Indução e caracterização molecular de mutantes

PCR

Banco sementes

Detecçãomutação

EMS

XSequenciam.

Vantagens do TILLING• Produz grande especro de mutações

pontuais (alélicas)

• Eficiente para genes pequenos

• Pode focar em regiões de interesse

• Aplicável para qualquer organismo

• Não transgênico

Detecção enzimática da mutação

CEL I

*

*

1 CA Oleykowski, CRB Mullins, AK Godwin & AT Yeung, ‘Mutation detectionusing a novel plant endonuclease’ Nucleic Acids Res. 26:4597 (1998)

IRD 700 IRD 800

Mapeamento de final duplo

TILLING com alta capacidade Banco de sementes

PCRDigestão com Cel I

**

**

**

**

Desnat.

-

+

gel, scan-

-

Primers gene específicos

Pool de DNA

EMS

X X

X X

**

**

**

**

-

+

-

-

Identificar mutantes

seleçãoindivíduos

PCR

Sequenciar

Desnat. eRenatur.

A typical 8-fold pool TILLING gel

GelBuddy calls the lanes

GelBuddy calibrates the lanes

Mark the bands

Mark the bands

GelBuddy reports fragment sizes

Zerr and Henikoff, NAR, 33;2806, 2005

•384 well liquid handling

•8 Li-Cors

•8x pooling

•Production capacity = 12,000 samples/day

•With amplicons of 1500bp = ~ 16 Mb/day

Projeto TILLING Seattle

PARSESNP*

(Project Aligned Related Sequences and Evaluate SNPs)

Taylor & Greene, NAR 31:3808, 2003

Two-dimensional arraying

EMS or MNUor MNU+NaN3

M3 seed

bank DNA and seed

M1

M2

flower seed

Mutagenesis

Distribution of 1890 mutations in 192 TILLed fragments

number of sequenced mutations per fragment

A:T<>G:C

GAA simple repeat:5 <> 6

<> indel 9 nt

Types of polymorphisms identified

• >99% G:C to A:T transitions• 55 repeated mutations observed, ~56 expected

996bp

=repeated mutation

EMS mutagenesis results in:

C

Exp Exp Exp

• some local bias

G->A

A

T

G

-2 -1 +1 +2

ExpObs Obs ObsObs