Influência da Infecção por uma Cepa Policlonal do ... · Ao professor Evandro Machado, por seu auxílio na infecção in vitro. Às minhas queridas amigas-irmãs, Gleise, Maria

Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas

Nívia Carolina Nogueira de Paiva

Influência da Infecção por uma Cepa Policlonal do

Trypanosoma cruzi sobre a Resposta Imune no Coração e

Cólon Durante a Fase Aguda da Infecção Experimental de

Camundongos

Ouro Preto

2015

Nívia Carolina Nogueira de Paiva

Influência da Infecção por uma Cepa Policlonal do

Trypanosoma cruzi sobre a Resposta Imune no Coração e

Cólon Durante a Fase Aguda da Infecção Experimental de

Camundongos

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para a obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas, Área de concentração, Imunobiologia de Protozoários.

Orientadora: Profa Cláudia Martins Carneiro

Co-orientadora: Profª Paula Melo de Abreu Vieira

Ouro Preto 2015

Nogueira-Paiva, NC Colaboradores

i

Laboratório de Imunopatologia – NUPEB/UFOP

Dr. Alexandre Barbosa Reis

Dr. Bruno Mendes Roatt

Msc. Kátia da Silva Fonseca

Larissa Maris Rezende Oliveri

Prof. Washington Luiz Tafuri (in memorian)

Laboratório de Farmácia Clínica – CIPHARMA/UFOP

Dra. Vanja Maria Veloso

Laboratório de Doença de Chagas – NUPEB/UFOP

Dra. Marta de Lana

Msc. Maykon Tavares de Oliveira

Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração – Centro de Pesquisas

René Rachou/FIOCRUZ

Dra. Andréa Teixeira de Carvalho

Laboratório de Neurogenômica – Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ

Dra. Karina Barbosa Queiroz

Nogueira-Paiva, NC Dedicatória

ii

Ao meu eterno e querido amigo, Carlos Henrique Gonçalves.

Nogueira-Paiva, NC Agradecimentos

iii

“(...) e que eu me lembre de Ti, com tranquilidade e determinação, mesmo quando for difícil

dizer que Te amo (...)” (Aleph, Paulo Coelho)

À Deus, obrigada pela presença e luz em todos os momentos.

À professora Cláudia Martins Carneiro, pela oportunidade e carinho. Por confiar no meu

trabalho ao longo de todos esses anos. Por guiar meus passos, compreender minhas limitações

e acima de tudo pela incrível orientação. Obrigada por mais essa etapa, minha eterna mestre.

À minha querida amiga, professora, co-orientadora, Paula, pela disponibilidade e

cumplicidade. Obrigada por fazer parte de cada capítulo de mais essa história. Eterna gratidão

da sua eterna aprendiz!!!!!

À professora Vanja, pela disponibilidade e generosidade durante a realização desse trabalho.

À minha filhinha científica, Larissa, cuja parceria ao longo desse trabalho foi imprescindível e

igualmente prazerosa.

Ao meu mais novo eterno colaborador, Maykon Tavares. Foi incrível conhecê-lo e trabalhar

ao seu lado. Obrigada!!!!

À Marta de Lana, por todo carinho de sempre...

À Dra Andréa Teixeira de Carvalho. Sua atenção, disponibilidade e grande experiência em

citometria de fluxo, contribuíram para o resultado final do nosso trabalho.

Ao professor Alexandre Reis, exemplo de paixão pelo que faz. Obrigada por inspirar, desde o

início, a minha caminhada acadêmica.

Ao Bruno, por toda a paciência de sempre e por ser tão generoso em compartilhar

conhecimento.

À Karina, pela realização da técnica de qPCR.


iv

À Kátia, amiga de todos os momentos.

Aos demais colaboradores, obrigada pela contribuição, disponibilidade e atenção.

À Luciana, Renata Rezende, Fernando, Rory e Levi... Esse trabalho tem um pedacinho de

vocês... Obrigada!!!!

À minha querida Maria, pelo carinho e paciência durante os meus primeiros passos e sempre.

Obrigada pela eterna parceria!

Ao professor Evandro Machado, por seu auxílio na infecção in vitro.

Às minhas queridas amigas-irmãs, Gleise, Maria Cláudia, Aline, Débora, Lucilene, Nádia,

Jamille, Emília, Mariana. Obrigada por alegrarem esse caminho!!!!!

À minha nova filhinha científica, Karla.

Aos meus amigos e parceiros de trabalho, Rodrigo, Luísa Perin, Narjara, Lúcia, Thaís, Lívia,

Flávia, Beatriz, Henrique, João Felipe, João Veloso, Jéssica, Marcelo, Diogo, Sidney, Luísa

Couto, Élcio, Iago, George, Josefa, Irmázio, pela disponibilidade e carinho com que sempre

me ajudaram durante o desenvolvimento desse trabalho.

Aos colegas de trabalho, e acima de tudo, amigos do Centro de Ciência Animal-CCA/UFOP

pelo apoio, pela agradável companhia e pelo carinho e ética dedicados ao trabalho com

animais.

Aos saudosos amigos e companheiros que com brilhantismo estão trilhando seus caminhos,

Amanda, Juliana, Sheler, Tânia, Laser, Ludmilla, Mariana Trevisan, Wendel, Flávia

Bittencourt, Samuel, Micheline, Dayane, Lara, Edith, Ana Luiza, Caio, Caroline, Nathália,

Diogo, Jaqueline, Jerusa, João Lino...

Aos colegas da secretaria do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas, NUPEB/UFOP.

Obrigada!!!!


v

Aos nossos guardiões, Maria, Celso, José Martins e Jorge. Obrigada pela amizade!

Às meninas que deixam nossa rotina mais agradável, Sônia e Cristiana.

À alguém muito especial, pela compaixão e solidariedade, a quem serei sempre grata.

Obrigada por devolver vida às cores e cores à minha vida!!!

À minhas irmãs Alquimistas, pela amizade e segurança. É muito bom saber que vocês estão

ao meu lado!!!!!

Ao meu pai, exemplo de perseverança. Obrigada por tornar meus sonhos possíveis!

À minha mãe, anjo e luz em todos os momentos. Sua “presença” acalma sempre meu coração.

Ao meu irmão “Dri”, maior razão da minha vida.

À minha tia Quitéria, simplesmente por tudo!!!

À minha família, por compreenderem minha ausência e nunca se esquecerem desta prima-

irmã, sobrinha, neta, e agora titia, que ama muito vocês!!!!!!!

Ao meu grande amor, Tiago, por ser o abraço que me mantém segura, o coração que me

mantém em paz. Seu amor faz com que cada dia renasça cheio de esperança.

À todos que contribuíram de forma direta ou indireta para que esse trabalho fosse realizado,

minha sincera gratidão!!!!!!

Nogueira-Paiva, NC Epígrafe

vi

“... O bom é ser inteligente e não entender. É uma benção estranha,

como ter loucura sem ser doida. É um desinteresse manso, é uma doçura

de burrice. Só que de vez em quando vem a inquietação: quero entender

um pouco. Não demais: mas pelo menos entender que não entendo.”

Clarice Lispector

Nogueira-Paiva, NC Resumo

vii

Fatores intrínsecos ao Trypanosoma cruzi e relacionados ao hospedeiro agem sobre a patogênese da doença de Chagas. Neste contexto, o polimorfismo genético do parasito parece ter um papel crítico no prognóstico da doença, e tem sido demonstrada uma associação entre o desenvolvimento das distintas formas clínicas e a distribuição geográfica de cepas do T. cruzi. Diante disso, esse projeto propôs avaliar a influência do polimorfismo biológico e molecular de subpopulações do T. cruzi sobre a resposta inflamatória no coração e cólon durante a fase aguda da infecção experimental. A primeira etapa consistiu na caracterização biológica (meio de cultura acelular e celular) e do perfil gênico (Low-Stringency Single Specific Primer-Polymerase Chain Reaction/LSSP-PCR) de subpopulações do parasito obtidas a partir de hemoculturas periódicas (3, 6 e 12 meses após a infecção-mai) em 24 camundongos experimentalmente infectados com 5000 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Berenice-78 (Be-78 parental) do T. cruzi. Foi possível identificar isolados com comportamento in vitro, assim como perfis de assinatura gênica, distintos do observado para a cepa Be-78 parental. Em alguns casos, os isolados mostraram certo grau de semelhança com a cepa Berenice-62 (Be-62), isolada da paciente Berenice, em fase crônica tardia, 16 anos antes do xenodiagnóstico que originou a cepa Be-78. Esses dados sugerem a presença de distintas subpopulações na cepa Be-78 e reafirmam a plasticidade do parasito frente à pressão seletiva exercida pela interação parasito-hospedeiro. Na segunda etapa, a infecção com um isolado selecionado na primeira etapa, que apresentou perfil distinto da cepa parental, foi comparada com a infecção com as cepas Be-78 parental e Be-62 em modelo murino com o objetivo de investigar a participação de diferentes subpopulações do parasito sobre o desenvolvimento do processo inflamatório durante os estágios iniciais da doença experimental. Nossos dados demonstraram um perfil cardiomiotrópico e retardo no controle da parasitemia na infecção pela cepa Be-78 parental, seguido por processo inflamatório intenso ao final da fase aguda, ao contrário da cepa Be-62 e do isolado Be-78is5-3mai, que por sua vez, apresentou-se preferencialmente parasitando o cólon, com parasitemia significativamente superior, porém, controlada precocemente, e processo inflamatório intenso ao longo da fase aguda. No coração, apesar de já observada no grupo Be-62 aos 14dai, no 28º, a densidade de macrófagos, linfócitos T CD4+ e CD8+ foi semelhante entre as cepas Be-62 e Be-78 parental, com sobreposição de células T CD8+ em relação às células T CD4+. O isolado Be-78is5-3mai apresentou miocardite, embora de menor intensidade, também apenas no 28ºdai, composta essencialmente por macrófagos e linfócitos T CD8+. De forma diferente ao observado no coração, o perfil de resposta imunológica no cólon foi cepa-dependente. Apenas o grupo Be-78 parental apresentou aumento precoce de células T CD4+, que foram substituídas por células T CD8+ e linfócitos B, no 14ºdai. Todos esses resultados são condizentes com o comportamento da parasitemia e do parasitismo tecidual nesse grupo. Embora com menor intensidade, o perfil imunofenotípico detectado nos animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai foi próximo àquele demonstrado pelo grupo Be-62, e sobretudo, distinto da cepa Be-78 parental. Nas primeiras duas semanas de infecção, o processo inflamatório foi constituído principalmente por macrófagos e células T CD8+, com aumento expressivo de linfócitos T CD4+ apenas ao final da fase aguda. Estes resultados indicam que o isolado Be-78is5-3mai, consistente com os dados da avaliação in vitro, demonstrou durante a fase aguda da infecção de camundongos BALB/c, um comportamento intermediário entre a cepas de referência utilizadas, apresentando virulência (parasitemia e mortalidade) compatível com a cepa Be-78 parental, no entanto, perfil histotrópico compartilhado com a cepa Be-62, reforçando a hipótese de que a infecção a longo prazo com a cepa Be-78 foi capaz de selecionar uma subpopulação que compartilha características com a cepa Be-62, ambas originada da paciente Berenice, com 16 anos de intervalo entre as coletas. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, Polimorfismo, Resposta Imune

Nogueira-Paiva, NC Abstract

viii

Factors intrinsic to Trypanosoma cruzi and other host-related act in Chagas disease pathogenesis. In this context, the parasite genetic polymorphism seems to have a critical role in disease prognosis, and have been demonstrated an association between the distincts clinical forms development and geographic distribution of T. cruzi strains. Polyclonal strains are common in the natural infections, and may involve specific interactions parasite-organ. Therefore, this project proposed to evaluate the influence of T. cruzi subpopulations polymorphism on the inflammatory response in the heart and colon during the acute phase of the experimental infection. The first step consisted in biological (cellular and acellular growth media culture) and molecular (Low-Stringency Single-Specific Primer Polymerase Chain Reaction/LSSP-PCR) profile characterization of parasite subpopulations obtained from periodic blood cultures (3, 6, 12 months after the infection-mai) in 24 mice experimentally infected with 5000 blood trypomastigotes forms of Berenice-78 (Be-78 parental strain) T. cruzi strain. It was possible to identify isolates with in vitro behavior, as well as gene signature profile distincts from that observed for the Be- 78 parental strain. In some cases, the isolates showed some degree of resemblance with the Berenice-62 (Be- 62) strain, isolated from patient Berenice in Chagas disease chronic phase, 16 years before the xenodiagnostic that originated the Be- 78 strain. These data suggest the presence of distinct subpopulations in Be-78 strain and underline the plasticity of the parasite against the selective pressure exerted by the parasite-host interaction. In the second stage, infection with one isolate selected in the first step, presenting distinctive profile of the to parental strain, will be compared to infection with Be-78 parental and Be-62 strains in isogenic murine model, in order to investigate the participation of the different subpopulations on the inflammatory process during the early stages of experimental disease. Our data demonstrated a cardiomyotropic profile and a delay in parasitemia controlling in Be-78 parental infected mice, followed by severe inflammation at the end of the acute phase, unlike the Be-62 strain and Be-78is5-3mai isolate, which in turn is preferably parasitizing the colon, with significantly higher parasitaemia, however, early controlled, and intense inflammation during the acute phase. At heart, despite already observed in the Be-62 group to 14dai, on the 28th, the density of macrophages, CD4+ and CD8+ T cells were similar between the Be-62 and Be-78 parental strains, with T-cell overlap CD8+ over CD4+ T cells. The isolated Be-78is5-3mai presented myocarditis, although of lower intensity, also in 28ºdai essentially composed of macrophages and CD8+ T lymphocytes. Differently to that observed in the heart, the immune response profile in the colon was strain-dependent. As Be-78 parental group showed an early increase of CD4+ T cells, which were replaced by CD8+ T cells and B lymphocytes in 14ºdai. All these results are consistent with the parasitaemia and tissue parasitism behavior in that group. Although to a lesser extent, the immunophenotypic profile detected in the animals infected with the isolated Be-78is5-3mai was close to that shown by Be-62 group. In the first two weeks of infection, the inflammation was composed primarily of macrophages and CD8+ T cells, with significant increase of CD4+ T cells only at the end of the acute phase. These results indicate that the isolate Be-78is5-3mai, consistent with the in vitro evaluation, shown during the acute phase of infection of BALB/c mice, an intermediate behavior between the both reference strains used, with virulence (parasitemia and mortality) compatible with the Be-78 parental strain, however, shared histotropic profile with the Be-62 strain, reinforcing the hypothesis that long-term infection with the Be-78 strain was able to select a subpopulation that shares characteristics with the Be-62 strain, both originated from Berenice patient, 16-year interval between collections. keywords: Trypanosoma cruzi, Polymorphism, Immune Response

Nogueira-Paiva, NC Lista de Figuras

ix

Figura 1: Esquema representando as citocinas e as populações celulares envolvidas na geração da resposta protetora ou patogênica na doença de Chagas .......................................................................... 9

Figura 2: Fluxograma representando as atividades relacionadas à obtenção e identificação de isolados da cepa Be-78 do T. cruzi (ETAPA I) ................................................................................................... 28

Figura 3: Fluxograma representando as atividades relacionadas à avaliação in vivo (ETAPA II) ...... 32

Figura 4: Fluxograma representando a distribuição dos animais infectados com diferentes subpopulações do Trypanosoma cruzi utilizados para determinação da curva de parasitemia e da taxa de mortalidade ....................................................................................................................................... 33

Figura 5: Desenho esquemático representando a distribuição de camundongos BALB/c entre os tratamentos/grupos no ensaio por citometria de fluxo. ......................................................................... 38

Figura 6: Desenho esquemático representando as combinações de anticorpos marcados com fluorocromos utilizadas no ensaio de citometria de fluxo ..................................................................... 41

Figura 7: Representação da estratégia de análise da frequência de células inflamatórias com distintos fenótipos em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ............................................................................................................................................................... 42

Figura 8: Representação da estratégia de análise da frequência de macrófagos em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ................................ 43

Figura 9: Representação da estratégia de análise da frequência de linfócitos B em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ................................ 43

Figura 10: Representação da estratégia de análise da frequência de linfócitos T CD4+ ou CD8+, expressando IFN- em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ................................................................................................................................ 44

Figura 11: Cinética de crescimento de epimastigotas, cultivadas em meio LIT no período de 0-20 dias, de isolados do parasito obtidos a partir de hemoculturas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi ....................................................................................................................................................... 51

Figura 12: Ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero usando as cepas Berenice-62, Berenice-78 parental e subpopulações/isolados da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, obtidos em hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa parental .................................................................................................................................................. 54

Figura 13: Ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero usando as cepas Berenice-62, Berenice-78 parental e subpopulações/isolados da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, obtidos em hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa parental .................................................................................................................................................. 55

Figura 14: Fotomicrografias representativas do ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero com as cepas Berenice-62, Berenice-78 parental e subpopulações/isolados da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, obtidos em hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa parental. ............................................................................................. 56


x

Figura 15: Assinaturas gênicas do fragmento de 330pb da região do minicírculo do kDNA reveladas em gel de poliacrilamida a 8% corado pela prata .................................................................................. 59

Figura 16: Fenograma construído a partir de UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages) resultante das análises dos perfis de assinatura gênica obtido por LSSP-PCR de isolados obtidos a partir de hemoculturas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi em comparação à cepa Be-78 parental e à cepa Be-62. ..................................................................................................... 60

Figura 17: Curvas de parasitemia de camundongos BALB/c infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ................. 63

Figura 18: Taxa de sobrevida referente aos camundongos BALB/c infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ............................................................................................................................................................... 64

Figura 19: Avaliação da carga parasitária no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ....................................................................................................................................................... 65

Figura 20: Análise morfométrica do processo inflamatório no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ............................................................................................................. 66

Figura 21: Fotomicrografias representativas da análise semi-quantitativa do processo inflamatório em cortes histológicos do coração de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi .................................. 67

Figura 22: Fotomicrografias representativas da análise semi-quantitativa do processo inflamatório em cortes histológicos do cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. ........................................... 68

Figura 23: Análise imunofenotípica do percentual médio de macrófagos (CD45+ F4/80+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ....... 70

Figura 24: Análise imunofenotípica do percentual médio de linfócitos B (CD45+ CD19+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ....... 71

Figura 25: Análise imunofenotípica do percentual médio de Linfócitos T CD4+ (CD45+ CD3+ CD4+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ............................................................................................................................................................... 72

Figura 26: Análise imunofenotípica do percentual médio de Linfócitos T CD8+ (CD45+ CD3+ CD8+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi ............................................................................................................................................................... 73


xi

Figura 27: Análise imunofenotípica e funcional do percentual médio de Linfócitos T CD4+ (CD45+ CD3+ CD4+) ou CD8+ (CD45+ CD3+ CD8+) expressando IFN- (IFN-+) em relação aos seus respectivos fenótipos auxiliar (CD4+) ou citotóxico (CD8+) presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi......................................................................................... 74

Figura 28: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando o perfil da parasitemia, da carga parasitária e do processo inflamatório ao longo dos tempos avaliados apresentado por cada uma das diferentes subpopulações do T. cruzi utilizadas nesse estudo no coração e cólon de camundongos BALB/c ......................................................................................................... 77

Figura 29: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando o perfil fenotípico do infiltrado inflamatório ao longo dos tempos avaliados apresentado por cada uma das diferentes subpopulações do T. cruzi utilizadas nesse estudo no coração e cólon de camundongos BALB/c ................................................................................................................................................. 78

Figura 30: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando as diferentes subpopulações do T. cruzi, em relação à carga parasitária e ao processo inflamatório (intensidade e fenótipo) no coração de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi .............................................. 117

Figura 31: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando as diferentes subpopulações do T. cruzi, em relação à carga parasitária e ao processo inflamatório (intensidade e fenótipo) no cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi .............................................. 118

Nogueira-Paiva, NC Lista de Quadros

xii

Quadro 1: Classificação atual das cepas do Trypanosoma cruzi em Discrete Typing Units ............... 16

Quadro 2: Classificação das cepas Berenice-62 e Berenice-78 segundo diferentes critérios. ............. 20

Quadro 3: Especificações dos anticorpos utilizados no ensaio de citometria de fluxo. ....................... 40

Nogueira-Paiva, NC Lista de Tabelas

xiii

Tabela 1: Avaliação das hemoculturas realizadas aos 3, 6 e 12 meses após a infecção (mai) de camundongos Swiss com a cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi. ................................................. 48

Tabela 2: Código dos isolados obtidos a partir de hemoculturas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi. ............................................. 49

Tabela 3: Resumo dos resultados obtidos na ETAPA I, comparando todos os parâmetros avaliados entre os isolados e as cepas Be-78 parental e Be-62 do Trypanosoma cruzi ........................................ 61

Tabela 4: Determinação dos períodos pré-patente e patente, dia e pico máximo de parasitemia e área sob a curva nos animais infectados com as cepas Be-62, Be-78 ou isolado Be-78is5-3mai do Trypanosoma cruzi. ............................................................................................................................... 63

Nogueira-Paiva, NC Lista de Abreviaturas e Siglas

xiv

APC: Allophycocyanin (Aloficocianina)

APCs: Antigen-Presenting Cells (Células apresentadoras de antígenos)

AUC: Area Under the Curve (Área sob a curva)

Be-62: Cepa Berenice-62 do Trypanosoma cruzi

Be-78: Cepa Berenice-78 Trypanosoma cruzi

Be-78is1-12mai: isolado obtido por hemocultura do animal 1, 12 meses após a infecção








BFA: Brefeldin A (Brefeldina A)

BSA: Bovine Serum Albumin (Albumina Sérica Bovina)

CD: Cluster of differentiation (antígeno de membrana celular)

CEUA: Comitê de Ética no Uso de Animais

Cel: Controle negativo sem anticorpo

CO2: Dióxido de Carbono

COII: Cytochrome Oxidase II (Subunidade II da Citocromo Oxidase mitocondrial)

dai: Dias após a infecção

DCh: Doença de Chagas

DIA-NADH: Diaphorase-NADH

DMSO: Dimethyl sulfoxide (Dimetilsulfóxido)

DNA: Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico)

dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate (Desoxinuleotídeo Trifosfatado)

DPmáx: Dia do pico máximo de parasitemia

DTT: Dithiothreitol (Ditiotreitol)

DTU: Discret Typing Units

EDTA: Ácido etilendiminotetracetico sal dissódico

EGC: Enteric Glial Cells (Células Gliais Entéricas)

FITC: Fluorescein Isothiocyanate (Isotiocianato de fluoresceína)

FL: Fluorescência

FSC: Forward Scatter (dispersão para frente)

GFAP: Glial Fibrillary Acidic Protein (Proteína Acídica Fibrilar da Glia)

gp63: Glicoproteínas de superfície


xv

Gran A: Granzima A

gRNA: RNA guia

HBSS: Hank’s Buffered Salt Solution (Tampão de Hank)

HE: Hematoxilina-Eosina

HEPES: 2- [4- (2-hidroxietil) piperazin-1-il] etanossulfônico

HVR: Hipervariable Region (regiões hipervariáveis do minicírculo do kDNA)

ICC: Insuficiência Cardíaca Congestiva

IFN- Interferon-gamma

IgG: Imunoglobulina G

IL-10: Interleucina-10



iNOS: Inducible Nitric Oxide Synthase (Enzima óxido nítrico sintase induzível)

kDNA: Kinetoplastid DNA (DNA do cinetoplasto)

LIT: Liver Infusion Tryptose

LSSP-PCR: Low-Stringency Single Specific Primer-Polymerase Chain Reaction

mai: Meses após a infecção

MASP: Mucin Associated Surface Proteins (Proteínas de superfície associadas à mucinas)

MEC: Matriz extracelular

MHC: Major Histocompatibility Complex (Complexo de histocompatibilidade principal)

MOI: Multiplicity of infection

NI: Animais não-infectados

NK: Natural Killer Cells (Células Natural Killer)

pb: Pares de Base

PBS: Phosphate-Buffered Saline (Tampão Salina-Fosfato)

PBS-P: Phosphate-Buffered Saline-Permeabilization (Tampão Salina-Fosfato de permeabilização)

PBS-W: Phosphate-Buffered Saline-Wash (Tampão Salina-Fosfato de lavagem)

PCR: Reação em Cadeia da Polimerase

PE: R-phycoerythrin (Ficoeritrina)

PerCP: Peridinin-Chlorophyll-protein (Proteína clorofila peridinina)

PGM: Phosphoglucomutase

PM: Peso molecular

Pmáx: Pico máximo de parasitemia

PP: Período patente

PPP: Período pré-patente


xvi

qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real ou

quantitativa)

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (Amplificação aleatória do DNA polimórfico)

rDNA: DNA ribossomal

RFLP: Restriction Fragment-Length Polymorfism (Polimorfismo de tamanho de produtos de digestão

do kDNA)

RNA: Ribonucleic Acid (Ácido Ribonucléico)

RPMI: Roswell Park Memorial Institute medium

SFB: Soro Fetal Bovino

SMF: Sistema Mononuclear Fagocitário

SNA: Sistema Nervoso Autônomo

SNE: Sistema Nervoso Entérico

SSC: Side Scatter (dispersão lateral)

Tc: DTU Tc

TGI: Trato Gastrointestinal

Th: Linfócito T helper

TH: Tirosina Hidroxilase

TLR: TOLL Like Receptor (Receptor do tipo TOLL)

TNF-: Fator de Necrose Tumoral-alfa

TS: Trans-sialidases

UPGMA: Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages

Z: Zimodema

Nogueira-Paiva, NC Sumário

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 1

1.1 Aspectos clínicos e epidemiológicos da doença de Chagas .......................................................... 2

1.2 Aspectos imunopatogênicos da doença de Chagas ....................................................................... 5

1.3 Polimorfismo e Plasticidade do Trypanosoma cruzi ................................................................... 10

1.4 As cepas “Berenice” do Trypanosoma cruzi ............................................................................... 18

2. JUSTIFICATIVA ............................................................................................................................ 22

3. OBJETIVOS .................................................................................................................................... 24

3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................................. 25

3.2 Objetivos Específicos .................................................................................................................. 25

3.2.1 Caracterização in vitro e seleção de um isolado da cepa Berenice-78 do T. cruzi (ETAPA I) ....................................................................................................................................................... 25

3.2.2 Avaliação in vivo da influência de infecções experimentais por diferentes populações do T. cruzi derivadas da paciente Berenice (ETAPA II) ........................................................................ 25

4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................ 26

4.1 Caracterização in vitro e seleção de isolados da cepa Be-78 do T. cruzi (ETAPA I) ................. 27

4.1.1 Curvas de Crescimento em meio de cultura acelular ........................................................... 28

4.1.2 Perfis de infectividade e desenvolvimento in vitro .............................................................. 28

4.1.3 Perfil de assinatura gênica .................................................................................................... 29

4.2 Avaliação in vivo da influência de infecções experimentais por diferentes populações do Trypanosoma cruzi originadas da paciente Berenice (ETAPA II) .................................................... 31

4.2.1 Infecção dos animais ............................................................................................................ 31

4.2.3 Parasitemia e sobrevida ........................................................................................................ 32

Abordagens 1 e 2 ........................................................................................................................... 34

4.2.4 Necropsia .............................................................................................................................. 34

4.2.5 Carga parasitária no coração e cólon .................................................................................... 34

4.2.6 Intensidade do processo inflamatório no coração e cólon .................................................... 36

Abordagem 3 ................................................................................................................................. 38

4.2.7 Necropsia .............................................................................................................................. 38

4.2.8 Perfil fenotípico do processo inflamatório no coração e cólon ............................................ 38

4.2.9 Estratégia de análise do perfil fenotípico do processo inflamatório no coração e cólon ...... 41

4.3 Análises estatísticas ..................................................................................................................... 45

5. RESULTADOS ................................................................................................................................ 46

Nogueira-Paiva, NC Sumário

ETAPA I............................................................................................................................................ 47

5.1 Hemoculturas .............................................................................................................................. 47

5.2 Curva de crescimento em meio de cultura acelular ..................................................................... 49

5.3 Perfis de infectividade e desenvolvimentos ................................................................................ 52

5.4 Perfil de assinatura gênica ........................................................................................................... 57

5.5 Representação esquemática do perfil e da caracterização gênica dos isolados da cepa Be-78 parental (ETAPA I) ........................................................................................................................... 61

ETAPA II .......................................................................................................................................... 62

5.6 Parasitemia e sobrevida ............................................................................................................... 62

5.7 Carga parasitária no coração e cólon durante a fase aguda da doença de Chagas experimental . 64

5.8 Processo inflamatório no coração e cólon durante a fase aguda da doença de Chagas experimental ...................................................................................................................................... 65

5.8.1 Intensidade do processo inflamatório ................................................................................... 65

5.8.2 Perfil fenotípico do processo inflamatório ........................................................................... 69

5.8.2.1 Macrófagos .................................................................................................................... 69

5.8.2.2 Linfócitos B ................................................................................................................... 70

5.8.2.3 Linfócitos T ................................................................................................................... 71

5.8.3 Perfil fenotípico e funcional dos Linfócitos T ...................................................................... 73

5.9 Representação esquemática do perfil da infecção no coração e cólon (ETAPA II) .................... 75

6. DISCUSSÃO .................................................................................................................................... 79

7. CONCLUSÃO ................................................................................................................................. 95

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 97

9. ANEXOS ........................................................................................................................................ 114

9.1 Anexo 1: Protocolo nº 2011/30- CEUA/UFOP ......................................................................... 115

9.2 Anexo 2: Protocolo nº 2014/29- CEUA/UFOP ......................................................................... 116

9.3 Anexo 3: Resumo dos resultados obtidos na ETAPA II ........................................................... 117

9.4 Anexo 4: Manuscrito publicado no periódico PLOs One/ETAPA I ......................................... 119

1

1. INTRODUÇÃO

Nogueira-Paiva, NC Introdução

2

1.1 Aspectos clínicos e epidemiológicos da doença de Chagas

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas (DCh), é um

protozoário hemoflagelado pertencente à ordem Kinetoplastida e família Tripanosomatidae

que infecta o homem e uma ampla variedade de mamíferos domésticos e silvestres. Os

hospedeiros invertebrados, vetores da DCh, são insetos hematófagos da subfamília

Triatominae, popularmente conhecidos como “barbeiros”. Durante seu repasto sanguíneo, o

triatomíneo elimina formas tripomastigotas metacíclicas que podem penetrar no hospedeiro

vertebrado através da pele ou mucosa adjacente, infectando principalmente células do sistema

mononuclear fagocitário (SMF). No interior dessas células, as formas tripomastigotas

metacíclicas se diferenciam em formas amastigotas, arredondadas e com flagelo involuído,

que dão início a uma série de replicações. Após vários ciclos de multiplicação as amastigotas

se diferenciam em tripomastigotas, que são liberadas na corrente sanguínea prontas para

infectar outras células hospedeiras e dar início a novas replicações, disseminando a infecção

para os diferentes tecidos e órgãos. O ciclo biológico do T. cruzi continua quando o

triatomíneo ingere as formas tripomastigotas sanguíneas durante hematofagia em mamíferos

infectados. No estômago do inseto, as formas tripomastigotas se transformam nas formas

epimastigotas (não-infectivas) e seguem para o intestino onde se reproduzem

extracelularmente por divisão binária simples. Uma vez que elas alcançam o reto, as

epimastigotas se diferenciam em formas tripomastigotas metacíclicas que podem ser

eliminadas nas fezes do triatomíneo durante o seu repasto sanguíneo reiniciando o ciclo

(Brener, 1987).

A via de transmissão vetorial, descrita acima, representa a principal e mais frequente

forma de transmissão, sendo o Triatoma infestans, o Rhodnius prolixus e o Triatoma

dimidiata os mais importantes vetores no ciclo doméstico da DCh (Zeledon e Rabinovich,

1981; Who, 2002). O T. infestans, embora atualmente considerado eliminado no Brasil (Dias,

1997), é historicamente associado às regiões endêmicas sub-amazônicas, enquanto as espécies

R. prolixus e T. dimidiata geralmente são encontradas ao norte da América do Sul e Central,

sendo que o último alcança o norte do México (Zeledon e Rabinovich, 1981; Who, 2002).

Contudo, a DCh ainda pode ser transmitida por mecanismos não-vetoriais através de

transfusão sanguínea, transplante de órgãos, transmissão vertical, acidentes de laboratório e

por via oral (Prata, 2001; Benchimol Barbosa, 2006; Bern et al., 2007).


3

Duas fases são clinicamente reconhecidas na DCh humana durante sua evolução

natural. Após a infecção pelo T. cruzi inicia-se a fase aguda, caracterizada por elevada

parasitemia, parasitismo tecidual e processo inflamatório intensos. Nesta fase iniciam-se as

lesões do sistema nervoso autônomo (SNA) que geralmente estão relacionadas a um infiltrado

inflamatório adjacente, associado ou não a ninhos do parasito (Lisboa, 1960; Andrade e

Andrade, 1966; Tafuri, 1971; Tafuri et al., 1971). A fase crônica inicia-se quando o sistema

imune do hospedeiro controla a multiplicação do parasito, ocorrendo simultaneamente à

redução do parasitismo tecidual e sanguíneo. Consequentemente, o processo inflamatório

tende a reduzir, porém a manutenção de uma resposta inflamatória ativa e progressiva está

associada às alterações graves da DCh e ao desenvolvimento da fase crônica determinada ou

aparente. Na forma determinada ou sintomática, manifestações clínicas mais comuns

envolvem o coração e o trato digestório, caracterizando as formas cardíaca ou digestiva

(megacólon ou megaesôfago), respectivamente, que podem ocorrer isoladas ou em associação

(Tafuri, 1971; Tafuri et al., 1971).

Indivíduos na fase crônica da infecção também podem apresentar a forma

indeterminada ou inaparente, considerada a mais frequente de todas as formas

anatomoclínicas da DCh (Andrade, 2005). O critério para o diagnóstico da forma

indeterminada, adotado pela Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, prevê “indivíduos

assintomáticos, com evidências sorológicas e/ou parasitológicas da infecção pelo T. cruzi,

com eletrocardiograma e estudo radiológico contrastado do esôfago e cólon dentro dos limites

normais” (Andrade, 2005). Os indivíduos infectados com o T. cruzi podem permanecer

assintomáticos pelo resto de suas vidas, no entanto, aproximadamente 30% deles, após vários

anos de infecção, podem apresentar alterações morfofuncionais no coração e/ou trato

digestório e assim evoluírem para a forma determinada da DCh (Andrade et al., 1997).

Portanto, a forma inaparente ou indeterminada parece ter um complexo significado

anatomoclínico e epidemiológico e tem sido considerada por muitos autores apenas como

uma fase ou forma latente da DCh. A despeito da normalidade nos exames radiológicos e

eletrocardiográficos do tórax, lesões histológicas podem estar presentes nestes indivíduos e

serem indicativas da evolução para a forma aparente mesmo que em níveis leves (Macedo,

1980; Coura et al., 1985; Castro et al., 1994; Andrade et al., 1997; Macedo, 1999; Prata,

2001).

Um estudo longitudinal realizado na cidade de Mambaí/Goiás entre os anos de

1975/76 a 1986/91 revelou que 120 dos 190 pacientes com DCh apresentavam a forma


4

indeterminada no ano inicial do trabalho. Entretanto, 39 desses pacientes portadores da forma

indeterminada tiveram evolução progressiva em 1986/91 (Castro et al., 2001). Destes 39

indivíduos, 33 evoluíram para a forma digestiva, sendo que 23 pacientes desenvolveram

megaesôfago e 10 pacientes manifestaram sintomas do megacólon (Castro et al., 2001).

O substrato anatômico da forma inaparente é representado por lesões inflamatórias

microscópicas focais, associadas ou não à presença de parasitos que são raramente

demonstrados pelos métodos histológicos comuns (Andrade, 2005), mas têm sido revelados

por técnicas mais sensíveis, como a imuno-histoquímica e a PCR (Polymerase Chain

Reaction-Reação em Cadeia da Polimerase) (Higuchi et al., 1993; Jones et al., 1993; Vago et

al., 2000; Vago et al., 2003). A cardiomiopatia chagásica é caracterizada por alterações

eletrocardiográficas como bloqueio atrioventricular, extra-sístoles ventriculares, síndrome do

nódulo sinusal e taquicardia supraventricular (Gascon et al., 2007). As manifestações clínicas

incluem arritmias, tromboembolismo periférico, aneurisma de ponta e insuficiência cardíaca

congestiva, podendo ocorrer morte súbita (Dias et al., 1956). Em relação à forma digestiva,

embora lesões associadas ao intestino delgado (megaduodeno, megajejuno e/ou megaíleo)

possam ocorrer, o megaesôfago e o megacólon são as manifestações gastrointestinais mais

comuns da DCh, ocorrendo em áreas endêmicas numa taxa de 15-20% dos pacientes

chagásicos, associada ou não à forma cardíaca (Prata, 2001). No megaesôfago pode-se

observar relaxamento anormal do esfíncter esofageal e diminuição da peristalse

caracterizando uma alteração motora conhecida como acalasia com disfagia, regurgitação,

pirose e dor torácica, enquanto o megacólon está associado à constipação crônica, com

obstrução parcial a total de segmentos colônicos (em especial, no segmento retossigmóide) e

complicações como desnutrição e vólvulo (torção) sigmóide (De Rezende, 1984; De Oliveira

et al., 1998; Prata, 2001; Sanchez-Guillen Mdel et al., 2006).

No contexto epidemiológico, o número estimado de pessoas infectadas pelo T. cruzi,

segundo a Organização Mundial de Saúde, é de aproximadamente 10 milhões, distribuídas em

21 países da América Latina, onde a doença ainda é considerada endêmica com o predomínio

da transmissão vetorial, como Argentina, Chile, Bolívia, Venezuela e Colômbia, e em regiões

não-endêmicas como Canadá, Estados Unidos, Austrália, Japão, França, Itália, Espanha,

Portugal e Bélgica (Who, 2010a; b). Nestes últimos a incidência da DCh está relacionada a

mecanismos de transmissão não-vetoriais facilitados por fenômenos de mobilidade

populacional (Schmunis, 2007; Who, 2010a). No Brasil, um inquérito sorológico nacional

para DCh, realizado entre os anos 1975 e 1980, estimou uma soroprevalência de 4,22%,


5

todavia, com o controle da transmissão vetorial, a incidência da DCh no país caiu para 1,3%

no ano de 1995 (Akhavan, 2000; Bocanegra, 2008). As maiores prevalências foram

encontradas no Rio Grande do Sul (8,84%), Minas Gerais (8,83%), Goiás (7,40%), Sergipe

(5,97%) e Bahia (5,44%) (Camargo et al., 1984; Bocanegra, 2008).

A gravidade e prevalência das diferentes formas clínicas da DCh variam entre

diferentes regiões geográficas (Andrade, 1985), no entanto, a causa dessa heterogeneidade

ainda não é clara. Uma grande diversidade de fatores atua na patogênese dessa doença,

determinando maior ou menor intensidade do infiltrado inflamatório e da destruição tecidual.

Entre estes, alguns estão relacionados ao hospedeiro, como constituição genética, estado

imunológico, nutricional e idade, enquanto outros, são inerentes ao T. cruzi, ligados ao seu

polimorfismo biológico e molecular, associado à diferenças relacionadas ao histotropismo,

constituintes antigênicos, sensibilidade à drogas, entre outros.

1.2 Aspectos imunopatogênicos da doença de Chagas

Pacientes com acometimento cardíaco apresentam miocardite crônica difusa

progressiva, com consequente destruição das miofibras e substituição por tecido conjutivo,

culminando no desenvolvimento da insuficiência cardíaca congestiva (ICC), consistindo em

um quadro clínico grave da DCh (Andrade, 1985; Barros et al., 2001; Barros et al., 2003).

Achados histopatológicos tanto na doença humana quanto em modelos experimentais

demonstram a presença de processo inflamatório, com caráter fibrosante e degenerativo,

constituído predominantemente por células mononucleares, acompanhadas por uma fibrose

intersticial e áreas de degeneração e miocitólise (Andrade, 1985; De Lana et al., 1988; Tafuri

et al., 1988; Rossi, 1995; Caliari et al., 2002b; Barros et al., 2003; Dutra e Gollob, 2008;

Dutra et al., 2009). Os gânglios nervosos epicárdicos aparecem com número reduzido de

neurônios, com acometimento do sistema excito-condutor relacionado às alterações

eletrocardiográficas (Andrade et al., 1978; Andrade, 1985; Rossi e Bestetti, 1995).

Alterações em outros componentes da matriz extracelular (MEC), além do colágeno,

são observadas em experimentos in vitro e in vivo. A fibronectina, uma glicoproteína da

MEC, tem sido associada à interação parasito-célula hospedeira durante o processo de invasão

e a mecanismos de adesão e migração de células inflamatórias (Wirth e Kierszenbaum, 1984).

A laminina, principal constituinte da membrana basal, por sua vez, precisa ser degradada para

invasão do parasito e, dessa forma, sua participação nos fenômenos iniciais do processo


6

infeccioso tem sido avaliado (Moody et al., 2000). De forma interessante, foi observado um

aumento na expressão de laminina no coração de camundongos C3H/He infectados com a

cepa Colombiana do T. cruzi. Ao contrário do observado para fibronectina, em áreas

associadas à infiltrado inflamatório, não foi possível observar imunomarcação de laminina

(Marino et al., 2003). Assim pode-se sugerir que o remodelamento da matriz extracelular,

tanto na fase aguda quanto na fase crônica da DCh, em resposta ao parasito e seus antígenos,

está envolvido na disseminação do parasito, no estabelecimento da inflamação e dos

processos citotóxicos associados (Higuchi et al., 1999; Marino et al., 2003).

A forma clínica digestiva da DCh é caracterizada por alterações anatômicas como

dilatação em graus variáveis, aumento do lúmen, ausência de obstrução mecânica e

espessamento da parede, especialmente relacionada à hipertrofia muscular.

Microscopicamente é observado infiltrado inflamatório constituído predominantemente por

células mononucleares na muscular da mucosa, submucosa e na muscular própria; ganglionite

e periganglionite, especialmente circundando o plexo de Auerbach; ulceração da mucosa e

fibrose intermuscular intersticial (Tafuri, 1971; Tafuri et al., 1971; Adad et al., 1991; Caliari

et al., 1996). Lesões inflamatórias regressivas do sistema nervoso entérico (SNE) afetam

neurônios, células gliais e fibras nervosas e são consideradas elementos essenciais na

patogênese da desordem gastrointestinal (Köberle, 1957; Koberle e De Alcantara, 1960;

Tafuri e Raso, 1962; Andrade e Andrade, 1966; Tafuri e Brener, 1967a; Tafuri, 1970; 1971;

Tafuri et al., 1971; Köberle, 1974; Adad et al., 1991; Adad et al., 2001; Lages-Silva et al.,

2001; Da Silveira et al., 2005; Da Silveira et al., 2007a; Da Silveira et al., 2007b; Da Silveira

et al., 2008; Da Silveira et al., 2009; Nascimento et al., 2010; Nogueira-Paiva et al., 2014).

Iantorno et al. (2007), utilizando enolase como marcador pan-neuronal e S-100 como

marcador pan-glial, descreveram perda significativa de neurônios e células gliais em pacientes

com megacólon chagásico. Desnervação, avaliada pela marcação de áreas PGP9.5, também

foi observada em pacientes com megacólon chagásico em estudo realizado por Da Silveira et

al. (2007a). Além de lesões neuronais, alterações no número e fenótipo das células gliais

também são encontradas em pacientes com a forma digestiva (Da Silveira et al., 2007b;

Nascimento et al., 2010).

Os mecanismos imunopatogênicos relacionados ao desenvolvimento do amplo

espectro de formas clínicas da DCh ainda não são totalmente compreendidos. A escassez de

parasitos detectados pela microscopia óptica convencional nas lesões teciduais ou no sangue

durante a fase crônica suscitou dúvidas sobre seu papel patogênico direto e, juntamente com a


7

presença de auto-anticorpos, levantou a hipótese da autoimunidade na patogênese da DCh.

Contudo, técnicas mais sensíveis, como a imuno-histoquímica e a Reação em Cadeia da

Polimerase (PCR), demonstram uma forte correlação entre a presença do parasito e a

ocorrência de lesões teciduais reforçando assim, a participação do parasito na patogênese das

formas crônicas da doença (Higuchi et al., 1993; Jones et al., 1993; Vago et al., 1996a;

Andrade et al., 1999; Anez et al., 1999; Vago et al., 2000; Lages-Silva et al., 2001; Vago et

al., 2003). No entanto, as teorias de autoimunidade e de manutenção de um parasitismo

tecidual deixaram de ser mutuamente excludentes para se tornarem complementares (Soares

et al., 2001). A persistência do parasito a longo prazo parece ter um papel-chave para a

manutenção de um processo inflamatório ativo capaz de causar lesões histológicas (Tarleton e

Zhang, 1999; Lages-Silva et al., 2001; Andersson et al., 2003; Da Silveira et al., 2005). No

entanto, a habilidade de mimetismo antigênico do T. cruzi tem sido demonstrada em infecções

naturais ou experimentais, relacionando-se ao desenvolvimento de resposta imune contra

células próprias (Cunha-Neto e Kalil, 1995). Independente da origem dos antígenos que

modulam a resposta imunológica durante a infecção crônica, é sabido que o sistema imune do

hospedeiro, particularmente a resposta imune celular, tem um papel central no

desenvolvimento das manifestações clínicas (Andersson et al., 2003; Dutra et al., 2009).

Durante a infecção e o desenvolvimento da fase aguda da DCh, fatores genéticos,

moleculares e/ou biológicos relacionados ao parasito, em associação com o perfil imune dos

hospedeiros podem ter um papel preditivo importante sobre o prognóstico da doença. É

sabido que nos estágios iniciais da infecção, o desenvolvimento da resposta imune Th1 e a

expressão de citocinas pro-inflamatórias são importantes para o controle da replicação do

parasito. No entanto, a modulação dessa resposta é fundamental para prevenir a lesão tecidual

com consequentes manifestações clínicas (Dutra et al., 2009).

Os primeiros eventos da resposta imune inata iniciam-se quando células do sistema

mononuclear fagocitário infectadas passam a sintetizar as citocinas Interleucina-12 (IL-12) e

TNF(Fator de Necrose Tumoral-alpha) que agem ativando as células Natural Killer (NK) e

linfócitos T e, consequentemente, induzindo a expressão de IF (Interferon-gamma) e

intermediando o processo de recrutamento de células inflamatórias para o local da infecção.

Essa citocina, por sua vez, ativa os macrófagos, mediando a morte dos parasitos

intracelulares, através da expressão da enzima iNOS (óxido nítrico sintase induzível) e

produção de NO, controlando a replicação do parasito (Torrico et al., 1991; Vespa et al.,

1994; Graefe et al., 2003). A indução de uma resposta celular efetiva requer estimulação


8

apropriada via células apresentadoras de antígenos. Adicionalmente, a ativação das células T

pela IL-12 e a manutenção dos altos níveis de IFN- por essas células consiste na interface

entre a resposta imune inata e adaptativa. Células T CD4+ e CD8+ têm sido descritas como

essenciais ao desenvolvimento da resposta imune contra o parasito e distintos fenótipos dessas

células podem estar associadas aos distintos quadros clínicos da DCh (De Alencar et al.,

2009; Dutra et al., 2009).

Pacientes com a forma indeterminada da doença representam uma situação de

equilíbrio entre a infecção e a resposta inflamatória. Estudos têm demonstrado uma alta

frequência de células T CD4+, que não expressam a molécula co-estimuladora CD28, em

pacientes com a forma indeterminada da doença. Adicionalmente, estes pacientes

apresentaram altos níveis de expressão de IL-10, sugerindo que o fenótipo CD4+ CD28- possa

estar associado à capacidade de modulação da resposta inflamatória (Menezes et al., 2004;

Dutra et al., 2009).

O infiltrado inflamatório, presente principalmente na camada mucosa e adjacente aos

gânglios mientéricos, associado às lesões desenvolvidas em pacientes com megaesôfago ou

megacólon, é constituído predominantemente por macrófagos, eosinófilos, células NK,

mastócitos e células T CD4+ (D'avila Reis et al., 2001; Da Silveira et al., 2007b). Ao contrário

do observado na forma digestiva, o intenso processo inflamatório observado no miocárdio de

pacientes com a forma cardíaca da doença, é composto especialmente por células T CD8+

associados à expressão de citocinas pro-inflamatórias, como TNFe IFN- e, moléculas

citotóxicas, como perforina e granzima A (Higuchi, 1999). Camundongos nocautes para

linfócitos T CD8+ expressando perforina apresentaram menores níveis de lesões teciduais e

alterações cardíacas (Silverio et al., 2010). No entanto, pacientes com a doença cardíaca

também apresentam células T CD4+, sendo demonstrado que a deficiência dessas células leva

a uma redução global da resposta imunológica do hospedeiro e consequente aumento de

parasitismo tecidual, provavelmente porque linfócitos T CD4+ promovem a ativação de

macrófagos e a proliferação de linfócitos T CD8+ e B (Rottenberg et al., 1995).

De forma geral, a influência da resposta imune sobre as manifestações clínicas tem

sido relacionada a um desequilíbrio entre as repostas Th1 e Th2 (Figura 1), levando a

persistência do parasito, a exacerbação da resposta inflamatória e ao consequente dano

tecidual. Nesse contexto, o balanço entre as citocinas pro-inflamatórias e anti-inflamatórias

parece ser imprescindível para a modulação da resposta imune. O tratamento de camundongos

com anti-IFN-impediu o controle da replicação do parasito, enquanto o bloqueio de IL-10


9

ou IL-4 resultou em controle mais efetivo da infecção (Mccabe et al., 1991; Torrico et al.,

1991).

Figura 1: Esquema representando as citocinas e as populações celulares envolvidas na geração da resposta protetora ou patogênica na doença de Chagas. Durante a fase aguda, células da resposta imune inata e adaptativa trabalham para controlar a replicação do parasito. As células NK são as principais responsáveis pela ativação de monócitos/macrófagos através da síntese de IFN- nos estágios iniciais da fase aguda. Macrófagos e células dendríticas apresentam antígenos às células T, além de sintetizarem citocinas e proverem os sinais co-estimuladores para ativação dessas células. Células T CD4+ auxiliam na ativação de células T CD8+, que através de mecanismos citotóxicos, passam a ser as principais responsáveis pelo controle do parasitismo tecidual. A parasitemia patente é controlada pela ação do sistema imune e os indivíduos entram na fase crônica da doença. A interação inicial parasito-hospedeiro é a chave para o estabelecimento do controle efetivo da parasitemia patente e ao mesmo tempo é crucial na formação do microambiente de citocinas que podem orquestrar a subsequente diferenciação das subpopulações de linfócitos T efetores e reguladores. Diferentes perfis de resposta imune podem ser montados: resposta imune eficaz e controlada, associada à forma indeterminada, onde as lesões histológicas não são suficientes para causar alterações anatomoclínicas, ou ainda uma resposta contínua, que controla a replicação do parasito, no entanto, não é modulada e acaba sendo patogênica, causando as lesões crônicas das formas sintomáticas cardíaca e digestiva. A forma cardíaca está associada à uma sobreposição de linfócitos T CD8+, e citocinas como IFN- e TNF-. A forma digestiva está principalmente associada à maior frequência de linfócitos TCD4+, células NK, mastócitos e a citocinas como TNF-, IL-1 e IL-6. Pacientes com a forma indeterminada apresentam densidades inferiores de linfócitos T tanto CD4+ quanto CD8+, populações de células Treg e uma expressão elevada de IL-10. Fonte: Adaptado de (Dutra et al., 2009)

Resposta imune modulada/ausência de lesão

Resposta imune não modulada/presença de lesão

Forma Cardíaca

Forma Digestiva

Forma Indeterminada

Controle da parasitemia patente

Fatores determinantes: resposta imune, cepa do parasito, genética do hospedeiro

Lesão tecidual

Lesão tecidual


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1.3 Polimorfismo e Plasticidade do Trypanosoma cruzi

O desenvolvimento de pesquisas com o intuito de reproduzir a DCh em modelos

experimentais, a partir do inóculo de subpopulações do parasito isoladas de hospedeiros

vertebrados ou invertebrados, mostraram a existência de uma variação intraespecífica do T.

cruzi com potenciais implicações fisiopatogênicas. Essas subpopulações receberam a

designação de cepas, referindo-se à amostra derivada de um "isolado", mantida em cativeiro

em reprodução contínua por passagens seriadas, em cultura ou animais de laboratório

(Lumsden, 1965).

A heterogeneidade intraespecífica do T. cruzi, observada pela primeira vez por Carlos

Chagas (1909), foi em seguida estudada e confirmada por Brener e Chiari (1963) que

demonstraram a ocorrência de três grupos morfologicamente distintos do parasito, de acordo

com a predominância de formas delgadas, largas e muito largas. Em 1969, Brener demonstrou

que as formas delgadas penetravam mais rapidamente nas células do hospedeiro e estas eram

mais susceptíveis aos mecanismos imunes, enquanto, as formas largas persistiam por um

tempo maior no sangue periférico, sendo, portanto, mais resistentes aos mecanismos

imunológicos do hospedeiro. Dessa maneira, as formas delgadas parecem mais adaptadas a

penetrarem nas células que as formas largas e muito largas, que tendem a acumular-se no

sangue (Brener, 1969). Corroborando com essa hipótese, as taxas de mortalidade foram

maiores nos animais infectados com as subpopulações constituídas predominantemente por

formas delgadas quando comparadas àquelas constituídas por formas largas ou muito largas,

onde muitos dos animais sobreviveram até a fase crônica (Brener, 1965), indicando que o

curso da infecção poderia depender da predominância relativa de uma forma sobre a outra.

Além dos aspectos morfológicos e sua influência sobre a resposta imune do

hospedeiro, a capacidade do T. cruzi de infectar vários tipos celulares garante a ele uma

adaptação bem sucedida e determina a manifestação de outro aspecto polimórfico, descrito

como cito/histotropismo (Andrade, 1985; Andrade et al., 1999; Vago et al., 2000; Andersson

et al., 2003; Macedo et al., 2004). A maioria das cepas apresenta preferência por células

musculares (Tarleton e Zhang, 1999) e dessa forma, os principais órgãos afetados são o

coração, o esôfago e o cólon, nos quais ocorrem as lesões mais graves que caracterizam as

formas cardíaca e/ou digestiva da doença. No entanto, estudos comprovam a presença de

parasitos no fígado, baço, músculo esquelético, pâncreas, intestino delgado, cérebro, bexiga,

tecido adiposo entre outros (Tafuri e Raso, 1962; Tafuri e Brener, 1967b; Melo e Brener,

1978; Saldanha et al., 2001; Meneghelli, 2004; Vieira et al., 2009; Ferreira et al., 2011) entre


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outros órgãos. De acordo com a preferência tecidual é atribuído às diferentes cepas a

designação de reticulotrópicas ou macrofagotrópicas, para aqueles que apresentam

histotropismo para células do sistema mononuclear fagocitário (SMF) e miotrópicas, para

subpopulações com afinidade para células musculares (Melo e Brener, 1978).

Ao longo das últimas décadas do século XX, vários parâmetros morfológicos,

biológicos e/ou moleculares de diferentes “amostras” do T. cruzi foram investigados com o

objetivo de estabelecerem-se critérios de classificação que pudessem, além de indicar alguma

relação com aspectos clínicos e epidemiológicos da doença, criar bases satisfatórias para a

identificação das cepas (Oliveira, 1986). A observação de diferenças morfológicas e

comportamentais entre essas amostras, relacionadas à virulência e patogenicidade, levou à

proposta de distribuição das cepas em BIODEMAS, onde pertenciam ao Tipo I aquelas que

apresentavam predomínio de formas delgadas, rápida taxa de multiplicação, pico de

parasitemia e mortalidade máxima entre 7º-12º dia após a infecção (dai) e macrofagotropismo

na fase aguda (ex.: cepas Y e Peruana); ao Tipo II, cepas com predomínio de formas largas,

taxas de multiplicação menores, picos irregulares de parasitemia e taxa de mortalidade

máxima entre o 12º-20º dai e cardiomiotropismo (ex.: amostra 12SF); e, por último, ao Tipo

III, parasitos preferencialmente largos, com lenta taxa de multiplicação, picos parasitêmicos

altos e tardios, ocorrendo entre o 20º-30º dai, elevada patogenicidade e especial tropismo para

o músculo esquelético (ex.: Colombiana) (Andrade, 1974; Andrade e Magalhaes, 1996).

Além dos padrões biológicos, análises dos perfis de isoenzimas também foram

utilizados para distinguir subpopulações do T. cruzi. A avaliação das combinações entre

diferentes perfis isoenzimáticos permitiu a classificação das cepas em ZIMODEMAS, capaz

de identificar inicialmente no Brasil, três padrões isoenzimáticos, Z1, Z2 e Z3,

correlacionados aos ciclos silvestre (Z1, Z3) ou doméstico (Z2) com circulação independente

em determinada área endêmica e transmissão por diferentes espécies de vetores, sendo todos

capazes de causar a doença aguda em humanos, embora o zimodema 2 esteja mais

relacionado às manifestações clínicas da fase crônica (Miles et al., 1977; Miles et al., 1978;

Miles et al., 1980; Tibayrenc e Miles, 1983; Romanha e Brener, 1988). Carneiro et al. (1990)

submeteram isolados obtidos por hemocultura de pacientes em fase crônica à avaliação de

oito loci enzimáticos antes e após manipulação em condições de laboratório e identificaram

quatro grupos isoenzimáticos, ZA, ZB e ZC, além da possibilidade de alteração no perfil de

isoenzimas após sucessivas passagens em camundongos.


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Embora diferenças relacionadas à genética, dieta e outros fatores, não sejam excluídas,

a associação entre a distribuição epidemiológica dos diferentes perfis isoenzimáticos e a

prevalência das manifestações clínicas foi observada durante a caracterização de isolados

originados de distintos hospedeiros na Venezuela, e nas regiões amazônica e central do Brasil.

Os zimodemas Z1 e Z3 foram identificados nas duas primeiras, onde prevalecem as formas

cardíaca e indeterminada, enquanto, na região central do Brasil, onde é comum o

desenvolvimento da forma digestiva, 98 dos 99 isolados de pacientes apresentaram perfil

compatível ao Z2 (Miles et al., 1981). Estudos convergindo as classificações em Biodemas e

Zimodemas confirmaram a distribuição epidemiológica dos zimodemas entre diferentes

regiões do Brasil, e demonstraram a equivalência entre o biodema Tipo I e o zimodema Z2b

(variante de Z2), biodema Tipo II e zimodema Z2 e, biodema Tipo III e zimodema Z1, sendo

o Tipo II/Z2, comumente encontrado parasitando cardiomiócitos e/ou células do sistema

nervoso entérico e predominante na região central do Brasil e o Tipo III/Z1, prevalente ao

norte do Brasil, e apresentando miotropismo (Andrade e Magalhaes, 1996). Sistemas

enzimáticos adicionais permitiram ainda a identificação de uma diversidade genética maior e

sendo proposta a existência de 43 genótipos, com quatro grupos considerados os genótipos

principais, genótipo 19, genótipo 20, genótipo 32, genótipo 39 (Tibayrenc et al., 1986;

Tibayrenc e Ayala, 1988). Análises posteriores sugeriram a existência de duas linhagens

maiores filogeneticamente heterogêneas, Linhagens 1 e 2, diferentes entre si em várias

propriedades biológicas (Tibayrenc, 1995).

Com o crescente interesse em correlacionar o polimorfismo do T. cruzi às variações

clinico-epidemiológicos da DCh, critérios de classificação baseados na caracterização

genética do DNA do parasito começaram a ser aplicadas aos estudos de campo e

experimentais. É sabido que o T. cruzi apresenta evolução predominantemente clonal, no

entanto, a possibilidade da ocorrência rara de recombinação sexual sugere a propagação de

genótipos clonais e o surgimento de linhagens do parasito que podem ser identificadas por

seus genótipos e/ou fenótipos distintos (Tibayrenc et al., 1986; De Freitas et al., 2006;

Zingales et al., 2009). O genoma do parasito é diploide e contém aproximadamente 23.000

genes, com cerca de 50% do genoma consistindo de sequências repetitivas, incluindo genes

codificadores de proteínas de superfície, como as trans-sialidases (TS), mucinas,

glicoproteínas de superfície (gp63) e proteínas de superfície associadas à mucinas (MASP)

(El-Sayed et al., 2005; Bartholomeu et al., 2009). Como outros flagelados da ordem

Kinetoplastida, o T. cruzi possui uma única mitocôndria que contém uma rede complexa de


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DNA mitocondrial circular, conhecida como DNA do cinetoplasto (Kinetoplastid DNA-

kDNA), constituindo aproximadamente 15% do DNA total da célula (Baptista et al., 2006). O

kDNA é organizado em anéis concatenados entre si denominados maxicírculos e

minicírculos. Os maxicírculos, equivalentes ao DNA mitocondrial clássico, estão presentes

em algumas dezenas de cópias e contêm 20 genes codificadores de proteínas envolvidas no

processo de fosforilação oxidativa, importantes para transformação em formas epimastigota

no intestino do vetor, ou proteínas da via glicolítica, usadas pelo parasito no hospedeiro

mamífero (Westenberger et al., 2006). Cerca de 20.000-30.000 minicírculos são encontrados

em estrita relação com os maxicírculos e são formados por quatro regiões equidistantes, com

sequências nucleotídicas de aproximadamente 100pb (pares de base) quase idênticas,

constituindo os domínios ou regiões conservadas separadas entre si por quatro regiões

hipervariáveis (Hipervariable Region-HVR) de 280-320pb (Liu et al., 2005). A maioria dos

transcritos primários originados dos genes dos maxicírculos não podem ser diretamente

traduzidos por conterem “erros” e são submetidos a um processo de edição, conduzida por

RNAs guia (gRNA), codificados por genes presentes nos minicírculos, capaz de modificar sua

sequência nucleotídica (“RNA edition”) alterando assim a estrutura primária do RNA e

produzindo uma sequência funcional (Avila e Simpson, 1995; Westenberger et al., 2006).

Dessa forma, maxicírculos e minicírculos têm funções complementares que contribuem para

mecanismos responsáveis por mudanças no estágio do ciclo de vida e no metabolismo

energético em diferentes hospedeiros (Avila e Simpson, 1995).

Os domínios hipervariáveis do minicírculo apresentam uma grande diversidade entre

as linhagens do T. cruzi, e foram os primeiros alvos da caracterização do kDNA na busca de

marcadores genéticos do polimorfismo. A classificação em “ESQUIZODEMAS”, proposta

por Morel et al. (1980) é baseada no polimorfismo de tamanho de produtos de digestão do

kDNA (Restriction Fragment-Length Polymorfism-RFLP) e subpopulações agrupadas dentro

do mesmo esquizodema apresentam padrões similares de produtos de endonuclease de

restrição, sendo genotipicamente relacionadas. kDNA total obtidos de isolados classificados

em diferentes zimodemas foram submetidos à RFLP da região hipervariável do minicírculo e

os resultados demonstraram que as seis amostras pertencentes ao zimodema C apresentaram

um único perfil de esquizodema, enquanto três subpopulações pertencentes ao zimodema A

demonstraram três diferentes esquizodemas (Morel et al., 1980), o que indica uma

complementaridade entre zimodemas e esquizodemas, no entanto, evidencia maior capacidade

em detectar variabilidade para a técnica de RFLP em detrimento à caracterização de


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isoenzimas. Avila et al. (1990) submeteram 56 amostras de T. cruzi isoladas de pacientes,

animais e insetos de diferentes regiões à RFLP do domínio variável do minicírculo a partir do

kDNA total ou de regiões de 330pb do minicírculo do kDNA previamente amplificadas

utilizando iniciadores específicos para a região conservada do minicírculo. Os padrões de

digestão obtidos da região variável do minicírculo amplificada apresentaram mais

informações que àquelas obtidas a partir do kDNA total, permitindo a classificação das cepas

em esquizodemas adicionais (Avila et al., 1990).

A amplificação aleatória do DNA polimórfico ou RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA) é baseada na utilização de iniciadores não-específicos que amplificam

aleatoriamente regiões do DNA do parasito, gerando perfis de RAPD que consistem de uma

complexa série de produtos de DNA de intensidade e tamanhos variados e potencialmente

capazes de fornecer informações geneticamente úteis devido à sua reprodutibilidade (Steindel

et al., 1993). A comparação entre “RAPDEMAS” e “ZIMODEMAS” de 32 isolados do T.

cruzi revelou que os perfis de RAPD de cepas pertencentes ao mesmo zimodema tenderam a

ser muito similares, enquanto expressivas mudanças no padrão de bandas produzidas foram

observadas quando um zimodema foi comparado a outro (Steindel et al., 1993), sugerindo

uma associação entre esses dois critérios de classificação.

Análises dos perfis isoenzimáticos e por RAPD sugeriram a redistribuição das cepas

da linhagem 2, em cinco subgrupos filogenéticos cada um compreendendo as cepas de

referência: T. cruzi IIa (CanIII cl1), T. cruzi IIb (Esmeraldo cl3), T. cruzi IIc (M5631 cl5), T.

cruzi IId (MN cl2) e T. cruzi IIe (CL Brener). Os dois primeiros grupos foram relacionados

principalmente ao ciclo silvestre, enquanto os demais grupos foram restritos ao ambiente

doméstico. A linhagem 1 (Z1), por sua vez, não apresentou perfis adicionais (Brisse et al.,

2000a). Baseado nesses dados, Brisse et al. (2000a; 2000b), propuseram a subdivisão do

táxon T. cruzi em seis Discrete Typing Units (DTUs: I, IIa, IIb, IIc, IId e IIe), com variações

geográficas e ecológicas.

Além do kDNA, sequências do DNA do parasito também foram submetidas à

genotipagem e o alinhamento comparativo de sequências do gene do mini-exon (ME) de

diferentes cepas do T. cruzi mostraram a presença de sequências altamente conservadas,

(exons e introns) e de regiões intergênicas divergentes, cuja análise por PCR permitiu a

identificação de dimorfismo entre as cepas de acordo com os produtos de amplificação. Cepas

pertencentes ao grupo 1, com produtos de 330pb foram diferentes das cepas designadas grupo

2, com produtos apresentando 350pb (Souto et al., 1996). A avaliação inicial do DNA


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ribossomal (rDNA) entre diferentes tripanosomatídeos permitiu a amplificação de sequências

de 100pb ou 125pb para duas cepas do T. cruzi, Tulahuen e Y, respectivamente, sugerindo a

aplicação dessa técnica para avaliação do polimorfismo intraespecífico observado para esse

parasito. A caracterização da região 24S do gene do rRNA de isolados/cepas do T. cruzi

obtidos de diferentes hospedeiros permitiu a divisão e dois grupos, 1 e 2, que incluíram cepas

que apresentaram amplificação de fragmentos de 125 ou 100pb, respectivamente (Souto e

Zingales, 1993). A avaliação simultânea de diferentes marcadores moleculares, região 24S do

rDNA, região intergênica do mini-exon e RAPD, confirmaram posteriormente a existência

dos dois grupos discretos e um terceiro grupo apresentando ambos os produtos de PCR e

denominado grupo 1/2 (Souto et al., 1996).

Microssatélites são unidades repetitivas pequenas de 2-6 nucleotídeos presentes em

número variável, extremamente polimórficas e distribuídas por todo o genoma nuclear

(Polymorphic tandem repeats of 2-6 bases long simple motifs) amplamente utilizadas para

investigações filogenéticas e, ainda, determinação da natureza monoclonal ou policlonal de

diferentes cepas do T. cruzi (Oliveira et al., 1998; Oliveira et al., 1999; Macedo et al., 2001).

Dados obtidos por Oliveira et al. (1998; 1999), analisando cepas e clones do T. cruzi

utilizando oito marcadores de microssatélites, confirmaram o genoma diploide, a organização

clonal e o alto polimorfismo do parasito.

A classificação atual (Quadro 1) demonstra a classificação geral em Discrete Typing

Units (DTU) que identifica as cepas do T. cruzi em grupos geneticamente mais relacionados

baseada em características moleculares e biológicas: TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV e TcVI

(Zingales et al., 2009).


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Quadro 1: Classificação atual das cepas do Trypanosoma cruzi em Discrete Typing Units

DTU Abreviatura Equivalência

T. cruzi I TcI T. cruzi Ia,b e DTU Ic

T. cruzi II TcII T. cruzi IIa e DTU IIbc

T. cruzi III TcIII Z3/Z1 ASATd, Z3-Ae, DTU IIcc e T. cruzi IIIf

T. cruzi IV TcIV Z3d, Z3-Be, DTU IIac

T. cruzi V TcV Boliviana Z2d, rDNA 1/2g, clonet 39h, DTU IIdc

T. cruzi VI TcVI Paraguaia Z2f, zimodema Bj e DTU IIec

DTU: Discrete Typing Units; a: Anonymous 1999; b: Falla et al. 2000; d: Miles et al. 1981; e: Mendonça et al. 2002; f: Freitas et al. 2006; g: Souto et al. 1996; Tibayrenc & Ayala 1991; i: Chapman et al. 1984; j: Romanha & Brener, 1988, Carneiro et al. 1990. Fonte: Adaptado de Zingales et al. 2009.

Na tentativa de relacionar a patogênese das distintas formas clínicas à variabilidade

intraespecífica do T. cruzi, Vago et al. (2000) caracterizaram geneticamente parasitos

obtidos do coração e do esôfago de pacientes que apresentavam concomitantemente

cardiomiopatia e megaesôfago. Perfis genéticos distintos do T. cruzi foram observados para

cada órgão, indicando a ocorrência de infecção com cepas policlonais e um histotropismo

diferencial entre os clones, possivelmente capaz de influenciar a patogênese e o

desenvolvimento de distintas formas clínicas (Camandaroba et al., 2006; Rodrigues et al.,

2010).

Cepas policlonais, comumente observadas em infecções naturais, são constituídas por

populações ou clones que apresentam características biológicas e genéticas distintas e podem

interagir diferentemente com o hospedeiro. Em áreas endêmicas, as cepas policlonais

formam-se quando pacientes são infectados por múltiplos contatos com diferentes

triatomíneos, e estes, por sua vez, podem adquirir várias subpopulações alimentando-se de

distintos indivíduos infectados (Oliveira et al., 1998; Macedo et al., 2002; Macedo et al.,

2004). Em uma cepa considerada policlonal ou mista, cada clone representa uma linhagem

que se reproduz por divisão binária e permanece inalterada por um grande número de

gerações até que ocorra mutação. Assim, cepas do T. cruzi representam um grupo de clones

que podem estabelecer relações simbiônticas, mas também competem por fontes disponíveis e

estas interações podem mudar drasticamente em diferentes ambientes (Macedo et al., 2002).


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O modelo “histotrópico clonal” leva em consideração todos esses fatores e sugere uma

hipótese para a formação de cepas do T. cruzi policlonais e como isto pode afetar a

patogênese da DCh. Segundo esse modelo, algumas associações são seletivamente vantajosas

formando cepas estáveis, no entanto o background genético do hospedeiro pode determinar a

susceptibilidade à infecção e o desenvolvimento da doença. Dessa forma, quando mamíferos

são infectados, o repertório clonal pode determinar quais tecidos podem ser afetados. Como

nem todos os clones são capazes de estabelecer a infecção, clones que conseguem se

estabelecer provavelmente competem entre si e colonizam tecidos diferentes. Dessa forma, a

interação de distintos clones/isolados com tecidos específicos poderia ser um fator

determinante para o desenvolvimento das distintas formas clínicas (Macedo et al., 2002).

A classificação atual das subpopulações do T. cruzi em Discrete Typing Units (DTU)

coloca as cepas Be-62 e Be-78 como pertencente ao DTU TcII (Zingales et al., 2009), no

entanto, dados obtidos em nosso laboratório mostraram que, cepas pertencentes ao mesmo

DTU TcII, cepas Y e Be-78, foram capazes de alcançar e parasitar o esôfago e o cólon de cães

da raça Beagle e induzir processo inflamatório considerável nas camadas submucosa e

muscular e ainda, em regiões adjacentes ao gânglio mientérico. Em contrapartida, animais

infectados com a cepa Y controlaram o parasitismo e retornaram o sistema imune a

homeostase, enquanto animais infectados com a cepa Be-78 mantiveram o parasitismo ao

longo de 2 anos de infecção e apresentaram lesões de caráter aparentemente progressivo.

Embora sejam linhagens suficientemente relacionadas para serem classificados dentro do

mesmo DTU, TcII, essas duas cepas são morfologicamente distintas e a interação parasito-

hospedeiro pode interferir com o desenvolvimento da resposta imune do hospedeiro e

determinar o sucesso no controle do parasitismo tecidual e das lesões associadas (Nogueira-

Paiva et al., 2014).

Variações com importância epidemiológica nos padrões de distribuição geográfica das

diferentes linhagens do parasito têm sido observadas atualmente e sua associação com as

formas clínicas da DCh, embora ainda não clara (Florez et al., 2010), têm sido amplamente

investigadas. Na América Central e na região norte da América da Sul, há um predomínio de

subpopulações pertencentes ao grupo TcI, enquanto as outras linhagens (TcII-VI) são

encontradas predominantemente ao sul da América do Sul. Na região central da América do

Sul (Brasil e Bolívia) parece ocorrer uma sobreposição entre as linhagens do T. cruzi (HIGO

et al., 2004). Além da distribuição geográfica, o polimorfismo das subpopulações do T. cruzi

parece também ter relação com as diferentes manifestações anatomoclínicas. A forma


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digestiva é principalmente atribuída ao TcII (Miles et al., 1981; Zingales et al., 1998; Virreira

et al., 2006; Freitas et al., 2009). Estudos epidemiológicos realizados na Colômbia

demonstraram, porém, que a cardiomiopatia parece não ser mais a única forma clínica da DCh

associada ao TcI, uma vez que foram descritas ocorrências da forma digestiva em pacientes

infectados com parasitos pertencentes ao TcI (Florez et al., 2010; Mantilla et al., 2010) e da

forma cardíaca associada ao TcII (Zafra et al., 2008). Na Bolívia, as subpopulações

pertencentes ao TcIId (atual TcV em Zingales et al. (2009) são as mais comumente

encontradas, seguidas pela linhagem TcI, e não parecem estar associadas a nenhuma forma

clínica específica, cujo desenvolvimento deve relacionar-se mais a fatores relacionados ao

hospedeiro (Del Puerto et al., 2010).

1.4 As cepas “Berenice” do Trypanosoma cruzi

A infecção com as cepas Berenice-62 (Be-62) e Berenice-78 (Be-78) do T. cruzi tem

sido estudada em modelos experimentais, tendo algumas de suas características bem definidas

como polimorfismo, patogenicidade, tropismo, resistência à quimioterapia, resposta imune

sistêmica e compartimentalizada (Brener, 1965; Lana e Chiari, 1986; Bahia et al., 2002;

Caliari et al., 2002a; Caliari et al., 2002b; Carneiro et al., 2007; Guedes et al., 2007; Veloso et

al., 2008; Vieira et al., 2009; Vieira et al., 2012; Nogueira-Paiva et al., 2014). Originalmente é

associada ao primeiro caso clínico humano descrito de DCh (Chagas, 1909) em uma paciente

residente em área endêmica para doença (município de Pirapora, MG/Brasil). Um

acompanhamento longitudinal das condições clínicas e parasitológicas dessa paciente

permitiu a observação de algumas peculiaridades, como por exemplo, a possibilidade de uma

infecção crônica com duração superior a 50 anos estar associada à ausência de manifestações

clínicas da doença.

Além da população isolada durante a fase aguda, cujo ciclo biológico foi reproduzido

em hospedeiro vertebrado e invertebrado (Chagas, 1909), duas outras amostras do parasito,

posteriormente denominadas Berenice-62 e Berenice-78, foram isoladas da mesma paciente

em momentos distintos, através de xenodiagnóstico utilizando T. infestans e Dipetalogaster

maximus, respectivamente (Salgado et al., 1962; Lana e Chiari, 1986). De forma interessante,

o isolado Be-78 apresenta comportamento biológico in vitro e aspectos relacionados à

virulência e patogenicidade distintos (Lana, 1981), sendo que duas hipóteses são consideradas

para explicar a alteração no perfil dessas subpopulações. Embora a paciente negue a


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ocorrência de contato posterior com vetor, a possibilidade de reinfecção não é totalmente

descartada, uma vez que continuou residindo em área endêmica. No entanto, se não houve

reinfecção, as diferenças entre as duas amostras coletadas da mesma paciente com 16 anos de

intervalo sugerem a ocorrência de uma seleção de população do parasito através de

mecanismos imunológicos que atuam durante a fase crônica da doença (Lana, 1981).

A cepa Be-62 é predominantemente constituída por formas delgadas, apresenta pico de

parasitemia ao redor do sétimo dia e taxa de mortalidade de 100% aos 15 dias após a infecção

(Brener, 1965; Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986), enquanto a cepa Be-78 é composta por

formas largas, apresenta pico de parasitemia mais tardio (15º dia) e taxa de sobrevida de

100% (Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986; Carneiro et al., 2007; Guedes et al., 2007). Quando

introduzidas em meio de cultura acelular, a amostra Be-78 apresentou menor capacidade de

crescimento e altas taxas de diferenciação, enquanto o isolado Be-62 demonstrou, sob as

mesmas condições, grande capacidade de multiplicação e taxas médias de diferenciação

(Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986).

A avaliação de cães infectados com as cepas Be-62 e Be-78 também demonstrou

aspectos particulares entre elas. Miocardite intensa tem sido constantemente associada à cepa

Be-78 durante a fase aguda da infecção, enquanto animais infectados com a cepa Be-62

demonstram um perfil variável, porém menos intenso, dependendo da forma infectiva e da via

de inoculação (Caliari et al., 1995; Bahia et al., 2002).

A análise de isoenzimas revelou que ambos os isolados pertenciam ao zimodema A

(Carneiro et al., 1990), no entanto, o perfil eletroforético permitiu a nítida diferenciação entre

as duas subpopulações (Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986). É importante ressaltar que os perfis

de isoenzimas e de endonucleases de restrição não se modificaram ao longo de sucessivas

passagens sanguíneas e/ou em culturas acelulares ou em diferentes situações de isolamento

(Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986). Comparando o tropismo tecidual, a cepa Be-78 é

amplamente observada parasitando células musculares (miotrópica) e a cepa Be-62, por sua

vez, tem histotropismo preferencial por células do sistema mononuclear fagocitário

(macrofagotrópica) (Lana e Chiari, 1986).

Embora ambos os isolados estejam atualmente classificados dentro do mesmo táxon

(Quadro 2), a caracterização genética das cepas Be-62 e Be-78 através da determinação dos

perfis de isoenzimas, endonucleases de restrição, e microssatélites reforçaram a existência de

importantes diferenças com potenciais implicações imunopatogênicas. O padrão

isoenzimático, baseado em 18 sistemas, confirmou a diferença em relação à PGM


20

(Phosphoglucomutase), já descrita por Lana e Chiari (1986), somando à DIA-NADH

(Diaphorase-NADH) (Cruz et al., 2006). Os dados obtidos por RAPD mostraram expressivas

diferenças em três dos nove iniciadores utilizados (Cruz et al., 2006). Adicionalmente, para

verificar se as duas amostras eram populações mono ou policlonais, as cepas parentais foram

submetidas ao processo de clonagem por diluição seriada e os quatro clones obtidos foram

comparativamente analisados pela técnica de microssatélite, utilizando sete loci, revelando

que ambas as cepas são populações provavelmente monoclonais, uma vez que cada cepa e

seus respectivos clones mostraram o mesmo perfil de amplificação com um ou dois picos em

todos os loci testados, que refletem homozigose ou heterozigose (Cruz et al., 2006). No

entanto, a presença de diferentes subpopulações clonais nas duas cepas avaliadas não é

descartada, uma vez que os métodos convencionais de clonagem não são capazes de

identificar todos os clones presentes em uma cepa podendo favorecer alguns indivíduos na

população original (Pinto et al., 1998) e o uso de marcadores moleculares mais sensíveis teria

maior chance de distingui-las (Cruz et al., 2006). Baseadas nas técnicas utilizadas neste

estudo, Cruz et al. (2006) concluem que as cepas Be-62 e Be-78, embora apresentem

propriedades biológicas e moleculares distintas, são filogeneticamente relacionadas e

consideradas pertencentes ao zimodema A (Romanha et al., 1979) ou Z2 (Miles et al., 1978),

Linhagem I (Souto et al., 1996) e, atualmente ao DTU TcII (Zingales et al., 2009).

Quadro 2: Classificação das cepas Berenice-62 e Berenice-78 segundo diferentes critérios.

Táxon Referência Bibliográfica

Genótipo 32 Tibayrenc & Ayala 1988

Zimodema A Romanha et al. 1979

Zimodema 2 Miles et al. 1978

Linhagem 1 Souto et al. 1996

T. cruzi II Anonymous 1999

Tc II Zingales et al. 2009

Em contrapartida, Veloso et al. (2005) avaliaram a influência da infecção crônica de

longa duração (2-7 anos) em hospedeiro vertebrado sobre as propriedades biológicas e

genéticas de quatro isolados obtidos de cães infectados com a cepa Be-78 do T. cruzi em

comparação à amostra parental, confirmando a heterogeneidade dessa cepa, sua plasticidade


21

frente a diferentes pressões de seleção e a importância das particularidades da interação

parasito-hospedeiro. Estas subpopulações, após isolamento, foram inoculadas em

camundongos e mantidas em passagens sanguíneas sucessivas sendo reisolados, por

hemocultura, após a primeira e 25ª passagem e submetidas à determinação das lesões

histológicas e caracterização dos perfis de isoenzimas e RAPD, utilizando cinco iniciadores

aleatórios. Os dados demonstraram diferenças significativas entre a cepa parental e seus

isolados em relação à parasitemia, virulência e patogenicidade em camundongos.

Adicionalmente, a avaliação molecular revelou perfis distintos de isoenzimas e RAPD entre

os diferentes isolados e ainda a presença de dois zimodemas dentro do mesmo isolado,

indicando a policlonalidade da cepa Be-78 parental. A capacidade de alguns isolados de

reverter os perfis genéticos, após a 25ª, passagem tornando-os semelhantes àqueles

observados para a cepa parental evidencia que a transição de uma subpopulação para outra é

gradual e que, eventualmente, uma pode sobrepor-se em relação à outra, dependendo da

resposta à pressão do ambiente (Veloso et al., 2005). Recentemente, outros isolados da cepa

Be-78, obtidos de diferentes passagens em camundongos, foram inoculados em cães da raça

Beagle. Seus perfis de RAPD, avaliados após hemocultura, revelaram a existência de dois

grupos, embora geneticamente relacionados, resultantes da possível influência de fatores do

hospedeiro, reforçando os dados de Veloso et al. (2005) (Veloso et al., 2012).

Valadares et al. (2012) submeteram as cepas Be-62 e Be-78 e dois isolados da cepa B-

78 a uma metodologia adaptada de Sorting celular (Fluorescence-Activated Cell Sorter-

FACS) e foram capazes de isolar uma única célula de cada uma dessas subpopulações do T.

cruzi para posterior genotipagem usando marcadores polimórficos para o genes da subunidade

II da Citocromo Oxidase mitocondrial (Cytochrome Oxidase II-COII) e nuclear (24S rDNA),

além da caracterização de quatro loci de microssatélites. Os resultados demonstraram que os

isolados da cepa Be-78 avaliados eram constituídos por três subpopulações, sendo uma

compatível com o perfil observado para Be-62, outra equivalente à Be-78 parental e uma

terceira apresentando um novo padrão, baseado nos quatro loci de microssatélites, ainda não

identificado (Valadares et al., 2012), reforçando a hipótese de que mudanças a nível biológico

e molecular podem ocorrer após passagens sucessivas ou infecção crônica de longa duração,

como resultado da pressão seletiva e do crescimento de subpopulações não previamente

detectadas mais constituintes da cepa original (Valadares et al., 2012; Veloso et al., 2012).

22

2. JUSTIFICATIVA

Nogueira-Paiva, NC Justificativa

23

Variações dos padrões de distribuição geográfica das diferentes linhagens ou

subpopulações do T. cruzi associadas ao amplo espectro clínico da DCh têm apontado o

polimorfismo intraespecífico do T. cruzi como um dos fatores importantes para o prognóstico

da doença. Essas distintas subpopulações presentes no inóculo durante a infecção natural,

segundo o modelo histotrópico clonal, podem apresentar características intrínsecas com

repercussão sobre o estabelecimento da infecção e colonização dos tecidos (Macedo et al.,

2002). Embora estudos genéticos possam comprovar a heterogeneidade intraespecífica do

parasito, avaliações do comportamento biológico e da interação parasito-hospedeiro,

poderiam esclarecer a importância das diferentes cepas, na determinação das manifestações

clínico-epidemiológicas da doença (Andrade e Magalhaes, 1996). Assim sendo, a

compreensão a respeito da participação de diferentes subpopulações do parasito no processo

patogênico, em relação à modulação da resposta imune e ao desenvolvimento das lesões

histológicas durante a fase aguda, poderá contribuir não só para elucidação dos fenômenos

relacionados aos danos teciduais, como será de fundamental importância para o

esclarecimento da evolução da doença, além de auxiliar no estabelecimento de estratégias

terapêuticas eficazes para o tratamento e prevenção da fibrose cardíaca e da lesão entérica na

infecção chagásica.

24

3. OBJETIVOS

Nogueira-Paiva, NC Objetivos

25

3.1 Objetivo Geral

Avaliar a influência da infecção por uma cepa policlonal do T. cruzi sobre a resposta

imune e o desenvolvimento das lesões histológicas no coração e cólon durante a fase aguda da

DCh experimental.

3.2 Objetivos Específicos

3.2.1 Caracterização in vitro e seleção de um isolado da cepa Berenice-78 do T. cruzi

(ETAPA I)

Identificar e selecionar um isolado da cepa Berenice-78 do T. cruzi com características

biológicas e/ou moleculares distintas da cepa parental.

3.2.2 Avaliação in vivo da influência de infecções experimentais por diferentes

populações do T. cruzi derivadas da paciente Berenice (ETAPA II)

Comparar os perfis das curvas de parasitemia;

Quantificar o parasitismo no coração e cólon;

Avaliar o processo inflamatório total no coração e cólon;

Fenotipar o perfil de células mononucleares no coração e cólon;

Analisar as células T CD4+ e CD8+ em relação à expressão de IFN- no coração e cólon.

26

4. MATERIAL E MÉTODOS

Nogueira-Paiva, NC Material e Métodos

27

4.1 Caracterização in vitro e seleção de isolados da cepa Be-78 do T. cruzi (ETAPA I)

Vinte e quatro camundongos Swiss com 30 dias de idade foram inoculados com 5 x

103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Be-78 por via intraperitoneal e mantidos no

Centro de Ciência Animal - CCA/UFOP com ração e água ad libitum durante 12 meses após

a infecção (mai). A confirmação da infecção e a curva de parasitemia, segundo metodologia

de Brener (1962), foram determinadas em exame de sangue a fresco. Os animais foram

submetidos à coleta de sangue para hemocultura aos três, seis e 12 mai (Figura 2). Em

ambiente estéril, 200l de sangue colhido do plexo orbital de cada camundongo foram

adicionados a um tubo plástico cônico estéril de 15mL (Falcon®, Becton Dickinson, EUA)

(1 tubo/animal), previamente identificados, contendo LIT suplementado com 10% de soro

fetal bovino inativado (LIT-10%SFB, Liver Infusion Tryptose-10% Soro Fetal Bovino) e

mantidos em estufa biológica refrigerada BOD (FANEM® modelo 347) à temperatura de

28°C ± 1°C, para avaliação aos 30, 60 e 90 dias após coleta.

A partir dos tubos positivos na hemocultura, foi realizada uma passagem em meio de

cultura acelular (LIT-10%SFB). Todos os tubos foram incubados a 28°C e, após um período

de 7 dias, foram centrifugados a 2200×g a temperatura ambiente durante 10min, seguido da

remoção do sobrenadante para um tubo plástico cônico de 15mĿ e acréscimo de 3mL de

LIT. Esse procedimento foi realizado com a finalidade de limpar a cultura. Posteriormente, a

cultura foi transferida para erlenmeyer, sendo examinada periodicamente para a adição de

LIT (1:3) em média a cada sete dias, para o crescimento e multiplicação do T. cruzi em fase

logarítmica até a concentração de 1 × 1010 epimastigotas/mĿ (adaptado de D’Ávila et al.,

2009). Na tentativa de evitar seleção de subpopulações do parasito por prolongada

manutenção em meio artificial, todos os cultivos permaneceram aproximadamente 40 dias

em meio LIT quando os parasitos foram criopreservados em nitrogênio líquido, ou lavados

três vezes com tampão PBS 10% (Phosphate-Buffered Saline) estéril, pH 7,2, por

centrifugação a 3400 × g a 4ºC durante 30min para obtenção de sedimento de parasitos

(massa úmida) que foi estocado a -80ºC até o momento da extração do DNA. Além disso,

simultaneamente, amostras dessas culturas foram submetidas à determinação do

comportamento em meio de cultura acelular (LIT) ou celular (células Vero) (Figura 2).

Todos os procedimentos estão sendo realizados de acordo com os princípios éticos

preconizados pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal), tendo sido

aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de Ouro Preto-

CEUA/UFOP (Anexo 1: Protocolo nº 2011/30).


28

Figura 2: Fluxograma representando as atividades relacionadas à obtenção e identificação de isolados da cepa Be-78 do T. cruzi (ETAPA I). Be-62 ( ): animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental ( ): animais infectados com a cepa Berenice-78. do T. cruzi; mai: meses após e infecção, LIT: Liver Infusion Tryptose.

4.1.1 Curvas de Crescimento em meio de cultura acelular

O comportamento das curvas de crescimento in vitro dos isolados em meio de cultura

acelular LIT-10% SFB (Liver Infusion Tryptose-10% Soro Fetal Bovino) foi determinado a

partir de um inóculo padrão de 1 x 107 parasitos/mL em um volume final de 3mL. Para isso,

o volume utilizado no inóculo referente a cada cultura foi determinado com auxílio da

câmara de Neubauer, e as culturas, em triplicata, foram mantidas em estufa biológica

refrigerada BOD (FANEM® modelo 347) à temperatura de 28°C ± 1°C durante o período de

avaliação. O crescimento numérico foi acompanhado diariamente através de contagem em

câmara de Neubauer, em aumento de 400x ao longo de 20 dias.

4.1.2 Perfis de infectividade e desenvolvimento in vitro

Be-78is

Be-62

Expansão das culturas em meio LIT

Comportamento em cultura celular

(Células Vero)

Assinatura gênica(LSSP-PCR)

Comportamento em cultura acelular

(Meio LIT)

Hemoculturas Positivas

Be-78

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 24...

Hemoculturas

3, 6 e 12 MAI

24 camundongos SwissETAPA I


29

Previamente ao ensaio de infecção in vitro, amostras de cultura de epimastigotas dos

parasitos foram incubadas em meio Grace (Grace’s Insect Medium, Sigma), e mantidas

durante 15 dias, para indução de metaciclogênese. O perfil de infecção e desenvolvimento in

vitro dos isolados da cepa Be-78 foi comparado aos perfis de crescimento da cepa Be-78

parental e da cepa Be-62, em culturas de células Vero (células renais extraídas de

Cercopithecus aethiops) submetidas à infecção e avaliadas após 24, 48 e 72 horas, em

triplicatas, segundo adaptações da metodologia utilizada por Andrade et al. (2010). Após 24

horas de cultura, monocamadas semiconfluentes de células Vero (104), fixadas em lamínulas,

foram incubadas em estufa a 5% de CO2 e à 37ºC, durante 18 horas (overnight), com formas

tripomastigotas metacíclicas de culturas axênicas das diferentes subpopulações do T. cruzi

(105), a uma MOI (multiplicity of infection) de 10. Após lavagem com tampão PBS 10% para

eliminação de parasitos extracelulares, as culturas foram mantidas nas mesmas condições de

incubação anteriores até o momento da coleta das células (24, 48 e 72 horas após o inóculo).

Em seguida, as culturas foram fixadas em metanol, coradas pelo Panótico Rápido e as taxas

de infecção e desenvolvimento ou multiplicação foram analisadas por microscopia óptica em

aumento de 1000x. A taxa de infecção foi obtida como número de células infectadas em

relação a 100 células contadas, enquanto a taxa de desenvolvimento foi avaliada como

número de parasitos em relação ao número de células infectadas.

4.1.3 Perfil de assinatura gênica

A avaliação do polimorfismo gênico entre os diferentes isolados e a cepa parental

Berenice-78, através da LSSP-PCR, consistiu na obtenção, amplificação e purificação do

DNA template acompanhadas por uma segunda amplificação utilizando um único primer sob

condições de baixa estringência (Pena et al., 1994). A amplificação específica do fragmento

de 330pb (pares de base) do kDNA do T. cruzi foi realizada conforme protocolo de (Gomes

et al., 1998). Os produtos amplificados foram revelados em gel de agarose 1,5% (1,0%

agarose + 0,5% agarose Low Melting Point/Invitrogen) e corados por brometo de etídio. Os

fragmentos de 330pb, visualizados pela radiação ultravioleta, foram removidos do gel com o

auxílio de um pipetador de plástico. Após aquecimento em banho-maria, esses fragmentos

foram homogeneizados, diluídos em água Milli-Q estéril na proporção de 1:10 e utilizados

em um segundo passo de amplificação. Para as reações de LSSP-PCR as amostras de DNA

foram re-amplificadas utilizando um único iniciador específico (correspondente ao iniciador

S35), denominado S35G* (5’-AAA TAA TGT ACG GGG GAG AT-3’). A mistura da


30

reação totalizou um volume final de 10 μL, contendo 6,38 μL de água milli-Q estéril; 2,0 μL

de tampão de amostra; 0,2 μL de cada desoxinucleotídeo (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP,

dTTP – Sigma, St. Louis, MO, EUA); 0,1 μL do iniciador S35G* (450μM) e 0,32 μL de Taq

DNA polimerase (5U/L - Go Taq- Promega). Nessa mistura foi acrescentado 1μL do DNA

diluído na proporção 1:10. A amplificação ocorreu nas seguintes condições: uma etapa

inicial de desnaturação do DNA a 94°C por 5min, anelamento a 30º por 1 minuto, extensão a

72º por 1 minuto, seguida de 40 ciclos de amplificação constituídos de um passo de

desnaturação a 94ºC por 1min, um de anelamento a 30°C por 1min, finalizado com uma

etapa de extensão a 72ºC por 10min.

Os produtos dessa segunda amplificação foram revelados, em duplicata, em gel de

poliacrilamida 8%, corados por prata e submetidos à análise do perfil do compartilhamento

de bandas e construção do fenograma para identificação de polimorfismos.


31

4.2 Avaliação in vivo da influência de infecções experimentais por diferentes populações

do Trypanosoma cruzi originadas da paciente Berenice (ETAPA II)

A avaliação in vivo foi dividida em três abordagens (Figura 3), nas quais foram

empregados 330 camundongos BALB/c jovens (5-8 semanas de idade), fêmeas, nascidos no

Setor de Criação do Centro de Ciência Animal-CCA da Universidade Federal de Ouro Preto.

Os animais, distribuídos em quatro grupos experimentais, não infectado (NI), infectado com

a cepa Berenice-78 do T. cruzi parental (Be-78 parental), infectado com um isolado da cepa

Be-78 (Be-78isolado) e infectado com a cepa Be-62 (Be-62), foram necropsiados aos 7, 14 e

28 dias após a infecção (dai). As abordagens 1 e 2 envolveram 90 animais distribuídos entre

os diferentes grupos experimentais (Be-78, n=22; Be-78is, n=22; Be-62, n=34; e NI, n=12),

sendo quantificados o parasitismo tecidual (qPCR) e o processo inflamatório total (HE). Dez

animais de cada grupo infectado foram submetidos à avaliação da curva de parasitemia e

taxa de mortalidade. A Abordagem 3 incluiu os demais 240 camundongos BALB/c

distribuídos entre os diferentes grupos experimentais (Be-78, n=48; Be-78is, n=48; Be-62,

n=96; e NI, n=48). Nessa abordagem, as amostras do coração e cólon, coletadas durante a

necropsia, foram submetidas à avaliação imunofenotípica das células inflamatórias por

citometria de fluxo (macrófagos, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+). As três abordagens

foram realizadas simultaneamente. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com

os princípios éticos preconizados pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal), tendo sido aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade

Federal de Ouro Preto-CEUA/UFOP (Anexo 2: Protocolo nº 2014/29).

4.2.1 Infecção dos animais

Duzentos e setenta camundongos BALB/c com idade variando entre 5-8 semanas

foram distribuídos em quatro grupos experimentais: infectados com a cepa Be-78 parental

(Be-78, n=70), infectados com um isolado da cepa Be-78 (Be-78is, n=70), infectados com a

cepa Be-62 (Be-62, n=130) e não-infectados (NI, n=60). O grupo infectado com a cepa Be-

62 foi realizado em número maior considerando os altos índices de mortalidade descritos na

fase aguda da infecção.Os animais infectados foram inoculados, por via intraperitoneal, com

5 x 103 formas tripomastigotas sanguíneas obtidas após descongelamento das amostras

utilizadas na ETAPA I. A infecção foi confirmada por observação de tripomastigotas


32

sanguíneos, em exame de sangue a fresco, e os animais mantidos no Centro de Ciência

Animal-CCA/UFOP com ração e água ad libitum durante o tempo de avaliação (28 dias).

Figura 3: Fluxograma representando as atividades relacionadas à avaliação in vivo (ETAPA II) proposta neste trabalho. Os 330 animais foram distribuídos em três abordagens. Abordagem 1: quantificação do parasitismo tecidual; Abordagem 2: avaliação do processo inflamatório; Abordagem 3: análise imunofenotípica e funcional das células inflamatórias. Todas as avaliações foram realizadas em amostras do coração e cólon coletadas durante as necropsias aos 7, 14 e 28 dias após a infecção. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental ( ): animais infectados com a cepa Berenice-78. do T. cruzi; dai: Dias após a infecção; qPCR: Polymerase Chain Reaction quantitativa.

4.2.3 Parasitemia e sobrevida

Para determinação da curva de parasitemia, 10 camundongos, pertencentes a cada um

dos grupos infectados, foram avaliados diariamente, a partir do 3o dai até a negativação do

exame, por cinco dias consecutivos, segundo a metodologia de Brener (1962) (Figura 4).

Cinco µL de sangue da veia caudal foram analisados diariamente ao microscópio óptico

(aumento de 400x) e a curva de parasitemia plotada, para cada grupo experimental,

empregando a média diária da parasitemia detectada nos animais. Esta foi expressa em

número de tripomastigotas sanguíneos por 0,1mL de sangue. O período pré-patente (PPP),

NI

(n=12)

NI

(n=20)

NI

(n=48)

ETAPA I

I

330 camundongos BALB/c

Abordagens 1 e 2

Abordagens 3

Necropsia (7, 14 e 28 DAI)

Coração e Cólon

Be-78

(n=20)

Be-78 parental

(n=12+10)

Be-78 parental

(n=48)

Be-62

(n=24+10)

Be-78cl2

(n=20)

Be-62

(n=96)

Be-78 isolado

(n=12+10)

Be-78cl1

(n=20)

Be-78 isolado

(n=48)

Fenotipagem de Leucócitos

Mononucleares

Abordagem 3

Citometria de Fluxo

Parasitismo Tecidual(qPCR)

Abordagem 1

PCR Microscopia Óptica

Abordagem 2

Infiltrado Inflamatório

ParasitemiaMortalidade


33

período patente (PP), pico máximo de parasitemia (Pmáx), dia do pico máximo de

parasitemia (DPmáx) também foram definidos.

Período pré-patente (PPP)

O PPP corresponde ao período compreendido entre a inoculação e o primeiro dia de

detecção do parasito no sangue periférico do animal.

Período patente (PP)

O PP corresponde ao período compreendido entre o primeiro dia de exame a fresco

positivo até a completa negativação da parasitemia e foi expresso em dias.

Pico máximo de parasitemia (Pmáx)

O Pmáx corresponde ao máximo de parasitemia e foi expresso em número de

tripomastigotas sanguíneos/0,1 mL de sangue.

Dia do pico máximo de parasitemia (DPmáx)

O DPmáx corresponde ao dia de ocorrência do máximo de parasitemia e foi expresso

em dias.

Além da parasitemia, a taxa de sobrevida foi avaliada nestes mesmos animais,

diariamente, até 42 dias após a infecção sendo a sobrevida registrada e expressa em

porcentagem cumulativa.

Figura 4: Fluxograma representando a distribuição dos animais infectados com diferentes subpopulações do Trypanosoma cruzi utilizados para determinação da curva de parasitemia e da taxa sobrevida. Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai obtido a partir da cepa Be-78 parental, selecionado na ETAPA I; Be-78 parental ( ): animais infectados com a cepa parental Be-78.

30 camundongos BALB/c

Parasitemia e taxa de sobrevida(diariamente)

Be-78 isolado

(n=10)

Be-62

(n=10)

Be-78 parental

(n=10)


34

Abordagens 1 e 2

4.2.4 Necropsia

Para a realização das atividades propostas nas Abordagens 1 e 2, quatro animais de

cada grupo foram eutanasiados, por deslocamento cervical, aos 7, 14 e 28 dai. Durante a

necropsia, amostras de coração in totum e cólon (região retossigmóide) foram coletadas

sendo um fragmento de cada órgão submerso em nitrogênio líquido e posteriormente

armazenado em freezer -80ºC para quantificação do parasitismo tecidual (quantitative-PCR),

enquanto um segundo fragmento foi fixado em solução Metanol 80%-Dimetilsulfóxido

(DMSO) 20% para posterior avaliação, do processo inflamatório (Figura 3).

4.2.5 Carga parasitária no coração e cólon

O parasitismo no coração e cólon foi quantificado por Real-Time PCR (Cummings e

Tarleton, 2003). Essa técnica foi dividida em duas etapas, sendo a primeira constituída pela

extração de DNA e a segunda pela amplificação específica do kDNA do T. cruzi.

Cerca de 20 mg de coração e cólon foram utilizados para obtenção do DNA genômico,

utilizando o kit Wizard Genomic® DNA Purification (Promega, São Paulo, Brasil), seguindo

as recomendações do protocolo do fabricante. Os fragmentos armazenados em freezer -80ºC

foram transferidos para tubos de microcentrífuga de 1,5mL e, para aperfeiçoar o processo de

digestão, foram previamente trituradas com tesoura estéril em 0,25 mL de tampão de lise (Tris

HCl 50mM pH 7,5; EDTA 1mM; 1% N-lauril sarcosina). O processo de digestão foi realizado

com a incubação das amostras em 0,025 mL de Proteinase K (25 mg/ mL) (Sigma, São Paulo,

Brasil) a 37°C por 16 horas. Em seguida, foram adicionados 0,6 mL de Solução de Lise

Nuclear (Nuclear Lysis Solution), e as amostras foram mantidas a 65° C por 15 minutos.

Posteriormente, foram adicionados 0,003 mL de Solução de RNase (RNase Solution) e as

amostras incubadas a 37° C por 15 minutos. Depois de 5 minutos em temperatura ambiente,

as amostras receberam 0,2 mL de Solução de Precipitação Protéica (Protein Precipitations

Solution) e foram vortequizadas vigorosamente. Após 5 minutos no gelo, foram centrifugadas,

a 12.000 x g por 5 minutos, e então, a fase aquosa foi recuperada e recebeu 0,6 mL de

isopropanol gelado (1:1). Os tubos foram invertidos 3x e centrifugados (12.000 x g por 5

minutos). Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e adicionou-se 0,6 mL de etanol

70% v/v gelado (preparado com água livre de DNAse). Depois de centrifugados (12.000 x g


35

por 5 minutos), o sobrenadante foi descartado e os tubos ficaram abertos no fluxo laminar

para secar os resíduos de álcool. O DNA foi hidratado em 0,05 ml de Solução de Re-

hidratação de DNA (DNA Rehidratation Solution) e incubado a 37° C por 2 horas. O controle

de qualidade do DNA foi realizado a partir da quantificação e avaliação do grau de pureza do

mesmo pelo aparelho NanoDrop® (GE Healthcare, São Paulo, Brasil).

Para a determinação da carga parasitária foi utilizada a técnica de PCR em tempo real.

As reações foram realizadas pelo kit SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems,

São Paulo, Brasil) em placas de 96 poços (MicroAmp® Optical 96 Well Reaction Plate –

Applied Biosystems, São Paulo, Brasil) e seladas com adesivo óptico (MicroAmp® Optical

Adhesive Film – Applied Biosystems, São Paulo, Brasil) ao final do procedimento.

Foram pipetados 3 μL de DNA (30 ng) em duplicata e 7 μL de um mix de reação

contendo 2 μL dos iniciadores (na concentração de 2,5 μM) e 5 μL de SYBR® Green Master

Mix, totalizando um volume de reação, em cada poço, de 10 μL. A reação de PCR foi

conduzida conforme programação contida no aparelho ABI 7500 Applied Biosystems; os

valores de baseline foram ajustados para 3-15 ciclos e o threshold foi ajustado à região

associada ao crescimento exponencial do produto da PCR (default).

As análises foram feitas pelo método da quantificação absoluta. O método da

quantificação absoluta baseia-se na comparação com um padrão cujo número de moléculas é

conhecido, e utiliza da equação da reta gerada pela diluição seriada da curva padrão (y=ax+b)

para quantificar a quantidade de DNA do parasita na amostra (x). Os iniciadores para o DNA

de T. cruzi foram desenhados para o gene TCZ (F 5' GCTCTTGCCCACAMGGGTGC 3 ', em

que M = A ou C, e R 5' CCAAGCAGCGGATAGTTCAGG 3'; amplicon de 195 pb) (Moser

et al., 1989; Cummings e Tarleton, 2003).

A curva padrão foi representada por um gráfico de regressão linear semi-log do valor

de Cq (eixo Y) em comparação ao log da quantidade inicial do ácido nucléico (eixo X). Foi

utilizado o DNA de epimastigotas da cepa Y do T. cruzi, na quantidade inicial de 600 pg, em

7 diluições seriadas de 1:10. O slope (inclinação) da curva padrão foi usado para estimar a

eficiência de amplificação (~100%) e o coeficiente de determinação (R2) estabelecido como

adequado foi de 0,98.

Em cada placa foi realizada uma curva padrão para determinar a quantidade de DNA

do parasita nas amostras. Separadamente, reações contendo 50 ng de DNA genômico, 0,5M

de iniciadores específicos para Fator de Necrose Tumoral-TNF murino TNF-5241 F 5’-

TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA-3’ e R 5’


36

AGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC (desenhado por Vector NTI), 10l SYBR™

Green, e água livre de nucleases para um volume final total de 20L, foram utilizadas como

controle endógeno. Além disso, cada reação no termociclador contou com dois controles

negativos que consistiram de uma reação sem adicionar DNA e outra reação com adição

apenas de DNA de tecido não-infectado. Como os resultados apresentados estavam em escala

logarítmica de DNA, foi feita uma conversão da quantidade de DNA encontrada para número

de cópias do parasita. Para tal, considerou-se que um genoma de T. cruzi possui,

aproximadamente, 0,33 pg de DNA (Lanar et al., 1981; Gonzalez et al., 1984; Souza et al.,

2011), efetuando a conversão e expressando os dados na forma de parasitas por mg de tecido.

Os valores corrigidos para cada grupo experimental foram apresentados como média e desvio

padrão. A curva de eficiência foi determinada usando o seguinte cálculo (Stordeur et al.,

2002):

Eficiência (E) = 10(−1/slope)

4.2.6 Intensidade do processo inflamatório no coração e cólon

As amostras de coração e cólon, fixadas em Metanol/DMSO, foram processadas

rotineiramente, incluídas em parafina, e submetidas à microtomia para obtenção de cortes

histológicos com 4m de espessura.

Para avaliação do infiltrado inflamatório, os cortes foram corados pela técnica de

Hematoxilina-Eosina. Após desparafinização em dois banhos de xilol, os cortes foram

hidratados em concentrações decrescentes de álcool (100, 90, 80 e 70%) e então lavados em

água corrente. Em seguida, foram corados pela Hematoxilina, por 10 minutos e lavados em

água corrente, para retirada do excesso do corante. Os cortes foram diferenciados em álcool

acidulado (100 mL de álcool absoluto e 10 gotas de ácido clorídrico) e novamente lavados em

água corrente para evitar acidificação excessiva. Posteriormente, foram corados pela Eosina,

por 30 segundos. Após a última lavagem em água corrente, foram desidratados, em 2 banhos

de álcool absoluto e levados à estufa a 56ºC para secagem e montados com lamínula e

Entellan.

A avaliação semi-quantitativa foi realizada nos tecidos sendo atribuídas as seguintes

classificações: processo inflamatório ausente, discreto, moderado e intenso.


37

Para quantificação do processo inflamatório os núcleos celulares foram quantificados

separadamente na submucosa e muscular, sendo 20 imagens (campos) aleatórias em cada uma

das camadas, totalizando uma área percorrida igual a 1,5 x 106 m2. As imagens foram

visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX

associada ao microscópio Leica DM5000B e todas as imagens foram analisadas com o auxílio

do software de análise e processamento de imagem Leica QwinV3 no Laboratório

Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Ouro Preto. O processo inflamatório foi determinado pela diferença significativa (p<0,05)

entre o número de núcleos celulares presentes nos animais infectados pelo T. cruzi e aquele

observado nos animais não-infectados ± desvio padrão (Caliari, 1997; Maltos et al., 2004;

Ferreira Junior et al., 2015). Os resultados foram demonstrados como média do número de

núcleos detectados nas 20 imagens em uma área de um frame (imagem/janela) igual a

75.183,8m2.

Todas as análises das células inflamatórias foram realizadas apenas nas camadas

musculares (miocárdio e camadas musculares interna e externa do cólon).


38

Abordagem 3

4.2.7 Necropsia

Para a obtenção do número de células necessário à avaliação imunofenotípica por

citometria de fluxo, proposta na Abordagem 3, cada tratamento, referente à subpopulação

infectante do T. cruzi e os diferentes tempos das necropsias, foi composto por 16 animais,

onde pools independentes de macerado de coração ou cólon de quatro camundongos

constituíram um único elemento dentro do tratamento (Figura 5). Dessa forma, 16 animais de

cada grupo foram eutanasiados, por deslocamento cervical, aos 7, 14 e 28 dias após a

infecção sendo procedida a coleta dos órgãos, posteriormente submetidos a protocolos para a

obtenção de suspensões celulares.

Figura 5: Desenho esquemático representando a distribuição de camundongos BALB/c entre os tratamentos/grupos no ensaio por citometria de fluxo.

4.2.8 Perfil fenotípico do processo inflamatório no coração e cólon

As suspensões de células do coração e cólon obtidas em pool (4 animais em cada

pool), conforme observado anteriormente, foram preparadas de acordo com o método

descrito por Cuervo et al. (2011) e Figueiredo et al. (2011). Em ambiente estéril, após a

Elemento 1 Elemento 2 Elemento 3 Elemento 4

Tratamento (ex.: grupo Be-78)

Elem

ento

1

Elem

ento

2

Elem

ento

3

Elem

ento

4

Elem

ento

1

Elem

ento

2

Elem

ento

3

Elem

ento

4

Coração Cólon


39

eutanásia e coleta dos órgãos em meio completo RPMI (5% Soro Fetal Bovino-SFB), as

amostras foram cortadas em fragmentos de 1mm, lavadas em tampão Hank’s Buffered Salt

Solution-HBSS + 5% de SFB + 25mM de HEPES e incubadas em dois banhos de 30 minutos

em solução de pré-digestão em Dithiothreitol-DTT a 1mM à 37º C sob agitação (120rpm).

Após lavagem em tampão HBSS + 5% de SFB + 25mM de HEPES foi procedida a digestão

em duas incubações de 60 minutos cada em solução de colagenase a 0,01% (Collagenase

type II from Clostridium histolyticum) sob agitação (120rpm) e à 37ºC. As suspensões

celulares foram centrifugadas a 1800 rpm por 10 minutos, ressupendidas em 10mL de

solução HBSS + 5% de SFB + 25mM de HEPES e filtradas em um primeiro sistema de

filtros com malha de 100m. Após centrifugação sob as mesmas condições anteriores, as

suspensões celulares foram ressuspendidas em 10mL de solução HBSS + 25mM de HEPES

+ 2mM EDTA e novamente filtradas em um segundo sistema utilizando malha de 40m para

retirada dos debris celulares. Após nova centrifugação, as suspensões celulares

resuspendidas em meio completo RPMI (5% de SFB) foram submetidas à quantificação em

câmara de Neubauer. Alíquotas de 100l de células cardíacas e entéricas (1 x 105células/mL)

foram incubadas na presença de meio de cultura RPMI (5% de SFB) por 12 horas em estufa

de CO2 com 5% de umidade a 37ºC. Os tubos foram retirados da estufa e foi adicionada

Brefeldina A - BFA (10 µg/ml, Sigma) para paralisação da liberação de citocinas mantendo-

as no interior do complexo de Golgi. Após 4 horas de incubação em BFA, as culturas foram

centrifugadas e foram coletados 1mL de sobrenadante de cultura para avaliação de citocinas.

As culturas foram então tratadas com 200μl EDTA (Sigma), numa concentração final de

20mM, e incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente. Este procedimento bloqueia o

processo de ativação posterior das células e garante a obtenção de resultados padronizados.

Posteriormente ao tratamento com EDTA, as células foram lavadas com 3 mL de tampão de

lavagem – PBS-W (0,015M de PBS 1X, 0,5% albumina sérica bovina – BSA e 0,1% de

azida sódica), por centrifugação a 1200 rpm durante 7 minutos a 18ºC. Após a última

lavagem, as células foram ressuspendidas em 2 mL de PBS-W. Em seguida, as amostras

foram incubadas com anticorpos anti-moléculas de superfície (CD45, CD3, CD4, CD8,

CD19 e F4/80 – Figura 6 e Quadro 3) por 30 minutos ao abrigo da luz. As especificações dos

anticorpos, fluorocromos, assim como a titulação padronizada são mostrados no Quadro 3.

Após a etapa da identificação das populações celulares, procedeu-se à lise dos eritrócitos e à

fixação dos leucócitos pelo tratamento com 2mL de solução de lise por 10 minutos à

temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a fixação, as suspensões de leucócitos foram


40

centrifugadas a 1200 rpm durante 7 minutos a 18ºC, os sobrenadantes descartados e as

células permeabilizadas com 2mL de solução permeabilizante – PBS-P (PBS-W e 0,5% de

saponina – Sigma), por 10 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a

permeabilização, as suspensões de leucócitos foram centrifugadas a 1200 rpm durante 7

minutos, o sobrenadante descartado e as células lavadas com 3mL de PBS-W. Após a

ressuspensão das células em PBS-W, procedeu-se à marcação intracitoplasmática em placas

de 96 poços e fundo em “U” (IFN-). Para isso, alíquotas de 30μL das suspensões celulares

previamente marcadas com as combinações de anticorpos anti-superfície CD45CD3CD4 ou

CD45CD3CD8 foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente, ao abrigo da luz na

presença de 20μL da suspensão de anticorpos anti-citocinas conjugados com o fluorocromo

PE (anti-IFN-– Figura 6 e Quadro 3) e previamente diluídos a 1:50 em PBS-P estéril com

10% de soro normal de Rato. Após a incubação, as células foram lavadas com 100μl de PBS-

P e, em seguida, com 200μl de PBS-W. As preparações celulares foram então fixadas em

200μl de solução fixadora e estocadas a 4ºC ao abrigo da luz até a sua leitura no citômetro de

fluxo.

Quadro 3: Especificações dos anticorpos utilizados no ensaio de citometria de fluxo.

Anticorpos (Marca) Fluorocromo

Especificações/Isotipo Clone Titulação

Fenótipo alvo

CD45 (eBioscience)

APC Rat anti-mouse/IgG2b Clone: 30F11

1:10 Pan-

leucocitário

F4/80 (eBioscience)

FITC Rat anti-mouse/IgG2a Clone: BM8

1:10 Macrófagos

CD19 (eBioscience)

FITC Rat anti-mouse/IgG2a Clone: eBIO1D3

1:10 Linfócitos B

CD3 (Biolegend)

FITC Rat anti-mouse/IgG2b Clone: 17A2

1:10 Linfócitos T

CD4 (Biolegend)

PerCp Rat anti-mouse/IgG2a Clone: RM4-5

1:10 Células CD4+

CD8 (Biolegend)

PerCp Rat anti-mouse/IgG2b Clone: 53-6.7

1:10 Células CD8+

IFN- (Serotec)

PE Rat anti-mouse/IgG2b Clone: XMG1.2

1:10 Células

produtoras de IFN-

CD: cluster of differentiation; APC: Aloficocianina; FITC: Isotiocianato de Fluoresceína; PercP: Proteína Clorofila Peridinina; PE: Ficoeritrina; IgG: Imunoglobulina G.


41

Figura 6: Desenho esquemático representando as combinações de anticorpos marcados com fluorocromos utilizadas no ensaio de citometria de fluxo. As cores representam os espectros de emissão dos fluorocromos.

4.2.9 Estratégia de análise do perfil fenotípico do processo inflamatório no coração e cólon

A aquisição de eventos foi realizada no citômetro de fluxo FACScalibur - Becton

Dickinson, utilizando o programa CELLQuestTMPro. As células das suspensões celulares de

coração (20.000 eventos) e cólon (100.000 eventos) foram adquiridas em escala linear e

inicialmente identificadas pelos parâmetros tamanho da célula (dispersão para frente [FSC]) e

complexidade interna (dispersão lateral [SSC]). A seleção das populações de células

leucocitárias foi baseada na utilização de marcadores de linhagem e análise multiparamétrica

com combinações de regiões em gráficos bidimensionais de distribuição pontual

(Pseudocolor “Large Dot”).

A análise dos dados foi realizada utilizando o software de análise de dados de

citometria de fluxo FlowJo X. Os resultados foram expressos como frequência (%) das

populações de macrófagos, de linfócitos B e das subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+

em relação às células com fenótipo CD45+. Além disso, foi analisado o perfil funcional

linfócitos T CD4+ e CD8+ em relação à expressão de IFN-, também determinado como

frequência em relação às células com fenótipo CD45+.

A Figura 7 representa a distribuição da população, em gráficos bidimensionais de

distribuição pontual com as diferentes combinações, nas suspensões celulares de coração e

cólon em tubo controle “Cel” (onde não foram adicionados anticorpos). Os controles

negativos foram utilizados para determinar a localização do gates utilizados para identificar

as populações positivas para cada fenótipo, sendo os limites aplicados como cut-off, as

regiões que abrangiam população negativa inferior a 1%.

CD

45-A

PC

CD

4-P

erc

P

CD

45-A

PC

IFN

g-P

E

IFN

g-P

E

CD

8-P

erc

P

Cel

Co

ntr

ole

d

e Is

oti

po

CD

3-F

TIC

CD

3-F

TIC

CD

45-A

PC

CD

19

CD

45-A

PC

F4/8

0-F

ITC


42

Figura 7: Representação da estratégia de análise da frequência de células inflamatórias com distintos fenótipos em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi: (A) Gráfico de distribuição pontual Tamanho (FSC) versus Granulosidade (SSC) demonstrando o padrão de distribuição da população nas suspensões celulares de coração e cólon (B) Gráfico de distribuição pontual FL4 versus Granulosidade (SSC) no tubo controle demonstrando ausência de fluorescência; (C) Gráfico de distribuição pontual FL1 (CD3 FITC) versus SSC no tubo controle demonstrando ausência de fluorescência; (D) Gráfico de distribuição pontual FSC versus FL3 no tubo controle demonstrando ausência de fluorescência; E) Gráfico de distribuição pontual FSC versus FL2 no tubo controle demonstrando ausência de fluorescência.

A subpopulação de leucócitos foi identificada aplicando os parâmetros expressão

característica do antígeno pan-leucocitário CD45 (SSC / FL4) e SSC, onde a região

inicialmente selecionada foi constituída das populações positivas “low” e “high” para o

marcador CD45 e granulosidade inferior a 500 (Figura 8A, 9A e 10A). A seleção dessa

subpopulação foi comum à análise de todos os fenótipos avaliados (Macrófagos, Linfócitos B,

Linfócitos T CD4+IFN-+, Linfócitos T Linfócitos T CD8+IFN-+).

Para determinação da frequência de macrófagos (Figura 8B) e linfócitos B (Figura

9B), as subpopulações de interesse foram selecionadas a partir da análise combinada F4/80

FITC / SSC (FL1 / SSC) ou CD19 FITC / SSC (FL1 / SSC), respectivamente.

CORAÇÃO

CÓLON

A) B) C) D) E)

A) B) C) D) E)


43

Figura 8: Representação da estratégia de análise da frequência de macrófagos em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi: (A) Gráfico de distribuição pontual FL4 (CD45 APC) versus Granulosidade (CSC) utilizado para a seleção da população de leucócitos – R1 (CD45). (B) Gráfico de distribuição pontual FL1 (F4/80 FITC) versus SSC demonstrando a frequência da população de macrófagos (F4/80+).

Figura 9: Representação da estratégia de análise da frequência de linfócitos B em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi: (A) Gráfico de distribuição pontual FL4 (CD45 APC) versus Granulosidade (CSC) utilizado para a seleção da população de leucócitos – R1 (CD45). (B) Gráfico de distribuição pontual FL1 (CD19 FITC) versus SSC demonstrando a frequência da população de linfócitos B (CD19+).

A) B)

CORAÇÃO

CÓLON A) B)

A) B)

CORAÇÃO

CÓLON

A) B)


44

As células com fenótipo de Linfócitos T foram definidas pela presença de expressão

simultânea de CD45 APC e CD3 FITC, e a subpopulação foi selecionada em um gráfico de

distribuição pontual CD3 FITC / SSC (FL1 / SSC) (Figura 10B). As frequências dos

linfócitos T CD4+ e CD8+ foram ainda quantificadas em uma terceira combinação FSC /

CD4+ PercP (FSC / FL3) ou FSC / CD8+ PercP (FSC / FL3), respectivamente (Figura 10C).

Para avaliação funcional de linfócitos T CD4+ e CD8+, uma quarta população foi selecionada

baseada na expressão do marcador intracelular IFN-, utilizando as combinações FSC / IFN-

PE/ (FSC / FL2) (Figura 10D).

Figura 10: Representação da estratégia de análise da frequência de linfócitos T CD4+ ou CD8+, expressando IFN- em suspensão de células do coração ou cólon de camundongos infectados com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi: (A) Gráfico de distribuição pontual FL4 (CD45 APC) versus Granulosidade (SSC) utilizado para a seleção da população de leucócitos – R1 (CD45); (B) Gráfico de distribuição pontual FL1 (CD3 FITC) versus SSC selecionando a população de interesse linfócitos T (CD3+); (C) Gráfico de distribuição pontual Tamanho (FSC) versus FL3 (CD4 PercP) demonstrando a frequência de linfócitos T CD4+; C) Gráfico de distribuição pontual FSC versus FL2 (IFN- PE) demonstrando a frequência de linfócitos T CD4+ IFN-+.

A) B) C) D)

A) B) C) D)

CORAÇÃO

CÓLON


45

4.3 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas com o apoio instrumental do software

GraphPad Prism 4.03 (Prism Software, Irvine, CA, USA). Em todos os casos, as diferenças

foram consideradas significativas quando valores de p foram inferiores a 0,05 (p<0,05).

Todos os dados foram submetidos à testes de normalidade, e, com exceção da análise

da AUC para os dados de parasitemia, todos os demais dados demonstraram-se não

paramétricos e testes adequados foram utilizados para determinar as diferenças estatísticas.

Para avaliação dos perfis de crescimento em meio de cultura axênico, foi considerada

a análise da área sob a curva (area under the curve-AUC) através do teste de análise de

variância Kruskal-Wallis, para dados não paramétricos. Quando as alterações foram

significativas, o pós-teste de Dunns foi realizado para determinar as diferenças específicas

entre as medianas referentes às diferentes subpopulações do T. cruzi em comparação às cepas

de referência usadas neste trabalho, Be-62 e Be-78 parental.

Em relação ao ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero, considerando as

subpopulações do parasito utilizadas na infecção e os tempos de incubação avaliados, as

diferenças significativas foram determinadas usando análise de variância, ANOVA two-way.

Diferenças significativas entre as médias referentes às diferentes subpopulações do T. cruzi

em comparação às cepas de referência, Be-62 e Be-78 parental, foram determinadas pelo pós-

teste de Bonferroni.

A área sob a curva (AUC) utilizada para comparar o perfil de parasitemia entre os

grupos infectados, cujos dados foram considerados paramétricos, foi submetida à análise

estatística utilizando o teste de análise de variância ANOVA One-way, e pós-teste de Tukey.

Para comparação da carga parasitária, da intensidade e do perfil imunofenotípico das

células inflamatórias no coração e cólon entre os diferentes grupos experimentais,

considerando tanto as subpopulações do T. cruzi quanto os diferentes tempos avaliados, foi

utilizado o teste de análise de variância ANOVA Two-way. Quando as alterações foram

significativas, o pós-teste de Bonferroni foi realizado para determinar as diferenças

específicas entre as médias referentes às diferentes subpopulações do T. cruzi.

46

5. RESULTADOS

Nogueira-Paiva, NC Resultados

47

ETAPA I 5.1 Hemoculturas

Para investigar potenciais diferenças em relação à virulência e patogenicidade de

diferentes subpopulações presentes no inóculo de uma cepa policlonal/mista do T. cruzi,

comum na infecção natural, este trabalho propôs obter, caracterizar e selecionar isolados com

comportamento, in vitro, distinto da cepa Be-78 parental e posteriormente, avaliar, in vivo, a

resposta inflamatória no coração e cólon ao longo da fase aguda da DCh experimental.

Camundongos Swiss infectados com 5x103 tripomastigotas sanguíneas, via

intraperitoneal, da cepa Be-78 do T. cruzi foram submetidos à coleta de sangue para

hemoculturas aos 3, 6 e 12 mai e as populações do parasito obtidas foram mantidas em

crescimento exponencial em meio LIT suplementado com 10% de SFB. A Tabela 1

representa os resultados das hemoculturas realizadas nos diferentes tempos de coleta. Embora

nem todos os animais tenham apresentado hemocultura positiva, foi possível isolar parasitos

em todos os tempos de coleta, ao longo de um ano de infecção, provavelmente devido às

diferenças na interação parasito-hospedeiro que permitiram ou não a manutenção de

parasitemia patente. Reforçando essa hipótese, alguns animais apresentaram positividade em

mais de um tempo (animais 1, 2, 5 e 15), entretanto, outros não foram positivos em nenhuma

das hemoculturas. Ao longo dos 12 meses de avaliação, houve perda de sete animais. Os

isolados obtidos nos diferentes tempos receberam um código de identificação demonstrado na

Tabela 2.


48

Tabela 1: Avaliação das hemoculturas realizadas aos 3, 6 e 12 meses após a infecção (mai) de camundongos Swiss com a cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi.

Animais Hemoculturas

3MAI 6MAI 12MAI

1 - + +

2 - + +*

3 - - -

4 - - +*

5 + + -

6 - - -

7 - - -

8 - - -

9 - - -

10 - - -

11 - - -

12 - - -

13 - - +*

14 - - na

15 - + +

16 - na na

17 - - -

18 - na na

19 - - na

20 - - na

21 + na na

22 - - -

23 - na na

24 - - -

(na): não avaliado; (+) hemocultura positiva; (-) hemocultura negativa; (*) crescimento insuficiente em meio LIT.


49

Tabela 2: Código dos isolados obtidos a partir de hemoculturas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi.

Hemocultura Animal Código

3mai 5 Be-78is5-3mai

21 Be-78is21-3mai

6mai

1 Be-78is1-6mai

2 Be-78is2-6mai

5 Be-78is5-6mai

15 Be-78is15-6mai

12mai 1 Be-78is1-12mai

15 Be-78is15-12mai

Be-78: Berenice-78; is: isolado; mai: meses após a infecção;

5.2 Curva de crescimento em meio de cultura acelular

Um dos parâmetros utilizados para identificar potenciais diferenças entre os isolados

obtidos foi a determinação do perfil de crescimento de formas epimastigotas cultivadas em

meio de cultura acelular, durante 20 dias após o inóculo de 107 parasitos/mL de cultura de

cada isolado, obtido nas hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 mai com a cepa Be-78 (cepa

Be-78 parental) do T. cruzi (Figura 11). Os perfis de crescimento dos isolados estão

apresentados em comparação à amostra da cepa Be-78 utilizada no inóculo (parental) e à cepa

Be-62.

Foi possível observar diferença significativa na área sob a curva (Area Under the

Curve-AUC) entre as duas cepas utilizadas como referência, com a cepa Be-78 (5,3x108)

parental apresentando maior número de parasitos que a cepa Be-62 (3,7x108). Além disso, os

isolados Be-78is15-6mai (4,2x108) e Be-78is1-12mai (4,2x108) apresentaram redução

significativa da AUC em relação à cepa Be-78 utilizada no inóculo (5,3x108), indicando que

essas duas subpopulações apresentam capacidade reduzida de crescimento em meio de cultura

em relação à cepa parental. O crescimento em meio de cultura simula o comportamento das

formas epimastigotas no intestino do hospedeiro invertebrado e, sendo assim, esses dados


50

podem refletir em uma habilidade reduzida de multiplicação dessas subpopulações, com

potenciais implicações sobre o sucesso da infecção vetorial (Figura 11).

Além da diferença na AUC, foi confirmado o comportamento diferenciado entre as

cepas Be-62 e Be-78 em culturas axênicas, evidenciando um crescimento com pico superior e

precoce e rápida entrada em fase de declínio, para a cepa Be-62, em comparação com a cepa

Be-78 (Figura 11).

Ao comparar as diferentes etapas de crescimento (Fase Lag, Log, Estacionária e de

Declínio) entre as subpopulações do parasito, independente da AUC, foi verificado que alguns

isolados, aqueles coletados 3mai (Be-78is5-3mai e Be-78is21-3mai), apresentaram perfil da

curva intermediário entre as cepa Be-62 e Be-78 parental (Figura 11), enquanto os demais

mostraram curvas mais próximas àquela exibida pela cepa Be-78 parental. Este dado

evidencia a presença, na população constituinte da cepa Be-78, de pelo menos uma

subpopulação que compartilha características biológicas com a cepa Be-62.

Considerando os distintos perfis de crescimento das formas epimastigotas observados

para as subpopulações avaliadas, a próxima pergunta desse trabalho refere-se ao

comportamento, em meio celular, para compreender como determinadas populações do

parasito comportam-se sob diferentes pressões ambientais.


51

Figura 11: Cinética de crescimento de epimastigotas, cultivadas em meio LIT no período de 0-20 dias, de isolados do parasito obtidos a partir de hemoculturas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi. O eixo Y representa o número médio de parasitos x 107/mL quantificados em triplicata e o eixo X representa os dias de cultivo. As curvas de crescimento dos isolados são apresentadas em comparação às curvas da cepa utilizada no inóculo (Berenice-78) e da cepa Berenice-62. Be-62; Be-78 utilizada no inóculo (Be-78 parental); Be-78is5-3mai; Be-78is21-3mai; Be-78is1-6mai; Be-78is2-6mai; Be-78is5-6mai; Be-78is15-6mai; Be-78is1-12mai; Be-78is15-12mai. a: diferença significativa na Área sob a Curva (AUC) em relação à cepa Be-62; b: diferença significativa na AUC em relação à cepa parental Be-78. Os dados representam as medianas de triplicatas.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112131415161718192021220.0

2.0×10 07

4.0×10 07

6.0×10 07

8.0×10 07

1.0×10 08

Nú

mer

o d

e p

aras

itos

x10

7 /m

L d

e cu

ltura

Dias de cultivo

2

6

10

0

Be-78is5-3mai Be-78is21-3mai




4

8

2

6

10

0

4

8

2

6

10

0

4

8

2

6

10

0

4

8

a

b

a

a

b


52

5.3 Perfis de infectividade e desenvolvimento in vitro

Para avaliar o comportamento em meio celular, os isolados foram submetidos à

avaliação dos perfis de infectividade e multiplicação em cultura de células Vero após 24, 48 e

72 horas de incubação.

A Figura 12 representa as taxas de infecção e desenvolvimento in vitro ao longo das

72 horas avaliadas. Todas as subpopulações foram observadas parasitando células Vero após

24 horas de incubação. De forma geral, as taxas de infectividade duplicaram a partir de 48

horas após o inóculo, correspondendo ao período de multiplicação do parasito no interior da

célula hospedeira. Em contrapartida, o isolado Be-78is2-6mai apresentou perfis de

infectividade e desenvolvimento intracelular três vezes superior às demais subpopulações já

no tempo de 24 horas, mantendo-se estável nos demais tempos avaliados. Entre 48 e 72 horas

após a incubação, as taxas de infectividade e multiplicação das subpopulações avaliadas

permaneceram estáveis, com exceção do aumento na taxa de desenvolvimento intracelular

observado para a cepa parental, sugerindo um comportamento mais lento em cultura de

células. Todas as outras subpopulações apresentaram perfil ascendente em relação ao número

de células infectadas, variando as taxas de multiplicação ao longo do tempo.

As Figuras 13 e 14 representam as taxas de infecção e desenvolvimento in vitro das

diferentes subpopulações avaliadas em comparação às cepas utilizadas como referência neste

trabalho, cepa Be-78 parental e Be-62, em cada tempo avaliado. A cepa Be-62 e os isolados

Be-78is5-3mai e Be-78is21-3mai foram capazes de parasitar mais células em relação à cepa

Be-78, 48 horas após o inóculo, no entanto, o número de amastigotas por célula infectada foi

semelhante entre as duas cepas de referência, refletindo, nesse momento, habilidade infectiva

inferior para a cepa parental. Após 72h de incubação, embora não haja diferença entre o

número de células infectadas, a taxa de multiplicação das formas amastigotas da cepa Be-78

foi superior à observada para a cepa Be-62 (p<0,001) e para as subpopulações isoladas aos

3mai (p<0,05). Esses dados mostram que a cepa Be-62 apresenta aumento precoce da

infectividade, em contrapartida, à maior capacidade replicativa in vitro da cepa Be-78 e à um

perfil de infectividade e desenvolvimento intracelular mais lento. Além disso, o

comportamento em cultura celular descrito para os isolados Be-78is5-3mai e Be-78is21-3mai

sugerem, de forma aditiva à curva de crescimento, mais uma semelhança entre esses isolados

e a cepa Be-62.

O isolado Be-78is2-6mai apresentou maior taxa de infectividade que as cepas Be-62

(p<0,001) e Be-78 (p<0,001) já no tempo de 24h, mantendo-se estável ao longo das 72 horas


53

avaliadas. O número de amastigotas foi maior em comparação às duas cepas de referência

(Be-62 e Be-78) nos tempos de 24 e 48h e, embora a contagem de formas intracelulares por

célula infectada não tenha sido diferente nesses dois tempos, o maior número de células

infectadas observado para este isolado permite que este seja considerado como portador de

um perfil de infectividade rápido e eficiente. Setenta e duas horas após o inóculo, o número de

amastigotas por célula infectada do isolado Be-78is2-6mai tornou-se inferior ao observado

para Be-78. Essa redução reflete o aumento da taxa de multiplicação das formas intracelulares

da cepa Be-78 observada neste tempo, no entanto, a taxa de infecção superior mantida pelo

isolado Be-78is2-6mai, reafirma o sucesso dessa subpopulação em desenvolver-se e invadir

novas células do tecido hospedeiro. Este comportamento parece ser resultado de uma seleção

exercida pela pressão do sistema imune do hospedeiro vertebrado (camundongo da linhagem

Swiss), capaz de favorecer a prevalência de uma subpopulação mais infectiva.

Os demais isolados não apresentaram alteração significativa no perfil de infectividade

em comparação às cepas Be-78 parental e Be-62, e ainda, mantiveram o número de

amastigotas por célula infectada inferior a estas cepas em todos os tempos avaliados, sendo

considerados isolados com baixas taxas de replicação. Uma exceção, entretanto, é o aumento

na taxa de desenvolvimento intracelular, observada 48 horas após o inóculo, para o isolado

Be-78is15-12mai em comparação à Be-78 parental e Be-62, demonstrando um pico de

proliferação precoce em relação à Be-78 parental e uma maior capacidade replicativa

comparada à Be-62. É importante ressaltar que esse isolado apresenta uma curva de

crescimento em meio acelular significativamente menor que a observada para a cepa Be-78

parental, ressaltando as especificidades comportamentais frente a diferentes pressões

ambientais.


54

0

5

10

15

0

200

400

600

0

20

40

60

80

100

Amostras/Tempo de cultura (horas)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s in

fect

adas

/100

cé

lula

s

Nú

mer

o d

e am

asti

go

tas

Nú

mer

o d

e am

asti

go

tas/

Cél

ula

s in

fect

adas

A)

B)

C)

*

*

**

** * * *

*

*

#

*#

24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72 24 48 72

*

*

*#

*#

Figura 12: Ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero usando as cepas Berenice-62 ( ), Berenice-78 (parental, ) e subpopulações/isolados da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, obtidos em hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa parental (Be-78is5-3mai ; Be-78is21-3mai ; Be-78is1-6mai ; Be-78is2-6mai ; Be-78is5-6mai ; Be-78is15-6mai ; Be-78is1-12mai ; Be-78is15-12mai ). Após 18 horas de exposição ao parasito, as células foram lavadas para eliminar parasitos extracelulares e mantidas em meio até a coleta, fixação e coloração 24 (barra sólida, ), 48 (barra tracejada, ) ou 72 horas (barra pontilhada, ) após o inóculo. A) Número de células infectadas em 100 células contadas; B) Número de amastigotas intracelulares em 100 células contadas; C) Número de parasitos intracelulares por célula infectada. *: diferença significativa em relação à cultura de 24horas; #: diferença significativa em relação à cultura de 48horas. Os dados representam as médias de triplicatas ± erro padrão.


55

Amostras/Tempo de cultura (horas)

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

0

200

400

600

0

200

400

600

0

200

400

600

0

5

10

15

0

5

10

15

0

5

10

15

Nú

mer

o d

e am

asti

go

tas

Nú

mer

o d

e am

asti

go

tas/

Cél

ula

s in

fect

adas

24h 48h 72h

a, b

b b b

ba, b

a, b

b

a, b

a, b

bb

b b b b b

a, b

a, b

b bb

b b bb

b b

a aa

a

a

a

a

A)

B)

C)

Nú

mer

o d

e cé

lula

s in

fect

adas

/100

cé

lula

s

Figura 13: Ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero usando as cepas Berenice-62 ( ), Berenice-78 (parental, ) e subpopulações/isolados da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, obtidos em hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa parental (Be-78is5-3mai ; Be-78is21-3mai ; Be-78is1-6mai ; Be-78is2-6mai ; Be-78is5-6mai ; Be-78is15-6mai ; Be-78is1-12mai ; Be-78is15-12mai ). Após 18 horas de exposição ao parasito, as células foram lavadas para eliminar parasitos extracelulares e mantidas em meio até a coleta, fixação e coloração 24, 48 ou 72 horas após o inóculo. A) Número de células infectadas em 100 células contadas; B) Número de amastigotas intracelulares em 100 células contadas; C) Número de parasitos intracelulares por célula infectada. a: diferença significativa em relação à cepa Be-62; b: diferença significativa em relação à cepa parental Be-78. Os dados representam as médias de triplicatas ± erro padrão.


56

Figura 14: Fotomicrografias representativas do ensaio de infecção in vitro em culturas de células Vero com as cepas Berenice-62, Berenice-78 parental e subpopulações/isolados da cepa Berenice-78 do Trypanosoma cruzi, obtidos em hemoculturas realizadas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com a cepa parental. Após 18 horas de exposição ao parasito, as células foram lavadas para eliminar parasitos extracelulares e mantidas em meio até a coleta, fixação e coloração aos 24, 48 ou 72 horas após o inóculo. Aumento da taxa de infectividade 48h após a incubação para a cepa Be-62 (a, b, c) e para o isolado Be-78is5-3mai (g, h, i); Aumento na taxa de multiplicação intracelular no tempo de 72h para a cepa Be-78 parental (d, e, f); Perfil de infectividade e desenvolvimento intracelular superior para o isolado Be-78is2-6mai (j, k. l) e inferior para Be-78is14-12mai (m, n, o). Panótico rápido. Barra=25m.

Be-62 Be-78 parental Be-78is5-3mai Be-78is2-6mai Be-78is15-12mai

24h

48h

72h

a d g j m

b e h k n

c f i l o


57

5.4 Perfil de assinatura gênica

Para determinar se a pressão ambiental, exercida pelo sistema imune do hospedeiro

vertebrado durante a infecção crônica, foi capaz de selecionar isolados, não apenas com perfis

biológicos específicos, mas também geneticamente distintos, as subpopulações avaliadas

neste estudo foram submetidas à caracterização molecular por LSSP-PCR. A vantagem da

utilização dessa técnica refere-se à possibilidade de comparar os perfis gênicos dos isolados

obtidos na ETAPA I, aos perfis gênicos das subpopulações encontradas, parasitando os

diferentes órgãos, na infecção in vivo pela cepa Be-78 parental. Essa avaliação, juntamente

com a caracterização das lesões histológicas, permitirá esclarecer um pouco mais os aspectos

propostos pelo modelo histotrópico clonal, comparando possíveis especificidades

comportamentais, relacionadas ao histotropismo e à patogenicidade.

Foi possível confirmar os dados da literatura em relação à diferença genética entre as

amostras do parasito isoladas da paciente Berenice, com 16 anos de intervalo entre as coletas,

Be-62 e Be-78, adicionando padrões distintos de assinatura gênica, aos já descritos diferentes

perfis de isoenzimas, RAPD e microssatélites (Figura 15). Em relação às subpopulações da

cepa Be-78, obtidas por hemocultura em diferentes tempos durante a fase crônica, pode-se

observar que o isolado Be-78is5-3mai apresentou um perfil com bandas comuns tanto à cepa

Be-78 parental quanto à cepa Be-62. Essa banda, localizada próxima à região de 100pb,

inaparente no perfil gênico da cepa parental, foi visível no padrão de bandas da cepa Be-62

(Figura 15). Embora menos expressiva, essa banda também foi aparente nos isolados Be-

78is1-6mai e Be-78is5-6mai, revelando alguma similaridade entre essas amostras e a/as

subpopulações constituintes da cepa Be-62, no entanto, a presença de um perfil variado entre

as duplicatas pode ser explicada pelo fato de que os isolados não foram obtidos por

metodologia de clonagem e portanto podem ser formados por mais de uma subpopulação

(Figura 15).

De forma interessante, o isolados Be-78is5-3mai, que apresentou uma banda comum à

cepa Be-62 (Figura 15), mostrou comportamento em meios de cultura mais próximo à cepa

Be-62 do que o observado para a cepa Be-78 parental. Em contrapartida, o isolado Be-78is2-

6mai, que apresentou taxas de multiplicação e desenvolvimento in vitro significativamente

superiores à cepa Be-78 parental, foi geneticamente similar, pela técnica de LSSP-PCR, à

amostra do inóculo parental (Figuras 12, 13, 14 e 15), mostrando que mudanças no

comportamento biológico não necessariamente refletem variações genéticas.


58

Oito bandas obtidas na análise do perfil de assinatura gênica por LSSP-PCR foram

usadas para construção do fenograma a partir de UPGMA (Unweighted Pair Group Method

using Arithmetic averages). A escolha das bandas foi baseada em sua resolução,

reprodutibilidade entre as duplicatas e intensidade. O fenograma mostrou dois grupos

distintos (Figura 16), o grupo I, incluindo a cepa Be-78 parental e os isolados obtidos, em

diferentes tempos, ao longo da fase crônica experimental (Be-78is5-3mai, Be-78is21-3mai,

Be-78is1-6mai, Be-78is2-6mai, Be-78is5-6mai, Be-78is15-6mai, Be-78is1-12mai e Be-

78is15-12mai) e, o grupo II, compreendendo a cepa Be-62. No grupo I, as subpopulações da

cepa Be-78 subdividiram-se em dois grupos, sendo o isolado Be-78is5-3mai, o único a

distanciar-se da cepa parental. Os demais isolados formaram um grupo correlacionado

geneticamente com a cepa parental (Figura 16).

A análise do perfil de LSSP-PCR demonstrou a ocorrência de quatro bandas

compartilhadas entre a amostra Be-78 parental e o isolado Be-78is5-3mai, enquanto o número

de bandas compartilhadas entre a cepa Be-62 e o isolado Be-78is5-3mai foi igual a três. De

forma interessante, a cepa Be-78 parental compartilhou apenas 2 bandas com a cepa Be-62.

Estes dados indicam que o isolado Be-78is5-3mai é geneticamente mais próximo à cepa Be-

78 parental que à cepa Be-62, entretanto, a distância ente este isolado e a cepa Be-62 é menor

que a distância genética entre a cepa Be-78 parental e a cepa Be-62.

A próxima etapa do trabalho propõe investigar, in vivo, a influência do polimorfismo

observado para a cepa Be-78, utilizando a amostra parental e um isolado com variação no

perfil biológico e/ou molecular. De acordo com os resultados apresentados, os isolados Be-

78is5-3mai, Be-78is2-6mai e Be-78is15-12mai representam diferenças em nível biológico

e/ou molecular em relação à cepa parental, mostrando-se como potenciais candidatos a

avaliação de possíveis especificidade no comportamento in vivo (Tabela 3).

Nogueira-Paiva, NC _____________________________ _________ _Resultados

59

Figura 15: Assinaturas gênicas do fragmento de 330pb da região do minicírculo do kDNA reveladas em gel de poliacrilamida a 8% corado pela prata. Peso molecular (PM) de 100pb na canaleta 1 e demais canaletas referentes aos perfis gênicos dos isolados obtidos a partir de hemoculturas aos 3, 6 ou 12 meses após a infecção de camundongos Swiss com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi em comparação à cepa Be-78 parental e à cepa Be-62. Be-62 (2-3); Be-78 parental (4-5); Be-78is5-3mai (6-7); Be-78is21-3mai (8-9); Be-78is1-6mai (10-11); Be-78is2-6mai (12-13); Be-78is5-6mai (14-15); Be-78is15-6mai (16-17); Be-78is1-12mai (18-19); Be-78is15-12mai (20-21); Cabeças de setas indicam as bandas, compartilhadas entre o isolado Be-78is5-3mai e as cepas de referência, Be-62 e Be-78 parental.

Be-

78is

53m

ai

Be-

78is

213m

ai

Be-

78is

16m

ai

Be-

78is

26m

ai

Be-

78is

56m

ai

Be-

78is

156m

ai

Be-

78is

112

mai

Be-

78is

1512

mai

PM

Be-

62

Be-

78

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

100pb

200pb

300pb

400pb500pb

1000pb

Nogueira-Paiva, NC ___________ _______Resultados

60

Be-78is1-12mai

Be-78is15-12mai

Be-78is5-6mai

Be-78is15-6mai

Be-78

Be-78is21-3mai

Be-78is1-6mai

Be-78is2-6mai

Be-78is5-3mai

Be-62

Figura 16: Fenograma construído a partir de UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages) resultante das análises dos perfis de assinatura gênica obtido por LSSP-PCR de isolados obtidos a partir de hemoculturas aos 3 (Be-78is5-3mai; Be-78is21-3mai) , 6 (Be-78is1-6mai; Be-78is2-6mai; Be-78is5-6mai; Be-78is15-6mai) ou 12 (Be-78is1-12mai; Be-78is15-12mai) meses após a infecção de camundongos Swiss com 5x103 formas tripomastigotas sanguíneas da cepa Be-78 do Trypanosoma cruzi em comparação à cepa Be-78 parental e à cepa Be-62.


61

5.5 Representação esquemática do perfil in vitro e da caracterização gênica dos isolados

da cepa Be-78 parental (ETAPA I)

Foi possível identificar isolados com comportamento em cultura acelular ou celular, e

perfis de assinatura gênica, distintos do observado para a cepa Be-78 parental. Em alguns

casos, os isolados mostraram certo grau de semelhança com a cepa Be-62, isolada da paciente

Berenice, em fase crônica tardia, 16 anos antes do xenodiagnóstico que originou a cepa Be-

78.

Tabela 3: Resumo dos resultados obtidos na ETAPA I, comparando todos os parâmetros avaliados entre os isolados e as cepas Be-78 parental e Be-62 do Trypanosoma cruzi. pb: pares de base.

Subpopulação do T. cruzi

Curva de Crescimento

(meio de cultura acelular)

Infectividade e desenvolvimento intracelular

(meio de cultura celular)

Perfil LSSP-PCR

Be-62 precoce/rápido infectividade precoce (48h)

menor taxa de multiplicação

Be-78 parental tardio/lento infectividade tardia (72)

maior taxa de multiplicação

Be-78is5-3mai precoce/rápido infectividade precoce (48h)


Be-78is21-3mai precoce/rápido infectividade precoce (48h)

taxa de multiplicação intermediária

Be-78is1-6mai tardio/lento infectividade precoce (48)


Be-78is2-6mai tardio/lento infectividade precoce (24h)

maior taxa de multiplicação

Be-78is5-6mai tardio/lento infectividade baixa


Be-78is15-6mai menos replicativo infectividade baixa


Be-78is1-12mai tardio/lento infectividade baixa


Be-78is15-12mai menos replicativo infectividade baixa


100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb

100pb

200pb


62

ETAPA II

5.6 Parasitemia e sobrevida

Para avaliar se o comportamento in vitro do isolado selecionado na ETAPA I (Be-

78is5-3mai) seria reproduzido in vivo em comparação com as cepas de referência utilizadas

nesse trabalho, Be-62 e Be-78 parental do T. cruzi, camundongos BALB/c foram infectados

individualmente com essas subpopulações do T. cruzi e acompanhados ao longo da fase aguda

da infecção.

As curvas de parasitemia estão representadas na Figura 17, e os dados referentes ao

período pré-patente, período patente, dia e pico máximo de parasitemia estão demonstrados na

Tabela 4. Foi possível observar um perfil diferenciado entre as três subpopulações estudadas

já em relação à curva de parasitemia. Não houve diferença significativa no período pré-

patente referente aos diferentes grupos infectados, sendo observados parasitos no sangue

periférico cerca de 4 a 5 dias após o inóculo. A cepa Be-62 apresentou PP de 25 dias enquanto

animais infectados com a cepa Be-78 parental ou com o isolado Be-78is apresentaram

parasitos circulantes por 49 ou 35 de avaliação, respectivamente. O dia do pico de parasitemia

foi precoce (9 dai) e o número de parasitos observados nesse dia foi significativamente

superior nos animais infectados com a cepa Be-62 em relação aos demais grupos infectados.

Ainda em relação ao pico de parasitemia, na curva referente ao isolado Be-78is foi observado

pico máximo no 15º dai, ocorrendo com quatro dias de antecedência em relação do DPmáx

para a cepa Be-78 parental (19º dai). Embora precoce, o número máximo de parasitos

demonstrado pelo grupo Be-78is foi significativamente inferior ao observado para o grupo

infectado com a cepa parental (Tabela 4). A média da área sob a curva de parasitemia (AUC)

dos animais infectados com a cepa Be-62 (3,1 x106) foi significativamente superior àquela

observada para animais infectados com a cepa Be-78 parental (2,1 x106) ou mesmo com o

isolado Be-78is (0,71 x106) (Figura 17). Comparando a infecção com a cepa parental (Be-78

parental) à infecção com o isolado (Be-78 isolado), pôde-se notar que o isolado apresentou

AUC significativamente inferior (Figura 17).


63

Tabela 4: Determinação dos períodos pré-patente e patente, dia e pico máximo de parasitemia e área sob a curva nos animais infectados com as cepas Be-62, Be-78 ou isolado Be-78is5-3mai do Trypanosoma cruzi.

PPP PP DPmáx Pmáx AUC

Be-62 4 25 9 1.151.455 ±

424.241

3.089.682 ±

674.745

Be-78 isolado 5 49 15 75.000 ±

66.957 a, b

715.650 ±

377.948 a, b

Be-78

parental 5 38 19

173.455 ±

54.149 a

2.136.545 ±

464.028 a

a: diferença significativa em relação à Be-62; b: diferença significativa em relação à Be-78; PPP (Período pré-patente), PP (Período Patente), DPmáx (Dia do Pico máximo de parasitemia) expressos em dias; Pmáx (Pico máximo de parasitemia) expresso em número de tripomastigotas sanguíneos/0,1mL de sangue

Figura 17: Curvas de parasitemia de camundongos BALB/c infectados com o isolado Be-78is5-3mai ( ), ou com as cepas de referência Berenice-62 ( ) e Berenice-78 parental ( ) do Trypanosoma cruzi. Cada curva representa a média de 10 animais. a: diferença significativa na Área sob a Curva (AUC) em relação à cepa Be-62; b: diferença significativa na AUC em relação à cepa parental Be-78.

As taxas de sobrevida dos animais infectados com as cepas Be-62 e Be-78 do T. cruzi

estão apresentadas na Figura 18. Os animais infectados com a cepa Be-62 apresentaram

mortalidade a partir do 16º dai, sendo que, ao final de 28 dias, a taxa de mortalidade alcançou

90%. Animais infectados com o isolado ou com a cepa Be-78 parental apresentaram taxa de

sobrevida de 100% até o final da avaliação.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000600000.0

1200000.0

Dias após a infecção

Tri

po

mas

tig

ota

s/0,

1mL

de

san

gu

e

a

a, b


64

Figura 18: Taxa de sobrevida referente aos camundongos BALB/c infectados com o isolado Be-78is5-3mai ( ), ou com as cepas de referência Berenice-62 ( ) e Berenice-78 parental ( ) do Trypanosoma cruzi. Cada curva representa a avaliação de 10 animais ao longo de 28 dias após a infecção.

5.7 Carga parasitária no coração e cólon durante a fase aguda da doença de Chagas experimental

As subpopulações do T. cruzi avaliadas comportaram-se de forma específica em

relação à carga parasitária, que foi determinada pela técnica de PCR em tempo real. A

intensidade do parasitismo no cólon foi expressivamente superior ao observado no coração

para todas as subpopulações do T. cruzi e em todos os tempos avaliados (Figura 19). No

coração, animais infectados com a cepa Be-78 parental apresentaram parasitismo

significativamente superior aos demais grupos infectados, nos tempos de 14 e 28dai (Figura

19). Embora animais infectados com a cepa Be-78 parental tenham apresentado, no cólon,

densidade parasitária superior àquela observada para o coração, os animais infectados com a

cepa Be-62 ou com o isolado Be-78is-3mai demonstraram quantidade significativamente

superior de parasitos de tecido quando comparados ao grupo Be-78 parental. A cepa Be-62

mostrou-se ainda mais eficiente em parasitar o cólon que o isolado Be-78is5-3mai (Figura

19).

So

bre

vid

a (%

)


0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 600

50

100

150


65

Figura 19: Avaliação da carga parasitária no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental (

): grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. As linhas conectoras indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais em um determinado tempo de avaliação; *: diferença significativa em relação à 7dai; #: diferença significativa em relação à 14dai.

5.8 Processo inflamatório no coração e cólon durante a fase aguda da doença de Chagas experimental

5.8.1 Intensidade do processo inflamatório

Para determinar se as distintas subpopulações do T. cruzi apresentaram especificidades

em relação à capacidade de provocar resposta inflamatória no coração e cólon dos animais

infectados, amostras desses órgãos, obtidas durante a necropsia, foram submetidas à avaliação

da intensidade do processo inflamatório em cortes histológicos corados pela técnica

Hematoxilina-Eosina.

No coração, foi possível detectar infiltrado inflamatório significativo nos animais

infectados com a cepa Be-62, 14 dias após a infecção (dai), sendo o processo inflamatório

mantido com intensidade semelhante no 28ºdai. Demonstrando um comportamento mais

tardio, animais infectados com a cepa Be-78 parental ou com o isolado Be-78is5-3mai

apresentaram infiltrado inflamatório significativo apenas aos 28dai em comparação aos

animais não-infectados. No entanto, nos animais pertencentes ao grupo Be-78is5-3mai, o

número de células inflamatórias foi significativamente inferior em relação aos animais dos

grupos Be-62 e Be-78parental no tempo 28dai (Figura 20 e 21). Embora nenhuma diferença

0

300

600

900

50000

100000

150000

10000000200000003000000040000000

0

10

20

30

40

50

300

600

900

Nú

mer

o d

e p

aras

ito

s/m

g d

e te

cid

o

Grupos experimentais /Tempo (dias após a infecção)

CORAÇÃO CÓLON

*

7 14 28 7 14 28

*

* #* #


66

significativa no número de células tenha sido observada no 7ºdai em nenhum dos grupos

infectados, pequenos focos inflamatórios puderam ser observados principalmente na região

subepicárdica e no átrio.

Em contrapartida, o número de células quantificado no cólon foi significativamente

maior em todos os grupos infectados, Be-62, Be-78 isolado e Be-78 parental, no 7º e 14ºdai,

comparados aos animais não infectados (Figura 20). Adicionalmente, o número de células

inflamatórias observado no grupo Be-78is5-3mai foi significativamente inferior àquele

observado para os grupos Be-62 e Be-78 parental, no 7º e 14ºdai, respectivamente (Figura

20). No 28ºdai, animais infectados com a cepa Be-62 ou com o isolado Be-78is5-3mai ainda

apresentavam processo inflamatório em comparação aos animais não-infectados, sendo mais

intenso no grupo Be-62. Entretanto, ao final da fase aguda, animais do grupo Be-78 parental

demonstraram padrão histológico compatível com a normalidade, sem processo inflamatório

significativo (Figura 20 e 22).

Figura 20: Análise morfométrica do processo inflamatório no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental ( ): grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. As linhas conectoras indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais em um determinado tempo de avaliação; *: diferença significativa em relação à 7dai; #: diferença significativa em relação à 14dai. Cut off, representado pela linha pontilhada, indica o número de núcleos celulares compatível com a normalidade em uma área igual a 75.183,8m2.

0

100

200

300

400

500

0

100

200

300

400

500

Nú

mer

o d

e cé

lula

s/75

.183

,8m

2


CORAÇÃO CÓLON

7 14 28 7 14 28

**

* #

* #

*

*


67

Figura 21: Fotomicrografias representativas da análise semi-quantitativa do processo inflamatório em cortes histológicos do coração de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Aspecto histológico normal em animais não-infectados ao longo da fase aguda (a, b, c); presença de infiltrado inflamatório discreto em animais infectados com a cepa Be-62 no 7ºdai (d), evoluindo para moderado a intenso aos 14 (e) e 28dai (f); infiltrado inflamatório discreto em animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai no 7ºdai (g) e 14ºdai (h), evoluindo para discreto a moderado aos 28dai (i); infiltrado inflamatório discreto em animais infectados com a cepas Be-78 parental no 7ºdai (j), evoluindo para moderado aos 14 (k) e intenso aos 28dai (l). NI: grupo de animais não-infectados; Be-62: grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado: grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental: grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. Hematoxilina-Eosina. Barra= 50m.

Be-62 Be-78 parentalBe-78is5-3mai

7dai

14d

ai28

dai

NI

a d g j

b e h k

f i lc


68

Figura 22: Fotomicrografias representativas da análise semi-quantitativa do processo inflamatório em cortes histológicos do cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Aspecto histológico normal em animais não-infectados ao longo da fase aguda (a, b, c); presença de infiltrado inflamatório focal de caráter discreto a moderado em animais infectados com a cepa Be-62 no 7ºdai (d), 14dai (e) e moderado a intenso no 28ºdai (f); infiltrado inflamatório discreto em animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai no 7ºdai (g), 14ºdai (h) e 28ºdai (i); infiltrado inflamatório discreto em animais infectados com a cepas Be-78 parental no 7º (j) e 14ºdai (k), e aspecto compatível com a normalidade aos 28dai (l). NI: grupo de animais não-infectados; Be-62: grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado: grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental: grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. Hematoxilina-Eosina. Barra= 50m.

Be-62 Be-78 parentalBe-78is5-3mai

7dai

14d

ai28

dai

NI

a d g j

b e h k

c f i l

Nogueira-Paiva, NC _ ___Resultados

69

5.8.2 Perfil fenotípico do processo inflamatório

Além da intensidade do processo inflamatório, a participação das distintas

subpopulações do T. cruzi na indução da resposta imune inata e adaptativa durante a fase

aguda da DCh experimental, foi avaliada através da determinação fenotípica e funcional do

infiltrado inflamatório, utilizando a técnica de imunofenotipagem por citometria de fluxo em

suspensão de células de coração e cólon.

5.8.2.1 Macrófagos

Aumento significativo no percentual de macrófagos foi observado no tecido muscular

cardíaco dos animais infectados com a cepa Be-62 nos tempos 14 e 28dai, quando comparado

aos demais grupos experimentais. Aos 14dai, animais do grupo infectado com o isolado Be-

78is5-3mai começaram a demonstrar percentual superior dessas células em relação aos

animais não-infectados, sustentando essa elevação no 28ºdai. A cepa Be-78 parental, por sua

vez, foi capaz de induzir aumento no percentual de macrófagos apenas no 28ºdai (Figura 23).

A análise ao longo do tempo no coração demonstrou ainda que, para o grupo Be-62,

no 28ºdai, embora ainda elevado, o percentual de macrófagos foi inferior em relação ao

observado 14dai.

No cólon, animais pertencentes ao grupo Be-62 e Be-78 isolado mostraram percentual

superior de macrófagos no 7º e 14ºdai em comparação com os grupos não-infectado e

infectado com a cepa Be-78 parental. O aumento observado nos animais infectados com a

cepa Be-62 aos 14dai foi superior àquele observado para o grupo Be-78 isolado. Entretanto,

este grupo, ao contrário do grupo Be-62, elevou a taxa de macrófagos no 28ºdai, mantendo-a

superior em todos os tempos avaliados. Animais do grupo Be-78 parental não apresentaram

alteração na densidade dos macrófagos ao longo da fase aguda (Figura 23).

A avaliação longitudinal no cólon revelou um perfil diferenciado entre as três

subpopulações estudadas, no qual, Be-62 retorna os níveis de macrófagos à normalidade ao

final da fase aguda, Be-78 isolado permanece com níveis elevados em todos os tempos e, Be-

78 parental, por sua vez, mantêm taxas compatíveis com a normalidade ao longo dos tempos

avaliados (Figura 23).


70

Figura 23: Análise imunofenotípica do percentual médio de macrófagos (CD45+ F4/80+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. Cada um dos 4 elementos do grupo foi composto por pool de órgãos (coração ou cólon) de 4 animais. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental (


5.8.2.2 Linfócitos B

No coração, a densidade de linfócitos B aumenta em todos os grupos infectados, Be-

62, Be-78 isolado, Be-78 parental no 14ºdai. No 28ºdai, no entanto, o percentual de linfócitos

B permanece superior apenas nos animais infectados com a cepa Be-78 parental (Figura 24).

No 7ºdai, o cólon dos animais de todos os grupos infectados apresenta aumento no

percentual de células B, sendo esse aumento mais expressivo nos animais infectados com a

cepa Be-62. Aos 14dai, a densidade de linfócitos B permanece elevada apenas nos grupos Be-

62 e Be-78 parental, demonstrando novamente taxas significativamente superiores no grupo

Be-62. Apenas animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai apresentaram níveis maiores

de linfócitos B no 28ºdai, tempo no qual, animais dos grupos Be-62 e Be-78 parental

retornaram a densidade de linfócitos B à percentuais compatíveis com os animais não-

infectados (Figura 24).

0

5

10

15

20

2525

50

0

5

10

15

20

2525

50

Ma

cró

fago

s F4

/80+

(%)


7 14 28 7 14 28

CORAÇÃO CÓLON

*

*#

* #*

#

* #


71

Figura 24: Análise imunofenotípica do percentual médio de linfócitos B (CD45+ CD19+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. Cada um dos 4 elementos do grupo foi composto por pool de órgãos (coração ou cólon) de 4 animais. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental (


5.8.2.3 Linfócitos T

a) Linfócitos T CD4+

No coração dos animais infectados com a cepa Be-62, pôde-se observar aumento

significativo no percentual de linfócitos T CD4+ ao longo de toda a fase aguda e, em relação a

todos os demais grupos, não-infectado, Be-78 isolado e Be-78 parental, sendo mais

expressivo no 14ºdai. A cepa Be-78 parental induziu elevação nos índices de células T CD4+

apenas aos 28dai. Contudo, não foi possível demonstrar alteração no percentual dessas células

nos animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai em nenhum dos tempos avaliados

(Figura 25).

O perfil de células T CD4+ demonstrado no cólon foi, no entanto, o oposto do

observado no coração, onde o percentual dessas células foi superior no início da fase aguda

(7dai) apenas nos animais pertencentes ao grupo Be-78 parental em relação aos grupos NI,

Be-62 e Be-78 isolado. Os animais infectados com a cepa Be-62 ou com o isolado Be-78is5-

3mai apresentaram aumento nas taxas de linfócitos T CD4+ somente no 28ºdai (Figura 25).

0

1

2

3

4

5

6

0

1

2

3

4

5

6

Lin

fóci

tos

B C

D1

9+ (%

)


7 14 28 7 14 28

CORAÇÃO CÓLON

*

* #

#

*

*

*

#


72

Figura 25: Análise imunofenotípica do percentual médio de Linfócitos T CD4+ (CD45+ CD3+ CD4+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. Cada um dos 4 elementos do grupo foi composto por pool de órgãos (coração ou cólon) de 4 animais. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental ( ): grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. As linhas conectoras indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais em um determinado tempo de avaliação; *: diferença significativa em relação à 7dai; #: diferença significativa em relação à 14dai.

b) Linfócitos T CD8+

De forma semelhante ao demonstrado para as células T CD4+ no coração dos animais

infectados com a cepa Be-62, pôde-se observar aumento significativo no percentual de

linfócitos T CD8+ ao longo de toda a fase aguda em relação aos grupos não-infectado e Be-78

isolado. Entretanto, a elevação destas células foi gradual e mostrou-se significativamente

superior no tempo de 28dai em comparação aos demais tempos avaliados. Animais infectados

com a cepa Be-78 parental ou com o isolado Be-78is5-3mai induziram elevação nos índices

de células T CD8+ apenas aos 28dai (Figura 26).

No cólon, animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai apresentaram aumento no

percentual de linfócitos T CD8+, de forma gradual, em todos os tempos avaliados ao longo da

fase aguda. Os animais dos grupos Be-62 demonstraram elevação na densidade dessas células

aos 14 e 28dai, enquanto nos animais pertencentes ao grupo Be-78 parental, o aumento na

taxa de células CD8+ pode ser percebido, e discretamente, apenas no 14ºdai, sendo

significativamente inferior ao aumento observado nos demais grupos infectados (Figura 26).

0

5

10

15

2020

30

0

5

10

15

2020

30

Lin

fóci

tos

T C

D4

+ (%

)


7 14 28 7 14 28

CORAÇÃO CÓLON

*

* #

#

* #


73

Figura 26: Análise imunofenotípica do percentual médio de Linfócitos T CD8+ (CD45+ CD3+ CD8+) em relação às células CD45+ presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. Cada um dos 4 elementos do grupo foi composto por pool de órgãos (coração ou cólon) de 4 animais. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental ( ): grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. As linhas conectoras indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais em um determinado tempo de avaliação; *: diferença significativa em relação à 7dai; #: diferença significativa em relação à 14dai.

5.8.3 Perfil fenotípico e funcional dos Linfócitos T

A frequência da expressão de IFN- nas células T é demonstrada na Figura 25 como

frequência de linfócitos T CD4+ IFN-+ ou linfócitos T CD8+ IFN-+ no coração e cólon.

Os animais do grupo Be-78 apresentaram níveis significativamente superiores de

células T CD4+ IFN-+ e CD8+ IFN-+, no coração, ao longo da fase aguda quando

comparados aos demais grupos experimentais, com produção mais elevada no 28ºdai.

Adicionalmente, uma discreta redução foi observada no 14ºdai, nesse grupo, em relação a

ambos os perfis. A cepa Be-62, por sua vez, foi capaz de induzir aumento na densidade de

linfócitos T CD4+ IFN-+ e CD8+ IFN-+ apenas no 28ºdai, e significativamente inferior ao

observado no grupo Be-78 parental, enquanto animais infectados com o isolado Be-78is5-

3mai não apresentaram alteração na expressão dessa citocina por nenhum dos fenótipos de

células T avaliados (Figura 27).

No cólon, padrão semelhante de frequência de linfócitos T CD4+ IFN-+ foi

demonstrado para o grupo Be-78 parental, no entanto o pico de expressão dessa citocina

ocorreu no 7ºdai. Linfócitos T CD8+ IFN-+ foram detectados em níveis superiores aos

0

5

10

15

2020

30

0

5

10

15

2020

30

Lin

fóci

tos

T C

D8

+ (%

)

7 14 28 7 14 28

CORAÇÃO CÓLON


*

* #

#

* #* #

* #*

**

* #


74

animais não-infectados apenas no 28ºdai para o grupo infectado com a cepa Be-78 parental.

Ao contrário do observado no coração, animais do grupo Be-78 isolado apresentaram

aumento significativo de linfócitos T CD4+ IFN-+ e CD8+ IFN-+ em relação aos animais

infectados ao final da fase aguda. Em contrapartida, somente aos 28dai, a cepa Be-62 foi

capaz de estimular a síntese dessa citocina apenas por células T CD8+ (Figura 27).

Além disso, foi possível demonstrar uma redução na expressão de IFN- tanto por

linfócitos TCD4+ quanto por T CD8+ ao longo dos 28 dias de avaliação nos animais não

infectados (Figura 27).

Figura 27: Análise imunofenotípica e funcional do percentual médio de Linfócitos T CD4+ (CD45+ CD3+ CD4+) ou CD8+ (CD45+ CD3+ CD8+) expressando IFN- (IFN-+) em relação aos seus respectivos fenótipos auxiliar (CD4+) ou citotóxico (CD8+) presentes no coração e cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Os dados estão representados como Média ± Erro Padrão. Grupos com n=4. Cada um dos 4 elementos do grupo foi composto por pool de órgãos (coração ou cólon) de 4 animais. NI ( ): grupo de animais não-infectados; Be-62 ( ): grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado ( ): grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental ( ): grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. As linhas conectoras indicam diferenças significativas entre os grupos experimentais em um determinado tempo de avaliação; as letras indicam diferença significativa dentro de um mesmo grupo experimental ao longo dos tempos avaliados (a: diferença significativa em relação à 7dai; b: diferença significativa em relação à 14dai).

0

1

2

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4

5

66

2020

30

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1

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2020

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2020

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1

2

3

4

5

66

2020

30

Lin

fóci

tos

T C

D8

+IF

N+

(%)

Lin

fóci

tos

T C

D4

+IF

N+

(%)


CORAÇÃO CÓLON

7 14 28 7 14 28

* #

* #

*

*

#* #

* #

**

#

* #

* #

* ** #


75

5.9 Representação esquemática do perfil da infecção no coração e cólon (ETAPA II)

A Figura 28 representa esquematicamente o comportamento da infecção, com as

distintas subpopulações do T. cruzi utilizadas nesse trabalho, comparando a parasitemia, a

carga parasitária e o processo inflamatório ao longo da fase aguda.

Observa-se o perfil cardiomiotrópico e o retardo no controle da parasitemia na

infecção pela cepa Be-78 parental, seguido por processo inflamatório intenso ao final da fase

aguda.

A cepa Be-62, por sua vez, apresentou-se preferencialmente parasitando o cólon, com

parasitemia superior no início da fase aguda, no entanto, capaz de controlá-la precocemente.

Apesar da redução do parasitismo cardíaco, o processo inflamatório mostrou-se intenso nos

dois órgãos avaliados no 28ºdai para essa cepa.

O isolado Be-78is5-3mai, consistente com os dados da avaliação in vitro,

demonstraram durante a fase aguda da infecção de camundongos BALB/c, um

comportamento intermediário entre a cepas de referência utilizadas, apresentando virulência

(parasitemia e mortalidade) compatível com a cepa Be-78 parental, no entanto, perfil

histotrópico compartilhado com a cepa Be-62.

Um resumo do perfil imunofenotípico apresentado pelos diferentes grupos

experimentais está esquematizado na Figura 29. No coração, apesar de já observada no grupo

Be-62 aos 14dai, no 28º, a densidade de macrófagos, linfócitos T CD4+ e CD8+ é semelhante

entre as cepas Be-62 e Be-78 parental, com sobreposição de células T CD8+ em relação às

células T CD4+. O isolado Be-78is5-3mai apresentou resposta inflamatória, embora de menor

intensidade, também apenas no 28ºdai, composta essencialmente por macrófagos e linfócitos

T CD8+.

De forma contrária ao observado no coração, o perfil de resposta imunológica no

cólon foi cepa-dependente. Apenas o grupo Be-78 parental apresentou aumento precoce de

células T CD4+, no 7ºdai, que foram substituídas por células T CD8+ e linfócitos B, no 14ºdai.

No 28ºdai, não foi observado processo inflamatório no cólon. Todos esses resultados são

condizentes com o comportamento da parasitemia e do parasitismo tecidual nesse grupo.

Embora com menor intensidade, o perfil imunofenotípico detectado nos animais infectados

com o isolado Be-78is5-3mai foi próximo àquele demonstrado pelo grupo Be-62, e sobretudo,

distinto da cepa Be-78 parental. Nas primeiras duas semanas de infecção, o processo


76

inflamatório foi constituído principalmente por macrófagos e células T CD8+, com aumento

expressivo de linfócitos T CD4+ apenas ao final da fase aguda.

.

Nogueira-Paiva, NC ___________ ____ _Resultados

77

Figura 28: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando o perfil da parasitemia, da carga parasitária e do processo inflamatório ao longo dos tempos avaliados apresentado por cada uma das diferentes subpopulações do T. cruzi utilizadas nesse estudo no coração e cólon de camundongos BALB/c. Os camundongos foram necropsiados durante da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. Cada dado (parasitemia, carga parasitária e número de células) foi separadamente transformado em percentual e os valores plotados na figura apenas para comparar o comportamento entre os grupos experimentais, sem considerar a intensidade em relação a cada variável analisada. Be-62: grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado: grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental: grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78; dai: dias após a infecção. ( ): parasitemia; ( ): carga parasitária (qPCR); ( ): processo inflamatório (HE).

7 14 28DAI

7 14 28DAI

7 14 28DAI

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7 14 28DAI

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Be-

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lCORAÇÃO CÓLON

Nogueira-Paiva, NC ___________ ____ _Resultados

78

Figura 29: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando o perfil fenotípico do infiltrado inflamatório ao longo dos tempos avaliados apresentado por cada uma das diferentes subpopulações do T. cruzi utilizadas nesse estudo no coração e cólon de camundongos BALB/c. Os camundongos foram necropsiados durante a fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. NI: grupo de animais não-infectados; Be-62: grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado: grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental: grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. ( ): Número de células. Cut off, representado pela linha pontilhada preta, indica o número de núcleos celulares compatível com a normalidade em uma área igual a 75.183,8m2

Be-

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Macrófago Linfócito T CD8+Linfócito T CD4+Linfócito B Cardiomiócito Célula Muscular Lisa

79

6. DISCUSSÃO

Nogueira-Paiva, NC Discussão

80

De acordo com a classificação atual das subpopulações do T. cruzi em Discrete Typing

Units (DTU), ambas as cepas de referência utilizadas nesse trabalho, Be-62 e Be-78,

pertencem a DTU Tc II (Zingales et al., 2009; Zingales et al., 2012). Embora essas duas

linhagens sejam suficientemente relacionadas para serem classificadas dentro do mesmo

DTU, elas apresentam peculiaridades já descritas na literatura que incluem, morfologia,

comportamento biológico e composição isoenzimática (Brener, 1965; Lana, 1981; Lana e

Chiari, 1986). A cepa Be-62 é composta, predominantemente, por formas delgadas, apresenta

pico de parasitemia em torno do sétimo dia e taxa de mortalidade de 100% em 15 dias após a

infecção em camundongos (Brener, 1965; Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986), enquanto a cepa

Be-78 é composta por formas largas, apresenta parasitemia com pico mais tardio (dia 15) e

uma taxa de sobrevida de 100% (Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986; Carneiro et al., 2007;

Guedes et al., 2007). Quando introduzida em meio de cultura acelular, a cepa Be-78

apresentou menor capacidade de crescimento e altos índices de diferenciação, enquanto que,

nas mesmas condições a cepa Be-62 mostrou uma alta capacidade de multiplicação e taxas

médias de diferenciação (Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986).

Além disso, dados obtidos em nosso laboratório mostraram que outras linhagens do T.

cruzi pertencentes ao mesmo DTU (Tc II), as cepas Y e Be-78, comportaram-se drasticamente

diferente em relação à patogenicidade nos principais órgãos afetados pela DCh, coração e

trato digestório, em infecção experimental de cães da raça Beagle (Veloso et al., 2008;

Nogueira-Paiva et al., 2014). No trato digestório, animais infectados com a cepa Y mostram

controle do parasitismo e homeostasia da resposta imunológica ao final da fase aguda,

enquanto animais infectados com a cepa Be-78 mantiveram parasitismo dois anos após a

infecção e apresentaram lesões de caráter aparentemente progressivo (Nogueira-Paiva et al.,

2014). As subpopulações presentes em cepas policlonais podem interagir de forma específica

com o hospedeiro, o que pode interferir com o desenvolvimento da resposta imune e

determinar o sucesso em controlar o parasitismo tecidual e as lesões associadas.

Têm sido descrito na literatura que após a infecção com uma cepa policlonal do T.

cruzi, a interação parasito-hospedeiro pode conduzir à ausência de parasitemia e/ou

parasitismo tecidual em alguns indivíduos, enquanto outros com hemoculturas positivas

podem diferir em relação ao desenvolvimento da resposta imunopatogênica, com aspectos

particulares de histotropismo, lesões histológicas, manifestações clínicas e prognóstico da

DCh (Silva et al., 2013). Um dos fatores investigados como potencial responsável é a genética

relacionada tanto ao hospedeiro quanto ao parasito (Andrade, 1990; Vago et al., 1996b; Vago


81

et al., 2000; Macedo et al., 2002; Silva et al., 2013). Variações, com importância

epidemiológica, dos padrões de distribuição geográfica das diferentes linhagens ou

subpopulações e do amplo espectro clínico da DCh têm apontando o polimorfismo

intraespecífico do T. cruzi como um dos fatores importantes para o prognóstico da doença.

Essas distintas subpopulações presentes no inóculo durante a infecção natural, segundo o

modelo histotrópico clonal, podem apresentar características intrínsecas com repercussão

sobre o estabelecimento da infecção e colonização dos tecidos (Macedo et al., 2002). Embora

estudos genéticos possam comprovar a heterogeneidade intraespecífica do parasito, avaliações

do comportamento biológico e da interação parasito-hospedeiro, poderiam esclarecer a

importância das diferentes cepas, na determinação das manifestações clínico-epidemiológicas

da doença (Andrade e Magalhaes, 1996). Assim sendo, a participação de diferentes

subpopulações do parasito no processo imunopatogênico durante a fase aguda da DCh

experimental foi investigada nesse estudo, dividido em duas etapas.

Na primeira etapa, a fim de testar a capacidade de um indivíduo em selecionar uma

subpopulação a partir de uma cepa policlonal do T. cruzi, 24 camundongos Swiss foram

infectados com cepa Be-78 e amostras de sangue coletadas por hemoculturas foram avaliadas

em três momentos após a infecção, durante a fase crônica recente (3 meses após a infecção-

mai), intermediária (6mai) e tardia (12mai). Os parasitos obtidos nas hemoculturas positivas

foram caracterizados in vitro quanto à cinética de crescimento em meio acelular, à

infectividade e desenvolvimento intracelular em meio de células Vero e ao perfil de assinatura

gênica por LSSP-PCR. A linhagem heterogênea de camundongos Swiss foi selecionada para o

presente estudo, em vez de uma população isogênica, devido à sua variabilidade genética

condizente com o perfil da população de pacientes com DCh.

Nossos resultados demonstraram que as assinaturas gênicas das cepas Be-62 e Be-78

parental, obtidas por LSSP-PCR, foram diferentes, confirmando a heterogeneidade genética

dessas duas cepas isoladas da mesma paciente com um intervalo de 16 anos. Nossos dados

complementam àqueles anteriormente descritos na literatura, usando caracterização dos perfis

isoenzimáticos ou caracterização de microssatélites (Lana, 1981; Lana e Chiari, 1986; De

Lana et al., 1996; Cruz et al., 2006; Valadares et al., 2012). As amostras das cepas Be-62 e

Be-78 têm sido mantidas em nosso laboratório, ao longo dos últimos 30 anos, em passagens

alternadas entre camundongos e cultura axênica, com intervalos onde as mesmas são

criopreservadas. Nós gostaríamos de ressaltar que a alternância entre a manutenção, in vivo ou

in vitro, não tem alterado a virulência, a patogenicidade ou o perfil molecular dessas cepas, o


82

que tem sido constantemente demonstrado em diversos trabalhos do nosso grupo (Lana e

Chiari, 1986; Veloso et al., 2005; Carneiro et al., 2007; Veloso et al., 2008; Vieira et al.,

2009; Valadares et al., 2012; Vieira et al., 2012).

O perfil de kDNA de um dos isolados, Be-78is5-3mai, compartilhou bandas

específicas com ambas as cepas de referência, Be-62 e Be-78 parental (Figura 15 e 16). Além

disso, esse mesmo isolado apresentou comportamento em meio de cultura acelular (meio LIT)

ou celular (células Vero) mais semelhante ao perfil da cepa Be-62 que àquela do grupo Be-78

(Tabela 3). Em contrapartida, o isolado Be-78is2-6mai, que mostrou taxas de infectividade e

desenvolvimento intracelular cerca de 3 vezes superior à cepa Be-78 parental, foi similar em

relação à assinatura gênica obtida por LSSP-PCR, demonstrando que mudanças no

comportamento biológico não necessariamente refletem variações genéticas (Tabela 3).

O isolado Be-78is5-3mai, que mais se distanciou geneticamente da cepa parental, foi

coletado do animal 5 aos 3 meses após a infecção-mai. Outro isolado foi originado desse

mesmo animal aos 6mai, Be-78is5-6mai. Embora esse isolado também tenha apresentado, em

seu perfil gênico, uma banda discreta próxima à região de 100pb similar à cepa Be-62, suas

propriedades biológicas in vitro foram similares à cepa Be-78 parental. Esta observação

sugere um processo de reversibilidade da modulação genética ao longo do tempo durante a

infecção crônica por T. cruzi, em que diferentes subpopulações podem ser favorecidas em um

determinado momento em detrimento de outras (Veloso et al., 2005; Veloso et al., 2012).

A manutenção dos isolados em meio de cultura foi realizada durante pouco tempo a

fim de minimizar sua influência sobre o processo de seleção. Assim, consideramos que a

pressão exercida pelo sistema imune do hospedeiro vertebrado (camundongo da linhagem

Swiss) seja a variável principal responsável por favorecer o processo de seleção, observado

nesse trabalho para o isolado Be-78is5-3mai. No entanto, é importante considerar a

possibilidade de que a hemocultura e a manutenção dos isolados in vitro, realizados

previamente à análise fenotípica e molecular, possam ter exercido alguma influência adicional

à seleção, alterando a organização de suas subpopulações podendo favorecer a expansão ou a

redução de determinados clones presentes na amostra parental (Macedo & Pena, 1998), mas

não a constituição de subclones da amostra obtida por hemocultura.

Além da possibilidade de que o isolado Be-78is5-3mai seja uma subpopulação

selecionada dentro da população policlonal da cepa Be-78 parental, o comportamento em

meios de cultura e o perfil gênico intermediários, observados para esse isolado, em relação às

cepas de referência, Be-78 parental e Be-62, também podem ser atribuídos à uma associação


83

entre subclones, com participação de dois ou mais subclones, determinando um perfil

biológico e molecular misto. A caracterização por microssatélites da cepa Be-78 realizada por

Valadares et al. (2012), de forma semelhante ao observado nesse estudo, confirmou o status

multiclonal da cepa Be-78, e sugeriu a presença de uma subpopulação, dentro da amostra de

Be-78, semelhante à Be-62.

Nossos dados confirmam a natureza policlonal ou mista da cepa Be-78, já relatada na

literatura (Veloso et al., 2005; Valadares et al., 2012; Veloso et al., 2012), e reforça a hipótese

de que a pressão seletiva exercida pelo hospedeiro durante a fase crônica pode favorecer o

desenvolvimento de uma ou mais subpopulação(s) sobre a(s) outra(s). Este fenômeno pode

estar relacionado com a plasticidade do T. cruzi e não menos importante, à interação parasito-

hospedeiro, uma vez que todos os animais receberam o mesmo inóculo e responderam à

infecção selecionando subpopulações distintas.

Três isolados obtidos após a infecção de camundongos Swiss com a cepa Be-78, Be-

78is5-3mai, Be-78is2-6mai e Be-78is15-12mai, mostraram diferenças nos parâmetros

biológicos e/ou moleculares avaliados em comparação com a cepa Be-78 parental (Tabela 3),

no entanto, um deles em especial, o isolado Be-78is5-3mai, parece apresentar características

peculiares que o colocam como principal candidato para investigação da influência do

polimorfismo genético, dentro de uma cepa policlonal, sobre a imunopatogênese da DCh.

Dessa forma, na segunda etapa do nosso trabalho, camundongos isogênicos, da linhagem

BALB/c, foram infectados com um dos isolados selecionados na primeira etapa, Be-78is5-

3mai e com as cepas de referência Be-78 parental e Be-62 com o objetivo de investigar a

participação de diferentes subpopulações do parasito no processo patogênico, no que diz

respeito à modulação da resposta imune e ao desenvolvimento das lesões histológicas durante

a fase aguda na tentativa de esclarecer aspectos propostos pelo modelo histotrópico clonal,

comparando possíveis especificidades comportamentais, relacionadas ao histotropismo e à

patogenicidade.

Foi possível confirmar o comportamento distinto da curva de parasitemia e taxa de

sobrevida entre as cepas de referência utilizadas nesse trabalho, Be-62 e Be-78 parental.

Animais infectados com a cepa Be-62 apresentaram pico de parasitemia precoce e

significativamente superior, em relação aos animais do grupo Be-78 parental. Além disso, a

mortalidade alcançou índice de 92% no grupo Be-62 no 28ºdai, em detrimento à 0% nos

demais grupos. Nossos dados corroboram com aqueles descritos por Lana e Chiari (1986),

que observaram padrão semelhante para essas cepas em camundongos de linhagens distintas,


84

CH3 isogênicos ou albinos, tanto para a parasitemia quanto para a taxa de sobrevida. Embora

com PPP, Pmáx e DPmáx distintos, Bahia et al. (2002) também descreveram comportamento

tardio da cepa Be-78 em comparação com a cepa Be-62 em cães infectados com

tripomastigotas sanguíneas pela via intraperitoneal.

Concordando com os dados de Camandaroba et al. (2006), que demonstraram o

mesmo padrão de parasitemia para cinco dos sete clones da cepa Colombiana analisados, os

animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai apresentaram PPP, PP, Pmáx e DPmáx

semelhantes à cepa Be-78 parental. No entanto, houve uma redução significativa na área sob a

curva, sugerindo infectividade inferior para o isolado Be-78is5-3mai quando comparado à

cepa Be-78 parental. Campos e Andrade (1996) e Camandaroba et al. (2001), ainda que

utilizando método de isolamento distinto, também detectaram alterações nas curvas

parasitêmicas de clones das cepas Colombiana e 21 SF, respectivamente, onde alguns dos

clones apresentaram menor virulência, com menores taxas de parasitemia e mortalidade, em

relação à cepa parental. Em nosso estudo, a baixa infectividade pode ser uma característica

inerente ao isolado ou pode ainda estar relacionada ao número reduzido de passagens em

culturas ou camundongos, que foi necessário neste trabalho para evitar variáveis adicionais ao

processo de seleção. A ascensão lenta e gradual da parasitemia de subpopulações

recentemente isoladas tem sido descrita na literatura por outros autores (Lana e Chiari, 1986;

Camandaroba et al., 2001). No entanto, na maioria das vezes, não estão associadas à

alterações no tropismo e imunogenicidade.

De forma semelhante aos resultados apresentados neste trabalho, diferentes autores

observaram taxa de sobrevida igual a 100% para animais infectados com a cepa Be-78, em

contrapartida a 100% de mortalidade para camundongos infectados com a cepa Be-62

(Brener, 1965; Lana e Chiari, 1986). Os animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai

apresentaram sobrevida compatível com a cepa Be-78 parental, o que também foi observado

por outros autores para clones obtidos da cepa Colombiana e 21 SF, sugerindo estabilidade da

cepa parental e indicando homogeneidade clonal de suas subpopulações (Campos e Andrade,

1996; Camandaroba et al., 2001; Camandaroba et al., 2006).

Cepas do T. cruzi representam um equilíbrio entre as subpopulações, sejam elas

homogêneas ou heterogêneas, onde ocorre a predominância de um clone principal, que é

responsável por um padrão de comportamento da cepa parental e de seus clones (Engel et al.,

1982; Gomes et al., 1991; Campos e Andrade, 1996; Camandaroba et al., 2001; Camandaroba

et al., 2006). Entretanto, segundo o modelo histotrópico clonal, nem todos os clones são


85

capazes de estabelecer a infecção, e aqueles que conseguem ainda podem competir entre si e

colonizar tecidos distintos (Macedo e Pena, 1998; Macedo et al., 2002). A capacidade de

diferentes subpopulações em interagir com tecidos específicos poderia ser um fator

determinante para o desenvolvimento do amplo espectro anatomoclínico da DCh. Para testar

essas duas hipóteses, onde o isolado Be-78is5-3mai represente um clone principal

apresentando virulência e patogenicidade compatíveis com a cepa de origem ou ainda

apresente-se como uma subpopulação que interaja de forma específica com os tecidos do

hospedeiro, a infecção experimental com o isolado foi ainda investigada em relação ao

histotropismo e à intensidade e fenótipo da resposta inflamatória nos principais órgãos

acometidos pela DCh.

A cepa Be-62 inicia precocemente a infecção de células no tecido cardíaco já aos 7dai,

mas esse parasitismo é reduzido ao final da fase aguda (28dai). Ao contrário, a cepa Be-78

parental apresenta aumento da carga parasitária cardíaca aos 14dai, mantendo-a elevada até o

28ºdai. Esse comportamento está diretamente relacionado ao perfil da curva de parasitemia

dessas duas cepas, onde se pode demonstrar compatibilidade entre os dias onde são

observados índices parasitêmicos e parasitismo tecidual maiores. Somado a isso, também

nota-se a queda do parasitemia em consequência ao controle da replicação do parasito pelo

sistema imune do hospedeiro, com redução do parasitismo tecidual.

Inversão no histotropismo entre as cepas Be-62 e Be-78 parental foi observada no

cólon, onde se pode perceber que a cepa Be-62 aumenta gradualmente o parasitismo tecidual

nesse órgão ao longo da fase aguda, alcançando pico no 28ºdai, enquanto a cepa Be-78 tem

sucesso na infecção já no 7ºdai, com flutuações até mostrar-se significativamente inferior em

relação aos demais grupos infectados no 28ºdai. Diferente do coração, o perfil da carga

parasitária no cólon parece estar relacionado ao momento onde ocorre o controle da

multiplicação do parasito pela resposta imunológica do hospedeiro. Dados obtidos por Lewis

et al. (2015) têm identificado o trato gastrointestinal como principal nicho onde o parasito

permanece, evadindo do sistema imune, durante a infecção crônica. Portanto, nossos dados

apontam uma associação entre o comportamento mais rápido da cepa Be-62, no que se refere

à infectividade, taxa de multiplicação e controle precoce da parasitemia (25dai) e o intenso

parasitismo no cólon observado no 28ºdai. Da mesma forma, o perfil tardio da cepa Be-78

parental parece ser o responsável pela manutenção de uma carga parasitária inferior à

observada para cepa Be-62 até o final da fase aguda. Uma vez que o controle da parasitemia

nos animais infectados com a cepa parental ocorreu apenas no 38ºdai, a avaliação da carga


86

parasitária no cólon desses animais em tempos mais tardios poderia revelar se a cepa Be-78

apresentaria histotropismo preferencial para o coração ou se, de forma semelhante às demais

subpopulações investigadas, evadiria o sistema imune “escondendo-se” no TGI na fase

crônica da infecção.

Dados obtidos em nosso laboratório no modelo cão, comparando achados

histopatológicos no coração, esôfago e cólon, revelaram uma preferência por órgãos do TGI

para a cepa Be-78, sustentando a participação de aspectos genéticos do hospedeiro sobre

aspectos patogênicos das distintas formas clínicas da DCh (Veloso et al., 2008; Nogueira-

Paiva et al., 2014). Corroborando com esses dados, a análise das respostas de diferentes

linhagens de camundongos, C57BL/6 e Swiss versus BALB/c e DBA-2, à infecção com uma

mistura das cepas JG e Coll.7G2 (Andrade et al., 2002) mostraram que, para os camundongos

BALB/c e DBA-2, o mesmo padrão de distribuição tecidual foi observado, com

predominância da cepa JG no coração e Col1.7G2 no reto e demais tecidos. No entanto,

camundongos C57BL/6 e Swiss apresentaram maior parasitismo cardíaco em relação à cepa

Col1.7G2, enquanto que, a cepa JG parasitou preferencialmente o reto e demais tecidos.

Dessa forma, a distinta distribuição tecidual observada para BALB/c e DBA-2 versus

C57BL/6 e Swiss foi associada às diferenças entre os perfis genéticos destes animais (Andrade

et al., 2002).

De forma interessante, o isolado Be-78is5-3mai apresentou, tanto no coração quanto

no cólon, comportamento mais próximo à cepa Be-62, com parasitismo reduzido no coração e

elevado no cólon no 28ºdai. Esses dados também reforçam a associação entre o perfil da curva

de parasitemia e o escape do parasito para o TGI, uma vez que, o DPmáx foi anterior ao

observado para a cepa Be-78 parental e, embora parasitos no sangue tenham sido observados

durante 45 dias, os índices parasitêmicos mostravam-se bem baixos a partir do 20ºdai. Essa

alteração no histotropismo demonstrada do isolado em comparação à cepa parental,

contrariam os resultados obtidos por Campos et al. (1996) e Camandaroba et al. (2001; 2006),

cujos clones das cepas Colombiana e 21 SF, respectivamente, apresentaram histotropismo

semelhante às suas cepas parentais. Essas diferenças podem estar relacionadas ao método

utilizado no isolamento das subpopulações, obtendo subpopulações monoclonais, além das

hemoculturas terem sido realizadas na fase aguda, onde ainda não é possível observar

claramente a ação do sistema imune no processo de seleção.

Estudos realizados por Andrade et al. (1999) envolvendo duas diferentes populações

do T. cruzi, JG e Col1.7G2, originalmente isoladas de pacientes com formas clínicas distintas


87

da DCh, também mostraram alteração no padrão de histotropismo. A cepa JG, isolada de um

paciente com megaesôfago, causou parasitismo cardíaco em camundongos infectados por ela

isoladamente ou em associação com a cepa Col1.7G2. Independente da infecção monoclonal

ou mista, para os autores, esses dados reforçam o modelo histotrópico clonal. Na infecção

mista pode ter havido uma interação entre as duas cepas que foi capaz de alterar a colonização

tecidual, enquanto, a inversão de histotropismo observada na infecção apenas com a cepa JG

confirma o envolvimento de características do hospedeiro.

Adicionalmente à complexidade da interação parasito-hospedeiro, a resposta imune

dirigida contra moléculas antigênicas, independente da fonte desses antígenos estar direta ou

indiretamente associada ao parasito (próprio parasito ou fenômenos de autoimunidade

induzidos pela infecção), tem um papel central sobre mecanismo patogênico da DCh (Dutra et

al., 2009). A ativação do sistema imune nos estágios iniciais da infecção é imprescindível para

o controle da parasitemia e do parasitismo tecidual, no entanto, a capacidade de controlar essa

resposta ao longo da infecção crônica, através da indução de mecanismos imunomodulatórios

parece ter papel central na manutenção de um equilíbrio favorável ao hospedeiro com bom

prognóstico da doença (Dutra et al., 2009).

Miocardite significativa foi notada no coração dos animais infectados com a cepa Be-

62 duas semanas antes do observado para os demais grupos infectados. Além disso, 28dai, o

isolado Be-78is5-3mai induziu uma resposta inflamatória inferior comparada à cepa parental e

à cepa Be-62. Resposta inflamatória exuberante ao final da fase aguda tem sido descrita por

vários autores em diferentes modelos experimentais para a cepa Be-78 (Bahia et al., 2002;

Caliari et al., 2002a; Vieira et al., 2009; Vieira et al., 2012) e Be-62 (Bahia et al., 2002).

No cólon, o comportamento da isolado foi mais próximo ao detectado para a cepa Be-

62, com um processo inflamatório sustentado, embora inferior, até o final da fase aguda

(28dai), em detrimento da resolução observada para o grupo de animais infectados com a cepa

Be-78 parental nesse tempo. De forma geral, uma associação pode ser vista entre o

parasitismo tecidual e a resposta imune no cólon, com histotropismo acompanhado de

processo inflamatório predominante para a cepa Be-62 e para o isolado Be-78is5-3mai.

Em relação ao coração, nossos dados estão em concordância com aqueles obtidos por

diferentes autores avaliando a infecção com isolados/clones e suas respectivas cepas

parentais, onde o processo inflamatório total apresentou caráter semelhante (Camandaroba et

al., 2001; Camandaroba et al., 2006). Entretanto, para o cólon, nossos resultados

demonstraram uma especificidade para o isolado Be-78is5-3mai no padrão de inflamação, que


88

concorda com o parasitismo tecidual dando a este características intermediárias entre a cepa

parental e a cepa Be-62. A possibilidade de o isolado compartilhar padrões comportamentais

com a cepa Be-62 é reforçada no estudo realizado por Valadares et al. (2012), no qual, uma

subpopulação semelhante à Be-62 foi detectada dentro da população policlonal da cepa Be-78

pela técnica de microssatélite. Achados histopatológicos após infecção monoclonal com duas

subpopulações do T. cruzi, cepa JG e o clone CL-Brener, revelaram que, durante a fase aguda,

o clone CL-Brener foi detectado parasitando diferentes tecidos dos camundongos infectados,

enquanto a cepa JG mostrou-se preferencialmente cardiomiotrópica (Franco et al., 2003).

Adicionalmente, na fase crônica da infecção somente a cepa JG foi encontrada no coração,

confirmando as especificidades dessas duas subpopulações em relação ao histotropismo.

Na infecção pelo T. cruzi, monócitos e macrófagos são reconhecidamente a primeira

barreira contra a disseminação do parasito pelo organismo, seja na doença humana ou

experimental. Os parasitos circulantes são fagocitados por monócitos, que uma vez ativados

por citocinas pró-inflamatórias (IFN) produzidas por células da resposta imune inata (Células

NK), representam o mecanismo inicial de resistência do hospedeiro (Fabrino et al., 2011). Os

parasitos que conseguem evadir a ação do sistema complemento e da atividade microbicida

dependente de NO de monócitos/macrófagos, conseguem se desenvolver e replicar dentro das

células parasitadas (Ouaissi e Ouaissi, 2005). Nos tecidos, o rompimento das células

parasitadas libera moléculas antigênicas que induzem a expressão de quimiocinas e citocinas

pro-inflamatórias, estimulando a mobilização de células inflamatórias para o local da infecção

promovendo a montagem de uma resposta imune celular eficiente, Th1, que resulte no

controle da replicação do parasito (Dosreis et al., 2005). O desenvolvimento da resposta

celular Th2 está associado ao fracasso do hospedeiro em controlar a disseminação da

infecção. Nesses tecidos, macrófagos infectados agem como células apresentadoras de

antígenos (APCs) produzindo citocinas, como IL-12, IFN-e TNF- e ainda providenciam os

sinais co-estimuladores necessários à ativação das células T, evidenciando sua importância na

interação entre a resposta imune inata e adaptativa (Gazzinelli et al., 1992; Van Voorhis,

1992; Vespa et al., 1994; Silva et al., 1995; Aliberti et al., 1996; Rodrigues et al., 2000;

Michailowsky et al., 2001; Ropert et al., 2002; Vieira et al., 2009).

Em concordância com dados da literatura (Melo e Machado, 1998; 2001; Arnaiz et al.,

2002; Paiva et al., 2009), um elevado percentual de macrófagos foi observado no coração dos

animais infectados, aumento esse que foi consistente com as curvas de parasitemia, sendo

mais intenso e precoce nos animais infectados com a cepa Be-62 (14dai), gradual e discreto


89

nos animais infectados com o isolado, e tardio, porém, moderado, no grupo Be-78 parental

(28dai). A depleção de macrófagos em ratos Holtzman, por pré-tratamento com sílica (1 dia

antes da infecção), infectados com a cepa Y, demonstrou aumento da parasitemia e

parasitismo cardíaco durante a fase aguda em relação aos animais apenas infectados,

apontando a importância dessas células no controle da replicação do parasito nas fases iniciais

da infecção (Melo, 1999; Melo e Machado, 2001).

Apesar de mais discreto, o aumento no percentual de macrófagos também foi

demonstrado no cólon dos animais infectados, 7 e 14dai, com exceção do grupo Be-78

parental. Interessantemente, o isolado Be-78is5-3mai foi a única subpopulação estudada a

manter a densidade de macrófagos elevada até o final da fase aguda, o que pode estar

relacionado à manutenção da parasitemia durante 49dai e ao parasitismo elevado no cólon.

A participação de linfócitos B no processo inflamatório foi discreta, aproximadamente

1,5 e 2,5-5% dos leucócitos totais CD45+, no coração e no cólon respectivamente. No

coração, foi possível observar aumento em todos os grupos infectados no 14ºdai, no entanto,

foi sustentado no 28ºdai, apenas nos animais infectados com a cepa Be-78 parental. Sete dias

após a infecção, todos os animais infectados apresentaram elevação na densidade de linfócitos

B no cólon. Nos grupos Be-62 e Be-78 parental, houve um aumento de cerca de 30% no

14ºdai em relação ao observado no 7ºdai, no entanto, os índices dessas células retornou a

normalidade no 28ºdai. Ao final da fase aguda, taxa elevada de linfócitos B foi observada no

cólon apenas nos animais infectados com o isolado Be-67is5-3mai.

O envolvimento de linfócitos B e plasmócitos nas lesões teciduais que ocorrem

durante a fase aguda nos principais órgãos envolvidos na DCh tem sido escassamente

examinado em modelos experimentais. Cardillo et al. (2007) demonstraram o papel crítico de

linfócitos B para a resistência do hospedeiro nos eventos iniciais da infecção pelo T. cruzi.

Camundongos C57BL/6 nocautes para linfócitos B, infectados com 500 formas

tripomastigotas sanguíneas da cepa Talahuen, foram mais susceptíveis à infecção,

apresentando maiores níveis parasitêmicos e redução na síntese de citocinas pró-inflamatórias

(IFN- e IL-12), em relação aos animais controle células B-competentes. Adicionalmente, em

detrimento dos animais imunocompetentes, que demonstraram aumento de células T CD4+ e

CD8+ no baço, camundongos nocautes não alteraram a frequência de células T CD4+ e ainda

reduziram pela metade o número de linfócitos T CD8+ em relação aos animais não infectados

(Cardillo et al., 2007). O processo inflamatório no músculo esquelético também foi reduzido

nos animais deficientes para célula B, sendo observada uma inversão na razão CD4+/CD8+


90

(sobreposição de CD4+), em relação aos animais imunocompetentes (sobreposição de CD8+)

(Cardillo et al., 2007). A associação entre a frequência de linfócitos B e a carga parasitária

também pode ser observada no nosso estudo, onde animais infectados com a cepa Be-78 e

com o isolado Be-78is5-3mai mantiveram, no coração e no cólon, respectivamente, níveis

mais altos de células B condizentes com a manutenção do parasitismo tecidual.

O papel protetor da resposta imune celular Th1, mediada por linfócitos T e IFN- na

infecção por T. cruzi tem sido descrito na literatura tanto em modelos experimentais quanto na

DCh humana (Gazzinelli et al., 1992; Munoz-Fernandez et al., 1992; Cardillo et al., 2007;

Sales et al., 2008). A polarização da resposta imunológica para o eixo Th1 é associada a um

perfil de controle da replicação do parasito nos eventos iniciais da infecção. Por outro lado, a

modulação do processo inflamatório, relacionada à produção de citocinas como IL-10, IL-17,

TGF-, por macrófagos e linfócitos T reguladores (Treg CD4+ CD25+ Foxp3+) é

imprescindível para prevenir uma resposta imune exacerbada com consequentes danos

teciduais secundários, sendo assim associada ao melhor prognóstico da doença (Mariano et

al., 2008; Sanoja et al., 2013).

Densidade elevada de células T CD4+ entre o infiltrado de células inflamatórias

mononucleares no tecido cardíaco são achados frequentes durante a fase aguda da infecção

experimental pelo T. cruzi (Mariano et al., 2008; Sales et al., 2008; Sanoja et al., 2013). Essas

células atuam na resistência à infecção através da produção de IFN- responsável por

estimular a síntese e NO por macrófagos e ainda, auxiliando na ativação e expansão de

linfócitos T CD8+ citotóxicos, sendo ambos os mecanismos importantes para o controle da

replicação intracelular do parasito (Brener e Gazzinelli, 1997).

A infecção com a cepa Be-62 foi capaz de manter níveis superiores de linfócitos T

CD4+ ao longo de toda a fase aguda no coração, alcançando maior frequência no 14ºdai, ao

contrário do observado para animais do grupo Be-78 parental, que apresentaram elevação na

densidade dessas células somente no 28ºdai. Aumento na frequência de células T CD4+ no

coração de camundongos C57BL/6 e BALB/c infectados com baixo (50 TS) ou alto (200 TS)

inóculo da cepa Y, no 14ºdai, mantido até o 22ºdai (menores níveis), também foi observado

por outros autores (Sanoja et al., 2013). Embora ainda elevado em relação aos animais não-

infectados, a redução na densidade dessas células no 22ºdai observada por Sanoja et al. (2013)

foi compatível com a redução da parasitemia, o que foi consistente com nossos dados que

demonstraram esse mesmo perfil aos 28dai condizente com o controle da parasitemia no

grupo Be-62. Pode-se sugerir que o comportamento da cepa Be-78 parental também parece


91

acompanhar o perfil descrito por Sanoja et al. (2013), com elevação do percentual de

linfócitos T CD4+ no 28º, próximo ao pico de parasitemia. A associação entre linfócitos T

CD4+ e controle da parasitemia durante a fase aguda também foi demonstrada por Russo et al.

(1988) em camundongos tratados com anticorpos anti-CD4 e infectados com a cepa CL.

Segundo os autores, após inativação das células T helper, miocardite reduzida, e aumento

significativo no número de parasitos no sangue, bem como no coração, foram detectadas nos

animais infectados e tratados em relação aos infectados não tratados.

Linfócitos T CD8+ são essenciais para o controle da infecção quando o parasito

encontra-se no estágio de amastigota intracelular (Rottenberg et al., 1993). Células T CD8+

reconhecem antígenos específicos derivados de proteínas citosólicas ligados à moléculas do

MHC de classe I em qualquer célula nucleada infectada (Tarleton, 2015). Após os estímulos

apropriados, em resposta ao reconhecimento de antígenos do T. cruzi, os linfócitos citolíticos

ativados podem agir sintetizando IFN- ou provocando a morte das células infectadas por

mecanismos que envolvem proteínas como perforina e granzimas A ou B (Martin e Tarleton,

2004).

Todos os animais infectados apresentaram aumento na frequência de linfócitos T

CD8+ no coração e cólon durante a fase aguda da infecção, entretanto, a cepa Be-78 parental e

o isolado Be-785-3mai, mostraram um atraso nessa reposta em relação à cepa Be-62. De

forma interessante, apenas camundongos infectados com a cepa Be-62 e com o isolado Be-

785-3mai, mantiveram, no cólon, elevação na densidade dessas células no 28ºdai. A

associação positiva entre o parasitismo tecidual e a resposta imune celular associada às células

T CD8+ parece evidente em nossos dados. De modo geral, ao final da fase aguda, observa-se

uma relação entre a densidade de células T CD8+ e maior carga parasitária no coração e no

cólon, para o grupo Be-78 parental e para os grupos Be-62 e Be-78 isolado, respectivamente.

Significante aumento de células T CD8+ também foi observado no coração de ratos Wistar

Furth (WF) infectados com a cepa Y, entre o 3º e 18ºdai, quando os animais sucumbiram à

infecção (Sato et al., 1992).

Cães infectados com a cepa Be-78 e necropsiados durante a fase aguda (33dai), de

forma similar ao observado em nosso estudo, apresentaram elevação na frequência de células

T CD4+ e CD8+, com sobreposição do fenótipo CD8+ em relação ao fenótipo CD4+ (Caliari et

al., 2002a). Interessantemente, animais infectados com essa cepa e mantidos ao longo da fase

crônica tardia apresentaram densidades similares em relação aos dois fenótipo de células T

estudados, enquanto animais infectados com a cepa Be-62, necropsiados também na fase


92

crônica tardia, demonstraram uma inversão na proporção CD4+/CD8+, com níveis superiores

de linfócitos T CD4+ (Caliari et al., 2002a). Embora nossas análises tenham sido realizadas

em modelo murino, os resultados obtidos durante a fase aguda da infecção, mostram um perfil

particular para a cepa Be-62, com um aumento precoce (14ºdai) e expressivamente superior

de células T CD4+, entretanto, ao final da fase aguda, ocorre sobreposição do fenótipo CD8+.

As especificidades do comportamento da cepa Be-62 devem-se não somente ao momento

investigado ao longo da infecção (fase aguda ou fase crônica), mas também à fatores

associados ao hospedeiro (camundongo ou cão). Avaliações ao longo da fase crônica no

modelo murino, poderão responder se ambas as cepas apresentarão comportamento

compatível com o observado em cães, além de mostrar a influência do polimorfismo da cepa

Be-78 nos animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai sobre o fenótipo do infiltrado

inflamatório, bem como sobre o histotropismo.

Para investigar o efeito do polimorfismo do T. cruzi sobre a ativação da resposta

imune durante a fase aguda da infecção, a habilidade de linfócitos T CD4+ ou CD8+ em

produzir IFN- também foi avaliada em camundongos infectados com as diferentes

subpopulações do parasito.

A cepa Be-78 foi capaz de estimular ao longo de toda a fase aguda, no coração e

cólon, a síntese de IFN- tanto por linfócitos T CD4+ quanto por linfócitos T CD8+, sendo a

expressão maior observada nesse último fenótipo. De forma contrária, animais infectados com

a cepa Be-62 apenas apresentaram aumento na síntese de IFN- no 28ºdai. Interessantemente,

as células T presentes no infiltrado inflamatório induzido pelo isolado Be-78is5-3mai foram

capazes de sintetizar IFN- somente no cólon e de forma tardia (28dai). A maior frequência

de linfócitos T CD8+ IFN-+ no 28ºdai para o grupo Be-78 isolado concorda com o aumento

na frequência do fenótipo CD8+ no processo inflamatório do cólon. Entretanto, não houve

aumento significativo de células T CD4+ no cólon desses animais, e a maior densidade de

linfócitos T CD4+IFN-+ em relação às células CD45+ está relacionada ao fato de que mais de

65% das células T helper estão sintetizando essa citocina, em detrimento aos 20% observados

para o grupo não-infectado (dados não mostrados).

Nossos resultados sugerem que a participação de IFN- sobre o controle do

parasitismo tecidual parece ocorrer de forma distinta no coração no cólon, além de ter um

fator cepa-dependente. No coração dos animais infectados com a cepa Be-62 e com o isolado

Be-78is5-3mai uma associação entre o aumento da expressão dessa citocina e o controle da

carga parasitária pode ser observada no 28ºdai. No entanto, no cólon, o atraso na produção de


93

IFN- pelos animais pertencentes a estes dois grupos pode estar associado à manutenção da

elevada carga parasitária. Em contrapartida, parece não haver relação entre a produção dessa

citocina e o parasitismo cardíaco nos animais do grupo Be-78 parental, uma vez que níveis

elevados dessa citocina ao longo de toda a fase aguda não foram capazes de controlar a

replicação do parasito. A avaliação de outras citocinas pró-inflamatórias envolvidas nos

eventos iniciais da infecção (IL-12, TNF- bem como de citocinas imunomoduladoras (IL-

10, TGF-) pode ser a chave para explicar o comportamento distinto da cepa Be-78 parental

com o seu isolado (Be-78is5-3mai) e com a cepa Be-62.

Michailowsky et al. (2001) demonstraram a importância do INF- na resistência de

camundongos BALB/c e C57BL6 à infecção com a cepa Colombiana do T. cruzi.

Camundongos nocautes para IFN- foram altamente susceptíveis à infecção, apresentando

elevação da parasitemia, maior número de ninhos de amastigotas no coração e sistema

nervoso central e 100% de mortalidade aos 20dai (Michailowsky et al., 2001). Esses dados

são consistentes com àqueles obtidos em nosso estudo para a cepa Be-62, onde o aumento

discreto e atrasado de IFN- associado à alta parasitemia e à elevada carga parasitária parecem

ter um papel importante na mortalidade (100%) observada 28dai. Por outro lado, embora

também tenha sido observado para o grupo Be-78 isolado, o perfil atrasado de produção dessa

citocina neste caso está associado a uma baixa virulência compatível com à observada para a

cepa Be-78 parental, reforçando que o isolado Be-78is5-3mai apresenta características

intermediárias entre a cepa Be-62 e a cepa Be-78 parental, no que diz respeito ao

comportamento in vitro, ao tropismo tecidual e à montagem da resposta imune nos eventos

iniciais da infecção.

Em suma, nossos resultados mostraram um perfil cardiomiotrópico e retardo no

controle da parasitemia na infecção pela cepa Be-78 parental, seguido por processo

inflamatório intenso ao final da fase aguda, ao contrário da cepa Be-62, que por sua vez,

apresentou-se preferencialmente parasitando o cólon, com parasitemia significativamente

superior, no entanto, controlada precocemente, e processo inflamatório intenso nos dois

órgãos avaliados ao longo da fase aguda. O isolado Be-78is5-3mai, consistente com os dados

da avaliação in vitro, demonstrou durante a fase aguda da infecção de camundongos BALB/c,

um comportamento intermediário entre a cepas de referência utilizadas, apresentando

virulência (parasitemia e mortalidade) compatível com a cepa Be-78 parental, no entanto,

perfil histotrópico compartilhado com a cepa Be-62. O perfil da resposta imunológica


94

apresentado pelos animais infectados com o isolado foi, de forma geral, consistente com

àquele observado para a cepa Be-62, sobretudo no cólon.

Estudos abordando aspectos imunopatogênicos, tanto em modelos experimentais de

infecção quanto em pacientes portadores da DCh, indicam que a situação ideal para ambos

parasito e hospedeiro ocorre quando há um balanço entre a resposta imune efetiva capaz de

manter o parasitismo em níveis baixos e a modulação desta, prevenindo seus efeitos

citotóxicos (Dutra et al., 2009). O efeito direto da resposta imunológica desenvolvida durante

a fase aguda da infecção sobre lesões crônicas, assim como a influência do polimorfismo

biológico e molecular do T. cruzi, associado também à fatores intrínsecos do hospedeiro

suscitam a necessidade de estudos complementares, no que diz respeito à modulação da

resposta imune e ao desenvolvimento das lesões histológicas durante a fase crônica,

contribuindo não só para elucidação dos fenômenos relacionados aos danos teciduais, como

sendo de fundamental importância para o esclarecimento da evolução da doença, além de

auxiliar no estabelecimento de estratégias terapêuticas eficazes para o tratamento e prevenção

da fibrose cardíaca e da lesão entérica na infecção chagásica.

Nesse sentido, a avaliação de camundongos BALB/c infectados com as cepas Be-62,

Be-78 parental e com o isolado Be-78is5-3mai está sendo conduzida por nosso grupo de

pesquisa, com o objetivo de elucidar melhor a influência da infecção por uma cepa policlonal

sobre as lesões cardíaca e digestiva ao longo da DCh experimental.

95

7. CONCLUSÃO

Nogueira-Paiva, NC Conclusão

96

Nossos dados reforçam a hipótese de que a infecção a longo prazo com a cepa Be-78 foi

capaz de selecionar uma subpopulação que compartilha características com a cepa Be-62.

Adicionalmente, confirmamos o modelo histotrópico clonal, indicando heterogeneidade

clonal capaz de influenciar de forma distinta os eventos iniciais da infecção, com possíveis

repercussões para o curso crônico da doença de Chagas.

A subpopulação Be-78is5-3mai, isolada de camundongos Swiss infectados com a cepa

policlonal Be-78 do Trypanosoma cruzi, demonstrou comportamento in vitro e perfil

gênico intermediários entre as cepas de referência, Be-78 parental e Be-62.

Durante a fase aguda da infecção de camundongos, o isolado Be-78is5-3mai manteve esse

mesmo comportamento, entre a cepas de referência utilizadas, apresentando virulência

(parasitemia e mortalidade) compatível com a cepa Be-78 parental, no entanto, perfil

histotrópico e resposta imune compartilhados com a cepa Be-62.

97

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Nogueira-Paiva, NC Referências Bibliográficas

98

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113

VIEIRA, P. M.; FRANCISCO, A. F.; MACHADO, E. M.; NOGUEIRA, N. C.; FONSECA KDA, S.; REIS, A. B.; TEIXEIRA-CARVALHO, A.; MARTINS-FILHO, O. A.; TAFURI, W. L.; CARNEIRO, C. M. Different infective forms trigger distinct immune response in experimental Chagas disease. PLoS One, v. 7, p. e32912, 2012. VIRREIRA, M.; SERRANO, G.; MALDONADO, L.; SVOBODA, M. Trypanosoma cruzi: typing of genotype (sub)lineages in megacolon samples from bolivian patients. Acta Trop, v. 100, p. 252-5, 2006. WESTENBERGER, S. J.; CERQUEIRA, G. C.; EL-SAYED, N. M.; ZINGALES, B.; CAMPBELL, D. A.; STURM, N. R. Trypanosoma cruzi mitochondrial maxicircles display species- and strain-specific variation and a conserved element in the non-coding region. BMC Genomics, v. 7, p. 60, 2006. WHO. Expert Committee. Control of Chagas disease. Brasília, Brasil. WHO technical report series 905. 2002. WHO. Chagas disease control and prevention in Europe. Report of a WHO Informal Consultation. 2010a. WHO. First WHO Report on Neglected Tropical Diseases: working to overcome the global impact of neglected tropical diseases. 2010b. WIRTH, J. J.; KIERSZENBAUM, F. Fibronectin enhances macrophage association with invasive forms of Trypanosoma cruzi. J Immunol, v. 133, p. 460-4, 1984. ZAFRA, G.; MANTILLA, J. C.; VALADARES, H. M.; MACEDO, A. M.; GONZALEZ, C. I. Evidence of Trypanosoma cruzi II infection in Colombian chagasic patients. Parasitol Res, v. 103, p. 731-4, 2008. ZELEDON, R.; RABINOVICH, J. E. Chagas' disease: an ecological appraisal with special emphasis on its insect vectors. Annu Rev Entomol, v. 26, p. 101-33, 1981. ZINGALES, B.; ANDRADE, S. G.; BRIONES, M. R.; CAMPBELL, D. A.; CHIARI, E.; FERNANDES, O.; GUHL, F.; LAGES-SILVA, E.; MACEDO, A. M.; MACHADO, C. R.; MILES, M. A.; ROMANHA, A. J.; STURM, N. R.; TIBAYRENC, M.; SCHIJMAN, A. G.; SECOND SATELLITE, M. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting recommends TcI to TcVI. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 104, p. 1051-4, 2009. ZINGALES, B.; MILES, M. A.; CAMPBELL, D. A.; TIBAYRENC, M.; MACEDO, A. M.; TEIXEIRA, M. M.; SCHIJMAN, A. G.; LLEWELLYN, M. S.; LAGES-SILVA, E.; MACHADO, C. R.; ANDRADE, S. G.; STURM, N. R. The revised Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: rationale, epidemiological relevance and research applications. Infect Genet Evol, v. 12, p. 240-53, 2012. ZINGALES, B.; SOUTO, R. P.; MANGIA, R. H.; LISBOA, C. V.; CAMPBELL, D. A.; COURA, J. R.; JANSEN, A.; FERNANDES, O. Molecular epidemiology of American trypanosomiasis in Brazil based on dimorphisms of rRNA and mini-exon gene sequences. Int J Parasitol, v. 28, p. 105-12, 1998.

114

9. ANEXOS

Nogueira-Paiva, NC Anexos

115

9.1 Anexo 1: Protocolo nº 2011/30- CEUA/UFOP


116

9.2 Anexo 2: Protocolo nº 2014/29- CEUA/UFOP


117

9.3 Anexo 3: Resumo dos resultados obtidos na ETAPA II

CORAÇÃO

Tempo Grupos Carga

Parasitária Inflamação

Total Macrófago Linfócito B

Linf T CD4+

Linf T CD8+

Linf T CD4+IFN-+

Linf T CD8+IFN-+

7dai

NI x Be-62 = = =

NI x Be-78 isolado ~ = = = = = = =

NI x Be-78 parental ~ = = = = =

Be-62 x Be-78 isolado = = = = =

Be-62 x Be-78 parental = = =

Be-78 isolado x Be-78 parental = = = = = =

14dai

NI x Be-62 = =

NI x Be-78 isolado = = = = =

NI x Be-78 parental = = = = =

Be-62 x Be-78 isolado = = = =

Be-62 x Be-78 parental = = =

Be-78 isolado x Be-78 parental = = = = = =

28dai

NI x Be-62 =

NI x Be-78 isolado = = = =

NI x Be-78 parental

Be-62 x Be-78 isolado = =

Be-62 x Be-78 parental = = = =

Be-78 isolado x Be-78 parental = = =

Figura 30: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando as diferentes subpopulações do T. cruzi, em relação à carga parasitária e ao processo inflamatório (intensidade e fenótipo) no coração de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. NI: grupo de animais não-infectados; Be-62: grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado: grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental: grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. (=): ausência de diferença estatística; (~): ausência de diferença estatística, no entanto, alguns parasitos presentes; ( ): e; ( ): estatisticamente superior para o grupo Be-62; ( ): estatisticamente superior para o grupo Be-78 isolado; ( ): estatisticamente superior para o grupo Be-78 parental.


118

CÓLON

Tempo Grupos Carga

Parasitária Inflamação

Total Macrófago Linfócito B Linf T CD4+ Linf T CD8+

Linf T CD4+ IFN-+

Linf T CD8+ IFN-+

7dai

NI x Be-62 = = = NI x Be-78 isolado = =

NI x Be-78 parental = = = Be-62 x Be-78 isolado = = = = =

Be-62 x Be-78 parental = = = = Be-78 isolado x Be-78 parental = = = =

14dai

NI x Be-62 = NI x Be-78 isolado = =

NI x Be-78 parental = = = Be-62 x Be-78 isolado = = = =

Be-62 x Be-78 parental = = = = Be-78 isolado x Be-78 parental = =

28dai

NI x Be-62 = = = NI x Be-78 isolado =

NI x Be-78 parental = = = = = Be-62 x Be-78 isolado = =

Be-62 x Be-78 parental = = = Be-78 isolado x Be-78 parental = = =

Figura 31: Representação esquemática dos resultados obtidos na ETAPA II, comparando as diferentes subpopulações do T. cruzi, em relação à carga parasitária e ao processo inflamatório (intensidade e fenótipo) no cólon de camundongos BALB/c necropsiados ao longo da fase aguda (7, 14 ou 28 dias após a infecção-dai) da infecção experimental com o isolado Be-78is5-3mai, ou com as cepas de referência Berenice-62 e Berenice-78 parental do Trypanosoma cruzi. NI: grupo de animais não-infectados; Be-62: grupo de animais infectados com a cepa Be-62; Be-78 isolado: grupo de animais infectados com o isolado Be-78is5-3mai; Be-78 parental: grupo de animais infectados com a cepa Berenice-78. (=): ausência de diferença estatística; (~): ausência de diferença estatística, no entanto, alguns parasitos presentes; ( ): estatisticamente superior para o grupo NI (nível de expressão compatível com a normalidade); ( ): estatisticamente superior para o grupo Be-62; ( ): estatisticamente superior para o grupo Be-78 isolado; ( ): estatisticamente superior para o grupo Be-78 parental.


119

9.4 Anexo 4: Manuscrito publicado no periódico PLOs One/ETAPA I

NOGUEIRA-PAIVA, N. C.; VIEIRA, P. M.; OLIVERI, L. M.; FONSECA KDA, S.; POUND-LANA, G.; DE OLIVEIRA, M. T.; DE LANA, M.; VELOSO, V. M.; REIS, A. B.; TAFURI, W. L.; CARNEIRO, C. M. Host-Parasite Interactions in Chagas Disease: Genetically Unidentical Isolates of a Single Trypanosoma cruzi Strain Identified In Vitro via LSSP-PCR. PLoS One, v. 10, p. e0137788, 2015.

RESEARCH ARTICLE

Host-Parasite Interactions in Chagas Disease:

Genetically Unidentical Isolates of a Single

Trypanosoma cruzi Strain Identified In Vitro

via LSSP-PCR

Nívia Carolina Nogueira-Paiva1, Paula Melo de Abreu Vieira1,3, Larissa Maris

Rezende Oliveri1, Kátia da Silva Fonseca1, Gwenaelle Pound-Lana1, Maykon Tavares de

Oliveira2, Marta de Lana2,5, Vanja Maria Veloso4, Alexandre Barbosa Reis1,5, Washington

Luiz Tafuri1†, Cláudia Martins Carneiro1,5*

1 Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatase Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG, Brazil, 2 Laboratório de Doença deChagas, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas,Universidade Federal de Ouro Preto,Ouro Preto, MG, Brazil, 3 Departamento de Ciências Biológicas,Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, UniversidadeFederal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG, Brazil, 4 Departamento de Farmácia, Escola de Farmácia,Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, MG, Brazil, 5 Departamento de Análises Clínicas, Escolade Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto,Ouro Preto, MG, Brazil

†Deceased.* [email protected]

Abstract

The present study aims at establishing whether the diversity in pathogenesis within a genet-

ically diverse host population infected with a single polyclonal strain of Trypanosoma cruzi

is due to selection of specific subpopulations within the strain. For this purpose we infected

Swiss mice, a genetically diverse population, with the polyclonal strain of Trypanosoma

cruzi Berenice-78 and characterized via LSSP-PCR the kinetoplast DNA of subpopulations

isolated from blood samples collected from the animals at various times after inoculation (3,

6 and 12 months after inoculation). We examined the biological behavior of the isolates in

acellular medium and in vitro profiles of infectivity in Vero cell medium. We compared the

characteristics of the isolates with the inoculating strain and with another strain, Berenice

62, isolated from the same patient 16 years earlier. We found that one of the isolates had

intermediate behavior in comparison with Berenice-78 and Berenice-62 and a significantly

different genetic profile by LSSP-PCR in comparison with the inoculating strain. We hereby

demonstrate that genetically distinct Trypanosoma cruzi isolates may be obtained upon

experimental murine infection with a single polyclonal Trypanosoma cruzi strain.

PLOSONE | DOI:10.1371/journal.pone.0137788 September 11, 2015 1 / 14

OPEN ACCESS

Citation: Nogueira-Paiva NC, Vieira PMdA, Oliveri

LMR, Fonseca KdS, Pound-Lana G, de Oliveira MT,

et al. (2015) Host-Parasite Interactions in Chagas

Disease: Genetically Unidentical Isolates of a Single

Trypanosoma cruzi Strain Identified In Vitro via

LSSP-PCR. PLoS ONE 10(9): e0137788.

doi:10.1371/journal.pone.0137788

Editor: Alex Córdoba-Aguilar, Universidad Nacional

Autonoma de Mexico, MEXICO

Received: May 19, 2015

Accepted: August 21, 2015

Published: September 11, 2015

Copyright: © 2015 Nogueira-Paiva et al. This is an

open access article distributed under the terms of the

Creative Commons Attribution License, which permits

unrestricted use, distribution, and reproduction in any

medium, provided the original author and source are

credited.

Data Availability Statement: All relevant data are

within the paper and its Supporting Information file.

Funding: Funding was provided by the Universidade

Federal de Ouro Preto (UFOP), Fundação de

Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais

(FAPEMIG), Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) and research fellowships from CNPq

(Carneiro CM, Reis AB, Lana M, Oliveri LMR),

CAPES (Fonseca KS, Nogueira-Paiva NC) and

http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1371/journal.pone.0137788&domain=pdf

http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Introduction

More than a hundred years after the first human clinical case of Chagas disease was described,

the origin of the broad clinical spectrum of the disease, ranging from asymptomatic to cardiac

and gastro-enteric manifestations, has yet to be elucidated. The polymorphism of Trypanosoma

cruzi (T. cruzi), the etiologic agent of Chagas disease, was demonstrated via both biochemical

and genetic assays [1]. However, attempts to correlate the pathogenicity, tissue-tropism or

drug-susceptibility [2] to specific strains or distinct typing units (DTU) of T. cruzi have failed.

Polyclonal strains are commonly found in natural infections. They consist of a combination

of subpopulations of clones with distinct biological and genetic characteristics. According to

the clonal-histotropic model [3] some clonal associations are selectively advantageous resulting

in stable strains. The host genetic background may however determine its susceptibility

towards infection and towards the development of the disease [4, 5]. When mammals are

infected, the clonal repertory may determine which tissues will be affected [6]. Given that not

all clones are able to trigger infection, the clones that are able to establish themselves probably

compete among each other and colonize distinct tissues. Therefore the interaction between

each clone and a specific tissue may be a determining factor in the development of distinct clin-

ical forms of Chagas disease [3].

The Berenice strain was isolated from the first described human case of Chagas disease [7]

from a patient living in an endemic area for the disease (município de Pirapora, MG/Brasil). In

addition to the T. cruzi subpopulation isolated during the acute phase [7], another two parasite

samples, currently named Berenice 62 (Be-62) and Berenice-78 (Be-78) strains, were isolated

from this same patient with a 16-year interval between collections via xenodiagnostic using

Triatoma infestans and Dipetalogaster maximus, respectively [8, 9]. Interestingly both isolates

present different in vitro biological behavior, virulence and pathogenicity [10]. Two hypotheses

have been put forward to explain the alteration in profile of these strains. Even though the

patient denies any contact with the vector after contracting the disease, the possibility of re-

infection cannot be completely discarded given that she continued living in an endemic area.

However, should there have been no re-infection, the differences between the two isolates sug-

gest selection of one or more subpopulations from the initial strain via immunologic mecha-

nisms that take place during the chronic phase of the disease [10]. This hypothesis is supported

by the demonstrated polyclonality of the Berenice strain [11] but remains to be elucidated.

While genetic studies can demonstrate the intraspecific heterogeneity of the parasite, prob-

ing the biological behavior and host-parasite interactions help clarify the importance of differ-

ent strains and different subpopulations within a strain in determining the clinical and

epidemiologic manifestations of the disease [12]. In this respect, Vago et al. [13] demonstrated

that T. cruzi with distinct kinetoplast DNA (kDNA) signatures were detected in different tis-

sues in human cases of Chagas disease. Veloso and coworkers [14] studied the host-parasite

interaction in experimental infections in dogs with polyclonal T. cruzi strains and found dis-

tinct T. cruzi populations in each host, which composition could vary along the course of long-

term infection [14]. Rodrigues and coworkers [5] observed that the immune response of

human patients in the case of co-infection with two different T. cruzi strains does not follow

the pattern of the immune response observed in the case of infection with either of the two

strains studied. All the above-cited studies of natural and experimental co-infections have

pointed out the need to consider clonal interactions in understanding the pathology.

Due to possible adaptive clonal selection, in vitro and in vivo studies on the genetic variabil-

ity of T. cruzi in infected animals have long suffered from experimental limitations related to

culture and maintenance of the parasite [15, 16, 17]. Many of these limitations were overcome

recently with the introduction of the experimental technique low-stringency single specific

Trypanosoma cruzi and Parasite Selection

PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0137788 September 11, 2015 2 / 14

FAPEMIG (Pound-Lana G, Oliveira MT). The funders

had no role in study design, data collection and

analysis, decision to publish, or preparation of the

manuscript.

Competing Interests: The authors have declared

that no competing interests exist.

primer polymerase chain-reaction (LSSP-PCR), a PCR-based technique that enables DNA pro-

filing directly from an infected tissue [18]. The technique is designed in such a way that minute

alterations in the genome, such as a single-base alteration can be detected [19]. As such it is a

very sensitive technique capable of differentiating between subpopulations within a given DTU

[20].

Although there is supporting evidence for the validity of the clonal-histotropic model, it

remains to be confirmed whether a single subpopulation should display tropism for a specific

organ or cell component. In an attempt to validate such hypothesis we designed the presently

reported study, where the Swiss mice host serves as a “filter” to isolate a clonal subpopulation

with distinct genetic characteristics from the infecting strain.

Animals, Materials and Methods

All procedures and experimental protocols were conducted in accordance with the directives

issued by the Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA) and approved by the Eth-

ics Committee in Animal Research at the Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), Minas

Gerais, Brazil (protocol number 2011/30, the arrive guidelines checklist in S1 File). Prior to the

study, the animals were dewormed and vaccinated against several infectious diseases.

2.1 T. cruzi strainsBe-62 [8] and Be-78 [9] strains were maintained by successive passages in mice. Be-62 and Be-

78 belong to DTU TcII [21].

2.2 Animals and experimental infectionTwenty-four one-month-old Swiss mice from the Center for Animal Science CCA/UFOP,

weighed 23.5–24.5g, were inoculated intraperitoneally with 5.0 × 103 bloodstream trypomasti-

gotes of the Be-78 T. cruzi strain and maintained at the following environmental conditions: 12

h day/night cycle, temperature 22 ± 2°C, food and water ad libitum for 12 months after infec-

tion (MAI). The infection and curve of parasitemia were confirmed via examination of fresh

blood samples according to the methodology of [22]. The anesthetized mice (ketamine 60 mg/

kg and xylazine 7.5 mg/kg, [23]) underwent blood sampling for hemoculture at three, six and

twelve MAI, which corresponds to the chronic phase of the disease. Under sterile conditions,

200 μl of blood collected from the orbital plexus of each mouse were added to 15 ml sterile

tubes (Falcon, Becton Dickinson, USA) containing liver infusion tryptose (LIT) medium sup-

plemented with 10% inactivated fetal bovine serum (LIT-10% FCS, Liver Infusion Tryptose-

10% Fetal Bovine Serum) and stored in a refrigerated B.O.D incubator at 28°C ± 1°C for assess-

ment at 30, 60 and 90 days after collection. During the course of the experiment the animals

were monitored daily and not show signs of pain or distress. The criteria used for evaluating

their health and welfare were their weight, appetite, water consumption, skin and fur condition,

in comparison with a non-inoculated control group. At the end of the study, mice were eutha-

nized in a CO2 chamber and all efforts were made to minimize suffering.

Positive hemocultures were maintained in exponential growth in LIT medium-10% FCS,

for a short period of time to minimize parasite selection, under the same conditions

(28°C ± 1°C) [24] to determine the behavior in acellular culture medium (LIT) or cellular cul-

ture medium (Vero cells) and also for obtaining a sufficient number of epimastigotes for

molecular characterization. Samples of these cultures were subjected to evaluation of in vitro

growth kinetics of epimastigotes, incubated in Grace (Grace's Insect Medium, Sigma) to induce

metacyclogenesis (in vitro infection assay) or washed and harvested for LSSP-PCR. For this

purpose the cultures were transferred to 50 ml tubes (Falcon, Becton Dickinson, USA) and



centrifuged at 3.400g for 30 min at 4°C. The supernatant was discarded and the pellet sus-

pended in 10 ml of sterile 10% PBS (Phosphate-Buffered Saline) at pH 7.2. The cells were

washed and centrifuged 3 times (3.400g for 10 min, 4°C) in 10% PBS. The epimastigotes

obtained were stored in a freezer at -70°C.

2.3 Growth kinetics in acellular culture mediumIn vitro growth kinetic curves of the isolates in acellular culture medium LIT-10% SFB were

obtained from a standard inoculum of 1 x 106 parasites / ml in a final volume 3 ml. For this

purpose the volume used in the inoculum for each culture was determined with a Neubauer

chamber, and the cultures were kept in triplicate in a refrigerated B.O.D incubator at

28°C ± 1°C during the evaluation period. Cell count was carried out daily in a Neubauer cham-

ber under 400x magnification over a period of 20 days [25].

2.4 Profile of infectivity and in vitro developmentThe in vitro profile of infectivity and growth of the isolates of Be- 78 strain were compared to

those of the parental Be-78 strain and of Be-62 strain in Vero cell cultures subjected to infection

and assessed after 24, 48 and 72h, in triplicate, according to a methodology adapted from

Andrade et al. [26]. Briefly, after 24h of culture, semiconfluent monolayers of Vero cells (104)

fixed on glass coverslips were incubated at 5% CO2 and 37°C for 18h (overnight) with axenic

cultures metacyclic trypomastigotes, to a MOI (multiplicity of infection) of 10, of different T.

cruzi subpopulations (105), previously submitted to metacyclogenesis in Grace medium. After

washing with PBS to remove extracellular parasites, cultures were kept under the same incuba-

tion conditions until the time of collection of the cells (24, 48 and 72h after inoculation). Subse-

quently, the cultures were fixed in methanol and stained with Fast Panoptic and the ratios of

infection and intracellular development or proliferation were examined by optical microscopy

under 1000x magnification. The infectivity ratio was calculated as the number of infected cells

per 100 cells counted, while the intracellular development ratio was calculated as the ratio of

the number of parasites counted over the number of infected cells.

2.5 Gene Signature by LSSP-PCRThe evaluation of gene polymorphism between different isolates and the Be-78 parental strain

by LSSP-PCR consisted in obtaining, purifying and amplifying the template DNA followed by

a second amplification using a single primer under conditions of low stringency [19]. The spe-

cific amplification of the 330bp (base pairs) fragment of the kDNA of T. cruzi was performed

according to the method of Gomes et al. [27]. The amplified products were revealed on 1.5%

agarose gel (1.0% agarose + 0.5% LowMelting Point agarose / Invitrogen) and stained with

ethidium bromide. The 330bp fragment, visualized under UV radiation, was removed from the

gel using a plastic pipettor. After heating in a thermostated water bath, these fragments were

homogenized, diluted in sterile Milli-Q water at a ratio of 1:10 (v/v) and used in a second

amplification step. For the LSSP-PCR reactions the DNA samples were re-amplified using a

single specific primer (corresponding to the primer S35), termed S35G� (5’-AAA TAA TGT

ACG GGG GAG AT-3’). The reaction mixture reached a final volume of 10 μL containing

6.38 μl of sterile milli-Q water; 2.0 μl of sample buffer; 0.2 μl of each deoxynucleotide (dNTP:

dATP, dCTP, dGTP, dTTP—Sigma, St. Louis, MO, USA); 0.1 μl of primer S35G � (450μM)

and 0.32 μl of Taq DNA polymerase (5U / μl—Go Taq Promega). To this mixture was added

1 μL of DNA diluted at 1:10 (v/v). The amplification was carried out under the following condi-

tions: initial DNA denaturation step at 94°C for 5 min, annealing at 30°C for 1 min, extension

at 72°C for 1 min, followed by 40 amplification cycles consisting of a denaturation step at 94°C



for 1 min, annealing at 30°C for 1 min, ending with an extension step at 72°C for 10 min. The

products of this second amplification were revealed in duplicate on 8% polyacrylamide gel,

stained with silver and analyzed for band sharing.

2.6 Statistical analysesFor the evaluation of growth profiles in axenic growth medium the area-under-the-curve

(AUC) was considered via Kruskal-Wallis one-way analysis of variance for non-parametric

data followed by Dunn´s post-hoc test for comparison with the reference Be-78 and Be-62

strains. The in vitro infection test with Vero cells were compared using Anova two-way analysis

of variance followed by Bonferroni post-hoc test for comparison with the reference Be-78 and

Be-62 strains. In all cases, differences were considered statistically significant at p values lower

than 0.05.

Results

3.1 HemoculturesOut of the twenty-four mice infected with the Be-78 T. cruzi strain and subjected to blood col-

lection seven presented positive hemocultures at one sampling time at least (Table 1). Although

not all animals were found positive for hemocultures, it was possible to isolate parasites at all

three sampling times, over a year of infection.

3.2 Growth kinetics in acellular culture mediumGrowth curves were recorded over 20 days after inoculation of 106 parasites / ml of culture for

each isolate. We observed a significant difference in the area under the curve (AUC) between

the two strains used as reference. The Be-78 parental strain (5,3x108) presented a higher repli-

cation ratio than the Be-62 strain (3,7x108). In addition to the AUC, the differences in behavior

in the distinct phases of the growth epimastigote curve was confirmed between these strains in

axenic culture showing a higher and earlier growth with early entry into the decline phase for

the Be-62 strain, compared to the strain Be-78 (Fig 1), as described by other authors [9, 10].

Furthermore, a significant reduction in the AUC was identified in two isolates, Be-78is15-6mai

(4,2x108) and Be-78is1-12mai (4,2x108) in comparison with the Be-78 strain used in the inocu-

lum (5,3 x108), indicating that the former have reduced ability to grow in culture medium com-

pared to the parental strain. In comparing the different stages of growth (lag, log, stationary

and decline phases), regardless of the AUC, among the various isolates, it was found that both

Table 1. Hemocultures. Repartition of the positive hemocultures from blood samples collected frommiceinfected with Berenice-78 T. cruzi strains at three, six and twelve months after infection.

Hemoculture Animal Identification

3MAI 5 Be-78is5-3mai

21 Be-78is21-3mai


2 Be-78is2-6mai

5 Be-78is5-6mai

15 Be-78is15-6mai


15 Be-78is15-12mai

Be-78: Berenice-78; is: isolate; MAI/mai: months after infection.

doi:10.1371/journal.pone.0137788.t001



isolates collected at three MAI (Be-78is5-3mai and Be-78is21-3mai) presented profiles similar

to the Be-62 strain (Fig 1). This data indicates the presence in the population of strain Be-78 of

at least one subpopulation that shares features similar to strain Be-62.

3.3 Infectivity and in vitro developmentIn order to evaluate the behavior of each parasite isolate in cell medium, the profiles of infectiv-

ity and development in Vero cell were determined at 24, 48 and 72h of incubation (Figs 2 and

3). All subpopulations successfully infected Vero cells after 24h. For most samples the

Fig 1. Growth kinetics in acellular culture medium.Growth kinetics of epimastigotes in LIT medium fromdays 0 to 20 of the parasites isolates obtained from hemoculture at 3, 6 or 12 months after infection of Swissmice with 5000 blood trypomastigotes from Be-78 Trypanosoma cruzi strain. The Y-axis represents thenumber of parasites triplicate median x 107/ml and the X axis represents the days of culture. The isolates’growth curves (hatched line) are presented in comparison with the curves of the strain used in the inoculum(Berenice-78 parental: continous black lineBe-78) and of Berenice-62 strain (continous grey line Be-62).

doi:10.1371/journal.pone.0137788.g001



infectivity ratios doubled at 48h after inoculation, corresponding to the period of multiplica-

tion of the parasite inside the host cell. One isolate obtained at 6MAI, however, (Be-78is2-

6mai) presented ratios of infectivity and development threefold higher than the other isolates

within 24h of incubation only, remaining stable until the end of the experiment. Between 48

Fig 2. Infectivity and in vitro development. In vitro infection assay in Vero cell cultures using Berenice-62(grey square), Berenice-78 (parental, black square) strains and subpopulations/isolates of Be-78 strain,obtained from hemocultures at 3, 6 or 12 months after infection of Swiss mice with 5000 bloodtrypomastigotes from Be-78 Trypanosoma cruzi strain. After 18 exposure hours to the parasite, the cells werewashed to remove extracellular parasites and maintained in medium until collection, fixation and staining 24(solid bar), 48 (hatched bar) ou 72 (dotted bar) hours after inoculum. A) number of infected cells in 100counted cells; B) number of intracellular amastigotes in 100 counted cells; C) number of intracellularparasites per infected cell. *: Significant difference compared to the 24 hours of culture; #: Significantdifference compared to the 48 hours of culture; a: significant difference compared to the strain Be-62; b:significant difference compared to the Be-78 parental strain. The data represent the mean oftriplicates ± standard error.


Fig 3. Infectivity and in vitro development illustration.Representative photomicrographs of in vitro assayinfection in Vero cell cultures with Berenice-62 and Berenice-78 parental strains and subpopulations/isolatesof Be-78 strain, obtained from hemocultures at 3, 6 or 12 months after infection of Swiss mice with 5000 bloodtrypomastigotes from Be-78 Trypanosoma cruzi strain. After 18 hours exposure to the parasite, the cells werewashed to remove extracellular parasites and maintained in medium until collection, fixed and stained at 24,48 or 72 hours after inoculation. Increasing the rate of infectivity (asterisks) 48h after incubation for Be-62strain (a, b, c) strain and for Be 78is5-3mai isolate (g, h, i); Increased rate of intracellular multiplication(asterisks) in 72h time for Be-78 parental strain (d, e, f); Infectivity and intracellular development profilesupper (asterisks) for isolate Be-78is2-6mai (j, k. G), and lower for Be-78is14-12mai (m, n, o). Fast Panotic.Bar = 25μm.




and 72h after incubation the ratios of infectivity and development of all samples remained sta-

ble, except for the ratio of development of the parental strain, lower in the early times, which

continued increasing with time, suggesting a slow behavior in cell culture of the latter. All

other subpopulations presented an increase in the ratio of infectivity with time and variable

ratio of development along the experiment.

Comparison of the in vitro ratios of infectivity and intracellular development of the different

isolates with the strains used as references in the present study (Be-62 and Be-78) is presented

in Fig 2. 48 h after inoculation Be-62 strain and the isolates Be-78is5-3mai and Be-78is21-3mai

were found to have parasitized more cells than Be-78 strain.

At 72h after infection, although there was no difference in the infectivity ratios, the ratio of

development of amastigotes from Be-78 was higher than that of Be-62 (p<0,001) and of the

isolates obtained at three MAI (p<0,05). This data demonstrates that strain Be-62 presents an

early increase in infectivity, whereas Be-78 shows a higher ability for in vitro development and

a slower profile of infectivity. The behaviors of isolates Be-78is5-3mai and Be-78is21-3mai

were similar to that of strain Be-62, which is in line with observations from the growth in acel-

lular medium assay.

Isolate Be-78is2-6mai showed a higher infectivity ratio than both strains Be-62 (p<0,001)

and Be-78 (p<0,001) already at 24h after inoculation, and remained stable for the rest of the

experiment. At 24 and 48h the number of amastigotes was higher than for Be-62 and Be-78.

Although the number of intracellular amastigotes per infected cell remained the same between

24 and 48h, the higher number of infected cells for this isolate indicates a fast and efficient

infectivity profile. 72 h after inoculation the number of infected cells for isolate Be-78is2-6mai

became lower than that of Be-78, which is due to a higher intracellular development ratio of

Be-78. Nonetheless, the higher infectivity ratio maintained by isolate Be-78is2-6mai reaffirms

the success of this particular isolate in invading new cells of the host tissue. This behavior may

be a result of selection by the vertebrate host immune system (Swiss mouse), which in the case

of this particular animal promoted a more virulent subpopulation.

The other isolates presented no significant change in infectivity profiles compared to those

of Be-62 and Be-78 strains, even though their ratios of development were lower. One exception,

however, is the increase in ratio of development, observed 48h after inoculation, for isolate Be-

78is15-12mai compared to Be-78 and Be-62, showing an early proliferation peak in compari-

son with Be-78 and greater replicative capacity compared to Be-62. This isolate showed a

growth curve in acellular medium significantly lower than that observed for the Be-78 parental

strain, highlighting the variable behavior of each strain under different environmental

pressures.

3.4 kDNA signature by LSSP-PCRMany of the bands in the multiband patterns by LSSP-PCR of the reference Be-78 and Be-62

strains were composed of bands shared by both reference strains. One band, however, in the

100bp region, is absent from the profile of strain Be-78 and visible in the Be-62 band profile

(Fig 4). Isolate Be-78is5-3mai presented a profile with bands shared with each of the strains,

the parental strain Be-78 and strain Be-62, including the band slightly below 100bp specific to

Be-62. This band was also visible, although with a lesser intensity, in the profiles of two other

isolates (Be-78is1-6mai and Be-78is5-6mai), indicating some similarities between the subpopu-

lation(s) present in the isolates and those present in strain Be-62. A slight variability in the

band profiles between duplicates may be due to the fact that the isolates were not obtained via

cloning and therefore may be composed of more than one subpopulation.



Eight bands obtained in the gene signature profile analysis for LSSP-PCR were used to build

the phenogram from UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Averages).

The choice of the bands was based on its resolution, reproducibility between duplicates and

intensity. The phenogram showed two distinct groups (Fig 5), group I, including the Be-78

parental strain and the isolates obtained at different times along the experimental chronic

phase (Be-78is5-3mai, Be-78is21-3mai, Be-78is1-6mai, Be-78is2-6mai, Be-78is5-6mai, Be-

78is15-6mai, Be-Be-78is1-12mai and 78is15-12mai) and group II, comprising the Be-62 strain.

In group I, the Be-78 strain of subpopulations divided into two groups, with isolated Be-78is5-

3mai, being the one who distanced itself from parental strain. The remaining isolates formed a

group more genetically correlated with the parental strain (Fig 5).

Isolate Be-78is5-3mai shared four bands in its LSSP-PCR profile with that of Be-78, versus

three with Be-62. Strain Be-78 shared only 2 bands with strain Be-62. This data indicates that

Fig 4. kDNA signature by LSSP-PCR.Gene signatures of 330bp fragment of the kDNAminicircle regionrevealed in 8% polyacrylamide gel and silver stained. 100bp molecular weight (MW) in channel one and otherchannels regarding the isolates genetic profiles obtained from hemocultures at 3, 6 or 12 months afterinfection of Swiss mice with 5000 blood trypomastigotes from Be-78 Trypanosoma cruzi strain compared tothe Be-78 parental and Be-62 strains. Be-62 (2–3); Be-78 parental (4–5); Be-78is5-3mai (6–7); Be-78is21-3mai (8–9); Be-78is1-6mai (10–11); Be-78is2-6mai (12–13); Be-78is5-6mai (14–15); Be-78is15-6mai (16–17); Be-78is1-12mai (18–19); Be-78is15-12mai (20–21). Arrow heads indicate the bands shared between theisolate Be-78is5-3mai and the reference strains, Be-78 parental and Be-62.


Fig 5. UPGMA. Phenogram constructed from UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Arithmeticaverages) resulting from the gene signature profile analysis obtained by LSSP-PCR of isolates obtained fromhemocultures at 3 (Be-78is5-3mai, Be-78is21-3mai), 6 (Be-78is1-6mai; Be-78is2-6mai; Be-78is5-6mai;78is15-6mai-Be) and 12 (Be-78is1-12mai; Be-78is15-12mai) months after infection of Swiss mice with 5000blood trypomastigotes from Be-78 Trypanosoma cruzi strain in comparison with the Be-78 parental and Be-62 strains.




the isolate Be-78is5-3mai is genetically closer to strain Be-78 than to strain Be-62, however,

this genetic distance between the isolate and Be-62 strain is less than the distance between

strain Be-78 and strain Be-62 (Fig 5).

Discussion

According to the current classification of T. cruzi subpopulations in Discrete Typing Units

(DTU) both Be-62 and Be-78 strains belong to DTU TcII [21]. Although these two strains were

sufficiently related to be classified within the same DTU they are morphologically distinct. The

Be-62 strain is predominantly composed of slender forms, presents peak parasitemia around the

seventh day and a mortality rate of 100% at 15 days after infection in mice [9, 10, 28], while the

Be-78 strain is composed of large shapes, presents peak parasitemia later (day 15) and a survival

rate of 100% [9, 10, 29, 30]. When introduced in acellular culture medium, Be-78 showed lower

growth capacity and high rates of differentiation, while under the same conditions Be-62

showed a high capacity of multiplication and average rates of differentiation [9, 10].

Furthermore, data obtained in our laboratory showed that strains belonging to the same

DTU, namely TcII, Y and Be-78 strains, had drastically different pathogenicities in experimen-

tal Beagle dog infection. Animals infected with the Y strain showed controlled parasitism and

their immune system returned to homeostasis, whereas animals infected with the Be-78 strain

maintained parasitism over two years after infection and showed lesions of apparently progres-

sive character [31]. The interaction of each subpopulation within the strain with the host may

interfere with the development of the host immune response and determine success in control-

ling tissue parasitism and associated lesions.

In order to test the ability of an individual to select a clonal subpopulation from a polyclonal

strain of T. cruzi we infected 24 Swiss mice with strain Be-78 and tested blood samples at three

different times after infection. The parasites from positive hemocultures were characterized in

vitro in terms of growth kinetics in acellular medium, profile of infection and development in

Vero cell medium and kDNA gene-signature by LSSP-PCR. Swiss mice were selected for the

present study, rather than a clonal population of mice, because of their genetic variability. It

was already observed that upon infection with a polyclonal strain of T. cruzi the host-parasite

interaction may lead to the absence of parasitemia in some individuals, whereas individuals

with positive hemocultures may differ in terms of pathologic response, in particular tissue-tro-

pism [4], most likely due to genetic factors.

We found that the gene signatures of Be-62 and Be-78 obtained by LSSP-PCR were differ-

ent, confirming the genetic heterogeneity of the two strains isolated from the same patient with

a 16 years interval. Our data complements previous literature reports using isoenzyme profiles,

RAPD and microsatellites [9, 10, 11, 32]. The Be-62 and Be-78 strain samples have been main-

tained in our laboratory for the past 30 years by alternating passages in mice and axenic cul-

ture, and including periods of cryopreservation. It is worth mentioning that, in spite of

alternating between in vivo and in vitromaintenance, no changes in the virulence, pathogenic-

ity or molecular profile have been observed in comparison with the original samples, as dem-

onstrated in various studies published by our group [9, 11, 14, 17, 29; 33; 34].

The kDNA profile of one of the isolates, Be-78is5-3mai, was closer to Be-62 and Be-78

strains (Fig 3). Interestingly, isolate Be-78is5-3mai, showed a behavior in Vero cell culture

medium closer to that of the Be-62 strain. In contrast, isolate Be-78is2-6mai, which showed in

vitro ratios of infectivity and development threefold higher than the Be-78 parental strain was

genetically similar in terms of gene signature by LSSP-PCR, showing that changes in the bio-

logical behavior do not necessarily reflect genetic variations. Growth in culture medium simu-

lates the behavior of epimastigotes in the gut of an invertebrate host and, therefore, a low ratio



of infectivity or development may reflect a reduced ability for multiplication of these subpopu-

lations, with potential implications on the success of vector infection.

The isolate that stood out the most in terms of genetic distance to the parental strain, Be-

78is5-3mai, was collected from animal 1 at 3MAI. Another isolate was obtained from the same

animal three months later at 6MAI, Be-78is5-6mai. Although the latter also displayed in its

LSSP-PCR profile the characteristic band slightly below 100bp similar to Be-62, yet with a

lower intensity, its biological properties in vitro were similar to the parental strain Be-78. This

observation is a hint on the reversibility of the genetic modulation over time in the case of

chronic infection with T. cruzi, where a subpopulation may be favored at a certain time and

another one take over later on.

Even though maintenance of the isolates in culture medium was limited in time, it is impor-

tant to consider the possible influence of hemoculture and in vitromaintenance prior to phe-

notypic and molecular characterization, which could add up to clonal selection exerted by the

immune system of the vertebrate host (Swiss mice). Hence, hemoculture and in vitromainte-

nance may favor one or more subpopulation over others resulting in the expansion or reduc-

tion of selected clones that were present in the original sample [35]. However, this process not

allow the appearance of subclones that were absent from the original sample. Therefore it is

more likely that the selective process, which resulted in isolate Be-78is5-3mai was a conse-

quence of the pressure exerted by the immune system of the host rather than a consequence of

clonal selection during in vitromaintenance.

Microsatellite characterization of the Be-78 strain by Valadares et al. [11] confirmed its mul-

ticlonality, and suggested the presence of a subpopulation with similar characteristics to those

of strain Be-62. Therefore, isolate Be-78is5-3mai may have originated either from selection of a

subpopulation within the polyclonal parental strain Be-78, or due to the association of sub-

clones, with the participation of one or more subclones, resulting in mixed biological and

molecular profiles. The latter is supported by the isolate´s intermediate behavior in culture

medium and genetic profile in comparison with the reference strains, Be-78 and Be-62.

The present data confirms the polyclonal or mixed nature of strain Be-78 already reported

in the literature [11, 14, 17] and reinforces the hypothesis that the selective pressure exerted by

the host throughout the chronic phase may favor the development of one or more subpopula-

tion(s) over the other(s). This phenomenon may be related to the plasticity of T. cruzi and not

less importantly, to the parasite-host interaction, since all outbred animals received the same

inoculum and responded to infection in selecting distinct subpopulations.

In conclusion, three isolates were obtained upon infection of Swiss mice with Be-78, namely

Be-78is5-3mai, Be-78is2-6mai and Be-78is15-12mai, which showed differences in biological

and/or molecular parameters compared to the parental strain. As such, they are good candi-

dates for probing in vivo the influence of clonal subpopulations in the pathogenesis of the

disease.

Conclusion

T. cruzi isolates from Swiss mice infected with the same polyclonal parental strain Be-78 char-

acterized in vitro were found to have a kDNA gene signature significantly distinct from the

parental strain. The present work confirms the hypothesis that the maintenance of a T. cruzi

population in outbred mice results in the selection of genetically distinct subpopulations.

Subsequent in vivo studies are under way to evaluate the pathogenicity and histotropy of a

specific isolate in comparison with that of the parental strain in experimental murine infection.



Supporting Information

S1 File. The ARRIVE Guidelines Checklist. Report of in vivo experiments in animal research.

(PDF)

Acknowledgments

We thank the Centro de Ciência Animal-CCA/UFOP for the availability and ethic work to ani-

mals and Renata Rezende Rocha Oliveira for help with the in vitro infection analyzes.

Author Contributions

Conceived and designed the experiments: CMC NCNP PMAVWLT. Performed the experi-

ments: NCNP LMROMTO KSF PMAV. Analyzed the data: NCNP LMRO PMAV VMV. Con-

tributed reagents/materials/analysis tools: ML ABR CMC PMAV. Wrote the paper: GPL

NCNP CMC PMAV.

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Influência da Infecção por uma Cepa Policlonal do ... · Ao professor Evandro Machado, por seu auxílio na infecção in vitro. Às minhas queridas amigas-irmãs, Gleise, Maria