reticulata do estado do Amapá (ZOGHBI et al., 2009a ,b), β-

cariofileno, trans -α- bergamoteno e β- bisaboleno em C. reticulata do Estado do Pará

(HERRERO- JÁUREGUI et al., 2011). α- copaeno foi o principal sesquiterpeno detectado em

C. paupera e C. piresii (ZOGHBI et al. , 2009a ,b) , e β-caryophyllene foi destaque na espécie

C. pubiflora (ZOGHBI et al., 2009a,b) e C. multijuga (CASCON; GILBERT, 2000) . Em

relação com o óleo essencial da folha de C. langsdorffii β- cariofileno também foi detectado

elevadas quantidades em C. Trapezifolia (VEIGA-JÚNIOR et al. , 2006).

Dias et al. (2012) descreveram a otimização e validação de um método SPME -

GC para análisar o β-cariofileno nas nanoemulsões e indicar a estabilidade produzidas por

homogeneização de alta pressão. O método proposto sugere um efeito protetor da formulação

quanto às concentrações de β-cariofileno, uma vez que não foi observado produtos de

degradação e o tempo de retenção do β-cariofileno não foi alterado, que demonstrou a

especificidade do método e aplicabilidade para quantificar o teor de β-cariofileno nas

formulações desenvolvidas .

Desta forma, o óleo de copaíba é um dos produtos naturais mais utilizados pela

população da Amazônia brasileira, onde tem uma grande representação econômica e social,

por ser nativo e ter várias comunidades dependentes de seu extrativismo (SANTOS et al.,

2001). Nexte contexto, vale ressaltar que a disseminação da indústria de produtos naturais em

todo mundo e no Brasil, nos últimos anos, levou à comercialização extensiva do óleoresina de

copaíba pelos laboratórios farmacêuticos. Das pequenas cidades do interior da Amazônia,

67

esses produtos são transportados para as cidades de Manaus e Belém, de onde são exportados

para a Europa e América do Norte ou enviados para a região sudeste para serem vendidos

pelas farmácias que comercializam produtos naturais. É um produto extrativo de relativo

valor na economia regional da Amazônia, uma vez que este produto encontra várias

aplicações na indústria. Os óleos podem ser encontrados nas farmácias de todo o país em

diversas apresentações, sendo as mais comuns cápsulas ou pequenos frascos de 30 mL

(VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002).

Apesar da existência de métodos de coleta de forma sustentável, ainda nos dias de

hoje, essas árvores acabam sendo derrubadas, obtendo-se uma extração irracional. Isso ocorre

devido ao crescente desmatamento na Região Amazônica, com interesse na madeira,

transformando o óleo resina de copaíba em subproduto da indústria madeireira (VEIGA-

JÚNIOR; PINTO, 2002; PINTO; MADURO, 2003). A época mais indicada para extração de

óleo é a das chuvas, principalmente devido à maior quantidade de água e maior fluidez do

óleo. As extrações realizadas no período seco apresentam a produção de um óleo bem mais

denso. Se uma mesma árvore for explorada em períodos diferentes, poderá produzir óleos de

qualidade diferente, inclusive de cor, densidade e componentes químicos (VEIGA-JÚNIOR;

PINTO, 2002).

Newton et al. (2011) avaliaram a sustentabilidade de extração, de árvores de C.

multijuga, por três anos e observaram que fatores morfológicos e ambientais restringem a

produtividade total de populações de Copaifera. Essas considerações auxiliarão na realização

de práticas de gestão sustentável. Foram estudadas a extração de oleoresina de quatro espécies

(C. guyanensis, C. multijuga, C. piresii e C. paupera) de duas reservas extrativistas no estado

do Amazonas (RESEX Médio Juruá e RDS Uacari). Foram coletadas 179 árvores de áraeas

de várzea e de terra firme. C. multijuga foi a única espécie que produziu regularmente o

óleoresina, com volumes de rendimento variados de C. multijuga (restrito a floresta de terra

firme) teve o maior rendimento, média de 505 mL, enquanto C. guyanensis produziu volumes

menores, 139 ml, porém, este valor foi mais elevado na várzea que na floresta de terra firme,

com rendimento de, apenas, 15 ml.

Como produto florestal primário, a exploração do óleoresina de copaíba apresenta

algumas características originárias de seu manejo que vão definir, em última instância, as

possibilidades de suas aplicações industriais e, portanto, estabelecer o seu padrão de qualidade

para o mercado (LEITE et al., 2001). Mesmo considerando a exploração racional e a coleta

organizada a partir de bolsões florestais contendo, muitas vezes, uma única espécie de

68

copaibeira, para evitar a mistura de óleos de diversas procedências é necessário, ainda, o

estabelecimento de procedimentos controlados, desde o momento em que o produto extraído é

acondicionado para transporte até sua comercialização. Este é um dos aspectos mais

importantes relacionados ao controle de qualidade do insumo bruto extraído e já constitui um

dos focos de atenção e iniciativa por parte de algumas cooperativas extrativistas florestais

(NEWTON et al., 2012).

Na literatura já foram descritas várias outras aplicações farmacológicas, tais

como, antimicrobiana e antibacteriana (OPDYKE, 1976; MIRANDA et al., 2000; TINCUSI

et al., 2002; SANTOS et al., 2007; SANTOS et al., 2008; IZUMI et al., 2012; IZUMI et al

2013), anti-helmíntico (PELLEGRINO, 1967; GILBERT et al., 1972), analgésico

(FERNANDES et al., 1992; CARVALHO et al., 2005), anti-inflamatório (BASILE et al.,

1988; FERNANDES et al., 1992; VEIGA- JÚNIOR et al., 2001; CARVALHO et al., 2005),

cicatrizante (BRITO et al, 1999), gastroprotetora (PAIVA et al., 1998), antitumoral (OHSAKI

et al., 1994; LIMA et al., 2003); tripanomicida (CASCON et al., 1998; IZUMI et al., 2012;

IZUMI et al., 2013) contra diversas formas de Leishmania spp. (SANTOS et al., 2010;

RONDON et al., 2012).

Costa-Lotufo et al. (2002) verificaram o potencial embriotóxico e citotóxico do

ácido caurenóico (diterpeno abundante nas espécies de Copaifera) no desenvolvimento

embrionário de ouriços do mar. Brito et al. (1999) observaram que ratos submetidos ao

tratamento por sonda orogástrica de óleorresina de copaíba tiveram seu o comportamento

alterado, concomitantemente, a ocorrência de diarréia e diminuição da curva ponderal dos

animais. Em outro estudo, Brito et al. (2000) observaram alterações gastroplégicas em ratos,

após o tratamento com oleorresina de copaíba (0,63 mL/kg), por via oral.

Devido sua suposta ação anti-inflamatória (VEIGA-JÚNIOR et al., 2007),

cicatrizante (CARVALHO et al., 2005) e bactericida (VENEZIANI et al., 2010; ZIECH et

al., 2013) é comumente embrocado via vaginal para tratamento de leucorréia, sífilis e

blenorragia e por isso Brito et al. (2001) estududaram os efeitos macroscópicos do óleo de

copaíba sobre a mucosa vaginal de ratas onde o mesmo promoveu a formação de grumos

esbranquiçados e aderidos à parede vaginal em toda sua extensão. Lima et al (2011)

realizaram um estudo de sobre a performance reprodutiva de ratas prenhas submetidas ao

tratamento com um creme vaginal a base do óleoresina de C. duckei. Os resultados deste

estudo demonstraram ausência de toxidade materna e embriofetotoxidade na dose

administrada, correspondente a 10 vezes preconizada para uso em mulheres.

69

Veiga-júnior et al. (2007) fizeram um estudo comparativo entre a composição e

atividade anti-inflamatória de C. cearenses e o perfil cromatográfico demonstrou que o

composto principal entre os sesquiterpenos foi β- cariofileno ( 57,5 , 49,7 e 40,9 % ,

respectivamente ) , seguido de α- humuleno , α- copaeno , α- bergamoteno , δ- cadineno, com

diferentes concentrações em cada oleorresina. Entre os diterpenos, ácido copálico foi o

principal componente de C. multijuga Hayne (6,2%) e foi encontrado em todas as oleorresinas

estudados. Em C. cearensis Huber ex Ducke , clorechinic (11,3% ) e ácidos hardwickiic

(6,2%) foram os principais diterpenos enquanto caurenóico (3,9% ) e ácidos kolavenic (3,4%)

predominou em C. reticulata. Os efeitos farmacológicos dos três oleorresinas foram avaliados

in vitro por meio da medição da produção de NO (óxido nítrico) por macrófagos murinos e in

vivo usando o modelo de pleurisia induzida por zimosano em ratos. O óleoresina de copaíba

C. multijuga (100 mg / kg ) foi a mais potente , tanto inibir a produção de NO e a pleurisia

induzida pelo zimosan . As oleoresinas de C. cearensis e C. reticulata também foram capazes

de inibir a produção de NO e a pleurisia, no entanto com menos intensidade.

Lima et al. (2003), demonstraram que o óleo de C. multijuga apresenta atividade

tumoricida em células de melanoma, tanto in vivo quanto in vitro. Em outro modelo

experimental, indução de colite por ácido acético em ratos, observou-se que o ácido

caurenóico, aplicado junto com o ácido acético, diminuiu o infiltrado de células inflamatórias

e edema da mucosa intestinal sugerindo seu efeito anti-inflamatório (PAIVA et al., 2003). A

presença da atividade mutagênica e tóxica do óleoresina de C. langsdorfii foi demonstrada

pelo teste do micronúcleo em eritrócitos policromáticos da medula óssea de camundongos em

estudo feito por Chen-Chen e Sena (2002). Semelhentemente, Maistro et al. (2005) avaliaram

as atividades citotóxicas e mutagênicas, em reticulócitos de sangue periférico e medula óssea,

através de constituintes químicos do óleoresina de C. duckei em aplicação cutânea em rato, e

provaram que, em doses elevadas, a óleoresina de C. duckei foi atividade citotóxica.

A atividade antineoplásica do óleo de Copaifera multijuga e de suas frações,

hexânica e clorofórmica, foram investigadas em tratamento crônico para a avaliação da

evolução do tumor de Ehrlich. Segundo os autores, o efeito antineoplásico foi confirmado e a

presença de alguns sesquiterpenos encontrados como, β-cariofileno, bisaboleno e γ-

cariofileno, também foram citada em outros trabalhos quanto à atividade antitumoral

(GOMES et al., 2008). A atividade contra formas evolutivas de espécies do gênero

Leishmania sp. foram testas com oito tipos diferentes de óleoresina de copaíba, apresentando

níveis variados contra formas promastigotas, sendo que a espécie que a C. reticulata

70

apresentou maior atividade para promastigotas, amastigotas axênicas e formas amastigotas

intracelulares, respectivamente. A avaliação citotóxica obtida do óleo de C. reticulada

apresentou atividade significativa na espécie Leishmania amazonense, entretanto seu

potencial terapêutico não foi estudado (SANTOS et al., 2008a).

2.4.1 Copaifera duckei Dwyer

Cascon e Gilbert (2000) compararam as composições de oleorresinas de C.

Guianensis, C. duckei e C. multijuga, todos de ocorrência comum na Amazônia brasileira,

mostra que a variação química significativa ocorre não só entre espécies, mas também dentro

de uma mesma espécie e em uma fonte de árvore individual. Lameira et al. (2009) analisaram

oleoresinas de três árvores de C. duckei colhidas no início de Setembro de 2003 ao final de

setembro de 2004, e a fração volátil foi analisda em GC- FID e GC / MS e observaram

alterações nas quantidades coletadas por influência da estação chuvosa. No entanto não houve

tanta diferença quanto ao percentual dos principais componentes encontrados, contrastando-se

com a terceira amostra, o qual mudou consideravelmente. Os constituintes majoritários da

fração sesquiterênica dos óleos de diversas espécies β-trans-cariofileno e seu óxido

(LEANDRO et al., 2012).

Carvalho et al., (2005) investigaram as atividades analgésica e anti-inflamatória

tópicas do óleoresina de C. duckei, cuja composição química terpenoidal foi avaliada em ratos

utilizando carragenina, para induzir o edema de pata, e os testes de granulomas, determinaram

que na indução do edema por carragenina e teste de granuloma. O óleoresina inibiu o edema

em 18% e granuloma em 42%, este último resultado é semelhante ao observado com a

administração de dexametasona, sugerindo assim que a óleo resina de C. duckei teve atividade

antiinflamatória e analgésica. Castro e Silva et al. (2004) avaliaram a atividade

antiproliferativa do óleoresina de C .duckei oleoresina na regeneração hepática em ratos e

observaram que este óleoresina foi capaz de desacoplar a fosforilação oxidativa em

mitocôndrias, e sugeriram que a inibição da proliferação hepatocelular observada no grupo

tratado com o óleoresina.

Lima et al. (2011), no estado do Amapá, realizaram o primeiro estudo na área de

toxicologia reprodutiva. Esse estudo consistiu na avaliação da performance reprodutiva de

ratas prenhas, submetidas ao tratamento com creme vaginal a base do óleo de copaíba (C.

duckei) e os resultados deste estudo demonstraram ausência de toxidade materna e

71

embriofetotoxidade na dose administrada, correspondente a 10 vezes a dose preconizada para

uso humano. É importante ressaltar que neste estudo, o creme de copaíba a 2,5% foi usado

aplicação tópica (via vaginal).

72

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88

4 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Avaliar toxidade subcrônica e reprodutiva, em ratos (Linhagem Wistar), do óleoresina

de copaíba (Copaifera duckei Dwyer) e do creme vaginal contendo o óleoresina.

3.2 ESPECÍFICOS

- Identificar o perfil cromatográfico do óleoresina por CG-EM;

- Quantificar o marcador presente no óleoresina;

- Análisar as variáveis que indiquem toxidade subcrônica (machos e fêmeas);

- Comparar os efeitos da formulação e das diferentes vias de administração;

- Investigar variáveis que indiquem toxidade aguda nas progenitoras e nas lactantes;

- Avaliar a performance reprodutiva materna;

- Avaliar os efeitos do óleoresina no período pré-natal (pré-implantação, pós-

implantação e desenvolvimento fetal);

- Avaliar os efeitos do óleoresina no período pós-natal (lactação);

- Investigar variáveis que indiquem embriofetotoxidade;

- Comparar os efeitos das diferentes doses administradas;

- Analisar a teratogenicidade (anomalias e/ou malformações externas e internas);

- Avaliar o desenvolvimento geral e sexual das progênies expostas ao óleoresina no

período perinatal (in útero) e pós-natal (lactação);

89

CAPÍTULO 1: CARACTERIZAÇÃO FITOQUÍMICA DO ÓLEORESINA DE



90

RESUMO

A padronização da matéria-prima de origem vegetal que constituirá o produto final, quanto

aos constituintes fitoquímicos e a caracterização de seus marcadores, é de suma importância

para que seja garantida a ação terapêutica. Portanto, este estudo teve como objetivo

caracterizar fitoquímicamente o óleoresina de Copaifera duckei Dwyer (ORCD) por

cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Utilizou-se

Cromatógrafo Gasoso 6850 Agilent® acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

Avaliou-se dois métodos de esterificação, um descrito por Hartman e Lago (H&L) e outro

pela IUPAC, com algumas adaptações do Manual de Métodos Analíticos do Instituto Adolfo

Lutz. Utilizou-se 100 mg do ORCD, submetida a esterificação pelo método IUPAC. As

amostras esterificadas foram comparadas com uma amostra não esterificada, diluída apenas

em hexano, para avaliar se ocorrem perdas ou degradações das substâncias pelo método

empregado. O método de esterificação descrito por H&L apresentou baixa resolução para o

trans-cariofileno e de acordo com os dados da espectroteca Wiley, a amostra esterificada pelo

método H&L difere quanto à composição das amostras não esterificadas e das esterificadas

pelo método IUPAC, as quais possuem composição muito semelhante. Portanto, o Método

H&L foi descartado para o preparo de amostra do ORCD, pois se mostrou insatisfatório

quanto ao isolamento do marcador e existem indícios que tal método cause degradação dos

componentes. Já o método IUPAC, apesar de aparentemente não causar alterações nos

componentes da amostra e apresentar ótima resolução do marcador, foi necessário avaliar sua

interferência sobre o marcador trans-cariofileno. No presente estudo, as técnicas empregadas

foram eficazes, uma vez que possibilitaram a separação dos componentes do ORCD. A

espectrômetria de massas forneceu o perfil de fragmentação, que possibilitou identificar os

constituintes presentes no ORCD, e a partir das análises obtidas, definiu-se como marcador

fitoquímico/farmacológico, o cariofileno, por estar disponível comercialmente, e por ser

utilizado como padrão em diversos trabalhos de quantificação do óleoresina de copaíba, e por

ser responsável por várias ações farmacológicas descritas ao óleoresina de copaíba. A amostra

do ORCD apresentou teor de cariofileno em torno de 0,5 µg/mL (0,5%), o que representa uma

faixa adequada para quantificação pelos métodos propostos.

Palavras-chave: óleoresina de Copaifera duckei, cromatografia gasosa acoplada a

espectrometria de massas (CG-EM), esterificação, cariofileno.

91

ABSTRACT

The standardization of the raw material of vegetable origin that will constitute the final

product, the phytochemical content and the characterization of their markers, it plays an

important role so that the therapeutic action can be assured. Therefore, this study had as

objective to characterize phytochemically the C. duckei oleoresin Dwyer (ORCD) through gas

chromatography coupled with mass spectrometry (CG-IN). It was used Gas Chromatograph

6850 Agilent® coupled to the Mass Spectrometer 5973 (CG-IN). Two esterification methods

were evaluated, one described by Hartman and Lake (H&L) and the other one by IUPAC,

with some adaptations from Analytical Methods Guideline of the Instituto Adolfo Lutz. 100

mg of ORCD was used, submitted to the esterification by the method IUPAC. The esterified

samples were compared with a non-esterified sample, which was only diluted in hexane, in

order to evaluate if there are losses or degradations of the substances because of the employed

method. The esterification method described by H&L showed low resolution for the trans-

caryophyllene, according to the data of the espectroteca Wiley, the esterified sample by the

method H&L differs for the composition, in comparison to the non-esterified samples and of

the esterified ones through the method IUPAC, which have very similar composition.

Therefore, the Method H&L was discarded for the preparation of the ORCD sample, because

it was shown unsatisfactory for the isolation of the marker and indications, that such method

causes degradation of the components. Although the method IUPAC, apparently did not cause

changes in the components of the sample and it showed a great resolution of the marker, it

was necessary to evaluate its interference on the trans-caryophyllene marker. In the present

study, the employed techniques were effective, once it was possible the separation of the

components of ORCD. The spectrometry of masses provided the fragmentation profile, which

enabled to identify the present constituents in ORCD, and from these analyses, the

caryophyllene was defined as phytochemical / pharmacological marker, once it is available

commercially, and because it is used as pattern for several studies of quantification of the

copaiba oleoresin, and it is responsible for several pharmacological actions described to the

copaiba oleoresin. The sample of ORCD presented caryophyllene content around 0.5 µg/mL

(0,5%), what represents an appropriate strip for quantification for the proposed methods.

Keywords: C. duckei oleoresin, gas chromatography coupled with mass spectrometry (CG-

IN), esterification, caryophyllene.

92

1 INTRODUÇÃO

As plantas medicinais têm sido utilizadas desde a antiguidade para o tratamento de

uma variedade de doenças e com o passar do tempo, algumas delas tiveram suas propriedades

terapêuticas identificadas (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005). Esse conhecimento passou a ser

propagado de geração em geração, fazendo parte da cultura popular. O óleo de copaíba, por

exemplo, vem sendo utilizado tradicionalmente pelas comunidades da região amazônica como

cicatrizante, antisséptico e anti-inflamatório, apresentando elevado valor econômico (VEIGA-

JÚNIOR; PINTO, 2002; NEWTON et al., 2012). Suas propriedades terapêuticas já vêm sendo

descritas nas farmacopéias britânica e americana desde longa data (MAIMOM, 2000).

Atualmente o conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos da


novos produtos farmacêuticos (STUPP et al., 2008). Neste contexto, diversas áreas do

conhecimento estão envolvidas na pesquisa de novas substâncias ativas oriundas de plantas,

tal como a fitoquímica, que isola, purifica e caracteriza os princípios ativos; a etnobotânica e a

etnofarmacologia, que buscam informações a partir do conhecimento de diferentes povos e

etnias; e a farmacologia e toxicologia, que estudam os efeitos fisiológicos causados pelos

constituintes químicos nos organismos, sejam eles benéficos e/ou maléficos.

A investigação fitoquímica é uma área de estudo de grande importância, pois o

isolamento de princípios ativos e a modificação química destes podem resultar na descoberta

de novos compostos com aplicação terapêutica. Outro aspecto é que o estudo fitoquímico

pode contribuir na classificação das plantas, em função dos seus constituintes químicos,

fornecendo subsídios nos estudos de quimiotaxonomia (POSER; MENTZ, 2004). A

identificação botânica das copaibeiras, utilizando as características das flores, é difícil, dado o

curto período em que ocorrem e a elevada altura das árvores (TAPPIN et al., 2004).

As árvores pertencem ao gênero Copaifera L., família Fabaceae Lindl, subfamília

Caesalpiniodea Kunth. No território brasileiro ocorrem mais de vinte espécies do gênero

Copaifera, podendo predominar uma espécie em determinada região, no entanto, comumente

coexistem várias que são adaptadas aos diversos climas brasileiros (CASCON; GILBERT,

2000; LEITE et al., 2001; VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002). Essas árvores exudam um

óleoresina chamado de óleo de copaíba, cujas propriedades biológicas são amplamente

descritas na literatura (VEIGA JUNIOR; PINTO, 2002; VEIGA JUNIOR et al., 2001; LIMA

et al., 2003). Óleoresinas são soluções naturais de resinas dissolvidas em óleos essenciais,

93

acumuladas em um tipo de aparelho secretor constituído por bolsas e/ou canais secretores

esquizógenos (MACEDO; LANGENHEIM 1989). Em espécies de Copaifera a fração de óleo

essencial é composta basicamente de sesquiterpenos, predominante na maioria deles, e a

fração resina de ácidos diterpênicos (VEIGA-JÚNIOR. et al., 1995).

A composição fitoquímica da fração sesquiterpênica é bastante variável, no entanto,

geralmente o β-cariofileno e seu óxido são os constituintes majoritários (LEANDRO et al.,

2012). A variação dessa fração está relacionada a fatores bióticos externos, tais como a injúria

provocada por insetos ou fungos (PINTO-ZEVALLOS et al., 2013). Um exemplo seria a

produção de β-cariofileno, que é particularmente efetivo contra lepidópteros, e do óxido de

cariofileno, que atua diretamente na inibição de fungos (HUANG et al., 2012; PINTO-

ZEVALLOS et al., 2013). Além dos sesquiterpenos são relatados trinta e cinco diterpenos que

possuem esqueletos caurano (6 compostos), labdano (16 compostos) e clerodano (13

compostos). Desses compostos, vinte e três são encontrados na forma ácida e doze como

álcoois e diterpenos neutros (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005).

Apesar da extensa literatura sobre óleos de copaíba, poucas referências discriminam a

espécie de Copaifera que está sendo estudada. Somente oito espécies tiveram seus óleo-resina

estudados: C. multijuga Hayne, C. duckei Dwyer, C. cearenses Huber ex Ducke, C.

langsdorfii Desf., C. officinalis L., C. reticulata Ducke, C. paupera e C. guianensis Desf.,

destas apenas as três primeiras são endêmicas do Brasil (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2005).

Oliveira et al. (2006) relatam que as maiores produções de óleo de C. reticulata e C. duckei

coincidem com o período de menor precipitação pluviométrica e a menor produção ocorre,

principalmente, no período mais chuvoso. Variações sazonais e a variabilidade química inter e

intra-espécies apontam para a necessidade de se estabelecer padrões de controle deste

óleoresina (VEIGA-JÚNIOR, 1997; CASCON; GILBERT, 2000). Segundo Langenhein

(2003), a variação na composição química do óleoresina de Copaifera pode influenciar a ação

farmacológica e a toxidez dos produtos que o utilizam em suas composições, podendo

comprometer o controle de qualidade.

Veiga-Júnior et al. (1997) desenvolveram métodos analíticos, baseados no uso das

técnicas de Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) e Cromatografia Gasosa de

Alta Resolução acoplada à Espectrometria de Massa (CG-EM), para controle da autenticidade

do óleoresina de copaíba. Teores totais dos sinais majoritários de diversas amostras estudadas

por Tappin et al. (2004) totalizaram pouco menos de 50% da composição do óleo. Isso indica

94

a complexidade da composição das amostras desse óleoresina quanto às substâncias

minoritárias, detectadas, mas de difícil quantificação.

Nos diversos óleoresinas de copaíba estudados, os sesquiterpenos predominantes são

-copaeno, -cariofileno, -bisaboleno, e -selineno, -humuleno, δ e γ-cadineno, β-

bisabolol e α- elemeno (WENNINGER et al., 1967; FERRARI et al., 1971; CRAVEIRO et

al., 1981; VEIGA-JÚNIOR, 1997; VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002; MACIEL et al., 2002;

CARVALHO et al., 2005). O -cariofileno possui comprovada ação anti-inflamatória,

antibacteriana, antifúngica e antiedêmica e o -bisaboleno com propriedades descritas como

anti-inflamatórias e analgésicas (VEIGA-JUNIOR; PINTO, 2002; OLIVEIRA et al., 2006;

OLIVEIRA et al., 2006; RAMOS, 2006).

Estudo realizado por Lameira et al. (2009), com C. duckei, detectou o β-cariofileno,

variando de 13,0-15,5%, 25,1-50,2% e 50,1-61,8%, nas amostras de óleosresina de três

árvores. Apesar deste estudo ter demonstrado uma variação sazonal, na composição química

da fração volátil dessa espécie, este composto está presente em todas as espécies de

Copaifera. Carvalho et al. (2005) realizaram análise cromatográfica do óleo resina de C.

duckei, sendo 63.6 % composta por sesquiterpenos (2,2 % β-elemeno, 5,0 % β-cariofileno,

14,7 % α-bergamoteno e 27,4 % β-bisaboleno) e 36,4 % por ácidos diterpênicos (13,5 % kaur-

16-en-19-óico, 8,3 % kauran-19-óico, 4,1 % copálico, 6,9 % poliáltico e 2,6 % ácido eperu-

8(17)-en-15,18-dióico). Considerando a estrutura dos ácidos diterpênicos, 22,8 % foram

ácidos tetracíclicos da série dos cauranos e 13,6 % da série dos labdanos bicíclicos (6,9 %

furano labdano).

Maistro et al. (2005) também analisaram a proporção de distribuição dos terpenos no

óleo resina desta espécie. Foi detectada a presença de 7,2 % de hidrocarbonetos

sequiterpenos, 1,8 % de diterpernos neutros não identificados e 92,2 % de ácidos diterpênicos.

Entre os componentes sesquiterpenicos destacou-se o trans-β-cariofileno (4.5%), trans-α-

bergamotene (1,0 %), α-humuleno (0,7 %), e β-bisabolene (1,0 %) e entre os diterpenos os

ácidos copálico (3,7 %), polialtico (27,1 %) e hardwickiic (59,3 %).

Dentro do aspecto de desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos, com

finalidade terapêutica, a tríade qualidade, segurança e eficácia são imprescindíveis (BRASIL,

2004a; ANVISA; RATES, 2001; WHO, 2002; LAPA et al., 2010). A análise do óleoresina

em CG-EM auxilia na identificação dos constituintes de relevância farmacológica e

toxicológica presentes no óleoresina. Além disso, respalda ,analiticamente, a formulação

95

quanto a qualidade do produto. Os objetivos deste estudo foram analisar e padronizar o

óleresina de Copaifera duckei (ORCD) por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria

de massas (CG-EM) para submeter ao desenvolvimento farmacotécnico e aos ensaios de

toxidade subcrônica (capítulo 2) e toxidade reprodutiva (capítulo 3 e 4).

96

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL

O óleoresina de copaíba usado nesta análise, para o desenvolvimento da formulação e

nos ensaios de toxidade subcrônica (capítulo 2) e toxidade reprodutiva (capítulos 3 e 4), foi

obtido da empresa Beraca, situada em Ananindeua, no estado do Pará, que tem como foco o

uso dos produtos da biodiversidade Amazônica. A pesquisa e o desenvolvimento de seus

produtos são realizados em parceria com universidades localizadas na região. Segundo o

laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD).

2.2 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA

(CG-EM)

A análise do óleoresina foi realizada em São Paulo, no Laboratório Farmacêutico

Almeida Prado Ltda, situado na cidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. Para a determinação

dos componentes deste ORCD, utilizou-se cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de

massas (CG-EM), segundo o método descrito por Adams (1995).

Para fins de controle de qualidade do ORCD foi necessário definir um marcador para

ser monitorado e poder garantir a qualidade do produto em questão. O marcador utilizado no

monitoramento da qualidade do produto foi a substância, que segundo dados da literatura

(LEANDRO et al., 2012; SOUZA-BARBOSA et al., 2013), é a substância responsável pela

ação farmacológica preconizada e ainda, que tem disponibilidade de padrões comerciais.

A substância considerada marcadora do óleoresina é o sesquiterpeno trans-cariofileno

(C15H24; PM 204).

2.2.1 Parâmetros do equipamento CG-EM

2.2.1.1 Dados do equipamento

Cromatógrafo Gasoso 6850 Agilent® acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-

EM).

97

2.2.1.2 Condições da análise

Gás carreador Hélio, fluxo de 1,5 mL/min., temperatura do injetor 270º C, forno 120º

C, detector 300º C. Coluna capilar DB -1,25 m x 0,32 mm, 0,25 µm. Volume de injeção de

1,0 µL, modo split 20:1. Rampa de aquecimento: 120º C por 2 min., aquecimento de 3º C por

min até 160º C, e 8º C/min até 290º C mantendo-se por 5 min. A amostra foi lida em modo

Scan, com 40 - 600 AMU.

Para se chegar a estes valores, foram testados empiricamente vários valores de rampa

de aquecimento e volume de injeção, divisão de amostra, até se obter um cromatograma com

os picos bem resolvidos e com reprodutibilidade de abundância entre as injeções.

2.2.1.3 Identificação dos compostos

Após a injeção da amostra foi gerado um cromatograma que relaciona tempo e

abundância do sinal obtido, ou seja, do pico cromatográfico. O tempo em que cada pico foi

gerado é referido como tempo de retenção (TR) e é característico para cada composto em

condições constantes de análise. Utilizando o detector espectrômetro de massas, obteve-se o

perfil de fragmentação dos compostos.

As figuras 1 e 2 representam o cromatograma do padrão de trans-cariofileno e seu

respectivo espectro de fragmentação.

4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0

5 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : B 2 . D \ d a t a . m s

Figura 1. Cromatograma do padrão trans-cariofileno obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850

(Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

98

4 0 6 0 8 0 1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

6 0 0 0

7 0 0 0

8 0 0 0

9 0 0 0

m / z - - >

A b u n d a n c e

S c a n 4 6 1 ( 6 . 0 1 3 m i n ) : B 2 . D \ d a t a . m s

1 3 3

9 3

1 0 5

1 6 17 9 1 2 0 1 4 7

4 1

1 8 9

6 75 5

1 7 5

2 0 4

2 6 3 2 7 8

Figura 2. Perfil de fragmentação do padrão trans-cariofileno, obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850

(Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

2.2.2 Preparo da amostra

Os produtos naturais necessitam de um preparo prévio antes de ser injetado no CG-

EM, pois é necessário que a substância seja volátil e apolar para que seja arrastada pela fase

móvel, caso contrário, ficará retida na coluna do equipamento. No caso do ORCD, os

sesquiterpenos já possuem volatilidade e característica apolar adequada à análise, porém os

ácidos diterpênicos, que representam a fração resinosa do óleo, necessitam ser esterificados

para se tornarem mais voláteis e apolares. Geralmente as técnicas de preparo de amostra

visam uma pré-purificação que direciona a análise ao composto alvo, concentrando-o ou

eliminando interferentes ou produtos que possam causar danos ao equipamento. Ao mesmo

tempo, é necessário que o preparo da amostra não interfira no composto alvo, ou seja, que

preserve o marcador trans-cariofileno.

No presente estudo foram avaliados dois métodos de esterificação, um descrito por

Hartman e Lago (1973) (H&L) e outro pela IUPAC, n. 2.301 (1987), com algumas adaptações

descritas no Método 2 do Manual de Métodos Analíticos do Instituto Adolfo Lutz (2005).

Para quantificar o ORCD, foi adotada a técnica de “padrão externo”, utilizando como

marcador o padrão de trans-cariofileno, grau analítico (análise quantitativa) obtido da

empresa Sigma Aldrich®

. A quantificação foi realizada pelo método de padronização externa,

que consiste na construção de uma curva de calibração com um padrão de um composto

presente na amostra, e assim determinar a concentração do determinado composto na amostra

através de cálculos matemáticos.

99

2.2.2.1 Quantidade de partida

Utilizou-se 100 mg de ORCD (0,100 g), submetida a esterificação pelo método

IUPAC. O volume final obtido foi de 25 mL, que corresponde, teoricamente, a uma

concentração de 4 mg/mL do ORCD. Essa análise foi realizada em triplicata, e o resultado

final foi expresso pela média das leituras obtidas.

2.2.2.2 Construção da curva de calibração

Para construção da curva de calibração, foram realizadas seis diluições com o padrão

trans-cariofileno, como se segue:

Foram preparadas quatro “soluções estoques” com o padrão de trans-cariofileno

(Quadro 1). A partir destas soluções foram preparadas outras diluições denominadas

“soluções de trabalho” (Quadro 2). Tanto as “soluções estoque” quanto as ”soluções de

trabalho” foram utilizadas na construção da curva de calibração (Quadro 3).

As concentrações propostas para construção da curva de calibração apresentaram

linearidade adequada (Figura 3). Estas concentrações também estão dentro do limite de

quantificação do método, que foi de 2,5 ng/mL.

Figura 3. Curva de calibração do padrão trans-cariofileno, coeficiente de correlação 0,997975237;

inclinação da reta 3,58189E-05.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

Concentração µg/mL

Ab

un

dâ

ncia

(á

rea d

o p

ico

)

30000000

25000000

20000000

15000000

10000000

5000000

0

100

Quadro 1. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano

Solução estoque de

trans-cariofileno

Padrão de trans-

cariofileno puro

(a ser adicionado)

Hexano

(a ser adicionado)

[ ] em µL de trans-

cariofileno padrão

por mL de hexano

A 1 µL 1,000 µL 1 mL 1,00 µL/mL

B 1 µL 10,000 µL 10 mL 0,10 µL/mL

C 1 µL 5,000 µL 5 mL 0,20 µL/mL

D 1 µL 2,000 µL 2 mL 0,50 µL/mL

Quadro 2. Correspondência entre volume de trans-cariofileno e hexano

Soluções de

trabalho

Tipo e quantidade de

Solução estoque a ser

adicionada

Hexano

(a ser adicionado)

[ ] em µL de trans-

cariofileno padrão

por mL de hexano

1 A 10 µL 1 mL 0,01 µL/mL

2 B 1 mL 1 mL 0,05 µL /mL

3 B B B 0,10 µL/mL

Quadro 3. Pontos da curva de calibração e suas correspondentes concentrações

Pontos da

curva Soluções

[ ] de trans-

cariofileno em

nL/mL

[ ] µL de trans-

cariofileno padrão

por mL de hexano

1 1 10,0 0,010 µL/mL

2 2 50,0 0,050 µL /mL

3 3 ou B 100,0 0,10 µL/mL

4 C 200,0 0,2 µL/mL

5 D 500,0 0,5 µL/mL

6 A 1000,0 1,0 µL/mL

Estas soluções foram armazenadas em refrigerador (4º C) até o momento da análise.

As diluições do padrão foram preparadas em triplicata e injetadas. Com os valores das médias

101

de cada ponto, construiu-se a curva utilizando o software chemstation, que integra os picos

cromatográficos (correlacionando à área obtida com a concentração correspondente do

padrão) e a partir daí, calculou-se a concentração do marcador na amostra. Os dados da

relação área/concentração ficam a disposição para serem utilizados em outras bases de dados

para cálculos mais específicos, como análise estatística.

102

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Óleoresinas de copaíba, quimicamente, podem ser definidos como soluções de ácidos

diterpênicos em um óleo essencial constituído majoritariamente por sesquiterpenos

(CASCON; GILBERT, 2000). Do ponto de vista biológico, é um produto de excreção ou

desintoxicação do organismo vegetal, e funciona como defesa da planta contra animais,

fungos e bactérias (VEIGA JR.; PINTO, 2002).

A cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) é uma das

técnicas mais importantes que se dispõe para análise de misturas complexas voláteis e de

baixo peso molecular. Segundo Siqueira (2003), a CG-EM está cada vez mais presente nas

análises de rotina dos laboratórios de química de produtos naturais e no setor de controle de

qualidade dos laboratórios farmacêuticos. Este fato deve-se, principalmente, ao método ser

rápido e reprodutível.

Na literatura, a utilização da técnica de CG-EM para análise qualitativa e quantitativa

do óleoresina de copaíba tem-se tornado rotineira (VEIGA-JR, 1997; RIGAMONTE-

AZEVEDO, 2004; TAPPIN, 2004; BIVALTI, 2006; LEANDRO et al.,2012; SOUZA-

BARBOSA et al., 2013). As amostras esterificadas foram comparadas com uma amostra não

esterificada, diluída apenas em hexano, para avaliar se ocorrem perdas ou degradações das

substâncias pelo método empregado. Na Figura 4, está representado o cromatograma obtido

pelo método H&L. O marcador cariofileno está evidenciado em um pico de baixa resolução e

pouca abundância em relação aos outros componentes da amostra.

A Figura 5 representa o cromatograma da amostra esterificada pelo método IUPAC e a

Figura 6 a amostra ORCD sem esterificar. É possível observar que as aparências destes dois

cromatogramas são muito semelhantes e ambos apresentam como pico mais abundante e bem

resolvido, o cariofileno.

103

4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0

1 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 1 0 0 0 0 0

1 2 0 0 0 0 0

1 3 0 0 0 0 0

1 4 0 0 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : C O P A I B A 1 0 M I - 1 M L . D \ d a t a . m s

Figura 4. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificada pelo método H&L, obtido

em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0

1 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

T im e - ->

A b u n d a n c e

T I C : C E M 2 S P 5 0 -1 . D \ d a t a . m s

Figura 5. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (FR 3340) esterificado pelo método IUPAC,

obtido em Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

CARIOFILENO

CARIOFILENO

104

4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0

5 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0

7 5 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : C O P N E S P 5 0 - 1 . D \ d a t a . m s

Figura 6. Cromatograma do óleoresina de C. duckei (RF 3340) não esterificado, obtido em

Cromatógrafo Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

O método de esterificação descrito por H&L apresentou baixa resolução para o trans-

cariofileno e de acordo com os dados da espectroteca Wiley, a amostra esterificada pelo

método H&L difere quanto à composição das amostras não esterificadas e das esterificadas

pelo método IUPAC, as quais possuem composição muito semelhante (Quadro 4). Portanto, o

Método H&L foi descartado para o preparo de amostra do ORCD, pois se mostrou

insatisfatório quanto ao isolamento do marcador e existem indícios que tal método cause

degradação dos componentes. Já o método IUPAC, apesar de aparentemente não causar

alterações nos componentes da amostra e apresentar ótima resolução do marcador, foi

necessário avaliar sua interferência no marcador trans-cariofileno.

Para isto foi submetido 1 µL do padrão de trans-cariofileno à esterificação por tal

método, sendo comparado o cromatograma obtido com o cromatograma do padrão diluído

apenas em hexano. Este ensaio revelou que o padrão de trans-cariofileno não sofreu alteração

significativa quando submetido a esterificação pelo método IUPAC (Figuras 7 e 8).

CARIOFILENO

105

Quadro 4. Composição do óleoresina de C. duckei e os respectivos tempos de retenção (TR)

conforme o tratamento da amostra: esterificado (H&L), esterificado (IUPAC) e não esterificado.

Óleo-resina - H&L Óleo-resina – IUPAC Óleo-resina - Não esterificado

RT COMPOSTO RT COMPOSTO RT COMPOSTO

5,027 Benzene 4,544 Cyclohexene 4,556 Cyclohexene

5,422 β- ememeno

/ciclohexano 4,754 α -Cubebene 4,766 α-Cubebene

6,179

1R,3Z,9S-

2,6,10,10-

Tetramethylbicyclo

[7.2.0]undeca-2,6-

diene

5,218 α-Copaene 5,231 α-Copaene

6,402 Caryophyllene 5,422 Cyclohexane 5,434 Cyclohexane/ β-elemene

6,624 γ-1-cadinene 5,651 3H-3a,7-Methanoazulene, 5,670 α-Gurjunene

7,076 Naphthalene 5,842 Trans-Caryophyllene 5,861 Trans-Caryophyllene

7,140 α.-Muurolene;

Naphthalene 5,988 Caryophyllene 6,007 Caryophyllene

7,591 α.-Muurolene;

Naphthalene 6,185

1-ethenyl-1-methyl-2-

(1-methylethenyl)-4-(1-

methylethylidene)-

bicyclogermacrene

6,204 γ-Elemene

7,833 β-Bisabolene;

Cyclohexene 6,293 trans-α-Bergamotene 6,312 trans-.α.-Bergamotene

7,967 1H-

Benzocycloheptene 6,624 α -Caryophyllene 6,643 α.-Humulene

8,107 δ-Cadinene;

Naphthalene 6,777 1H-Cycloprop[e]azulene 6,789 1H-Cycloprop[e]azulene

8,418 δ-Selinene 7,076 Naphthalene 7,095 Naphthalene

8,622 cis-α-bisabolene 7,171 Germacrene D 7,197 Germacrene-D

9,156 - 7,286 α-Selinene 7,311

1H-Cycloprop[e]azulene,

decahydro-

1,1,7-trimethyl-4-

methylene

9,875 - 7,521 4,7-Methanoazulene 7,540

4,5-dimethyl-11-

methylenetricyclo[7.2.1.0(

4.9)]dodecane

1,251 - 7,846 β-Bisabolene 7,629 α-Muurolene

10,524 - 8,126 δ -Cadinene 7,871 δ -Bisabolene

10,759 - 8,635 cis-α-bisabolene 8,151 γ-Cadinene

11,179 γ -Cadinene 8,921 Germacrene B 8,666 cis-α-bisabolene

11,873 Patchoulene /α-

Copaene 9,366 Caryophyllene oxide 8,953 Germacrene B

12,025 - 10,384 - 9,398 Caryophyllene oxide

12,738 - 21,225 Palmitic acid-methyl Ester 10,422 Fonenol

14,519 28,687 Linoleic acid, methyl Ester

21,002 Palmitic acid-

methyl Ester

106

4 . 0 0 6 . 0 0 8 . 0 0 1 0 . 0 0 1 2 . 0 0 1 4 . 0 0 1 6 . 0 0 1 8 . 0 0 2 0 . 0 0 2 2 . 0 0 2 4 . 0 0 2 6 . 0 0 2 8 . 0 0 3 0 . 0 0 3 2 . 0 0

5 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0

7 5 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : P C M 2 . D \ d a t a . m s

5 . 8 7 0

6 . 0 1 9

8 . 7 0 1

9 . 4 3 7

Figura 7. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, esterificado pelo método IUPAC, obtido em


5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0

5 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0 0

7 0 0 0 0 0 0

7 5 0 0 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : P C 1 U L 5 M L . D \ d a t a . m s 5 . 9 9 4

9 . 3 8 5

Figura 8. Cromatograma do padrão trans-cariofileno, não esterificado, obtido em Cromatógrafo

Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

CARIOFILENO

ÓXIDO DE CARIOFILENO

ÓXIDO DE

CARIOFILENO

CARIOFILENO

107

As possíveis interferências do método de esterificação IUPAC foram analisadas, pela

leitura de uma amostra branco do mesmo, ou seja, procedendo a metodologia de esterificação

sem adicionar nenhum componente e realizando a leitura da fração hexânica no cromatógrafo.

Este ensaio demonstrou que não existem substâncias do método que interferem na análise

cromatográfica (Figura 9).

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

3 0 0 0 0

3 5 0 0 0

4 0 0 0 0

4 5 0 0 0

5 0 0 0 0

5 5 0 0 0

6 0 0 0 0

6 5 0 0 0

7 0 0 0 0

7 5 0 0 0

8 0 0 0 0

8 5 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : B R A N C O M E T 2 . D \ d a t a . m s

Figura 9. Cromatograma do Branco utilizado no método de esterificação IUPAC, obtido em


O ORCD apresentou teor de cariofileno em torno de 0,5 µg/mL (0,5 %), o que

representa uma faixa adequada para quantificação pelo método proposto. Na Figura 10 pode

ser observado o cromatograma e a análise quantitativa de uma das amostras. No presente

estudo, a técnica de análise foi eficaz, uma vez que possibilitou a separação dos componentes

da amostra. O espectrômetro de massas forneceu o perfil de fragmentação, que possibilitou

identificar os constituintes presentes no óleoresina C. duckei (ORCD). Dados da literatura já

relataram a descrição de, aproximadamente, cem sesquiterpenos e trinta e sete ácidos

diterpênicos, desconsiderando duplicidades ocasionadas pelo uso de nomes IUPAC e usual

(VEIGA JR.; PINTO, 2002; LEANDRO et al., 2012). O marcador utilizado neste estudo, o β-

cariofileno, além de estar disponível comercialmente, é utilizado como padrão em diversos

trabalhos de quantificação do óleoresina de copaíba. Esse composto é responsável por várias

108

ações farmacológicas descritas ao óleoresina de copaíba (VEIGA-JÚNIOR; PINTO, 2002;

TAPPIN 2004; LEANDRO et al., 2012; SOUZA-BARBOSA et al., 2013).

5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0

5 0 0 0 0 0

1 0 0 0 0 0 0

1 5 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 0

2 5 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

3 5 0 0 0 0 0

4 0 0 0 0 0 0

4 5 0 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0

5 5 0 0 0 0 0

6 0 0 0 0 0 0

6 5 0 0 0 0 0

T i m e - - >

A b u n d a n c e

T I C : D I L 2 5 A 1 . D \ d a t a . m s

Figura 10. Cromatograma e análise quantitativa do óleoresina de C. duckei, obtido em Cromatógrafo

Gasoso 6850 (Agilent®) acoplado a Espectrômetro de Massa 5973 (CG-EM).

Segundo a pesquisa realizada por Rigamonte-Azevedo (2004), o cariofileno é o

terpenóide encontrado com maior freqüência (100%) nos óleos de copaíba estudados. Por

isso, o teor de cariofileno nos óleos de copaíba deve ser monitorado, para certificar a

qualidade desse produto. Neste estudo, o teor encontrado foi de 0,5 % (0,5 µg/mL), que

corresponde a um teor adequado, tanto para ser utilizada como marcador do fitomedicamento

como para ser detectado pelo método proposto, o de esterificação da IUPAC. A análise do

óleoresina em CG-EM, portanto, certifica a qualidade desse produto (CASCON; GILBERT,

2000).

Souza-Barbosa et al. (2013) analisaram a composição fitoquímica de 22 amostras de

óleoresina de C. multijuga Hayne por GC-FID e GC-EM e um total de 35 compostos

componentes foram identificados, sendo o sesquiterpeno β-cariofileno e óxido de cariofileno

encontrados em maiores quantidades. Estudo realizado por Lameira et al. (2009), com C.

duckei, detectou o β-cariofileno, variando de 13,0-15,5%, 25,1-50,2% e 50,1-61,8%, nas

109

amostras de óleoresinas de três árvores. Apesar desse estudo ter demonstrado uma variação

sazonal, na composição química da fração volátil dessa espécie, este composto está presente

em todas as espécies de Copaifera, sendo assim, foi escolhido como marcador de qualidade

do produto aqui estudado.

O β-cariofileno é um sesquiterpeno bicíclico natural que está presente, como maior

constituinte, em diversos óleos essenciais, utilizados na medicina tradicional, tal como o óleo

de cravo (GOIRIS et al., 2002; GRAMOSA; SILVEIRA, 2005). Esses óleos essenciais

inibem o crescimento de algumas bactérias, leveduras e fungos (ALMA et al., 2003; HONG

et al., 2004; LOURENS et al., 2004; SABULAL et al., 2006; SAROGLOU et al., 2007).

Quanto aos demais compostos, as ações terapêuticas já foram descritas, tal como, atividade

antifúngica do óxido de cariofileno, antitumoral do ácido hardwickiico e atividade

antitripanossômica do ácido copálico (LEANDRO, 2012; VEIGA JR.; PINTO, 2002) e,

portanto, têm sido usados em uma variedade de produtos farmacêuticos e alimentares

(GOIRIS et al., 2002).

Pieri et al., (2009) descreveram que os componentes sesquiterpênicos, β-bisaboleno e

β-cariofileno, e outros hidrocarbonetos têm ação cicatrizante, potencial anti-séptico,

antibacteriano, germicida, expectorante, diurético e analgésico. Outras ações, também, têm

sido atribuídas ao óleoresina de Copaifera spp. tal como, vasorrelaxante, citotóxica e

embriotóxica.

110

4 CONCLUSÃO

A partir dos resultados obtidos nas análises realizadas, pode-se sugerir as seguintes

conclusões:

No presente estudo, a técnica de esterificação H&L foi eficaz, uma vez que possibilitou

a separação dos componentes da amostra. A espectrômetria de massas forneceu o perfil

de fragmentação, que possibilitou identificar os constituintes presentes no óleoresina C.

duckei (ORCD);

A partir das analises obtidas, definiu-se como marcador fitoquímico/farmacológico, o

β-cariofileno, por estar disponível comercialmente, e por ser utilizado como padrão em

diversos trabalhos de quantificação do óleoresina de copaíba, e por ser responsável por

várias ações farmacológicas descritas ao óleoresina de copaíba;

A amostra do ORCD apresentou teor de cariofileno em torno de 0,5 µg/mL (0,5 %), o

que representa uma faixa adequada para quantificação pelos métodos propostos.

111

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115

CAPÍTULO 2: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE SUBCRÔNICA DO

ÓLEORESINA E DO DO CREME VAGINAL DE C. duckei Dwyer

116

RESUMO

As infecções do trato genital baixo têm sido a causa mais frequente de consulta ginecológica.

Com base na aplicação do óleoresina de copaíba C. duckei (ORCD) e do creme vaginal do

óleoresina de copaíba (CVORCD), esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos tóxicos

em fase de tratamento subcrônico desses produtos. Foram utilizados ratos (Rattus

norvegicus), linhagem wistar (machos e fêmeas), com peso médio de 145 a 220g que foram

tratados por via oral (v.o) e intravaginal (i.v). Os grupos tratados receberam a dose de 320

mg/kg, 40 mg/kg e 28 mg/kg, respectivamente, com ORCD (v.o - ORCD), ORCD via vaginal

(i.v - ORCDV) e creme vaginal do ORCD (i.v - CVORCD). Os grupos controles foram

tratados com 0,5 mL de água destilada (v.o) e 220 mg do creme vaginal base (i.v - CVB). O

tratamento subcrônico por 22 dias com ORCD e o CVORCD não provocou sinais clínicos de

toxicidade, nenhuma morte foi registrada e não alterou o desenvolvimento ponderal dos

animais. As fêmeas tratadas com ORCD, por via oral, apresentaram maior ingestão de água,

mas o consumo de ração não foi diferente em machos e em fêmeas. O uso do CVORCD não

alterou a ingestão de água das fêmeas, mas alterou o consumo de ração. O ORCDV foi capaz

de provocar efeito hipoglicemiante e elevação dos níveis séricos de creatinina. Os parâmetros

hematológicos dos animais (machos e fêmeas) não foram alterados pelo uso oral do ORCD

(320 mg/kg). O uso do CVORCD alterou o hematócrito, os linfócitos e a concentração de

hemoglobina. O uso do CVORCD e ORCDV, por via intravaginal, não alteraram os

parâmetros bioquímicos das ratas. As fêmeas tratadas, por via oral, com ORCD (320 mg/kg)

apresentaram algum tipo de suscetibilidade específica ao uso (elevação do colesterol total,

HDL e FA). A elevação dos níveis séricos das enzimas AST e ALT não foi atribuída ao uso

do ORCD por via oral e intravaginal e o uso do CVORCD, bem como os produtos presentes

na formulação do creme vaginal base (CVB).

Palavras-chave: Óleoresina, Copaifera duckei, creme vaginal, toxicidade subcrônica, não

clínico.

117

ABSTRACT

The infections of the lower genital tract have been the most frequent cause of gynecological

consultation. Based on the application of the oleoresin of copaiba C. duckei (ORCD) and of

the vaginal cream of the copaiba oleoresin (CVORCD), this study had as objective to evaluate

the toxicity in the subchronic treatment phase of these products. Mice were used (Rattus

norvegicus), wistar lineage (males and females), with a medium weight of 145 to 220g which

were treated orally (v.o) and intravaginal (i.v). The treated groups received a dose of 320

mg/kg, 40 mg/kg and 28 mg/kg, respectively, with ORCD (v.o - ORCD), ORCD vaginally

(i.v - ORCDV) and vaginal cream of ORCD (i.v - CVORCD). The control groups were

treated with 0,5 mL of distilled water (v.o) and 220 mg of the cream vaginal base (i.v - CVB).

The subchronic treatment for 22 days with ORCD and CVORCD did not cause clinical signs

of toxicity, no death was registered and it did not change the weight development of the

animals. The female rats treated with ORCD, orally, presented a higher ingestion of water, but

the ration consumption was not different among male and female rats. The use of CVORCD

did not alter the ingestion of water of the female ones, but it changed the ration consumption.

ORCDV was capable to cause effect hypoglycemic effect and rising of the serum creatinine

levels. The hematological parameters of the animals (male and female) were not changed by

the oral use of ORCD (320 mg/kg). The use of CVORCD changed the hematocrit, the

lymphocytes and the hemoglobin concentration. The use of CVORCD and ORCDV, through

intravaginal, did not change the biochemical parameters of the female rats. The female rats,

which were treated orally, with ORCD (320 mg/kg) presented some type of specific

susceptibility to the use (elevation of the total cholesterol, HDL and FA). The rising of the

serum levels of the enzymes AST and ALT was not related to the use of ORCD orally and

intravaginal and the use of CVORCD, as well as the present products in the formulation of the

vaginal cream base (CVB).

Keywords: Oleoresin, Copaifera duckei, vaginal cream, subchronic toxicity, non-clinical.

118

1 INTRODUÇÃO

Os produtos naturais - os metabólitos secundários das plantas - tornaram-se agentes

terapêuticos e/ou profiláticos úteis na prática medicinal (CARVALHO, 2004). Segundo

alguns autores, os vegetais possuem um sistema imunológico rudimentar que proporciona o

desenvolvimento de meios de defesa química contra o ataque de bactérias, fungos,

protozoários, insetos e outros animais (ALENCAR, 1982; CARVALHO, 2004). O óleo de

copaíba tem sido utilizado na medicina tradicional popular e silvícola para diversas

finalidades, desde a época da chegada dos portugueses ao Brasil. Há na literatura estudos que

comprovam propriedades antinflamatórias, cicatrizantes, antissépticas e mesmo bactericidas,

sendo, entretanto, referidos efeitos adversos como náuseas, vômitos e diarreia se utilizado,

principalmente, em doses elevadas.

As copaibeiras são árvores comuns à América Latina e África Ocidental

(FRANCISCO, 2005). No Brasil são encontradas nas regiões Sudeste, Centro-Oeste e

Amazônica. A altura dessas árvores varia entre 25 e 40 metros (ARAÚJO-JÚNIOR et al.,

2005) e o diâmetro entre 0,4 e 4 metros. Possuem folhagem densa, casca aromática, flores

pequenas e frutos secos. As sementes são pretas e ovóides com um arilo amarelo, rico em

lipídeos. Do tronco da árvore da copaíba é extraído um óleoresina, de cor que varia,

dependendo da espécie, de amarelo a marrom (ALENCAR, 1982; XENA; BERRY, 1998).

O óleo de copaíba é um produto natural, composta de uma parte sólida, resinosa não

volátil, formada por ácidos. Esses ácidos são responsáveis por 55 a 60 % do óleo, diluída na

outra parte, um óleo essencial, composto de sesquiterpenos, que podem ser divididos em

sesquiterpenos oxigenados (álcoois) e hidrocarbonetos sesquiterpênicos (CASCON;

GILBERT, 2000; MACIEL et al., 2002; RIGAMONTE-AZEVEDO et al., 2004). Por ser um

exudato constituído por ácidos resinosos e compostos voláteis, a designação correta para o

óleo de copaíba é a de óleoresina (VEIGA-JUNIOR et al., 2005).

A concentração e natureza dos diterpenos e sesquiterpenos presentes no óleoresina

extraído pode variar de acordo com as variações de espécies, fatores biológicos, como insetos

e fungos, ou fatores abióticos (VEIGA-JUNIOR et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2006;

RAMOS, 2006). A época de coleta também pode influenciar na concentração de seus

constituintes, embora alguns estudos com o uso da Copaifera duckei não tenham apresentado

diferença significativa na composição de óleos extraídos das mesmas árvores, em épocas

sazonais diferentes (CASCON; GILBERT, 2000).

119

As infecções do trato genital baixo têm sido a causa mais frequente de consulta

ginecológica (50-70% das queixas). Acredita-se que toda mulher sexualmente ativa já tenha

tido pelo menos um episódio de vaginose bacteriana e/ou vulvovaginite. Diversas doenças

microbianas (bacteriana, viral ou fúngica) são relatadas na literatura. Em muitos casos, os

responsáveis pelas infecções, bacterianas e fungicas, adquirem resistência ao medicamento

administrado, e por este motivo grande número de antibióticos e/ou quimioterápicos tem sido

desenvolvido (KOSHI; CHERIAN, 1995).

O aumento da resistência das bactérias e fungos aos antibióticos/quimioterápicos

convencionais tem estimulado intensos esforços para desenvolver novos agentes

antimicrobianos eficazes. Desta forma, os produtos naturais podem ser usados como

alternativa aos antimicrobianos atuais. Este cenário tem despertado o interesse da classe

científica e da indústria farmacêutica, sobretudo, nas moléculas de origem vegetal, já que as

plantas possuem grande potencial em sintetizar substancias químicas com estruturas

diversificadas, como sistema de defesa contra os agentes patogênicos (RODRIGUES et al.,

1997). Contudo, para que sejam efetivas como agentes antimicrobianos, as substâncias

precisam ser produzidas e acumuladas em concentrações suficientes nos órgãos e sítios

intracelulares, e se são efetivas em tecidos vegetais poderão ser efetivas em tecidos animais

(SANTOS, 1998).

O óleoresina de copaíba é um dos mais conhecidos produtos fitoterápicos amazônicos,

sendo reconhecido pela sua grande utilização na medicina popular, devido à sua propriedade

de restaurar mucosas, principalmente no caso de inflamações ginecológicas (FRANCISCO,

2005) e ação desinfectante de secreções no trato pulmonar humano. Tem propriedades

diuréticas, o que explica seus efeitos benéficos nas cistites (BRITO et al, 2001). Assim,

também é utilizado no tratamento da leucorréia e blenorragia por via tópica (cápsulas

vaginais) e por via oral, pois o óleo é eliminado por via renal e tem trânsito uretral (BRITO et

al., 2001). Atualmente, o conhecimento tradicional, principalmente, sobre os produtos da


novos produtos farmacêuticos. Apesar da existência de vários cremes vaginais no mercado, o

óvulo de copaíba nunca deixou de ser utilizado pela população (LIMA et al., 2011).

Na literatura já foram descritos ao óleoresina de copaíba, efeito anti-inflamatório

(CARVALHO et al., 2005; BIAVATTI et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2008;

KOBAYASHI et al., 2011), analgésico (VEIGA-JUNIOR; PINTO, 2002; OLIVEIRA et al.,

2005; CARVALHO et al., 2005; PACHECO et al., 2006), antimicrobiano (VEIGA-JÚNIOR

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kobayashi%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21323483

120

et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2006; PACHECO et al., 2006; NAKAMURA et al., 2008;

SANTOS et al., 2009; PIERI et al., 2012), antibacteriano e bacteriostático (VEIGA-JUNIOR;

PINTO, 2002; DRUMOND et al., 2004; VEIGA-JUNIOR et al., 2005; FREIRE et al., 2006;

SOUZA et al., 2011; PIERI, 2012), anti-helmíntico e tripanomicida (CAVALCANTI NETO

et al., 2005; BIAVATTI et al., 2006; IZUMI et al., 2012), antifúngico, antineoplásico

(VEIGA- JÚNIOR; PINTO, 2002; PEDREIRA, 2007; SANTOS et al., 2009), antitetânico

(BRITO et al., 2000), cicatrizante (EURIDES et al., 1998; BRITO et al., 1999; ESTEVÃO et

al., 2009), antitumoral (MACIEL et al., 2002; LIMA et al., 2003; RIGAMONTE-AZEVEDO

et al. 2004; VEIGA-JUNIOR et al., 2005; OLIVEIRA et al, 2006; PACHECO et al., 2006),

germicida (BLOISE, 2003), expectorante (BRITO et al., 2000; MACIEL, et al., 2002;

RIGAMONTE-AZEVEDO et al., 2004; BRITO et al., 2005; FREIRE et al., 2006; RAMOS,

2006) e diurético (MACIEL et al., 2002; FREIRE et al., 2006; SILVA et al., 2006).

Outras indicações também são conhecidas e citadas, como a ação antiviral (VEIGA-

JUNIOR; PINTO 2002), repelente, larvicida e inseticida (MACIEL et al., 2002; GERIS et al.,

2008; PROPHIRO et al., 2012; KANIS et al., 2012), sífilis (PACHECO et al., 2006),

antiblenorrágico, antileucorréico e cercaricida (MACIEL et al., 2002; RIGAMONTE-

AZEVEDO et al., 2004). Outras ações referentes aos óleos de copaíba também têm sido

descobertas, como a de vasorelaxante, citotóxico e embriotóxico (COSTA-LOTUFO et al.,

2002), com o isolamento do diterpeno, ácido caurenóico, também capaz de acumular além de

atividade anti-inflamatória e protetora de colite induzida por ácido acético (PAIVA et al.,

2004; VEIGA-JUNIOR et al., 2005).

Lima-Silva et al. (2009) pesquisaram o efeito do óloresina de C. langsdorffii, na

isquemia e reperfusão de retalhos cutâneos ranzomizados no dorso de ratos e, notaram

discreta ação anti-lipoperoxidativa, intensa ação anti-oxidante e atividade anti-inflamatória. A

ação farmacológica dos óleos de Copaifera sp. é atribuída à estrutura química de seus

constituintes (LIMA-NETO et al., 2008, SANTOS et al., 2009), que tem como principais

componentes responsáveis os hidrocarbonetos sesquiterpênicos, especialmente o β-bisaboleno

e β-cariofileno (VEIGA-JUNIOR; Pinto, 2002; OLIVEIRA et al., 2005; VEIGA-JUNIOR et

al., 2005; RAMOS, 2006). Porém, o exato mecanismo de ação desses compostos ainda não

está bem elucidado (BRITO et al., 2001; WESTPHAL et al., 2007; SOUZA et al., 2011).

Desta forma, é importante ressaltar que a população já utiliza este óleoresina para

diversos fins terapêuticos, contudo, existe a necessidade de trabalhos que esclareçam melhor a

segurança deste fitoterápico. Lima et al (2011) realizaram um estudo, performance

121

reprodutiva, de ratas prenhas submetidas ao tratamento com o creme vaginal de ORCD

(óleoresina de Copaifera duckei). Os resultados deste estudo demonstraram ausência de

toxidade materna e embriofetotoxidade na dose administrada, correspondente a 10 vezes a

dose que será usada em humanos. Estudos de toxicologia reprodutiva dessa magnitude são

importantes dar subsídios à prescrição médica para mulheres gestantes. Com base na

aplicação desse creme vaginal do ORCD, esse estudo teve como objetivo avaliar os efeitos

tóxicos em fase de tratamento subcrônico.

122


2.1 MATERIAL

Foi obtido da empresa Beraca, situada em Ananindeua, no estado do Pará, que tem

como foco o uso dos produtos da biodiversidade Amazônica. A pesquisa e o desenvolvimento

de seus produtos são realizados em parceria com universidades localizadas na região.

Segundo o laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD). A

análise do ORCD em CG-EM está descrito no capítulo 1.

O creme vaginal de copaíba (CVORCD) e o creme base (CVB) foram obtidos no

Laboratório Farmacêutico ALMEIDA PRADO LTDA, situado na cidade de São Paulo, São

Paulo, Brasil, na concentração de 2,5% e disponibilizado em frascos de polietileno.

2.2 ASPECTOS ÉTICOS

Antes do início das atividades no Biofármacos do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa (UFV), o projeto de tese foi

submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Amapá,

recebendo o número 008A/2011 (APÊNCIDE A).

2.2.1 Animais

Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus), linhagem wistar (machos e fêmeas), com

peso médio de 145 a 220g, provenientes do Biotério da Universidade Federal de Juiz de Fora,

Minas Gerais. Após a chegada dos animais no laboratório Biofármacos do Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Viçosa (UFV), estes passaram

por um período de adaptação e foram mantidos em sala com umidade e temperatura

controlada, em torno de 23oC ± 2

oC, com ciclo de 12 horas de claro/escuro, com água e ração

ad libitum.

123

2.2.2 Vias de administração e doses utilizadas

Para o estudo da toxidade em fase de tratamento subcrônico (22 dias de tratamento) foi

empregada a via oral (v.o com cânula para gavagem) e via vaginal (v.v com micropipeta). Os

grupos tratados receberam a dose de 320 mg/kg, 40 mg/kg e 28 mg/kg, respectivamente, com

óleoresina de C. duckei (v.o), óleoresina de C. duckei (v.v) e creme vaginal do óleoresina de

C. duckei (v.v). Para os grupos controles foi utilizado 0,5 mL de água destilada (v.o) e 220 mg

do creme vaginal base (v.v).

2.2.3 Grupos experimentais

Os 35 animais foram divididos, aleatoriamente, de acordo com o tipo de tratamento.

Assim, 20 animais foram divididos em dois grupos (n=10/grupo, sendo 5 machos e 5 fêmeas)

e tratados via oral, com o óleoresina de C. duckei e água destilada (ORCD e Controle). Os

outros 15 animais (fêmeas) foram divididos em três subgrupos (n=5/grupo), que receberam

tratamento via vaginal, o creme vaginal do óleoresina de C. duckei (CVORCD), outro

somente com o óleoresina de C. duckei (ORCDV) e o grupo controle apenas com o creme

vaginal base (Controle CVB).


ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL)

2.3.1 Desenvolvimento ponderal e consumo de água e ração

Os animais foram pesados a cada 5 dias (d1, d5, d10, d15, d20), utilizado balança

Gehaka BG4000, com capacidade de 4200 g e precisão de 0,1 g. O consumo de água e ração

foi mensurado, diariamente, desde o início do tratamento até o d20, utilizando-se proveta e a

balança, respectivamente. Diariamente, foi oferecido 100g de ração e 250 mL de água ao

grupo.

124

2.3.2 Coleta da amostra

Após o término do tratamento, os animais foram submetidos ao jejum de 12 horas, e

após, foram anestesiados com tiopental sódico (35 mg/kg, i.p). A coleta de 5 mL de sangue foi

realizada pela veia porta-hepática, sendo acondicionado em dois tipos de tubos: um com

anticoagulante EDTA para determinação dos parâmetos hematológicos e outro, sem

anticoagulante, para obtenção do soro e avaliação dos parâmetros bioquímicos.

Posteriormente, procedeu-se a eutanásia por deslocamento cervical.

2.3.3 Avaliação dos parâmetros bioquímicos

Para análise bioquímica, o material foi centrifugado a 3.500 rpm durante 10 minutos,

para separar o soro dos elementos figurados do sangue. Posteriormente, procedeu-se a

dosagem das enzimas plasmáticas, como aspartato aminotransferase (AST) e alanina

aminotransferase (ALT), do colesterol total e a fração HDL, triglicérides, fosfatase alcalina,

albumina, glicose e creatinina, utilizando kits BIOCLIN® (ensaios enzimáticos colorimétricos

e cinéticos colorimétricos) e o equipamento multiparamétrico (Alizé) da Biomérieux.

2.3.4 Avaliação dos parâmetros hematológicos

Para análise hematológica, fez-se o hemograma completo, determinando os

valores de hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos, plaquetas e os índices

hematimétricos, volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e

concentração de hemoglobina corpuscular média (HCM), utilizando analisador automático de

células hematológicas HumaCount Plus. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em

extensões coradas com May-Grunwald-Giemsa, em cada ensaio, 100 células foram analisadas

e contadas.

2.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados obtidos nas diversas análises foram expressos em média erro padrão da

média (média ± E.P.M) de cada grupo experimental. Para comparar os dados do consumo de

água, ração e desenvolvimento ponderal, empregou-se o teste “t” de Student (não pareado).

125

Para a análise bioquímica e hematológica, aplicou-se o teste de Mann-Withney. Para análise

dos grupos tratados por via vaginal, foi utilizado ANOVA, seguido do teste de Tukey. O nível

de significância considerado foi de 5% (p< 0.05). Os softwares utilizados foram o Instat

GraphPad® e Prism GraphPad

®.

126



ÓLEORESINA DE COPAÍBA (VIA ORAL E VAGINAL)

3.1.1 Desenvolvimento ponderal, consumo de água e ração

Durante o tratamento, não foram observados sinais clínicos de toxidade e

nenhuma morte foi registrada. O ORCD não alterou o desenvolvimento ponderal dos animais

(machos e fêmeas) nos 22 dias de tratamento, pois não houve diferença estatística

significativa entre os grupos controle e tratados com o óleoresina pela via oral (ORCD 320

mg/kg) (Figura 1).

Figura 1. Efeito da administração (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 mg/kg) e água

destilada (Controle) sobre o desenvolvimento ponderal de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.

Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo).

A ingestão diária de água foi maior nos grupos tratados com óleoresina (ORCD 320

mg/kg) por via oral, tanto nos machos como nas fêmeas, contudo foi significativo somente

entre as fêmeas (Figura 2). O consumo diário de ração foi maior nos grupos controles

(machos e fêmeas), mas não houve significância estatística entre os grupos (Figura 3).

1 5 10 15 20150

200

250

300Controle (Machos)

ORCD 320 mg/Kg (machos)

Controle (fêmeas)

ORCD 320 mg/Kg (Fêmeas)

Tempo (dias)

mas

sa c

orp

ora

l (g)

127

0

10

20

30

40Controle (machos)

ORCD 320 (machos)

Controle (fêmeas)


*

Águ

a (m

L)


destilada (Controle) sobre o consumo diário de água de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os

valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05.

0

5

10

15

20

25Controle (machos)

ORCD 320 mg/Kg (machos)

Controle (fêmeas)


Raç

ão (

g)


destilada (Controle) sobre o consumo diário de ração de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar. Os

valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo).

Apesar da ingestão diária de água ser maior nos grupos tratados com ORCD (machos e

fêmeas), somente no grupo das fêmeas este fato pode estar relacionamento ao tratamento,

apontando, talvez, maior suscetibilidade específica das fêmeas. Sachetti et al. (2009) ao

estudar a toxidade, aguda oral, do óleoresina de C. reticulata (300 e 2000 mg/kg) em ratas

Wistar, não observaram diminuição no peso corpóreo e sinais clínicos de toxidade, assim

como alteração no consumo de ração. Em relação ao tratamento subcrônico do CVORCD por

via vaginal, não houve alteração no desenvolvimento ponderal das fêmeas tratadas CVORCD,

somente do grupo tratado com ORCDV, sem significância estatística (Figura 4).

128

1 5 10 15 20170

180

190

200

210

220

230Controle CVB

Tratado CVORCD 28 mg/Kg

Tratado ORCDV 40 mg/Kg

Tempo (dias)

mas

sa c

orp

ora

l (g)

Figura 4. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei (Tratado

CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. duckei (Tratado ORCDV 40 mg/kg) e creme vaginal base

(Controle CVB) sobre o desenvolvimento ponderal de ratas, linhagem Wistar. Os valores representam

a média ± E.P.M (n=5/grupo). ∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **

p < 0.05 grupo

ORCDV comparado ao grupo CVORCD.

O consumo diário de água não foi diferente entre os grupos tratados (CVORCD 28

mg/kg e ORCDV 40mg/kg) e Controle CVB (Figura 5). Todavia, a ingestão de ração foi

maior no grupo tratado (CVORCD 28 mg/kg). Foi observado, também, diferença entre o

grupos CVORCD 28 mg/kg e tratado, unicamente, com o óleoresina de copaíba (ORCDV

40mg/kg) (Figura 6).

0

10

20

30Controle CVB

CVORCD 28 mg/Kg

ORCDV 40 mg/Kg

Águ

a (m

L)

Figura 5. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei (CVORCD 28

mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre o

consumo diário de água de ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M


p < 0.05 grupo ORCDV comparado ao

grupo CVORCD.

129

0

5

10

15

20Controle CVB

CVORCD 28 mg/Kg

ORCDV 0.04 mg/Kg

Raç

ão (

g)

Figura 6. Efeito da administração (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei (CVORCD 28

mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle CVB) sobre o

consumo diário de ração de ratas, linhagem Wistar. Os valores representam a média ± E.P.M


p < 0.05 grupo ORCDV comparado ao

grupo CVORCD.

3.1.2 Avaliação dos parâmetros bioquímicos

O tratamento subcrônico com o óleoresina de C. duckei, por via oral, demonstrou

alterações na dosagem de alguns parâmetros bioquímicos nas fêmeas (colesterol total = 76.8 ±

2.2, HDL = 37.1 ± 1.5 e FA = 112.6 ± 16.6). Estes parâmetros estiveram mais elevados, se

comparados ao grupo controle. Observou-se, nos grupos tratados, diminuição da glicemia

(83.3 ± 4.2 e 52.7 ± 10.0) e aumento significativo, dos níveis séricos de creatinina (0.5 ± 0.0 e

1.2 ± 0.3), repectivamente, em machos e fêmeas (Tabela 1). O ORCDV e o CVORCD, não

alteram os parâmetros bioquímicos das ratas, pois não houve diferença significativa, se

comparadas ao grupo Controle CVB (Tabela 2).

*

**

130

Tabela 1. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 mg/kg) e água

destilada (Controle) sobre os parâmetros bioquímicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem Wistar.

FÊMEAS MACHOS

Controle ORCD 320 mg/kg Controle ORCD 320 mg/kg

AST (U/L) 241.6 ± 50.0 304.0 ± 9.2 193.2 ± 27.6 198.4 ± 29.3

ALT (U/L) 83.6 ± 22.1 95.0 ± 21.7 53.0 ± 4.8 50.6 ± 6.0

Colesterol total

(mg/dL) 66.5 ± 1.8 76.8 ± 2.2

* 61.6 ± 3.3 67.8 ± 8.0

Colesterol HDL

(mg/dL) 27.9 ± 1.0 37.1 ± 1.5

* 31.6 ± 1.2 30.0 ± 2.0

Triglicerídeos

(mg/dL) 82.0 ± 4.5 75.0 ± 7.2 55.5 ± 2.3 56.9 ± 12.4

FA (U/L) 23.6 ± 2.4 112.6 ± 16.6* 90.8 ± 8.9 114.4 ± 9.4

Albumina (g/dL) 3.5 ± 0.0 3.6 ± 0.0 3.7 ± 0.0 3.7 ± 0.0

Glicose (mg/dL) 111.7 ± 20.9 52.7 ± 10.0* 154.5 ± 6.7 83.3 ± 4.2

*

Creatinina (mg/dL) 0.5 ± 0.0 1.2 ± 0.3* 0.4 ± 0.0 0.5 ± 0.0

*

Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05 (Teste de Mann-Whitney). AST: aspartato

aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina.

Tabela 2. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei

(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle

CVB) sobre os parâmetros bioquímicos de ratas, linhagem Wistar.

FÊMEAS

Controle CVB CVORCD 28 mg/kg ORCDV 40mg/kg

AST (U/L) 435.6 ± 83.8 325.0 ± 13.9 505.4 ± 56.1

ALT (U/L) 106.2 ± 25.5 63.6 ± 11.3 134.6 ± 26.8

Colesterol total (mg/dL) 77.4 ± 3.9 82.0 ± 5.5 79.9 ± 3.8

Colesterol HDL (mg/dL) 35.6 ± 2.2 34.0 ± 1.4 33.5 ± 2.0

Triglicerídeos (mg/dL) 79.6 ± 3.1 67.6 ± 7.8 78.3 ± 1.8

FA (U/L) 36.2 ± 6.6 28.8 ± 4.8 28.2 ± 5.0

Albumina (g/dL) 3.8 ± 0.1 3.7 ± 0.0 3.7 ± 0.0

Glicose (mg/dL) 95.6 ± 9.5 133.9 ± 17.1 110.3 ± 6.8

Creatinina (mg/dL) 0.6 ± 0.0 0.6 ± 0.0 0.6 ± 0.0

Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo).∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **

p < 0.05

grupo ORCDV comparado ao grupo CVORCD (ANOVA, seguido do teste de Tukey). AST: aspartato

aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina.

131

3.1.3 Avaliação dos parâmetros hematológicos

Os parâmetros hematológicos (hemograma completo e contagem total e diferencial de

leucócitos) foram avaliados no 23o dia, após o término do tratamento com o ORCD (v.o e v.v)

e o CVORCD (v.v). O tratamento, via oral, não ocasionou interferências (machos e fêmeas),

pois as os parâmetros sanguíneos estiveram dentro da faixa de normalidade (CLIFFORD;

GIKNIS, 2008), exceto as plaquetas das fêmeas tratadas (1400.3 ± 130.7) (Tabela 3).

Tabela 3. Efeito da administração subcrônica (v.o) do óleoresina de C. duckei (ORCD 320 mg/kg) e

água destilada (Controle) sobre os parâmetros hematológicos de ratos (machos e fêmeas), linhagem

Wistar.

Os valores representam a média ± E.P.M (n=5/grupo), ∗p < 0.05 comparado ao grupo controle (Teste de Mann-

Whitney). Hm: Hemácias; Hb: Hemoglobina; Ht: Hematócrito, VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM:

Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média.

No tratamento CVORCD 28 mg/kg, foi observado valores estatisticamente diferente

em relação ao Controle CVB (hemoglobina, hematócrito e linfócitos). Os valores de

Monócitos (Controle CVB = 7.0 ± 3.6 e Tratado CVORCD = 12.4 ± 4.5), eosinófilos

(Controle CVB = 6.0 ± 1.7; CVORCD = 9.6 ± 4.5 e ORCDV = 7.4 ± 2.2) e plaquetas

(CVORCD = 1256.4 ± 64.8) estão acima dos valores de referência (CLIFFORD; GIKNIS,

2008). No grupo ORCDV 40mg/kg, observou-se diminuição do índice hematimétrico HCM

(18.9±0.3) e hemácias (8.1 ± 0.0) se comparadas ao grupo tratado com creme vaginal

(CVORCD 28 mg/kg), todavia estão dentro da faixa de normalidade (CLIFFORD; GIKNIS,

2008) (Tabela 4).

FÊMEAS MACHOS

Controle ORCD 320

mg/kg Controle

ORCD 320

mg/kg

Hm (x106/mm

3) 7.9 ± 0.1 7.9 ± 0.1 9.2 ± 0.0 8.9 ± 0.2

Hb (g/dL) 14.8 ± 0.1 14.7 ± 0.2 15.7 ± 0.1 15.7 ± 0.1

Ht (%) 41.3 ± 0.4 40.4 ± 0.6 48.0 ± 0.3 46.7 ± 1.1

VCM (fl) 52.2 ± 0.6 51.2 ± 0.4 52.0 ± 0.3 52.6 ± 0.5

HCM (pg) 18.6 ± 0.1 18.5 ± 0.2 17.0 ± 0.1 17.6 ± 0.4

CHCM (g/dL) 35.7 ± 0.3 36.3 ± 0.3 32.7 ± 0.1 32.9 ± 0.4

Leucócitos

(x103/mm

3)

3.7 ± 0.6 6.1 ± 1.9 3.6 ± 0.6 4.0 ± 0.6

Linfócito (%) 56.2 ± 3.8 66.6 ± 3.5 63.8 ± 2.1 68.4 ± 2.8

Monócito (%) 2.4 ± 0.6 2.2 ± 0.5 1.6 ± 0.4 2.4 ± 0.6

Neutrófilo seg. (%) 40.0 ± 3.5 28.4 ± 2.7 32.6 ± 2.2 27.8 ± 2.7

Eosinófilo (%) 1.4 ± 1.4 2.8 ± 0.9 2.0 ± 0.8 1.2 ± 0.8

Plaquetas (x103/mm

3)

1069.0 ±

35.5 1400.3 ± 130.7

1026.3 ±

159.0 1059.6 ± 62.4

132

Tabela 4. Efeito da administração subcrônica (v.v) do creme vaginal do óleoresina de C. duckei

(CVORCD 28 mg/kg), do óleoresina de C. dukei (ORCDV 40mg/kg) e creme vaginal base (Controle

CVB) sobre os parâmetros hematológicos de ratas, linhagem Wistar.

Controle CVB CVORCD 28 mg/kg ORCDV 40mg/kg

Hm (x106/mm

3) 7.9 ± 0.2 7.4 ± 0.1 8.1 ± 0.0

**

Hb (g/dL) 15.4 ± 0.2 14.6 ± 0.1* 14.8 ± 0.0

Ht (%) 41.5 ± 1.3 38.8 ± 0.7* 42.2 ± 0.4

VCM (fl) 52.4 ± 0.5 52.2 ± 0.3 51.2 ± 0.2

HCM (pg) 19.4 ± 0.5 19.7 ± 0.3 18.9 ± 0.3**

CHCM (g/dL) 37.1 ± 0.7 37.7 ± 0.5 35.2 ± 0.5

Leucócitos (x103/mm

3)

Linfócitos (%)

Monócitos (%)

Neutrófilos segmentados (%)

Eosinófilos (%)

Plaquetas (x103/mm

3)

6.1 ± 2.8

64.8 ± 5.1

7.0 ± 3.6

22.2 ± 2.5

6.0 ± 1.7

1078.6 ± 140.4

3.3 ± 0.5

45.4 ± 5.9*

12.4 ± 4.5

32.6 ± 4.2

9.6 ± 4.5

1256.4 ± 64.8

2.3 ± 0.1

58.8 ± 3.0

2.2 ± 0.8

31.6 ± 3.4

7.4 ± 2.2

1005.2 ± 71.2

∗p < 0.05 comparado ao grupo Controle CVB, **

p < 0.05 grupo CVORCD comparado ao grupo CVORCD

(ANOVA, seguido do teste de Tukey). Hm: Hemácias; Hb: Hemoglobina; Ht: Hematócrito, VCM: Volume

Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina

Corpuscular Média.

Na avaliação dos parâmetros hematológicos, o óleoresina de ORCD, administrado por

via oral, não interferiu nos valores do hemograma completo (eritrograma e leucograma) em

ratos (machos e fêmeas). O uso subcrônico do CVORCD alterou a hemoglobina, hematócrito

e linfócitos. Os valores de VCM e CHCM, comumente usados na classificação morfologica

das anemias, estiveram dentro da faixa de normalidade neste estudo (CLIFFORD; GIKNIS,

2008). A insuficiência renal e hepática crônica podem ocasionar anemias, do tipo normocítica

normocrômica, isto é, quando o VCM e CHCM estão dentro dos valores de referência.

Todavia, apesar do decréscimo da concentração de hemoglobina das ratas tratadas com

CVORCD, a hipótese de anemia pode ser descartada; pois embora a diferenças entre os

grupos tenha sido significativa, os valores da hemoglobina e do hematócrito estão dentro da

faixa de normalidade (CLIFFORD; GIKNIS, 2008).

133

De maneira inversa, os valores dos monócitos, eosinófilos e plaquetas dos grupos

controle e tratados (CVORCD e ORCDV) encontram-se acima dos valores de referência

(CLIFFORD; GIKNIS, 2008), mas este resultado é aceitável, visto que, variações em diversos

parâmetros, tanto hematológicos como bioquímicos podem existir em ratos e camundongos.

Segundo Pinheiro et al. (2003), as diferenças podem estar relacionadas com o gênero, a

linhagem, o genótipo e, também, podem ser influenciados pelo ambiente, manuseio, dieta,

idade, entre outros fatores.

A elevação do colesterol total (76.8 ± 2.2) e colesterol-HDL (37.1 ± 1.5) nas fêmeas

tratadas ORCD 320 mg/kg foi pouco expressivo, pois os valores encontram-se dentro da faixa

de referência (DANTAS, 2006; CLIFFORD; GIKNIS, 2008). Por isso, não deve ser atribuído

como alteração clínica importante, porém o uso subcrônico ORCD, por via oral, pode estar

associado à algum tipo de suscetibilidade específica das fêmeas, já que não houve

manifestações equivalentes nos machos.

Os níveis séricos de aminotransferases indicam alteração funcional ou estrutural da

célula hepática, podendo ser utilizado para avaliar a função hepática de maneira confiável. A

maior parte da AST está localizada nas mitocondrias dos hepatócitos, enquanto a ALT

localiza-se principalmente no citoplasma (HESSEL, 1996). A lesão hepática hepatocelular é

designada se ALT for duas vezes maior que o valor limítrofe ou se a razão ALT/FA ≥ 5;

colestática se FA for duas vezes maior que o valor limítrofe ou a proporção ALT/FA ≤ 2; e

mista (hepatocelular e colestática) se a proporção ALT/FA variar de 2 a 5 (KAPLOWITZ,

2001).

A FA também esteve elevada nas fêmeas tratadas ORCD (112.6 ± 16.6), todavia,

também não deve ser considerado como indicativo de alteração clínica importante, pois os

níveis séricos encontram-se dentro dos valores de referência (CLIFFORD; GIKNIS, 2008).

Por outro lado, Botelho et al. (2010) também notaram aumento no soro da FA, após

tratamento subagudo com óleoresina de C. officinalis. Neste estudo, os níveis séricos das

enzimas (AST e ALT) não foram diferentes, estatisticamente, entre os grupos controles e

tratados, tanto por por via oral (machos e fêmeas), como pela via vaginal (CVORCD, CVB e

ORCDV). É importante ressaltar que em todos os grupos, os valores estiveram acima dos

valores de referência (CLIFFORD; GIKNIS, 2008), a exceção da ALT do grupo CVORCD

(63.6 ± 11.3).

A elevação de ALT e AST, bem como a proporção de ALT/FA ≤ 2 (lesão hepática

colestática) (KAPLOWITZ, 2001), parece não estar associado ao uso do óleoresina de C.

134

duckei e do creme vaginal. Contudo, estudos adicionais, tal como a análise histopatológica do

fígado seria necessário, visando esclarecer melhor a existência ou não de lesão hepática.

Araújo-Júnior et al. (2005) corrobora os resultado obtidos neste estudo, pois o óleoresina de

C. officinalis, também, não foi capaz de alterar os níveis séricos de AST e ALT após

tratamento agudo (7 dias), sem danos relevantes nos hepatócitos de ratos wistar (machos).

Não obstante, Noguchi et al. (2002) observaram diminuição dos níveis séricos das enzimas

hepáticas AST e ALT, após o tratamento com óleoresina de C. reticulata. Um estudo

conduzido por Castro-e-Silva et al. (2004) foi levado a efeito ao identificar atividade

antiproliferativa, durante a regeneração hepática em ratos, após o uso do óleoresina de C.

duckei. Segundo o autor, este óleoresina pode alterar a função mitocondrial, desacoplando e,

causando uma relativa diminuição da regeneração e da função do fígado.

Os níveis séricos de creatinina e a concentração sanguínea da uréia são dois

importantes fatores para se avaliar o índice de filtração glomerular, níveis estes que podem

estar elevados ou diminuídos em determinadas situações. A creatinina é um composto

endógeno, obtido por meio do metabolismo muscular da creatina, sendo constante a sua

produção pelo organismo. O valor sérico desse metabólito, além da função renal, depende da

massa muscular, nutrição e ocorrência de edema (PASUPATHY et al., 2011). Neste estudo,

os níveis séricos de creatinina (machos e fêmeas) estiveram elevados em relação ao grupo

controle. Entretanto, nos machos os valores mantiveram-se dentro dos valores de referência

(CLIFFORD; GIKNIS, 2008), não sendo associado qualquer alteração clínica importante,

mas nas fêmeas sugere-se algum tipo de suceptibilidade neste gênero. Esse achado, pode estar

associado ao uso subcrônico de ORCD, porém estudos adicionais, tal como a dosagem de

uréia e análises morfológica e histopatológica dos rins, devem ser realizados para comprovar

essa alteração na função renal e/ou lesão renal.

Brito et al (2001) avaliaram a função renal de ratos, dosando uréia e creatinina, após

tratamento oral, subagudo (14 dias), com óleoresina de C. reticulata (0.06 ml/kg e 0.63

ml/kg), e concluíram que esse óleoresina não é capaz de alterar a função renal de ratos wistar.

Em outro estudo (BRITO et al. 2005), observaram a melhora da função renal de ratos

submetidos à síndrome de isquemia e reperfusão renal, após administração, por sete dias, do

óleoresina de C. multijuga (0.63 ml/kg).

Por outro lado, o uso do óleoresina de C. officinalis provocou vasocongestão

glomerular difusa, fato que pode alterar patologicamente a função renal; entretanto, as

dosagens de uréia e creatinina não foram realizadas no referido estudo (BOTELHO et al.

135

2010). Segundo Alves (2007), níveis plasmáticos alterados de uréia, em ratos, não são bons

indicadores de lesão renal, porém alterações nos níveis de creatinina podem ser um indicador

confiável para avaliar a presença da lesão, pois seu nível sérico não é influenciado pela dieta,

idade e sexo.

O tratamento, via oral, com ORCD causou um efeito hipoglicemiante, tanto em

machos como em fêmeas. Esta ação farmacológica pode estar associada à presença, neste

óleoresina, do ácido caurenóico. Este constituínte, é um ácido diterpênico presente na fração

resinosa dos óleos de Copaifera sp. (CASCON; GILBERT, 2000; VEIGA-JR; PINTO, 2002;

CARVALHO et al., 2005; LEANDRO et al., 2012). Segundo Bresciani et al. (2004), o

potencial hipoglicêmico de Wedelia paludosa pode estar associada, em parte, ao ácido

caurenóico presente em diversas partes desta planta.

O uso subcrônico com CVORCD não alterou os parâmetros bioquímicos analisados.

Não obstante, os resultados confirmam ausência de toxidade sistêmica, pois a maioria dos

parâmetros esteviveram dentro dos limites de normalidade, provavelmente, por não ocorrer

absorção do fármaco. O uso de medicamentos tópicos visa ação local, por exemplo, na pele e

mucosas, e em geral apresentam baixa toxidade. Segundo Robert e Scialli (1994), a pele pode

funcionar como depósito de substâncias ativas; Contudo, se a pele estiver íntegra, raramente o

fármaco será absorvido em quantidades significativas.

136

4 CONCLUSÃO

O tratamento subcrônico com ORCD na dose de 320 mg/kg não provocou

toxidade sistêmica (machos e fêmeas) pelos parâmetros avaliados (massa corporal, consumo

de água e ração, dosagens bioquímicas e hematológicas);

O tratamento subcrônico com o creme vaginal contendo o óleoresina de C. duckei

(CVORD) 28 mg/kg e o óleoresina (ORCDV 40 mg/kg) não causou toxidade sistêmica,

sugerindo apenas ação local;

Sugere-se segurança de uso do óleoresina de C. duckei, na vias de administração e

doses empregadas.

137

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CAPÍTULO 3: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA EM

RATAS SUBMETIDAS AO TRATAMENTO COM ÓLEO RESINA DE C.

duckei NOS PERÍODOS DE PRÉ-IMPLANTAÇÃO E PÓS-

IMPLANTAÇÃO E ANÁLISE DA TERATOGENICIDADE

144

RESUMO

A toxicologia experimental desenvolve estudos para elucidar os mecanismos de ação dos

agentes tóxicos nos diversos sistemas biológicos e a avaliação dos efeitos decorrentes dessa

ação. Estudos de toxidade reprodutiva revelam o efeito de uma ou mais substâncias ativas na

reprodução de mamíferos. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a toxidade

reprodutiva em ratas submetidas ao tratamento com óleoresina de Copaifera duckei (ORCD)

nos períodos de pré-implantação e pós-implantação e analisar a teratogenicidade. Para tanto,

foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), fêmeas, isogênicas, e machos. O

ORCD foi administrado por via oral (v.o), nas doses que correspondem a 10% da DL50

(3758,16 mg/kg) e 50% da DL50. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes

tratamentos: Grupo controle G1 (0,5 mL de água destilada), Tratado G2 (366,89 mg/kg de

ORCD) e Tratado G3 (1874 mg/kg de ORCD). Este estudo foi dividido em dois ensaios,

Experimento 1 (E1) e o Experimento 2 (E2), de acordo com os segmentos I e II dos estudos

de toxicologia reprodutiva, adaptados de normas da Environmental Protection Agency e

recomendados pela Food and Drugs Administration e Organization for Economic

Cooperation and Development. O E1 compreendeu o segmento I, avaliando-se apenas as

fêmeas durante a gestação no período de pré-implantação. Já o E2 compreendeu os

seguimentos I (fêmeas no período pós-implantação) e II (teratogenicidade). Para tanto, dos 40

animais, 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E1G1, E1G2 e E1G3) e 5 machos reprodutores

no E1 e 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E2G1, E2G2 e E2G3) e 5 machos reprodutores

no E2. O tratamento com ORCD no período pré-implantação (d0-d5) não provocou sinais

clínicos de toxidade no grupo E1G2 (366,89 mg/kg). Contudo, no grupo E1G3 (1874 mg/kg)

foi observado alguns sinais clínicos de toxidade aguda, tal como, diarréia, piloereção,

estresse, agitação, tremores, hemorragia nasal e vaginal. Além disso, houve registro de um

óbito, no d5 de prenhez, que correpondeu ao 6º dia de tratamento. O ORCD (366,89 mg/kg e

1874 mg/kg), administrado neste período crítico do densenvolvimento, pré-implantação,

demonstrou não alterar esse processo de sincronização, com êxito nas implantações do

blastocisto no útero. Quanto as perda pós-implantação, estas foram avaliadas mesmo não

compreendendo o período de tratamento com ORCD. Não foi observada diferença entre os

grupos, o que poderia descartar a hipótese de perda pós-implantação por metabólitos do

ORCD ainda presentes no sangue materno. No entanto houve alterações significativas no peso

fetal (nas duas doses) e índice placentário (na maior dose), sugerindo a presença de

metabólitos do ORCD, no entanto estudos adicionais, de toxicocinética devem ser realizados

para melhor definição e compreensão desses efeitos. O tratamento com ORCD no período

pós-implantação (d6-d15) evidenciou toxidade aguda, provocando diarréia e agitação após o

tratamento, tanto no grupo E2G2 (366,89 mg/kg) como no grupo E2G3 (1874 mg/kg). Porém

outros sinais clínicos de toxidade ocorreram apenas com o tratamento com a maior dose, tal

como estresse, piloereção, sialorréia, apatia, desidratação, hemorragia nasal e vaginal,

caracterizando aborto espontâneo. No presente estudo, não houve abortos espontâneos no

grupo controle (E2G1), e os casos registrados estão associados à toxidade materna sistêmica

do ORCD 1874 mg/kg. Quanto a análise da teratogenicidade, o ORCD nas doses

administradas, 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg, não causou nenhum tipo de alteração ou

malformação, tanto externamente como internamente (esquelética e visceral).

Palavras-chave: Copaifera duckei, óleoresina, toxidade reprodutiva, pré e pós-implantação e

teratogenicidade.

145

ABSTRACT

The experimental toxicology develops studies to elucidate the mechanisms of the toxic agents'

action in the several biological systems and the evaluation of the current effects of this action.

Studies of reproductive toxicity reveal the effect of one or more active substances in the

reproduction of mammals. Therefore, this study had the objective to evaluate the reproductive

toxicity in female rats submitted to the treatment with oil resin of Copaifera duckei (ORCD)

in the pre-implantation periods and post-implantation and to analyze the teratogenicity. Wistar

Mice were used (Rattus norvegicus albinus), females, isogenical, and males. ORCD was

administered orally (v.o), in the doses that correspond to 10% of DL50 (3758,16 mg/kg) and

50% of DL50. This way, the groups were submitted to the following treatments: Control

Groups G1 (0,5 mL of distilled water), Treated G2 (366,89 mg/kg of ORCD) and Treated G3

(1874 mg/kg of ORCD). This study was divided in two samples, Experiment 1 (E1) and the

Experiment 2 (E2), according to the segments I and II of the studies of reproductive

toxicology, adapted from the rules of Environmental Protection Agency and recommended by

the Food and Drugs Administration and Organization for Economic Cooperation and

Development. E1 was accomplished in the segment I, which were evaluated only the female

rats during the gestation in the pre-implantation period. E2 was accomplished the segments I

(female rats in the post-implantation period) and II (teratogenicity). 40 animals, 15 females

(experimental n=5/grupo, E1G1, E1G2 and E1G3) and 5 reproductive males in E1 and 15

females (experimental n=5/grupo, E2G1, E2G2 and E2G3) and 5 reproductive males in E2.

The treatment with ORCD in the pre-implantation period (d0-d5) did not cause clinical signs

of toxicity in the group E1G2 (366,89 mg/kg). However, in the group E1G3 (1874 mg/kg) it

was observed some clinical signs of acute toxicity, such as, diarrhea, piloerection, stress,

agitation, tremors, nasal and vaginal hemorrhage. Besides, there was one death, in the

pregnancy d5, which corresponds to the 6th day of treatment. ORCD (366,89 mg/kg and 1874

mg/kg), administered in this critical period of the development, pre-implantation, it showed

not to change that synchronization process, with success in the implantation of the blastocyst

in the uterus. About the loss post-implantation, these were evaluated even out of the treatment

period with ORCD. No difference was observed among the groups, what could discard the

hypothesis of loss post-implantation for metabolites of ORCD presents in the maternal blood.

However there were significant changes in the fetal weight (in the two doses) and placental

rate (in the largest dose), suggesting the presence of metabolites of ORCD, however

additional studies, of toxicokinetics should be accomplished for better definition and

understanding of those effects. The treatment with ORCD in the post-implantation period (d6-

d15) showed acute toxicity, causing diarrhea and agitation after the treatment, both in the

group E2G2 (366,89 mg/kg) and the group E2G3 (1874 mg/kg). However other clinical signs

of toxicity just happened when the treatment with the largest dose was administered, such as

stress, piloerection, sialorrhea, apathy, dehydration, nasal and vaginal hemorrhage, and

characterizing spontaneous abortion. In the present study, there were not spontaneous

abortions in the control group (E2G1), and the registered cases are associated to the systemic

maternal toxicity of ORCD 1874 mg/kg. About the analysis of the teratogenicity, ORCD in

the administered doses, 366,89 mg/kg and 1874 mg/kg, did not cause any change or

malformation, neither externally nor internally (skeletal and visceral).

Keywords: Copaifera duckei, oleoresin, reproductive toxicity, pre and post-implantation and

teratogenicity.

146

1 INTRODUÇÃO

O estudo das plantas medicinais iniciou-se, praticamente, no início da evolução do

homem sobre a terra. A percepção de que certas espécies de plantas eram capazes de curar e

que outras não serviam nem mesmo para o consumo alimentício, foi, sem dúvida, o primeiro

passo na descoberta sobre a potencialidade dos produtos naturais. Segundo Bendazzoli

(2000), esse conhecimento foi adquirido pelo homem primitivo, e deu-se, provavelmente, a

partir de um processo de tentativa e erro. Assim, a descoberta das propriedades

farmacológicas e a identificação da toxidade das plantas são processos que caminham juntos

ao longo da história.

A toxicologia experimental desenvolve estudos para elucidar os mecanismos de ação

dos agentes tóxicos nos diversos sistemas biológicos e a avaliação dos efeitos decorrentes

dessa ação. Dessa forma, estudos relacionados à composição química e aos seus efeitos

podem contribuir de modo efetivo na busca e potencial utilização de vegetais na produção de

novas drogas com segurança e eficácia (OGA, 2008). O objetivo dos estudos de toxidade

reprodutiva é revelar os efeitos de uma ou mais substâncias ativas na reprodução de

mamíferos. Por este propósito, investigações e interpretações dos resultados devem ser

relacionadas com outros dados farmacológicos e toxicológicos disponíveis, para determinar

situações em que riscos potenciais para a reprodução humana são maiores, menores ou iguais

àqueles relativos a outras manifestações toxicológicas (BRASIL, 2013).

Um defeito ao nascimento, ou defeito congênito, pode ser definido como uma

anormalidade estrutural, funcional ou do metabolismo presente no nascimento, que pode levar

às anormalidades físicas, deficiências mentais ou morte (SCHARDEIN, 2000). Cerca de 30%

das internações pediátricas estão relacionados a problemas de saúde relacionados com

malformações congênitas. Nos Estados Unidos, a cada ano, aproximadamente 120.000 bebês

nascem com uma malformação estrutural, sendo um para cada 33 nascidos vivos (HANSEN;

HARRIS, 2013). No Brasil, as malformações ocupam o segundo lugar entre as causas de

mortalidade infantil, determinando 11, 2% dos óbitos (GEREMIAS; ALMEIDA; FLORES,

2009).

Segundo Embiruçui et al. (2005), os teratógenos constituem agentes ambientais,

químicos, físicos e biológicos, que podem causar anormalidades obstétricas e (ou) fetais. A

classificação ds anomalias congênitas estão baseadas na gravidade dos achados anormais, que

podem ser classificadas como maiores ou menores. As maiores são as que resultam em graves

147

defeitos anatômicos, funcionais ou estéticos, que podem, às vezes, levar a óbito. Como

exemplo, anencefalia, fenda labial ou palatina, hidrocefalia, cardiopatia, entre outros. Já as

menores, geralmente, têm importância cirúrgica, médica ou estética e podem ser únicas ou

múltiplas e associar-se a malformações maiores, por exemplo, a prega simiesca, polidactilia e

clinodactilia do quinto dedo (FERNANDEZ et al., 2005).

A ciência que trata do estudo das anomalias e/ou malformações congênitas é a

teratologia. Wilson (1977) definiu a teratologia como “a ciência interessada em determinar as

causas, mecanismos e as manifestações dos erros no desenvolvimento, sejam eles estruturais

ou funcionais, que podem ser iniciados em qualquer período entre a fertilização e a maturação

pós-natal”. O termo toxicologia reprodutiva é recente, refere-se a uma área do conhecimento

relativamente nova, que tem suas raízes fortemente relacionadas à teratologia. Estudos

envolvendo toxicologia reprodutiva incluem malformações estruturais, retardo no

crescimento, dano no desenvolvimento e a morte do organismo (ROGERS; KAVLOCK,

2001). Esta área da toxicologia também se preocupa com o estudo da cinética, mecanismo de

ação tóxica, patogênese e as conseqüências da exposição aos agentes tóxicos ou condições

que levem ao desenvolvimento anormal do animal (ROGERS; KAVLOCK, 2001).

Estudos de toxidade do desenvolvimento pré-natal devem ser conduzidos em animais

de laboratório, para prevenir tragédias como a da talidomida. Estudos não clínicos de

toxicologia reprodutiva fornecem informações quanto aos perigos, tanto para a saúde materna

como riscos e/ou danos à saúde fetal (DASTON; SEED, 2007). Os fetos que foram expostos à

talidomida, por exemplo, apresentaram intestinos malformados, defeitos na audição, ausência

de orelhas, anomalias renais e oculares. Todavia, o fenótipo que mais chamou a atenção foi a

focomelia, uma síndrome caracterizada pela aproximação ou encurtamentos dos membros ao

tronco do feto (SMITHELLS; NEWMAN, 1992).

Os estudos de toxidade reprodutiva consistem em ensaios realizados em animais,

objetivando verificar o potencial de um xenobiótico provocar efeitos adversos sobre o

processo reprodutivo, incluindo a fertilidade, o desenvolvimento embriofetal,

desenvolvimento pós-natal dos descendentes até a maturidade sexual. Diante disso, torna-se

fundamental o conhecimento das etapas do desenvolvimento embrionário, pois alguns

estágios do desenvolvimento são mais vulneráveis que outros (ROGERS; KALVLOCK,

2001).

A exposição pré-natal e a pós-natal a tóxicos podem produzir mudanças que não

podem ser previstas a partir dos efeitos observados em adultos, e esses efeitos são muitas

148

vezes irreversíveis. Resultados adversos no desenvolvimento, em ambos os sexos, podem

resultar de exposição a agentes tóxicos no útero ou no leite (GIUSTI et al., 1995). Nas fases

pré e pós-natal, os órgãos sexuais e o sistema nervoso central que ainda estão se diferenciando

podem ser atingidos por substâncias presentes no sangue materno através da placenta, durante

a gestação, ou através do leite, durante a lactação. Além disso, indivíduos expostos durante

períodos críticos de desenvolvimento são mais vulneráveis à ação de substâncias químicas em

função da menor capacidade metabólica e excretora e da ausência de muitos mecanismos de

retroalimentação do sistema endócrino (ZENICK; CLEGG, 1989).

A prenhez de ratos pode ser dividida em três períodos: pré-implantação, organogênese

e fetal (FRITZ; GIESE, 1990). A fase de pré-implantação compreende o período que vai

desde a fecundação até a implantação do blastocisto no útero, que ocorre até o 6º dia (FRITZ;

GIESE, 1990). Esta fase é caracterizada pela presença de células totipotentes em divisão e a

exposição a um agente tóxico pode impedir a implantação do blastocisto no útero (ROGERS;

KALVLOCK, 2001). A redução do número de células no embrião, durante essa fase, pode

induzir retardo na formação do blastocisto (KOLA; FOLB, 1986) e, conseqüentemente,

aumento nas perdas pré e pós-implantação (LEMÔNICA et al., 1996). Segundo Almeida e

Lemônica (2000), a taxa de perda pré-implantação é a correlação entre o número de ovos

liberados e aqueles que, depois de fecundados, conseguiram ser implantados no útero. Já a

perda pós-implantação refere-se à relação entre o número de blastocistos implantados e

aqueles que não conseguiram se desenvolver. Ao blastocisto implantado, que não conseguiu

se desenvolver dá-se o nome de “reabsorção” e isso indica falha no desenvolvimento do

embrião.

Após a implantação, inicia-se a fase de organogênese, do 7º ao 14º. Esse período é

caracterizado por uma intensa proliferação e migração celular, remodelamento tissular e

formação rudimentar das estruturas e órgãos do corpo. É o período de maior susceptibilidade,

à ação de agentes teratogênicos, com indução de malformações, considerado o período

teratogênico clássico (BRENT, 1993). Após esta fase, dá-se início a terceira fase, conhecida

como fase fetal, caracterizada por diferenciação e crescimento tissular, maturação fisiológica

dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto, compreendendo o 16º ao 21º dia de

prenhez (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS; KALVLOCK, 2001). Nesse período, a

sensibilidade frente a malformações anatômicas é extremamente baixa, porém a exposição a

agentes químicos pode produzir morte celular e inibição da divisão celular. Essas alterações

podem interferir com a formação dos sistemas nervoso, endócrino e imunológico,

149

promovendo desordens funcionais e de comportamento (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS;

KALVLOCK, 2001).

A diferença genética, entre as espécies, faz com que se torne necessário, a utilização

de mais de uma espécie nos ensaios de toxicologia reprodutiva (MENGUE et al., 2001;

BRASIL, 2013). O estudo realizado por Van-Cauteren et al. (1987) é levado a efeito, pois a

utilização de três diferentes espécies de animais (ratos, coelhos e camundongos) nos ensaios,

possibilitou observar as diferentes respostas toxicológicas a cada espécie. Outro fator

importante é o período gestacional exposto a esse agente, pois, a susceptibilidade de cada

órgão a uma determinada anomalia ou malformação dependerá da etapa em que se encontra o

desenvolvimento, de forma que o concepto seja sensível a diferentes períodos (CALLIARI-

MARTIN, 1998; ROGERS; KAVLOCK, 2001).

Poucos estudos experimentais têm sido realizados para testar os efeitos teratogênicos

de plantas medicinais, embora a extrapolação desses dados tenha fundamental importância

para a prevenção de riscos tóxicos, tanto para a gestante como para o concepto. Um exemplo

de efeito tóxico ao concepto, foi descrito no estudo com extrato aquoso de boldo (Coleus

barbatus) administrado em ratas prenhes, nas doses de 440 e 880 mg/kg/dia, durante o

período de organogênese, resultando em alterações vertebrais e diminuição do número de

centros de ossificação (ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000). A utilização de qualquer

medicamento na gestação, mesmo que seja fitoterápico, deve-se considerar a relação risco-

benefício. Uma preparação fitoterápica, Kava Kava® (Piper methysticum Forst) foi avaliada

quanto a sua toxidade sistêmica e reprodutiva, não sendo observado, hepatotoxidade, toxidade

sistêmica, reprodutiva e teratogenicidade na dose de 35 mg/kg (PINTO, 2004).

Neste sentido, embora existam pequenas variações nos protocolos de avaliação de

risco de toxicologia pré-natal, entre as agências de regulamentação, de maneira geral, estas

requerem nos testes, um grupo de animais controle, e no mínimo, outros três, nos quais

receberão as diferentes doses da substância química a ser avaliada. Em geral, a escolha destas

doses está baseada nos seguintes critérios: uma que produza efeitos tóxicos, outra em que os

animais não manifestem qualquer alteração de toxidade e a outra, intermediária entre estas

(OECD, 2001a). Esta substância a ser testada deverá ser administrada, no mínimo, da

implantação à cesariana. Para avaliar a performance reprodutiva, um dia antes do parto, as

fêmeas são submetidas à cesariana, avaliando-se o número de corpos lúteos, nº de

implantações, com fetos e placentas pesados. A seguir, metade da prole é utilizada para

150

avaliação esquelética e a outra metade para pesquisa de anomalias viscerais, avaliando-se,

então, a teratogenicidade (OECD, 1996; US EPA, 1991).

Os estudos em teratologia, geralmente, apresentam baixas incidências de defeitos

congênitos. Para melhor atender a necessidade dos protocolos experimentais, a dose utilizada

deve ser tóxica, objetivando uma exposição sistêmica maior do que a esperada no humano

(WEBSTER; FREEMN, 2001). Embora a preconização dos estudos não clínicos seja a

realização da mesma via de administração a ser usada em humanos, a via oral é uma

importante via a ser investigada, principalmente, pela melhor visualização de seus efeitos

sistêmicos, pois determinados agentes químicos podem atravessar a placenta e atingir o feto.

As substâncias endógenas e exógenas que atravessarem a placenta penetram na circulação

fetal através da veia umbilical e passam pelo fígado do feto antes de atingirem o coração e a

circulação sistêmica (ADAMSON et al., 2002, CROSS, 2005).

O líquido amniótico é o principal reservatório de substâncias exógenas do feto, sendo

também a maior via de excreção de substâncias por ele deglutidas, as quais são filtradas pelo

rim fetal, retornando à mãe pela artéria umbilical (BURDON et al., 2007). Alguns

medicamentos podem ser transformados em metabólitos polares no fígado fetal e aí se

acumularem, por outro lado mesmo os agentes lipossolúveis que não sofreram

biotransformação entram em contato com ele, podendo causar diversas anomalias

ADAMSON et al., 2002, CROSS, 2005). O acúmulo de substâncias exógenas no

compartimento fetal pode acontecer, principalmente, devido à ausência de enzimas de

biotransformação, que dificulta a detoxificação pelo próprio feto (COX et al., 2009).

O óleoresina de copaíba, por ser um importante produto natural utilizado na medicina

tradicional, principalmente na região amazônica, é comumente, usado como anti-inflamatório,

analgésico e antisséptico, além de muitas outras ações farmacológicas já descritas. Várias

formulações e formas farmacêuticas estão disponíveis em farmácias e drogarias em todo

Brasil (Pieri et al., 2009).

Lima et al. (2011) realizaram um estudo de sobre a performance reprodutiva de ratas

prenhas submetidas ao tratamento com um creme vaginal a base do óleo de copaíba

(Copaifera duckei). Os resultados deste estudo demonstraram ausência de toxidade materna e

embriofetotoxidade na dose administrada, correspondente a 10 vezes a dose terapêutica

preconizada para o uso em mulheres. Estudos de toxicologia reprodutiva dessa magnitude são

importantes para dar subsídio ao clínico quanto à segurança de uso nesse grupo de mulheres,

as gestantes. Este capítulo teve como objetivo avaliar a toxidade reprodutiva do óleoresina de

151

C. duckei em dois períodos críticos da prenhez de ratas: o período de pré-implantação e o

período de pós-implantação do blastocisto, bem como a análise da teratogenicidade.

152


2.1 MATERIAL




Segundo o laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD).


Antes do início das atividades no LABORATÓRIO DE PESQUISA EM

FÁRMACOS/UNIFAP, o projeto de tese foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal do Amapá, recebendo o número 008A/2011 (APÊNDICE).

2.3 ANIMAIS

Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), 30 fêmeas, isogênicas,

provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em

Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade de Campinas – UNICAMP e 10 machos

provenientes do Laboratório Central do Amapá (LACEN-AP). Após a chegada dos animais,

os mesmo passaram por um período de adaptação, e foram mantidos em estantes climatizadas

com temperatura controlada (23±2º C), obedecendo a um ciclo claro/escuro de 12 horas

(período claro das 7:00 h da manhã às 19:00 h da noite) e receberam água e ração (Labina®) à

vontade até o início dos ensaios.

2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS

A DL50 do ORCD, em ratos por via oral, é 3,79 ml/kg, que correponde a 3758,16

mg/kg (CASCON, 2004). A via de administração utilizada foi a via oral (v.o), gavagem,

objetivando-se avaliar alterações sistêmicas. Neste estudo optou-se em utilizar doses que

correspondem a 10% da DL50 para o grupo tratado G2 e 50% da DL50 para o grupo tratado

G3. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos: O grupo controle

153

G1 (0,5 mL de água destilada), o tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e tratado G3 (1874

mg/kg de ORCD).

2.5 DESENHO EXPERIMENTAL

Este estudo foi dividido em dois ensaios, Experimento 1 (E1) e o Experimento 2 (E2),

de acordo com os segmentos I e II dos estudos de toxicologia reprodutiva, adaptados de

normas da Environmental Protection Agency e recomendados pela Food and Drugs

Administration e Organization for Economic Cooperation and Development. O E1

compreendeu o segmento I, avaliando-se apenas as fêmeas durante a gestação no período de

pré-implantação. Já o E2 compreendeu os seguimentos I (fêmeas no período pós-implantação)

e II (teratogenicidade). Para tanto, dos 40 animais, 15 fêmeas (n=5/grupo experimental,

E1G1, E1G2 e E1G3) e 5 machos reprodutores no E1 e 15 fêmeas (n=5/grupo experimental,

E2G1, E2G2 e E2G3) e 5 machos reprodutores no E2 (Figura 1).

154

Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 1 e 2 para avaliar a toxicologia reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C. duckei, de

acordo com os segmentos I (pré-implantação e pós-implantação) e II (teratogenicidade).

CONTROLE

0,5 mL água

E2G1 (n=5)

TRATADO 10% DL50

366,8 mg/kg

E2G2 (n=5)

TRATADO 50% DL50

1874 mg/kg

E2G3 (n =5)

SEGMENTO I Pré-implantação

EXPERIMENTO 1

TRATADO 10% DL50

366,8 mg/kg

E1G2 (n=5)

TRATADO 50% DL50

1874 mg/kg

E1G3 (n =5)

CONTROLE

0,5 mL água

E1G1 (n=5)

SEGMENTOS I e II

Pós-implantação Teratogenicidade

EXPERIMENTO 2

ENSAIOS

TOXICOLOGIA

REPRODUTIVA

155

2.5.1 Seqüência experimental

2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal)

Após o período de adaptação e ao atingirem a maturidade sexual, aproximadamente

250 g, iniciou-se o exame de esfregaço vaginal, diariamente, pela manhã. Uma micropipeta,

contendo 10μL de soro fisiológico 0,9%, era introduzinda no canal vaginal e, posteriormente,

aspirando juntamente com as células, que eram visualizadas em microscopia óptica, para

detectar a fase do ciclo estral, segundo a técnica descrita por Marcondes et al. (2002) (Quadro

1).

Quadro 1. As quatro fases do ciclo estral, mediante exame de citologia vaginal.

Fase

Duração Caracterização do esfregaço

Pro

estr

o

12 h

Grande número de células epiteliais nucleadas, algumas células epiteliais

queratinizadas (sem núcleo) e ausência total de leucócitos. Fase estrogênica

máxima.

Est

ro

14 h

Presença de células queratinizadas e ausência total de leucócitos. Também

conhecida como fase estrogênica ou proliferativa.

Met

aest

ro

21 h

Inúmeros leucócitos, filamentos de muco e resíduos de células epiteliais

queratinizadas. É conhecida como fase progesterônica ou secretora.

Die

stro

57 h

Período de repouso em que a mucosa vaginal apresenta-se delgada, com

leucócitos e algumas células nucleadas. Também é conhecida como fase

secretora.

2.5.3 Período de Acasalamento

Após a detecção da fase proestro, as fêmeas nulíparas, foram separadas em gaiolas de

polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho ao final da tarde. Nesta

fase ocorre distensão uterina, pico de LH (hormônio luteinizante) e o comportamento de

cópula. É caracterizada como fase estrogênica máxima e a ovulação ocorre espontaneamente

na metade do ciclo escuro durante esta fase.

156

Na manhã subseqüente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais foram

coletados. Foi considerada como indicativo de prenhez a presença de espermatozóides,

associado ao diagnóstico da fase estro do ciclo estral, na qual são encontradas apenas células

queratinizadas (COOPER et al., 1993) (Figura 2). Confirmada a prenhez, esse dia foi

considerado como o dia zero (d0) e as fêmeas prenhas foram mantidas em caixas individuais

de polipropileno (414 x 344 x 168 mm). Os acasalamentos foram repetidos até a obtenção do

número suficiente de progenitoras em cada grupo (E1G1, E1G2, E1G3, E2G1, E2G2 e

E2G3). Após, deu-se início a sequência experimental, de acordo com cada protocolo

experimental (E1 e E2).

Figura 2. Esfregaço vaginal confirmando o indicativo de prenhez pela presença de espermatozóides e

células queratinizadas (fase estro).

2.5.4 Experimento 1 (E1)

2.5.4.1 Tratamento no período pré-implantação (d0-d5) E1

Neste ensaio fêmeas prenhas dos grupos E1G1, E1G2 e E1G3 foram tratadas na fase

de pré-implantação do blastocisto no útero, que acontece cinco a seis dias após a fecundação

(ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000; BERNARDI et al., 2002). Desta forma, a duração do

tratamento correspondeu do d0 ao d5 de prenhez, uma vez ao dia.

157

2.5.4.2 Toxidade aguda nas progenitoras E1

Durante o tratamento, as ratas foram avaliadas quanto à presença de manifestações de

sinais de toxidade aguda, tal como: diarréia, piloereção, estresse, tremores, salivação e

hemorragia. Para a avaliação da massa corporal das fêmeas, foi utilizada balança Gehaka

BG4000, com capacidade de 4200 g e precisão de 0,1 g, com registros no d0, d2, d3, d5, d14

e d21 de prenhez. O ganho de massa corporal foi calculado pela diferença entre o final do

tratamento em relação ao início (d5 – d0) e do final da prenhez em relação ao início (d21 –

d0).

O consumo de água e ração foi mensurado, diariamente, após o início do tratamento

até o final da gestação, e utilizou-se a mesma balança citada anteriormente. Diariamente, era

oferecido 50g de ração para cada rata prenha. A ingestão de água também foi medida, com

disponibilidade de 250 mL diariamente.

2.5.4.3 Avaliação da performance reprodutiva E1

No d21 as ratas foram anestesiadas com 50 mg/kg de tiopental sódico (Thiopentax®)

para realização da cesárea, com exposição dos cornos uterinos para observação dos nódulos

de reabsorção e retirada dos ovários para contagem de corpos lúteos com auxílio de uma lupa

Nikow®, modelo SMZ 645 (C-W 10x A/22). Após a laparotomia, os implantes foram

contados, fetos e placentas foram retirados, imediatamente, seguindo a eutanásia das

progenitoras em câmara de CO2. As seguintes variáveis foram determinadas.

1. PERDAS PRÉ-IMPLANTES = (no de corpos lúteos – n

o de implantes/

no de corpos lúteos) x 100.

2. PERDAS PÓS-IMPLANTES = (no de implantes – n

o de nativivos / n

o

de implantes) x 100.

3. ÍNDICE DE REABSORÇÕES = (nº reabsorções / nº implantes) x 100;

sendo o nº de reabsorções = (nº implantes) – (nº filhotes nascidos).

4. ÍNDICE PLACENTÁRIO = Peso da Placenta / Peso fetal

5. RAZÃO SEXUAL = (nº machos / nº fêmeas) x 100

158


No caso de ausência de desenvolvimento fetal ou de pontos de implantações visíveis, o

útero foi colocado em solução de NaOH 0,2 % para revelar se houve ou não algum ponto de

implantação naquele útero (LIMA et al, 2011).


2.5.5.1 Tratamento no período pós-implantação (d6-d15) E2


de pós-implantação do blastocisto no útero, que correspondeu do d6 de prenhez ao d15 de

prenhez (ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000; BERNARDI et al., 2002), uma vez ao dia.


Idem ao item 2.5.4.2 Contudo, a massa corporal foi registrada no d6, d9, d12, d15 e

d21 e o ganho de ganho de massa corporal foi calculado pela diferença do final do tratamento

ao início do tratamento (d15 – d6) e do final da prenhez ao início da prenhez (d21 – d0). O

consumo de água e ração foi mensurado (idem 2.5.4.2).

2.5.5.3 Avaliação da performance reprodutiva E2

Idem item 2.2.6.3. As seguintes variáveis foram determinadas.

1. PERDAS PRÉ-IMPLANTES = (no de corpos lúteos – n

o de implantes/

no de corpos lúteos) x 100.

1. PERDAS PÓS-IMPLANTES = (no de implantes – n

o de nativivos / n

o

de implantes) x 100.

2. ÍNDICE DE REABSORÇÕES = (nº reabsorções / nº implantes) x 100;

sendo o nº de reabsorções = (nº implantes) – (nº filhotes nascidos).

3. ÍNDICE DE PARTO = (no de fêmeas que pariram / n

o de fêmeas com

evidência de prenhez) x 100

159

4. ÍNDICE DE NASCIMENTO = (no de nativivos / n

o de filhotes

nascidos) x 100.

5. RAZÃO SEXUAL = (nº machos / nº fêmeas) x 100


Idem item 2.5.4.3.1.

2.5.6 Avaliação da Embriofetotoxidade E2

2.5.6.1 Peso e classificação dos recém-nascidos (RNs) E2

Após a laparotomia, os RNs foram pesados utilizando-se balança Marte com

capacidade de 500 g e precisão de 0,001 g. Os RNs foram classificados em AIP (Adequado

para Idade de Prenhez), PIP (Pequeno para Idade de Prenhez) e GIP (Grande para Idade de

Prenhez), de acordo com os pesos corpóreos, segundo os parâmetros estabelecidos por

Calderon (1988):

AIP: Peso corpóreo compreendido entre a média de peso do grupo controle mais ou

menos o desvio-padrão;

PIP: Peso corpóreo inferior à média de peso do grupo controle menos o desvio-

padrão;

GIP: Peso corpóreo superior à média do peso do grupo controle mais o desvio-padrão.

Após a pesagem os RNs foram analisados macroscopicamente (Análise Externa) e,

posteriormente, foram processados para as análises Internas (Análise Esquelética e Visceral),

segundo as metodologias descritas por Staples e Schnell (1964) e Wilson (1965),

respectivamente.

160

2.5.7 Teratogenicidade E2

2.5.7.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas E2

Após a pesagem, os RNs foram examinados externamente, com análise minuciosa dos

olhos, boca, implantação das orelhas, conformação craniana, membros anteriores e

posteriores, perfuração anal e cauda (WILSON, 1965) (Figura 3).

Figura 3. Análise das anomalias e/ou malformações externas dos RNs.

2.5.7.2 Análise das anomalias e/ou malformações internas E2

2.5.7.2.1 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas E2

Imediatamente após a análise externa dos RNs, a metade de cada ninhada foi colocada

em álcool 70% por 12 horas; após, os RNs foram colocados em acetona P.A por 24 horas,

eviscerados, diafanizados e corados com vermelho de alizarina, conforme a metodologia

descrita por Staples e Schnell (1964). As análises foram realizadas com o auxílio de

estereomicroscópio Nikow®, modelo SMZ 645 (C-W 10 x A/22) (Figura 4).

161

Figura 4. Processamento e análise das anomalias e/ou malformações esqueléticas dos RNs.

Os pontos de ossificação foram observados e contados, segundo método proposto por

Aliverti et al. (1979). Foram avaliados os pontos de ossificação nos seguintes locais: esterno,

falanges anteriores e posteriores, metacarpos, metatarsos e vértebras cervicais e caudais.

A análise esquelética consistiu em uma análise minuciosa dos ossos do crânio (nasal,

frontal, parietal, interparietal, supraoccipital e as fontanelas), cervical, costelas e torácicas,

lombar, sacral, caudal, esterno (manúbrio, esternebrios e xifóide), membros superiores

(clavícula, escápula, húmero, ulna, radio, carpo, metacarpo e falanges) e membros inferiores

(ílio, ísquio, púbis, fêmur, fíbula, tíbia, tarso, metatarso e falanges), seguindo os critérios para

determinação de anomalias (calcificação) ou malformações (número, forma, localização e

tamanho), segundo a harmonização proposta por Solecki et al., 2001.

2.5.7.2.2 Processamento e análise das anomalias e/ou malformações viscerais E2

A outra metade dos RNs de cada ninhada foi colocada em solução de Bouin por 4 dias

para fixação das estruturas viscerais e descalcificação dos ossos; após, foi colocado em álcool

70% até o dia da análise. O método de secção seriada de Wilson (1965) foi utilizado para

observar anomalias e/ou malformações viscerais. As análises foram realizadas com o auxílio

de estereomicroscópio Nikow®, modelo SMZ 645 (C-W 10 x A/22) (Figura 5).

162

Figura 5. Processamento dos RNs e secções seriadas de Wilson (1965)

A análise visceral constituiu de uma análise detalhada das secções da cabeça (palato,

septo nasal, coana, bulbo olfatório, cristalino, retina, ventrículos laterais e 3º ventrículo)

(Figuras 6, 7 e 8).

Figura 6. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) septo nasal e (2)

palato.

Figura 7. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) coana, (2) lentes, (3)

cristalino, (4) bulbo olfatório e (5) retina.

1

2

1

2

3 4

5 2

163

Figura 8. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da cabeça. (1) ventrículos laterais e

(2) 3º ventrículo.

Secções do tórax (traquéia, esôfago, timo, medula, jugular, veia cava superior, átrios,

arco da aorta, veia pulmonar, pulmões, ventrículos, septos interventriculares) (Figuras 9, 10,

11 e 12), abdômen (diafragma, veia cava inferior e veia hepática) (Figuras 13 e 14), pelve

renal (rins, ureteres, bexiga e reto) (Figura 15) e órgãos reprodutores (macho: testículos,

epidídimo, canal deferente; fêmea: ovários e útero) (Figura 16).

Figura 9. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) Timo, (2) Traquéia,

(3) Esôfago e (4) Medula espinhal.

Figura 10. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) Arco da aorta, (2)

Traquéia, (3) Esôfago, (4) Veia cava superior, (5) Veia pulmonar, (6) átrios e (7) Pulmões.

7

7 1 4

6

6

5 2 3

1

2

3

3

4

1

2

1

164

Figura 11. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) átrios direito e

esquerdo, (2) Aorta ascendente, (3) Artéria pulmonar (4) brônquios após bifurcação da traquéia, (5)

Aorta descendente, (6) Lobos pulmonares e (7) Esôfago.

Figura 12. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do Tórax. (1) Septo

interventricular, (2) Ventrículos direito e esquerdo (3) Veia cava inferior (4) os quatro lobos do

pulmão (5) Aorta descendente, e (6) Esôfago.

Figura 13. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1) Diafragma, (2)

Veia cava inferior e (3) pulmões.

1 1

2 3

4 4

5 6

6 7

3

1 2

2

4 4 4

4

5

6

1

2

3 3

1

165

Figura 14. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção do abdômen. (1) Fígado, (2) Ápice

do estômago e (3) Diafragma.

Figura 15. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve. (1) Papila renal (2) Pelve

renal e (3) Rin direito.

Figura 16. Análise das secções seriadas de Wilson (1965). Secção da Pelve e Análise dos órgãos

reprodutores. (A) Macho. (1) Testículos, (2) Epidídimo, (3) Canal deferente, (4) Bexiga, (5) Ureter e

(6) reto. (B) Fêmea. (1) Útero (cornos uterinos direito e esquerdo), (2) Ovários direito e esquerdo

abaixo dos (3) rins, (4) Bexiga, (5) Ureter e (6) reto.

As anomalias e/ou malformações investigadas foram: palatosquese, língua bífida,

alterações do septo nasal, microftalmia e macroftalmia (mono ou bilateral), anoftalmia, retina

1

2

3

A B

4

1 1

2

4

3

5

1 1

2 2

3 3

5 6

6

1

3 2

166

dobrada, lente degradada, anencefalia, hidrocefalia em diversos graus, fístula

traqueoesofágica, arco da aorta duplo ou voltado à direita, destrocardia, sinistrocardia,

cardiomegalia, comunicação intratrial, alteração no septo interventricular, pulmão pequeno ou

grande, hérnia do diafragma, agenesia renal, ectopia renal, hidronefrose, fusão renal,

hipoplasia ou hiperplasia renal, agenesia de ureter, fusão do ureter, duplicação do ureter,

dilatação do ureter (mono ou bilateral), hiperplasia ou hipoplasia vesical.

2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E1 E E2

Para comparação dos valores médios entre os grupos de massa corporal, ingestão de

água, consumo de ração, performance reprodutiva materna e pontos de ossificação, foi

empregada análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey. Para a comparação do

percentual de PIP, AIP e GIP, incidência de malformações ou de anomalias fetais aplicou-se o

teste do qui-quadrado, teste de tendência. Foi considerado, como nível de significância

estatística, o limite de 5 % (p < 0,05). As análises estatísticas foram realizadas empregando-se

software Instat GraphPad® e os gráficos foram construídos no software Prism GraphPad

®.

167


3.1 EXPERIMENTO 1 (E1)

3.1.1 Toxidade aguda nas progenitoras E1

O tratamento com ORCD no período pré-implantação (d0-d5) não provocou sinais

clínicos de toxidade no grupo E1G2 (366,89 mg/kg). Contudo, no grupo E1G3 (1874 mg/kg)

foi observado alguns sinais clínicos de toxidade aguda, tal como, diarreia (1/5), piloereção

(3/5), estresse (4/5), agitação (5/5), hemorragia nasal (2/5) e vaginal (1/5) (Figura 17). Além

disso, houve registro de um óbito no d5 de prenhez, que correpondeu ao 6º dia de tratamento.

A toxidade sistêmica é manifestada através das alterações no desevolvimento ponderal

dos animais, redução do consumo de água e ração e alterações comportamentais, tal como,

apatia, sangramento e piloereção (MELLO et al., 1997). Neste estudo, essas alterações

comportamentais foram observadas, inclusive com ocorrência de óbito. Por outro lado,

Sachetti et al. (2009) avaliaram os sinais clínicos de toxidade aguda, após tratamento com C.

reticulata, em ratas prenhas e atribuíram os sinais clínicos encontrados (piloereção, diarreia e

cromodacriorréia) ao stresse durante o experimento, pois os mesmos sinais foram detectados

no grupo controle. No presente estudo, alterações comportamentais não foram observadas no

grupo controle E1G1.

Figura 17. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 1874 mg/kg (E1G3) no período de pré-

implantação (d0-d5). Sinal clínico de toxidade aguda (hemorragia nasal).

168

3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E1

Durante o tratamento (d0-d5), as ratas dos grupos E1G1 (controle) e E2G2 (366,89

mg/kg) ganharam massa corporal e sua evolução foi normal. Contudo, o grupo E1G3, que foi

tratado com a maior dose (1874 mg/kg), perdeu massa durante o tratamento e voltaram a

ganhar após o término do tratamento (d14). Asssim, pode-se inferir que o ORCD interferiu na

massa corporal, no entanto, foi significativo (p<0,05) apenas no d5 de prenhez (Figura 18).

Figura 18. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e ORCD 1874 mg/kg

(E1G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação

(d0-d5) e após o tratamento (d14). No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5

mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 são indicados pelos

índices a(em relação ao E1G1) e

b(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de Variância

(ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo, sendo E1G3 n=4).

A redução na massa corporal ou redução no ganho de massa deve-se a uma variedade

de respostas, que pode estar associada apenas a uma anorexia induzida pelo tratamento ou

toxidade sistêmica (US EPA, 1996). É importante ressaltar que o d5, dia em que houve

diminuição significativa em relação ao grupo controle (E1G1), correpondeu ao final da

implantação do blastocisto no útero (BERNARDI et al., 2002). Contudo, não foram

observadas no E1G3 diferenças significativas quanto às perdas pré-implantação (dados

descritos na Tabela 1). Por outro lado, estudo conduzido por Lourenço et al. (2009) com

camundongas prenhas que receberam três doses (297,48 mg/kg, 594,96 mg/kg e 892,44

mg/kg) de C. langsdorfii , concluíram que o óleoresina estudado não alterou o ganho de peso

materno.

d0 d2 d3 d5 d14220

240

260

280

300

320

340E1G1

E1G2

E1G3

a,b

Tempo de prenhez (dias)

massa c

orp

ora

l (g

)

169

3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E1

O tratamento com ORCD não alterou a ingestão de água, não sendo observadas

diferenças entre o grupo controle e os tratados (E1G2 e E1G3) e entre os períodos de

tratamento (d0-d5) e após o tratamento (d6-d10) (Figura 19).


(E1G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-

d5) [1] e após o tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada

(0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos


b(E1G3 em relação ao E1G2) e


tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo,

sendo E1G3 n=4).

Ao analisar a ingestão diária de água, apenas no período de tratamento (d0-d5), nota-

se que também não foi detectada diferenças significativas entre os grupos em cada dia, a

exceção do d1 no qual o grupo E1G3 diferiu (p<0,05) em relação ao E1G2 (Figura 20).

O ORCD, tanto na menor dose (366,89 mg/kg – E1G2) como na maior dose (1874

mg/kg – E1G3) alterou o consumo de ração. No grupo E1G3 também houve diferença

estatística ao comparar o período 1 que corresponde ao de tratamento (d0-d5) e o período 2

que corresponde o pós-tratamento (d6-d10) (Figura 21).

1 2 1 2 1 20

5

10

15

20

25

30

35

40E1G1

E1G2

E1G3

Ág

ua (

mL

)

170


(E1G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação

(d0-d5). No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos

representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao

E1G1) e b(E1G3 em relação ao E1G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste



(E1G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5)

[1] e após o tratamento (d6-d10) [2]. No grupo controle (E1G1) foi administrada água destilada (0,5

mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos

índices a(em relação ao E1G1),



tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo, sendo

E1G3 n=4).

O consumo diário de ração foi alterado pelo tratamento com ORCD. Nos dias d0, d1 e

d2 houve um comportamento semelhante entre os grupos tratados (E1G2 e E1G3), porém o

grupo E1G3 diferiu (p<0,05), tanto do grupo controle (E1G1) como do E1G2 (366,89 mg/kg),

nos dias d0, d1, d2 e d3 de prenhez e, consequentemente, de tratamento (Figura 22).

d0 d1 d2 d3 d4 d50

10

20

30

40

50E1G1

E1G2

E1G3

b


Ág

ua (

mL

)

1 2 1 2 1 20

5

10

15

20

25

30E1G1

E1G2

E1G3a

a, b

a, c

Ração

(g

)

171


(E1G3), sobre o consumo diário de ração (g) de ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação





Os toxicologistas têm buscado entender como a mudança no peso corporal pode afetar

a função reprodutiva. De fato, sabe-se que em fêmeas, o peso corporal flutua normalmente

com o estado fisiológico do animal, até mesmo porque os hormônios femininos (estrogênio e

progesterona) influenciam na ingestão de alimentos e no consumo energético; as taxas de

retenção de água e deposição de gordura também são afetadas. O consumo de alimento é

elevado durante a gestação, em parte devido ao elevado nível de progesterona sérica (BAIRD,

2000).

No presente estudo vale ressaltar que houve diminuição do consumo de ração durante

o tratamento com ORCD nas duas doses (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg). No grupo que recebeu

a maior dose (1874 mg/kg) o consumo foi ainda menor e este achado pode ser associado à

perda de massa corpórea neste grupo (E1G3).

3.1.2 Performance reprodutiva materna E1

A performance reprodutiva materna foi avaliada e entre os parâmetros, tal como, nº de

corpos lúteos, implantações, fetos vivos e reabsorções não foi observada diferença entre os

d0 d1 d2 d3 d4 d50

5

10

15

20

25E1G1

E1G2

E1G3

a,b

a,b

a,b

a,b


Ração

(g

)

172

grupos. Da mesma forma, também não foi encontrada diferença nos grupos entre as perdas

pré-implantação, pós-implantação, índices de reabsorções e razão sexual. Portanto, o

tratamento com ORCD não foi capaz de interferir nesses parâmetros, contudo, alterou o

ganho de peso materno no período de pré-implantação, que correspondeu ao mesmo período

de tratamento, por conseguinte alterou o peso fetal e o índice placentário no grupo E1G3 e o

peso fetal do E1G2 (Tabela 1).

Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance reprodutiva materna de

ratas prenhas tratadas no período de pré-implantação (d0-d5).

E1G1 E1G2 E1G3

Fêmeas acasaladas (n) 5 5 5

† durante o tratamento (n) 0 0 1

Corpos lúteos (n) 11.20 ± 0.37 10.80 ± 1.31 11.50 ± 0.64

Implantações (n) 10.60 ± 0.50 10.60 ± 0.67 10.75 ± 0.94

Fetos vivos (n) 10.40 ± 0.50 9.20 ± 1.06 8.00 ± 2.41

Reabsorções (n) 0.20 ± 0.20 1.40 ± 0.67 2.75 ± 1.54

Perda pré-implantação (%) 5.00 ± 5.00 11.49 ± 4.99 9.00 ± 4.12

Perda pós-implantação (%) 1.81 ± 1.81 7.78 ± 5.10 30.39 ± 19.72

Índice de reabsorção (%) 1.81 ± 1.81 13.78 ± 6.97 30.39 ± 19.72

Razão sexual (%) 79.66 ± 36.47 125.50 ± 47.30 26.66 ± 46.18

Ganho de peso materno

no tratamento (d0-d5) (g)

14.00 ± 2.72 18.40 ± 3.77 - 19.00 ± 3.14a,b


na prenhez (d0-d21)(g)

83.80 ± 3.76 80.60 ± 3.64 52.50 ± 19.37

Peso fetal (g) 4.50 ± 0.08 4.84 ± 0.04a 3.04 ±0.07

a,b

Peso placentário (g) 0.53 ± 0.01 0.56 ± 0.01 0.51 ± 0.06

Índice placentário 0.11 ± 0.00 0.11 ± 0.00 0.19 ± 0.01a,b

O grupo controle (E1G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e os tratados receberam ORCD 366,89 mg/kg

(E1G2) e ORCD 1874 mg/kg (E1G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e os valores com p < 0,05 estão



(ANOVA) seguido do teste de tukey.

Na rata, o corpo lúteo permanece dominante durante todo o curso da gestação e é a

fonte primária de estrogênios e progestogênios (principalmente progesterona) (GOPINATH,

2013). Neste estudo o ORCD nas doses administradas não alterou o número de corpos lúteos,

perdas pré e pós-implantação. Segundo Gray et al. (2004), a implantação em ratos e seres

173

humanos é também caracterizada por uma pronunciada reação estroma-endométrio, referida

como decidualização (a decídua forma o componente maternal da placenta). A característica

fundamental deste processo é o desenvolvimento sincronizado do embrião para o estágio de

blastocisto e a diferenciação do útero para o estado receptivo. Em seguida ocorrem interações

entre o blastocisto ativado e o epitélio uterino para iniciar a implantação (PARIA e col.,

2000).

A ocorrência de estresse oxidativo no início da gestação pode prejudicar o

desenvolvimento da placenta e /ou acelerar a degeneração do sinciotrofoblasto, culminando

com perdas pré-implantação (GUPTA et al. 2007). O estresse oxidativo é caracterizado como

um distúrbio no estado de equilíbrio dos sistemas pró-oxidantes /antioxidantes em células

intactas. Quando ocorrem eventos oxidativos adicionais, os sistemas pró-oxidantes podem

aumentar com relação aos antioxidantes, resultando em danos oxidativos (SIES; STAHL;

SEVANIAN, 2005). Esses danos causam toxicidade nas células e tecidos, ao afetar a

homeostase do retículo endoplasmático (HANSEN; HARRIS, 2013). A persistência do stresse

oxidadativo pode, eventualmente, aumentar a apoptose das células deciduais e resultar em

perdas pré-implantação (LIU et al. 2011).

O ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg), administrado neste período crítico do

densenvolvimento, pré-implantação, demonstrou não alterar esse processo de sincronização,

com êxito nas implantações do blastocisto no útero. Quanto as perda pós-implantação, estas

foram avaliadas mesmo não compreendendo o período de tratamento com ORCD. Não foi

observada diferença entre os grupos, o que poderia descartar a hipótese de perda pós-

implantação por metabólitos do ORCD ainda presentes no sangue materno. No entanto houve

alterações significativas no peso fetal (nas duas doses) e índice placentário (na maior dose),

sugerindo a presença de metabólitos do ORCD, no entanto estudos adicionais, de

toxicocinética devem ser realizados para melhor definição e compreensão desses efeitos.

No presente estudo, o marcador utilizado foi o β-cariofileno. Liu et al. (2013)

investigaram a biodisponibilidade oral e farmacocinética do β-cariofileno livre e complexado

com a ciclodestrina (β-cariofileno/ciclodextrina) após uma única dose oral de 50 mg/kg em

ratos. GC/MS/SIM foi utilizado para determinar as concentrações de β-cariofileno no plasma,

que demonstrou biodiponibilidade 2,6x maior que o β-cariofileno complexado. Nos resultados

do referido estudo β-cariofileno livre obteve concentração plasmática máxima de 0.12 ± 0.02

µg/mL e o tempo para atingir a concentração máximo de 3.50 ± 0.60 horas, e tempo médio de

de 4.07 ± 0.07 horas.

174

Diversos outros fatores podem ser indicados como responsáveis pelo retardamento do

crescimento fetal. Sabe-se que o crescimento e a diferenciação do feto são determinados

basicamente por informações genéticas contidas no interior das células em fase de divisão e

multiplicação. Superpondo-se ao controle genético, atuam fatores restritivos do crescimento,

que limitam a utilização de nutrientes pelas células, e fatores estimulantes, tais como

hormônios. Do equilíbrio entre esses fatores resultará a curva de crescimento fetal, bem como

o peso do feto ao nascimento. Além disso, o crescimento fetal é influenciado positivamente

ou negativamente pelo estado nutricional materno (DIETZ et al., 2009).



O tratamento com ORCD no período pós-implantação (d6-d15) evidenciou toxidade

aguda, provocando diarreia e agitação após o tratamento, tanto no grupo E2G2 (366,89

mg/kg) como no grupo E2G3 (1874 mg/kg). Porém outros sinais clínicos de toxidade

ocorreram apenas com o tratamento com a maior dose, tal como estresse (4/5), piloereção

(4/5), sialorréia (1/5), apatia (1/5), desidratação (1/5), hemorragia nasal (3/5) e vaginal (2/5),

caracterizando aborto espontâneo (Figura 23).

Figura 23. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 1874 mg/kg (E2G3) no período de pós-

implantação (d6-d15). Sinal clínico de toxidade aguda e aborto espontâneo.

175

Em estudos de toxidade reprodutiva, o uso de doses elevadas é de fundamental

importância, muito mais que nos outros tipos de estudo de toxidade. Este fato deve-se a

necessidade da compreensão dos feitos tóxicos sistêmicos, por exemplo, os sinais clínicos,

diminuição do ganho de peso corporal (não mais do que 10%) e/ou evidência de toxicidade

em algum órgão alvo (OECD, 2001). Acredita-se que a taxa de aborto espontâneo precoce,

em humanos, seja em torno de 50%. Os abortamentos espontâneos ocorrem por várias razões,

uma delas é a presença de anormalidades cromossômicas, as demais estão relacionados aos

fatores maternos (GUPTA et al., 2007).

No presente estudo, não houve abortos espontâneos no grupo controle (E2G1), e os

casos registrados estão associados à toxidade materna sistêmica do ORCD 1874 mg/kg.

Oestensen et al. (2006) afirmam que algumas substâncias tóxicas podem atravessar a barreira

placentária e interferir no desenvolvimento embriofetal, muitas vezes de forma negativa. A

exposição a agentes químicos e drogas podem gerar um desequilíbrio no processo de oxi-

redução e induzir mudanças nos processos metabólicos (HANSEN; HARRIS, 2013). Por

outro lado, Sotto et al. (2013) publicaram um trabalho que demonstra que o óxido de β-

cariofileno, embora absorvido através das membranas celulares e apesar da sua estrutura

química potencialmente reativo, é desprovido de efeitos genotóxicos, pois não induz pontos

mutações e danos. Este composto, o β-cariofileno está presente no ORCD (0,5 µg/mL), no

entanto, outros constituintes estão presentes no ORCD com ação sinérgica entre seus

constituintes (IZUMI et al., 2012).

3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal materna E2

Houve um comportamento semelhante entre os grupos E2G1 e E2G2 na evolução da

massa corporal durante o tratamento (d6-d15), porém os valores diferiram entre si ao nível de

5%. Já o grupo E2G3, o ORCD alterou a evolução do ganho de massa corporal, pois o gráfico

demonstra uma queda acentuada de massa corpórea durante o tratamento, voltando a evoluir

após o tratamento (d15-d21). A média do grupo que recebeu a maior dose (1874 mg/kg -

E2G3) foi diferente, tanto em relação ao grupo controle (E2G1) como o tratado com a menor

dose (E2G2) (Figura 24).

A alteração da massa coporal é um importante parâmetro utilizado nos ensaios

toxicológicos não clínicos para indicar efeitos adversos de drogas e substâncias químicas

(TEO et al., 2002), sendo importante que os animais sobreviventes não percam mais do que

176

10% do seu peso corporal inicial (KLAASSEN; WATKINS, 2012). A gestação é

caracterizada pelo aumento progressivo da massa corporal materna, decorrente do

crescimento fetal e seus anexos (aproximadamente 40%) e de adaptações próprias do

organismo (os demais 60%), caracterizados por anabolismo no início e catabolismo no final

da gestação (RUDGE; BORGES; CALDERON, 2000). Neste estudo, o tratamento com

ORCD 1874 mg/kg diminuiu mais que 10% da massa corporal das ratas. Não houve o

aumento progressivo esperado na prenhez, em torno de 40%.


(E2G3), sobre o desenvolvimento ponderal (g) de ratas prenhas tratadas no período de pós-

implantação (d6-d15) e após o tratamento (d21). No grupo controle (E2G1) foi administrada água

destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão


b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise

de Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração E2

O ORCD nas doses administradas no período de pós-implantação não foi capaz de

interferir na ingestão hídrica. Embora tenha sido detectado diferenças, significativas, entre os

períodos 1 de tratamento (d6-d16) e o período 2 de pós-tratamento (d16-d20) no grupo E2G2,

este não diferiram, significativamente, do grupo controle (E2G1). No grupo E2G3 houve um

aumento significativo após o período de tratamento, diferindo tanto do grupo controle (E2G1)

como do grupo tratado com a menor dose (366,89 mg/kg - E2G2) (Figura 25). A ingestão

diária hídrica, também não foi alterada pela administração do ORCD, contudo, embora não

d6 d9 d12 d15 d21200

250

300

350

400E2G1

E2G2

E2G3

aa

a

b

a

a,ba,b

a,b


massa c

orp

ora

l (g

)

177

seja significativo, o grupo E2G3 apresentou um consumo menor quando comparado com os

grupos controle (E2G1) e tratado 366,89 mg/kg (E2G3) (Figura 26).


(E2G3), sobre a ingestão de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-

d15) [1] e após o tratamento (d16-d20) [2]. No grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada

(0,5 mL/animal). As barras representam a média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos

índices a(em relação ao E2G1),



tratamento). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).


(E2G3), sobre a ingestão diária de água (mL) de ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação

(d6-d15). No grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os dados

representam a média ± Erro Padrão da Média e resultados com p < 0,05, estatisticamente

significativos, são representados pelos índices a(em relação ao E2G1),

b(E2G3 em relação ao E2G2).

Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

1 2 1 2 1 20

10

20

30

40

50

60E2G1

E2G2

E2G3

c

a,b

Ág

ua (

mL

)

6 7º 8 9º 10 11 12 13 14 15

10

20

30

40

50

60E2G1

E2G2

E2G3


Ág

ua

(m

L)

178

1 2 1 2 1 20

5

10

15

20

25

30E2G1

E2G2

E2G3

a,b

b, c

c

Ração

(g

)

A média do consumo de ração durante o tratamento foi menor no grupo E2G3

(p<0,05). O ORCD nas doses administradas influenciou o consumo de ração, pois houve

diferença na média do consumo durante o período 1 de tratamento (d6-d15) e período 2 de

pós-tratamento (d16-d20) (Figura 27). No entanto, o aumento do consumo de ração também

pode estar associado a evolução da prenhez, pois no final há necessidade de um aumento da

capacidade nutricional e energética, inerentes às alterações fisiológicas e crescimento

ponderal do feto (RUDGE; BORGES; CALDERON, 2000).

Figura 27. Efeito do tratamento por via oral com

ORCD 366,89 mg/kg (E1G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3), sobre o consumo de ração (g) de ratas

prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15) [1] e após o tratamento (d16-d20) [2]. No

grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a

média ± E.P.M e valores com p < 0,05 estão indicados pelos índices a(em relação ao E2G1),

b(E2G3

em relação ao E2G2) e c(1 tratamento em relação 2 após o tratamento). Foi aplicado Análise de

Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n= 5/grupo).

A administração, via oral do ORCD 1874 mg/kg (50% DL50) foi capaz de diminuir o

consumo diário de ração das ratas prenhas, com difereças significativas (d9-d15) (Figura 28),

coincidindo com a diminuição da massa corpórea deste grupo. Segundo Fowden et al. (2006)

a nutrição materna exerce um importante papel no desenvolvimento e modulação dos sistemas

fisiológicos do ser em formação.

179


(E2G3), sobre a ingestão diária de ração (g) de ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação





O tratamento com ORCD 1874 mg/kg, tanto no período de pré como no pós-

implantação causou toxidade sistêmica. Segundo Mello (2001), a toxicidade sistêmica pode

ser diagnosticada pela diminuição da massa corporal dos animais, diminuição do

desenvolvimento ponderal e pelo aparecimento de alterações comportamentais como apatia,

prostração e piloereção.

3.2.2 Performance reprodutiva materna E2

A tabela 2 mostra que o tratamento com ORCD não alterou de forma estatisticamente

significativa as seguintes variáveis reprodutivas: (nº de corpos lúteos, de implantações, de

reabsorções, perdas pós-implantação, índice de parto, índice de nascimento, peso fetal e peso

placentário). No entando o ORCD 1874 mg/kg demonstrou ter efeito sobre o número de fetos

vivos e o índice placentário e, consequentemente, influência sobre o ganho de peso materno

durante o tratamento e por toda prenhez. É importante ressaltar que houve perda de peso no

grupo E2G3, que diferiu (p<0,05) em relação à dose de 366,89 mg/kg do E2G2 (Tabela 2).

d6 d7 d8 d9 d10 d11 d12 d13 d14 d150

5

10

15

20

25E2G1

E2G2

E2G3

aa,b

a,ba,b

b

a,b

Tempo (dias)

Ração

(g

)

180

Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a performance reprodutiva materna de

ratas prenhas tratadas no período de pós-implantação (d6-d15).

E2G1 E2G2 E2G3

Fêmeas acasaladas (n) 5 5 5

† durante o tratamento (n) 0 0 0

nº de corpos lúteos 12.20 ± 0.80 11.40 ± 0.92 12.60 ± 1.47

nº de implantações 9.00 ± 1.61 9.00 ± 1.22 5.80 ± 1.53

nº de fetos vivos 8.80 ± 1.77 8.40 ± 1.56 2.20 ± 1.71a

Reabsorções (n) 0.20 ± 0.20 0.60 ± 0.40 3.60 ± 1.47

Perda pré-implantação (%) 24.73 ± 13.05 15.45 ± 4.74 66.89 ± 13.54

Perda pós-implantação (%) 5.00 ± 5.00 10.22 ± 7.74 54.00 ± 22.21

Índice de parto (%) 100 ± 0.00 100 ± 0.00 80 ± 0.00

Índice de nascimento (%) 100 ± 0.00 100 ± 0.00 100 ± 0.00


no tratamento (d6-d15) (g)

19.00 ± 4.61 27.20 ± 5.94 -49.60 ± 14.46ª,b


na prenhez (d0-d21) (g)

88.20 ± 10.38 72.40 ± 11.71 -15.40 ± 27.56ª,b

Peso fetal (g) 4.86 ± 0.08 4.96 ± 0.04 4.63 ± 0.07

Peso placentário (g) 0.50 ± 0.01 0.48 ± 0.01 0.55 ± 0.06

Índice placentário 0.10 ± 0.00 0.09 ± 0.00 0.11 ± 0.01 b


(E2G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e os valores com p < 0,05 estão


b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de

Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey.

O peso dos ovários e o número de corpos lúteos na prenhez são capazes de deduzir,

indiretamente, as condições hormonais relativas à progesterona materna. Nível inadequado

desse hormônio interfere na viabilidade do embrião, pois não permite que o endométrio se

torne, adequadamente preparado, para manutenção da prenhez (BAIRD, 2000). No presente

estudo a prenhez foi mantida, com índice de nascimento de 100% em todos os grupos, não

havendo diferença, também, entre o número de corpos lúteos, perdas pré e pós-implantação.

Assim, é possível inferir que, a progesterona esteve em níveis adequados e que o ORCD nas

doses administradas (366,89 e 1874 mg/kg) não foi capaz de alterar seus níveis plasmáticos.

A placenta é um órgão materno fetal pelo qual se dão as trocas de substâncias, tal

como nutrientes e oxigênio. Assim, os vasos do cordão umbilical unem a circulação

placentária à circulação fetal e a placenta sintetiza glicogênio, colesterol e ácidos graxos, que

181

servem de fonte de nutrientes e energia para embrião/feto (KINGDOM; KAUFMANN,

1999). A média do peso fetal foi menor no grupo E2G3, no entanto, sem diferenças

significativas entre os grupos. O peso fetal pode ser alterado por fatores ambientais ou agentes

tóxicos com consequência direta destes agentes/fatores sobre o concepto em desenvolvimento

ou ao nível placentário (GOODMAN; JAMES; HARBISON, 1982). Para Aliverti et al.

(1979), o peso fetal não é parâmetro conclusivo em estudos de desenvolvimento porque pode

variar dependendo do tamanho da ninhada.

De acordo com a fórmula aplicada, o peso fetal é inversamente proporcional índice

placentário. Neste estudo o ORCD 1874 mg/kg alterou de maneira significativa o índice

placentário. Este índice (relação peso placenta/peso do feto) é usado como padrão de função

placentária (KINGDOM; KAUFMANN, 1999). Vários autores já observaram que diversos

fatores, tais como hipertensão, desnutrição materna, infecção intra-uterina e fumo, prejudicam

o desenvolvimento placentário, determinando placentas pequenas e com baixo conteúdo de

DNA, RNA e proteínas (KINGDOM; KAUFMANN, 1999; ROSSO, 2006).

O número de reabsorções do grupo E2G3, embora não tenha sido significativo

(p<0,05), notou-se maior ocorrência neste grupo, sendo observadas, inclusive, reabsorções

tardias (Figura 30). A partir da implantação, o embrião pode continuar seu desenvolvimento

normal, desenvolver-se anormalmente ou morrer. Reabsorção é o nome que se dá para a lise

‘in situ’ de um embrião ou feto (KALTER, 1980).


implantação (d6-d15). (A) Útero normal com fetos e placentas (E2G1) e (B) Útero de rata com

reabsorções tardias no corno esquerdo (E2G3) (ponta da seta).

O ORCD nas doses administradas não foi o agente causador das reabsorções

encontradas no útero das ratas tratadas. De modo semelhante, Almeida e Lemônica (2000)

A B

182

encontraram aumento no número de reabsorções com o aumento da dose (440 e 880 mg/kg)

de Coleus barbatus, porém sem diferença estatística significativa. Lourenço et al. (2009)

também não encontraram reabsorções associadas ao tratamento com óleoresina de C.

langsdorfii.

No presente estudo a reabsorção (Figura 29) não ocorreu durante a gastrulação, mas

em período posterior, o de organogênese. No entanto, a exposição de agentes químicos no

útero podem ocasionar falhas no controle do sistema de redox e sinalização. O mecanismo

que envolve a geração de espécies reativas ao oxigênio e estresse oxidativo foi estudado por

Hansen e Harris (2013) para melhor compreensão desses efeitos. Em ratos, se a glutationa

sintetase não for produzida as células morrem durante a gastrulação (SHI et al. 2000), por isso

a glutationa sintetase é tão importante no início do desenvolvimento. Na organogênese, os

períodos de maior sensibilidade dos embriões de ratos a teratógenos é o 10º dia por apresentar

baixa concentração da glutationa sintetase (17 nmol/mg) comparado ao 14.5º dia (45

nmol/mg) (HIRANRUENGCHOK; HARRIS, 1993; LIU; CHAN; KUBOW, 2007). Todavia,

em um outro estudo recente, Abbas et al. (2013) demonstraram que o β-cariofileno causa

regressão significativa no tamanho de cistos e produz apoptose no explante endometrial, sem

interferir na prenhez ou ovulação.

3.2.3.1 Embriofetoxidade E2

Um critério indicativo de embriofetoxidade é avaliar o percentual de RN´s que

nasceram pequenos (PIP), guandes (GIP) ou adequados (AIP) a idade de prenhez. Quanto a

esse critério, o ORCD nas duas doses administradas não foi capaz de interferir no tamanho

desses RN´s, não havendo diferença estatística entre os grupos analisados (Figura 30). Um

suprimento adequado de nutrientes é essencial para o desenvolvimento intra-uterino do feto

(REGNAULT et al., 2002). Distúrbios no suprimento sanguíneo uterino estão associados com

alta morbidade pré-natal e neonatal e restrição de crescimento intra-uterino (AUGUSTIN,

2000; ZYGMUNT e col., 2003). Segundo Khera (1987), estudos com animais avaliam a

embriotoxidade como consequência da toxidade materna (associado à perda de peso materno

durante a prenhez).

Contudo, neste estudo, apesar de evidências quanto à diminuição do ganho de peso

materno e consumo de ração, com diferenças significantes em relação ao controle,

principalmente o E2G3, que recebeu a maior dose (1874 mg/kg); não houve toxidade fetal,

183

que poderia ter ocorrido indiretamente, por meio da toxidade materna encontrada. Estes

resultados são diferentes dos esperados, segundo a literatura (BARROW, 2000; JONG-

CHOON KIM et al., 2001). Portanto, as duas doses administradas de ORCD em ratas prenhaz

no período de organogênese não alterou o crescimento fetal.

<


(E2G3), sobre recém-nascidos de progenitoras tratadas no período de pós-implantação (d6-d15). No

grupo controle (E2G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). As barras representam a

média dos grupos. PIP: Pequeno para Idade de Prenhez. AIP: Adequado para Idade de Prenhez, GIP:

Grande para Idade de Prenhez. O Teste do qui-quadrado foi aplicado e os percentuais não diferiram

entre si ao nível de 5% (p>0,05).

3.2.4 Teratogenicidade E2

3.2.4.1 Análise das anomalias e/ou malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais)

E2

Quanto a análise da teratogenicidade, o ORCD nas doses administradas, 366,89 mg/kg

e 1874 mg/kg, não causou nenhum tipo de alteração ou malformação, tanto externamente

como internamente (esquelética e visceral). Esse resultado foi observado ao analisar tanto os

RN´s como as ninhadas afetadas (Tabela 3). Apesar do efeito sistêmico do ORCD de toxidade

aguda no período de organogênese, o mesmo não foi capaz de interferir na formação dos

órgãos rudimentares.

PIP AIP GIP0

20

40

60

80

100E2G1

E2G2

E2G3

perc

en

tual (%

)

184

Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-implantação (d6-d15),

sobre a frequência das anomalias e malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais) em

ninhadas e recém-nascidos.

E2G1 E2G2 E2G3

Malformações externas

Recém-nascidos afetados 0/44 0/42 0/11

Ninhadas afetadas 0/5 0/5 0/3

Anomalias externas



Malformações esqueléticas



Anomalias esqueléticas



Malformações viscerais



Anomalias viscerais




(E2G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3). O Teste do qui-quadrado foi aplicado e os valores não diferiram entre si

ao nível de 5% (p>0,05).

Segundo Hansen e Harris (2013), teratógenos são substâncias químicas, naturais ou

farmacêuticas, que causam algum defeito específico ao nascimento ou determinados defeitos.

Mais de 1000 teratógenos já foram identificados através de ensaios utilizando animais e

destes, muitos já se apresentaram também teratogênicos em seres humanos (SCHARDEIN,

2000). Os achados comumente encontrados nos estudos de teratologia são morte do

embrião/feto, retardo do crescimento fetal, aumento da incidência de aberrações menores em

estrutura e variações na ossificação do esqueleto, mas nenhum aumento de malformações

estruturais (WEBSTER; FREEMAN, 2001).

185

Os estudos em teratologia, geralmente, utilizam determinado número de ninhadas por

grupo, sendo esta considerada como unidade experimental. A detecção da incidência de

defeitos congênitos é baixa, porém, isto pode ser ajustado, se a dose utilizada for tóxica,

podendo resultar numa exposição sistêmica maior do que a esperada no ser humano. Nessas

condições, é possível detectar teratógenos humanos por afetarem mais ninhadas

experimentais. Diante disso, é importante ressaltar que estudos teratológicos não buscam

detectar pequenas incidências de anormalidades (WEBSTER; FREEMN, 2001). Neste estudo

a dose utilizada foi elevada, possivelmente tóxica, que correponde a 50% e 10 % da DL50,

1874 e 366,89 mg/kg, respectivamente.

Nos últimos 20 anos, diversos trabalhos têm sugerido que o estresse oxidativo é um

fator crítico na teratogênese (FANTEL, 1996; FANTEL; PERSON, 2002; WELLS et al.

2005; HANSEN, 2006; KOVACIC; SOMANATHAN, 2006; DENNERY, 2007; WELLS et

al., 2009; WILFFERT et al. 2011; HANSEN; HARRIS, 2013). No início da organogênese, as

mitocôndrias ainda estão imaturas e a execução de sua função metabólica encontra-se

diminuída (O’HARA et al., 2003). No entanto, esse período coincide com a mudança do

metabolismo anaeróbico para o aeróbio e o embrião passa a depender cada vez mais da

fosforilação oxidativa para atender suas maiores necessidades energéticas (FANTEL;

PERSON, 2002). A diminuição da função antioxidante durante as fases iniciais da

organogênese resulta em maior susceptibilidade, pois a oxidação prolongada pode ser

prejudicial. O estresse oxidativo explica por que alguns eventos são ativados ou desativados,

causando disfunção celular ou morte celular, podendo levar a teratogênese (HANSEN;

HARRIS, 2013).

O estresse oxidativo em uma definição toxicológica baseia-se na toxidade gerada pelo

acumulo espécies reativas ao oxigênio e a perda da capacidade antioxidante, que resulta em

morte celular. Na teratogênese, esses pontos pode não ser apenas o resultado de morte celular

prematura, mas em vez disso, pode ser o resultado da crítica desregulação da sinalização

celular. A sensibilidade dos ratos aos teratógenos varia com a fase de desenvolvimento dos

órgãos que venha a ser mais susceptível em um determinado momento. Por exemplo, no 9º

dia de prenhez os olhos e o cérebro são mais suscetíveis às agressões, mas o paladar e sistema

urogenital são afetados. Por outro lado, no 13º de gestação, o palato e sistema urogenital são

os mais suscetíveis, com os olhos e o cérebro mais resistente a teratógenos (WILSON, 1973).

Neste estudo o ORCD nas doses administradas, 366 mg/kg e 1874 mg/kg, não

induziram efeitos teratogênicos, se comparados ao grupo controle E3G1. Esperava-se que no

186

grupo controle E3G1 houvesse uma incidência menos expressiva de anomalias e/ou

malformações. No entanto, embora expressiva, não apresentou significância estatística entre

os grupos, tanto em relação ao número de filhotes quanto às ninhadas afetadas. Assim, a

equidade de anomalias e/ou malformações nos grupos tratado E3G2 e E3G3 podem estar

associado a um efeito protetor (antioxidante) do ORCD, presença de 0,5% (0,5 µg/mL) de β-

cariofileno. Calleja et al. (2013) testou a inibição da peroxidação lipídica utilizando o β-

cariofileno, e os resultados sugerem que esse sesquiterpeno, presente em numerosas plantas e

alimentos, seja um antioxidante natural.

Outro princípio básico importante da teratogênese é a indução de dismorfogênense nas

espécies sensíveis. Em geral, os períodos de desenvolvimento da susceptibilidade das

malformações estruturais ocorrem, principalmente, durante a organogênese (KARNOFSKY,

1965). A fase de desenvolvimento é conhecida pela especialização dos tipos celulares e suas

funções. O início e a duração da organogênese diferem entre espécies diferentes. Por isso os

estudos envolvem duas espécies de mamíferos, uma roedora e outra não roedora (SCHÜLER-

FACCINI et al., 2001). Este estudo utilizou uma espécie roedora, Rattus novergicus da

linhagem Wistar, e alterações e/ou malformações encontradas não estiveram associadas ao

uso do ORCD no período de organogênese.

No entanto, a exemplo da talidomida, que induz efeitos teratogênicos em humanos e

coelhos, e pequenos efeitos em ratos (PARMAN et al., 1999), sugere-se estudos adicionais

para melhor definir a segurança de uso do ORCD na espécie humana. A talidomida é um

produto sintético e seus efeitos deve-se apenas a ação de uma única molécula e um

determinado alvo-receptor, que difere muito frente a um produto natural, a exemplo do

ORCD, caracterizado, principalmente, por um conjunto de moléculas ativas que atuam em

diversos alvos-receptores. A ação do ORCD não se deve a ativação de uma única molécula

(IZUMI et al., 2012; VENEZIANI et al., 2010), mas a um conjunto de moléculas que atuam

em sinergismo farmacológico, diminuindo respostas exacerbadas de um único receptor

(TYLER, 1997). Todavia, ao analisar o percentual das alterações e/ou malformações, sem

utilizar a ninhada como unidade experimental, o ORCD na dose de 1874 mg/kg (E2G3)

alterou o percentual das anomalias e/ou malformações esqueléticas encontradas, com

diferenças significativas, em relação o tamanho da occipital e na ossificação da fontanela

(Tabela 4) (Figura 31).

187

Tabela 4. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-implantação (d6-d15),

sobre o percentual das anomalias e malformações externas e internas (esqueléticas e viscerais) em

ninhadas e recém-nascidos.

E2G1 E2G2 E2G3

Malformações esqueléticas (%)

Presença ou ausência

Agenesia esternébrio 4,54 4,54 0

Agenesia de costela 4,54 4,54 0

Forma

Esternébrio em “borboleta” 18,10 9,09 0

Localização

Vértebra torácica 4,54 0 0

Vértebra lombar 0 4,54 0

Esternébrio 0 4,54 0

Tamanho

Interparietal 0 9,09 0

occipital 0 0 40,0 a

Anomalias esqueléticas (%)

Ossificação incompleta

Vértebra lombar 4,54 0 0

Falanges 31,81 40,90 80,0

Fontanela 4,54 0 60,0 a

Supraociptal 0 13,63 20,0

Interparietal 36,36 18,10 20,0

Membro superior ou inferior 9,09 4,54 40,0

Esternébrio 4,54 0 0

Não ossificado

Vértebra Lombar 4,54 0 0

Malformações viscerais (%)

Retinocele 4,54 0 0

Comunicação intra-ventricular 4,54 9,09 0

Cardiomegalia 0 4,54 0

Hidrocefalia 9,09 4,54 0

Anomalias viscerais (%)

Hipoplasia renal 4,54 0 16,66


(E2G2) e ORCD 1874 mg/kg (E2G3). O Teste do qui-quadrado foi aplicado e a (p<0,05).

188


implantação (d6-d15). (A) Fontanela normal (E2G1) e (B) Fontanela com anomalia de grau moderado

– Ossificação incompleta (E2G3) (ponta da seta).

A análise percentual, embora tenha mostrado resultados significativos em relação aos

demais grupos experimentais (E3G1 e E3G2) não permite inferir que o ORCD tenha

aumentado a incidência de malformações (tamanho da supraoccipital) e alteração (ossificação

da fontanela), pois o número de filhotes neste grupo (2.20 ± 1.71) foi baixo, dificultando

análise da ninhada, recomendado por Webster e Freemn (2001) para detectar teratógenos.

Apesar do percentual elevado, considerou-se baixa a quantidade (valores absolutos) dessas

alterações e malformações. Esta análise baseia-se nas considerações feitas por Bernardi

(1999) em relação aos agentes teratogênicos que geram apenas uma determinada anomalia,

mas o aumento da frequência com que esta ocorre.

Outras malformações e anomalias também foram investigadas e encontradas, tanto

esqueléticas como viscerais, porém não foram estatisticamente significativas as diferenças

(figuras 33, 34, 35 e 36). O comportamento ósseo pode ser visto através de três

manifestações: deficiência na homogeneidade, redução geral da densidade e redução da área

corada. Nos ratos a manifestação de sinais de ossos incompletos, pobremente calcificado ou

osso não ossificado são indicações de retardo de ossificação do esqueleto fetal. Parece existir

entre os teratologistas um consenso a respeito da manifestação do retardo na ossificação de

fetos, após o processo de coloração com alizarina vermelha (ALIVERT et al, 1979).

A B

189

Figura 32. Malformação esquelética (Agenesia de esternébrio) A. Esterno normal de um RN do grupo

controle (E2G1) e B. Ausência de esternébrio do grupo tratado (E2G2) (ponta da seta).

Nas análises das estruturas esqueléticas dos fetos, também foram verificadas a

ocorrência das manifestações: forma irregular, orifícios e fissuras. A forma irregular de ossos

dos fetos é um sinal de teratogenicidade, enquanto que orifícios e fissuras são considerados

formas variantes normais dos ossos, ou seja, não são considerados sinais de teratogenicidade

(SOLECKI et al., 2001).

Figura 33. Alteração esquelética (Falanges com ossificação incompleta) A. Falanges inferiores de um

RN do grupo controle (E2G1) e B. Falanges inferiores com ossificação incompleta (E2G3) (ponta da

seta).

Ossificações incompletas acompanhadas da diminuição de massas fetais e alterações

na calcificação de outros ossos agregam significado às análises (CHAHOUD;

A B

A B

190

PAUMGARTTEN, 2005). A redução das massas fetais nem sempre é acompanhado de

retardo de ossificação. Para ninhadas com grande número de fetos, as massas fetais podem ser

relativamente menores, mas nas análises esqueléticas podem apresentar padrões de

calcificação iguais encontrados em fetos de maior massa para um mesmo período gestacional.

Figura 34. Malformação visceral A. ventrículos laterias e 3º ventrículo normais (E1G3) e B.

ventrículos laterais e 3º ventrículo malformado - hidrocefalia leve (E2G2) (ponta da seta).

Figura 35. Alteração visceral A. Rins normais (E1G3) e B. Rin direito alterado – hipoplasia

renal (ponta da seta).

Com relação às anomalias e/ou malformações viscerais, as hidrocefalias encontradas

podem ser variantes do normal. É possível à constatação de casos isolados e devido ao acaso,

uma vez que não foi estatisticamente significativo. Portanto, independe de doses

administradas, já que foram observadas essas variações em fetos do grupo controle E3G1.

Segundo Spinosa et al. (2002), as hidrocefalias leves e algumas moderadas podem regredir em

algumas espécies, inclusive em humanos e que as diferenças entre espécies podem ocorrer

devido às possíveis transformações farmacocinéticas que impõe a unidade

materno/placentária/fetal.

A B

191

O presente estudo corrobora com o estudo realizado por Lourenço et al. (2009) com

camundongas prenhas, testando três doses de óleo de copaíba C. langsdorfii (297,48, 594,96 e

892,44 mg/kg. Não detectaram malformações ou alterações externas, viscerais e esqueléticas.

Sachetti et al. (2011) testaram três doses (500, 1000 e 1250 mg/kg) de C. reticulata em ratas

prenhas no período de organogênese e também não encontraram alterações e/ou

malformações associados ao óleresina de copaíba.

3.2.4.1.1 Contagem dos pontos de ossificação E2

O tratamento com ORCD na dose 1874 mg/kg interferiu na ossificação das falanges

anteriores dos RN´s expostos no período de organogênese. No entanto, contagem total dos

pontos de ossificação no E2G1, E2G3 e E2G3 foi, em média, 32.86, 33.04, e 31.40,

respectivamente, sem diferenças estatísticas significativas. Com relação às falanges

anteriores, os centros de ossificação do E2G3 diferiram tanto do controle E2G1 como do

grupo E2G2 que recebeu a menor dose (Tabela 5). Segundo Bernardi (1999), quanto maior o

período crítico de um determinado sistema, mais suscetível este será aos efeitos de um

determinado agente. Por esse motivo, nos testes de teratogênese, as anomalias ósseas dos

animais sempre são avaliadas, pois o período de organogênese do esqueleto é bastante longo.

A maior parte da transferência de cálcio para a mineralização do esqueleto fetal ocorre

no terço final da gestação. A mãe obtém esse cálcio aumentando sua absorção de cálcio na

dieta e reabsorção a partir dos ossos. O aumento da necessidade de cálcio parece ser uma

demanda uniforme para todos os mamíferos durante a gestação e lactação. Nos mamíferos,

essa transferência de cálcio da mãe para a prole ocorre via transporte transplancentário do

cálcio, durante o desenvolvimento fetal, ou através da secreção de cálcio no leite, durante a

lactação (WYSOLMERSKI, 2002).

Durante o desenvolvimento fetal, a maior parte do esqueleto desenvolve-se primeiro

como um padrão ou modelo cartilagíneo, e então a cartilagem deste modelo é gradualmente

substituída por osso. Estudos com humanos revelaram que o retardo da ossificação no período

pré-natal, e logo após o nascimento, predispõe ao desenvolvimento de osteoporose em idades

mais avançadas (TOTHILL; HANNAN, 2002). Estudos realizados com o extrato

hidroalcoolico da planta Lantana câmara demonstraram que esta planta foi capaz de aumentar

a frequência de retardo na ossificação de fetos (MELLO et al., 2005).

192

Tabela 5. Efeito do tratamento por via oral com ORCD, no período de pós-implantação (d6-

d15), sobre os pontos de ossificação em recém-nascidos.

E2G1 E2G2 E2G3

Vértebras cervicais 5.0 0± 0.00 5.00 ± 0.00 5.0 ± 0.00

Esternébrios 5.86 ± 0.13 5.90 ± 0.06 6.00 ± 0.00

Falanges anteriores 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00 3.80 ± 0.20 a,b

Metacarpos 3.95 ± 0.04 4.00 ± 0.00 4.00 ± 0.00

Falanges posteriores 4.00 ± 0.00 3.90 ± 0.09 4.00 ± 0.00

Metatarsos 4.95 ± 0.04 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00

Vértebras caudais 5.45 ± 0.17 5.22 ± 0.17 5.20 ± 0.20

Ossificação Total 11 1 32.86 ± 0.71 33.04 ± 0.20 31.40 ± 0.97

Resultados expressos em Média ± E.P.M e valores com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao

E2G1) e b(E2G3 em relação ao E2G2). Foi aplicado Análise de Variância (ANOVA) seguido do teste de tukey.

Este estudo é uma continuação do estudo já realizado por Lima et al., (2011).

Diferentemente, foi empregada uma formulação e outra via de administração, a via vaginal.

No entanto, também não foram detectadas alterações e/ou malformações externas,

esqueléticas e viscerais, após o uso do creme vaginal contendo o óleoresina de C. duckei no

período de prenhez. O presente estudo buscou avaliar os efeitos sistêmicos do ORCD, o

mesmo utilizado na formulação do creme vaginal (CVORCD). Embasado nos princípios de

toxicologia, qualquer substância pode ser considerada um agente tóxico, dependendo das

condições da exposição como dose, tempo, freqüência da exposição e as mais variadas vias de

administração. Por estas razões, é imprescindível conhecer as condições de uso seguro das

diversas substâncias químicas que podem ser de origem vegetal, animal ou mineral, para que

não ocorram danos à saúde humana ou animal, ou mesmo levando à ocorrência de agravos ao

meio ambiente e de óbitos (VENANCIO, 2006).

193

4 CONCLUSÃO

O tratamento com ORCD nas doses 366,89 mg/kg (10% da DL50) e 1874 mg/kg (50%

da DL50) no período pré natal (pré e pós-implantação) nos permite concluir que:

No período de pré-implantação:

A dose 366,89 mg/kg não provoca toxidade materna;

A dose 1874 mg/kg provoca toxidade materna;

As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não alteraram a performance reprodutiva

materna;

No período de pós-implantação:

As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg provocam toxidade materna;

A dose 366,89 mg/kg não alterou a performance reprodutiva materna e a dose de 1874

mg/Kg alterou, diminuindo o número de fetos vivos e aumentando os índices placentários;

As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não foram embriofetotóxicas;

As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não provocou teratogenicidade;

Houve efeito da dose (1874 mg/kg em relação 366,89 mg/kg) sobre a diminuição da

ossificação das falanges anteriores;

194

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202

CAPÍTULO 4: AVALIAÇÃO DA TOXIDADE REPRODUTIVA APÓS O

TRATAMENTO COM ÓLEORESINA DE C. duckei NOS PERÍODOS PERINATAL E

PÓS-NATAL

203

RESUMO

Os efeitos da exposição a medicamentos no período perinatal, as mudanças que ocorrem em

um organismo em desenvolvimento podem ser de natureza funcional ou bioquímica,

estrutural ou morfológica. As lesões produzidas podem ser reversíveis ou irreversíveis. O

estudo dessas alterações associados ao exame da prole expostas a medicamentos, sejam estes

de origem sintética ou natural, são importantes. Alterações funcionais ou bioquímicas

somente poderão ser investigadas após alguns dias de nascimento e desenvolvimento da prole.

Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a toxidade reprodutiva após o tratamento com

óleoresina de Copaifera duckei (ORCD) nos períodos perinatal e pós-natal. Para tanto, foram

utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), fêmeas, isogênicas, e machos. O ORCD

foi administrado por via oral (v.o), nas doses que correspondem a 10% da DL50 (3758,16

mg/kg) e 50% da DL50. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos:

Grupo controle G1 (0,5 mL de água destilada), Tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e

Tratado G3 (1874 mg/kg de ORCD). O estudo foi dividido em dois ensaios, Experimento 3

(E3) e o Experimento 4 (E4), de acordo com o segmento III dos estudos de toxicologia

reprodutiva, adaptados de normas da Environmental Protection Agency e recomendados pela

Food and Drugs Administration e Organization for Economic Cooperation and Development.

O E3 compreendeu o segmento III, avaliando-se fêmeas durante no período perinatal (de

desenvolvimento fetal in útero). O E4 também compreendeu o seguimento III, porém o

tratamento compreendeu o período pós-natal (lactação). Para tanto, 40 animais, sendo 15

fêmeas (n=5/grupo experimental, E3G1, E3G2 e E3G3) e 5 machos reprodutores no E3 e 15

fêmeas (n=5/grupo experimental, E4G1, E242 e E4G3) e 5 machos reprodutores no E4 foram

utilizados. Durante o tratamento com ORCD, sinais clínicos de toxidade aguda, tal como

agitação, sangramento e estresse foram relatados em 2 animais no grupo tratado com 366,89

mg/kg (E3G2). Com o aumento da dose, de 366,89 mg/kg para 1874 mg/kg, além desses

sinais, diarréia e piloereção também foram relatados nas progenitoras do E3G3 durante o

tratamento. Durante o tratamento com ORCD 1874 mg/kg todas as ratas vieram a óbito. O

ORCD 366,89 mg/kg apresentou efeito sobre o índice de viabilidade, índice de desmame e

razão sexual, com diferença estatística (p<0,05) entre o grupo tratado E3G2 em relação ao

grupo controle E3G1. O ORCD 366,89 mg/kg não alterou o trabalho de parto, pois não foi

encontrada diferenças significativas ao comparar a média do tempo de prenhez. O grupo

E3G2 obteve maior tempo de prenhez (23.0 ± 0.31) e tamanho da ninhada (8.80 ± 0.66). As

lactantes tratadas com o ORCD apresentaram agitação e estresse após o tratamento, sendo

ainda relatado piloereção em uma lactante do grupo E4G2 que recebeu a menor dose (366,89

mg/kg) e sangramento nasal e uma das ratas do E4G3 que recebeu a maior dose (1874

mg/kg). Esses sinais clínicos foram detectados nos experimentos, E1 (pré-implantação), E2

(pós-implantação) e E3 (desenvolvimento fetal). O ORCD nas doses utilizadas (1874 e 366,89

mg/kg) não causaram aumento do tempo de prenhez, nem mesmo diminuição do índice de

nascimento, de viabilidade e tamanho da ninhada. Todavia o índice de desmame e a razão

sexual diferiram (p<0,05) do grupo controle E4G1. No exame histopatológico, todos os

animais tanto do grupo controle (E4G1) como dos tratados (E4G2 e E4G3) apresentaram

integridade tecidual dos rins analisados, e os achados na avaliação histopatológica hepática

não diferiram dos do grupo controle.

Palavras-chave: Copaifera duckei, óleoresina, toxidade reprodutiva, perinatal e pós-natal,

lactação.

204

ABSTRACT

The effects of the exhibition to medicines in the perinatal period, the changes that happen in

an organism in development can be from functional or biochemical, structural or morphologic

nature. The produced lesions can be reversible or irreversible. The study of these changes

associated to the exam of the offspring exposed to medicines, not only from synthetic but also

from natural origin, they are important. Functional or biochemical changes can only be

investigated from birth after some days and development of the offspring. Therefore, this

study had as objective to evaluate the reproductive toxicity after the treatment with Copaifera

duckei oleoresin (ORCD) in the perinatal and postnatal periods. Wistar rats were used (Rattus

norvegicus albinus), females, isogenical, and males. ORCD was administered orally (v.o), in

the doses that correspond to 10% of DL50 (3758,16 mg/kg) and 50% of DL50. This way, the

groups were submitted to the following treatments: Control groups G1 (0,5 mL of distilled

water), Treated G2 (366,89 mg/kg of ORCD) and Treated G3 (1874 mg/kg of ORCD). The

study was divided in two samples, Experiment 3 (E3) and the Experiment 4 (E4), according to

the the segment III of the studies of reproductive toxicology, adapted from the rules of

Environmental Protection Agency and recommended by the Food and Drugs Administration

and Organization for Economic Cooperation and Development. E3 was related to the segment

III, being evaluated female rats during in the perinatal period (of fetal development in uterus).

E4 was also related to the continuation III, however the treatment was developed during the

postnatal period (weaning). 40 animals were used, 15 females (experimental n=5/grup, E3G1,

E3G2 and E3G3) and 5 reproductive males in E3 and 15 females (experimental n=5/group,

E4G1, E242 and E4G3) and 5 reproductive males in E4 were used. During the treatment with

ORCD, clinical signs of acute toxicity, such as agitation, bleeding and stress were recorded in

2 animals in the treated group with 366,89 mg/kg (E3G2). Because of the rise of dose, from

366,89 mg/kg to 1874 mg/kg, besides these signs, diarrhea and piloerection were also

reported in the progenitors of E3G3 during the treatment. During the treatment with ORCD

1874 mg/kg all of the female rats died. ORCD 366,89 mg/kg presented effect over the

viability rate, weaning rate and sexual reason, with statistical difference (p <0,05) among the

treated group E3G2 in relation to the control group E3G1. ORCD 366,89 mg/kg did not

change the labor, because it was not found any significant differences when comparing the

average time of pregnancy. The group E3G2 had a higher time of pregnancy (23.0 ± 0.31) and

size of the brood (8.80 ± 0.66). The lactic ones treated with ORCD presented agitation and

stress after the treatment, it also was reported piloerection in lactic one from the group E4G2

that received to smallest doses (366,89 mg/kg) and nasal bleeding and one of the female rats

of E4G3 that received the largest dose (1874 mg/kg). Those clinical signs were recorded in

the experiments, E1 (pre-implantation), E2 (post-implantation) and E3 (fetal development).

ORCD in the used doses (1874 and 366,89 mg/kg) did not cause increase the time of

pregnancy, not even decrease of the rate of birth, of viability and size of the brood. However,

the weaning rate and the sexual reason differed (p <0,05) in relation to the control group

E4G1. In the histopathologic exam, all the animals, both from the control groups (E4G1) and

from treated ones (E4G2 and E4G3) presented tissue integrity of the analyzed kidneys, and

the findings in the evaluation of hepatic histopathologic did not differ from those in the

control groups.

Keywords: Copaifera duckei, oleoresin, reproductive toxicity, perinatal and postnatal,

lactation.

205

1 INTRODUÇÃO

As anomalias congênitas contribuem, significativamente, como a principal causa de

morte (70% do todas as mortes neonatais) no primeiro mês de vida, e um percentual

significativo (22%) das mortes em crianças durante os primeiros 15 meses de vida

(HANSEN; HARRIS, 2013). A exposição a medicamentos no período periconcepcional

representa uma causa fundamental de malforções fetais. Os efeitos teratogênicos de várias

classes de fámacos são conhecidos e resultam de 3 a 5% das anomalias congênitas

(HANSEN; HARRIS, 2013). Nesse conceito, são também incluídas anomalias latentes, que

demoram anos para se expressar, como é o caso dos fetos expostos ao dietilestilbestrol, usado

no tratamento do câncer, com risco aumentado de desenvolverem adenocarcinoma da vagina,

neoplasia, com surgimento apenas a partir da adolescência (ARAÚJO, 2006).

Os efeitos da exposição aos medicamentos no período perinatal pode ser de natureza

funcional ou bioquímica, estrutural ou morfológica (ALMEIDA; LEMÔNICA, 2000). As

lesões produzidas podem ser reversíveis e irreversíveis. As irreversíves não causam nenhuma

conseqüência tardia ao animal, tanto estrutural como funcional, manifestando-se em geral por

diminuição no peso corporal ao nascimento, essas lesões são embriotóxicas. As irreverssíveis

não são compatíveis com a vida, pois produzem embrioletalidade, podendo resultar em

abortos espontâneos, natimortos ou reabsorção. As lesões compatíveis com a vida são

chamadas teratogênicas ou tóxicas, que dependem, exclusivamente, do período de exposição

do animal (WILSON, 1973).

Um medicamento considerado teratogênico é aquele capaz de aumentar a freqüência

de uma anormalidade funcional ou estrutural na prole de determinada espécie animal, quando

administrado nos progenitores antes da concepção ou à mãe durante algum período crítico da

gestação (WILSON, 1973). Nos períodos de desenvolvimento fetal e neonatal, todos os

tecidos estão formados e os animais crescem, no entanto, alguns sistemas ainda sofrem

maturação. No período perinatal, que inclui o período de gestação e o neonatal, observam-se

caracteristicamente histiogênese, maturação funcional e ganho de peso corporal. A exposição

a medicamentos neste período pode produzir redução no peso corporal, desordens funcionais

e carcinogênese (BERNARDI, 2007).

O feto é mais resistente aos efeitos letais do que o embrião, porém apresenta grande

suscetibilidade a agentes carcinogênicos devido a alta replicação celular, ontogenia de

206

enzimas de biotransformação e baixa imunocompetência. A toxidade reprodutiva é a

ocorrência de qualquer interferência causada por alguma substância nas capacidades

reprodutivas de machos e fêmeas, incluindo não só o período perinatal, mas o pós-natal

também (NEUBERT et al., 1992). Atualmente há necessidade de estudos longitudinais,

abrangendo não só alterações estruturais, mas também modificações funcionais, como o

desenvolvimento de características físicas desde os primeiros dias de vida e até estudos de

comportamento animal, conforme sugeriu Bernardi (2007).

A maior parte dos estudos de toxidade reprodutiva utilizam apenas protocolos para

avaliar a toxidade da reprodução, que é amplamente aceito pelas agências regulatórias de

avaliação de toxidade, por exemplo, FDA e ANVISA (US EPA, 1996; BRASIL, 2013). Esses

protocolos consistem na administração da substância a ser avaliada, em fêmeas prenhas desde

a implantação até o final da prenhez (um dia antes do parto), momento em que os fetos são

analisados quanto às malformações esqueléticas e viscerais antes do nascimento. No entanto,

sua grande limitação refere-se ao fato de que estes estudos, não expõem e não examinam os

animais experimentais, em nenhum período pós-natal. Embora algumas agências reguladoras

incluam testes na fase de desenvolvimento pós-natal, esta não é obrigatória, por isso,

geralmente não são conduzidos pelas indústrias (CLAUDIO et al. 1999).

Nas fases pré e pós-natal, os órgãos sexuais e o sistema nervoso central que ainda

estão se diferenciando, podem ser atingidos por substâncias presentes no sangue materno,

através da placenta durante a gestação ou através do leite durante a lactação. Os indivíduos

expostos nesses períodos de desenvolvimento são mais vulneráveis à ação de substâncias

químicas em função de menor capacidade metabólica e excretora e da ausência de muitos

mecanismos de retroalimentação do sistema endócrino (ZENICK; CLEGG, 1989).

A gestação altera alguns processos de biotransformação de medicamentos, afetando

intensamente a excreção renal, que é a via mais importante na eliminação da maioria dos

medicamentos do organismo. O fluxo plasmático renal e a filtração glomerular apresentam-se

aumentados desde o início até o final da gestação, o que facilita o processo de eliminação de

medicamentos. As alterações fisiológicas do sistema materno na prenhez propiciam um

aumento na absorção e distribuição de medicamentos, redução na sua biotransformação e

incremento na excreção (BERNARDI, 2007). No puerpério ou período pós-natal, ocorrem

mudanças fisiológicas e anatômicas, decorrentes da gravidez, que perduram por algumas

semanas (SOUZA, 2007).

207

O estudo dessas alterações associados ao exame da prole expostas a medicamentos,

sejam estes de origem sintética ou natural, são importantes. Alterações funcionais ou

bioquímicas somente poderão ser investigadas após alguns dias de nascimento e

desenvolvimento da prole. Segundo Buschmann (2006), a principal diferença do SNC

humano e dos roedores é o período de desenvolvimento, que no homem ocorre,

principalmente, na fase pré-natal e em roedores após o nascimento.

Embora o conhecimento a respeito de drogas na lactação tenha sido muito ampliado,

ainda não se conhecem os efeitos colaterais para as crianças amamentadas de muitas drogas

utilizadas pela nutriz (BRASIL, 2000). Deve-se ressaltar que a lactação é um período no qual

os RN´s são mais sensíveis que os adultos a efeitos tóxicos das substâncias químicas, já que

que o neonato tem baixa capacidade de biotransformar os xenobióticos pela imaturidade dos

sistemas enzimáticos (ALCORN; MCNAMARA, 2003). Acrescente-se, também, que certos

sistemas irão se desenvolver completamente somente no período pós-natal. Por exemplo, o

SNC no rato se forma completamente ao redor do 21º dia de vida (KAUFMANN, 2000) e,

neste caso, existem claras evidências que este sistema em desenvolvimento é muito mais

sensível, em relação ao SNC de ratos adultos, aos vários xenobióticos (TILSON, 2000).

O leite materno pode ser uma via de excreção materna de substâncias tóxicas (BEGG

et al., 2002). O princípio fundamental da prescrição de medicamentos para mães lactantes

baseia-se no conceito de risco e benefício. Deve-se optar, sempre que possível, por uma droga

já estudada, com pouca excreção no leite materno e sem risco aparente para a saúde do bebê.

Diversos estudos comprovaram que o abandono precoce da amamentação deve-se a exposição

dos lactentes a medicações maternas (AMERICAN ACADEMY OF PEDIATRICS, 2001;

LAMOUNIER et al., 2002; ANDERSON; POCHOP, 2003). De fato, diversas substâncias

químicas são transferidas ao leite, representando uma importante fonte de intoxicação para o

neonato. Como exemplos, estão algumas toxinas encontradas em plantas, como alcalóides

pirrolizidínicos e ptaquilosídeos (MEDEIROS; GÓRNIAK; GUERRA, 1999). Os efeitos de

muitas drogas novas ainda não foram devidamente estudados, ou apresentam divergências na

literatura quando utilizados na lactação (BRASIL, 2000). Portanto, surge a necessidade

estudos para melhor compreensão dos efeitos sistêmicos provocados por esses agentes

químicos durante a lactação. Fármacos que apresentam evidências de danos significativos à

saúde do lactente devem ser contra indicados na amamentação. Nesse caso, deve-se suspender

a amamentação, pois o risco do uso do medicamento pela nutriz é maior que os benefícios do

aleitamento materno (NETO, 2006).

208

O período de desenvolvimento fetal e de lactação também aresentam grande

susceptibilidade a exposição de agentes químicos, casando prejuízos tanto a saúde materna

como a fetal e/ou neonatal. Segundo Claudio et al. (1999), a maior limitação dos protocolos

de avaliação da toxidade é a ausência de exame dos filhotes, em fase pós-natal, o que, na

maioria das vezes, poderá levar a erros no julgamento sobre o efeito teratogênico da

substância testada ou aos efeitos tardios provenientes na lactação. Este capítulo teve como

objetivo avaliar a toxidade reprodutiva do óleresina de C. duckei em dois períodos do

desenvolvimento: o final do período pré-natal (in útero) e o período pós-natal (lactação),

avaliando o desenvolvimento geral e sexual da progênie da primeira geração.

209


2.1 MATERIAL




Segundo o laudo da empresa, o óleoresina obtido foi da espécie C. duckei Dwyer (ORCD).


Antes do início das atividades no LABORATÓRIO DE PESQUISA EM

FÁRMACOS/UNIFAP, o projeto de tese foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Universidade Federal do Amapá, recebendo o número 008A/2011 (APÊNCIDE

A).

2.3 ANIMAIS

Foram utilizados ratos Wistar (Rattus norvegicus albinus), 30 fêmeas, isogênicas,

provenientes do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em

Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade de Campinas – UNICAMP e 10 machos

provenientes do Laboratório Central do Amapá (LACEN-AP). Após a chegada dos animais,

os mesmo passaram por um período de adaptação, e foram mantidos em estantes climatizadas

com temperatura controlada (23±2º C), obedecendo a um ciclo claro/escuro de 12 horas

(período claro das 7:00 h da manhã às 19:00 h da noite) e receberam água e ração (Labina®) à

vontade até o início dos ensaios.

2.4 VIA DE ADMINISTRAÇÃO E DOSES UTILIZADAS

A DL50 do ORCD, em ratos por via oral, é 3,79 ml/kg, que correponde a 3758,16

mg/kg (CASCON, 2004). A via de administração utilizada foi a via oral (v.o), gavagem,

objetivando-se avaliar alterações sistêmicas. Neste estudo optou-se em utilizar doses que

correspondem a 10% da DL50 para o grupo tratado G2 e 50% da DL50 para o grupo tratado

210

G3. Desta forma, os grupos foram submetidos aos seguintes tratamentos: O grupo controle

G1 (0,5 mL de água destilada), o tratado G2 (366,89 mg/kg de ORCD) e tratado G3 (1874

mg/kg de ORCD).

2.5 DESENHO EXPERIMENTAL

O estudo foi dividido em dois ensaios, Experimento 3 (E3) e o Experimento 4 (E4), de

acordo com o segmento III dos estudos de toxicologia reprodutiva, adaptados de normas da

Environmental Protection Agency e recomendados pela Food and Drugs Administration e

Organization for Economic Cooperation and Development. O E3 compreendeu o segmento

III, avaliando-se fêmeas durante no período perinatal (de desenvolvimento fetal in útero). O

E4 também compreendeu o seguimento III, porém o tratamento compreendeu o período pós-

natal (lactação). Para tanto, 40 animais, sendo 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E3G1,

E3G2 e E3G3) e 5 machos reprodutores no E3 e 15 fêmeas (n=5/grupo experimental, E4G1,

E242 e E4G3) e 5 machos reprodutores no E4 foram utilizados (Figura 1).

211

Figura 1. Desenho experimental - Experimentos 3 e 4 para avaliar a toxicologia reprodutivas após tratamento, via oral, com óleoresina de C.

duckei, de acordo com o segmento III (perinatal e pós-natal).

CONTROLE 0,5 mL água

E3G1 (n=5)

CONTROLE 0,5 mL água

E4G1 (n=5)

TRATADO 10% DL50

366,8 mg/kg

E4G2 (n=5)

TRATADO 50% DL50

1874 mg/kg

E4G3 (n =5)

SEGMENTO III Perinatal

EXPERIMENTO 3

TRATADO 10% DL50

366,8 mg/kg

E3G2 (n=5)

TRATADO 50% DL50

1874 mg/kg

E3G3 (n =5)

ENSAIOS

TOXICOLOGIA

REPRODUTIVA

SEGMENTO III Pós-natal

EXPERIMENTO 4

212

2.5.1 Seqüência experimental

2.5.2 Análise do ciclo estral (Citologia vaginal)

Após o período de adaptação e ao atingirem a maturidade sexual, aproximadamente

250 g, iniciou-se o exame de esfregaço vaginal, diariamente, pela manhã. Uma micropipeta,

contendo 10μL de soro fisiológico 0,9%, era introduzinda no canal vaginal e, posteriormente,

aspirando juntamente com as células, que eram visualizadas em microscopia óptica, para

detectar a fase do ciclo estral, segundo a técnica descrita por Marcondes et al. (2002)

2.5.3 Período de Acasalamento

Após a detecção da fase proestro, as fêmeas nulíparas, foram separadas em gaiolas de

polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho ao final da tarde. Na

manhã subseqüente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais foram coletados. Foi

considerada como indicativo de prenhez a presença de espermatozóides, associado ao

diagnóstico da fase estro do ciclo estral. Confirmada a prenhez, esse dia foi considerado como

o dia zero (d0). Após a confirmação da prenhez, as ratas foram separadas, randomicamente,

em cada grupo (E3G1, E3G2, E3G3, E4G1, E4G2 e E4G3). Após, deu-se início a sequência

experimental, de acordo com cada protocolo experimental (E3 e E4).


2.5.4.1 Tratamento no período perinatal in útero (d16-d20) E3


de desenvolvimento fetal. Esta fase caracteriza-se pela diferenciação e crescimento tissular,

maturação fisiológica dos diferentes sistemas e crescimento ponderal do feto, compreendendo

o d16 ao d21 (FRITZ; GIESE, 1990; ROGERS; KALVLOCK, 2001). Assim, o período de

tratamento foi do d16 ao d20, uma vez ao dia.

A duração da prenhez da rata tem uma duração máxima de 23 dias e, após o parto, que

desta vez ocorrerou sem intervenções cirúrgicas, foram avaliados diversos parâmetros, tal

213

como mortalidade materna, tempo de prenhez, tamanho da ninhada. No dia do desmame as

progenitoras foram sacrificadas em câmera de CO2.


Durante o tratamento, as ratas foram avaliadas quanto à presença de manifestações de

sinais de toxidade aguda, tal como, diarreia, piloereção, agitação, sialorréia e sangramento.

2.5.4.2.1 Avaliação de massa corporal das progenitoras E3

As ratas foram pesadas nos d16, d17, d18 e d20 para avaliar o ganho de massa

corporal foi calculado.

2.5.4.2.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3

O consumo de água e ração foi mensurado nos d16, d17, d18 e d20.

2.5.4.3 Avaliação da progênie exposta no período perinatal (in útero) E3

Alguns parâmetros foram avaliados conforme as fórmulas abaixo:

1. ÍNDICE DE NASCIMENTO (%) = (nº de filhotes nascido vivos/ nº de filhotes

nascidos) x 100

2. ÍNDICE DE VIABILIDADE (%) = (no de filhotes vivos no 4

o dia pós-natal / nº de

nativivos) x 100.

3. ÍNDICE DE DESMAME (%) = (nº de filhotes vivos no desmame/ nº de nascidos

vivos) x 100

4. RAZÃO SEXUAL (%) = (nº machos / nº fêmeas) x 100

2.5.4.3.1 Massa da progênie E3

As massas dos filhotes (fêmeas e machos) de todos os grupos de tratamento foram

aferidas após o nascimento (dpn = dia pós-natal), dpn1, dpn 7, dpn 14 e d19 (lactação) e

dpn24, dpn49, dpn59 e dpn 74 (desenvolvimento).

214

2.5.4.3.2 Avaliação do desenvolvimento geral e sexual da progênie E3

2.5.4.3.2.1 Descolamento dos pavilhões auriculares E3

Após o nascimento foi dado início a observação da progênie quanto ao descolamento

bilateral completo dos pavilhões auriculares. As observações foram realizadas, diariamente,

até a detecção da variável.

2.5.4.3.2.2 Surgimento de pelos E3

A progênie foi observada a partir do 6º dia pós-natal quanto ao surgimento de pêlos.

As observações foram feitas, diariamente, até a detecção de surgimento de pêlos na cabeça,

membros e dorso dos animais.

2.5.4.3.2.3 Abertura palpebral ocular bilateral E3

A progênie foi observada a partir do 12º dia pós-natal quanto à abertura bilateral

completa das pálpebras. As observações foram feitas, diariamente, até a detecção da variável.

2.5.4.3.2.4 Manifestações das características sexuais E3

No dpn6 foi realizada a sexagem dos filhotes, os quais foram mantidos na mesma

caixa com a progenitora. O parâmetro utilizado foi a visualização da distância ano-genital,

sendo maior nos machos em relação às fêmeas.

Para os descendentes machos, foi observada a descida dos testículos à bolsa escrotal e

separação prepucial. Já as fêmeas foram observadas quanto à abertura do canal vaginal e a

regularidade do ciclo estral, pelo exame da citologia vaginal, por um período de quinze dias.

2.5.4.3.2.5 Avaliação da atividade motora E3

Para investigar o possível efeito na atividade motora foi realizado nos 75 dpn o Teste

do Campo Aberto, de acordo com a metodologia caracterizada por Holland e Weldon (1968).

O aparelho para realização deste ensaio consistiu em uma caixa de madeira (40 x 60 x 50 cm)

com o chão dividido em 12 quadrantes. Cada animal foi colocado no centro do campo aberto

215

onde foi registrado, por um período de 5 min, o número de cruzamentos pelos quadrantes

(locomoção horizontal) e o número de rearing (locomoção vertical).


2.5.5.1 Tratamento no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4

Neste ensaio as fêmeas lactantes dos grupos E4G1, E4G2 e E4G3 foram tratadas na

fase de lactação. Nesta fase as células alveolares mamárias são pequenas e o espaço

intercelular é largo, o que faz com que substâncias maternas, incluindo drogas, linfócitos,

imunoglobulinas e proteínas transfiram-se mais facilmente para o leite materno (HALE,

2004). Desta forma, o tratamento foi durante a lactação, do 13dpn ao 19dpn, uma vez ao dia.

2.5.5.2 Toxidade aguda nas lactantes E4

Durante o tratamento, as ratas lactantes foram avaliadas quanto à presença de

manifestações de sinais de toxidade aguda, tal como, diarreia, sialorréia, piloereção, agitação

e sangramento. Após o nascimento dos descendentes, os mesmo parâmetros do E3 foram

avaliados no E4 (mortalidade materna, tempo de prenhez e tamanho da ninhada).

2.5.5.2.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4

As ratas foram pesadas nos dpn13, dpn14, dpn15, dpn16, dpn17, dpn18 e dpn19, para

avaliar o ganho de massa corporal.

2.5.5.2.2 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4

O consumo de água e ração foi mensurado As ratas foram pesadas nos dpn13, dpn14,

dpn15, dpn16, dpn17, dpn18 e dpn19.

No dpn19, dia do desmame, foi realizada a coleta de sangue e processadas para análies

bioquímicas e hematológicas. Posteriormente, essas progenitoras foram sacrificadas em

câmeras de CO2 e seus órgãos (fígado, rins, baço, coração e pulmão) foram examinados e

216

pesados. Após, foram mantidos em formol 10%, para conservação, até o processamento para

análises histopalógicas.

2.5.5.2.3 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4

Para análise bioquímica, o material foi centrifugado a 3.500 rpm durante 10 minutos,

para separar o soro dos elementos figurados do sangue. Posteriormente, procedeu-se a

dosagem das enzimas plasmáticas, como aspartato aminotransferase (AST) e alanina

aminotransferase (ALT), e demais parâmetros como bilirrubina total e direta, colesterol total,

fosfatase alcalina, glicose, triglicerídeos, uréia e creatinina, utilizando kits BIOCLIN®

(ensaios enzimáticos colorimétricos e cinéticos colorimétricos) e o equipamento

multiparamétrico (Alizé) da Biomérieux.

Para análise hematológica, fez-se o hemograma completo, determinando os valores de

hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos, plaquetas e os índices hematimétricos,

volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de

hemoglobina corpuscular média (HCM), utilizando analisador automático de células

hematológicas HumaCount Plus. A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em

extensões coradas com May-Grunwald-Giemsa, em cada ensaio, 100 células foram analisadas

e contadas.

2.5.5.2.4 Análise histopatológica das lactantes E4

Os órgãos, previamente conservados em formol 10%, foram encaminhados ao Centro

de Diagnóstico de Anatomia Patológica e Citopatologia, para processamento e análise. As

amostras foram fragmentadas em 5 mm de diâmetro para uma boa fixação. Após a completa

fixação, o material foi lavado e deixado em álcool 70% por três horas. Após sucessivas

passagens em álcool 96º e 100º, foram realizadas três passagens em xilol e um banho de

parafina a 60º C por uma hora e um segundo banho de parafina em estufa à vácuo por mais

uma hora, seguindo a inclusão do material.

Para obtenção dos cortes histológicos, os blocos de parafina foram aparados,

objetivando-se retirar o excesso de parafina dos lados da peça emblocada, para evitar o

enrugamento dos cortes. Foram cortados com a espessura de 5µm e com o auxílio de uma

pinça os fragmentos da fita de cortes foram colocados em banho-maria com água destilada a

217

temperatura de 45º a 50ºC e após os cortes serem esticados foram pescados com a lâmina,

previamente limpas e desengorduradas. Em seguida, as lâminas foram secadas em estufa a

55ºC.

As lâminas foram passadas em sequencias de xilol e álcoois para desparafinar e

hidratar os cortes, para posterior coloração com hematoxilina-eosina (HE). Para cada órgão

foram confeccionadas três lâminas. Após, foram analisadas por microscopia óptica pela

Patologista Drª. Nelma Rocha.

2.5.5.3 Avaliação dos lactentes expostos no período pós-natal (dpn13-dpn19) E4

Alguns parâmetros foram avaliados conforme as fórmulas abaixo:

1. ÍNDICE DE NASCIMENTO (%) = (nº de filhotes nascido vivos/ nº de filhotes

nascidos) x 100

2. ÍNDICE DE VIABILIDADE (%) = (no de filhotes vivos no 4

o dia pós-natal / nº de

nativivos) x 100.

3. ÍNDICE DE DESMAME (%) = (nº de filhotes vivos no desmame/ nº de nascidos

vivos) x 100

4. RAZÃO SEXUAL (%) = (nº machos / nº fêmeas) x 100

2.5.5.3.1 Toxidade aguda dos lactentes E4

Durante o tratamento, os filhotes lactentes foram avaliadas quanto à presença de

manifestações de sinais de Toxidade aguda.

2.5.5.3.2 Massa dos lactentes E4

Os filhotes lactentes (fêmeas e machos) de todos os grupos de tratamento foram

pesados no dpn1, dpn 7, dpn 14 e d19 (lactação) e dpn24, dpn49, dpn59 e dpn 74

(desenvolvimento).

2.5.5.3.3 Avaliação do desenvolvimento geral da progênie

218

2.5.5.3.4 Descolamento dos pavilhões auriculares

Idem o item 2.5.4.3.2.1

2.5.5.3.5 Surgimento de pêlos

Idem item 2.5.4.3.2.2

2.5.5.3.6 Abertura palpebral ocular bilateral

Idem item 2.5.4.3.2.3

2.5.5.3.7 Manifestações das características sexuais

Idem item 2.5.4.3.2.4

2.5.5.3.8 Avaliação da atividade motora

Idem o item 2.5.4.3.2.5

2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA E3 E E4

Para comparação dos valores médios de massa corporal, ingestão de água, consumo de

ração, tempo de prenhez, intervalos entre estros, duração de cada fase do ciclo, dia do 1º estro,

desenvolvimento ponderal da progênie e avaliação da atividade motora foi empregada teste t

não pareado (2 grupos) e e análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey (3

grupos). Com relação aos parâmetros reprodutivos maternos, tal como mortalidade materna,

índice de nascimento, índice de viabilidade, índice de desmame, desenvolvimento geral da

progênie e regularidade do ciclo foi aplicado o qui-quadrado. Para avaliar os parâmetros

bioquímicos, hematológicos e peso dos órgão empregou-se ANOVA, seguido de Tukey. Foi

considerado, como nível de significância estatística, o limite de 5 % (p < 0,05). As análises

estatísticas foram realizadas no software Instat GraphPad® e os gráficos construídos no

software Prism GraphPad®.

219




Durante o tratamento com ORCD, sinais clínicos de toxidade aguda, tal como agitação

(2/5), estresse (2/5) foram relatados no grupo tratado com 366,89 mg/kg (E3G2). Com o

aumento da dose para 1874 mg/kg, além desses sinais, sangramento nasal (2/5) e vaginal

(2/5), diarréia (1/5) e piloereção (2/5) também foram relatados nas progenitoras do E3G3

durante o tratamento.

Souza et al. (2000), semelhantemente, observaram sinais clínicos de toxidade aguda

após administração do óleoresina de C. multijuga. No entanto, Ribeiro et al. (2007) e sachetti

(2009) não detecaram esses sinais de toxidade em ratos após administração do óleoresina de

Copaifera spp (800 mg/kg) e Copaifera reticulata (500, 1000 e 1250 mg/kg),

respectivamente.

3.1.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das progenitoras E3

Durante o tratamento com ORCD no período de desenvolvimento fetal (final da

prenhez) houve uma evolução ponderal da massa corpórea nos grupos controle (E3G1) e

tratado 366,89 mg/kg (E3G2), e devido a toxidade no grupo E3G3, houve diminuição abrupta

da massa corporal entre o segundo e terceiro dia de tratamento, d17 e d18, respectivamente,

culminando com óbito de todas as ratas do grupo E3G3 no terceiro dia (d18) de tratamento

com ORCD 1874 mg/kg (Figura 2).

A taxa de crescimento corporal durante o período fetal é muito grande, principalmente

nas últimas semanas (MOORE; PERSAUD, 2008). Esse crescimento poderia ser

acompanhado pelo aumento da massa corporal materna, de maneira gradual. Neste estudo o

ORCD 1874 mg/kg causou toxidade materna e, consequentemente, toxidade fetal, resultando

em óbitos maternos e fetais. Como a gestação é um estado que demanda aumento das

atividades metabólicas necessárias para suportar, tanto a fisiologia hormonal materna quanto

o desenvolvimento normal do feto. Assim, o excessivo ou inadequado ganho de peso pode



220

acarretar complicações tanto para a saúde materna como para a fetal (HERRERO-

MERCADO et al, 2011).


(E3G3), sobre a massa de ratas prenhas, tratadas no período perinatal, correspondente ao período de

desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E3G1) foi administrada água destilada (0,5

mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos




3.1.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das progenitoras E3

Não foi observada diferença estatística significativa entre os grupos controle E3G1 e

os tratados E3G2 e E3G3, nas doses de 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg, respectivamente.

Todavia, no gráfico, nota-se a diminuição abrupta da ingestão de água no grupo E3G3 entre o

segundo (d17) e o terceiro (d18) dia de tratamento, que culminou no óbito dessas progenitoras

(Figura 3). A diminuição da ingestão hídrica no grupo E3G3 é compatível com a perda de

massa corporal, citado anteriormente, indicando que a dose de 1874 mg/kg causou toxidade

materna.

O consumo médio de ração das progenitoras que receberam o ORCD (E3G2 e E3G3)

não diferiu do controle (E3G1), exceto no último dia de tratamento (d20) (p<0,05). O

comportamento no gráfico foi semelhante entre os grupos tratados, com aumento do consumo

médio no segundo dia de tratamento (d17), diminuindo no terceiro dia (d18) (Figura 4).

16 17 18 20250

300

350

400E3G1

E3G2

E3G3

a,b

dia de Prenhez (d)

M

assa (

g)

221


(E2G3), sobre a ingestão de água de ratas prenhas, tratadas no período perinatal, correspondente ao

período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi administrada água

destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M. Os valores não diferiram entre si

ao nível de 5% (p>0,05). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=

5/grupo).


(E2G3), sobre o consumo de ração de ratas prenhas, tratadas no período perinatal, correspondente ao

período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E2G1) foi administrada água

destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são


b(E3G3 em relação ao E3G2). Foi aplicado Análise

de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey e Teste t não pareado (n= 5/grupo).

16 17 18 2025

30

35

40

45

50

55E3G1

E3G2

E3G3

dias de Prenhez (d)

Ág

ua (

mL

)

16 17 18 2010

15

20

25

30E3G1

E3G2

E3G3

a

dias de Prenhez (d)

Ração

(g

)

222

3.1.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos de progenitoras expostas no período perinatal

(in útero) (E3)

Durante o tratamento com ORCD 1874 mg/kg todas as ratas vieram a óbito. O ORCD

366,89 mg/kg apresentou efeito sobre o índice de viabilidade, índice de desmame e razão

sexual, com diferença estatística (p<0,05) entre o grupo tratado E3G2 em relação ao grupo

controle E3G1 (Tabela 1).

Para Nepuceno et al. (2005), as condições hormonais maternas também são

necessárias para o bom desenvolvimento embrionário, sendo amplamente conhecido que

níveis sangüíneos de progesterona inadequados interferem com a viabilidade do embrião, por

não permitirem que o endométrio esteja adequadamente preparado para a sustentação da

gestação. A progesterona é um dos principais agentes responsáveis pelo relaxamento uterino

na gestação, e estudos indicam que a redução dos níveis plasmáticos deêm início ao parto

(MOHAN; BINNETT, 2006).

Tabela 1. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros reprodutivos maternos de

ratas tratadas no período de pós-implantação (d16-d20).

E3G1 E3G2 E3G3

Mortalidade materna (n) 0 0 100

Tempo de Prenhez (dias) 22.2 ± 0.2 23.0 ± 0.31 -

Índice de nascimento (%) 100 ± 0.00 97.77 ± 2.22 -

Índice de viabilidade (%) 100 ± 0.00 72.5 ± 19.52 a -

Índice de desmame (%) 100 ± 0.00 72.5 ± 19.52 a -

Tamanho da ninhada (n) 6.40 ± 1.28 8.80 ± 0.66 -

Razão Sexual (M/F) 128.33%±54.11% 165% ±80.15% a

-


(E3G2) e 1874 mg/kg (E3G3). Os dados representam a média ± E.P.M. As variáveis indicadas como índices ou

percentuais foram aplicadas qui-quadrado e as variáveis com medidas ordinais foi aplicado o teste t não pareado. a (p < 0,05).

O parto é o processo pelo qual o feto, a placenta e as membranas fetais são expelidos

do trato reprodutor materno. O trabalho de parto é a sequência de contrações uterinas que

resultam na dilatação do colo uterino, saída do feto e da placenta do útero (MOORE;

PERSAUD, 2008). No presente estudo o ORCD 366,89 mg/kg não alterou o trabalho de



223

parto, pois não foi encontrada diferenças significativas ao comparar a média do tempo de

prenhez. O grupo E3G2 obteve maior tempo de prenhez (23.0 ± 0.31) e tamanho da ninhada

(8.80 ± 0.66). Por outro lado, Almeida (2009) considera que o número de filhotes, geralmente,

está associado à variabilidade no tempo da prenhez, de modo que, quanto maior o número,

menor o tempo de prenhez.

O período imediatamente após o nascimento é um período crítico quando o cérebro

imaturo é permanentemente alterado por hormônios esteróides gonadais e da supra-renal

(GOMES et al.,1999). Variações no cuidado maternal têm sido amplamente consideradas

como uma influência crítica no desenvolvimento (CHAMPAGNE et al., 2003). O índice de

viabilidade mostra a presença de alterações estruturais e funcionais que não causam morte no

útero, mas são incompatíveis com a vida enquanto que o índice de desmame avalia as

alterações morfofuncionais incompatíveis com a vida, embora eles apenas causem a morte em

longo prazo (BEDRAN, 1988).

Sachetti et al. (2011) estudaram os efeitos pós-natal do óleoresina de C. reticulata, no

entanto, não avaliram os índices de viabilidade e de desmame. Um estudo conduzido por

Dimech et al. (2006) sobre a performance reprodutiva em ratos machos com o extrato

hidroalcoólico de Mentha crispa (0,5 e 1,0 g/kg) não encontram diferença nos índices de

viabilidade e desmame na progênie. Mentha crispa também apresenta na composição do óleo

essencial cariofileno e humuleno, embora em menor quantidade (PIANOWSKI, 2000),

compostos que também estão presentes nos óleoresinas de Copaifera spp.

3.1.2 Toxidade na progênie de progenitoras tratadas no período perinal in útero (d16-

d20) E3

3.1.2.1 Desenvolvimento ponderal progênie (Lactação)

O desenvolvimento ponderal da progênie foi alterado pela administração do ORCD

366,89 mg/kg no período de desenvolvimento fetal, após observar a evolução durante o

período de lactação. Nota-se diferença estatística no dpn 14 e dpn 19, com valores médios de

massa corporal de 22,12 e 26,24 gramas (g), respectivamente, no grupo E3G2 comparado a,

19,61 e 21,26 g no E3G1 (Figura 5).

224


(E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal (lactação) da progênie de ratas tratadas no período

perinatal, correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E3G1)

foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi

aplicado Teste t não pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).

A transformação do embrião em feto é gradual. O desenvolvimento durante o período

fetal está basicamente relacionado com o rápido crescimento do corpo com a diferenciação

dos tecidos, órgãos e sistemas. O período de tratamento neste ensaio foi o de desenvolvimento

fetal. Nesta fase, o feto necessita de substratos para crescer e produzir energia. Gases e

nutrientes provenientes da mãe passam livremente pela membrana placentária e chegam ao

feto. Muitos fatores maternos, fetais e ambientais podem influenciar o crescimento pré-natal.

Sabe-se que a desnutrição materna grave resultante de dieta de má qualidade causa uma

redução do crescimento fetal.

Neste estudo, não houve diferença entre os grupos no 1º dpn pós-natal e a evolução

ponderal da progênie seguiu normalmente. É importante ressaltar que durante a evolução, a

progênie de ratas que receberam ORCD 366,89 mg/kg no período fetal, apresentaram maior

ganho de massa corporal. Por outro lado, Sachetti (2011) estudaram a embriotoxidade do

óleoresina de C. reticula e observaram alterações no desenvolvimento embriofetal, com

retardo do crescimento fetal da prole.

O crescimento e o desenvolvimento fetal são determinados, primariamente, tanto pelo

padrão genético do feto quanto pela sua capacidade em produzir seus próprios fatores de

crescimento, os quais influenciarão o crescimento e a diferenciação (VAN ASSCHE et al.,

2001). Entretanto, a regulação gênica do crescimento fetal é influenciada por diferentes

1 7 14 190

10

20

30E3G1

E3G2

a

a

Dia pós-natal (dpn)

Massa (

g)

225

fatores externos os quais podem exercer efeitos inibitórios ou estimulatórios. Além disso,

como o embrião dos mamíferos cresce e se desenvolve dentro do útero materno, o

crescimento fetal é dependente do status nutricional materno e da capacidade da placenta em

transferir adequadamente os nutrientes da mãe para o feto (HOLEMANS et al., 2003).

3.1.2.2 Desenvolvimento ponderal da progênie (pós-lactação) E3

O desenvolvimento ponderal da progênie de ratas tratadas com ORCD 366,89 mg/kg

no período fetal também foi afetado após o período de lactação, com diferenças estatísticas

significativas (Figura 6).


(E3G3), sobre o desenvolvimento ponderal (pós-lactação) da progênie de ratas tratadas no período

perinatal, correspondente ao período de desenvolvimento fetal (d16-d20). No grupo controle (E3G1)

foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M. Foi

aplicado Teste t não pareado (n= 5/grupo). a (p < 0,05).

3.1.2.3 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E3

O ORCD 366,89 mg/kg alterou o tempo de abertura do canal vaginal (p<0,05) (Tabela

2). Em seres humanos a diferenciação sexual do trato reprodutivo ocorre relativamente no

início da gestação (entre sete e quatorze semanas), e a maioria dos eventos de diferenciação

sexual do sistema nervoso central ocorre no período pré-natal. No rato a diferenciação sexual

do trato reprodutivo ocorre no final da gestação (após 15 dias) e a do sistema nervoso só se

24 49 59 740

50

100

150

200

250E3G1

E3G2

a

a

a

a


Mas

sa

(g

)

226

completa após o nascimento (GRAY et al., 2004). Hollenbach et al. (2010) avaliaram o

desenvolvimento pós-natal de duas preparações fitoterápicas contendo extrato de soja

(Glycine max, família Fabaceae). A descida dos testículos ocorreu entre o 15o e o 19

o dia de

vida em todos os animais, a separação prepucial entre o 34o

e o 39o

dia de vida e a abertura do

canal vaginal, entre o 30o e o 37

o dia de vida. Tanto nas características de desenvolvimento

geral quanto do desenvolvimento sexual não ocorreu diferença entre os grupos. No entato, a

análise do tempo de abertura do canal vaginal foi estatisticamente diferente entre os grupos

(E3G1 e E3G2).

Tabela 2. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento geral da progênie de

ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal (d16-d20).

E3G1 E3G2

Descolamentos dos pavilhões auriculares

(até o dpn 3)

100% 100%

Aparecimentos de penugem (até o dpn 5) 100% 100%

Erupção dos incisivos (até o dpn 9) 100% 100%

Aparecimentos de pêlos (até o dpn 8) 100% 100%

Abertura dos olhos (até o dpn 14)

(após o dpn 14)

46,87%

53,12%

38,7%

61,2%

Descendentes Machos

Descida bilateral dos testículos (até o dpn 17)

Separação prepucial completa (apartir do dpn 33)

100%

100%

100%

100%

Descendentes Fêmeas

Abertura do Canal Vaginal

(dpn35 ao dpn45)

(dpn46 ao dpn57)

91,67%

8,33%

6,67%a

93,33%a

O grupo controle (E3G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e o tratado recebeu ORCD 366,89 mg/kg

(E3G2). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste qui-quadrado. a (p < 0,05).

O ORCD 366,89 mg/kg adiou o aparecimento do 1º estro da progênie, pois a média de

chegada do 1º estro no grupo controle E3G1 foi de 46,66 ± 1,47 dpn comparado com a média

de 55,85 ± 1,60 do grupo E3G2. Não houve diferença estatatística em relação os intervalos

entre estros e a regularidade do ciclo (Tabela 3).

227

Tabela 3. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo estral, período de

15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal (d16-d20).

E3G1 E3G2

Intervalos entre estros (dias) 5.5 ± 1.65 5.4 ± 1.50

Dia do 1º estro (dpn) 46.66 ± 1.47 55.85 ± 1.60a

Ciclo regular ( %) 8.33 0.00


(E3G2) e ORCD 1874 mg/kg (E3G3). As variáveis com medidas ordinais foram aplicadas o teste t não pareado

e variáveis com percentual foram aplicadas qui-quadrado. a (p < 0,05).

A vagina responde morfologicamente e funcionalmente em resposta a flutuações nos

níveis de estrogênios. Assim, a abertura do canal vaginal e dados do ciclo estral podem ser

usados como indicadores de início da puberdade (MARTY; CRISSMAN; CARNEY, 1999).

O padrão de eventos do ciclo estral pode ser utilizado como indicador de normalidade das

funções ovarianas e neuroendócrinas reprodutivas em fêmeas não prenhas (US EPA, 1996). A

normalidade do ciclo estral pode ser acompanhada, observando as mudanças citológicas no

esfregaço vaginal. Neste estudo, a duração de cada fase do ciclo não foi diferente ao comparar

os grupos controle E3G1 e tratado E3G2 (Tabela 4).

Tabela 4. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase do ciclo estral,

período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de desenvolvimento fetal

(d16-d20).

Fases do Ciclo Estral E3G1 E3G2

Proestro 1.66 ± 0.18 1.40 ± 0.19

Estro 1.50 ± 0.26 1.46 ± 0.19

Metaestro 7.16 ± 0.51 7.13 ± 0.51

Diestro 4.66 ± 0.59 5.00 ± 0.62


(E3G2). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste t pareado. Os valores não diferiram entre si

ao nível de 5% (p>0,05)

No entanto, os tempos de duração de cada fase estavam alterados nos dois grupos

experimentais (E3G1 e E3G2). Dentro da normalidade, a duração de cada fase corresponde,

repectivamente, diestro (57 h), metaestro (21 h), estro (14 h) e proestro (12 h). Sabe-se que os

228

roedores são animais do tipo poliestro, ou seja, apresentam ciclos estrais regulares e

sucessivos, que duram de quatro a seis dias na rata, estando na dependência dos hormônios

sexuais (GOLDMAN; MURR; COOPER, 2007; GOPINATH, 2013). O controle da

luminosidade do ambiente é um fator importante, pois ciclos ovarianos consistentes ou

regulares podem ser detectados em roedores apenas quando abrigados sobre condições

regulares de luminosidade (COOPER; GOLDMAN; VANDENBERGH, 1993). Alterações

dos fotoperíodos padronizados, 12 ou 14 horas de exposição à luz comum, podem levar a

várias alterações dos ciclos, incluindo inibição da ovulação e manutenção dos esfregaços

vaginais persistentes em estro (BAIRD et al. 1999; GOPINATH, 2013). Neste estudo, embora

esteja alterado o tempo de duração de cada fase, os esfregaços não estavam persistentes em

estro, com diminuição do diestro e persistência em metaestro.

Stouffer et al. (2006) relatam que a formação do corpo lúteo ocorre no estro,

alcançando sua máxima dimensão no diestro, sendo mantido até o metaestro do ciclo seguinte.

No diestro do próximo ciclo, o corpo lúteo regride bruscamente devido à ausência do suporte

luteotrófico. Com isso, a secreção de progesterona declina durante o diestro e uma nova

ovulação ocorre posteriormente (GOPINATH, 2013). Assim, a fase luteal em ratas é atípica.

O corpo lúteo de ratas que não acasalaram secretam baixos níveis de progesterona por pouco

tempo (1-2 dias). Isto serve como base para o curto ciclo dos roedores.

3.1.2.3.1 Avaliação da atividade motora E3

No 75 dpn todos os filhotes foram avaliados quanto a atividade locomotora, com duas

categorias comportamentais. O ORCD na dose de 366,89 mg/kg foi capaz de elevar (p < 0,05)

tanto o número de quadrantes explorados (174,30 ± 6,21) como o “rearing” (45,53 ± 2,70),

que é o ato de permanecer sobre as duas patas traseiras para investigar o ambiente (locomoção

vertical) (Tabela 5).

Tabela 5. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a atividade motora da progênie

(F0) de ratas tratadas no período de pós-implantação (d16-d20).

E3G1 E3G2

Quadrantes 93,5 ± 8,74 174,30 ± 6,21a

Rearings 28,2 ± 3,70 45,53 ± 2,70a


(E2G2). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste t pareado. a (p<0,05)

229

Ribeiro et al. (2007) não detectaram alterações comportamentais ao óleoresina de

Copaifera spp. (doses crescentes de 50 a 800 mg/kg). Sachetti et al. (2009) estudaram o

potencial neurotóxico do óleoresina de C. reticulata em ratas Wistar nas doses de 300 e 2000

mg/kg p.c, administrados por via oral, não sendo detectado alteração neurocomportamental.

O ORCD 366,89 mg/kg aumentou a atividade motora da progênie exposta durante a

fase fetal. A função motora e o comportamento de animais expostos a agentes químicos no

período pré-natal são, rotineiramente, avaliados pelo teste de campo aberto. Desta forma a

locomoção caracteriza-se pelo nº de quadrantes explorados, que se for elevado indica efeito

estimulante. O esfeito sedativo pode ser observado quando houver diminuição do tempo de

parada ou “rearing”. Costa-Silva et al. (2006) em estudo com o óleo da Carapa guianensis

(andiroba), sugerem ação central, identificados com o aumento da atividade motora da prole

de ratas tratadas ( 375, 0,75 e 1,5 g/kg).


3.2.1 Toxidade aguda das lactantes E4

As lactantes tratadas com o ORCD apresentaram agitação (3/5) e estresse (1/5) após o

tratamento com as duas doses. No grupo E4G2 que recebeu a menor dose (366,89 mg/kg)

houve relatado piloereção (2/5) e no E4G3 sangramento nasal (1/5) ao receber a maior dose

(1874 mg/kg). Esses sinais clínicos foram detectados nos experimentos, E1 (pré-implantação),

E2 (pós-implantação) e E3 (desenvolvimento fetal). Contudo, estudo realizado por Ribeiro et

al. (2007) não corrobora com nossos achados. Não foi encontrado quaisquer alteração no

padrão de comportamento nos roedores expostos tanto a fração volátil como ao óleoresina de

copaíba (espécie não informada) em doses crescentes de 50 a 800 mg/kg pc.

3.2.1.1 Avaliação do ganho de massa corporal das lactantes E4

A massa corpórea das lactantes dos grupos tratados E4G2 e E4G3 não diferiu (p<0,05)

do grupo controle E4G1. Porém, houve diferença estatística significativa entre os dois grupos

tratados, e os valores variaram de 319 a 329 g no E4G2, enquanto que no E4G3 variou entre

254 a 277 g (Figura 7). A exposição ao ORCD durante a lactação não causou toxidade

materna nas lactantes, no entanto pode-se observar efeitos relacionados a dose administrada,

230

ente a maior e a menor. Sachetti et al. (2011) avaliaram a toxidade reprodutiva e a

embriofetotoxidade do óleoresina de C. reticulata, houve toxidade materna nas doses de 1000

e 1250 mg/kg, evidenciado pela redução de peso corpóreo e pela diminuição no consumo de

ração.


(E4G3), sobre a massa de ratas lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo

controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a média ±

E.P.M e resultados com p < 0,05 são indicados pelos índices a(em relação ao E4G1) e

b(E4G3 em

relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=

5/grupo).

3.2.1.2 Avaliação do consumo de água e ração das lactantes E4

A ingestão de água das lactantes não foi alterada pelo tratamento com ORCD nas

doses de 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg, pois os valores médios dos grupos tratados (E4G2 e

E4G3) foram muito próximo dos valores do grupo controle (E4G1). Não houve difereça

estatística significativa entre o grupo E4G3, tratado com a maior dose (50% da DL50), e

E4G2, tratado com a menor dose (10% da DL50) (Figura 8).

13 14 15 16 17 18 19200

250

300

350

400E4G1

E4G2

E4G3

b b b b bb

dia pós-natal (dpn)

Mas

sa

(g

)

231


(E4G3), sobre a ingestão de água de ratas lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No

grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a


b(E4G3

em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=

5/grupo).

A ingestão hídrica também não foi alterada nos experimentos anteriores (E1, E2 e E3),

sugerindo que o ORCD, nas doses administradas, não seja capaz de interferir neste parâmetro

em nenhum momento do ciclo reprodutivo de ratas. Com relação a ração, O ORCD na dose

de 1874 mg/kg foi capaz de alterar seu consumo de nos 15, 16 e 19 dpn. O gráfico demonstra

um comportamento semelhante entre os três grupos analisados, elevação do consumo de ração

no 18º dpn e decaindo no d19 dpn (Figura 9). Passos et al. (2000), afirmam que a nutrição

materna, durante a lactação, é um fator determinante na programação do peso da prole na

idade adulta.

13 14 15 16 17 18 190

50

100

150E4G1

E4G2

E4G3

b


Ág

ua (

mL

)

232

13 14 15 16 17 18 190

20

40

60

80E4G1

E4G2

E4G3

ba, b

a, b

ba, b


Ração

(g

)


(E4G3), sobre o consumo de ração de ratas lactantes, tratadas no final da lactação (dpn13-dpnd19). No

grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5 mL/animal). Os pontos representam a

média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são indidados pelos índices a(em relação ao E4G1) e

b(E4G3

em relação ao E4G2). Foi aplicado Análise de variância (ANOVA) seguido do teste de tukey (n=

5/grupo).

3.2.1.3 Avaliação dos parâmetros reprodutivos das lactantes E4

O ORCD nas doses utilizadas (1874 e 366,89 mg/kg) não causaram aumento do tempo

de prenhez, nem mesmo diminuição do índice de nascimento, de viabilidade e tamanho da

ninhada. Todavia o índice de desmame e a razão sexual diferiram (p<0,05) do grupo controle

E4G1 (Tabela 6). No experimento 3, em que a exposição ao ORCD ocorreu na fase de

desenvolvimento fetal houve diminuição significativa da viabilidade, diferentemente do

Experimento 4, não houve alteração na viabilidade dos filhotes até o dpn4. É importante

ressaltar que neste caso, do E4, o ORCD ainda não havia sido administrado, pois o período de

tratamento durante a lactação compreendeu do dpn 13 ao dpn 19, não podendo ser atribuído

ao ORCD, no entanto, nos perimite inferir ação do ORCD 366,89 mg/kg no período fetal.

233

Tabela 6. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros reprodutivos

maternos de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

E4G1 E4G2 E4G3

Mortalidade materna (n) 0 0 0

Tempo de Prenhez (dias) 22.2 ± 0.20 22.8 ± 0.20 22.4 ± 0.24

Índice de nascimento (%) 100 100 97.5 ± 2.50

Índice de viabilidade (%) 98.33 ± 1.66 100 96 ± 2.44

Índice de desmame (%) 98.33 ± 1.66 100a 83.14 ± 11.14

a

Tamanho da ninhada (n) 8.80 ± 0.86 7.40 ± 0.67 8.00 ± 0.94

Razão Sexual (M/F) 161.8 ± 22.91 215% ± 122.37a 69 ± 0.17.42

a


(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a média ± E.P.M. As variáveis indicadas como índices ou

percentuais foram aplicadas qui-quadrado e as variáveis com medidas ordinais foram aplicadas ANOVA,

seguido do teste de Tukey a (p < 0,05).

Em mamíferos, é indispensável o desempenho normal das funções maternas para a

saúde dos filhotes. Os cuidados parentais, em especial o maternal, são essenciais para a

sobrevivência e o desenvolvimento dos filhotes já que em várias espécies os filhotes são

imaturos ao nascimento (CASTRO; CHIORATO; PINTO, 2000). Com relação a diferença

encontrada no índice de desmame, não houve um padrão de dose-resposta, pois o grupo

tratado com 366,89 mg/kg (menor dose) o índice foi de 100% e na maior foi em média 83.14

± 11.14%. A diferença na razão sexual neste ensaio também não pode ser atribuída a

administração do ORCD, no entanto serve como parâmetro que pode ser comparado com

experimento 3 e inferir se há ou não determinados padrões de respostas de acordo com o sexo

do animal (toxidade pré-natal ou pós-natal).

Variações no tempo de gestação podem indicar alterações no processo de gestação ou

parto. Um prolongamento significante do tempo de gestação pode ser causado pela falha do

mecanismo de parturição e pode resultar em morte ou prejuízo da ninhada por distocia

(dificuldade de parir) (US EPA, 1996). Segundo Olson (2003), a parturição é composta por

cinco eventos fisiológicos integrados, os quais são: ruptura da membrana fetal, dilatação

cervical, contratilidade do miométrio, separação placental e involução uterina, sendo que as

prostaglandinas têm um papel central em cada um deles. Tanto no experimento 3 como no

experimento 4, não houve diferença entre os grupos em relação ao tempo de prenhez.

234

3.2.1.4 Análise dos parâmetros bioquímicos e hematológicos das lactantes E4

A dose de 1874 mg/kg de ORCD alterou a concentração de creatinina (3.10 ± 1.23).

Não houve diferença estatística, significativa, entre os grupos para os demais parâmetros

analisados (bilirrubina total e direta, colesterol total fosfatase alcalina, glicose, AST, ALT,

triglicerídeos e uréia) e os dados estão representados na Tabela 7.

Tabela 7. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros bioquímicos de

ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

E4G1 E4G2 E4G3

Bilirrubina total (mg/dL) 0.94 ± 0.09 1.02 ± 0.19 1.20 ± 0.17

Bilirrubina direta (mg/dL) 0.30 ± 0.05 0.49 ± 0.12 0.53 ± 0.08

Colesterol total (mg/dL) 72.40 ± 10.19 72.20 ±9.84 90.00 ± 26.21

Creatinina (mg/dL) 0.84 ± 0.09 1.36 ± 0.23 3.10 ± 1.23a

Uréia (mg/dL) 32.00 ± 6.39 43.00 ± 6.57 75.66 ± 28.76

FA (U/L) 99.40 ± 18.89 60.80 ± 5.63 69.33 ±7.83

Glicose (mg/dL) 143.80 ± 20.03 132.60 ± 23.79 112.00 ± 9.16

AST (U/L) 147.20 ± 19.77 197.40 ± 55.15 84.33 ± 33.93

ALT (U/L) 78.40 ± 8.13 77.00 ± 13.75 64.00 ± 9.60

Triglicerídeos (mg/dL) 155.20 ± 37.10 127.2 ± 22.76 125.66 ± 49.68

AST: aspartato aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase; FA: Fosfatase Alcalina. O grupo controle

(E4G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e os tratados receberam ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874

mg/kg (E2G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são representados pelos


b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado ANOVA, seguido do teste de

Tukey.

Os valores de referência hematológicos e bioquímicos em ratos não-tratados são dados

de grande valor como ponto de partida para diversos estudos, tais como as avaliações de

efeitos farmacológicos e toxicológicos sobre estes parâmetros (MELO et al. 2012). A

princípio, os valores descritos por Giknis e Clifford (2008), provenientes do Laboratório

Charles River, localizado em Montreal, Canadá, foram adotados como refência por utilizarem

ratas Wistar com idade acima de 17 semanas. Bilirrubina total (0.07 – 0.21 mg/dL),

Bilirrubina direta (0.03 – 0.07 mg/dL), colesterol total (23-97 ml/dL), creatinina (0.3 - 0.6

mg/dL), fosfatase alcalina (18-62 U/L), glicose (89 -163 mg/dL), AST (64 – 222 U/L), ALT

(14 – 64 U/L), triglicerídeos 39 - 130 (16-175 mg/dL) e Uréia (11.7 – 25 mg/dL)

235

No entanto, apesar da idade das ratas na referência de Giknis e Clifford (2008) estarem

em maior conformidade com este estudo, os valores de referência adotados por Melo et al.

(2012) também foram considerados por serem provenientes do biotério central de Sergipe,

Brasil, no entanto eram ratas mais jovens, com até 12 semanas de idade. Bilirrubina total

(0,07 – 0,09 mg/dL), Bilirrubina direta (0,01 – 0,03 mg/dL), colesterol total (46 – 101 ml/dL),

creatinina (0,4 - 0,7 mg/dL), fosfatase alcalina (63 – 138 U/L), glicose (61 – 147 mg/dL),

AST (83 – 184 U/L), ALT (26 – 60 U/L), triglicerídeos (39 – 130 mg/dL) e Uréia (30 – 57

mg/dL).

Os valores de bilirrubina total, fosfatase alcalina, ALT e uréia estiveram acima dos

valores de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008). Além dos parâmetros anteriormente

Bilirrubina direta, AST (E4G2) e triglicerídeos apresentaram valores médios elevados (MELO

et al. 2012). Segundo Melo et al. (2012), os animais experimentais não se comportam do

mesmo modo nas condições a que estão submetidos nos diferentes países onde são mantidos

em cativeiro, sendo também influenciados por vários fatores ecológicos característicos de

cada latitude geográfica do planeta.

O valor médio da creatinina no grupo E4G3, além de estatisticamente significativo,

esteve acima dos valores de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012).

Análise desse parâmetro bioquímico auxilia na avaliação sobre os potenciais efeitos do

ORCD sobre a filtração glomerular. Assim o aumento das concentrações séricas sugere uma

diminuição da função renal, todavia a creatinina é relativamente insensível aos índices de

filtração glomerular, sendo necessária uma diminuição de 50 – 70% da mesma para que se

note um aumento da creatinina no soro. O aumento deste metabólito no soro não reflete

necessariamente uma lesão renal induzida por um composto químico, mas podem ser

secundários a desidratação, hipovalemia ou catabolismo de proteínas. No presente estudo, a

hipótese de desidratação pode ser descartada, pois não houve diferença quanto à ingestão

hídrica neste grupo.

A uréia no E4G3 apresentou valores elevados, embora sem diferença estatística, os

valores de todos médios em todos os grupos (E4G1, E4G2 e E4G3) estiveram acima dos

valores de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012). A diminuição da

filtração glomerular, de forma geral, leva ao aumento das concentrações plasmáticas de

creatinina e uréia. Em ratos, níveis plasmáticos alterados para uréia não são bons indicadores

de lesão renal, mas alterações na creatinina podem ser um indicador confiável para avaliar a

236

presença da lesão, pois seu nível sérico não é influenciado pela dieta, idade ou sexo (MOTA,

2003).

Uma alteração significativa nos níveis de uréia sérica poderia ser interpretada como

uma alteração renal, porém os valores observados em todos os grupos estaão alterados, fora

do padrão considerado para a espécie (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012;

SILVA et al. 2005). Alterações da função hepática podem ser detectadas por pela dosagem

sérica de AST e ALT. Essas enzimas estão presentes em altas concentrações no músculo,

fígado e cérebro, e a elevação da sua atividade no sangue pode indicar necrose ou moléstia

especialmente nesses tecidos (MESSIAS et al., 2009).

A análise dos parâmetros hematológicos das ratas lactantes revelou diferenças,

estatísticas significativas, entre os grupos controle E4G1 e tratados E4G2 e E4G3. O ORCD

foi capaz de alterar os valores médios da hemoglobina (15.44 ± 0.29 e 15.96 ± 0.76) e do

hematócrito (48.02 ± 0.84 e 51.06 ± 2.21) nas duas doses administradas, 366,89 mg/kg e 1874

mg/kg, respectivamente. Assim, o ORCD, nas doses administradas melhoraram a função

dessas células. Alterações no volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular

média (HCM) e volume de plaquetas foi observado no grupo que recebeu 366,89 mg/kg de

ORCD (E4G2). No grupo E4G3 as alterações observadas foram: o volume de plaquetas,

plaquetócrito, amplitude de distribuição das plaquetas com base no tamanho (MPV) e volume

plaquetário médio (MPV). Diferenças estatísticas importantes foram encontradas entre grupos

tratados, E4G2 e E4G3, respectivamente, no VCM (61.8± 0.86 e 57.00 ± 1.52), HCM (19.9 ±

0.3 e 17.80 ± 0.61), plaquetas (873.4 ± 43.94 e 1093.66 ± 56.13), amplitude de distribuição

das plaquetas com base no tamanho (PDW) (9.66 ± 0.39 e 7.8 ± 0.20) e plaquetócrito (554.2

± 26.67 e 654 ± 30.56) (Tabela 8).

O hemograma é um exame importante que indica o estado fisiológico e patológico dos

homens e animais. A ingestão de substâncias tóxicas, inclusive plantas e outros produtos

naturais, podem alterar as das células sanguíneas (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008).

Baixas concentrações de hemoglobina, hemácias e hematócrito podem indicar anemia,

hemorragia recente ou retenção de líquido, causado hemodiluição (ODUOLA et al., 2007). Já

uma contagem diminuída de plaquetas (trombocitopenia) pode resultar de uma série de

situações patológicas, como a destruição aumentada dessas células, devido ao uso de certas

drogas, a desordens imunes, a coagulação vascular disseminada e até lesões mecânicas. Os

leucócitos são as principais células sanguíneas envolvidas na resposta inflamatória, embora

237

plaquetas e eritrócitos também participem. Os leucócitos são classificados em neutrófilos

(40%-75%), linfócitos (20%-50%), monócitos (2%-10%), eosinófilos (1%-6%) e basófilos

(<1%). Destes, os neutrófilos são os mais importantes na patogênese da inflamação. São as

células predominantes nas primeiras 6 a 24 horas nas inflamações agudas (GOURLAY;

ASIMAKOPOULOS; TAYLOR, 2002).

Tabela 8. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os parâmetros hematológicos de ratas


Grupos E4G1 E4G2 E4G3

Hm (x106/mm

3) 7.09 ± 0.37 7.76 ± 0.06 7.96 ± 1.01

Hb (g/dL) 12.42 ± 0.69 15.44 ± 0.29a 15.96 ± 0.76

a

Ht (%) 39.34 ± 2.08 48.02 ± 0.84a 51.06 ± 2.21

a

VCM (fl) 55.72 ± 0.56 61.8± 0.86a

57.00 ± 1.52b

HCM (pg) 17.52 ± 0.35 19.9 ± 0.3a 17.80 ± 0.61

b

CHCM (g/dL) 31.59 ± 0.39 32.18 ± 0.30 31.26 ± 0.12

RDW (%) 16.4 ± 0.18 16.9 ± 0.49 17.6 ± 0.55

Leucócitos (x103/mm

3) 4.46 ± 0.96 8.42 ± 0.63 7.46 ± 3.48

Linfócitos (%) 85.4 ± 3.40 84.7 ± 4.98 75.23 ± 2.19

Monócitos (%) 9.22 ± 3.29 11.36 ± 3.05 18.6 ± 2.30

Granulócitos (%) 5.38± 2.55 3.94 ± 2.13 6.16 ± 0.31

Plaquetas (x103/mm

3) 604.6 ± 55.18

873.4 ± 43.94

a 1093.66 ± 56.13

a,b

MPV fL(µm3) 6.46 ± 0.14 6.34 ± 0.02 5.96 ± 0.12 a

PDW (%) 9.78 ± 0.39 9.66 ± 0.39 7.8 ± 0.20 a,b

Pct (%) 371 ± 38.48 554.2 ± 26.67a

654 ± 30.56a

Hm: Hemácias; Hb: Hemoglobina; Ht: Hematócrito, VCM: Volume Corpuscular Médio, HCM: Hemoglobina

Corpuscular Média, CHCM: Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média, RDW: Distribuição do diâmetro

dos eritrócitos, Pct: plaquetócrito, PDW: amplitude de distribuição das plaquetas com base no tamanho e MPV:

volume plaquetário médio. O grupo controle (E4G1) recebeu água destilada (0,5 mL/animal) e os tratados

receberam ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e

resultados com p < 0,05 são representados pelos índices a(em relação ao E4G1) e

b(E4G3 em relação ao E4G2).

Foi aplicado ANOVA, seguido do teste de Tukey.

O valores de referência usados neste estudo foram, MPV (6.4-9.5 fL(µm3)), plaquetas

(599-1144 x103/mm

3 ), RDW (10,6-14,6 %), CHCM (33,2- 37,8 g/dL), CHM (17,6-20,3 pg),

hematócrito (38,5 – 49,2 %), hemoglobina (13,7 -17,2 g/dL), hemácias (7,16- 9,24

x106/mm

3), leucócitos (0,96-7,88 x10

3/mm

3), VCM (50,3- 57 fl), linfócitos (48,9-88,11 %) e

238

monócitos (1- 3,6%) (GIKNIS; CLIFFORD, 2008). De maneira semelhantes aos parâmetros

bioquímicos, levou-se em considerações outros valores de referência, MPV (6,8 – 8,0

fL(µm3)), plaquetas (757 – 1476 x103/mm

3 ), RDW (12,7 – 18,2 %), CHCM (29,9 – 34,9

g/dL), CHM (16,6 – 18,9 pg), hematócrito (39,1 – 48,5 %), hemoglobina (13,2 – 15,1 g/dL),

hemácias (7,3 – 8,64 x106/mm

3), leucócitos (4,7 – 12,98 x10

3/mm

3), VCM (49,1 – 62,5 fl),

linfócitos (57,9 – 90,0 %) e monócitos (0,6 – 7,9 %) (MELO et al. 2012)

O estudo hematológico demonstrou que o valor médio da hemoglobina foi menor no

grupo controle (E4G1), inclusive com diferença estatística. A hemoglobina baixa no sangue

indica presença de anemia e pode ser causada por perda de sangue, falta de vitaminas ou

destruição dos glóbulos vermelhos. O hematócrito avalia a percentagem das hemácias no

volume total de sangue (ODUOLA et al., 2007). No grupo E4G1, o hematócrito (39.34 ±

2.08), embora estatisticamente significativo dos demais grupos, esteve dentro dos intervalos

de referência (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et al. 2012). O hematócrito, hemoglobina

e contagem de eritrócitos são usados para avaliar o grau de anemia (ODUOLA et al., 2007).

Os índices hematimétricos (VCM, HCM e CHCM) determinam se os eritrócitos são,

em média, normocíticos, macrocíticos, microcíticos ou se são hipocrômicos. A avaliação

destes parâmetros no presente estudo revela que, embora estatisticamente diferente do grupo

controle, estes estiveram dos limites de normalidade (GIKNIS; CLIFFORD, 2008; MELO et

al. 2012).

3.2.1.5 Análise histopatológica das lactantes E4

Não foi encontrada diferença estatística no peso dos órgãos de ratas lactantes tratadas

com ORCD nas doses de 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3) em relação ao grupo

controle (E4G1). O peso do coração do grupo E4G3 (0.86 ± 0.10) diferiu (p<0,05) do grupo

E4G2 (1.11 ± 0.04). Com relação ao peso das lactantes no 19º dpn, houve difereças

estatísticas significativas em relação aos grupos controle e grupos tratados com ORCD

(Tabela 9).

A análise do peso corpóreo avalia os possíveis efeitos tóxicos no organismo como um

todo. No entanto, o peso dos órgãos e suas observações macro e microscópicas são utilizadas

para avaliar efeitos tóxicos específicos em algum sistema ou órgão específico (MANSON;

KANG, 1994). A avaliação das massas absolutas dos órgãos não reprodutivos é importante,

pois o fígado e os rins são responsáveis pelo metabolismo e eliminação de substâncias e, em

239

casos de intoxicação, podem ter a massa aumentada ou diminuída (MELLO, 2007). Neste

estudo, a análise macroscópica dos órgãos (fígado e rins) demonstrou pouca variação de

tamanho e de cor entre as peças examinadas, apresentamdo-se com formato e volumes

habituais, superfície externa lisa, brilhante, sem macro ou micronodulações, até mesmo na

superfície de corte.

De maneira semelhante, Sachetti et al. (2009) também não encontraram alterações

macroscópicas de diversos órgãos analisados macroscopicamente (pulmões, traquéia, coração,

estômago, fígado, baço, e rins) após 14 dias de tratamento com óleresina de C. reticulata em

ratas prenhas.

Tabela 9. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre os órgãos de ratas tratadas no período de

lactação (dpn13-dpn19).

E4G1 E4G2 E4G3

Baço 0.65 ± 0.03 0.70 ± 0.04 0.51 ± 0.05

Coração 0.96 ± 0.03 1.11 ± 0.04 0.86 ± 0.10b

Fígado 14.04 ± 2.18 11.33 ± 0.94 10.40 ± 0.93

Pulmão 1.34 ± 0.08 1.49± 0.03 1.26 ± 0.02

Rins 1.96 ± 0.07 1.99 ± 0.11 1.77 ± 0.12

Peso das lactantes (dpn19) 297.40 ± 6.00 293.40± 10.41

224.00 ± 6.11a,b


(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são

representados pelos índices a(em relação ao E4G1) e

b(E4G3 em relação ao E4G2). Foi aplicado ANOVA,

seguido do teste de Tukey.

O exame histopatológico dos rins de todos os animais, tanto do grupo controle (E4G1)

como dos tratados (E4G2 e E4G3) apresentaram integridade tecidual, conforme demonstrado

nas figuras 10, 11 e 12. Em contraste, análise do corte histológico do fígado demonstrou

algumas alterações importantes, como microvacuolizações, contudo, este achado não esteve

associado ao ORCD, pois o fígado de ratas do grupo contole (E4G1) também apresentarm

essas alterações no citoplasma do hepatócito (Figura 13). No entanto, um fígado do E4G2

(366,89 mg/kg) apresentou microvacuolização intensa, com presença de colestase extra-

hepática (Figura 14), tendo sido observada necrose focal (1 foco) em região centrolobular

com afluxo de elementos inflamatórios (Figura 15).

240

Figura 10. Aspecto microscópico de rin (corte longitudinal) de rata lactante que recebeu água

destilada (5mL) do dpn 13 - dpn 19 (E4G1). A. Região cortical - glomérulos renais e cápsulas

Bawman, sem alteração tecidual e túbulos contorcidos proximais íntegros. B. Região cortical - células

sem alterações citoplasmáticas e nucleares (ponta da seta). C. Região glomerular, sem alterações

tecidual (HE, 20x).

241

Figura 11. Aspecto microscópico de rin (corte transversal) de rata lactante que recebeu ORCD

(366,89 mg/kg) do dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região cortical – ducto coletor cortical evidenciando

núcleos e citoplasmas íntegros (ponta da seta) B. Região cortical evidenciando glomérulo e capsula de

Bowman sem alteração tecidual (ponta da seta) (HE, 40x).

242

Figura 12. Aspecto microscópico de rin de rata lactante que recebeu ORCD (1874 mg/kg) do dpn 13

- dpn 19 (E4G3). A. Região cortical com ductos proximais evidenciando a presença de células

cubóides simples íntegras com núcleos e citoplasma íntegros (ponta da seta - HE, 40x). B. Região

medular – ductos longitudinais com células íntegras (ponta da seta - HE, 20x). C. Presença de dois

glomérulos integros e capsula bawman sem alterações (ponta da seta - HE, 20x).

243

Figura 13. Aspecto microscópico do fígado de rata lactante que recebeu ORCD (366,89 mg/kg) do

dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Hepatócitos normais sem grandes alterações celulares (ponta da seta) (HE,

20x). B. Hepatócitos com microvacuolização citoplasmática intensa (ponta da seta) (HE, 20x). C.

Hepatócitos com microvacuolização citoplasmática intensa (HE, 40x).

244


dpn 13 - dpn 19 (E4G2). Colestase extra-hepática (ponta da seta - HE, 20x).

O betahidroxibutirato é um corpo cetônico e a produção destes metabólitos acentua-se

na fase final da gestação devido à diminuição consumo de alimentos (HARMEYER;

SCHULUMBOHM, 2006). Desta forma, a colestase hepática detectada somente em uma rata

do grupo E4G2, tratado com a menor dose (366,89 mg/kg) pode ser pontual, pois não foi

observado efeito da dose e número significativo de animais afetados.

Por outro lado, sabe-se que óleoresinas de Copaifera spp. são ricas em diterpenos que

os designa característica apolar. Esses compostos, ao serem metabolizados no fígado

aumentam atividade enzimática do citocromo P-450 (Cyp-450), ao ponto de lesar os

hepatócitos. Diterpenos do tipo neo-clerodano, transformados pelo citocromo P-450 em

metabólitos hepatotóxicos, que apresentavam subunidade epóxido desencadeou casos de

hepatite tóxica na França pelo uso de capsulas de têucrio (Teucrium chamaedrys L. –

Labiateae) (LOEPER et al., 1994). Estudos farmacológicos mostraram que os diterpenóides

furânicos (muitos estão presentes entre os clerodanos) causam apoptose dentro de 2 h em

hepatócitos de ratos (FAU et al. 1997). Assim, estudos adicionais devem ser realizados, para

melhor definir esses efeitos. podem aumentar a exposição do lactente, pela elevação dos

níveis plasmáticos e aumento do tempo em que a droga permanece na circulação (SOUZA,

2007)

245

Sachetti et al. (2011) encontraram uma discreta degeneração hidrópica, caracterizada

pelo acúmulo de água no citoplasma, em todos os grupos experimentais (controles e

Tratados), não sendo associada ao tratamento com óleoresina de C. reticulata. Esse estudo

corrobora com os nossos resultados, pois a microvacuolização citoplasmática encontrada é

decorrente da retenção hídrica (edema), que caracteriza a degeneração hidrópica


dpn 13 - dpn 19 (E4G2). A. Região centrolobular normal (ponta da seta - HE, 20x). B. Necrose focal

em região centrolobular (ponta da seta - HE, 10x).

As dosagens bioquímicas, principalmente das enzimas AST, ALT e bilirrubina, são

relevantes para investigar a função hepática. No entanro, para Borges (2001), o termo lesão

hepática deve ser usado somente após estudo histológico do fígado; a lesão será então

246

denominada de acordo com os achados histológicos. Assim, o fígado é um dos maiores órgãos

do corpo situado na cavidade abdominal que desempenha muitas e importantes funções como:

metabólicas, excretoras e secretoras, de armazenamento, de proteção, de circulação e de

coagulação sanguínea (MOTTA, 2003).

Estes achados incluem alterações, encontradas nos hepatócitos, como deposição de

gordura, pigmentação, amiloidose e degenerações. A tumefação celular é uma das principais

alterações microscópicas identificáveis após uma lesão de grau leve. Além disso, pode ocorrer

a degeneração gordurosa, que é considerada a manifestação mais importante de doença

hepática tóxica, fibrose e hiperplasia biliar (MACLACHLAN; CULLEN, 1998).

Colestase é definida como toda alteração fisiopatológica caracterizada pela diminuição

ou ausência de fluxo biliar no duodeno (ERLINGER, 1999). No final da prenhez e durante a

lactação há uma diminuição da demanda de glicose e aminoácidos e, consequentemente,

aumento o metabolismo dos lipídios. Segundo Marques e Rademarcher (1999) concentrações

plasmáticas aumentadas de ácidos graxos não insaturados e betahidroxibutirato estão

associados ao acúmulo de triglicerídeos no fígado, que aumentam a incidência de colestase no

início da lactação.

3.2.2 Toxidade aguda nos lactentes E4

3.2.2.1 Sinais clínicos de toxidade aguda E4

O único sinal clínico de toxidade aguda observada entre os lactentes foi fraqueza

(E4G3), ou seja, que as progenitoras receberam a maior dose (1874 mg/kg) de ORCD, porém

este sinal somente foi observado após o desmame em alguns animais do grupo. Segundo Hale

(2004) nos primeiros dias da lactação, os fármacos transferem-se mais facilmente para o leite

materno, pois as células alveolares são menores e o espaço intercelular torna-se mais largo. A

via pela qual o medicamento é administrado à mãe tem importância pelos níveis alcançados

no plasma materno e, posteriormente no leite humano. Dessa forma, muitos fármacos

administrados topicamente ou inalados não atingem níveis plasmáticos significativos,

possuindo níveis lácteos não mensuráveis (CHAVES; LAMOUNIER, 2004).

O leite é composto por três frações (aquosa, lipídica e protéica), sendo que os

fármacos e seus respectivos metabólitos podem estar presentes em quaisquer destas porções,

247

devido às características físico-químicas Souza et al. (2007). Conforme Anderson (2005) a

excreção dos fármacos para o leite materno depende de algumas características (peso

molecular; lipossolubilidade; capacidade de ligação às proteínas; grau de ionização; meia-vida

de eliminação; biodisponibilidade e concentração plasmática materna). Sua passagem entre o

plasma e o leite é bidirecional. No presente estudo, os sinais clínicos de toxidade observados

pode caracterizar uma evidencia, indireta, quanto a presença de metabólitos nos lactentes. No

entanto, estudo bromatológico deve ser realizado para confirmar ou descartar a presença ou

não de metabólitos no leite materno de ratas tratadas com ORCD.

3.2.2.2 Desenvolvimento ponderal dos lactentes durante a lactação (tratamento) E4

A evolução ponderal dos lactentes do grupo E4G3 foi estatisticamente diferente dos

grupos controle E4G1 e tratado (366,89 mg/kg) E4G2 entre os 7º dpn e o 19º dpn. Os valores

médios, da massa corporal, foram maiores no grupo tratado (1874 mg/kg) E4G3 e estão

representados no gráfico (Figura 16).


(E4G3), sobre a massa corporal da progênie (período de lactação), de ratas lactantes tratadas no final

da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5

mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são representados

pelos índices a(em relação ao E2G1),



1 7 14 190

10

20

30

40

50E4G1

E4G2

E4G3

a

a,b

a,b

a,b

a


a

Massa

(g)

248

A dieta materna durante os períodos críticos de desenvolvimento exerce um papel

importante na regulação da homeostase dos descendentes e pode trazer consequências até a

vida adulta (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). Neste estudo, apesar da diminuição do

consumo de ração, pelas lactantes ser significativo no grupo E4G3 (1874 mg/kg), no período

de tratamento (dpn 13-19), a massa corporal dos lactentes não diminui, com evolução

ponderal normal e massa corporal maior neste grupo.

3.2.2.3 Desenvolvimento ponderal dos descendentes após lactação (pós-tratamento) E4

A evolução ponderal dos filhotes após a lactação seguiu normalmente, ao usar como

parâmetro o período antecedente (lactação). Contudo, entre o dpn 59 e dpn 74 a evolução de

massa corpórea dos descendentes do E4G3 (17.84 g) foi menor (p<0,05) em relação ao grupo

E4G2 (42.36 g) (Figura 17).


(E4G3), sobre a massa corporal da progênie (período de pós-lactação), de ratas lactantes tratadas no

final da lactação (dpn13-dpnd19). No grupo controle (E4G1) foi administrada água destilada (0,5

mL/animal). Os pontos representam a média ± E.P.M e resultados com p < 0,05 são representados

pelos índices a(em relação ao E4G1) e



Passos et al. (2001) demonstrou que filhotes de ratas lactantes submetidas à

desnutrição protéica ou energética apresentam, na vida adulta, uma alteração no

comportamento alimentar diferente em resposta ao tipo de desnutrição sofrida na lactação,

provavelmente devido à composição do leite das mães. Alguns estudos demonstraram que a

restrição protéica em ratas lactantes pode levar a alterações metabólicas e fisiológicas na prole

24 49 59 740

50

100

150

200

250E4G1

E4G2

E4G3

a,b

a,b

a,bb


Massa

(g)

249

que podem ser permanentes, mesmo que o animal tenha livre acesso à ração normal após o

desmame (RAMOS et al., 1997; PASSOS et al., 2000). Estes estudos reforçam o conceito de

“imprinting metabólico” (WATERLAND; GARZA, 1999) que se traduz por uma alteração

permanente de uma determinada função, conseqüente à algum evento ocorrido em um período

crítico nos primeiros dias de vida.

3.2.2.4 Desenvolvimento geral e sexual da progênie E4

O desenvolvimento geral da progênie de ratas tratadas, no período de lactação, com

ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg) não apresentaram diferenças em relação ao controle

E4G1 ao analisar os seguintes parâmetros: aparecimento de penugem, erupção dos incisivos,

aparecimento de pêlos e, nos descendentes machos, descida bilateral dos testículos e

separação prepucial). O ORCD provocou diminuição do tempo de descolamento dos

pavilhões auriculares (Figura 18), abertura dos olhos (Figura 19) e abertura do canal vaginal

das descendentes fêmeas (Tabela 10).

Figura 18. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3)

sobre o descolamento do pavilhão auricular de lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Pavilhão auricular antes

do descolamento (B) Pavilhão auricular após descolamento (ponta da seta).

A B

250

Figura 19. Efeito do tratamento por via oral com ORCD 366,89 mg/kg (E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3)

sobre a abertura palpebral ocular bilateral de lactentes (dpn 13-dpn19). (A) Palpebras antes da abertura

(B) Palpebras após a abertura (ponta da seta).

Tabela 10. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre o desenvolvimento geral da progênie

de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

E4G1 E4G2 E4G3

Descolamentos dos pavilhões auriculares

(Até o dpn 3)

(Após o dpn 3)

64.28%

35.71%

100% a

-

75.67% a

24.32% a

Aparecimentos de penugem (até o dpn 5) 100% 100% 100%

Erupção dos incisivos (até o dpn 9) 100% 100% 100%

Aparecimentos de pêlos (até o dpn 8) 100% 100% 100%

Abertura dos olhos (até o dpn 14)

(após o dpn 14)

46.51%

53.49%

78.37% a

21.63% a

100% a

-

Descendentes Machos

Descida bilateral dos testículos (até o dpn 17)

Separação prepucial completa (a partir do dpn 33)

100%

100%

100%

100%

100%

100%

Descendentes Fêmeas

Abertura do canal vaginal

(dpn33 ao dpn 45)

(dpn46 ao dpn 57)

46.67%

53.33

94.11% a

5.89%

95.00% a

5.00%


(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado o teste qui-quadrado. a (p <

0,05).

A B

251

O tempo normal para o início da abertura do canal vaginal se inicia no dpn 30,

contudo, nesse experimento, a abertura se deu a partir do dpn 33, tanto no experimento 3

como no experimento 4. No entato, no E4 a abertura iniciou mais cedo nos grupos tratados

(E4G2 e E4G3). Compostos antiestrogênicos podem promover um retardo no período de

abertura do canal vaginal e alterar a regularidade do ciclo estral (MARTY, CRISSMAN;

CARNEY, 1999). Semelhantemente, Muller (2007) estudou o extrato da M. citrifolia e,

apesar de encontrar toxidade no desenvolvimento pré-natal, a exposição in utero e lactação ao

extrato não provocou efeitos adversos sobre o desenvolvimento geral dos descendentes

(massa ao nascimento, período para o descolamento dos pavilhões auriculares abertura dos

olhos, aparecimento de pêlos e índice de viabilidade até o 4º dia pósnatal) dos grupos tratados

quando comparados com o grupo controle.

O ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg) diminuiu, respectivamente, o dia do 1º estro

(40.92 ± 1.97 e 42.5 ±1.14). Contudo, é importante ressaltar que o ORCD, nas doses

administradas, não foi capaz de alterar o tempo de intervalos entre estros e regularidade do

ciclo (Tabela 11).

Tabela 11. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a regulação do ciclo estral, período de

15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

E4G1 E4G2 E4G3

Intervalos entre estros (dias) 5.5 ± 0.58 5.54 ± 0.77 6.53 ± 0.65

Dia do 1º estro (dpn) 50.78 ± 1.12 40.92 ± 1.97a 42.5 ±1.14

a

Ciclo regular (n) 13.33% 5.55% 5.0%


(E4G2) e ORCD 1874 mg/kg (E4G3). As variáveis com medidas ordinais foram aplicadas ANOVA, seguido do

teste de Tukey, e variáveis com percentual foi alicado o qui-quadrado. a (p < 0,05).

A duração de cada fase do ciclo estral das descendentes fêmeas não foi alterada pela

ingestão de leite materno de lactantes exposta ao ORCD (366,89 mg/kg e 1874 mg/kg). Os

valores médios de cada fase e o erro padão da média da estão representados na Tabela 12.

252

Tabela 12. Efeito do tratamento por via oral com ORCD sobre a duração de cada fase do ciclo estral,

período de 15 dias, das descendentes fêmeas (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-

dpn14).

E4G1 E4G2 E4G3

Proestro 1.06 ± 0.20 0.88 ± 0.16

1.1 ± 0.19

Estro 2.33 ± 0.33 1.94 ± 0.29

2.5 ± 0.21

Metaestro 7.06 ± 0.26 7.76 ± 0.44 6.85 ± 0.40

Diestro 4.6 ± 0.48 4.41 ± 0.45 4.55 ± 0.35


(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M. Foi aplicado ANOVA, seguido do este

de Tukey. Os valores não diferiram entre si ao nível de 5% (p>0,05).

Segundo Goldman et al. (2007), durante o ciclo estral da rata, três ou mais gerações de

corpo lúteo podem estar presentes no ovário provenientes dos vários ciclos ovulatórios destes

animais. A pineal, sincronizada pelo ciclo claro/escuro, determina as mudanças periódicas na

função reprodutiva em várias espécies animais (REITER, 1993; WEAVER et al., 1993;

TEIXEIRA et al., 2002). Exposições no período de desenvolvimento a compostos capazes de

desregular o sistema endócrino podem causar efeitos imediatos por interferir com a

diferenciação normal, assim como podem provocar efeitos latentes que são revelados

posteriormente em resposta a hormônios endógenos na maturidade (SILBERGELD, FLAWS;

BROWN, 2005).

3.2.2.4.1 Avaliação da atividade motora E4

Os descendentes (E4G2 e E4G3) que receberam leite materno, de ratas lactantes

expostas ao ORCD (366,89 mg e 1874 mg/kg), entre o 13º e 19º dpn tiveram sua atividade

exploratória diminuída (p< 0,05), com valores médios e EPM, respectivamente, 118.91± 5.82

e 122.51± 4.89 em relação a E4G1 (143.71 ± 5.47) (Tabela 13).

253


progênie (F0) de ratas tratadas no período de lactação (dpn13-dpn19).

E4G1 E4G2 E4G3

Quadrantes 143.71 ± 5.47 118.91± 5.82a 122.51± 4.89

a

Rearings 47.34 ± 2.01 47.62±2.64 48.48 ± 1.71


(E4G2) e 1874 mg/kg (E4G3). Os dados representam a Média ± E.P.M. a(p< 0,05). Foi aplicado ANOVA,

seguido do teste de Tukey.

O teste de campo aberto tem sido amplamente utilizado para quantificar movimentos

locomotores e de exploração dos animais de laboratório em experimentos com roedores

(EILAN, 2003). De maneira diferente ao experimento 3, o ORCD (366,89 e 1874 mg/kg),

provavelmente, diminuição da atividade motora dos lactentes expostos durante a lactação. É

importante ressaltar a diferença entre humanos e roedores em relação ao SNC. No homem

alterações no sistema nervoso central ocorrem no desenvolvimento pré-natal e em roedores

após o nascimento (SMART; DOBBING, 1974).

254

4 CONCLUSÃO

O tratamento com ORCD nas doses 366,89 mg/kg (10% da DL50) e 1874 mg/kg (50%

da DL50) no período pré-natal (desenvolvimento fetal) e pós-natal (lactação) nos permite

concluir que:

No período pré-natal (desenvolvimento fetal):

A dose 366,89 mg/kg não provoca toxidade materna sistêmica, somente sinais

clínicos;

A dose 1874 mg/kg provoca toxidade sistêmica materna elevada, com óbito de 100%;

A dose 366,89 mg/kg alteraram alguns parâmetros reprodutivos (viabilidade e

desmame);

A dose 366,89 mg/kg não altera o desenvolvimento ponderal e geral da progênie;

A dose 366,89 mg/kg altera (diminui) o desenvolvimento sexual da fêmea;

A dose 366,89 mg/kg altera (aumenta) a atividade motora da progênie exposta;

No período pós-natal (lactação):

A dose 366,89 mg/kg provocou toxidade aguda com sinais clínicos;

A dose 1874 mg/kg provoca toxidade materna sistêmica;

A dose 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não alterou os parâmetros reprodutivos;

A dose de 1874 mg/kg elevou os níveis de creatinina no plasma, mas não causou lesão

renal;

As doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg aumentou a produção de hemácias;

As doses de 1874 mg/kg e 366,89 mg/kg não causaram lesão hepática;

As alterações nas células hepáticas foram compatíveis com a própria condição materna

(ratas puerpéricas);

A dose de 1874 mg/kg provocou toxidade aguda nos lactentes;

255

A dose de 1874 mg/kg aumentou a massa corporal dos filhotes;

As doses de 1874 mg/kg e 366,89 mg/kg alteraram (aumento) do desenvolvimento

geral e sexual da progênie;

A dose de 1874 mg/kg altera (diminui) a atividade motora dos lactentes;

Necessidade de estudo bromatológico do leite e toxicocinética;

256

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estudo de produtos naturais como fonte de medicamentos é uma tarefa extremante

árdua. Pois as agências reguladoras introduzem novas exigências de forma que possam

qualificar melhor o emprego desses produtos. No que tange os recursos da biodiversidade

vegetal da região Amazônica, estes representam grande alternativa para a descoberta e

introdução de novos fármacos na terapêutica. Sendo assim, o óleoresina de C. duckei aqui

estudado, representa não somente uma alternativa, mas um patrimônio farmacêutico do povo

amazônida, pelo seu emprego centenário sobre diversas patologias regionais e de ocorrência

no território brasileiro. A eficácia desse produto já está bem estabelecida pelo seu uso

tradicional, tornando-se uma ferramenta facilitadora do processo de chegada de um novo

produto (medicamento fitoterápico) ao mercado farmacêutico. Isto porque todo medicamento

deve atender a tríade (eficácia, qualidade e segurança).

Estudo dessa magnitude, envolvendo não somente os aspectos fitoquímicos (busca

de um marcador), também os aspectos toxicológicos (subcrônico e reprodutivo) fazem parte

da tríade do medicamento, que garantem a qualidade e a segurança do medicamento,

respectivamente. Este é um estudo pioneiro e até o presente, não existem na literatura dados

sobre a toxidade reprodutiva do óleoresina de C. duckei e toxidade subcrônica do creme

vaginal contendo este óleoresina. Em geral, os resultados obtidos nas diversas análises e

experimentos foram satisfatórios e de grande relevância para que esse produto amazônida

possa chegar ao mercado.

Assim, quanto à análise fitoquímica, sugere-se a utilização da técnica de esterificação

H&L em CG-EM, utilizando-se como marcador fitoquímico/farmacológico, o β-cariofileno.

Este fato deve-se a disponibilidade comercialmente, e por ser utilizado como padrão em

diversos trabalhos de quantificação de óleoresinas de diversas espécies de Copaifera. Em

relação ao tratamento subcrônico, o óleoresina de C. duckei (320 mg/kg) não provocou

toxidade sistêmica (machos e fêmeas) pelos parâmetros avaliados (massa corporal, consumo

de água e ração, dosagens bioquímicas e hematológicas). O creme vaginal contendo

óleoresina 2,5% (28 mg/kg) e o óleoresina (i.v) (40 mg/kg) não causaram toxidade sistêmica,

sugerindo apenas ação local, sugerindo-se segurança de uso do óleoresina de C. duckei, na

vias de administração e doses empregadas.

No que tange toxidade reprodutiva, o tratamento com óleoresina de C. duckei (366,89

mg/kg - 10% da DL50) e (1874 mg/kg - 50% da DL50) no período pré-natal (pré e pós-

263

implantação) doses 366,89 mg/kg e 1874 mg/kg não alteraram a performance reprodutiva

materna, no entanto a maior dose (1874 mg/Kg) foi capaz de alterar, diminuindo o número de

fetos vivos e aumentando os índices placentários. As doses administradas em ratas prenhas

(366,89 mg/kg e 1874 mg/kg) não causaram embriofetotóxidade e teratogenicidade, sendo

observado apenas da dose (1874 mg/kg em relação 366,89 mg/kg) sobre a diminuição da

ossificação das falanges anteriores.

Quanto ao tratamento no período pré-natal (desenvolvimento fetal) e pós-natal

(lactação), a menor dose 366,89 mg/kg não provocou toxidade materna sistêmica, somente

sinais clínicos e alteração de alguns parâmetros reprodutivos (viabilidade e desmame), no

entanto a maior dose 1874 mg/kg provocou toxidade sistêmica materna elevada, com óbito de

100%. A dose de 366,89 mg/kg alterou alguns parâmetros reprodutivos, mas não foi capaz de

alterar o desenvolvimento ponderal e geral da progênie, no entanto diminuiu o

desenvolvimento sexual das fêmeas e aumentou a atividade motora da progênie exposta. No

período pós-natal (lactação), a dose de 1874 mg/kg provocou toxidade materna sistêmica,

elevou os níveis de creatinina no plasma, mas não foi capaz de causar lesão renal e as

alterações nas células hepáticas foram compatíveis com a própria condição materna (ratas

puerpéricas). Com relação aos parâmetros hematológicos, a duas doses aumentaram a

produção de hemácias, no entanto não alterou os parâmetros reprodutivos. As doses testadas

de 1874 mg/kg e 366,89 mg/kg aumentaram o desenvolvimento geral e sexual da progênie,

porém a maior (1874 mg/kg) diminuiu a atividade motora dos lactentes. Assim, sugere-se

estudos adicionais, tal como bromatológico do leite e toxicocinética para melhor definir

alguns efeitos.

Por fim, a realização deste trabalho demonstrou a complexidade que envolve o estudo

de um produto fitoterápico, já que trabalhou-se com um fitocomplexo. Além disso, de forma

pormenorizada, qualificou o uso desse produto, por via intravaginal, para infecções

ginecológicas baixas e processos inflamatórios. As doses utilizadas nos ensaios foram

elevadas, para que os possíveis efeitos tóxicos pudessem aparecer e ser avaliados (subcrônico

e reprodutivo). Assim, a partir dos resultados obtidos, podemos inferir que em doses

terapêuticas, este produto pode ser seguro, inclusive em mulheres na idade fértil, sem

comprometimento da performance reprodutiva.

Outros trabalhos poderão ser realizados, com intuito de garantir as exigências

atribuídas pela Agencia Reguladora Brasileira, ANVISA, e demonstrar e contribuir com a

valorização da biodiversidade amapaense e amazônica, no que se refere ao potencial de

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princípios ativos existentes que necessitam ser estudados em diversos níveis, para que os

qualifiquem como matéria-prima ativa para um possível produto farmacêutico.

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APÊNDICE

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