Resumo: 10.001

INFLUÊNCIA DA VISCOSIDADE E CONDUTIVIDADE DA SOLUÇÃO NA CONDUTÂNCIA DO NANOSENSOR DA ALFAHEMOLISINA

Autores 1MELO, M. C. D. A.

1, MACHADO, D. C.

1, RODRIGUES, C. G.

1 DEPARTAMENTO DE

BIOFÍSICA E RADIOBIOLOGIA - UFPE

Apoio Financeiro: CNPq/Capes, INCT-INAMI

Resumo Introdução Os canais iônicos encontrados em membranas biológicas são naturalmente utilizados por diversos tipos de microorganismos e células, como elemento de reconhecimento molecular, possibilitando o emprego destas nanoestruturas proteicas, como elemento sensor e transdutor para o desenvolvimento de uma nova geração de biossensores estocásticos (Anal Chim Acta 675: 106, 2010). O nanoporo formado pela incorporação da alfatoxina em bicamadas lipídicas, é um bom modelo para detecção de analitos em meio aquoso, sendo utilizado até como um espectrômetro de massa, com sensibilidade para diferenciação de até uma única unidade monomérica do polímero neutro (Pat. USA 2010/012290, 2010). Por outro lado para outros polímeros mais complexos (carga residual e maiores grupamentos laterais) incluindo o DNA, ainda é necessário padronizar as condições experimentais favoráveis à detecção adequada. Objetivos Analisar a influência da viscosidade e condutividade da solução na condutância do nanoporo da alfatoxina visando estabelecer condições físico-químicas “ideais” para otimização da detecção de polímeros complexos. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos A viscosidade das soluções foram determinadas com um Reômetro oscilatório digital (Anton Paar, Physica MCR 301). As medidas foram avaliadas na solução de KCl 4M acrescidas de glicerol em concentrações (5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 e 20% p/v). As membranas lipídicas foram confeccionadas de acordo com a técnica de Montal & Mueller (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3561,1972). Todos os experimentos com as bicamadas, confeccionadas com o lipídeo DPhPC (Avanti Lipids, USA) sintético, foram realizados em condições de fixação de voltagem usando um amplificador de patch clamp (Axonpatch 200B). O valor da condutância média do nanoporo em 40 mV, foi obtida nas soluções banhantes de KCl 4M, Tris 5 mM, pH 7,5 e glicerol nas concentrações de 5% ou 10% (p/v); pela incorporação de mais de 100 canais. A incorporação dos nanoporos se deu pela adição de alfatoxina (Calbiochem, USA) à solução banhante da membrana. Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. Na confecção dos histogramas utilizamos o programa Origin 8.0. Resultados Os valores de viscosidade da solução de KCl 4M, acrescida de 5% e 10% de glicerol foram: 0,88±0,1 (n=3); 0,99±0,2 (n=3) e 1,11±0,2 (n=3) (mPa•s), respectivamente. A diminuição da condutividade da solução de KCl 4 M (533,33±1,2, n=6) e glicerol 5% (205,17±1,1, n=6) ou 10% (198,4±0,8, n=6) foi mais acentuada que o aumento na viscosidade da solução. Por outro lado a taxa de redução na condutância do nanoporo em KCl 4M (3,812 ± 0,02, n=161), KCl 4M, 5% de glicerol (3,114 ± 0,85, n=350) ou KCL 4M, 10% de glicerol (2,54 ± 0,02; n=190), manteve-se praticamente constante. Conclusão

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A diminuição na condutividade da solução influencia de maneira mais acentuada que o aumento em sua viscosidade, na taxa de redução da condutância do nanoporo formado pela alfatoxina, portanto, as soluções mais viscosas são mais indicadas para melhorias na sensibilidade do sensor formado por este canal.

Palavras-chaves: alfahemolisina, condutância, condutividade, condutância, viscosidade

Resumo: 10.002

REGULAÇÃO DA ATIVIDADE DA Cu(I)-ATPASE (Atp7b) HEPÁTICA POR INSULINA E GLUCAGON

Autores

1,2Hilário-Souza, E.

1,2, VIEYRA, A.

1,2, LOWE, J.

1 Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho -

IBCCF/UFRJ, 2 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia Estrutural e Bioimagem -

INCT/INBEB

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq e INBEB.

Resumo Introdução A homeostasia do cobre e o entendimento molecular do transporte ativo desse metal são fundamentais para a compreensão das patologias relacionadas ao cobre (Síndrome de Menkes e Doença de Wilson). Alguns estudos já descreveram a regulação da localização da Cu(I)-ATPase (Atp7b) de mamíferos por hormônios, porém a regulação do transporte de cobre nessas condições ainda é pouco entendida. Objetivos Analisar a regulação da atividade da Cu(I)-ATPase (Atp7b) presente em hepatócitos na presença de insulina e glucagon. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Para a obtenção de frações de membrana contendo complexo de Golgi de fígado de porco foi utilizada a técnica de centrifugação diferencial (Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43;358, 2011). A atividade da Atp7b foi obtida medindo a quantidade de fosfato inorgânico produzido pela hidrólise enzimática do ATP (J. Biol. Chem. 66;375, 1925). Para determinar a atividade das proteínas cinases endógenas, histonas 2B foram utilizadas como substrato e a atividade foi identificada através da diferença da fosforilação na presença ou ausência do peptídeo inibidor de PKA 5-24 (iPKA5-24). Os dados foram analisados por ANOVA monocaudal e verificados pelo teste de Bonferroni (p Resultados

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Na condição controle a atividade da Atp7b foi de 37,2 ± 3,4 nmol Pix mg-1 x min-1. Na presença de insulina 10 μM, a atividade da Atp7b foi estimulada em aproximadamente 100% e na presença de glucagon 0,1 nM foi observada uma inibição de aproximadamente 90%. Para analisar quais vias de sinalização estariam sendo reguladas por esses hormônios, foram utilizados inibidores específicos para diferentes etapas das vias. Quando a atividade da Atp7b foi medida na presença de glucagon e iPKA5-24 10 nM, o resultado obtido foi igual ao controle, indicando que esse hormônio ativa essa via de sinalização. Na condição controle, a atividade da PKA foi de 4,0 ± 0,5 pmol P esterificado x mg-1 (em 10 min) e com a adição de glucagon houve um aumento de aproximadamente 100%. Para analisar a via ativada pela insulina, foi utilizada a genisteína 10 μM, inibidor de tirosina cinase e o wortmannin 20 nM, inibidor de fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K). Nos dois casos, a atividade da Atp7b foi semelhante a do controle, indicando que o receptor tirosina cinase e a PI3K fazem parte dessa via. Como já foi demonstrado que a insulina pode inibir a via da PKA, a atividade da Atp7b foi medida na presença de insulina e iPKA5-24 10 nM. A atividade ficou semelhante ao encontrado na condição somente com insulina. Como não houve um efeito aditivo, o efeito observado pela adição de insulina se deve em parte a inibição da via da PKA. A atividade da PKA foi medida na presença de insulina e houve uma inibição de 90%. Conclusão Pela primeira vez foi demonstrada a modulação da atividade enzimática da Atp7b por hormônios. A insulina aumenta a atividade da Atp7b através da sua ligação com o receptor tirosina cinase, que ativa a PI3-K e inibe a PKA. O glucagon inibe a atividade da Atp7b através da ativação da via de sinalização da PKA. Além da atividade, é necessário avaliar se esses hormônios também alteram a expressão e a localização celular da Atp7b.

Palavras-chaves: Cu(I)-ATPase, Doença de Wilson, glucagon, insulina, vias de sinalização

Resumo: 10.003

PROTEÍNA CINASE C ÉPSILON MODULA A ATIVIDADE DA Cu(I)-ATPase ENVOLVIDA NA DOENÇA DE WILSON

Autores

1,2CARDOSO, L.H.D.

1,2, HILARIO-SOUZA, E.

1,2, VIEYRA, A.

1,2, LOWE, J.

1 Instituto de Biofísica

Carlos Chagas Filho - IBCCF/UFRJ, 2 Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Biologia

Estrutural e Bioimagem - INCT/INBEB

Apoio Financeiro: FAPERJ, CNPq, INBEB.

Resumo Introdução Apesar de essencial para todos os organismos, o cobre se torna tóxico em altas concentrações. Os níveis de cobre na célula devem ser bem regulados, e diversas proteínas estão envolvidas neste processo. Atp7b é uma das duas ATPases transportadoras de cobre encontradas em mamíferos, e é responsável pela excreção de cobre do organismo. Mutações no gene ATP7B levam à doença de Wilson, na qual diversos sintomas são causados pelo acúmulo de cobre em diferentes tecidos. Objetivos Diferentes ATPases têm sua atividade modulada por uma ou mais cinases, levando a efeitos fisiológicos. Trabalhos anteriores de nosso grupo demonstraram que Atp7b é inibida pela proteína cinase A. O objetivo do presente estudo é

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determinar se vias de sinalização envolvendo proteína cinase C são capazes de modular a atividade de Atp7b. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Frações de membrana contendo vesículas de Golgi de fígado de porco foram obtidas através de centrifugação diferencial (Int J Biochem Cell Biol. 43:3, 2011). Estas amostras foram utilizadas para SDS-PAGE/Western Blotting para detecção de isoformas de PKC. A atividade de Atp7b nas amostras foi medida por método colorimétrico de dosagem de fosfato inorgânico (J. Biol. Chem. 66:375, 1925). Duas condições foram utilizadas para obter a atividade específica de Atp7b, sem e com o quelante de cobre BCS (resultados em nmol Pi x mg ptn-1 x min-1). O teste ANOVA monocaudal com p ≥ 0,05, pós-teste Newman-Keuls foi usado para análise estatística (n ≥ 4). Resultados O ativador de PKC análogo do diacilglicerol (DAG), PMA, estimulou a atividade de Atp7b (controle: 16,9 ± 0,9; PMA 10 nM: 26,4 ± 1,8), enquanto o inibidor calfostina C levou a uma diminuição da atividade (controle: 36,9 ± 0,5; calfostina 10 nM: 23,2 ± 6,8). Quando fosfatase lambda 80 U/mL foi adicionada após pré incubação com PMA 10 nM, o estímulo foi revertido e atividade similar foi observada para fosfatase lambda sozinha (controle: 22,8 ± 1,1; fosfatase: 10,1 ± 3,0; PMA/fosfatase: 10,2 ± 2,4). A inibição da fosfolipase C (PLC) por U73122 100 nM levou a uma diminuição da atividade Cu(I)-ATPásica (controle: 39,8 ± 5,1; U73122: 14,7 ± 0,7). Diferentes isoformas de PKC (alfa, epsilon e zeta) foram encontradas nas amostras. Para determinar se a PKC envolvida no processo era dependente de Ca2+, diferentes meios com PMA 10 nM e 2 μM de Ca2+ livre ou seu quelante EGTA 20 mM foram usados. A adição de Ca2+ não levou a alterações na atividade, mas na presença de PMA e EGTA teve aumento semelhante à da condição com PMA apenas (controle: 17,5 ± 1,7; PMA/Ca2+: 19,1 ± 2,7; Ca2+: 21,5 ± 2,3; PMA/EGTA: 35,7 ± 2,0). Utilizando o inibidor específico para PKC epsilon 0,5 μM, a atividade Cu(I)-ATPásica diminuiu (controle: 30,7 ± 1,7; iPKC epsilon: 12,2 ± 0,6). Conclusão PKC epsilon, uma isoforma de PKC pertencente à classe novel (dependente de DAG, mas não de Ca2+) ativa Atp7b em um processo que depende de uma etapa de fosforilação. PLC e PKC estão naturalmente ativadas nas amostras, o que indica que esta via de sinalização pode ocorrer in vivo. Diferentes vias que ativam PLC ou elevam os níveis de DAG no fígado podem aumentar a atividade desta Cu(I)-ATPase, alterando o metabolismo do cobre.

Palavras-chaves: cobre, Cu(I)-ATPase, Doença de Wilson, PKC

Resumo: 10.004

CAFEÍNA MODULA A LIBERAÇÃO DE GABA EM RETINA DE AVES NO DESENVOLVIMENTO

Autores 1FERREIRA, D. D. P.

2, STUTZ, B.

2, DE MELLO, F. G.

1, KUBRUSLY, R. C. C.

1 MFL - UFF,

2

IBCCF - UFRJ

Apoio Financeiro: CNPq, Capes, Proppi, INNT, Pronex, FAPERJ, Reuni

Resumo Introdução A retina é parte integral do Sistema Nervoso Central (SNC) e expressa diversos neurotransmissores, que estão envolvidos em importantes eventos durante o desenvolvimento. GABA e glutamato são os principais neurotransmissores inibitório e excitatório, respectivamente. A homeostasia do SNC depende de um equilíbrio entre as transmissões sinápticas desse sistemas. Sabe-se que aminoácidos excitatórios podem estimular a liberação de GABA na retina, e que esta é preferencialmente estimulada por aspartato, agonista preferencial de receptores NMDA. Um importante neuromodulador na retina é a adenosina, que através de seus receptores, é capaz de influenciar a transmissão sináptica de diversos neurotransmissores, como glutamato e GABA. Objetivos Investigar os efeitos modulatórios da exposição de cafeína, um antagonista não seletivo de receptores de adenosina (A 1 R e A 2A R) na regulação da liberação de GABA induzida por D-Aspartato em retinas de embriões de galinha durante o desenvolvimento. Código de Experimentação Animal IBCCF 035 Código de Experimentação Humana Métodos Retinas de galinha de E13 foram dissecadas e incubadas com 3 H-GABA ou 3 H-D-Aspartato em 1mL de solução Hanks4 por 1h a 37ºC. Foram realizados ensaios de captação de 3 H-GABA e liberação de 3 H-GABA ou 3 H-D-Aspartato. Além disso, os níveis de AMPc foram quantificados após a incubação do tecido com drogas utilizadas como estímulo por métodos descritos previamente (GILMAN, Proc Natl Acad Sci USA. 67:305, 1970; DE MELLO et al, Proc Natl Acad Sci USA. 79:5708, 1982). Os resultados foram analisados pelo programa GraphPad Prism. Os valores foram expressos como média±EPM e o intervalo de confiança considerado foi a partir de 95%. Os procedimentos realizados estão de acordo com o protocolo IBCCF 035 aprovado pelo Comitê de Ética do CCS. Resultados Em retinas E13, D-Aspartato (500μM) (D-Asp), um agonista seletivo de receptores NMDA aumentou a liberação de 3 H-GABA em 4,5 vezes em relação aos níveis basais (B) (B=2,21±0,05, n=6; D-Asp=9,95±0,24, n=6). Na presença de cafeína, (500μM) (Caf + D-Asp) essa liberação induzida por D-Asp foi aumentada em 60% (Caf + D-Asp=16,10±2,29, n=7). MK-801 10μM (MK), um antagonista não competitivo do receptor NMDA, foi capaz de bloquear o efeito da cafeína na liberação de 3 H-GABA (MK=3,18±0,58, n=3), corroborando o envolvimento deste receptor. O bloqueio da liberação também foi observado na presença de NNC 711 (NNC), inibidor do GAT-1 (NNC=2,42±0,33, n=3). Para verificar se a cafeína estaria regulando o transporte de GABA, foi realizada a captação de 3 H-GABA na presença de cafeína 500μM (Caf), porém não houve diferença em relação aos níveis controle (C) (C=100%, n=3; Caf=105%±11,14%, n=3). O efeito da cafeína foi mimetizado por DPCPX 100nM (DPCPX), antagonista A 1 R, (DPCPX=21,95±1,42, n=4) e por forscolina 10μM (F), ativador da adenilil ciclase (F=18,76±1,82, n=4); e bloqueado por H-89 1μM (H-89), inibidor da PKA (H-89=11,58±0,98, n=4), genisteína 10μM (Gen), inibidor de proteína tirosina cinase (Gen=9,19±0,31, n=3), PP1 3μM (PP1), inibidor da família src cinase (PP1=9,76±0,42, n=3) e ifenprodil 1μM (If1) ou 10μM (If10), antagonista da subunidade GluN2B do receptor NMDA (If1=11,88±0,7226, n=6; If10=8,785±0,3550, n=2). Os níveis de AMPc estimulados com forscolina (F) foram reduzidos na presença do agonista A 1 R, CHA 200μM (CHA) (F=2317±447, n=3; CHA=1094±420, n=2). Conclusão Os resultados apresentados sugerem que a cafeína potencializa a liberação de GABA induzida por D-Aspartato via inibição

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de receptores de adenosina A 1 , com participação da via da PKA, src e GluN2B.

Palavras-chaves: adenosina, cafeína, GABA, receptor NMDA, retina

Resumo: 10.005

A via de síntese de colesterol regula a secreção de insulina em células INS-1E através da isoprenilação de proteínas e da organização estrutural e funcional da membrana

Autores 1Zúñiga-Hertz J.P.

2, ALI, S.S.

2, PATEL, H.

1, ABDULKADER, F.

1 Fisiologia e Biofísica - ICB-

USP, 2 Anesthesiology - UCSD

Apoio Financeiro: CNPq (modalidades GD e SWE), Fapesp

Resumo Introdução Introdução: O colesterol junto com intermediários da sua biossíntese, os grupos isoprenila, dentre eles o geranilgeranil pirofosfato (GGPP), regulam o processo de secreção de insulina. A secreção de insulina estimulada pela glicose (GSIS) é controlada pelas proteínas GTPases pequenas que requerem a incorporação de GGPP na sua estrutura. Por sua vez, as propriedades biofísicas das membranas de células secretoras de insulina, como fluidez e rigidez, são dependentes de colesterol, exercendo um impacto direto no processo de fusão do grânulo de insulina. Objetivos Objetivos: Considerando que as estatinas, pelo seu alvo farmacológico, inibem a síntese de colesterol e dos grupos isoprenila, o nosso objetivo foi entender a dependência do GSIS na isoprenilação de proteínas e no colesterol. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Metodos: Células INS-1E foram incubadas na ausência ou presença de sinvastatina (SIM, 1µM) em tratamentos agudos (2h) e crônicos (24h); metil-β-ciclodextrina (MβCD, 1mM) foi utilizada como controle de redução de colesterol. Para avaliar a importância do GGPP na GSIS, células INS-1E foram suplementadas com GGPP 20µM durante 24h e desafiadas com SIM 2h. A insulina secretada após 2h de incubação com glicose 2,8 e 16,7mM foi medida por radioimunoensaio (RIE). A fluidez e rigidez da membrana plasmática foram avaliadas através de espectroscopia de resonância paramagnética de elétrons (EPR) utilizando o ácido-5-doxilesteárico (5-DSA) como marcador. A localização em lipid rafts de proteínas que compõem o complexo de secreção SNARE foi avaliada através de western blot de microdomínios de membrana isolados por ultracentrifugação em gradientes de sacarose. O conteúdo de colesterol de membrana plasmática foi avaliado através de método fluorométrico.

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Resultados Resultados: O tratamento agudo de SIM diminui GSIS através da inibição da geranilgeranilação de proteínas (30,8% vs. controle). O tratamento crônico de SIM inibe GSIS (34,6% vs. controle) e diminui o conteúdo de colesterol da membrana (55% vs. controle), decorrendo um aumento da fluidez (diminuição de um 40% da razão rigidez/fluidez de membrana sob o controle) desta e a perda da organização da maquinaria de secreção, evidenciado pela diminuição da localização de proteínas chaves para a secreção como Cav1.2 (43% vs. controle) e Syn1A (68% vs. controle) em lipid rafts. Conclusão Conclusões: Os nossos resultados sugerem que a GSIS depende da via de biossíntese de colesterol tanto pela isoprenilação de proteínas quanto pela manutenção da integridade de parâmetros biofísicos e funcionais da membrana plasmática.

Palavras-chaves: Secreção, Colesterol, Isoprenilação, Lipid Rafts, Resonância paramagnética de elétrons

Resumo: 10.006

ÁCIDO ÚSNICO: CARACTERIZAÇÃO E INTERAÇÃO COM MEMBRANAS MODELO

Autores 1Mazza, I.

1, BARRETO, D.

2, MAGALHÃES, N. S. S.

1, BIANCONI, M. L.

1 Instituto de Bioquímica

Médica - UFRJ, 2 Departamento de Farmácia - UFPE

Apoio Financeiro: FAPERJ

Resumo Introdução O ácido úsnico (UA), metabólito secundário de líquens, é uma droga promissora para o tratamento de tuberculose, tumores e para uso como antibiótico de amplo espectro de ação. Entretanto, sua hepatotoxicidade associada a uma baixa solubilidade representam desafios para sua administração. Além disso, sua interação com membranas, partição e mecanismo de ação ainda não foram totalmente esclarecidos. Objetivos Determinar a partição da droga e seu efeito em membranas modelo para investigar seus mecanismos de ação e toxicidade. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos

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Calorimetria diferencial de varredura (DSC) foi utilizada para determinar a estabilidade de lipossomos multilamelares (2 mM) compostos por fosfolipídios zwitteriônicos com mesma cabeça polar (colina) e diferentes caudas hidrofóbicas (DMPC, DPPC e DSPC) ou por um fosfolipídio carregado negativamente (DPPG). Para os experimentos de fluorescência, foi utilizada a sonda 3-palmitoil-2-(1-pirenedecanoil)L-α- fosfatidilcolina (10-PyPC; 2 mol%) em vesículas unilamelares grandes (LUVs; 2mM) de dioleilfosfatidilcolina (DOPC) puro ou contendo dioleilfosfatidilglicerol (DOPG) nas proporções de 3:1 ou 1:1 (DOPC:DOPG). O coeficiente de absorção molar (Ɛ) foi determinado, por espectroscopia UV-Visível em tampão PBC 150 mM, em diferentes valores de pH (6,5; 7,4; 9,8; 12) e em n-octanol saturado com PBC. O coeficiente de partição (Log P) octanol-água para o UA foi determinado pelo método shake flask. Resultados A interação do UA (25 mol%) causou desaparecimento da pré-transição de MLVs de PC, além da diminuição da Tm em cerca de 2 °C para DMPC (de 23,6 para 21,3 °C) e DPPC (de 41,1 para 39,4 °C) e cerca de 3 °C para DSPC (de 54,3 para 51,5). Esses efeitos foram acompanhados pela diminuição da cooperatividade da transição de fase como observado pelo aumento da largura dos picos principais. Ao contrário do que se esperava, devido à sua reconhecida ação contra Mycobacterium tuberculosis, os efeitos do UA foram menos expressivos em MLVs compostos de PG, apesar de ser observada uma diminuição da Tm (de 40,4 para 39,7 °C) e da cooperatividade da transição. Porém, a entalpia da transição de fases lipídicas não variou pela adição de UA em qualquer um dos modelos lipídicos estudados. Os efeitos observados foram dependentes de concentração de UA. Não foram observadas modificações significativas na relação excímero-monômero de 10-PyPC pela adição de UA, sugerindo que a droga não interage na região hidrofóbica da bicamada se localizando, preferencialmente, mais próximo às cabeças polares. Os valores de coeficiente de absorção molar do UA foram determinados em 290 nm, em tampão PBC pH 6,5 (Ɛ290nm= 26.000M-1cm-1), pH 7,4 (Ɛ290nm = 23.000 M-1 cm-1), pH 9,8 (Ɛ290nm = 30.000 M-1cm-1), pH 12 (Ɛ249nm = 29.000 M-1cm-1) e em octanol saturado com PBC (Ɛ283nm = 42.000 M-1cm-1). O coeficiente de partição do UA determinado pelo método shake flask foi 2. Conclusão Os dados obtidos até o momento com DSC e fluorescência sugerem que o UA se localiza, preferencialmente, próximo às cabeças polares dos fosfolipídios. Essa sugestão é corroborada pelo valor de coeficiente de partição que é comparável ao de anestésicos locais do tipo amina terciária na sua forma carregada. A interação preferencial com PC é importante para o melhor o entendimento dos mecanismos de ação e toxicidade da droga, já que células de mamíferos são ricas em PC e células bacterianas em PG.

Palavras-chaves: Ácido úsnico, Interação droga-membrana, Calorimetria, Tuberculose

Resumo: 10.007

Novo modelo de expressão heteróloga para estudos de proteínas de membrana (ex:AQP1): oócitos de Rana catesbeiana

Autores 1,2

Beloto-Silva O 1, SANTOS-SOARES, A.

1, MILACH-JR, A. C.

1, PROCOPIO J

1, MALNIC, G.

1,

Musa-Aziz R 1 Fisiologia e Biofísica - ICB-USP,

2 Fisiologia - UNIP

Apoio Financeiro: FAPESP, São Paulo

Resumo Introdução

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Oócitos de Xenopus laevis são utilizados extensivamente como modelo de expressão heteróloga “in vivo” de proteínas de membrana, transportadores e canais, sendo valiosos para estudar eletrofisiologia e biologia molecular de novas proteínas, tal qual o canal para H2O Aquaporina 1 humana (hAQP1), altamente expresso em hemácias e células do túbulo proximal, as quais também medeiam altas taxas de transporte de gases CO2 e NH3. No entanto, devido às restrições impostas pelas entidades governamentais para importação dessas rãs, tornou-se necessário buscar um modelo alternativo de expressão heteróloga, utilizando oócitos de rãs comercializadas no Brasil, como as da espécie Rana catesbeiana. Objetivos Avaliar se oócitos de Rana permitem indução experimental da expressão de hAQP1 na membrana. Código de Experimentação Animal CEEA-no.84 folhas 72 do livro 02 Código de Experimentação Humana Métodos Rãs adultas pesando entre 300-350g, anestesiadas por imersão em solução de MS222 (“tricaine methanesulfonate”) foram submetidas a cirurgia 1) para remoção de fragmentos ovarianos e 2) coleta de sangue através de punção cardíaca para medidas da osmolaridade e pH plasmático. Os fragmentos ovarianos foram tratados com 1mg/ml de Colagenase Tipo IA para dissociação e defoliculação dos oócitos sob condições estéreis. Oócitos maduros, isolados, morfologicamente semelhantes ao oócitos de Xenopus foram mantidos em meio de cultura Leibovitz L-15 (específico para ambientes sem manutenção de CO2), pH 7,55 e 185 mOsm a 18C. Após um dia, os oócitos foram injetados com 50 nl de cRNA que codifica a hAQP1 (‘hAQP1’) ou injetados com 50 nl de H2O (‘controle’). Três dias após a injeção de cRNA, foram realizados experimentos de biotinilação das proteínas de superfície com os oócitos ‘hAQP1’ e ‘controle’. Para análise da síntese e inserção da proteína na membrana, amostras de proteínas total e biotiniladas foram detectadas por “western blot”, utilizando anticorpo para AQP1. Para análise da função da hAQP1 no transporte de H2O, oócitos ‘hAQP1’ e ‘controle’ foram imersos em solução hipotônica (90 mOsm) e o tempo de inchamento/explosão celular foi avaliado por análise observacional. Resultados A osmolaridade plasmática de Rana foi de 185 ± 4,4 (n=21) mOsm e o pH plasmático foi de 7,55 ± 0,6 (n=21) a 18C. Os valores descritos para Xenopus são: 195 mOsm e pH 7,50 a 18C. Foi possível, então, adaptar as soluções utilizadas para o tratamento dos oócitos de Rana. A solução controle padronizada contém (em mM): 90 NaCl, 5 KCl, 1,2 CaCl2, 1 MgCl2, 5 Hepes, pH 7,55 e osmolaridade 185 mOsm a 18C. Resultados preliminares mostram que oócitos ‘hAQP1’ de Rana em meio hipotônico incham em 1,2 ± 0,5 (n=9) min e explodem em 3,1 ± 0,9 (n=9) min. Já o 'controle' não explode após 5 min. Sabe-se que oócitos de Xenopus que expressam hAQP1 explodem entre 30 e 60 seg. Os ensaios de “western blot” de amostras total e biotinilada evidenciaram um banda de 28 kDa, mostrando que hAQP1 foi sintetizada e inserida na membrana dos oócitos de Rana. Este achado corresponde a banda de 28 kDa evidenciada nos ensaios de "western blot" de amostras biotiniladas de hAQP1 em oócitos de Xenopus. Conclusão Dados preliminares indicam que oócitos de Rana podem ser utilizados como novo modelo experimental de expressão heteróloga para estudo de proteínas de membrana, através de técnicas eletrofisiológicas e de biologia molecular.

Palavras-chaves: Expressão Heteróloga de Proteínas, Oócitos, Aquaporina 1, Medida do Transporte de H2O, Medida da Expressão Proteica na Membrana

Resumo: 10.008

INFLUÊNCIA DE ANIONS DE HOFMEISTER NA INTERAÇÃO DO ssDNA COM O NANOPORO DE ALFATOXINA

Autores 1AGUIAR, J. P. D.

1, MACHADO, D. C.

1, JÚNIOR, J. J. D. S.

1, RODRIGUES, C. G.

1 Biofísica e

Radiobiologia - UFPE

Apoio Financeiro: CNPq,INCT-INAMI,UFPE

Resumo Introdução O estudo da translocação e interação de moléculas com nanoporos tem se intensificado nos últimos anos, empregando essas nanoestruturas (naturais ou sintéticas) como elemento fundamental no desenvolvimento de sensores; visando sua utilização como alternativa para o sequenciamento de DNA. Neste contexto, o nanoporo proteico formado pela alfatoxina atua como elemento de reconhecimento para detectar diversas moléculas em meio aquoso, podendo ser até utilizado como um espectrômetro de massas para o polietilenoglicol (Pat. USA 2010/012290, 2010). O uso do nanoporo pode tornar o sequenciamento mais rápido e barato, pois, não há a necessidade de marcação ou amplificação do DNA. Entretanto, há um problema fundamental para o desenvolvimento de um dispositivo comercial baseado nesta tecnologia: insuficiente nível de reconhecimento das bases durante a passagem da molécula do DNA via o poro, devido à altíssima velocidade de translocação (≤10μs por base). A velocidade desejável para o sequenciamento com o nanoporo é 1 ms por base. Tendo em vista a resolução desse problema, neste trabalho foram utilizados especificamente ânions de Hofmeister que alteram o grau de estruturação da água da solução banhante do nanoporo. Objetivos Analisar a influência dos ânions de Hofmeister nos parâmetros biofísicos, condutância e tempo de permanência do ssDNA no nanoporo formado pela alfatoxina; visando determinar qual solução permite melhor resolução e capacidade de discriminação de nucleotídeos. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Todas as bicamadas planas livres de solvente foram confeccionadas com o lipídeo DPhPC(Avanti Lipids, USA) sintético, conforme as técnicas convencionais de construção de membranas (Proc. Natl. Acad. Sci.USA 69:3561,1972). Os experimentos foram realizados em condições de fixação de voltagem, através de um amplificador de patch clamp (Axonpatch 200B). O valor da condutância média do nanoporo em 40 mV, foi obtida em cada uma das soluções banhantes: KF, KCl ou KBr 4M, Tris 5 mM, pH 7,5, pela incorporação de mais de 100 canais. A incorporação de um nanoporo unitário se deu pela adição de alfatoxina (~0.25μg) (Calbiochem, USA) à solução banhante da membrana. Posteriormente, o ssDNA (Invitrogen, USA) foi adicionado no compartimento cis da câmara experimental em concentração final de 300nM, e o protocolo experimental consistiu na aplicação de potenciais de -200 a 200 mV (incrementos de 20 mV) e registrar a corrente iônica através do nanoporo da alfatoxina nas soluções banhantes supracitadas. Os parâmetros biofísicos foram determinados por meio do programa p-Clamp (Axon). Resultados

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A condutância do nanoporo é um parâmetro importante, pois pode interferir na relação sinal/ruído, na análise da corrente residual (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:20,2007) e consequentemente na identificação dos nucleotídeos. O valor da condutância do nanoporo da alfatoxina em 40 mV foi de: 3.812±0.02 (n=161); 2.558 ± 0.01(n= 166); 3.845±0.01 (n=104) nS na solução de KCl, KF, ou KBr, respectivamente. O valor do tempo de permanência do ssDNA no nanoporo no potencial de 100 mV, aumentou em aproximadamente 20x na solução de Fluoreto (4,82±0.30 ms, n=3), em relação ao Cloreto (0,212±0.02 ms, n=3) e ao Brometo (0,301±0.23 ms, n=3). Conclusão Os ânions de Hofmeister interferem na interação ssDNA-nanoporo de alfatoxina, sendo o Fluoreto o mais efetivo no aumento do tempo de residência do DNA no nanoporo.

Palavras-chaves: alfatoxina, DNA, Hofmeister, nanoporo, sequenciador

Resumo: 10.009

CARACTERIZAÇÃO DAS MODIFICAÇÕES DE TRANSPORTE DO ANTIMÔNIO(III) EM DIFERENTES ESPÉCIES DE LEISHMANIA RESISTENTES DO NOVO MUNDO.

Autores 1REIS, P. G. D.

2, NETO, R. L. M.

1, MELO, M. N. D.

1, FRÉZARD, F. J. G.

1 Fisiologia e Biofísica -

UFMG, 2 Centre de Recherche en Infectologie - CRI

Apoio Financeiro: CNPq; Capes; Fapemig

Resumo Introdução O principal combate às leishmanioses baseia-se na quimioterapia, sendo o sal de antimônio (Sb) pentavalente o medicamento de primeira escolha no Brasil. No entanto, uma das principais limitações deste tratamento é o aumento da incidência de resistência. Os mecanismos pelos quais Leishmania spp. adquirem resistência foram objetos de inúmeros estudos. O sequestro do Sb(III) em vesículas intracelulares mediado pelo transportador MRPA é o modelo mais aceito. Mas, somente esse recurso não explica: 1- a redução da incorporação intracelular de Sb na maioria das linhagens resistentes; 2- a ausência de amplificação/superexpressão do gene MRPA em algumas linhagens resistentes. Assim, as vias de transporte do Sb(III) em cepas de Leishmania resistentes precisam ser melhor caracterizadas. Objetivos Caracterizar as vias de influxo e efluxo de Sb(III) em cepas de diferentes espécies de Leishmania do novo mundo, através de estudos cinéticos e do efeito inibidores clássicos dos transportadores MRP/MDR. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana

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Métodos Cepas de promastigotas sensíveis (SbS) e selecionadas in vitro pela resistência ao Sb(III) (SbR), provenientes de quatro espécies de Leishmania (L. (L.) amazonensis, L. (V.) braziliensis, L. (L.) guyanensis e L. (L.) infantum) foram analisadas quanto às taxas de influxo e de efluxo através da dosagem de Sb por absorção atômica. Em seguida, avaliou-se a influência de inibidores dos transportadores MRP e MDR nos parâmetros de transporte e na sensibilidade dessas cepas ao Sb(III). Para a análise estatística dos dados (n= 3), foram utilizados os testes de One Way Anova seguido do teste de Bonferroni (diferença significativa com p Resultados As taxas de influxo (d[Sb]/dt x10-12, mol/(l.s)) foram significativamente menores nas cepas resistentes em relação às respectivas selvagens: na ordem de 2,5 vezes em L. (V.) braziliensis (1,06±0,28 vs 2,64±0,83); 1,25 vezes em L. (L.) amazonensis (4,32±3,58 vs 5,41±2,09); 15 vezes em L. (L.) infantum (0,36±0,08 vs 5,24±5,09); e 162 vezes na L. (L.) guyanensis (0,006±0,001 vs 0,972 ±0,054). Já a análise de efluxo mostrou % de retenção celular de Sb significativamente menores, após 60 min de análise, nas populações resistentes em relação às respectivas selvagens: L. (V.) braziliensis (39,21±12,85 vs 91,33±33,25); L. (L.) amazonensis (68,17±17,66 vs 91,33±33,25); L (L.) infantum (67,45±7,69 vs 89,09±9,78) e L. (L.) guyanensis (29,65±12,22 vs 91,54±25,29). Os testes dos inibidores na células resistentes evidenciaram um aumento da sensibilidade ao Sb(III) na presença da proclorperazina (10,0 μM) e probenicide (10,0 mM) em todas as cepas e também na presença do verapamil (1,0 μM) na cepa L. (V.) braziliensis. Proclorperazina e probenicide inibirem o efluxo de Sb(III) apenas nas cepas de L. (V.) braziliensis e L. (L.) guyanensis. Conclusão Os perfis de transporte de Sb(III) nas cepas resistentes indicam que a redução de Sb intracelular ocorre simultaneamente através da redução da taxa de influxo e o aumento da taxa efluxo deste metal, e sugerem o envolvimento de bombas de efluxo outras que a MRPA.

Palavras-chaves: Leishmania, Resistência, Antimônio, Transporte, Inibidores

Resumo: 10.010

FCCP AND IONOMYCIN INDUCE LOSS OF MITOCHONDRIAL INNER MEMBRANE POTENTIAL IN A CYCLOSPORIN A-SENSITIVE PROCESS: EVIDENCE OF MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION PORE (MPTP) IN SEA URCHIN SPERMATOZOA

Autores 1TORREZAN, E.

1, MARQUES-SANTOS, L. F.

1 Departamento de Biologia Molecular - UFPB

Apoio Financeiro: CAPES

Resumo Introdução Mitochondrial permeability transition pore (MPTP) is a protein complex which opening promotes an abrupt increase in permeability of the mitochondrial inner membrane to solutes of up to 1500 Da. This event was first described in the late 1970s and its formation and opening is a voltage-dependent and calcium-dependent process sensitive to cyclosporine A, a peptide that interacts with the mitochondrial cyclophilin preventing the pore opening. The involvement of MPTP on leading

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to mitochondrial swelling and to necrotic and apoptotic cell death has been studied as a therapeutic target, mainly to cardiac diseases, neurodegeneration and aging processes. Few studies report the presence and the physiological role of MPTP in gametes and embryonic cells. Objetivos Our work aimed to investigate the presence of MPTP and its opening mechanisms in sea urchin spermatozoa. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Animals were collected at João Pessoa coast, Paraíba, Brazil (7° 7′ S, 34° 49′ W) and maintained in filtered sea water under frequent air flow (ICMBio authorization: 32105-2). Gametes were obtained by intracoelomic injection of KCl (0.5 M) and kept under refrigeration until use. Spermatozoa were activated in filtered sea water and immediately treated with the uncoupling agent trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP) or with the calcium ionophore ionomycin in the presence or absence of cyclosporin A (CsA). Mitochondrial inner membrane potential (MIMP) was evaluated by the mitochondrial potential-sensitive dye TMRE (75 nM) in flow cytometry and fluorescence microscopy. Resultados MIMP was monitored for 2, 5, 10 and 15 minutes after FCCP or ionomycin addition. The percentage of cells with intact MIMP 2 minutes post FCCP (50 nM) was 81.53 ± 8.70 % (statistically equal to the control group). However, FCCP decreased TMRE staining after 5, 10 and 15 minutes of incubation: 46.32 ± 16.76 %, 29.93 ± 6.42 % and 17.63 ± 4.71 %, respectively. Ionomycin (250 nM) induced MIMP depolarization when cells were incubated for 2, 5, 10, 15 minutes: 67.40 ± 5.28 %, 38.20 ± 11.38 %, 28.42 ± 10.79 %, 24.74 ± 9.04 %, respectively; when compared to control group 94.66 ± 0.80. To investigate MPTP involvement in mitochondrial depolarization, spermatozoa were pre-treated with CsA (5 microM). CsA prevented the loss of TMRE staining induced by FCCP or ionomycin. CsA inhibited 27.21 ± 5.09 % of MIMP depolarization when cells were post-treated with FCCP while 53.97 ± 2.75 % inhibition was observed when cells were post-treated with ionomycin. Furthermore, CsA alone did not affect TMRE staining once the percentage of intact mitochondrial cells was statistically equal to the control group: 91.71 ± 2.33 %. Conclusão Our data suggest that respiratory chain uncoupling and intracellular calcium increase induce mitochondrial permeability transition pore opening in sea urchin spermatozoa. This work is the first report of MPTP opening in invertebrate male gametes.

Palavras-chaves: FCCP, IONOMYCIN, MITOCHONDRIAL INNER MEMBRANE POTENTIAL, MPTP, SPERMATOZOA

Resumo: 10.011

Neutrophil dysfunction induced by hyperglycemia: modulation of myeloperoxidase activity

Autores

1FERREIRA, C. D. S.

2, ARAÚJO, T. H.

1, ÂNGELO, M. L.

3, PENNACCHI, P. C.

3, OKADA, S. S.

1, PAULA, F. B. D. A.

3, MIGLIORINI, S.

1, RODRIGUES, M. R.

1 Análises Clínicas e Toxicológicas

- UNIFAL, 2 Histologia - UNIFAL,

3 Análises Clínicas e Toxicológicas - USP

Apoio Financeiro: FAPEMIG

Resumo Introdução Neutrophils play a critical role in host defense. They are required at the onset of the pathogen defense response. The killing and microbicidal functions of neutrophils are directly related to metabolic pathways involving the NADPH oxidase system activation generates ROS (Reactive Oxygen Species) in a process referred to as oxidative burst. Molecular oxigen is reduced by the NADPH electron generation O2- (superoxide anion). Although O2- does not have killing activity, molecules generated from this anion do. Hydrogen peroxide (H2O2) is formed from O2- dismutation, and hypochlorous acid (HOCl) is generated from H2O2, chloride ions (Cl-) and myeloperoxidase (MPO), the principal enzyme released by neutrophil azurophilic granules. Crosstalk between the NADPH oxidase system and MPO enzyme metabolic pathways may generate molecules toxic to both cells and microorganisms. Diabetes mellitus patients present physiological impairments, including diminished immunological function and inflammatory responses leading to higher susceptibility to bacterial and fungal infections. Some studies have suggest that these responses are caused by neutrophil dysfunction caused by hyperglycemia. Objetivos This study evalutes the effect of the diabetic state on the NADPH oxidase system and MPO enzyme activity of rat peritoneal neutrophils. Código de Experimentação Animal 163 e 189 Código de Experimentação Humana Métodos Wistar male rats weighing 280g were obtained from the UNIFAL-MG. The rats were allocated to one of the two main groups: control or diabetic. The animals were sacrificed by deepening anesthesia following the administration of 40mg/kg of sodium pentobarbital i.p. All in vivo experiments followed the guidelines of the ICLAS. Diabetics were with glycemia over 250mg/dL after 7 days of alloxan injection. The animals were sacrificed 30 days after confirmation of diabetes.The neutrophils were obtained by i.p. lavage with PBS 4h after an i.p. injection of 2mL of 12% sterile sodium caseinate solution in saline. The NADPH oxidase system activity was measured using chemiluminescence and cytochrome C reduction assays. MPO activity was measured by monitoring HOCl production, and MPO protein expression was analysed using W. blot and immunofluorescence. C. albicans phagocytosis and death were evaluated by optical microscopy using the MGG staining method. Resultados Plasma glucose concentration was measured weekly to confirm diabetes progression. The alloxan treated animals exhibited weight loss and severe hyperglycemia compared with the control group. Similar to the plasma glucose levels, fructosamine concentrations showed persistent hyperglycemia over the course of the experimental. Superoxide anion production by neutrophils did not differ between diabetic and control rats. We measured both ROS formation and O2- generation. The average emission intensity, calculated by integrated light analysis shows that both diabetic and control neutrophils produce approximately the same amount of ROS; however a difference can be seen in the group kinetics of ROS production. The diabetic group appears to have a delayed response to PMA stimulus compared with the control group. None of the reaction controls triggered significant light emission under the tested conditions. In the reaction using the SOD, O2- production was

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completely abolished. MPO protein expression in peritoneal neutrophils from diabetic rats was approximately 60% higher than the control group. MPO localization in diabetic neutrophils was similar to the control group. A TNB oxidation assay was used to indirectly measure HOCl concentration. The diabetics neutrophils showed an approximately 40% decrease in HOCl generation compared with the controls. Diabetics showed impaired MPO activity despite higher MPO protein expression. The percentage of phagocytosis of C. albicans yeasts by neutrophils at 120 min. was 49 +/- 2,8% and 23 +/- 1% in rats from control and diabetic groups, respectively, and yeasts killed were 42 +/- 4,8% in controls and 20 +/- 4,5% in diabetics. Conclusão In conclusion, we demonstrated that, although the MPO expression increased in diabetic animals compared with the control group, enzymatic activity was impaired and that this impairment was caused by hyperglycemia. Knowing the importance of ROS production for pathogen destruction and that the O2- concentration is similar in both groups, our experimental model suggests that phagocytosis and killing activities are compromised by impaired production of HOCl, highlighting the importance of MPO in the microbicidal function of neutrophils.

Palavras-chaves: myeloperoxidase, type 1 diabetes, ROS, phagocytosis, microbicidal

Resumo: 10.012

DETECÇÃO DE POLÍMEROS DE BASE VINÍLICA PELO NANOPORO PROTÉICO DE ALFATOXINA

Autores 1BARROS, S. M.

1, MACHADO, D. C.

1, RODRIGUES, C. G.

1 Departamento de Biofísica e

Radiobiologia - UFPE

Apoio Financeiro: CNPq, inct-INAMI, CAPES

Resumo Introdução O nanoporo proteico da alfatoxina tem sido bastante estudado com interesse nanobiotecnológico, principalmente, como elemento de reconhecimento molecular para o desenvolvimento de dispositivos analíticos (Chem. Rev. 112:6431, 2012). Em todas as aplicações o mecanismo molecular fundamental consiste na interação em meio aquoso iônico, entre uma molécula (analito) de interesse com o nanoporo proteico unitário; gerando alteração (bloqueios) no fluxo iônico através do canal e, finalmente resultando em uma série temporal de eventos de bloqueio da corrente iônica que é característica da molécula que entra ou permeia o nanoporo (Phys Rev. Lett. 97:018301, 2006). Neste contexto, recentemente demonstramos que o simples aumento da concentração do KCl (de 1M para 4M) (Biophys. J. 95:5186,2008) melhora qualitativamente as características do nanoporo da alfatoxina como sensor, permitindo, sua utilização como potencial espectrômetro de massas (Pat. US 2010/0122907, 2010) para o polímero neutro polietilenoglicol (PEG). Apesar de todos os avanços obtidos, muitas dificuldades ainda precisam ser superadas para a disponibilização comercial de dispositivos baseados no nanoporo, principalmente para a detecção de analitos poliméricos de estrutura molecular mais complexa. Deste modo propomos ampliar a caracterização de polímeros sintéticos de estrutura química similar ao PEG, mas com um aumento na complexidade molecular, a fim de demonstrar a eficiência deste dispositivo sensor na caracterização diferenciada de polímeros sintéticos variados. Objetivos Utilizar o nanoporo proteico formado pela alfa-toxina de Staphylococcus aureus, para a detecção dos polímeros sintéticos

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Polivinilpirrolidona (PVP) e Polivinil álcool (PVA). Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos As bicamadas lipídicas utilizadas neste trabalho foram confeccionadas de acordo com a técnica de Montal & Mueller (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3561, 1972), utilizando diftanoilfosfatidilcolina (DPhPC), (Avanti Lipids, USA) e para a formação do poro a proteína alfatoxina (Calbiochem, USA). Todos os experimentos foram executados sob as condições de temperatura ambiente de 25 ± 1 °C; fixação de voltagem, empregando um amplificador de Patch Clamp (Axon Patch 200B) como descrito em (Biophys. J. 100: 2929, 2011), solução banhante da membrana composta por 4M KCl, 5mM Tris e pH 7.5. Os polímeros empregados foram o Polivinilpirrolidona (PVP) de 10KDa e Polivinil álcool (PVA) 50KDa (Aldrich, USA). A condutância de um único canal, determinada em voltagens aplicadas de -200 a +200 mV, foi utilizada para construção do gráfico G-V (condutância-voltagem) dependente nas condições controle e experimental, na ausência e presença dos um dos polímeros adicionados. Resultados O efeito dos polímeros na redução da condutância do nanoporo foi dependente do potencial transmembrana, sendo igual a 60 mV para o PVP, e de 160 mV, para o PVA. Adicionalmente os perfis de bloqueio foram característicos de cada polímero analisado (PVP e PVA), bem como a porcentagem (50% e 90%) de redução na condutância do nanoporo, respectivamente. Conclusão O nanoporo formado pela alfatoxina interage com a Polivinilpirrolidona e o Polivinil álcool, gerando um perfil de bloqueios característicos de cada um, permitindo sua detecção, e demonstrando que estes polímeros em solução aquosa de KCl 4 M encontram-se eletricamente carregados.

Palavras-chaves: alfatoxina, detecção, nanoporo, Polivinilpirrolidona, Polivinil álcool

Resumo: 10.013

COMPARISON OF TWO TECHNIQUES IN THE EVALUATION OF CALCIUM TRANSIENTS ELICITED BY METABOTROPIC PURINERGIC RECEPTORS IN GLIAL SATELLITE CELLS.

Autores 1BATISTA, D. R.

1, CASSOLA, A. C.

1 Department of Physiology and Biophysics - ICB

Apoio Financeiro: CNPq, Fapesp.

Resumo Introdução

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Dorsal root ganglia (DRG) contains pseudo-unipolar neurons of sensory input. Neuron somata is enveloped by satellite glial cells (SGC) whose functions is unclear. A recent report has shown a paracrine communication between neurons and SGC mediated by ionotropic purinergic receptors (PNAS 104:9864, 2007). In previous studies we demonstrated that SGC from rats express several subtypes of P2Y, metabotropic purinergic receptor. The study was carried on observing intracelular calcium transients elicited by especific agonists and antagonists of P2Y receptors. Fluorescence signals from Fluo-4 (Molecular Probes), a calcium indicator, were detected by a confocal laser scanning microscope (Zeiss, LSM 510). Despite the consistency of many measurements showing a rapid rise of the intracellular free-Ca2+ concentration ([Ca2+]i) and a slow decay, upon fast application of agonists, some concern about the proper follow-up of the kinetics remain. The concern arise from the t: a) The limited time resolution of the confocal scanning (0.33 Hz) and from the use of Fluo-4, whose excitation-emission properties precludes the calculation of fluorescence raios. Objetivos Here we show intracellular free-Ca2+ measurements with a wide-field fluorescence microscope with a better time resolution (2Hz). Besides the transients were observed with Fura-2 (Molecular Probes), a ratiometric indicator. Código de Experimentação Animal protocolo 033, fls 30, livro 2 Código de Experimentação Humana Métodos DRG from newborn (3 days) Wistar rats were treatead with collagenase and mechanically dissociated. The cells were cultivated on poli-L-lysine-treated glass cover slips. The culture was kept in DMEM with 5% fetal bovine serum, at 37°C and under 5% CO2 atmosphere. Satellite cells still attached to neurons were observed. Changes in [Ca2+]i were evaluted in a fluorescence microscope with UV ilumination (Leica, AF6000), using Fura-2 as a calcium indicator. Fluorescence was excited at 340 nm (F340) and 387 nm (F387) and emitted fluorescence observed above 510 nm. The fluorescence ratio F340/F387 (R) was used to describe relative changes in the [Ca2+]i. Time series were recorded in control conditions and during the exposure to the agonist. Resultados ATP 0.1 mM promoted transitory increases in the [Ca2+]i in SGC (n=53). The medium value of R at the peck is 1.399 with a standart deviation of ± 0.402. Comparing the kinetics of estimates with Fluo-4 and Fura-2, the overlap is such that artifacts in the previous measurements are excluded. Conclusão Coincidence in the observed free-Ca2+ transients by two techniques strengthen previous evidences for the occurrence of several types of purinergic receptor in satellite glial cells.

Palavras-chaves: Calcium, Dorsal Root Ganglia, Glia, Purinergic, Satellite Glial Cell

Resumo: 10.014

Interação do peptídeo antimicrobiano Esculentina 1b (1-18) com diferentes composições de

modelos miméticos de membrana

Autores 1Moreira-Silva, I.

1, Riske, K. A.

1, Juliano, M. A.

1, PEREZ, K. R.

1 Biofísica - UNIFESP

Apoio Financeiro: CNPq, InctFCx, Fapesp e Capes

Resumo Introdução Peptídeos antimicrobianos (PAM) são parte do sistema imune inato de animais e plantas e sua função está relacionada ao combate de micro-organismos invasores. Independentemente do seu modo de ação, os PAM interagem com a membrana destes micro-organismos. A Esculentina 1b é um peptídeo isolado da pele de um anuro da espécie Rana esculenta . Ele é composto por 46 resíduos de aminoácidos, mas os primeiros 18 (GIFSKLAGKKLKNLLISG) se mostraram particularmente interessante, pois apresentam atividade antimicrobiana sem apresentar atividade hemolítica. Este peptídeo possui uma estrutura randômica em meio aquoso, mas na presença de uma membrana de PE:PG 7:3 mol:mol ele assume a estrutura de uma α-hélice (FEBS Journal, 276:5647, 2009). Objetivos Estudar o mecanismo de ação da Esculentina 1b(1-18), Esc [1-18], que é a forma amidada dos primeiros 18 resíduos de aminoácidos da Esculentina 1b com modelos miméticos de membranas variando a concentração de carga negativa superficial da membrana. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Ensaio de vazamento de carboxifluoresceína (CF) de vesículas unilamelares grandes (LUVs), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espalhamento de luz dinâmico e microscopia de vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Resultados Os ensaios de vazamento de CF de LUVs pela ação do peptídeo revelaram que a associação da Esc[1-18] à membrana é dependente da concentração de carga negativa em sua superfície, mostrando uma maior porcentagem de vazamento para vesículas com composição POPC:POPG acima de 50 mol% de POPG. Dos experimentos de ITC obteve-se que a Esc[1-18] não interage com LUVs compostas por POPC 100 mol%, não apresentando uma variação de calor significativa quando comparada com o calor de diluição destas LUVs no tampão de trabalho. Já na titulação do peptídeo com LUVs compostas por POPC:POPG 50 mol% e POPG 100 mol% foi possível medir uma variação de calor positiva mostrando que a associação da Esc[1-18] na superfície destas vesículas segue um processo global endotérmico o que é indicativo da abertura de poros na membrana (Biochemistry, 37:3909, 1998). As variações de entalpia por mol de peptídeo, ΔH, calculadas para a associação do peptídeo a LUVs compostas de POPC 100 mol%, POPC:POPG 50 mol% e POPG 100 mol% foram 0,5 cal/mol, 1,18 kcal/mol e 0,65 kcal/mol, respectivamente. Notou-se através das medidas de turbidez que tanto para as LUVs de POPC:POPG 50 mol%, quanto para as de POPG 100 mol%, utilizadas no ITC, ocorre o fenômeno de agregação que, parece ser distinto para cada um destes sistemas lipídicos. As GUVs compostas por POPC:POPG 50 mol% mostraram que a adição da Esc[1-18] induz a formação de poros estáveis na membrana ocasionando principalmente a perda do contraste do conteúdo interno destas vesículas sem o rompimento das membranas. Para as GUVs compostas por 100 mol% de POPG ocorreu o rápido rompimento das membranas sem a observação da perda de contraste. Conclusão

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A Esc[1-18] interage e permeabiliza membranas carregadas negativamente. Os estudos calorimétricos e de microscopia indicam que seu modo de ação é através da formação de poros. Além disso, o peptídeo pode causar agregação das vesículas.

Palavras-chaves: peptídeo antimicrobiano, membrana, calorimetria, poro

Resumo: 10.015

Salicylate enhances depolarization suppression of excitation in cartwheel neurons from the dorsal cochlear nucleus of rat.

Autores 1ZUGAIB, J.

1, LEAO, R. M. X.

1 Fisiologia - FMRP-USP

Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq

Resumo Introdução Intoxication by sodium salicylate induces tinnitus in both humans and experimental animals, which is postulated to be caused by central mechanisms leading to hyperactivity of dorsal cochlear nucleus (DCN) fusiform neurons. Salicylate inhibits the enzyme cyclooxygenase (COX-2) which oxidates endocannabinoids (EB`s). Objetivos Here we are testing the effect of sodium salicylate on the phenomenon of depolarization suppression of excitation (DSE) in parallel fibers (PF) synapses on glutamatergic fusiform and glycinergic cartwheel neurons of the DCN, which is mediated by (EB`s). Código de Experimentação Animal 027/2012 Código de Experimentação Humana Métodos Brain slices were prepared from 18 to 22 days old rats, and glutamatergic neurotransmission was elicited by stimulating the (PF) with a bipolar electrode, in the presence of picrotoxin and strychnine. DSE was produced by a depolarization to 0 mV with durations of 0.5, 1, 2 and 4 seconds Resultados DSE was stronger in cartwheel than in fusiform neurons (maximum DSE at 4 seconds: cartwheel 41 ± 5%; fusiform 21 ± 5%. n=19 and 12 respectively. p=0.0002, 2-way ANOVA). Incubation of the slices with sodium salicylate (NaSal, 1.4 mM) for at least 1 hour before the recording did not affect the PF-evoked EPSC amplitude either in cartwheel (control: -414 ± 60 pA; NaSal: -756 ± 207 pA; n=12 and 18 respectively, p=0.08, t-test) and fusiform cells (control: -454 ± 104 pA; NaSal: -404

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± 66 pA; n=8 and 10 respectively. p=0.68, t-test). However, salicylate enhanced the DSE in cartwheel cells significantly (p Conclusão We conclude that sodium salicylate is able to enhance DSE in DCN’s cartwheel neurons and could contribute for generating hyperactivity in the fusiform neurons after salicylate intoxication.

Palavras-chaves: dorsal cochlear nucleus, brainstem, salycilate, DSE, endocannabinoids

Resumo: 10.016

THE ACTIVATION OF ESTROGEN RECEPTORS INDUCES ERK1/2 PHOSPHORYLATION IN THE CORPUS OF THE EPIDIDYMIS.

Autores 1CAVALCANTI, F. N.

1, LUCAS, T. F. G.

1, LAZARI, M. F. M.

1, PORTO, C. S.

1 Farmacologia -

EPM-UNIFESP

Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq and CAPES

Resumo Introdução The epididymis plays an important role in sperm transport, maturation, protection and storage. This organ can be functionally divided into four regions: initial segment, caput, corpus and cauda. This functional segmentation is accompanied by a region-specific gene expression (Henderson NA et al., J Endocrinol 2006; 190:779). Although the epididymis is an androgen-dependent tissue, other factors, including estrogen, may control its function. The classic estrogen receptors (ESR1 and ESR2) are present in this tissue. Although ESR2 expression does not change among epididymal regions, the expression of ESR1 is higher in the corpus and cauda, suggesting that the impact of estrogen may vary among epididymal regions. The mRNA for GPER (G protein-coupled estrogen receptor) is expressed in all epididymal regions but it is higher in the corpus than the other regions of the epididymis (reviewed in Hess RA et al., J Androl 2011; 32:600). Objetivos This study was proposed to further investigate whether estrogen activates the mitogen-activated protein quinases (ERK1/2) in the corpus of the epididymis, and to identify which estrogen receptors mediate this effect. This rapid signaling pathway is involved with proliferation, differentiation and cell survival in different male reproductive tissues. Código de Experimentação Animal 2043/11 Código de Experimentação Humana Métodos The experimental procedures were approved by the Research Ethical Committee from UNIFESP (#2043/11). The rat

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epididymis was sectioned, and the corpus region was cut into pieces and washed with nutrient solution, for the removal of sperm and luminal fluid. Tissues were incubated in nutrient solution in the absence (vehicle, control) or presence of 17beta-estradiol (E2, 10nM), ESR1-selective agonist PPT (100 nM), ESR2-selective agonist DPN (100 nM), GPER-selective agonist G1 (100 nM) for 5-30 minutes at 30°C. In another series of experiments, the tissues were previously treated or not with the ESR1 and ESR2 antagonist ICI 182,780 (10nM), for 60 minutes, and then with PPT (100nM).Tissues were frozen in liquid nitrogen, pulverized, and Western blot for detection of total ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 was performed. Resultados The expression of total ERK1 is 8-fold higher than ERK2 in the corpus of the epididymis. The treatment with E2, PPT, DPN and G-1 induced a rapid increase in the phosphorylation state of ERK1/2 in the corpus of the epididymis, with a peak at 5 min (1.9-, 2.3-, 1.5- and 1.5-fold increase, respectively). The increase in the ERK1 phosphorylation was similar to that observed in ERK2 phosphorylation. The increase in the phosphorylation of ERK1/2 mediated by PPT was blocked by ICI 182,780. Conclusão The results indicate that estrogen, interacting either with the classical estrogen receptors ESR1 and ESR2 or the G-protein coupled estrogen receptor GPER, mediates rapid (nongenomic) actions in the corpus of the epididymis.

Palavras-chaves: epididymis, ERK1/2, estrogen receptors

Resumo: 10.017

Calorimetric and Structural Analysis of the Interaction of Inhibitor of Apoptosis Protein XIAP with Smac Mimetic Compounds

Autores 1SANTOS, R. B.

2, OLIVEIRA, A. C.

1, SOUZA, T. L. F.

1 Faculdade de Farmácia - UFRJ,

2 Instituto

de Bioquímica - UFRJ

Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ, INBEB.

Resumo Introdução Apoptosis resistance, in cancer, can be generated by high expression of inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) family, which is responsible by the inhibition of initiator and effector caspases. Smac/DIABLO is an endogenous inhibitor of XIAP due to its direct interaction on the XIAP-BIR3 domain. Smac mimetics have been considered potential drug candidates, owing to its capacity to bind on XIAP-BIR3 and to sensitize apoptosis in cancer cell. Objetivos The goal of this work is better understand the effects of the binding of Smac mimetics on the structure and stability of the XIAP-BIR3 and to add useful information to drug design. Código de Experimentação Animal

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Código de Experimentação Humana Métodos Smac mimetic compounds with structural similarities, but with different activities, were selected to us investigate the individual thermodynamic contributions of functional groups. We used circular dichroism (CD), fluorescence spectroscopy and isothermal titration calorimetric (ITC) to perform the structural and thermodynamic analyses. Denaturation with guanidine hydrochloride (GdnHCl) was used to estimate the domain stability. Resultados Analysis of tryptophan fluorescence spectra showed that this domain has a high stability and that the chemical denaturation occurs with two transitions. The domain underwent a different stabilization in the presence of the different compounds and the denaturation, differently, occurred with a single transition. Additionally, the Smac mimetics promote a significant change in the CD spectra of free XIAP-BIR3 domain, indicating changes in the secondary structure content. Results obtained by ITC revealed that, besides have different affinities, the enthalpy-entropy contributions of each compounds are significantly different. Conclusão The significant changes in the structure and stability of XIAP-BIR3 promoted by the interaction with Smac mimetics, and that contribute to the difference in the thermodynamic binding parameters, may be a relevant factor to be considered in affinity optimization of anti-IAP drug candidates.

Palavras-chaves: Apoptosis, XIAP-BIR3, Mimetic compounds, Thermodynamics

Resumo: 10.018

Colesterol como agente modulador da seletividade de peptídeos antimicrobianos.

Autores 1SILVA-GONÇALVES, L. C.

1, ARCISIO-MIRANDA, M.

1 Laboratório de Neurobiologia Estrutural

e Funcional - Departamento de Biofísica - Unifesp

Apoio Financeiro: CNPq, Fapesp

Resumo Introdução Peptídeos biologicamente ativos fazem parte do sistema imune inato de uma ampla variedade de organismos, defendendo-os contra infecções causadas por bactérias, fungos, parasitas, vírus, sendo alguns efetivos contra células tumorais [Biochimica et Biophysica Acta 1778:357, 2008; Peptides 24:1693, 2003]. A cationicidade apresentada por estes peptídeos parece favorecer a interação dos mesmos com membranas de bactérias e células tumorais [Biochimica et Biophysica Acta 1778:357, 2008] devido ao seu elevado teor de fosfolipídeos aniônicos. Outro fator importante para a ação destes peptídeos é a maior fluidez das membranas de bactérias e de algumas células tumorais. A presença do colesterol nas células de mamíferos desempenha um efeito condensador nas membranas, pois aumenta a organização das cadeias

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acilas ocasionando um aumento na espessura da bicamada. Outros efeitos causados pelo colesterol são a diminuição das flutuações de densidade lateral e das oscilações observadas na bicamada. A combinação destes efeitos aumenta o módulo de compressibilidade lateral da membrana, causando um aumento na energia necessária à permeabilização da membrana pelos peptídeos [Biophysical Journal 73:1492, 1997]. Objetivos Explorar o papel do colesterol na ação de peptídeos biologicamente ativos. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Bicamadas lipídicas planas foram formadas pelo método de Mueller. Orifícios circulares (~0.15 mm de diâmetro) foram formados nas paredes de filmes de teflon acoplados à uma câmara de acrílico, definindo dois compartimentos (cis e trans), os quais foram preenchidos com a mesma solução tampão [Tris (10 mM), KCl (150 mM), pH 7.4]. Este conjunto foi colocado no interior de uma gaiola de faraday sobreposta à uma mesa anti-vibracional. Uma alíquota da solução do peptídeo foi adicionada ao compartimento cis e a solução foi homogeneizada através de fluxo de ar obliquamente dirigido. Após a estabilização do sistema um potencial de -100 mV foi aplicado no compartimento trans e a atividade do peptídeo começou a ser monitorada. Resultados A atividade do peptídeo HR-1 em bicamadas lipídicas planas formadas com DOPC, DOPC:Col (70:30 w/w) e DOPC:POPS:Col (55:15:30, w/w/w) comprovam o efeito do colesterol sobre a atividade deste peptídeo. Em bicamadas lipídicas formadas sem o colesterol a amplitude média dos poros observados é de aproximadamente 0,5 pA (n = 5) enquanto nas composições com colesterol, além dos eventos com amplitude próxima a 0,5 pA, observa-se o aparecimento de poros com amplitudes próximas a 2 pA (n = 5). Os eventos de maior amplitude também possuem um tempo de abertura maior, alguns dos eventos observados chegam a permanecer no estado aberto por 5 minutos ou mais, enquanto os eventos de menor amplitude permanecem no estado aberto por apenas alguns milisegundos. Outra característica observada nestes experimentos foi a influência que o ter de fosfolipídeos aniônicos exerce sobre a atividade do peptídeo. Nas bicamadas formadas com 15% de POPS o número de eventos observados foi significativamente maior, em comparação às bicamadas formadas sem este fosfolipídeo. Conclusão O colesterol modula a atividade de peptídeos antimicrobianos, tanto na presença de fosfolipídeos aniônicos quanto em sua ausência.

Palavras-chaves: Peptideos Bioativos, colesterol, canais unitarios, eletrofisiologia, espectroscopia

Resumo: 10.019

A ANGIOTENSINA II ESTIMULA A ATIVIDADE DO NHE3, AO MENOS EM PARTE, POR REDUZIR

A ATIVIDADE DA PKA EM CÉLULAS DE TÚBULO PROXIMAL RENAL

Autores 1CRAJOINAS, R. O.

2, QUEIROZ-LEITE, G. D.

2, MALNIC, G.

1, GIRARDI, A. C. C.

1 Ciências

Médicas - USP, 2 Fisiologia e Biofísica - USP

Apoio Financeiro: FAPESP

Resumo Introdução A atividade da isoforma 3 do trocador Na+/H+ (NHE3) é aumentada por ação da angiotensina II (Ang II) em células de túbulos proximais. Os efeitos da Ang II em túbulos renais decorrem principalmente da ativação de receptores AT1. A ligação de Ang II a receptores AT1 pode resultar em inibição de adenilil ciclase via estimulação de proteína G inibitória. O NHE3 é inibido por fosforilação por proteína cinase A (PKA) e a redução nos níveis de AMPc, com consequente diminuição da atividade desta cinase, pode ser um dos mecanismos pelos quais o NHE3 é ativado por Ang II. Objetivos Este estudo tem como objetivo testar a hipótese de que a Ang II diminui os níveis de fosforilação endógena do NHE3 em sítios consenso para a PKA (serinas 552 e 605), aumentando a atividade deste transportador e, por conseguinte, a reabsorção de sódio em túbulo proximal renal. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Células OKP foram tratadas com 100 µM Dopamina (DOP) por 30 min na presença ou na ausência de 10-10 M Ang II por 5, 15 e 30 min, apenas com Ang II por 30 min ou com veículo (controle). A função do NHE3 em células OKP foi feita por meio da recuperação do pH dependente de sódio após pulso ácido com cloreto de amônio. As análises por “immunoblotting” foram feitas para avaliar os níveis de fosforilação do NHE3 por PKA nas serinas 552 e 605 e para determinar a atividade da PKA. Resultados A DOP inibiu a atividade do NHE3 em relação ao controle (0,2013 ± 0,019 vs. 0,3036 ± 0,023 unidades pH/min). Quando a DOP foi incubada com Ang II por 15 (0,2347 ± 0,034 unidades pH/min) e 30 min (0,3295 ± 0,032 unidades pH/min), este efeito inibitório foi abolido. Conforme esperado, a Ang II estimulou a atividade do NHE3 (0,5075 ± 0,022 vs. 0,3036 ± 0,023 unidades pH/min). A DOP aumentou os níveis de fosforilação do NHE3 das serinas 552 (64 ± 5 %) e 605 (389 ± 42 %) em relação ao controle. Quando a DOP foi incubada com Ang II por 15 e 30 min, este efeito sobre os níveis de fosforilação nos sítios consenso para PKA da região C-terminal do NHE3 foi abolido. Similarmente, a atividade da PKA foi aumentada nas células tratadas com DOP e nas células tratadas com DOP e Ang II por 5 min em comparação ao controle. A incubação das células por um maior tempo com Ang II, na presença de DOP, fez com que a atividade da PKA retornasse aos valores basais. Todos estes efeitos da Ang II foram prevenidos quando as células foram pré-tratadas com o bloqueador do receptor AT1 (losartan). Conclusão Conclui-se que um dos mecanismos pelos quais a Ang II estimula a atividade do NHE3 em túbulo proximal é por meio da inibição da atividade da PKA que leva à diminuição dos níveis de fosforilação endógena do NHE3, especialmente na serina

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552.

Palavras-chaves: Angiotensina II, Fosforilação, NHE3, OKP, Proteína cinase A

Resumo: 10.020

The impact of soluble β-amyloid peptide accumulation on receptor traffic in cultured neurons.

Autores

1OLIVEIRA, L. T.

2, LEON, G. V. O.

3, PROVANCE, D. W.

4, MELLO, F. G.

1, SORENSON, M. M.

1,2, SALERNO, V. P.

1 Instituto de Bioquimica Medica - IBqM,

2 Departamento de Biociencias de

Atividade Fisica - EEFD, 3 Centro Desenvolvimento Tecnológico de Saúde - IOC,

4 Instituto de

Biofisica Carlos Chagas Filho - IBCCF

Apoio Financeiro: Faperj, CNPq, CNPq/INCT/IMBEB

Resumo Introdução Myosin Vb (MVb), a motor protein involved in intracellular traffic, is essential for the transport of vesicles in actin-rich cortical regions, dendritic spines, and axon terminals and is directly involved in the trafficking of glucose transporter 4 (GLUT4) receptor subunits to the synapse as a response to long term potentiation (LTP). Disruption of MVb function could also have a major impact on memory and learning since the transported organelles are critical for synaptic function and plasticity. Objetivos An important contributor to MVb disruption is the soluble β-amyloid 42 (Aβ42) peptide, which is internalized by neurons and leads to the redistribution of MVb (Cytoskeleton. 69(3):166, 2012). The presence and extra-neuronal accumulation of Aβ peptide is a hallmark of Alzheimer disease (AD) but recent findings show that synapses are the main targets of Aβ42 oligomers. The oligomers alter receptor composition and morphology, causing synapse dysfunction, likely responsible for the early memory deficit and cognitive decline in AD. Código de Experimentação Animal IBCCF 035 Código de Experimentação Humana Métodos Here we examined the impact of Aβ42 on intracellular transport of GLUT4 receptors by MVb in chick retinal neurons. Cultured cells were maintained 4 days in vitro (DIV) at low density, then challenged with fluo-Aβ42 oligomers for 30 min and prepared for fluorescence and differential interference contrast (DIC) microscopy. Resultados Previously, we showed that Aβ42 labeled oligomers internalized for an extended time (more than 30 min) display a punctate

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distribution that shifts from peripheral neuronal processes to the perinuclear region. Our immunocytochemistry assays revealed a loss of GLUT4 receptor exposed at the cell membrane. Conclusão This loss could cause changes in synaptic activity. The results are also consistent with the hypothesis that AD proceeds as a result of an imbalance between Aβ production and Aβ clearance.

Palavras-chaves: β-amyloid, oligomers, myosin, GLUT4

Resumo: 10.021

ASPECTOS TERMODINÂMICOS DA INTERAÇÃO ENDOCANABINÓIDE-FOSFOLIPÍDEOS

Autores

1BRITO, A. M. S.

2, RISKE, K. A.

1, ARCISIO-MIRANDA, M.

1 Laboratório de Neurobiologia

Estrutural e Funcional - Departamento de Biofísica - Unifesp, 2 Laboratório de Biomembranas -

Departamento de Biofísica - Unifesp

Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq, Capes

Resumo Introdução Anandamida (AEA) é um neurotransmissor de origem fosfolipídica que pertence à classe dos endocanabinóides e está envolvido em várias funções fisiológicas por meio de interações com os receptores CB1 e CB2 para canabinóides. No entanto, estudos com camundongos nocaute para os receptores canabinóides mostram a manutenção dos efeitos endocanabinóides do AEA (J. Neurochem., 75; 6, 2000). A hipótese do nosso grupo é que pelo menos parte destes efeitos ocorram pela interação das moléculas de endocanabinóides com membranas fosfolipídicas e, consequentemente, alteração de suas propriedades físico-químicas. Além disso, vem sendo demonstrado que a composição fosfolipídica das membranas celulares possui papel importante na atividade do AEA (PLoS ONE 4; 4989, 2009). Sendo assim, informações a respeito da sua localização na bicamada lipídica e como se estabelece esta interação são de extrema relevância para entendermos os mecanismos de ligação à membrana e entrada na célula. Objetivos Observar e analisar os aspectos termodinâmicos de interações entre o endocanabinóide AEA e bicamadas fosfolipídicas. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos Vesículas unilamelares grandes (LUVs) de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) foram preparadas por extrusão (~100 nm) em

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concentração de 10 mM em tampão KCl 150 mM HEPES 10 mM (pH 7,4). O AEA foi dissolvido no mesmo tampão para a uma concentração de 0,5 mM. A calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi realizada utilizando um aparelho VP-ITC (Microcal, Northhampton, MA, EUA). As vesículas foram injetadas na cela contendo o endocanabinóide, sendo uma injeção de 10 μL a cada 800s. Os dados foram analisados utilizando o programa Origin versão 7.0 (Microcal). Resultados A titulação do AEA com vesículas de DOPC gerou picos característicos de ITC. A entalpia total medida foi de ΔH ~ 0,3 kcal/mol AEA. O sinal exotérmico foi interpretado como vindo do processo de partição da molécula de AEA na bicamada lipídica. Embora a magnitude de ΔH não tenha sido muito grande, os resultados claramente mostram uma interação entre o endocanabinóide e membranas de DOPC. Resultados de espalhamento de luz dinâmico (DLS) mostraram que a interação do AEA com as vesículas não altera o tamanho médio destas. Conclusão A técnica de ITC foi capaz de detectar um sinal exotérmico advindo da interação do endocanabinoide AEA com membranas modelo do fosfolipídio DOPC, encontrado em abundância em membranas celulares.

Palavras-chaves: anandamida, fosfolipídeos, ITC

Resumo: 10.022

MODULAÇÃO DE CANAIS PARA PRÓTONS SENSÍVEIS A VOLTAGEM POR ANFIFÍLICOS

Autores 1ARNAUT, A. M.

1, OLIVEIRA, F. A.

1, ARCISIO-MIRANDA, M.

1 Laboratório de Neurobiologia

Estrutural e Funcional - Departamento de Biofísica - UNIFESP

Apoio Financeiro: Fapesp

Resumo Introdução Os canais iônicos são proteínas de membrana que permitem a passagem de íons através de seu poro. Os canais podem ser classificados de acordo com o íon primário que o atravessa, sendo que alguns deles são ativados por estímulos elétricos – os canais sensíveis à voltagem. Entre eles está o canal para prótons, Hv1, cuja função primordial é a extrusão de prótons do meio intracelular [Physiology 25-27, 2010; Nature 440-1213, 2006; Science 312-589, 2006.] O processo de abertura e fechamento destes canais, além da cinética deste processo, podem ser influênciados por fatores físicos e/ou químicos. Entre os fatores químicos podem-se citar os hormônios, drogas e, recentemente incluídas, algumas moléculas anfifílicas como ácidos graxos e os ligantes endocanabinóides [Pharmacol.Ther. 111-114, 2006]. Contudo, ainda é raro na literatura estudos mostrando a eficiência de moléculas anfifílicas na modulação de canais Hv1. Objetivos estudar os efeitos modulatórios de anfifílicos, como ácidos graxos poli-insaturados e ligantes endocanabinóides, no processo de abertura e fechamento de canais Hv1. Código de Experimentação Animal

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Código de Experimentação Humana Métodos

Células HEK293T foram cultivadas, a 37C e 5%CO2, em meio DMEM suplementados com 10% FBS e 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina). As células foram transfectadas com o vetor de expressão pCDNA3.1(-) (Invitrogen) contendo o inserto para o canal Hv1 de humanos pelo método de Ca2PO4. De 24 a 48 horas pós transfecção, as células foram utilizadas para a obtenção dos registros eletrofisiológicos. Para a obtenção das correntes de prótons empregamos a

técnica de patch-clamp, no modo whole-cell, com resistência de pipeta em torno de 5 M. As soluções externa e interna (de pipeta) continham, respectivamente: 85 mM NMDG, 5 mM CaCl2 e 100 mM HEPES (pH 7.0) e 70 mM NMDG, 1 mM

EGTA e 150 mM MES (pH 5.5). Todos os registros foram obtidos a temperatura ambiente (22-25C). Análise estetística (teste t-student) foi realizada com o programa GraphPad Prism 5.0. Resultados Iniciamos nossa investigação analisando os efeitos do ácido araquidônico (AA) no processo de ativação dos canais Hv1.

Assim, curvas de corrente vs. voltagem foram obtidas antes e após a aplicação de 10 M de AA. As correntes de prótons foram aumentadas em todos os potenciais a partir da ativação mínima (~-20 mV), sem sofrer deslocamentos laterais. Aumento da ordem de 60% foi obtido na corrente máxima observada em potenciais de +100 mV; corrente de prótons sem AA foi igual a 85 ± 5 pA/pF (n=5) e com AA foi igual a 138 ± 4 pA/pF (n=5). Conclusão Concluímos que agentes anfifílicos poli-insaturados como o ácido araquidônico podem modular o processo de abertura e fechamento dos canais para prótons Hv1.

Palavras-chaves: canais iônicos, patch clamp, whole cell, HEK293T, endocanabinóides

Resumo: 10.023

NMR structure of the consensus segment adjacent to second transmembrane domain of hP2X7 receptor

Autores 1FERREIRA, D. N. M.

2, FREITAS, M. S.

1, TEIXEIRA, P. C. N.

1, SOUZA, C. A. M.

1, ALVES, L.

A. 1 IOC - FIOCRUZ,

2 IBqM - UFRJ

Apoio Financeiro: FIOCRUZ, CNPQ, CAPES, FAPERJ

Resumo Introdução P2X7 is a trimeric ligand gated ionotropic receptor that belongs to the purinergic receptor family, which can be activated in nano molar range by extracellular ATP that opens a cation selective channel. However, high concentrations of ATP (> 100 μM) leads to another stage which allows the passage of molecules up to 900 Da across the membrane thought a large

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conductance channel. Nevertheless, there is no consensus if the receptor itself dilates or another protein is recruited. P2X receptor activation is related to pro-inflammatory cytokines and neurotransmitter release, cell death and pain signaling. Nonetheless, the lack of specific agonists and antagonists hinds the pharmacological and functional studies of this receptor. Moreover, new specific P2X7 agonists and antagonists could be used in clinic, for example, in neuropathic pain and rheumatoid arthritis clinical trials. Currently, knowledge about 3D protein structure guides the rational design of agonists and antagonists. Up to now, there is no structural data described in the literature for the P2X7 receptor. One explanation is that, in general, structural studies of membrane proteins are very difficult. Such proteins are rarely suitable to crystallography methods and almost always overstep the maximum molecular weight appropriated to NMR approaches. Therefore, an alternative to overcome those hindrances would be to use divide and conquer approach. In this method, small segments of a protein can be studied separately from the rest of the protein, and the secondary structure is held. Thus, we can draw conclusions about the structure-function relationship of the membrane proteins parts. This method is widely used throughout the world in many membrane proteins varying from G-protein coupled receptors to virus fusion peptide and ion channels. In this sense, the aim of this work was also to use this approach to determine the P2X7 receptor tridimensional structure. There is a consensus region adjacent to the second transmembrane domain (residues 313 to 336 - hP2X7 numbering) that shared similarity with the H5 segment of K+ channels (P-loop). The consensus segment (called ADSEG) alone can form ion channels in artificial bilayers with selective properties very close to whole P2X7 receptor. Therefore, this region might be important to the selective proprieties of P2X7 receptor. Objetivos Based on divide and conquer approach, we used liquid NMR spectroscopy to determine the structure of the consensus segment of P2X7 receptor in a membrane mimetic environment. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos We acquire TOCSY and NOESY spectra of a solution containing 2mM of the peptide in DMSO in a Bruker Avance III 800Mhz spectrometer. The data was processed using TopSpin software, and the spectra were assigned with CCpN Analysis software. The assigned spectra was used to calculate the structure using ARIA software Resultados Here we report the solution NMR structure of ADSEG segment in the membrane mimetic solvent DMSO. This is the first 3D structure of the consensus transmembrane domain of P2X7 receptor in literature and may help us to understand more about the selective proprieties of PX7 receptor. Conclusão We conclude that consensus segment adjacent to second transmembrane domain of hP2X7 receptor adopts a β-sheet configuration in DMSO.

Palavras-chaves: divide and conquer, ion channels, P2X, RMN, transmembrane peptide

Resumo: 10.024

CONSTRUÇÃO DE UM CLUSTER SMP (DISKLESS) E DINÂMICA MOLECULAR DE MODELO DE BICAMADA LIPÍDICA.

Autores 1SOARES, R. F.

1, TEIXEIRA, P. C. N.

1, ALVES, L. A.

1, LOPES, R. M.

1, CAFFARENA, E. R.

1,

ALVES, L. A. 1 IOC - FIOCRUZ

Apoio Financeiro:

Resumo Introdução Cluster de computadores Beowulf de alto desempenho é um aglomerado de computadores de arquitetura aberta, com uma configuração que permite dois ou mais computadores trabalharem seus processos de forma paralela, com baixo custo de aquisição e um desempenho que pode superar os supercomputadores. A dinâmica molecular é uma técnica computacional baseada na mecânica clássica e termodinâmica estatística, possibilitando prever e observar o possível comportamento, a conformação de biossistemas, mediante o estudo da conformação molecular e os tipos de interações. Dentre os biossistemas as bicamadas lipídicas constituem um importante campo a ser estudado, pois, compõem a base universal das membranas celulares contendo intermediários entre os meios intra e extra celular como as proteínas de membrana. Neste trabalho, apresentamos a montagem de um cluster de computadores Beowulf Symmetric Multiprocessing (SMP) diskless. Realizamos simulações com uma bicamada lipídica constituída de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) solvatada em água, inserimos seguimentos transmembrana (TM) do receptor P2X4 do peixe zebra (zfP2X4R), a fim de avaliarmos o desempenho do cluster (em gigaflops) e a qualidade dessas simulações. Objetivos Construção e avaliação do desempenho de um cluster Beowulf de alto desempenho através da realização de dinâmica molecular em modelo de bicamada lipídica. Código de Experimentação Animal Não se aplica Código de Experimentação Humana Não se aplica Métodos Definimos o hardware, o sistema operacional (CentOS 6.3) e determinamos do numero de computadores (5 nós), para então montarmos o cluster. Em seguida conectamos os cinco nós a uma rede de alta velocidade do tipo Ethernet utilizando um switch 10/100/1000gbits e utilizamos o sistema Diskless Remote Boot in Linux (DRBL). As simulações foram realizadas em agrupamento Gibbs (NPT), temperatura 325 K, com acoplamentos de pressão semi-isotrópico a pressão atmosférica de 1 bar (Berendsen et al., 1984), com acoplamento para o plano xy e o eixo z (normal à bicamada). O campo de força utilizado foi o Gromos96 ffG53a6 modificado por Kukol (2009), e solvatação explícita para água (modelo SPC) (Berendsen et al., 1981). A esses sistemas foram aplicados o método de Particle Mesh Ewald e potencial de Leonard-Jones para considerar as interações de Coulomb e de van der Waals, com raio de 1,2 nm e 1,5 nm, respectivamente. O algoritmo LINCS foi aplicado sobre todas as ligações (kukol, 2009 & Pandey, et al., 2011). Resultados A bicamada se manteve estável ao logo da simulação (40ns), o desempenho do cluster para cinco nós foi de 3.125 , e para um nó foi de 12,321gigaflops. A inserção dos segmentos TM do zfP2X4R na bicamada se apresentou com boa remoção das superposições. Conclusão

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O teste de desempenho do cluster demonstrou sua aplicabilidade na resolução de cálculos complexos, entretanto o uso de redes inferiores com taxas de 1Gbits podem ser um fator limitante em seu desempenho. A estabilidade da bicamada pós-dinâmica mostrou-se coerente com os resultados observados na literatura (Kukol 2009; Pandey 2011), validando nossa simulação.

Palavras-chaves: Alto Desempenho, Bicamada Lipídica, Cluster Beowulf, Dinâmica Molecular, Gigaflops

Resumo: 10.025

EFEITO DE BLOQUEADORES DE COTRANSPORTADORES SOBRE ATIVIDADE EPILEPTIFORME NÃO-SINÁPTICA

Autores 1LOPES, M. R.

1, MIRANDA, M. F.

1, SIQUEIRA, G. M.

1, CANTON, L. E.

1, RODRIGUES, A. M.

1, ALMEIDA, A. C. G.

1 Departamento de Engenharia de Biossistemas - UFSJ

Apoio Financeiro: Fapemig, CNPq e CAPES

Resumo Introdução Alterações na expressão dos cotransportadores NKCC e KCC2 vem sendo associada a processos epilépticos (Epil. Behav, 20; 148; 2011), atuando como mecanismo de hiperexcitabilidade, que em combinação com acoplamento neuronal, pode levar a sincronização e, por conseguinte, à crises (J. Neurosc, 27; 14012; 2007). Objetivos Dados de numerosos estudos experimentais atribuem um efeito antiepiléptico aos bloqueadores de co-transportadores por sua ação modulatória no volume extracelular (Epil., 53, 18, 2012) e na homeostase do cloreto. Assim, o presente projeto objetivou investigar o efeito do bloqueio dos cotransportadores KCC2 e NKCC nas atividades epileptiformes (AE), por bloqueadores de cotransportadores furosemida (FUR) e bumetanida (BUM). Código de Experimentação Animal CEUA nº 11/2010 Código de Experimentação Humana Métodos Protocolo de aprovação CEUA nº 11/2010. Para registro das atividades epileptiformes não sinápticas (AENS) no giro dentado do hipocampo foram utilizados ratos machos wistar com 6 semanas de vida, peso ~150 gr. Após indução das AENS, as fatias foram submetidas à perfusão com solução contendo FUR (5mM) ou BUM (12.5μm). Para análise estatística foi utilizado o teste Mann Whitney, com nível de significância igual a 5% , sendo quantificados os parâmetros amplitude do DC (DC), duração dos eventos (DE), intervalo entre eventos (IE) e population spikes (PS). Resultados

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FUR inibiu as AE’s em todos os experimentos (n=12) realizados. Os vintes eventos que precederam o bloqueio apresentaram decremento significativo de todos os parâmetros (DC, DE, PS e IE). No que se refere à BUM (n=12), não houve bloqueio das atividades epileptiformes e as alterações ao longo da aplicação não apresentaram diferença significativa para quaisquer dos parâmetros. Conclusão Furosemida suprime as AENS induzidas em hipocampo de animais nos quais a expressão do KCC2 e NKCC correspondem aos níveis normais para a faixa etária utilizada, com baixa expressão de NKCC e alta expressão de KCC2. Nestas condições a FUR, por ser um bloqueador de KCC2 tem um maior substrato para atuação, ao contrário da BUM que apresenta maior afinidade ao NKCC. Ainda, a alta concentração de potássio, no modelo utilizado para indução das AENS, inibe o NKCC (Physiol Rev., 80, 212, 2000). Nestas condições experimentais, as AENS encontram-se em um estado onde o KCC2 assume um papel crítico como regulador da excitabilidade. Portanto neste modelo, a ausência do efeito supressor das AE’s pela BUM sugere que não é o bloqueio do NKCC, mais sim o bloqueio do KCC2, o responsável pelo efeito antiepileptogênico. Confrontado-se com dados da literatura, os quais relatam uma inconsistência para a atuação da BUM nas AE’s, os resultados experimentais sugerem que tal inconsistência pode residir nas condições do tecido utilizado, sendo indicado proceder teste experimentais com animais com expressão alterada dos cotransportadores.

Palavras-chaves: ATIVIDADE EPILEPTIFORME NÃO-SINAPTICA, COTRANSPORTADORES, BUMETANIDA, FUROSEMIDA

Resumo: 10.026

MODULATION OF THE E-NTPDASE ACTIVITY PRESENT IN LLC-PK1 CELLS BY PURINERGIC RECEPTORS

Autores

1COSTA-ALVES, M. S.

1, NOVAES-SILVA, E. F.

1, FERREIRA-CANTINE, O.

1, RIBEIRO, M. C.

2, WENGERT, M.

1,3, CARUSO-NEVES, C.

1,4, PINHEIRO, A. A. S.

1 IBCCF - RJ,

2 IFRJ - RJ,

3

MCT - INBEB/CNPq, 4 MCT - INPeTAm/CNPq

Apoio Financeiro: FAPERJ, CAPES and CNPq

Resumo Introdução Extracellular nucleotides and nucleosides modulate several tissue functions by acting through purinergic receptors. The renal proximal tubule cells release ATP into the lumen where it can be degraded by ecto-ATPases. Recently our laboratory has shown the presence of an ecto-ATPase activity in LLC-PK1 cells, a model of pig proximal tubule cells, which resembles a type 3 E-NTPDase. Moreover, the proximal tubule has P1 and P2 receptors. The regulation of ecto-ATPase by P2Y1 receptors in retinal pigment epithelial cells has been shown. However it is unclear how the E-NTPDase in LLC-PK1 cells is regulated. Objetivos The aim of this study was to evaluate the modulation of E-NTPDase activity by purinergic receptors. Código de Experimentação Animal

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Código de Experimentação Humana Métodos LLC-PK1 cells were grown in DMEM supplemented with 10% FBS for 2 days (90% confluence), in 5% CO < sub > 2 < /sub > /37 < sup > 0 < /sup > C. Cells were serum deprived or not for different times and incubated overnight with nucleotides (ATP, ATPγS, ADP or AMP), or adenosine. Additionally, cells were treated or not overnight with different concentrations of wortmannin (PI3K inhibitor), 10 < sup > -3 < /sup > M PPADS (P2 antagonist) or 10 < sup > -4 < /sup > M iodotubericidinn (adenosine kinase inhibitor). After washing with PBS, cells were assayed to determine the ecto-ATPase activity by using a reaction medium containing 20mM Hepes-tris buffer pH 7,0, 4mM KCl, 5mM glucose, 116mM NaCl, 5mM MgCl < sub > 2 < /sub > and (γ- < sup > 32 < /sup > Pi)ATP/ 0,7mM ATP-Na < sup > + < /sup > . The reaction was stopped after 10 min by the addition of activated charcoal. The amount of Pi in the supernatant was determined by liquid scintillation. Resultados Initially, we observed that the activity increased with time of serum deprivation (starvation) achieving 57% stimulation after 12h. The E-NTPDase activity of non-starved cells in the presence of wortmannin was not altered, which discard the participation of PI-3K/PKB pathway in the activity stimulation during starvation. To evaluate whether P2 receptors are involved in this process, we incubated cells with 10 < sup > -3 < /sup > M PPADS overnight in DMEM without serum. In this case, the activity decreased from 12.42±0.36 to 9.61±0.6 nmol Pi x mg < sup > -1 < /sup > x min < sup > -1 < /sup > . ATP hydrolysis of non-starved cells increased according to an increment in ATP concentration (10 < sup > -6 < /sup > M and 10 < sup > -3 < /sup > M), with maximal effect observed in 10 < sup > -3 < /sup > M ATP which induced a 2-fold stimulation when compared to the control. 10 < sup > -6 < /sup > M AMP and 10 < sup > -3 < /sup > M adenosine also increased ecto-ATPase activity of non-starved cells (45% and 41% of control, respectively). The participation of P2 receptors in the ATP stimulatory effect was shown by incubating cells with 10 < sup > -6 < /sup > M ATPγS and the activity raised from 7.93±0.26 to 12.44±0.6 nmol Pi x mg < sup > -1 < /sup > x min < sup > -1 < /sup > . Moreover, 10 < sup > -3 < /sup > M PPADS reversed the ATP stimuli in non-starved cells. Since adenosine increased the ecto-ATPase activity, we treated cells with iodotubericidinn to evaluate the possible intracellular conversion of adenosine into ATP. This treatment abolished the adenosine effect on the ecto-ATPase activity. Conclusão Our results indicate that purinergic receptors could increase the E-NTPDase activity contributing to regulate the extracellular ATP levels in LLC-PK1 cells.

Palavras-chaves: E-NTPDASE, LLC-PK1, PURINERGIC RECEPTORS

Resumo: 10.027

BIOCOMPATIBILIDADE DE FORMULAÇÕES DE ARTICAINA EM NANOCÁPSULAS DE POLI(ÉPSILON-CAPROLACTONA) EM CÉLULAS EPITELIAIS.

Autores

1SILVA, C. B. D.

1, MUNIZ, B. V.

1, FERREIRA, L. E. N.

2, MELO, N. F. S. D.

2, FRACETO, L. F.

1,

LEITE, M. F. B. 1, GROPPO, F. C.

1, VOLPATO, M. C.

1 Departamento de Ciências Fisiológicas -

UNICAMP, 2 Departamento de Engenharia Ambiental - UNESP

Apoio Financeiro: FAPESP processo 2012/02539-1 e processo 2012/07310-2

Resumo Introdução Anestésicos locais são os fármacos mais usados no controle da dor perioperatória. Além da toxicidade aos sistemas nervoso central e cardiovascular, podem exercer uma grande variedade de efeitos sobre as células, podendo interferir em processos de cicatrização e resposta inflamatória, além de causar citotoxicidade. Uma das possibilidades para a redução da toxicidade de fármacos e melhora na biodisponibilidade dos mesmos é o uso de sistemas de liberação controlada, como as nanopartículas poliméricas. Objetivos Avaliar a biocompatibilidade in vitro de células epiteliais HaCaT, após 1h de exposição às seguintes formulações: articaína sem aditivo (arti), articaína com epinefrina 1:200.000 (arti epi) e articaína associada a nanocápsulas de poli(épsilon-caprolactona) (arti nano). Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos As nanocápsulas de poli(epsilon-caprolactona) foram preparadas pelo método de dupla emulsificação descrito por Grigoriev & Miller, 2009. Células epiteliais HaCaT foram mantidas em Meio Eagle de Dulbecco modificado - DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) e cultivadas em placas de Petri para cultura de tecido de 61 cm2 em atmosfera de 5% de CO2 a 37oC. Após apresentarem semi-confluência, as células foram dispersas em placas de cultura de tecidos com 96 poços e mantidas por 24 horas em estufa com 5% de CO2 a 37ºC. Posteriormente o meio de cultura foi substituído por um meio livre de antibiótico e soro fetal bovino e encubado por 1h com as formulações de arti, arti epi ou arti nano, nas concentrações: 31,25 / 25 / 18,75 / 12,5 e 6,25 mM. Foi utilizado como controle células submetidas ao meio de cultura, sem tratamento. Terminadas a incubação, a viabilidade celular foi estimada utilizando o método da redução do MTT. O experimento foi realizado em três ensaios independentes realizados em triplicata. Resultados Os resultados foram submetidos ao teste de Kruskal Wallis/Student Newman Keuls, α=5%. Resultados: (mediana ± desvio interquartílico, em porcentagem, em relação ao controle), respectivamente para as concentrações 31,25; 25; 18,75; 12,5 e 6,25mM: arti (27,9±6,9; 62,6±18,9; 77,2±13,0; 80,5±11,7; 7,4±12,3), arti epi (30,3±16,1; 54,9±28,0; 66,3±6,7; 72,5±12,2; 67,6±19,5) e arti nano (2,8±10,4; 4,8±12,7; 27,3±27; 37,2±11,4; 45,6±31,4). Na maior concentração não houve diferença entre as formulações. Na menor concentração arti foi menos tóxica que arti nano. Nas concentrações intermediárias arti não diferiu de arti epi, sendo ambas menos tóxicas que arti nano. Conclusão Nas concentrações estudadas, a encapsulação de articaína em nanocápsulas de poli(épsilon-caprolactona) diminuiu a viabilidade celular após 1 hora de exposição.

Palavras-chaves: Anestésico local, Articaína, Nanocápsulas , Viabilidade celular

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Resumo: 10.028

A NOVEL HYPOKALEMIC PERIODIC PARALYSIS MUTATION THAT CAUSES LOSS OF NEGATIVE CHARGE IN NAV1.4 RESULTS IN GATING PORE CURRENTS

Autores

1DURRAN, S. C. M.

1, MANNIKKO, R.

3, RYBALCHENKO, V.

3, FRANCIS, D. G.

1, RAJA-

RAYAN, D. L. 1, MATTHEWS, E.

2, SWEENEY, M. G.

3, CANNON, S. C.

1, HANNA, M. G.

1

Institute of Neurology - UCL, 2 Institute of Neurology - UCL,

3 Department of Neurology and

Neurotherapeutics - UT Southwestern

Apoio Financeiro: National Commissioning Group of the United Kingdom Department of Health

Resumo Introdução Skeletal muscle channelopathies are inherited disorders of muscle excitability due to disruption of the normal function of ion channels. Hypokalemic periodic paralysis (HypoPP) is one such disorder in which patients experience episodes of flaccid paralysis associated with reduced serum K + levels. To date causative mutations that give rise to HypoPP have been found in the S4 segments causing neutralisation of arginine residues of either Cav1.1 or Nav1.4. Expression studies have shown all six Nav1.4 HypoPP mutations tested to date result in an aberrant "gating pore current" due to loss of a positively charged arginine residue. Objetivos While S4 arginine mutations account for ~90% of HypoPP cases, ~10% of cases remain undiagnosed. A cohort of well defined HypoPP patients without common mutations was used to identify novel mutations in areas of the known genes not yet associated with the disease. The effects of these mutations on channel function were tested. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos The whole coding region of SCN4A (gene coding for Nav1.4) was sequenced and analysed for novel variants. Wild-type and mutant channels were expressed in Xenopus leavis oocytes and HEK293 cells. The channel properties were studied using two-electrode and cut-open voltage clamp, and whole cell patch clamp. Resultados We have identified a novel HypoPP mutation in Nav1.4 which is located in an area of the channel outside of the S4 voltage sensor. The mutation causes loss of negative charge which has not been previously associated with the disorder. Moreover, we found that this mutation causes a gating pore current which is activates at the resting potential. Conclusão

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These expression studies show for the first time (to our knowledge) that a HypoPP mutation of a residue other than S4 arginine can result in a gating pore current and support the notion that a common functional deficit, the gating pore current, produces susceptibility to attacks of HypoPP.

Palavras-chaves: Gating pore current, Hypokalemic periodic paralysis, Nav1.4, Sodium channel

Resumo: 10.029

EFEITOS DA ARTICAÍNA A 2%, 3% E 4%, ASSOCIADA OU NÃO A LIPOSSOMAS, SOBRE VIABILIDADE CELULAR EM FIBROBLASTOS GENGIVAIS HUMANOS.

Autores

1MUNIZ, B. V.

1, Batista-da SILVA, C.

1, FERREIRA, L. E. N.

2, SILVA, C. M. G. D.

2, PAULA, E.

D. 1, GROPPO, F. C.

1, VOLPATO, M. C.

1 Ciências Fisiológicas - FOP-Unicamp,

2 Departamento de

Bioquímica - IB - Unicamp

Apoio Financeiro: Fapesp # 2011/15768-6

Resumo Introdução A articaína, em particular, tem sido implicada em número considerável de casos de parestesia após bloqueio do nervo alveolar inferior e essa ocorrência parece ser concentração-dependente. A associação a carreadores, como lipossomas, tem demonstrado redução na toxicidade sistêmica e aumento da duração da anestesia em alguns modelos. Objetivos O objetivo do presente estudo é avaliar viabilidade celular em culturas de fibroblastos gengivais humanos quando expostos à articaína livre e encapsulada em lipossomas. Código de Experimentação Animal Código de Experimentação Humana Métodos As células foram expostas às formulações: articaína livre a 2%, 3% e 4% (ATC 2, ATC 3, ATC 4) e em suspensão lipossomal - lipossomas unilamelares com gradiente de concentração iônico (ATC-LIPO 2, ATC-LIPO 3, ATC-LIPO 4), além dos controles (suspensão lipossomal - Control LIPO e ausência de tratamento – Control MEIO). O teste de viabilidade celular foi medido pelo método de redução do MTT em espectrofotometria, realizado após 4h da exposição às formulações. Trabalho realizado com cultura de células imortalizadas. Resultados Os resultados foram submetidos ao teste de Kruskal-Wallis/ Student-Neuman-Keuls; α=5%. Resultados (mediana ± desvio

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interquartílico, em porcentagem, em relação ao controle): Control MEIO (97,46±119,9); ATC 2 (2,89±8,14); ATC 3 (8,14±17,34); ATC 4 (1,14±5,95); Control LIPO (57,62±23,86); ATC-LIPO 2 (9,02±46,67); ATC-LIPO 3 (9,89±10,95); ATC-LIPO 4 (13,40±21,89). A ATC livre reduziu a viabilidade celular em relação ao Control MEIO em todas as concentrações utilizadas, sendo a maior redução observada com a ATC 4 (p < 0,05). O Control LIPO não diferiu do control MEIO. As formulações com articaína encapsulada em lipossomas apresentaram menor viabilidade em relação ao controle (p < 0,05), entretanto a encapsulação aumentou a viabilidade da articaína 4% (p < 0,05). Conclusão A articaína reduz a viabilidade celular em todas as concentrações testadas. A suspensão lipossomal não altera a viabilidade celular e a encapsulação melhora a viabilidade quando é utilizada articaína na concentração 4%.

Palavras-chaves: Articaína, Lipossomas, Viabilidade Celular, Fibroblastos Gengivais Humanos, Carreadores

Resumo: 10.030

Activation of Group I Metabotropic Glutamate Receptors Depolarize and Increase the Excitability of Trapezoid Body Neurons in Newborn Mice.

Autores 1ALHADAS, É.S.

1, NAVES, L. A.

1, KUSHMERICK, C.

1 Fisiologia e Biofisica - UFMG

Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq, PGFisFar-UFMG

Resumo Introdução Group I Metabotropic Glutamate Receptors (mGluR-I) are Gq-protein coupled receptors linked to the PLC/IP3 pathway and to the release of Ca2+ from intracellular stores, but their effects on the excitability of trapezoid body neurons are largely unknown. Previously, using whole-cell voltage clamp, we showed that activation of mGluR-I in the Medial Nucleus of the Trapezoid Body generates an inward current at potentials near the resting potential, suggesting an excitatory role for these metabotropic receptors. To test this hypothesis, we employed sharp intracellular recordings of membrane potentials and action potentials to determine the impact of mGluR-I activation on neuronal excitability. Objetivos To test the impact of mGluR-I activation on the electrical excitability of trapezoid body neurons. Código de Experimentação Animal 131/2009 CETEA-UFMG Código de Experimentação Humana Métodos Experiments were performed on brainstem slices containing the Trapezoid Body obtained from P4-10 C57BL mice of either

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sex. Standard intracellular recordings techniques using glass pipettes filled with 2 M KCl, resistance of 110-160 MOhm, were used to measure the membrane potential and action potentials. Although we aimed for the principal neurons of the medial nucleus of the trapezoid body, the action potential pattern in many recordings indicate that other neuronal types were also recorded. Membrane potential, input resistance, and action potential threshold and number were recorded in control solution, during application of the specific mGluR-I agonist DHPG (0.1 mM) and again after washout of DHPG from the bath. Data are from N=7 independent experiments and are presented as mean ± S.E.M. Statistical significance was determined using the paired Student t test. Resultados Resting membrane potential was -76±5.5 mV. Application of DHPG (0.1 mM) caused a rapid depolarization of the membrane potential by 5.0±0.56 mV (p Conclusão We conclude that activation of mGluR-I in Trapezoid body neurons significantly reduces their threshold for action potential generation and increases their electrical excitability.

Palavras-chaves: Glutamate Receptor, Group I mGluR, Excitability, DHPG, Trapezoid body